TW202214278A - 馬鬱蘭發酵物及其利用 - Google Patents

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倉澤智子
柴田慎也
伊澤直樹
伊藤雅彦
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日商養樂多本社股份有限公司
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Abstract

本發明提供一種提高活性用之經改良之源自馬鬱蘭的材料。
本發明關於一種發酵物，係以馬鬱蘭或其處理物作為原料的藉由選自屬於乳桿菌屬(Lactobacillus屬)的微生物之1種或2種以上微生物而得之發酵物。此發酵物有用於作為皮膚外用劑、化妝料之調配材料等。

Description

馬鬱蘭發酵物及其利用
本發明關於有用於作為皮膚外用劑等的植物發酵物，更詳細而言，係關於馬鬱蘭(marjoram)發酵物及含有此發酵物之皮膚外用劑。
馬鬱蘭為原產於地中海地區之多年生草本植物且為野生種，並作為草藥或生藥用而被廣泛栽培。以往係將植物萃取物或發酵物用於化妝料等，但關於馬鬱蘭作為皮膚外用劑之利用已被報導。亦即，例如，專利文獻1中，已記載以馬鬱蘭之乙醇萃取物促進熱休克蛋白之表現，抑制黑色素生成。又，已記載亦可作為皮膚外用劑而被提供。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
專利文獻1：日本特開2011-190200號公報
惟，由以往萃取物所進行之方法，無法充分引導出自馬鬱蘭而得之活性。
因此，本發明之目的為提供提高活性用之經改良之源自馬鬱蘭的材料。又，藉此提供新穎之皮膚外用劑。
為了達成上述目的，本發明者們勤奮研究，從而完成本發明。
第一，本發明提供一種發酵物，係以馬鬱蘭或其處理物作為原料的藉由選自屬於乳桿菌屬(Lactobacillus屬)的微生物之1種或2種以上微生物而得之發酵物。
於本發明之發酵物中，前述微生物較佳為選自由胚芽乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)、馬利乳桿菌(Lactobacillus mali)、可可豆乳桿菌(Lactobacillus fabifermentans)、及大麥乳桿菌(Lactobacillus hordei)所組成之群組之1種或2種以上微生物。
第二，本發明提供含有上述發酵物之皮膚外用劑。
於本發明之皮膚外用劑中，該皮膚外用劑較佳係為了引發美白效果而使用者。
於本發明之皮膚外用劑中，前述發酵物較佳為具有抑制黑色素生成之作用者。
於本發明之皮膚外用劑中，前述發酵物較佳為具有阻礙(亦稱為抑制)酪胺酸酶之作用者。
根據本發明，由於屬於以馬鬱蘭或其處理物作為原料並將此原料經特定微生物處理而得之發酵物，因此在抑制黑色素生成之活性、阻礙酪胺酸酶之活性等會引發美白效果之活性方面較為優良。故，藉此可提供新穎之皮膚外用劑。
圖1係顯示試驗例2中抑制黑色素生成之活性之調查結果的圖表，圖1(A)為顯示細胞內黑色素生成量(相對於未添加待測試料時之細胞內黑色素量之百分率)變化之調查結果之圖表，圖1(B)為顯示細胞內蛋白質量(相對於未添加待測試料時之細胞內蛋白質量之百分率)變化之調查結果之圖表。
本說明書中之「馬鬱蘭」係與本發明所屬技術領域中具有通常知識者一般所理解之植物同義，具體而言，意指包括唇形科牛至屬之馬鬱蘭(學名：Origanum majorana)。馬鬱蘭為原產於地中海地區之植物，並作為草藥或生藥用而被廣泛栽培，且可容易取得。
