CN117062820A - 生物素的制造方法、以及生物素的l-赖氨酸盐及其制造方法 - Google Patents

生物素的制造方法、以及生物素的l-赖氨酸盐及其制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供能够将表生物素有效地从生成物中除去、提高生物素的纯度、得到纯度高的生物素的生物素的制造方法、以及生物素的L‑赖氨酸盐及其制造方法，提供包括以下工序的生物素的L‑赖氨酸盐的制造方法，所述工序为(a)在溶剂中使粗生物素与L‑赖氨酸接触，得到生物素的L‑赖氨酸盐的溶液或悬浮液的工序；及(b)在工序(a)中得到生物素的L‑赖氨酸盐的溶液的情况下，使该生物素的L‑赖氨酸盐从生物素的L‑赖氨酸盐的溶液中析出的工序，还提供包括下述工序的生物素的制造方法，所述工序是在由上述制造方法制造生物素的L‑赖氨酸盐后使该生物素的L‑赖氨酸盐与酸接触、从而得到生物素的工序。

Description

生物素的制造方法、以及生物素的L-赖氨酸盐及其制造方法
技术领域
本发明涉及生物素的制造方法、以及生物素的L-赖氨酸盐及其制造方法。
背景技术
生物素为属于维生素B族的水溶性维生素(非专利文献1)。生物素被期待具有糖尿病预防效果、皮肤疾病改善效果、生物素缺乏症改善效果等，作为医药品、饲料添加剂等的需求高涨。生物素由下述式(1)表示，也称为D-生物素。
[化学式1]
如下文所示，生物素(BIF)例如由脲基体(URD)经由7个工序而合成(专利文献1)。
[化学式2]
此处，生物素除了具有上述式(1)表示的D-生物素以外，还具有7个异构体(非专利文献2)。在合成D-生物素的过程中，例如，下述式(2)表示的L-生物素等异构体有时包含在生成物中。这些D-生物素以外的异构体从安全性的观点考虑也期望从生成物中去除。
[化学式3]
虽然公开了通过使D-生物素及L-生物素的外消旋体与L(+)-精氨酸反应，以难溶性的盐的形式结晶化从而进行纯化、提高D-生物素的纯度的方法，但关于作为生物素的非对映异构体的表生物素(epibiotin)的分离除去，并没有记载(非专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2018/025722号
非专利文献
非专利文献1：Pierre J.de Clercq，“Biotin：ATimeless Challenge for TotalSynthesis”Chemical Reviews，1997，Vol.97，No.6.
非专利文献2：Toru YAMANO，Isao AOKI，and Kunio TAKANOHASHI“DirectOptical Resolution of(±)-Biotin and(±)-Epibiotin by a Reserved-Phase High-Performance Liquid Chromatography”J.Nutr.Sci.Vitaminol.，39，419-423，1993.
非专利文献3：DONALD E.WOLF，RALPH MOZINGO，STANTON A.HARRIS，R.CHRISTIANANDERSON AND KARL FOLKERS“Biotin.VI.Resolution of dl-Biotin”CONTRIBUTION FROMTHE RESEARCH LABORATORIES，JOURNAL of the American Chemical Society，1945，Vol.67，No.12,2100-2102
发明内容
发明所要解决的课题
在以上述这样的路径合成生物素的情况下，含有生物素的生成物有时含有非对映异构体等作为杂质。在非对映异构体中，下述式(3)表示的表生物素是尤其难以从生成物中除去的杂质。
[化学式4]
生成物中的表生物素的基于高效液相色谱(HPLC)的面积百分率有时达到约5％，因此也可能成为使生物素的纯度降低的主要原因。该表生物素的除去例如可通过反复进行中和晶析处理、活性炭处理等纯化处理来进行，但也会产生生物素的收率降低这样的问题。因此，期望将表生物素有效地从生成物中除去、提高生物素的纯度的方法。
因此，本发明的目的在于提供能够将表生物素有效地从生成物中除去、提高生物素的纯度、得到纯度高的生物素的、生物素的制造方法。另外，本发明的目的在于提供能够将表生物素有效地从生成物中除去、提高生物素的纯度、得到纯度高的生物素的、生物素的L-赖氨酸盐及其制造方法。
用于解决课题的手段
本申请的发明人等进行了深入研究，结果发现，在溶剂中使包含生物素及表生物素的粗生物素与L-赖氨酸接触而得到生物素的L-赖氨酸盐后，使该生物素的L-赖氨酸盐与酸接触来进行生物素的脱盐处理，由此可得到纯度高的生物素。
即，本发明包括以下的发明。
[1]生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，其包括以下的工序：
(a)在溶剂中使粗生物素与L-赖氨酸接触，得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液或悬浮液的工序；及，
(b)在工序(a)中得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液的情况下，使生物素的L-赖氨酸盐从生物素的L-赖氨酸盐的溶液中析出的工序。
[2]如[1]所述的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，其中，溶剂包含选自由水、甲醇、乙醇、2-丙醇、丙酮及乙腈组成的组中的至少一种。
[3]如[1]或[2]所述的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，其中，工序(a)是在水中使粗生物素与L-赖氨酸接触、得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液的工序。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，其中，工序(b)是通过使生物素的L-赖氨酸盐的溶液与析出溶剂接触、从而使生物素的L-赖氨酸盐析出的工序。
