TW202203777A - 一種生態型生物保鮮劑及其製備方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及保鮮劑的加工技術領域，特別涉及一種生態型生物保鮮劑及其製備方法，保鮮劑主要活性成分是由微生物發酵而得的蛋白多糖成分；該成分經巴氏滅菌法滅酶殺菌後仍擁有特殊的等溫吸濕曲線而具有良好的保鮮效果，同時不會造成保鮮劑成分對產品的污染，是一種生態型的生物保鮮劑；發明還針對微生物發酵生產蛋白多糖的特點制定相應的加工路線，利用中藥培養基特殊的底物促使微生物生產高品質的蛋白多糖，使該保鮮劑成分在對食品、蔬果與海產品的保鮮上有突出的效果，具有良好的乳化保水效果，抗氧化功能及抑菌防腐作用，能有效提高保鮮食品的水分含量，降低水活性，起到良好的保水、保鮮目的。

Description

一種生態型生物保鮮劑及其製備方法
本發明涉及保鮮劑加工技術領域，特別涉及一種生態型生物保鮮劑及其製備方法。
海產品由於其富含人體必需的微量元素，具有很高的營養價值而備受人們推崇，海產品味道鮮美，產品價格普遍高於其他養殖產品；但是，由於產品特性，其鮮品較普通肉質產品來說更易變質，保鮮期更短。目前，海產品的保鮮主流的保鮮方法是氣調保鮮和冷凍保鮮，兩種保鮮方法都有設備複雜、工序複雜的缺陷，而目前也有一些保鮮劑應用於海產品的保鮮，但是這些保鮮成分參差不齊，有些保鮮方法僅能保存海產品不受微生物侵害，並不能達到有效保水，提高水份含量，降低水活性的效果，這就導致了保鮮劑的保鮮能力大打折扣。
生物保鮮劑是一類新興的保鮮劑，大體分為：植物類提取成分保鮮劑、生物類提取成分保鮮劑，也有較少的微生物類提取成分保鮮劑；由於微生物代謝的複雜性，往往其代謝產物會有較多的不確定性，用來製備保鮮劑存在技術手段複雜、活性成分複雜等技術缺陷，在一定程度上阻礙了微生物類保鮮劑發展。
蛋白質與多糖以共價和非共價鍵相連構成多種巨大分子稱為蛋白多糖(proteoglycans，PG)，大量蛋白多糖聚合物可形成許多微小空隙的分子篩，使基質成為限制細菌、腫瘤細胞、寄生蟲等有害大分子物質擴散的防禦屏障。某些能產生透明質酸酶的細菌、癌細胞等，可通過破壞基質的防禦屏障而得到擴散。因此，蛋白多糖具有一定的限制細菌擴散的作用；但是目前，蛋白多糖的提取方法多採用提取、合成方法獲得，而鮮少有利用微生物發酵代謝生成的相關報導，這是因為目前微生物發酵產生蛋白多糖的路徑複雜，產量低、發酵條件未知、發酵的底物也未知；但微生物可因外物刺激產生多酚氧化酶促進蛋白質胺基與多糖基以共價鍵結合產生蛋白多糖；而目前申請人還未發現利用中藥濃縮液成分可刺激微生物發酵生產蛋白多糖的相關報導，因此，有必要以此為突破口，研究一種可高效產蛋白多糖，並能應用於海產品保鮮的方法，與其在食品、蔬果深加工產品保鮮等應用，例如百香果汁涼茶，火龍果汁涼茶，優酪乳仙草凍及果汁仙草凍等。再者，目前較為有效的保鮮劑，大都為化學性的防腐劑，長期食用有害人體健康，因此，開發高效的生態型生物保鮮劑具有迫切的技術性與應用性需求。
鑒於上述內容，有必要提供一種生態型生物保鮮劑的製備方法，該方法能製備的保鮮劑具有良好的抗氧化效果和保鮮功效，可以應用於食品保鮮，同時還能提高此等產品的水份含量，降低水活性。
為達到上述目的，本發明所採用的技術方案是：
一種生態型生物保鮮劑，所述保鮮劑為微生物的發酵產物， 其發酵方法為：微生物經活化培養基和中藥強化培養基培養後得到強化乳酸菌，然後將強化乳酸菌接種至發酵培養基中制得發酵產物。
進一步的，所述微生物為嗜熱乳酸桿菌(Lactobacillus thermophilus)、約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)和/或鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)。其中，嗜熱乳酸桿菌、約氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌的有效活菌數均為2.0×109cfu/g。
