TW202320734A - 木槿發酵物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明之課題在於提供一種為了提升活性而經改良之源自木槿的材料。
本發明之發酵物為以木槿或其處理物作為原料，且由選自屬於乳桿菌(lactobacilli)之微生物、屬於乳球菌屬(Lactococcus屬)之微生物、屬於明串珠菌屬(Leuconostoc屬)之微生物、及屬於小球菌屬(Pediococcus屬)之微生物之1種或2種以上的微生物所形成者。此發酵物有用於作為皮膚外用劑、化妝品中的調配材料等。

Description

木槿發酵物及其用途
本發明係關於有用於作為皮膚外用劑等的植物發酵物，更詳細而言，係關於木槿發酵物、及含有此的皮膚外用劑。
木模係一種自然生長於地中海沿岸之歐洲原產的多年生草本植物，作為藥草和生藥被廣泛種植。以往，植物萃取物和發酵物被用於化妝品等，據報導木槿亦被用作皮膚外用劑。例如，專利文獻1中，記載木槿之1,3-丁二醇萃取物具酪胺酸酶抑制活性，而將此使用作為美白化妝料的調配材料。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]日本特開昭60-104005號公報
然而，以往之方法中，未能充分地發揮由木槿所致的活性。
因此，本發明之目的在於提供一種為了提升活性而經改良之源自木槿的材料。此外，藉此提供新穎的皮膚外用劑。
為了達成上述目的，本發明者精心研究從而完成本發明。
本發明之第1項在於提供一種發酵物，其係以木槿或其處理物作為原料，且由選自屬於乳桿菌(lactobacilli)之微生物、屬於乳球菌屬(Lactococcus屬)之微生物、屬於明串珠菌屬(Leuconostoc屬)之微生物、及屬於小球菌屬(Pediococcus屬)之微生物之1種或2種以上的微生物所形成者。
依據本發明之發酵物中，在前述微生物為屬於乳桿菌(lactobacilli)之微生物的情況下，該微生物較佳為選自乳植物桿菌屬(Lactiplantibacillus屬)、乳酸桿菌屬(Lacticaseibacillus屬)、及甘草乳酸桿菌屬(Liquorilactobacillus屬)之1種或2種以上的微生物。
依據本發明之發酵物中，前述微生物較佳為選自由植物乳桿菌(Lactiplantibacillus plantarum)、戊糖乳桿菌(Lactiplantibacillus pentosus)、玉米乳桿菌(Lacticaseibacillus zeae)、馬里甘草乳桿菌(Liquorilactobacillus mali)、副乾酪乳桿菌(Lacticaseibacillus paracasei)、法比弗曼乳桿菌(Lactiplantibacillus fabifermentans)、大麥酒乳桿菌(Liquorilactobacillus hordei)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、假腸繫膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)、腸繫膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici)、及 戊糖小球菌(Pediococcus pentosaceus)所構成之群組之1種或2種以上的微生物。
本發明之第2項係提供含有上述發酵物的皮膚外用劑。
依據本發明之皮膚外用劑中，該皮膚外用劑較佳係用於提供美白效果。
依據本發明之皮膚外用劑中，前述發酵物較佳係具有黑色素產生抑制作用者。
依據本發明之皮膚外用劑中，前述發酵物較佳係具有酪胺酸酶抑制作用者。
由於本發明為以木槿或其處理物作為原料，且將此以特定微生物處理而得的發酵物，因此黑色素產生抑制活性、酪胺酸酶抑制活性等帶來美白效果的活性優異。據此，藉此可提供新穎的皮膚外用劑。
本說明書中，「木槿」係與通常知識者理解的植物同義，具體而言，包含錦葵科木槿屬之木槿(學名：Althaea officinalis，在日文中亦稱為
Figure 111137069-A0202-12-0003-1
(薄紅立葵)、
Figure 111137069-A0202-12-0003-5