[5]如[4]所述的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，其中，析出溶剂包含选自由甲醇、乙醇、2-丙醇、丙酮及乙腈组成的组中的至少一种。
[6]如[4]或[5]所述的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，其中，水与析出溶剂的体积比(析出溶剂/水)为5以上30以下。
[7]如[4]～[6]中任一项所述的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，其中，工序(b)是将生物素的L-赖氨酸盐的溶液加热至40℃以上80℃以下后与析出溶剂接触，然后冷却至-10℃以上10℃以下，由此使生物素的L-赖氨酸盐析出的工序。
[8]如[1]或[2]所述的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，其中，工序(a)是在包含选自由醇、丙酮及乙腈组成的组中的至少一种的有机溶剂中使粗生物素与L-赖氨酸接触，得到生物素的L-赖氨酸盐的悬浮液的工序。
[9]如[8]所述的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，其中，有机溶剂为醇。
[10]如[8]或[9]所述的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，其中，相对于1g粗生物素，有机溶剂的使用量为8mL以上。
[11]生物素的制造方法，其包括在由[1]～[10]中任一项所述的方法制造生物素的L-赖氨酸盐后，使该生物素的L-赖氨酸盐与酸接触，得到生物素的工序。
[12]生物素的L-赖氨酸盐。
[13]如[12]所述的生物素的L-赖氨酸盐，其中，表生物素的基于HPLC面积百分率的含量为0.035％以下。
发明效果
根据本发明的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，能够将表生物素有效地从粗生物素中除去，得到纯度高的生物素的L-赖氨酸盐，通过使用所得的生物素的L-赖氨酸盐，能够制造纯度高的生物素。另外，在本发明的生物素的制造方法中，使用由本发明的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法得到的纯度高的生物素的L-赖氨酸盐来制造生物素，因此能够得到纯度高的生物素。因此，不用多次进行生成物的纯化处理就能够以高收率得到纯度高的生物素。就以这样的方式得到的生物素而言，表生物素的含量少，因此例如能够实现生物素的基于HPLC面积百分率的含量(纯度)为99.96％以上的超高纯度。本发明中，“基于HPLC面积百分率的含量”按照实施例中记载的方法测定，HPLC在实施例中记载的条件下进行。
生物素及表生物素为弱酸，因此通过与碱性强的L-赖氨酸接触，能够生成生物素的L-赖氨酸盐和表生物素的L-赖氨酸盐。生物素的L-赖氨酸盐与表生物素的L-赖氨酸盐在特定溶剂中的溶解度不同。该溶解度的差异的大小大于其他的生物素的碱盐与表生物素的碱盐在特定溶剂中的溶解度的差异。因此，通过使生物素的L-赖氨酸盐及表生物素的L-赖氨酸盐与一种盐的溶解度高而另一种盐的溶解度低的溶剂接触，从而得到溶解度高的盐的溶液、和溶解度低的盐的固体。由此，能够更有效地分离生物素的L-赖氨酸盐与表生物素的L-赖氨酸盐。通过使分离的生物素的L-赖氨酸盐与酸接触，从而能够分离生物素。
具体实施方式
以下，说明本发明的详细内容。
本发明的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法包括以下的工序：
(a)在溶剂中使粗生物素与L-赖氨酸接触，得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液或悬浮液的工序；及，
(b)在工序(a)中得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液的情况下，使生物素的L-赖氨酸盐从生物素的L-赖氨酸盐的溶液中析出的工序。
需要说明的是，在工序(a)中得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液的情况下，进行工序(b)，但在工序(a)中得到生物素的L-赖氨酸盐的悬浮液的情况下，不进行工序(b)。
(粗生物素)
粗生物素包含生物素及表生物素。粗生物素典型而言为固态物。根据一例，粗生物素中的生物素的基于HPLC面积百分率的含量(纯度)为90％以上且低于99.92％。另外，根据一例，粗生物素中的表生物素的基于HPLC面积百分率的含量为约5％以下。
粗生物素可以为上述的生物素合成的7个工序中的第7工序(步骤7)中得到的生成物。即认为，在上述的生物素合成的7个工序中的第6工序中，将乙烯基硫醚体(DVE)向N,N’-二苄基生物素(HVC)还原时，N,N’-二苄基生物素的差向异构体作为副产物产生。关于该N,N’-二苄基生物素的差向异构体，认为通过在第7工序中进行脱保护反应，生成表生物素。需要说明的是，粗生物素也可以是对第7工序中得到的生成物实施活性炭处理等纯化处理后的生成物。另外，粗生物素也可以为市售的生物素。
粗生物素的制造方法的一例如下所述。
首先，利用专利文献1等中记载的已知方法由脲基体(URD)合成下述式(6)所示的乙烯基硫醚体(DVE)。
[化学式5]
另外，乙烯基硫醚体(DVE)可以在利用专利文献1等已知的方法(例如，专利文献1的步骤1～步骤3)合成下述式(4)所示的内酯化合物(LCT)后，利用下述的方法合成。
[化学式6]