進一步的，所述活化培養基製備方法為：取26g的MRS培養基和7.2g的NB培養基混合後溶於蒸餾水中，並補水至1L制得；pH為5.5-7.0。
進一步的，所述中藥強化培養基製備方法為：將澱粉混合物溶液和NB培養基按照體積比為1：1製成基礎培養基；再添加3mL/L-6mL/L的中藥混合濃縮液混勻後，將培養基的pH調整為5.5-7.0；所述發酵培養基製備方法為：將澱粉混合物溶液和NB培養基按照體積比為1：1製成基礎培養基；再添加體積百分數為2%-4%的中藥混合濃縮液混勻後，將培養基的pH調整為5.5-7.0。
進一步的，所述中藥強化培養基與發酵培養基的中藥混合濃縮液相同，製備方法為：將黃柏、黃苓和蘆薈的單味中藥與蒸餾水按照質量比為2：200-300混合，煮沸，並保持沸騰狀態30-40min，然後濃縮至原液的1/2，濃縮後進行冷卻、在5000r/min條件下離心10-15min，收集離心液得到中藥濃縮液I；將離心沉澱物再與蒸餾水再次混合，並重複中藥濃縮液I的製備方法提取中藥濃縮液II，將中藥濃縮液I和中藥濃縮液II合併得到相應的黃柏、黃苓和蘆薈中藥濃縮液；之後將黃柏、黃苓和蘆薈中藥濃縮液按 照等體積比混合得到所述中藥混合濃縮液。
進一步的，所述澱粉混合物溶液的製備方法為：將白米粉、玉米粉、麵粉各自以2：200-300熬煮20-30min後，在5000-6000r/min轉速下離心15-20min、過濾、取濾液以體積比為1：1：1混合而成。
一種製備生態型生物保鮮劑的方法，所述方法為將微生物分別接種到活化培養基中活化後，再分別接種到中藥強化培養基中進行強化培養發酵；發酵結束後按照等體積比將強化培養後的菌液進行混合，得到複合乳酸菌；再將複合乳酸菌接種到發酵培養基中，在40-42℃下密封培養8-12h後將發酵液經過提取得到生物保鮮劑；所述發酵培養基的複合乳酸菌接種量為10%-14%。
進一步的，所述發酵液提取方法為：在5000-6000r/min轉速下離心15-20min，收集上清液，用減壓濃縮機將上清液濃縮至原體積的1/3後，向濃縮液中加入等體積濃度為95%的乙醇溶液混勻，於4℃下靜置24h至沉澱析出，於5000-6000r/min轉速下離心15-20min，取沉澱物經透析純化，再將透析液真空冷凍乾燥、磨粉。
進一步的，所述發酵液提取還包括將離心沉澱物進行二次循环分子量(18-20kD)透析純化處理。
進一步的，所述保鮮劑最後還經巴氏滅菌法滅酶殺菌保存。
一種生態型生物保鮮劑在食品保鮮上的應用。
進一步的，所述食品為可食用的飲料、蔬菜、水果和/或海產品。
進一步的，所述海產品為羅非魚、牡蠣、對蝦、蛤蜊和/或 青蟹。
本發明具有如下有益效果：
1、本申請的保鮮劑主要活性成分是由微生物發酵而得的蛋白多糖成分；該成分具有良好的抑菌功效，同時還不會造成保鮮劑成分對產品的污染，是一種生態型的生物保鮮劑；發明人在研究過程中發現，對微生物培養基進行改進有助於提高蛋白多糖的含量，特別是向培養基中增加中藥濃縮液成分，能有效促使乳酸菌等微生物代謝產生蛋白多糖的生成；蛋白多糖具有良好的乳化性能，作為保鮮劑可有效附著在海產品表面，能提高對海產品的保鮮能力。用蛋白多糖保鮮果汁涼茶除了具有良好的保鮮效果外，還具有高效乳化水果纖維、提高粒徑的均勻分佈效果，能達到保鮮、乳化的雙重效果，能降低果汁涼茶的沉澱產生。同時，採用蛋白多糖對優酪乳仙草凍與果汁仙草凍進行保鮮，能有效乳化仙草膠、提高仙草多糖的質地達到口感細膩的效果，能改善仙草凍的品質。申請人研究發現，本申請的保鮮劑對大部分食品的保鮮效果均能達到12個月；其原因除了中藥能增加胞外多糖分泌，也促進乳酸菌發酵產生蛋白多糖，更加強化穩定與乳化作用、降低水活性與提高保水性並使保鮮劑具有較強抗氧化性外，中藥本身對細菌的抑制作用對保鮮劑的效果也產生了協同、增強的作用。