(天鵞絨葵)、或
Figure 111137069-A0202-12-0003-6
Figure 111137069-A0202-12-0003-4
(Marsh mallow；錦葵)等)的意思。木槿係一種自然生長於地中海沿岸之歐洲原產的多年生草本植物，作為藥草和生藥被廣泛種植，並且易於獲得。
本發明中，使微生物作用於木槿或其處理物，而成為由該微生物所形成的發酵物。作為使微生物作用的木槿之植物體的部位，可列舉葉部、根部、花部、莖部、地上部分、整株植物、或此等之部位的混合物等，惟較佳係葉部、地上部分、根部、或此等之部位的混合物等，更佳係葉部、根部或此等之部位的混合物。作為使微生物作用的植物體之形態，係植物原料或其乾燥物的粉碎物、壓榨液、萃取物、或此等之混合物等(稱為處理物)，並無特別限定。較佳係壓榨液、萃取物、或此等之混合物等，更佳係萃取物。
作為作用於木槿或其處理物的微生物，可列舉屬於乳桿菌(lactobacilli)之微生物、屬於乳球菌屬(Lactococcus屬)之微生物、屬於明串珠菌屬(Leuconostoc屬)之微生物、屬於小球菌屬(Pediococcus屬)之微生物等。更具體而言，係植物乳桿菌(Lactiplantibacillus plantarum)、戊糖乳桿菌(Lactiplantibacillus pentosus)、玉米乳桿菌(Lacticaseibacillus zeae)、馬里甘草乳桿菌(Liquorilactobacillus mali)、副乾酪乳桿菌(Lacticaseibacillus paracasei)、法比弗曼乳桿菌(Lactiplantibacillus fabifermentans)、大麥酒乳桿菌(Liquorilactobacillus hordei)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、假腸繫膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)、腸繫膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici)、戊糖小球菌(Pediococcus pentosaceus)等。若為屬於此等之微生物，則可良好地促進木槿的發酵，且提供優異的美白效果活性。然而，並非意指可使用於本發明的微生物限於此等之菌種。可單獨將1種類的微生物用於與上述原料所進行的處理、或 併用2種類以上的微生物而用於與上述原料所進行的處理。亦即，可依序藉由相異2種類以上之微生物所進行的處理、或同時併用相異2種類以上的微生物進行處理，此外，可組合此等之處理。
又，如下述所列舉的2020年4月出版的學術期刊所述，針對以往屬於乳酸桿菌(Lactobacillus)屬的乳酸菌，其菌屬已被重新分類，並且在菌種之一部分中屬名已被變更。
(針對乳酸菌之重新分類)
‧Zheng et al., 「A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae.」 Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020 Apr; 70(4):2782-2858 DOI 10.1099/ijsem.0.004107
於此，本說明書中，顯示重新分類以後之新分類的表示法。又，舊分類中，屬於乳酸桿菌(Lactobacillus)屬且重新成為新分類之表示法的微生物統稱為「屬於乳桿菌(lactobacilli)的微生物」，而被包括在可使用於本發明之微生物者。
此外，如下述所列舉的2000年出版的學術期刊所述，由於以往乳酸菌的歷史分類與命名問題，許多被稱為酪蛋白乳酸桿菌(Lactobacillus casei)的乳酸菌在某些時候被稱為副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)。
(針對舊稱「副乾酪乳桿菌」之同義碼(異名))
‧鈴木健一朗，「乳酸菌之分類的現狀與問題點 特別關於命名法」Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria 2000 Vol.11, No. 2, pp49-59.