在使内酯化合物(4)与乙酸碱金属盐接触后，与硫代羧酸反应，由此得到包含下述式(5)所示的硫代内酯化合物(DTL)的混合物。
[化学式7]
在氮气氛下，向锌末中加入二卤代乙烷而使其活化后，与卤代烷烃衍生物接触，制备卤代烷基锌。在其中混合已溶解于有机溶剂中的硫代内酯化合物(5)，向反应液中添加酸，得到乙烯基硫醚体(DVE)。
利用已知的方法将合成的乙烯基硫醚体还原，由此得到包含下述式(7)所示的N,N’-二苄基生物素(HVC)的生成物。该生成物包含作为副产物产生的N,N’-二苄基生物素的差向异构体。
[化学式8]
通过将该生成物与酸混合，发生N,N’-二苄基生物素及其差向异构体的脱苄基化反应，得到包含生物素及表生物素的生成物。作为粗生物素，可以使用以这样的方式得到的生成物，也可以使用活性炭处理后的生成物。
活性炭处理是通过将粗生物素与活性炭混合，从而将杂质从粗生物素中除去的方法。
(生物素)
生物素由下述式(1)表示，也称为D-生物素。
[化学式9]
通过在溶剂中使生物素与L-赖氨酸接触，从而能够生成生物素的L-赖氨酸盐。
(表生物素)
表生物素由下述式(3)表示，也称为D-表生物素。表生物素可包含L-表生物素。
[化学式10]
通过在溶剂中使表生物素与L-赖氨酸接触，能够生成表生物素的L-赖氨酸盐。
(L-赖氨酸)
本发明中使用的L-赖氨酸没有特别限制。
相对于1摩尔的生物素而言的L-赖氨酸的使用量优选为0.50摩尔以上2.0摩尔以下，更优选为1.0摩尔以上1.5摩尔以下。
(溶剂)
用于使粗生物素与L-赖氨酸接触的溶剂优选包含选自由水、醇、丙酮及乙腈组成的组中的至少一种。其中，优选使用由选自由水、或、醇、丙酮及乙腈组成的组中的至少一种构成的有机溶剂，更优选使用水或醇。水包括蒸馏水、纯化水、纯水、超纯水、自来水或它们的混合物。也可以使用含水有机溶剂。含水有机溶剂中的体积基准的含水率优选为50％以下，更优选为20％以下。
醇优选包含选自由甲醇、乙醇及2-丙醇组成的组中的至少一种，其中，优选使用乙醇。
(L-赖氨酸盐的制造)
作为本发明的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，可举出：
(1)包括在水中使粗生物素与L-赖氨酸接触而得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液的工序、以及使生物素的L-赖氨酸盐从生物素的L-赖氨酸盐的溶液中析出的工序的、生物素的L-赖氨酸盐的制造方法(以下，也称为“制造方法(1)”)；以及
(2)包括在包含选自由醇、丙酮及乙腈组成的组中的至少一种的有机溶剂中使粗生物素与L-赖氨酸接触，得到生物素的L-赖氨酸盐的悬浮液的工序的、生物素的L-赖氨酸盐的制造方法(以下，也称为“制造方法(2)”)。
根据制造方法(1)及(2)，各自得到表生物素或其盐少的高纯度的生物素的L-赖氨酸盐。就得到的高纯度的生物素的L-赖氨酸盐中的表生物素的基于HPLC面积百分率的含量而言，根据一例，为0.035％以下，根据另一例，为0.020％以下，根据另一例，为0.010％以下，根据另一例，为0.004％以下。下限值为0％或检测极限值。就得到的高纯度的生物素的L-赖氨酸盐中的生物素的基于HPLC面积百分率的含量(纯度)而言，根据一例，为99.92％以上，根据另一例，为99.94％以上，根据另一例，为99.95％以上，根据另一例，为99.96％以上。上限值为100％。
(制造方法(1))
(得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液的工序)
生物素的L-赖氨酸盐由下述式(8)表示。
[化学式11]
在制造方法(1)中，首先，通过在水中使粗生物素与L-赖氨酸接触，从而得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液。该工序为工序(a)的一个方式。
在水中使粗生物素与L-赖氨酸接触的方法没有特别限制。在水中将粗生物素与L-赖氨酸搅拌混合时，能够得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液。水、粗生物素及L-赖氨酸的添加顺序也没有特别限制。
根据一例，相对于1g粗生物素而言的水的使用量例如为1mL以上10mL以下，优选为3mL以上5mL以下。根据另一例，相对于1g粗生物素而言的水的使用量例如为0.5mL以上5mL以下，优选为0.5mL以上2mL以下。
粗生物素与L-赖氨酸的接触时的温度没有特别限制。可以于室温接触，也可以于下一工序(使生物素的L-赖氨酸盐析出的工序)中的生物素的L-赖氨酸盐的溶液与析出溶剂接触时的温度接触。
在使粗生物素与L-赖氨酸在水中接触后，可以将得到的混合物搅拌混合。搅拌的情况下，搅拌时间例如为1分钟以上24小时以下，优选为10分钟以上12小时以下。另外，搅拌可以于接触时的温度或更高的温度进行，可以与前述接触时的温度同样地为室温，也可以是下一工序中的生物素的L-赖氨酸盐的溶液与析出溶剂接触时的温度。
生成的生物素的L-赖氨酸盐及表生物素的L-赖氨酸盐可以各自处于在水中溶解或溶剂化的状态，本发明中，包括这些状态在内，称为生物素的L-赖氨酸盐的溶液。
在生物素的L-赖氨酸盐的溶液中生成生物素的L-赖氨酸盐这一情况例如可通过核磁共振(NMR)波谱分析来确认。
(使生物素的L-赖氨酸盐析出的工序)
在制造方法(1)中，接着，使生物素的L-赖氨酸盐从上述工序(得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液的工序)中得到的生物素的L-赖氨酸盐的溶液中析出，得到生物素的L-赖氨酸盐的析出物。该工序相当于工序(b)。