2、本申請的針對微生物發酵生產蛋白多糖的特點制定相應的加工路線，由於中藥培養基中，加入中藥其成分複雜，會對微生物的生長有一定的抑制作用，甚至還會抑制微生物分泌蛋白多糖，經發明人不斷研究發現：黃柏、黃苓和蘆薈的中藥混合濃縮液能有效提高微生物對蛋白多糖的分泌能力，分泌足夠多的蛋白多糖才能達到對海產品的保鮮效果， 而且，從該保鮮劑的等溫吸濕曲線表明：該保鮮劑具有高水分含量與低水活性轉捩點的等溫吸濕曲線，這表明該保鮮劑具有優良的保水與保鮮效果。能有效提高海產品的保水能力和抗菌性；水活性是指自由水是產品保質的一個重要指標；本申請保鮮劑保鮮處理後，海產品的水活性達到0.75以下，說明能抑制多數細菌、酵母菌、黴菌、嗜鹽細菌的生長，具有很好的抑菌效果。
圖1 是本發明單因素實驗中藥添加量對蛋白多糖產量的影響圖；
圖2 是本發明單因素實驗發酵時間對蛋白多糖產量的影響圖；
圖3 是本發明單因素實驗菌種添加量對蛋白多糖產量的影響圖；
圖4 是本發明實施例蛋白多糖乳化作用能力圖；
圖5 是本發明實施例蛋白多糖的等溫吸濕曲線圖。
本說明書中公開的所有特徵，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特徵和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。
本說明書(包括任何附加權利要求、摘要)中公開的任一特徵，除非特別敘述，每個特徵只是一系列等效或類似特徵中的一個例子而已。
實施例1：
本實施例的生態型保鮮劑製備方法包括如下步驟：
1.製備複合乳酸菌菌液：
①製備中藥混合濃縮液：將黃柏、黃苓和蘆薈的單味中藥分別與蒸餾水按照質量比為2：200混合，煮沸，並保持沸騰狀態30min，然後濃縮至原液的1/2，濃縮後進行冷卻、在5000r/min條件下離心10min，收集離心液得到中藥濃縮液I；將離心沉澱物再與蒸餾水再次混合，並重複中藥濃縮液I的製備方法提取中藥濃縮液II，將中藥濃縮液I和中藥濃縮液II合併得到相應的黃柏、黃苓和蘆薈中藥濃縮液；之後將黃柏、黃苓和蘆薈中藥濃縮液按照等體積比混合得到所述中藥混合濃縮液；
②製備澱粉混合物溶液：將白米粉、玉米粉、麵粉各自以2：200熬煮20min後，在6000r/min轉速下離心15min、過濾、取濾液以體積比為1：1：1混合而成。
③製備活化培養基：取26g的MRS培養基和7.2g的NB培養基混合後溶於蒸餾水中，並補水至1L；pH5.5；
④製備強化培養基：將NB培養基和步驟②的澱粉混合物溶液按照體積比為1：1混合，然後再加入6mL/L的步驟1)中藥混合濃縮液；混勻後將pH值調整為5.5；
⑤將活菌數均為2.0×109cfu/g的嗜熱乳酸桿菌、約氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌分別按照1mg/L的接種量分別接種到步驟③的活化培養基中，在40℃、兼性厭氧條件下靜置培養24h；
⑥然後取步驟⑤活化後的菌液3ml分別接種於步驟④的強化培養基中混勻，培養48h得到相應的嗜熱乳酸桿菌、約氏乳桿菌、鼠李糖 乳桿菌強化菌液，最後將上述強化菌液按照等體積比混合得到複合乳酸菌菌液。
2、接種複合乳酸菌發酵製備生物保鮮劑：
(1)按照如下體積百分數量取各原料：10%的步驟⑥的複合乳酸菌菌液、2%的步驟①的中藥濃縮液，餘量為基礎培養基，混勻後將pH值調整為5.5；其中，基礎培養基製備方法為：將NB培養基中和步驟②的澱粉混合物溶液按照體積比為1：1混合制得；
(2)將步驟(1)的培養基混合後，在40℃條件下培養12h得到發酵產物，然後將發酵產物進行過濾、收集濾液在5000r/min轉速下離心20min，收集上清液，用減壓濃縮機將上清液濃縮至原體積的1/3後，向濃縮液中加入等體積濃度為95%的乙醇溶液混勻，於4℃下靜置24h至沉澱析出，於5000r/min轉速下離心20min，取沉澱物經透析純化，再將透析液真空冷凍乾燥、磨粉；得到粗品生物保鮮劑。
實施例2：
本實施例的生態型保鮮劑製備方法包括如下步驟：