於此，本說明書中，在以往被稱為副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)的乳酸菌中，包括以往作為其同義碼(異名)而稱為酪蛋白乳酸桿菌(Lactobacillus casei)者。
例如，上述植物乳桿菌(Lactiplantibacillus plantarum)舊稱中係胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)，上述戊糖乳桿菌(Lactiplantibacillus pentosus)舊稱中係戊糖乳酸桿菌(Lactobacillus pentosus)，上述玉米乳桿菌(Lacticaseibacillus zeae)舊稱中係玉米乳酸桿菌(Lactobacillus zeae)，上述馬里甘草乳桿菌(Liquorilactobacillus mali)舊稱中係馬里甘草乳酸桿菌(Lactobacillus mali))，上述副乾酪乳桿菌(Lacticaseibacillus paracasei)舊稱中係副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)，上述法比弗曼乳桿菌(Lactiplantibacillus fabifermentans)舊稱中係比弗曼乳酸桿菌(Lactobacillus fabifermentans)，上述大麥酒乳桿菌(Liquorilactobacillus hordei)舊稱中係大麥酒乳酸桿菌(Lactobacillus hordei)。然後，此等皆係屬於乳桿菌(lactobacilli)的微生物，而被包含於可使用於本發明的微生物。
關於使上述微生物作用於木槿或其處理物之際的條件，只要為木槿之成分藉由上述微生物以某種方式起變化的條件，則無特別限制，惟例如，較佳係使作用於木槿或其處理物的微生物增殖至初始菌數之2至10000倍量，典型而言，5至1000倍量，更典型而言，10至1000倍量的生長條件。生長不良則無法良好地發酵。
在使上述微生物作用於木槿或其處理物之際，作為該微生物之生長的助劑，可使用例如葡萄糖、果糖、蔗糖、寡糖等糖類，丙胺酸、精胺酸、色胺酸、半胱胺酸等胺基酸類，酪蛋白分解物、蛋白質分解物等肽類，酵母萃取物、肉萃取物、大豆萃取物等萃取物類，聚氧乙烯脫水山梨糖醇油酸酯等具脂肪酸側鏈的界面活性劑，或者，屬於標準的乳酸菌用培養基構成之例如乳酸桿菌MRS培養液(Difco)等。
然而，除了源自木槿的成分以外，殘留其他成分時，就防腐性、使用感等觀點而言，由於有著獲得的發酵物之品質受到影響之情況，因此不希望在發酵之際，調配超過所需要者的源自木槿的成分以外之成分。據此，在使用上述助劑之情況下，例如，相對於作為發酵原料之木槿或其處理物100質量份，較佳係將上述助劑之構成比例設為0.001質量份以上5.0質量份以下、更佳係設為0.01質量份以上0.5質量份以下。另一方面，可不添加任何非源自木槿的原料，而供於由上述微生物所進行的處理。
以下，為了獲得依據本發明之發酵物，針對未被限定之任意態樣，進行更具體的說明。
作為使上述微生物作用的原料者，例如，可獲得木槿之萃取物，並將此作為原料。此時，例如，相對於植物體之乾燥粉末，加入10至200倍量之水或熱水(例如，可使用逆滲透膜處理水、離子交換水、自來水、井水、蒸餾水、超純水等)進行加熱處理以獲得熱水萃取物，可將此直接以萃取懸浮液之狀態作為原料，亦可依據需要將水分蒸發濃縮而作為原料，或者，可藉由濾器過濾、離心分離等固液分離手段除去固形份而獲得之上 清作為原料，並相對於如此之原料，將上述微生物進行適當的初始濃度接種，使其作用即可。
關於由上述微生物所進行之處理，可根據通常之通氣、靜置培養的方法進行。此時，初始菌數濃度較佳係1×104CFU/mL以上5×107CFU/mL以下，更佳係1×105CFU/mL以上1×107CFU/mL以下。溫度條件係20℃至40℃，較佳係25℃至37℃。處理期間係12小時至10天，更佳係1至3天。藉由如此之處理，例如，可使微生物增殖至初始菌數之2至10000倍量，典型而言為5至1000倍量，更典型而言為10至1000倍量，從而獲得發酵物。在由微生物所進行的處理後，可直接以包含已使用的微生物的狀態作為本發明之發酵物，惟就上述防腐性、使用感等之觀點而言，較佳係藉由濾器過濾、離心分離等固液分離手段除去發酵中所使用的微生物之菌體，將獲得的上清作為發酵物。此外，在由微生物所進行的處理後，亦能夠在其處理物加入各種溶劑，製備萃取物或稀釋物，以使用作為本發明之發酵物。於此使用的溶劑，可列舉水，乙醇、丙醇等低級醇，鯨蠟醇、硬脂醇等高級醇，1,3-丁二醇、1,3-丙二醇、甘油等多元醇等化妝品中常用的溶劑，惟並非限定於此等者，且可單獨使用或者混合使用二種以上。