生物素的L-赖氨酸盐的溶液中，除了包含生物素的L-赖氨酸盐以外，可能包含表生物素的L-赖氨酸盐。因此，优选仅将生物素的L-赖氨酸盐从生物素的L-赖氨酸盐的溶液中分离。作为将生物素的L-赖氨酸盐从生物素的L-赖氨酸盐的溶液中分离的方法，可举出将使生物素的L-赖氨酸盐选择性地溶解或选择性地析出的溶剂、与生物素的L-赖氨酸盐的溶液混合的方法。从容易操作的方面考虑，优选通过将生物素的L-赖氨酸盐的溶液与使生物素的L-赖氨酸盐选择性地析出的溶剂(以下，也称为“析出溶剂”)接触，从而使生物素的L-赖氨酸盐析出，得到生物素的L-赖氨酸盐的析出物。
作为析出溶剂，优选使用包含选自由甲醇、乙醇、2-丙醇、丙酮及乙腈组成的组中的至少一种的有机溶剂，更优选使用由选自由甲醇、乙醇、2-丙醇、丙酮及乙腈组成的组中的至少一种构成的有机溶剂。作为析出溶剂，从对生物素的L-赖氨酸盐的选择性高的方面考虑，优选使用包含选自由乙醇及2-丙醇组成的组中的至少一种的有机溶剂，更优选使用由选自由乙醇及2-丙醇组成的组中的至少一种构成的有机溶剂。从提高生物素的L-赖氨酸盐的纯度和收率这样的方面考虑，更优选使用2-丙醇。
根据一例，相对于1g粗生物素而言的析出溶剂的使用量例如为1mL以上200mL以下，优选为10mL以上100mL以下，更优选为32mL以上50mL以下。根据另一例，相对于1g粗生物素而言的析出溶剂的使用量例如为5mL以上50mL以下，优选为8mL以上20mL以下。
水与析出溶剂的体积比(析出溶剂/水)例如为1以上50以下，优选为5以上30以下。体积比大时，有生物素的L-赖氨酸盐的收率提高的倾向。另一方面，体积比小时，有生物素的L-赖氨酸盐中包含的表生物素或其盐的量降低的倾向。从能够得到表生物素或其盐少的高纯度的生物素的L-赖氨酸盐的方面考虑，特别优选使相对于1g粗生物素而言的析出溶剂的使用量以及水与析出溶剂的体积比(析出溶剂/水)为上述范围。需要说明的是，在作为析出溶剂使用多种析出溶剂的情况下，析出溶剂的体积是指多种析出溶剂的合计体积。
生物素的L-赖氨酸盐的溶液与析出溶剂的接触时的温度例如为0℃以上100℃以下，优选为40℃以上80℃以下。若使生物素的L-赖氨酸盐的溶液与析出溶剂接触，则生物素的L-赖氨酸盐析出，成为生物素的L-赖氨酸盐的悬浮液。若于更高温下进行生物素的L-赖氨酸盐的溶液与析出溶剂的接触，则生物素的L-赖氨酸盐的溶液的流动性提高，生物素的L-赖氨酸盐的溶液与析出溶剂充分接触，因此生物素的L-赖氨酸盐的析出量增加，有生物素的L-赖氨酸盐的收率提高的倾向。需要说明的是，可以在使加热或冷却至上述接触温度的生物素的L-赖氨酸盐的溶液与析出溶剂接触后进一步对所得的混合物进行加热。
生物素的L-赖氨酸盐的溶液与析出溶剂的接触通过向生物素的L-赖氨酸盐的溶液中添加析出溶剂来进行即可。需要说明的是，析出溶剂可以分多次添加于生物素的L-赖氨酸盐的溶液中。例如，可以在搅拌下滴加析出溶剂，也可以在将第1析出溶剂添加于生物素的L-赖氨酸盐的溶液中并搅拌一定时间后，向其中进一步添加第2析出溶剂并搅拌一定时间。第1析出溶剂与第2析出溶剂可以使用彼此不同的种类的溶剂，也可以使用同一种溶剂。另外，第1析出溶剂的量与第2析出溶剂的量可以相同，也可以不同。
在得到生物素的L-赖氨酸盐的悬浮液时，优选在使生物素的L-赖氨酸盐的溶液与析出溶剂接触后将得到的混合物搅拌混合。搅拌时间例如为1分钟以上24小时以下，优选为10分钟以上12小时以下。搅拌优选于接触时的温度或更高的温度进行，例如优选于0℃以上100℃以下、优选40℃以上80℃以下的温度进行搅拌。若在更高温度下进行生物素的L-赖氨酸盐的溶液与析出溶剂的混合物的搅拌，则混合物的流动性提高，生物素的L-赖氨酸盐的溶液与析出溶剂充分接触，因此生物素的L-赖氨酸盐的析出量增加，有生物素的L-赖氨酸盐的收率提高的倾向。
在得到生物素的L-赖氨酸盐的悬浮液时，优选在将生物素的L-赖氨酸盐的溶液与析出溶剂的混合物于上述温度搅拌混合后进行冷却，并搅拌混合。生物素的L-赖氨酸盐的溶液与析出溶剂的混合物的冷却温度例如设为-20℃以上10℃以下即可，优选设为-10℃以上10℃以下。若将生物素的L-赖氨酸盐的溶液与析出溶剂的混合物冷却，则生物素的L-赖氨酸盐的析出量增加，有生物素的L-赖氨酸盐的收率提高的倾向。另外，搅拌时间例如设为1分钟以上24小时以下，优选设为10分钟以上12小时以下。
生物素的L-赖氨酸盐的析出物通过过滤等从生物素的L-赖氨酸盐的悬浮液中取出即可。优选然后用清洗溶剂进行清洗。作为清洗溶剂，使用与析出溶剂相同种类的溶剂。通过使清洗后的析出物干燥，得到生物素的L-赖氨酸盐的固态物。生物素的L-赖氨酸盐例如为粉末状。
(制造方法(2))
在制造方法(2)中，在包含选自由醇、丙酮及乙腈组成的组中的至少一种的有机溶剂中，使粗生物素与L-赖氨酸接触，得到生物素的L-赖氨酸盐的悬浮液。该工序为工序(a)的一个方式。
在有机溶剂中使粗生物素与L-赖氨酸接触的方法没有特别限制。有机溶剂、粗生物素及L-赖氨酸的添加顺序也没有特别限制，只要在有机溶剂中将粗生物素与L-赖氨酸混合即可。
相对于1g粗生物素而言的有机溶剂的使用量例如为1mL以上，优选为5mL以上，更优选为8mL以上。生物素的L-赖氨酸盐在醇中基本不溶解，因此不影响收量。因此，有机溶剂的使用量的上限没有限制，但考虑到操作性时，优选为100mL以下，更优选为50mL以下。
用于使粗生物素与L-赖氨酸接触的有机溶剂优选为由选自由醇、丙酮及乙腈组成的组中的至少一种构成的有机溶剂，更优选为醇。如上所述，从能够得到表生物素或其盐少的高纯度的生物素的L-赖氨酸盐的方面考虑，醇优选包含选自由甲醇、乙醇及2-丙醇组成的组中的至少一种，其中，优选使用乙醇。
粗生物素与L-赖氨酸的接触时的温度没有特别限制，例如为0℃以上100℃以下，优选为20℃以上80℃以下。
若在有机溶剂中使粗生物素与L-赖氨酸接触，则粗生物素和L-赖氨酸在有机溶剂中逐渐溶解，生成的生物素的L-赖氨酸盐析出，最终成为生物素的L-赖氨酸盐的悬浮液。
优选在使粗生物素与L-赖氨酸在有机溶剂中接触后将得到的混合物搅拌混合。搅拌时间例如为1分钟以上24小时以下，优选为30分钟以上12小时以下。搅拌优选于接触时的温度或更高的温度进行，例如于0℃以上100℃以下、优选40℃以上80℃以下的温度进行搅拌是优选的。若于更高温下进行混合物的搅拌，则混合物的流动性提高，生物素与L-赖氨酸充分接触，因此生物素的L-赖氨酸盐的析出量增加，有生物素的L-赖氨酸盐的收率提高的倾向。