1、製備複合乳酸菌菌液：
①製備中藥混合濃縮液：將黃柏、黃苓和蘆薈的單味中藥分別與蒸餾水按照質量比為2：300混合，煮沸，並保持沸騰狀態40min，然後濃縮至原液的1/2，濃縮後進行冷卻、在5000r/min條件下離心15min，收集離心液得到中藥濃縮液I；將離心沉澱物再與蒸餾水再次混合，並重複中藥濃縮液I的製備方法提取中藥濃縮液II，將中藥濃縮液I和中藥濃縮液II合併得到相應的黃柏、黃苓和蘆薈中藥濃縮液；之後將黃柏、黃苓和蘆薈中藥 濃縮液按照等體積比混合得到所述中藥混合濃縮液；
②製備澱粉混合物溶液：將白米粉、玉米粉、麵粉各自以2：300熬煮30min後，在5000r/min轉速下離心20min、過濾、取濾液以1：1：1混合而成。
③製備活化培養基：取26g的MRS培養基和7.2g的NB培養基混合後溶於蒸餾水中，並補水至1L；pH7.0；
④製備強化培養基：將NB培養基中和步驟②的澱粉混合物溶液按照體積比為1：1混合，然後再加入3mL/L的步驟①中藥混合濃縮液；混勻後將pH值調整為7.0；
⑤將活菌數均為2.0×109cfu/g的嗜熱乳酸桿菌、約氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌分別按照1mg/L的接種量分別接種到步驟③的活化培養基中，在40℃、兼性厭氧條件下靜置培養24h；
⑥然後取步驟⑤活化後的菌液接種於步驟④的強化培養基中混勻，培養48h得到相應的嗜熱乳酸桿菌、約氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌強化菌液，最後將上述強化菌液按照等體積比混合得到複合乳酸菌菌液。
2、接種複合乳酸菌發酵製備生物保鮮劑：
(1)按照如下體積百分數量取各原料：12%的步驟⑥的複合乳酸菌菌液、3%的步驟①的中藥濃縮液，餘量為基礎培養基，混勻後將pH值調整為7.0；其中，基礎培養基製備方法為：將NB培養基中和步驟②的澱粉混合物溶液按照體積比為1：1混合制得；
(2)將步驟(1)的培養基混合後，在41℃條件下培養10h得到發酵產物，然後將發酵產物進行過濾、收集濾液在6000r/min轉速下離 心15min，收集上清液，用減壓濃縮機將上清液濃縮至原體積的1/3後，向濃縮液中加入等體積濃度為95%的乙醇溶液混勻，於4℃下靜置24h至沉澱析出，於6000r/min轉速下離心15min，取沉澱物經透析純化，再將透析液真空冷凍乾燥、磨粉；得到粗品生物保鮮劑。
實施例3：
本實施例的生態型保鮮劑製備方法包括如下步驟：
1、製備複合乳酸菌菌液：
①製備中藥混合濃縮液：將黃柏、黃苓和蘆薈的單味中藥分別與蒸餾水按照質量比為2：250混合，煮沸，並保持沸騰狀態35min，然後濃縮至原液的1/2，濃縮後進行冷卻、在5000r/min條件下離心12min，收集離心液得到中藥濃縮液I；將離心沉澱物再與蒸餾水再次混合，並重複中藥濃縮液I的製備方法提取中藥濃縮液II，將中藥濃縮液I和中藥濃縮液II合併得到相應的黃柏、黃苓和蘆薈中藥濃縮液；之後將黃柏、黃苓和蘆薈中藥濃縮液按照等體積比混合得到所述中藥混合濃縮液；
②製備澱粉混合物溶液：將白米粉、玉米粉、麵粉各自以2：250熬煮20-30min後，在5500r/min轉速下離心18min、過濾、取濾液以1：1：1混合而成。
③製備活化培養基：取26g的MRS培養基和7.2g的NB培養基混合後溶於蒸餾水中，並補水至1L；pH6.0；
④製備強化培養基：將NB培養基和步驟②的澱粉混合物溶液按照體積比為1：1混合，然後再加入4mL/L的步驟①中藥混合濃縮液；混勻後將pH值調整為6.0；
⑤將活菌數均為2.0×109cfu/g的嗜熱乳酸桿菌、約氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌分別按照1mg/L的接種量分別接種到步驟③的活化培養基中，在40℃、兼性厭氧條件下靜置培養24h；