依據本發明之發酵物可直接將其作為皮膚外用劑使用，或者可在皮膚外用劑之製造步驟中進行調配而予以使用。具體而言，例如，可適合地用作為乳液、乳霜、清潔劑、按摩膏、防曬霜、底妝、霜狀粉底等形態的化妝料或者其原料。又，如此之化妝料意指包含與醫藥品、醫療器 材等品質、有效性及安全性之確保等相關的法律中所定義的醫藥品、準醫藥品、化妝品。
此外，就皮膚外用劑之形態而言，可為使作用於皮膚的成分被擔持在適當的基材部分而成的濕膜(pack)、片膜(mask)、凝膠等。亦即，可適合用作在如此之皮膚外用劑中的作用於皮膚的成分。
此外，本發明之未被限定之任意態樣中，上述皮膚外用劑可為標示出可用於帶來美白效果、具有黑色素產生抑制作用、具有酪胺酸酶抑制作用等機能性的製品。
[實施例]
以下列舉實施例以具體地說明本發明，惟此等之實施例並非限定本發明之範圍者。
〔1.木槿萃取物之製備〕
1-1.植物
將市售木槿(學名：Althaea officinalis)之葉或根的乾燥物使用於試驗。
1-2.萃取
將預培養用之木槿萃取物如下述地進行製備。亦即，以植物粉末：水=1：20(質量比)之方式加入水(逆滲透膜處理水，以下稱為「RO水」)，以使最終濃度成為0.2w/v%之方式添加葡萄糖，及以使最終濃度成為0.1w/v%之方式添加酵母萃取物(Difco)，充分攪拌以製備懸浮液。將3mL的懸浮液分注至每個試管，蓋上鋁蓋並在121℃高壓滅菌15分鐘以獲得熱水萃取物。
就作為主培養用之木槿萃取物而言，係製備(1)無添加、及(2)添加0.2w/v%葡萄糖及0.1w/v%酵母萃取物的2種類木模萃取物。亦即，以植物粉末：水=1：20(質量比)之方式加入RO水，並以無添加的方式充分攪拌以製備懸浮液而作為上述(1)，或者以最終濃度成為0.2w/v%之方式添加葡萄糖、及以最終濃度成為0.1w/v%之方式添加酵母萃取物(Difco)，充分攪拌以製備懸浮液而作為上述(2)。將10mL的該懸浮液分注至試管，蓋上矽栓並在98℃高壓滅菌100分鐘以獲得熱水萃取物。
〔2.乳酸菌〕
將所使用的13種類的乳酸菌示於表1。菌係將-80℃ DMSO保存菌株接種於Lactobacilli MRS Broth(Difco)，在最佳培養溫度培養20小時後，將以相同條件進一步繼代1代者作為菌液，以用於木槿萃取物之預培養。又，所使用的13種類之菌株能夠從表1所記載的公開的分讓機構獲取。此外，對於所使用的13種類之乳酸菌中的11種類之乳酸菌(No.5及No.10以外)，均獲得並使用了代表各乳酸菌之屬種的標準菌株。
[表1]
Figure 111137069-A0202-12-0011-8
〔試驗例1〕(木槿葉之使用)
預培養係藉由在預培養用之木槿葉萃取物3mL接種0.5v/v%菌液(初始菌數濃度：約1.9×106至2.4×107CFU/mL)，在有氧下以最佳溫度靜置培養48小時而進行。
主培養係藉由在主培養用之木槿葉萃取物10mL接種1v/v%預培養後之培養物(初始菌數濃度：約0.4×105至2.3×106CFU/mL)，在有氧下以最佳溫度靜置培養72小時而進行。
主培養後確認活菌數。具體而言，將主培養後之培養物以原液或者0.1w/v%酵母萃取物經適宜稀釋的液，使用螺旋板EDDY JET2(IUL Instruments)在Lactobacilli MRS瓊脂平板培養基播種100μL，在最佳溫度培養3天後，將所形成的菌落使用菌落計數器ProtoCOL3(SYNBIOSIS)計數，以算出CFU(菌落形成單位)/mL之值。又，針對主培養前之初始菌數亦以同樣的方式確認。
將獲得的結果示於表2。
[表2]
Figure 111137069-A0202-12-0013-9
其結果，乳酸菌No.13(嗜熱性鏈球菌(Streptococcus thermophiles))由於預培養後之活菌數低，因此屬於不適合於將木槿葉作為原料之發酵物的製備中的菌種或菌株。