於本發明中，使微生物作用於馬鬱蘭或其處理物，而成為該微生物之發酵物。就讓微生物作用之馬鬱蘭的植物體部位而言，可列舉葉部、花部、枝幹部、地上部、根部、全草、或此等部位之混合物等，較佳為葉部、地上部、或此等部位之混合物等，更佳為葉部。就讓微生物作用之 植物體形狀而言，係原來的植物體或其乾燥物之粉碎物、榨汁液、萃取物、或者此等之混合物等，並無特別限制。較佳為榨汁液、萃取物、或此等之混合物等，更佳為萃取物。
就作用於馬鬱蘭或其處理物之微生物而言，可列舉屬於乳桿菌屬(Lactobacillus屬)之微生物等。更具體而言，係胚芽乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)、馬利乳桿菌(Lactobacillus mali)、可可豆乳桿菌(Lactobacillus fabifermentans)、大麥乳桿菌(Lactobacillus hordei)等。若為此等微生物，馬鬱蘭之發酵被良好地促進，並且在會引發美白效果之活性方面較為優良。惟，並非意指可用於本發明之微生物限定為此等菌種。可單獨使用1種微生物於上述原料之處理中，亦可併用2種以上微生物於上述原料之處理中。亦即，可依序進行經由2種以上不同的微生物之處理，亦可一次併用2種以上不同的微生物而進行處理，又，也可組合此等處理。
關於使上述微生物作用於馬鬱蘭或其處理物時之條件，若為馬鬱蘭之成分會因上述微生物而產生某些變化之條件即可，並無特別限制，例如，更佳係會使作用於馬鬱蘭或其處理物之微生物增殖至初始菌數的2至10000倍量，典型而言為5至1000倍量，更典型而言為10至1000倍量之生長條件。若生長不足，便無法良好地進行發酵。
使上述微生物作用於馬鬱蘭或其處理物時，就其微生物生長之輔助材料而言，可使用例如：葡萄糖、果糖、蔗糖、寡糖等醣類；丙胺酸、精胺酸、色胺酸、半胱胺酸等胺基酸類；酪蛋白水解物、蛋白水解物等肽類；酵母萃取物、肉萃取物、大豆萃取物等萃取物類；油酸聚氧乙烯 山梨醇酯等側鏈具有脂肪酸之界面活性劑；或者標準的乳桿菌用培養基構成之例如乳桿菌MRS培養液(Difco)等。
惟，若除了源自馬鬱蘭之成分以外，還有其他成分殘留，從防腐性、使用感等之觀點來看，由於有對所得發酵物之品質造成影響之情況，因此發酵時，調配需要量以上的源自馬鬱蘭之成分以外之成分並非所望。故，使用上述輔助材料時，例如，相對於源自馬鬱蘭之物100質量份，其以外之構成成分的比例較佳設為0.001質量份以上5.0質量份以下，更佳設為0.01質量份以上0.5質量份以下。另一方面，亦可設為在不添加任何非源自馬鬱蘭之原料的狀態下供給於經由上述微生物之處理。
以下更具體說明關於用以獲得本發明之發酵物之不受限的任意態樣。
就要讓上述微生物作用之原料而言，例如，可獲得馬鬱蘭之萃取物，並以其為原料。此時，例如，對植物體之乾燥粉末添加10至200倍量的水或熱水(可使用例如逆滲透膜處理水、離子交換水、自來水、井水、蒸餾水、超純水等)，經加熱處理獲得熱水萃取物，將其直接以萃取懸浮液之狀態作為原料，或將水分任意地蒸發濃縮而作為原料，或者藉由過濾器過濾、離心分離等固液分離手段去除固體部分並獲得上清液而作為原料，並以適當的初始濃度對那樣的原料接種上述微生物，使其作用即可。