⑥然後取步驟⑤活化後的菌液3ml分別接種於步驟④的強化培養基中混勻，培養48h得到相應的嗜熱乳酸桿菌、約氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌強化菌液，最後將上述強化菌液按照等體積比混合得到複合乳酸菌菌液。
2、接種複合乳酸菌發酵製備生物保鮮劑：
(1)按照如下體積百分數量取各原料：14%的步驟⑥的複合乳酸菌菌液、4%的步驟①的中藥濃縮液，餘量為基礎培養基，混勻後將pH值調整為6.0；其中，基礎培養基製備方法為：將NB培養基中和步驟②的澱粉混合物溶液按照體積比為1：1混合制得；
(2)將步驟(1)的培養基混合後，在42℃條件下培養8h得到發酵產物，然後將發酵產物進行過濾、收集濾液在5500r/min轉速下離心18min，收集上清液，用減壓濃縮機將上清液濃縮至原體積的1/3後，向濃縮液中加入等體積濃度為95%的乙醇溶液混勻，於4℃下靜置24h至沉澱析出，於5500r/min轉速下離心18min，取沉澱物經透析純化，再將透析液真空冷凍乾燥、磨粉；得到粗品生物保鮮劑。
特別說明：上述實施例1-3為避免污染施用物件，將保鮮劑再進一步進行巴氏滅菌法滅酶殺菌處理，處理條件為65℃,30min。申請人研究發現，該成分經巴氏滅菌法滅酶殺菌後仍擁有特殊的等溫吸濕曲線而具有良好的乳化保水效果，抗氧化功能及抑菌防腐作用等，保鮮功能效果良好。
一、重點參數步驟探索：
設置中藥添加量、發酵時間添加量、菌種添加量的單因素實驗；按照實施例1的方法生產蛋白多糖，測定蛋白多糖產量，
其中，中藥添加量是指：中藥添加到發酵培養基中的量；
菌種添加量是指：菌種經活化、強化培養基培養製備得到複合乳酸菌，複合乳酸菌再接種到發酵培養基中的量；
發酵時間是指：複合乳酸菌接種到發酵培養基中，在發酵培養基中的反應時間。
結果見圖1-3所示：
中藥添加量對蛋白多糖生產的影響結果如圖1所示。隨著中藥添加量的增加，蛋白多糖的產量呈先上升後下降的趨勢。中藥添加量的變化，主要是影響乳酸菌的發酵作用，提供發酵生產蛋白多糖的刺激因數，強化乳酸菌的生長並激發酶類的生化反應。當添加量為3%時，蛋白多糖的產量最高，此時乳酸菌的生長達最穩定，發酵作用最為旺盛，最適合蛋白多糖的生產。
發酵時間對蛋白多糖生產的影響結果如圖2所示。隨著發酵時間的增加，蛋白多糖生產呈上升後趨平現象。蛋白多糖生產發酵時間從4-12h時，乳酸菌快速生長，菌體生長量增加，從而蛋白多糖也隨之增加，當發酵時間達10h時，蛋白多糖生產量達最大後趨穩定，因此蛋白多糖最適生產的發酵時間為10h-12h。
菌種添加量對蛋白多糖生產的影響結果如圖3所示。菌種添加量對蛋白多糖生產是呈先上升後下降的趨勢。菌種添加量於6%-12%時約 與蛋白多糖產量成正相關，菌種添加量于12%時約為6%時的2倍，菌種添加量增加有利於蛋白多糖的生產；但添加至14%則過多而消化了蛋白多糖使之產量減少，由於微生物量增多競爭食物而減少蛋白多糖的生產。故最適菌種添加量為12%左右。
根據單因素實驗結果設計正交實驗，具體如下：
根據單因素試驗結果，選取中藥添加量、菌種添加量和發酵時間等因素進行三因素三水準的L9(33)正交優化試驗，試驗因素水準如表3所示，正交試驗結果及極差分析結果如表4所示，各因素對蛋白多糖生產影響的主次順序為A>C>B，即中藥添加量對蛋白多糖生產影響最大，其次為發酵時間，菌種添加量的影響則最小。最優組合為A2B2C3，即中藥添加量3%，菌種添加量12%，發酵時間12h。適當的菌種添加量可稍微促進蛋白多糖生產，充足的發酵時間比菌種添加量可較為促進產生蛋白多糖，而適當的中藥添加量則可大為強化促進蛋白多糖的生產，但過量的中藥則會限制蛋白多糖的生產。
表1 蛋白多糖生產正交實驗因素水準
Figure 110112844-A0101-12-0013-1
表2 正交試驗結果及極差分析結果
Figure 110112844-A0101-12-0014-2