上述以外之乳酸菌12株中，藉由以木槿葉萃取物培養，培養後之活菌數顯示6×105CFU/mL以上，活菌數與初始菌數相比，至少增加6倍以上(作為例外，乳酸菌No.8(Lactococcus lactis subsp.lactis)「GY添加」時，約4.3倍左右：乳酸菌No.10(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides)「無添加」時，約4.6倍左右)。在木槿葉萃取物添加葡萄糖及酵母萃取物時的影響，因乳酸菌之種類而異，有活菌數增加之傾向(例如：乳酸菌No.2(Lactiplantibacillus pentosus))、大致相同(例如：乳酸菌No.6(Lactiplantibacillus fabifermentans))、抑制之傾向(例如：乳酸菌No.9 (Leuconostoc pseudomesenteroides))，未觀察到一致的傾向。相對於菌之生長影響的程度皆不那麼顯著。
從上述可知，上述乳酸菌12株，亦即，乳酸菌No.1(Lactiplantibacillus plantarum subsp.plantarum)、乳酸菌No.2(Lactiplantibacillus pentosus)、乳酸菌No.3(Lacticaseibacillus zeae)、乳酸菌No.4(Liquorilactobacillus mali)、乳酸菌No.5(Lacticaseibacillus paracasei)、乳酸菌No.6(Lactiplantibacillus fabifermentans)、乳酸菌No.7(Liquorilactobacillus hordei)、乳酸菌No.8(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸菌No.9(Leuconostoc pseudomesenteroides)、乳酸菌No.10(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides)、乳酸菌No.11(Pediococcus acidilactici)、及乳酸菌No.12(Pediococcus pentosaceus)適合於將木槿葉作為原料之發酵物的製備。
〔試驗例2〕(木槿根之使用)
預培養係藉由在預培養用之木槿根萃取物3mL接種0.5v/v%菌液(初始菌數濃度：約3.1×106至2.8×107CFU/mL)，在有氧下以最佳溫度靜置培養48小時而進行。
主培養係藉由在主培養用之木槿根萃取物10mL接種1v/v%預培養後之培養物(初始菌數濃度：約0.7×105至3.6×106CFU/mL)，在有氧下以最佳溫度靜置培養72小時而進行。
主培養後與試驗例1同樣地確認活菌數。
將獲得的結果示於表3。
[表3]
Figure 111137069-A0202-12-0015-10
其結果，乳酸菌No.13(Streptococcus thermophilus)由於預培養後之活菌數低，因此屬於不適合於將木槿根作為原料之發酵物的製備中的菌種或菌株。
上述以外之乳酸菌12株中，藉由以木槿根萃取物培養，培養後之活菌數顯示1×106CFU/mL以上，活菌數與初始菌數相比，至少增加10倍以上。在木槿根萃取物添加葡萄糖及酵母萃取物時的影響，因乳酸菌之種類而異，有活菌數增加之傾向(例；乳酸菌No.4(Liquorilactobacillus mali))、大致相同(例；乳酸菌No.5(Lacticaseibacillus paracasei))、抑制之傾向(例；乳酸菌No.6(Lactiplantibacillus fabifermentans))，未觀察到一致的傾向。相對於菌之生長影響的程度皆不那麼顯著。
從上述可知，上述乳酸菌12株，亦即，乳酸菌No.1(Lactiplantibacillus plantarum subsp.plantarum)、乳酸菌No.2(Lactiplantibacillus pentosus)、乳酸菌No.3(Lacticaseibacillus zeae)、乳酸菌No.4(Liquorilactobacillus mali)、乳酸菌No.5(Lacticaseibacillus paracasei)、乳酸菌No.6(Lactiplantibacillus fabifermentans)、乳酸菌No.7(Liquorilactobacillus hordei)、乳酸菌No.8(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸菌No.9(Leuconostoc pseudomesenteroides)、乳酸菌No.10(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides)、乳酸菌No.11(Pediococcus acidilactici)、及乳酸菌No.12(Pediococcus pentosaceus)適於將木槿根作為原料之發酵物的製備。