經由上述微生物之處理可由按照一般的通氣、靜置培養之方法進行。此時，就初始菌數濃度而言，較佳為1×104CFU/mL以上5×107CFU/mL以下，更佳為1×105CFU/mL以上1×107CFU/mL以下。就溫度條件而言，係20℃至40℃，更佳為25℃至37℃。就處理期間而言， 係12小時至10日，更佳為1至3日。藉由這樣的靜置培養，可使微生物增殖至例如初始菌數之2至10000倍量，典型地為5至1000倍量，更典型地為10至1000倍量，而獲得發酵物。在經由微生物之處理後，可在包括已使用之微生物的狀態下直接作為本發明之發酵物，但從上述之防腐性、使用感等觀點來看，較佳為藉由過濾器過濾、離心分離等固液分離手段去除發酵中所使用之微生物菌體，並將所得之上清液作為發酵物。又，在經由微生物之處理後，亦可將各種溶劑添加於處理物，調製萃取物或稀釋物，而作為本發明之發酵物使用。此處使用之溶劑可列舉水、乙醇、丙醇等低級醇；十六醇、十八醇等高級醇；1,3-丁二醇、1,3-丙二醇、甘油等多元醇等泛用於化妝品中之溶劑，但並不限制於此，可單獨使用或混合兩種以上使用。
本發明之發酵物可直接作為皮膚外用劑使用，或者亦可於皮膚外用劑之製造步驟中調配而使用。具體而言，可適合作為例如乳液、乳霜、清潔劑、按摩霜、防曬乳、隔離霜、粉底霜等型態之化妝料或者其原料而使用。此外，此處所謂的化妝料係包括日本之「有關確保醫藥品、醫療機器等的品質、有效性及安全性等之法律」中所定義之醫藥品、準藥品(quasi drug)、化妝品之意。
又，就皮膚外用劑之型態而言，可為將會作用於皮膚之成分搭載於適當基材部而成之塗抹型面膜(pack)、片狀面膜(mask)、凝膠等，亦即，可適合作為這樣的皮膚外用劑之會作用於皮膚之成分而使用。
又，於本發明之不受限的任意態樣中，上述皮膚外用劑可為標示有為了引發美白效果所使用、具有抑制黑色素生成之作用、具有阻礙酪胺酸酶之作用等機能性之產品。
[實施例]
以下列舉實施例以具體說明本發明，惟，此等實施例並不限制本發明之範圍。
[1.馬鬱蘭萃取物之調製]
1-1.植物
試驗中係使用市售之馬鬱蘭(學名：Origanum majorana)之葉之乾燥物。
1-2.萃取
預培養用之馬鬱蘭萃取物係調製如下。亦即，以植物粉末：水之質量比成為1：20之方式添加水(逆滲透膜處理水，以下稱為「RO水」)，以最終濃度成為0.2w/v%之方式添加葡萄糖及以最終濃度成為0.1w/v%之方式添加酵母萃取物(Difco)，充分攪拌而調製懸浮液。將每3mL懸浮液分注於試管，蓋上鋁蓋，經121℃、15分鐘之高壓滅菌釜而獲得熱水萃取物。
就正式培養用之馬鬱蘭萃取物而言，調製(1)無添加、以及(2)添加有0.2w/v%葡萄糖及0.1w/v%酵母萃取物之2種。亦即，以植物粉末：水之質量比成為1：20之方式添加RO水，無添加，並充分攪拌而調製懸浮液作為上述(1)，或以最終濃度成為0.2w/v%之方式添加葡萄糖及以最終濃度成為0.1w/v%之方式添加酵母萃取物(Difco)，並充分攪拌而調製懸浮 液作為上述(2)。將每10mL之該懸浮液分注於試管，蓋上矽栓，經98℃、100分鐘之高壓滅菌釜而獲得熱水萃取物。
[2.乳酸菌]
所使用之13種乳酸菌顯示於表1。將保存於-80℃之DMSO之菌株接種於乳桿菌MRS培養液(Lactobacilli MRS Broth)(Difco)，於最適培養溫度培養20小時後，以在相同條件下進一步經1次繼代培養者作為菌液，供給於馬鬱蘭萃取物之預培養。此外，所使用之11種乳酸菌(No.5及No.10以外)之各者皆係取得代表了各乳酸菌之屬種的標準菌株(type strain)而使用。所使用之13種菌株可自表1所記載之寄存機構取得。
[表1]
Figure 110120979-A0202-12-0009-1
[試驗例1]
預培養係將菌液以0.5v/v%(初始菌數濃度：約0.5×106至2×107CFU/mL)接種於預培養用之馬鬱蘭萃取物3mL，於有氧環境下，最適溫度中靜置培養48小時。