經發明人研究發現，本申請的保鮮劑其蛋白多糖含量比常規組高，因此，針對蛋白多糖產率發明人做了如下實驗：
二、蛋白多糖產率測試：
實驗1：中藥培養基成分對蛋白多糖產率的影響：
實驗組：按照“重點參數步驟探索”正交實驗的最佳條件，即(中藥添加量3%，菌種添加量12%，發酵時間12h)製備蛋白多糖；製備過程的其他方法：即製備複合乳酸菌菌液、提取、純化蛋白多糖的方法與實施例1完全一致。
對照組1：僅採用MRS培養基生產蛋白多糖，即製備方法為：將微生物菌種按照說明書直接接種到MRS培養基中，在40℃條件下培 養12h得到發酵產物，然後將發酵產物進行過濾、收集濾液在5000r/min轉速下離心20min，收集上清液，用減壓濃縮機將上清液濃縮至原體積的1/3後，向濃縮液中加入等體積濃度為95%的乙醇溶液混勻，於4℃下靜置24h至沉澱析出，於5000r/min轉速下離心20min，取沉澱物經透析純化，再將透析液真空冷凍乾燥、磨粉；得到粗品生物保鮮劑。
對照組2：中藥濃縮液的中藥成分僅有黃柏和黃苓，其它技術參數及製備方法與實驗組1完全相同。
控制組：純新鮮蠔汁。
將實驗組和對照組1-2的微生物發酵後中藥發酵液放入冰箱上層靜置3小時後，再分裝至離心管中進行離心6000r/min，15min，離心後提取沉澱物至稱量瓶內，放入105℃的烘箱中進行72h烘乾，稱量恒重得細胞幹重。上清液加入3倍等體積的95%酒精，放入冰箱上層靜置24h後進行萃取，再用真空冷凍乾燥法析出沉澱物，進行稱量得蛋白多糖產量，蛋白多糖幹重與菌體幹重的比值即為蛋白多糖的產率。
測試結果見表3：
表3 中藥培養基成分對蛋白多糖的影響產率
Figure 110112844-A0101-12-0015-3
注：表中a，b，c，d表示同一列比較具有統計學的顯著差異(P<0.05)。
由表3可知，實驗組的蛋白多糖產率明顯大於對照組1-2和控制組。說明添加中藥濃縮液可有效提高微生物的蛋白多糖產量；且多種中藥組合的中藥液其對蛋白多糖的含量增加有促進作用。
實驗2：中藥乳酸菌配方對蛋白多糖產率的影響：
申請人在進行中藥強化培養基和發酵乳酸菌的摸索過程中進行了大量的實驗，最終發現，採用本申請公開的中藥培養基配方和乳酸菌配方能有效提高蛋白多糖產率，具體如下(申請人做了很多組，這裡僅列具有代表性的3組)：
組1：採用黃柏，伏苓和蘆薈的中藥混合濃縮液強化培養嗜熱乳酸桿菌、約氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌，並按照實施例1的方案製備蛋白多糖；即為實施例1的方案；
組2：採用枸杞子、紅景天和紅麴的中藥混合濃縮液強化培養嗜酸乳桿菌、青春雙岐桿菌和副乾酪乳桿菌；其他技術參數和製備方法按照實施例1進行，最終製備得到蛋白多糖產品；
組3：採用黃苓，山藥和綠藻的中藥混合濃縮液強化培養植物乳桿菌、約氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌；其他技術參數和製備方法按照實施例1進行，最終製備得到蛋白多糖產品；
具體實驗方法為：
將組1-3的微生物發酵後中藥發酵液放入冰箱上層靜置3小時後，再分裝至離心管中進行離心6000r/min，15min，離心後提取沉澱物至稱量瓶內，放入105℃的烘箱中進行72h烘乾，稱量恒重得細胞幹重。上清液加入3倍等體積的95%酒精，放入冰箱上層靜置24h後進行萃取，再用 真空冷凍乾燥法析出沉澱物，進行稱量得蛋白多糖產量，蛋白多糖幹重與菌體幹重的比值即為蛋白多糖的產率。測試結果見表4：
表4中藥乳酸菌配方對蛋白多糖產率的影響
Figure 110112844-A0101-12-0017-4
注：表中a，b表示同一列比較具有統計學的顯著差異(P<0.05)。
從表4可看出，組1的蛋白多糖產率顯著高於組2-3(P<0.05)，說明本申請的中藥配合與乳酸菌配合使用能有效提高蛋白多糖產率。
實驗3：粗蛋白多糖的純化及純蛋白多糖中蛋白質與多糖含量測定：