得到的生物素的L-赖氨酸盐的悬浮液优选于上述温度搅拌混合后冷却，并进行搅拌混合。生物素的L-赖氨酸盐的悬浮液的冷却温度例如设为-20℃以上10℃以下即可，优选设为-10℃以上10℃以下。若将生物素的L-赖氨酸盐的悬浮液冷却，则生物素的L-赖氨酸盐的析出量增加，有生物素的L-赖氨酸盐的收率提高的倾向。另外，搅拌时间例如为1分钟以上24小时以下，优选为30分钟以上12小时以下。
生物素的L-赖氨酸盐的析出物通过过滤等从生物素的L-赖氨酸盐的悬浮液中取出即可。然后，优选用清洗溶剂进行清洗。作为清洗溶剂，使用与粗生物素和L-赖氨酸接触时使用的醇同样种类的醇。通过使清洗后的析出物干燥，从而得到生物素的L-赖氨酸盐的固态物。生物素的L-赖氨酸盐例如为粉末状。
(生物素的制造方法)
使由本发明的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法得到的生物素的L-赖氨酸盐与酸接触，由此将生物素的L-赖氨酸盐分解，能够得到生物素。典型而言，通过使生物素的L-赖氨酸盐与酸接触，固体状的生物素析出。
在本发明的生物素的制造方法中，生物素是将基本不含表生物素或其盐的高纯度的生物素的L-赖氨酸盐分解而得到的，因此能够使所得的生物素中的表生物素的基于HPLC面积百分率的含量非常低。就得到的生物素中的表生物素的基于HPLC面积百分率的含量而言，根据一例，为0.1％以下，根据另一例，为0.01％以下，根据另一例，为0.006％以下。该含量的下限值为0％或检测极限值。
作为酸，例如，可以使用选自由盐酸、硫酸、甲烷磺酸、磷酸、磷酸氢钠、磷酸氢钾及柠檬酸组成的组中的至少1种酸。作为酸，优选使用盐酸。若使用盐酸，则有生物素的L-赖氨酸盐中可能包含的表生物素等杂质量降低的倾向。盐酸的浓度例如设为1质量％以上20质量％以下即可。另外，也可以代替酸而使用能够生成上述酸的酸性盐。作为酸性盐，优选使用选自由硫酸氢钾、硫酸氢钠、磷酸氢钠及磷酸氢钾组成的组中的至少1种。也可以并用酸和酸性盐。
相对于1摩尔的生物素的L-赖氨酸盐而言的酸的使用量例如为0.1摩尔以上20摩尔以下，优选为0.5摩尔以上10摩尔以下，更优选为1.0摩尔以上3.0摩尔以下。
生物素的L-赖氨酸盐与酸的接触可以在使生物素的L-赖氨酸盐溶解于溶解溶剂之后进行。通过与酸的接触，生物素析出。生物素的L-赖氨酸盐的溶解溶剂优选包含选自由水、甲醇、乙醇、2-丙醇、丙酮及乙腈组成的组中的至少1种。作为溶解溶剂，更优选使用水。
相对于1g生物素的L-赖氨酸盐而言的溶解溶剂的量例如为1mL以上100mL以下，优选为1mL以上30mL以下，更优选为1mL以上15mL以下。
使生物素的L-赖氨酸盐溶解于溶解溶剂中后，与酸的接触优选在加热下进行。接触时的温度例如为50℃以上120℃以下，优选为70℃以上100℃以下。
与酸的接触优选通过向使生物素的L-赖氨酸盐溶解于溶解溶剂而得的溶液中滴加酸来进行。酸的滴加所耗费的时间例如为10分钟以上2小时以下，优选为15分钟以上2小时以下。
优选一边搅拌生物素的L-赖氨酸盐的溶液一边添加酸而使其接触，添加酸后也于接触时的温度搅拌。添加酸后的搅拌时间例如设为1分钟以上5小时以下，优选设为20分钟以上2小时以下。
生物素的L-赖氨酸盐的溶液与酸的混合溶液优选于上述温度搅拌后进行冷却。生物素的L-赖氨酸盐的溶液与酸的混合溶液的冷却温度例如设为-20℃以上10℃以下，优选设为-10℃以上10℃以下。若将生物素的L-赖氨酸盐的溶液与酸的混合溶液冷却，则生物素的析出量增加，有生物素的收率提高的倾向。
生物素的L-赖氨酸盐的溶液与酸的混合溶液优选一边搅拌一边冷却。生物素的L-赖氨酸盐的溶液与酸的混合溶液的冷却时间例如设为1分钟以上5小时以下，优选设为20分钟以上2小时以下。
生物素的析出物只要通过过滤等从加入有酸的生物素的L-赖氨酸盐的溶液中取出即可。然后，可以使用清洗溶剂，对从生物素的L-赖氨酸盐分离得到的生物素的固态物进行清洗。作为清洗溶剂，可使用与能够将生物素的L-赖氨酸盐溶解的溶解溶剂同样的溶剂。将清洗后的固态物例如于常温进行干燥，由此得到高纯度的生物素。
以这样的方式得到的生物素不含表生物素等杂质，因此能够实现非常高的纯度。就得到的高纯度生物素中的生物素的基于HPLC面积百分率的含量(纯度)而言，根据一例，为99.96％以上。基于HPLC面积百分率的含量(纯度)的上限值为100％。
需要说明的是，为了进一步提高纯度，可以对利用以上方法得到的生物素进一步实施上述的中和晶析处理、活性炭处理等纯化处理，也可以将基于L-赖氨酸的中和晶析处理重复进行多次。
实施例
以下举出例子，更详细地说明本发明，但这些例子不限定本发明的范围。
＜纯度测定＞
使用高效液相色谱(HPLC)，以下述的条件测定制造例中得到的粗生物素、实施例中得到的干燥后的生物素的L-赖氨酸盐、以及实施例中得到的干燥后的生物素中的、生物素及表生物素的基于HPLC面积百分率的含量。
需要说明的是，生物素的基于HPLC面积百分率的含量以用下述条件测得的、生物素的峰的面积值相对于除了溶剂的峰及L-赖氨酸的峰以外的全部峰的面积值的合计而言的比例的形式求出。就表生物素的基于HPLC面积百分率的含量而言，除了代替生物素的峰的面积值而使用表生物素的峰的面积值这一点以外，与上述同样地求出。
装置：Waters Corporation制Waters Alliance(注册商标)e2695检测器：紫外分光光度计Waters 2489
测定波长：200nm
流动相A：20mM KH2PO4水溶液(pH3)
流动相B：乙腈
流动相的送液：
0-30分钟：流动相A 92％、流动相B 8％
30-35分钟：流动相A 20％、流动相B 80％
35-40分钟：流动相A 92％、流动相B 8％
流速：1.0mL/min