〔試驗例3〕
試驗例1(木槿葉之使用)中培養後之活菌數顯示5×105CFU/mL以上之12種類的乳酸菌(No.1至12)之中，選擇No.1、2、4、5、6、7、10、11的乳酸菌，針對使用各乳酸菌的培養物，檢查黑色素產生抑制活性。
具體而言，使用無添加葡萄糖及酵母萃取物之木槿葉萃取物進行的主培養結束後，將培養物以3000rpm(1600×g)離心10分鐘，將上清以0.22μm濾器進行無菌過濾而獲得發酵上清。發酵上清在4℃進行避光保存後，在-20℃進行冷凍保存直至測定為止。
表4中，針對所使用的發酵上清或未發酵之木槿葉萃取物，顯示pH測定之結果，以及藉由在105℃加熱3小時後，於乾燥器內冷卻所測定的蒸發殘渣濃度(mg/mL)。
[表4]
Figure 111137069-A0202-12-0017-11
黑色素產生抑制活性之測定係藉由以下所示之試驗方法實施。
〔試驗方法〕
(1)細胞
細胞係使用B16小鼠黑色素瘤細胞(B16-F1)。試驗中使用從購入時算起的繼代第5至10次的細胞。
(2)黑色素產生抑制試驗
在24孔板加入包含5%FBS之DMEM培養基500μL，將B16小鼠黑色素瘤細胞1.4×104cells/well(7.5×104cells/cm2)播種後，在5%CO2、37℃培養24小時。其後，將培養基更換為1mL包含被驗試樣之含茶鹼的培養基1mL，並進一步培養3天。
作為被驗試樣，將各乳酸菌的發酵上清或未發酵之木槿葉萃取物作為樣品原液100%，在培養基中以5%之調配比例(體積比)的方式添 加。作為對照，使用RO水取代各乳酸菌的發酵上清或未發酵之木槿葉萃取物，並以相同調配比例添加至培養基。
(3)細胞內黑色素產生量
在培養結束後將細胞以PBS(-)洗滌2次，並以99.5%乙醇固定細胞。風乾除去乙醇後，將1N NaOH加入孔中並在80℃加熱30分鐘，從而獲得使細胞及黑色素溶解而成的細胞溶解液。冷卻後，將細胞溶解液總量轉移到96孔板，測定405nm的吸光度。每個培養孔之細胞內黑色素產生量係從使用了合成黑色素的檢量線求出，相對於對照的細胞內黑色素產生量則係藉由下述式求出。
Figure 111137069-A0202-12-0018-12
(4)細胞內蛋白質量
將上述細胞溶解液以超純水(Milli-Q水)稀釋10倍，並使用將BSA作為標準蛋白質的BCA法(Pierce BCA Protein assay kit)定量，藉由下述式求出相對於對照的細胞內蛋白質量。
Figure 111137069-A0202-12-0018-13
將獲得的結果彙整示於表5。
[表5]
Figure 111137069-A0202-12-0019-14
其結果，針對細胞內蛋白質量(相對於未添加被驗試樣時之細胞內蛋白質量的百分比)，各乳酸菌的發酵上清與未發酵之木槿葉萃取物相比，沒有顯示出顯著的傾向，相對於此，針對細胞內黑色素產生量(相對於未添加被驗試樣時之細胞內黑色素量的百分比)，各乳酸菌的發酵上清之中，乳酸菌No.1(Lactiplantibacillus plantarum subsp.plantarum)、乳酸菌No.2(Lactiplantibacillus pentosus)、乳酸菌No.4(Liquorilactobacillus mali)、乳酸菌No.5(Lacticaseibacillus paracasei)、乳酸菌No.6(Lactiplantibacillus fabifermentans)、乳酸菌No.7(Liquorilactobacillus hordei)、乳酸菌No.10(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides)、及乳酸菌No.11(Pediococcus acidilactici)與未發酵相比，確認出細胞內黑色素產生量降低的傾向。
從上述可知，在使用上述乳酸菌之木槿葉萃取物的發酵物中，與未發酵之萃取物相比，細胞數不會降低，並提高黑色素產生抑制活性。
〔試驗例4〕
試驗例1(使用木槿葉)中培養後之活菌數顯示5×105CFU/mL以上的12種類(No.1至12)之中，選擇No.3、5、8、11、12之乳酸菌，與試驗例3同樣地製備發酵上清(No.5、11係使用試驗例3中所使用者)，檢查酪胺酸酶抑制活性。
表6中，針對所使用的發酵上清或未發酵之木槿葉萃取物(No.5、11係使用試驗例3中所使用者)，顯示pH測定之結果，以及藉由在105℃加熱3小時後，於乾燥器內冷卻所測定的蒸發殘渣濃度(mg/mL)。