本申請的實施例以及實驗1和實驗2製備得到的均為粗蛋白多糖(僅經過1次透析處理)；為了進一步對蛋白多糖進行純化，並分析純化後蛋白多糖的主要組成成分，申請人還對組1-3的粗蛋白多糖再進行二次循環純化：取所得粗品蛋白多糖經分子量(18-20kD)透析，透析液經真空冷凍乾燥、磨粉後以蒸餾水清洗過濾。再將蒸餾水清洗濾液經分子量(18-20kD)透析，真空冷凍乾燥、磨粉得純化約90%的純蛋白多糖。再利用酸水解純蛋白多糖並分別測定水解前後蛋白質和多糖含量及純蛋白多糖品質，其中，純蛋白多糖中蛋白質和多糖總和的回收率約90.3%-91.2%，具體見表5。本實驗蛋白質測定採用GB 5009.5-2010的凱氏定氮法，多糖測定採用總糖苯酚硫酸法測定。
其中，純蛋白多糖的純化回收率的計算方法為：(純蛋白多糖/粗蛋白多糖)×100%；
蛋白質和多糖的總回收率的計算方法為：[(蛋白質+多糖)/純蛋白多糖]×100%。
表5 純蛋白多糖中蛋白質與多糖含量
Figure 110112844-A0101-12-0018-5
注：表中a，b，c表示同一列比較具有統計學的顯著差異(P<0.05)。控制組為未經酸水解的純蛋白多糖。
從表5可知，本申請的保鮮劑主要為蛋白質與多糖組成，其中組1的蛋白質含量、多糖含量、純蛋白多糖含量顯著高於組2-3(P<0.05)；而組2-3的蛋白質含量、多糖含量、純蛋白多糖含量之間並無顯著差異(P>0.05)；說明，本申請的中藥乳酸菌配方較能生產更多的蛋白多糖，效果優於其他中藥乳酸菌配方組合。
三、蛋白多糖的乳化效果測試：
實驗組：按照“重點參數步驟探索”正交實驗的最佳條件，即(中藥添加量3%，菌種添加量12%，發酵時間12h)製備蛋白多糖；製備過程的其他方法：即製備複合乳酸菌菌液、提取、純化蛋白多糖的方法與實施例1完全一致；
控制組：採用MRS培養基生產得到的蛋白多糖；其他提取、純化蛋白多糖的方法與實施例1完全一致；
對照組：純新鮮蠔汁10mg/mL。
取新鮮蠔汁與蛋白多糖混合(1：1)然後與實驗組(EX)和控制組(CL)進行配置，使各組的蛋白多糖溶液終濃度為10mg/mL，然後將實驗組(EX)、控制組(CL)和對照組(BK)分別以體積比2：3與花生油混合，在震盪器上進行震盪2min，靜止24h後測量乳化層和總高度。計算乳化指數；其中，乳化指數的計算公式如下：
乳化指數(%)=(乳化層高度/總溶液高度)×100%
乳化結果見圖4：添加中藥的實驗組(EX)(85.10±2.40%)皆比不添加中藥的控制組(CL)(62.1±2.9%)與純新鮮蠔汁(BK)(36.2±1.5%)具有顯著較高的乳化活性(P<0.05)，乳化指數的高低大致呈現實驗組(EX)>控制組(CL)>對照組(BK)，其中實驗組(EX)比控制組(CL)大約有1.3~1.5倍的效果，比對照組(BK)大約有2.2~2.5倍的效果，此現象顯示乳化指數與蛋白多糖濃度呈現密切相關，可說明中草藥對乳化效果有促進作用。
四、保鮮劑的抗氧化活性研究：
對照組1：
本對照組活化益生菌時不添加中藥濃縮液，其它實施方式與實施例1一致，即強化培養基按照強化培養基成分配置但不含中藥混合濃縮液：由澱粉混合物溶液和NB培養基按照質量比為1：1製成基礎培養基，將培養基的pH調整為5.5；然後向基礎培養基中直接接種益生菌，同等條件下發酵。
對照組2：
本對照組使用MRS培養基來發酵生產蛋白多糖，即製備方法為：將微生物菌種按照說明書直接接種到MRS培養基中，在40℃條件下培養12h得到發酵產物，然後將發酵產物進行過濾、收集濾液在5000r/min轉速下離心20min，收集上清液，用減壓濃縮機將上清液濃縮至原體積的1/3後，向濃縮液中加入等體積濃度為95%的乙醇溶液混勻，於4℃下靜置24h至沉澱析出，於5000r/min轉速下離心20min，取沉澱物經透析純化，再將透析液真空冷凍乾燥、磨粉；得到粗品生物保鮮劑。
對照組3：
本對照組僅選用2味中藥即黃柏和黃苓製備中藥濃縮液，然後利用此中藥混合濃縮液製備中藥培養基，其他技術參數和製備方法按照實施例1進行，最終製備得到蛋白多糖產品。