柱温度：40℃
柱、填充剂：XBridge C18、5μm(4.6x150mm)
L-赖氨酸的RT：1.493
生物素的RT：11.912
表生物素的RT：15.729。
＜粗生物素的制造例1＞
(内酯化合物(LCT)的合成)
首先，利用专利文献1中记载的方法，由脲基体(URD)经历3个工序，合成了15.00g的内酯化合物(LCT)。
(硫代内酯化合物(DTL)的合成)
将内酯化合物15.00g(0.047mol)、乙酸钾盐7.31g(0.074mol)、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)22.5mL加入200mL四颈瓶中，在室温、氮气流下搅拌而得到混合物。
将该混合物加热至125℃的温度后，将硫代乙酸4.25g(0.056mol)分成十分之一的量每隔3分钟加入，于125℃的温度搅拌2小时，得到包含硫代内酯化合物的混合物。
接着，将该混合物冷却至成为80℃的温度后，加入15mL的DMA。向其中，经30分钟进一步加入40mL的水，于25℃以上30℃以下的温度搅拌2小时，得到包含硫代内酯化合物的析出物的混合物。将其过滤，滤出硫代内酯化合物的析出物。将滤出的硫代内酯化合物的析出物用清洗液进行清洗。作为清洗液，使用10mL的丙酮与20mL的水的混合溶剂。清洗后的硫代内酯化合物的析出物的量为16.34g。使用HPLC在上述的条件下进行测定，结果清洗后的硫代内酯化合物的析出物(湿体)中包含的硫代内酯化合物的量为13.39g，根据内酯化合物的收率为85％(步骤4)。
(5-碘代戊酸乙基锌的合成)
在氮气氛下，使锌末(hakusuitech公司制R末，4.29g，65.6mmol)悬浮于四氢呋喃(THF、7.0mL)、甲苯(4.9mL)的混合溶剂中，于75℃经30分钟滴加1,2-二溴乙烷(2.57g、13.7mmol)，于相同温度搅拌30分钟。然后，于55℃经30分钟滴加5-碘代戊酸乙酯(I-TAI7.0g，27.3mmol)，于相同温度搅拌3小时。取一部分反应液，利用上述方法以气相色谱进行分析，结果向锌化合物的转化率为97.96％。
(乙烯基硫醚体(DVE)的合成)
将反应液冷却至25℃，添加硫代内酯化合物(6.48g，19.1mmol)、甲苯(14mL)。然后，于相同温度添加10％Pd/C(179.4mg，0.169mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF，1.8mL)悬浮液，于40℃搅拌3小时，于25℃搅拌14小时。
反应结束后，于25℃添加16％盐酸(14mL)，于相同温度搅拌1小时后，将反应液过滤。将滤液于40℃搅拌1小时后，用水(14mL，2x21mL)、5％亚硫酸钠水溶液(21mL)、5％碳酸氢钠水溶液(21mL)、水(14mL)对有机层进行清洗、水洗、浓缩而得到乙烯基硫醚体。用高效液相色谱对得到的有机层进行分析，结果向乙烯基硫醚体的转化率为98.37％(步骤5)。
(N,N’-二苄基生物素(HVC)的合成)
将该乙烯基硫醚体(最大19.1mmol)溶解于甲醇(59mL)及水(16mL)的混合液中，加入Pd(OH)2/C(50质量％湿式，0.59g)，在11℃、氢压0.9MPa的条件下进行接触还原12小时。反应结束后，将反应液过滤，向滤液中加入31质量％NaOH水溶液(7.01g)，于40℃搅拌混合2小时。氢化结束后，向反应液中加入10质量％盐酸，使pH为1。将甲醇减压蒸馏除去，将生成物用乙酸乙酯萃取，并进行水洗、浓缩，由此得到包含N,N’-二苄基生物素的生成物。该生成物包含作为副产物产生的N,N’-二苄基生物素的差向异构体。
(生物素(BIF)的合成)
于室温向N,N’-二苄基生物素(2.04g，4.81mmol)中加入均三甲苯(6.6mL)和硫酸(1.7mL)，于100℃搅拌2.5小时。反应结束后，将均三甲苯除去，加入甲苯(7.7mL)，搅拌10分钟。将甲苯除去后，在将反应液保持为80℃的状态下将水(25mL)分8份、以10分钟间隔加入，于相同温度搅拌10分钟。将反应液放置冷却后，冷却至5℃，搅拌3小时。将得到的晶体滤出，用水(8.2mL)、丙酮(10mL)进行清洗。然后，于60℃减压干燥16小时，由此得到生物素(1.02g，收率86.5％)。以下，也将该生物素称为粗生物素。该粗生物素中的生物素的基于HPLC面积百分率的含量(纯度)为99.914％，表生物素的基于HPLC面积百分率的含量为0.037％。
＜实施例1＞
(生物素的L-赖氨酸盐BLS1的制造)
将制造例1中得到的粗生物素1.0g(4.09mmol)、758mg(4.50mmol)的L-赖氨酸、和5mL的蒸馏水依次加入反应容器中，进行搅拌、混合，使之溶解，得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液。将该溶液在搅拌下加热至60℃后，滴加30mL的2-异丙醇(IPA)，于相同温度搅拌30分钟。将滴加后的溶液在搅拌下冷却至5℃后，保持在5℃搅拌一晚，使生物素的L-赖氨酸盐析出。通过过滤将析出的生物素的L-赖氨酸盐取出，于25℃减压干燥，得到干燥后的生物素的L-赖氨酸盐。干燥后的生物素的L-赖氨酸盐的量为1.32g，其收率为82.67％。以下，也将该生物素的L-赖氨酸盐称为生物素的L-赖氨酸盐BLS1。
针对得到的生物素的L-赖氨酸盐BLS1，以400MHz进行1H-NMR波谱分析，以下示出结果。作为溶剂，使用重水(D2O)。
δ4.60(m，1H)
4.46(m，1H)
3.72(t，1H)
3.36(m，1H)
3.02(m，3H)
2.80(d，1H)
2.20(t，2H)
1.88(m，2H)
1.75(m，3H)
1.62(m，3H)
1.40-1.55(m，4H)。
＜实施例2＞
(生物素的L-赖氨酸盐BLS2的制造)