[表6]
Figure 111137069-A0202-12-0020-15
酪胺酸酶抑制活性之測定係將Matsuda等人之方法(Matsuda H et al.；Studies of cuticle drugs from natural sources.III.Inhibitory effect of Myrica rubra on melanin biosynthesis.,Biol.Pharm.Bull.,18(8),1148-1150(1995))改變一部分並予以實施。具體而言，將各乳酸菌的發酵上清或未發酵之木槿葉萃取物分別以50μL(樣品原液)加入96孔微孔板的 各孔中，於各孔加入300mM磷酸緩衝液(pH6.8)50μL混合後，在室溫預培育10分鐘。其次，將270U/mL酪胺酸酶溶液(酪胺酸酶：源自蘑菇，Sigma-Aldrich)25μL與0.06w/v% 3,4-二羥基-L-苯丙胺酸(L-DOPA，富士軟片和光純藥股份有限公司)25μL加入各孔並混合，在室溫培育5分鐘後，測定屬於多巴色素(黑色素生合成之中間體)之極大吸收波長的475nm吸光度。反應系統之最終體積係150μL，其中，發酵上清(樣品原液)之最終調配比例係50μL/150μL。
從所測定的吸光度並依據下述式算出酪胺酸酶抑制率。式中，「對照」係表示加入RO水以取代樣品的反應系統，「空白」係表示加入50mM磷酸鉀緩衝液以取代酪胺酸酶的反應系統。
Figure 111137069-A0202-12-0021-16
S475nm：樣品
SB475nm：空白樣品
C475nm：對照
CB475nm：空白對照
試驗係針對各乳酸菌的發酵上清或未發酵之木槿葉萃取物，進行3次的酪胺酸酶反應試驗，以求出其平均與標準偏差。將結果示於表7。
【表7]
Figure 111137069-A0202-12-0022-17
其結果，未發酵之木槿葉萃取物中酪胺酸酶抑制率係17%(SD：±2%)，相對於此，各乳酸菌的發酵上清之中，乳酸菌No.3(Lacticaseibacillus zeae)係28%(SD：±1%)、乳酸菌No.5(Lacticaseibacillus paracasei)係27%(SD：±8%)、乳酸菌No.8(Lactococcus lactis subsp.lactis)係33%(SD：±7%)、乳酸菌No.11(Pediococcus acidilactici)係39%(SD：±3%)、乳酸菌No.12(Pediococcus pentosaceus)係38%(SD：±3%)。
從上述可知，使用上述乳酸菌之木槿葉萃取物的發酵物中，與未發酵之萃取物相比，酪胺酸酶抑制活性提高。
〔試驗例5〕
試驗例2(木槿根之使用)中選擇培養後之活菌數顯示1×106CFU/mL以上之12種類的乳酸菌(No.1至12)，與試驗例3同樣地製備各乳酸菌的發酵上清，檢查黑色素產生抑制活性。
表8中，針對所使用的發酵上清或未發酵之木槿根萃取物，顯示pH測定之結果，以及藉由在105℃加入3小時後，於乾燥器內冷卻所測定的蒸發殘渣濃度(mg/mL)。
[表8]
Figure 111137069-A0202-12-0023-18
將獲得的結果彙整示於表9。
[表9]
Figure 111137069-A0202-12-0024-19
其結果，針對細胞內蛋白質量(相對於未添加被驗試樣時之細胞內蛋白質量的百分比)，各乳酸菌的發酵上清與未發酵之木槿根萃取物相比，沒有顯示出顯著的傾向，相對於此，針對細胞內黑色素產生量(相對於未添加被驗試樣時之細胞內黑色素量的百分比)，各乳酸菌的發酵上清之中，乳酸菌No.1(Lactiplantibacillus plantarum subsp.plantarum)、乳酸菌No.2(Lactiplantibacillus pentosus)、乳酸菌No.3(Lacticaseibacillus zeae)、乳酸菌No.4(Liquorilactobacillus mali)、乳酸菌No.5(Lacticaseibacillus paracasei)、乳酸菌No.6(Lactiplantibacillus fabifermentans)、乳酸菌No.7(Liquorilactobacillus hordei)、乳酸菌No.8(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸菌No.9(Leuconostoc pseudomesenteroides)、乳酸菌No.10 (Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides)、乳酸菌No.11(Pediococcus acidilactici)、及乳酸菌No.12(Pediococcus pentosaceus)與未發酵相比，確認出細胞內黑色素產生量降低的傾向。