正式培養係將預培養後之培養物以1v/v%(初始菌數濃度：約0.2×105至3×106CFU/mL)接種於正式培養用之馬鬱蘭萃取物10mL，於有氧環境下，最適溫度中靜置培養72小時。
正式培養後確認活菌數。具體而言，以螺旋接種儀(spiral plater)EDDY JET2(IUL Instruments)，將100μL的正式培養後之培養物之原液或經0.1w/v%之酵母萃取物適當稀釋之液接種於乳桿菌MRS瓊脂平面培養基，於最適溫度培養3日後，以菌落計數器ProtoCOL3(SYNBIOSIS)計數所形成之菌落，算出CFU(菌落形成單位)/mL之值。此外，關於正式培養前之初始菌數，亦經相同方式確認。
[表2]
Figure 110120979-A0202-12-0010-2
其結果為，乳酸菌No.13(嗜熱鏈球菌，Streptococcus thermophilus)於預培養後並未檢測出活菌，而為不適用於以馬鬱蘭為原料之發酵物之調製的菌種或菌株。
上述以外之12株乳酸菌中，經由於馬鬱蘭萃取物中之培養，活菌數較初始菌數增加至少10倍以上。於馬鬱蘭萃取物添加有葡萄糖及酵母萃取物時之影響為活菌數增加之傾向(例：乳酸菌No.11(乳酸片球菌，Pediococcus acidilactici))、幾乎同程度(例：乳酸菌No.5(乾酪乳桿菌，Lactobacillus casei)、乳酸菌No.12(戊糖片球菌，Pediococcus pentosaceus))、受抑制之傾向(例：乳酸菌No.3(玉米乳桿菌，Lactobacillus zeae))，依乳酸菌之種類而不同，並未觀察到一樣的傾向。對於各菌之生長之影響程度，均無非常顯著。
綜上，顯示上述乳酸菌12株，亦即乳酸菌No.1(胚芽乳桿菌胚芽亞種，Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)、乳酸菌No.2(戊糖乳桿菌)、乳酸菌No.3(玉米乳桿菌)、乳酸菌No.4(馬利乳桿菌)、乳酸菌No.5(乾酪乳桿菌)、乳酸菌No.6(可可豆乳桿菌)、乳酸菌No.7(大麥乳桿菌)、乳酸菌No.8(乳酸乳球菌乳酸亞種，Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸菌No.9(假腸膜明串珠菌，Leuconostoc pseudomesenteroides)、乳酸菌No.10(腸膜明串珠菌腸膜亞種，Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides)、乳酸菌No.11(乳酸片球菌)、及乳酸菌No.12(戊糖片球菌)適用於以馬鬱蘭為原料之發酵物之調製。
[試驗例2]
於試驗例1之培養後之活菌數顯示為1×106CFU/mL以上之12種乳酸菌(No.1至12)之中，選擇No.1、2、4、6、7之乳酸菌，針對各乳酸菌之培養物調查抑制黑色素生成之活性。
具體而言，在經由未添加葡萄糖及酵母萃取物之馬鬱蘭萃取物所進行之正式培養結束後，將培養物以3000rpm(1600×g)離心10分鐘，將上清液以0.22μm過濾器進行無菌過濾而獲得發酵上清液。發酵上清液於4℃避光保存後，直至測定為止冷凍保存於-20℃。表3中，顯示所使用之發酵上清液或未發酵之馬鬱蘭萃取物的pH測定結果、以及在105℃加熱3小時後於乾燥器內經放冷而測定時之蒸發殘留物濃度(mg/mL)。
[表3]
Figure 110120979-A0202-12-0012-3