将制造例1中得到的粗生物素1.0g(4.09mmol)、758mg(4.50mmol)的L-赖氨酸、和5mL的蒸馏水依次加入反应容器中，搅拌、混合，使之溶解，得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液。将该溶液在搅拌下加热至60℃后，滴加40mL的2-异丙醇(IPA)，于相同温度搅拌30分钟。将滴加后的溶液在搅拌下冷却至5℃后，保持在5℃搅拌一晚，使生物素的L-赖氨酸盐析出。通过过滤将析出的生物素的L-赖氨酸盐取出，于25℃减压干燥，得到干燥后的生物素的L-赖氨酸盐。干燥后的生物素的L-赖氨酸盐的量为1.58g，其收率为98.67％。以下，也将该生物素的L-赖氨酸盐称为生物素的L-赖氨酸盐BLS2。
＜实施例3＞
(生物素的L-赖氨酸盐BLS3的制造)
将制造例1中得到的粗生物素1.0g(4.09mmol)、758mg(4.50mmol)的L-赖氨酸、和5mL的蒸馏水依次加入反应容器中，搅拌、混合，使之溶解，得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液。将该溶液在搅拌下加热至60℃后，滴加50mL的2-异丙醇(IPA)，于相同温度搅拌30分钟。将滴加后的溶液在搅拌下冷却至5℃后，保持在5℃搅拌1小时，使生物素的L-赖氨酸盐析出。通过过滤将析出的生物素的L-赖氨酸盐取出，用25mL的2-异丙醇对其进行清洗。于25℃减压干燥，得到干燥后的生物素的L-赖氨酸盐。干燥后的生物素的L-赖氨酸盐的量为1.61g，其收率为quant.。以下，也将该生物素的L-赖氨酸盐称为生物素的L-赖氨酸盐BLS3。
＜实施例4＞
(生物素的L-赖氨酸盐BLS4的制造)
将制造例1中得到的粗生物素1.0g(4.09mmol)、758mg(4.50mmol)的L-赖氨酸、和4mL的蒸馏水依次加入反应容器中，搅拌、混合，使之溶解，得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液。将该溶液在搅拌下加热至60℃后，滴加32mL的2-异丙醇(IPA)，于相同温度搅拌30分钟。将滴加后的溶液在搅拌下冷却至5℃后，保持在5℃搅拌1小时，使生物素的L-赖氨酸盐析出。通过过滤将析出的生物素的L-赖氨酸盐取出，用16mL的2-异丙醇对其进行清洗。于25℃减压干燥，得到干燥后的生物素的L-赖氨酸盐。干燥后的生物素的L-赖氨酸盐的量为1.61g，其收率为quant.。以下，也将该生物素的L-赖氨酸盐称为生物素的L-赖氨酸盐BLS4。
＜实施例5＞
(生物素的L-赖氨酸盐BLS5的制造)
将制造例1中得到的粗生物素1.0g(4.09mmol)、758mg(4.50mmol)的L-赖氨酸、和1mL的蒸馏水依次加入反应容器中，搅拌、混合，使之溶解，得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液。将该溶液在搅拌下加热至60℃后，滴加20mL的乙醇(EtOH)，于相同温度搅拌30分钟。将滴加后的溶液在搅拌下冷却至5℃后，保持在5℃搅拌1小时，使生物素的L-赖氨酸盐析出。通过过滤将析出的生物素的L-赖氨酸盐取出，用10mL的冷乙醇对其进行清洗。于25℃减压干燥，得到干燥后的生物素的L-赖氨酸盐。干燥后的生物素的L-赖氨酸盐的量为1.58g，其收率为98.60％。以下，也将该生物素的L-赖氨酸盐称为生物素的L-赖氨酸盐BLS5。
＜实施例6＞
(生物素的L-赖氨酸盐BLS6的制造)
将制造例1中得到的粗生物素1.0g(4.09mmol)、758mg(4.50mmol)的L-赖氨酸、和0.5mL的蒸馏水依次加入反应容器中，搅拌、混合，使之溶解，得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液。将该溶液在搅拌下加热至60℃后，滴加10mL的乙醇(EtOH)，于相同温度搅拌30分钟。将滴加后的溶液在搅拌下冷却至5℃后，保持在5℃搅拌1小时，使生物素的L-赖氨酸盐析出。通过过滤将析出的生物素的L-赖氨酸盐取出，用25mL的冷乙醇对其进行清洗。于25℃减压干燥，得到干燥后的生物素的L-赖氨酸盐。干燥后的生物素的L-赖氨酸盐的量为1.61g，其收率为quant.。以下，也将该生物素的L-赖氨酸盐称为生物素的L-赖氨酸盐BLS6。
＜实施例7＞
(生物素的L-赖氨酸盐BLS7的制造)
将制造例1中得到的粗生物素5g(20.47mmol)、3.29g(20.51mmol)的L-赖氨酸、和5mL的蒸馏水依次加入反应容器中，搅拌、混合，使之溶解，得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液。将该溶液在搅拌下加热至60℃后，滴加100mL的乙醇(EtOH)，于相同温度搅拌30分钟。将滴加后的溶液在搅拌下冷却至5℃后，保持在5℃搅拌1小时，使生物素的L-赖氨酸盐析出。通过过滤将析出的生物素的L-赖氨酸盐取出，用25mL的冷乙醇对其进行清洗。于25℃减压干燥，得到干燥后的生物素的L-赖氨酸盐。干燥后的生物素的L-赖氨酸盐的量为7.93g，其收率为99.24％。以下，也将该生物素的L-赖氨酸盐称为生物素的L-赖氨酸盐BLS7。
＜实施例8＞
(生物素的L-赖氨酸盐BLS8的制造)
将制造例1中得到的粗生物素1.0g(4.09mmol)、758mg(4.50mmol)的L-赖氨酸、和20mL的乙醇(EtOH)依次加入反应容器中，搅拌、混合，得到生物素的L-赖氨酸盐的悬浮液。将该悬浮液在搅拌下加热至60℃后，于相同温度搅拌30分钟，然后冷却至5℃，于相同温度度搅拌1小时。通过过滤，将生物素的L-赖氨酸盐取出，用25mL的乙醇对其进行清洗。于25℃减压干燥，得到干燥后的生物素的L-赖氨酸盐。干燥后的生物素的L-赖氨酸盐的量为1.61g，其收率为quant.。以下，也将该生物素的L-赖氨酸盐称为生物素的L-赖氨酸盐BLS8。
＜实施例9＞
(生物素的L-赖氨酸盐BLS9的制造)