從上述可知，使用上述乳酸菌之木槿根萃取物的發酵物中，與未發酵之萃取物相比，不會提高細胞毒性，而會提高黑色素產生抑制活性。
〔試驗例6〕
試驗例2(使用木槿根)中培養後之活菌數顯示1×106CFU/mL以上的12種類之乳酸菌(No.1至12)之中，選擇No.1、3、6、11、12之乳酸菌，與試驗例5同樣地製備發酵上清(使用試驗例5中所使用者)，檢查酪胺酸酶抑制活性。
表10中，針對所使用的發酵上清或未發酵之木槿根萃取物(使用試驗例5中所使用者)，顯示pH測定之結果，以及藉由在105℃加熱3小時後，於乾燥器內冷卻所測定的蒸發殘渣濃度(mg/mL)。
[表10]
Figure 111137069-A0202-12-0025-20
將獲得的結果彙整示於表11。
[表11]
Figure 111137069-A0202-12-0026-21
其結果，未發酵之木槿根萃取物中，酪胺酸酶抑制率係10%(SD：±33%)，相對於此，各乳酸菌的發酵上清之中，乳酸菌No.1(Lactiplantibacillus plantarum subsp.plantarum)係6%(SD：±5%)、乳酸菌No.3(Lacticaseibacillus zeae)係15%(SD：±6%)、乳酸菌No.6(Lactiplantibacillus fabifermentans)係16%(SD：±16%)、乳酸菌No.11(Pediococcus acidilactici)係15%(SD：±3%)、乳酸菌No.12(Pediococcus pentosaceus)係11%(SD：±25%)。
從上述可知，使用上述乳酸菌之木槿根萃取物的發酵物中，與未發酵之萃取物相比，酪胺酸酶抑制活性提高。

Claims (7)

  1. 一種發酵物，係以木槿或其處理物作為原料，且由選自屬於乳桿菌(lactobacilli)之微生物、屬於乳球菌屬(Lactococcus屬)之微生物、屬於明串珠菌屬(Leuconostoc屬)之微生物、及屬於小球菌屬(Pediococcus屬)之微生物之1種或2種以上的微生物所形成者。
  2. 如請求項1所述之發酵物，其中，在前述微生物為屬於乳桿菌(lactobacilli)之微生物的情況下，該微生物為選自乳植物桿菌屬(Lactiplantibacillus屬)、乳酸桿菌屬(Lacticaseibacillus屬)、及甘草乳酸桿菌屬(Liquorilactobacillus屬)之1種或2種以上的微生物。
  3. 如請求項1所述之發酵物，其中，前述微生物為選自由植物乳桿菌(Lactiplantibacillus plantarum)、戊糖乳桿菌(Lactiplantibacillus pentosus)、玉米乳桿菌(Lacticaseibacillus zeae)、馬里甘草乳桿菌(Liquorilactobacillus mali)、副乾酪乳桿菌(Lacticaseibacillus paracasei)、法比弗曼乳桿菌(Lactiplantibacillus fabifermentans)、大麥酒乳桿菌(Liquorilactobacillus hordei)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、假腸繫膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)、腸繫膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳酸小球菌(Pediococcus acidilactici)、及戊糖小球菌(Pediococcus pentosaceus)所構成之群組之1種或2種以上的微生物。
  4. 一種皮膚外用劑，係含有如請求項1至3中任一項所述之發酵物。
  5. 如請求項4所述之皮膚外用劑，其係用於提供美白效果。
  6. 如請求項4所述之皮膚外用劑，其中，前述發酵物係具有黑色素產生抑制作用者。
  7. 如請求項4所述之皮膚外用劑，其中，前述發酵物係具有酪胺酸酶抑制作用者。
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