抑制黑色素生成之活性之測定係經以下所示之試驗方法實施。
[1.試驗方法]
(1)細胞
細胞係使用B16小鼠黑色素瘤細胞(B16-F1)。試驗中係使用自購入時算起繼代培養數為第5至10次的細胞。
(2)黑色素生成之抑制試驗
於24孔盤中加入500μL之包含5% FBS之DMEM培養基，以1.4×104細胞/孔(7.5×104細胞/cm2)接種B16黑色素瘤細胞後，於5% CO2、37℃中培養24小時。之後，更換為包含待測試料之含有0.5mM茶鹼之培養基1mL，再培養3日。
就待測試料而言，以樣品原液作為100%，將各乳酸菌之發酵上清液或未發酵之馬鬱蘭萃取物以成為0.5%、1%、2%、5%之調配比例(體積比)之方式添加於培養基中。就對照組而言，以RO水代替各乳酸菌之發酵上清液或未發酵之馬鬱蘭萃取物，並以相同之調配比例添加於培養基。又，就陽性對照組而言，將1%之作為準藥品之美白原料所熟知之熊果素的水溶液添加於培養基(最終濃度：0.15至2.44mM)。
(3)細胞內黑色素生成量
培養結束後將細胞以PBS(-)清洗2次，以99.5%乙醇固定細胞。經風乾去除乙醇後，將1N之NaOH添加於孔中，於80℃加熱30分鐘，獲得使細胞及黑色素溶解而成之細胞溶解液。放冷後，將全量之細胞溶解液移至96孔盤，測定405nm之吸光度。自使用了合成黑色素之檢量線求得每培養孔之細胞內黑色素生成量，相對於對照組之細胞內黑色素生成量係以下式求得。
Figure 110120979-A0202-12-0014-4
(4)細胞內蛋白質量
以超純水(Milli-Q水)將上述細胞溶解液進行10倍稀釋，藉由以BSA作為標準蛋白質之BCA法(Pierce BCA Protein assay kit)進行定量，以下式求得相對於對照組之細胞內蛋白質量。
Figure 110120979-A0202-12-0014-6
(5)IC50值
關於各乳酸菌之發酵上清液或未發酵之馬鬱蘭萃取物、及既定之調配比例，根據進行2至5次試驗之結果，針對細胞內黑色素生成量及細胞內蛋白質量之各者求得50%阻礙濃度(IC50值)。IC50值之計算係將未添加待測試料之各值設為100%時的成為50%之濃度或其推定值。此外，各發酵上清液及未發酵之馬鬱蘭萃取物之濃度係以上述表3所示之蒸發殘留物濃度換算。
[2.結果]
結果彙整並顯示於表4。
[表4]
Figure 110120979-A0202-12-0015-7
其結果為，陽性對照組之熊果素中，細胞內黑色素生成量之IC50值係340μg/mL，相對於此，未發酵之馬鬱蘭萃取物中，IC50值係430μg/mL。另一方面，關於乳酸菌No.1(胚芽乳桿菌胚芽亞種)、乳酸菌No.2(戊糖乳桿菌)、乳酸菌No.4(馬利乳桿菌)、乳酸菌No.6(可可豆乳桿菌)、及乳酸菌No.7(大麥乳桿菌)，於各乳酸菌之發酵上清液中觀察到所有IC50值較未發酵之萃取物低之傾向。又，如圖1所示，相較於未發酵之萃取物，細胞內蛋白質量(相對於未添加待測試料時之細胞內蛋白質量之百分率)之變化並未觀察到多少差異，但關於細胞內黑色素，相較於未發酵之萃取物之細胞內黑色素生成量(相對於未添加待測試料時之細胞內黑色素量之百分率)則顯著降低。
綜上，顯示上述乳酸菌之馬鬱蘭萃取物之發酵物中，相較於未發酵之萃取物，未引起細胞數降低，且提高了抑制黑色素生成之活性。
[試驗例3]
於試驗例1之培養後之活菌數顯示為1×106CFU/mL以上之12種(No.1至12)之中，選擇No.1、2、4、6、7之乳酸菌，以與試驗例2相同方式調製發酵上清液，調查阻礙酪胺酸酶之活性。