将制造例1中得到的粗生物素1.0g(4.09mmol)、758mg(4.50mmol)的L-赖氨酸、和10mL的乙醇(EtOH)依次加入反应容器中，搅拌、混合，得到生物素的L-赖氨酸盐的悬浮液。将该悬浮液在搅拌下加热至60℃后，于相同温度搅拌30分钟，然后冷却至5℃，于相同温度度搅拌1小时。通过过滤，将生物素的L-赖氨酸盐取出，用15mL的冷乙醇对其进行清洗。于25℃减压干燥，得到干燥后的生物素的L-赖氨酸盐。干燥后的生物素的L-赖氨酸盐的量为1.61g，其收率为quant.。以下，也将该生物素的L-赖氨酸盐称为生物素的L-赖氨酸盐BLS9。
＜实施例10＞
(生物素的L-赖氨酸盐BLS10的制造)
将制造例1中得到的粗生物素1.0g(4.09mmol)、758mg(4.50mmol)的L-赖氨酸、和8mL的乙醇(EtOH)依次加入反应容器中，搅拌、混合，得到生物素的L-赖氨酸盐的悬浮液。将该悬浮液在搅拌下加热至60℃后，于相同温度搅拌30分钟，然后冷却至5℃，于相同温度度搅拌1小时。通过过滤，将生物素的L-赖氨酸盐取出，用20mL的冷乙醇对其进行清洗。于25℃减压干燥，得到干燥后的生物素的L-赖氨酸盐。干燥后的生物素的L-赖氨酸盐的量为1.62g，其收率为quant.。以下，也将该生物素的L-赖氨酸盐称为生物素的L-赖氨酸盐BLS10。
＜实施例11＞
(生物素的制造)
使6.0g(15.37mmol)的干燥后的生物素的L-赖氨酸盐BLS7溶解于21.0mL的蒸馏水中，得到溶液。将该溶液在搅拌下加热至90℃后，保持90℃，经30分钟滴加11.2g(15.37mmol)的10质量％盐酸。将滴加盐酸后的悬浮液于相同温度搅拌30分钟，在搅拌下冷却至5℃后，于相同温度搅拌30分钟。通过过滤将析出的生物素取出，用12mL的蒸馏水对其进行清洗。将清洗后的生物素于25℃减压干燥，得到干燥后的生物素。干燥后的生物素的量为3.59g，其收率为95.58％。
将与实施例1至10的生物素的L-赖氨酸盐的制造有关的条件及测定结果归纳于下述表1。表1中的“含量”为基于HPLC面积百分率的含量(％)。
[表1]
将与实施例11的生物素的制造有关的条件、以及与制造例1、实施例11有关的测定结果归纳于下述表2。表2中的“含量”为基于HPLC面积百分率的含量(％)。
[表2]
如表1所示，在溶剂中使粗生物素与L-赖氨酸接触，从生物素的L-赖氨酸盐的溶液或悬浮液中分离出生物素的L-赖氨酸盐，由此得到生物素的L-赖氨酸盐，能够减少表生物素的量。另外，如表2所示，就使生物素的L-赖氨酸盐在溶剂中与酸接触的实施例11涉及的干燥后的生物素而言，基本不含表生物素，能够提高生物素的纯度。

Claims (13)

1.生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，其包括以下的工序：
(a)在溶剂中使粗生物素与L-赖氨酸接触，得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液或悬浮液的工序；及，
(b)在工序(a)中得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液的情况下，使生物素的L-赖氨酸盐从生物素的L-赖氨酸盐的溶液中析出的工序。
2.如权利要求1所述的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，其中，溶剂包含选自由水、甲醇、乙醇、2-丙醇、丙酮及乙腈组成的组中的至少一种。
3.如权利要求1或2所述的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，其中，工序(a)是在水中使粗生物素与L-赖氨酸接触、得到生物素的L-赖氨酸盐的溶液的工序。
4.如权利要求1～3中任一项所述的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，其中，工序(b)是通过使生物素的L-赖氨酸盐的溶液与析出溶剂接触、从而使生物素的L-赖氨酸盐析出的工序。
5.如权利要求4所述的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，其中，析出溶剂包含选自由甲醇、乙醇、2-丙醇、丙酮及乙腈组成的组中的至少一种。
6.如权利要求4或5所述的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，其中，水与析出溶剂的体积比(析出溶剂/水)为5以上30以下。
7.如权利要求4～6中任一项所述的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，其中，工序(b)是将生物素的L-赖氨酸盐的溶液加热至40℃以上80℃以下后与析出溶剂接触，然后冷却至-10℃以上10℃以下，由此使生物素的L-赖氨酸盐析出的工序。
8.如权利要求1或2所述的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，其中，工序(a)是在包含选自由醇、丙酮及乙腈组成的组中的至少一种的有机溶剂中使粗生物素与L-赖氨酸接触，得到生物素的L-赖氨酸盐的悬浮液的工序。
9.如权利要求8所述的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，其中，有机溶剂为醇。
10.如权利要求8或9所述的生物素的L-赖氨酸盐的制造方法，其中，相对于1g粗生物素，有机溶剂的使用量为8mL以上。
11.生物素的制造方法，其包括在由权利要求1～10中任一项所述的方法制造生物素的L-赖氨酸盐后，使该生物素的L-赖氨酸盐与酸接触，得到生物素的工序。
12.生物素的L-赖氨酸盐。
13.如权利要求12所述的生物素的L-赖氨酸盐，其中，表生物素的基于HPLC面积百分率的含量为0.035％以下。
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