阻礙酪胺酸酶之活性之測定係改變Matsuda們之方法(Matsuda H et al.；Studies of cuticle drugs from natural sources.III.Inhibitory effect of Myrica rubra on melanin biosynthesis.,Biol.Pharm.Bull.,18(8),1148-1150(1995))的一部分而實施。具體而言，將各乳酸菌之發酵上清液或未發酵之馬鬱蘭萃取物各50μL(樣品原液)加入96孔微孔盤之各孔，於各孔添加300mM磷酸緩衝液(pH6.8)50μL並混合後，於室溫預培養(pre-incubate)10分鐘。接著，將270U/mL酪胺酸酶溶液(酪胺酸酶：源自蘑菇，Sigma-Aldrich)25μL、0.06w/v%之3,4-二羥基-L-苯基丙胺酸(L-DOPA，富士軟片和光純藥股份有限公司)25μL添加至各孔並混合，於室溫培養(incubate)5分鐘後，測定多巴色素(dopachrome，黑色素生合成之中間體)之最大吸收波長475nm之吸光度。反應系之最終體積為150μL，其中，發酵上清液(樣品原液)之最終調配比例為50μL/150μL。
以下式由所測定之吸光度算出酪胺酸酶阻礙率。式中，「對照組」表示添加有RO水來代替樣品之反應系，「空白」表示添加有50mM磷酸鉀緩衝液來代替酪胺酸酶之反應系。
Figure 110120979-A0202-12-0017-9
S475nm：樣品
SB475nm：空白樣品
C475nm：對照組
CB475nm：空白對照組
試驗係針對各乳酸菌之發酵上清液或未發酵之馬鬱蘭萃取物，進行3次酪胺酸酶反應試驗，而求得其平均與標準差。結果顯示於表5。
[表5]
Figure 110120979-A0202-12-0017-8
其結果為，未發酵之馬鬱蘭萃取物中，酪胺酸酶阻礙率為0%(SD：±3%)，相對於此，各乳酸菌之發酵物中，乳酸菌No.1(胚芽乳桿菌胚芽亞種)中為24%(SD：±4%)，乳酸菌No.2(戊糖乳桿菌)中為20%(SD：±3%)，乳酸菌No.4(馬利乳桿菌)中為24%(SD：±3%)，乳酸菌No.6(可可豆乳桿菌)中為36%(SD：±2%)，乳酸菌No.7(大麥乳桿菌)中為30%(SD：±3%)。
綜上，顯示上述乳酸菌之馬鬱蘭萃取物之發酵物中，相較於未發酵之萃取物，提高了阻礙酪胺酸酶之活性。

Claims (7)

  1. 一種發酵物，係以馬鬱蘭或其處理物作為原料的藉由選自屬於乳桿菌屬(Lactobacillus屬)的微生物之1種或2種以上微生物而得之發酵物。
  2. 如請求項1所述之發酵物，其中，前述微生物係選自由胚芽乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)、馬利乳桿菌(Lactobacillus mali)、可可豆乳桿菌(Lactobacillus fabifermentans)及大麥乳桿菌(Lactobacillus hordei)所組成之群組之1種或2種以上微生物。
  3. 一種皮膚外用劑，其含有請求項1或2所述之發酵物。
  4. 如請求項3所述之皮膚外用劑，係為了引發美白效果而使用者。
  5. 如請求項3或4所述之皮膚外用劑，其中，前述發酵物為具有抑制黑色素生成之作用者。
  6. 如請求項3或4所述之皮膚外用劑，其中，前述發酵物為具有阻礙酪胺酸酶之作用者。
  7. 如請求項5所述之皮膚外用劑，其中，前述發酵物為具有阻礙酪胺酸酶之作用者。
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