對照組4：
純新鮮蠔汁。
抗氧化實驗
氧化保健效果以DPPH自由基清除能力，還原力，亞鐵離子螯合作用及亞油酸過氧化的抑制作用等抗氧化指標作為評估依據，並以總酚含量說明抗氧化的效果機理；具體測試實施例1、對照組1-5和陽性對照(維生素C)的DPPH自由基清除能力、還原力、亞鐵離子鼇合作用、亞油酸過氧化的抑制作用和總酚含量。測試方式如下：
(1)DPPH自由基清除能力：
配製10mL的各實驗組樣品溶液，濃度為10mg/mL。用移液 管各取2.5mL樣品溶液加到3支試管中。稱取0.001g DPPH置於50mL小燒杯中，加入酒精進行溶解後，用容量瓶配製50mL DPPH溶液。用移液管各取2.5mL的DPPH溶液加到含有2.5mL的樣品溶液試管中，混合均勻。在黑暗中靜止20min後將試管放在波長517nm處測定吸光值。另外以蒸餾水同樣步驟進行控制組測試。並用抗壞血酸做陽性對照。DPPH清除能力計算方法如下：
DPPH清除能力(%)=[(OD517控制組-OD517試樣)]/(OD517控制組)]×100
式中OD517控制組為控制組吸光值，OD517試樣為試樣吸光值。
(2)還原力：
取各實驗組樣品溶液，分別加入1mL緩衝溶液(Buffer)和1mL K3Fe(CN)6溶液，再將試管放入調至50℃烘箱中烘焙20分鐘取出試管，分別加入2.5mL的蒸餾水和0.5mL的FeCl3，使其反應20min然後測定700nm時的吸光值，分別表徵各組樣品溶液的還原力。並用抗壞血酸做陽性對照。
(3)亞鐵離子螯合作用
根據Dinis等人的研究方法稍加修改，取各實驗組的樣品溶液分別加入2.775mL通用緩衝液(pH值7.4)和2mmol/L，0.075mL FeCl2溶液。反應開始後加入5mmol/L 0.15mL的ferrozine溶液。10分鐘後，在室溫下，測定560nm的吸光值。另外以蒸餾水同樣步驟進行控制組測試。並用乙二胺四乙酸(EDTA)作為陽性對照。螯合能力計算方法如下：
螯合能力(%)=[(OD560控制組-OD560樣品)(OD560控制組)-1]×100；
式中OD560控制組為控制組吸光值，OD560試樣為試樣吸光值。
(4)亞油酸過氧化的抑制作用
採用硫氰酸鐵法，取實驗組的的樣品溶液，分別混合2.5mL，0.2mol/L亞油酸在2mL，0.2mol/L磷酸鹽緩衝液(pH值為6.6)在試管中放置在黑暗中37℃中加速氧化。24小時後，加入4.7mL的75%酒精，然後加入0.1mL 30% NH4SCN和0.1mL 20mmol/L FeCl2.4H2O，混合3分鐘。在500nm吸光值下測定抗氧化活性(AOA)，另外以蒸餾水同樣步驟進行控制組測試。並用抗壞血酸做陽性對照。抗氧化活性(AOA)計算方法如下，
AOA(%)=[(OD500控制組-OD500樣品)(OD500控制組)-1]×100；
式中OD500控制組為控制組吸光值，OD500試樣為試樣吸光值。
(5)總酚含量
取定量的樣品溶液，分別加入0.2mL的Folin-Ciocalteu試劑和2mL的純水。靜置五分鐘後加入1mL 20%的Na2CO3溶液，震盪後於黑暗環境下靜置1h。最後測波長760nm處的吸光值。對比沒食子酸標準曲線以求出樣品溶液的總酚含量。配製10mg/mL的沒食子酸溶液，即取200mg沒食子酸加入20mL蒸餾水。然後加入不同蒸餾水量稀釋之，使沒食子酸的濃度成一定量的梯度分佈(如2mg/mL，4mg/mL，6mg/mL，8mg/mL，10mg/mL)，再分別測其吸光值製作標準曲線，以吸光值換算濃度得總酚含量。
實驗結果見表6：
表6 保鮮劑的抗氧化效果
Figure 110112844-A0101-12-0023-6
注：表中a，b，c，d，e表示同一列比較具有統計學的顯著差異(P<0.05)。
由表6可知，實施例1的DPPH清除能力、還原力、螯合能力、AOA、總酚含量皆大於對照組1-4，由此見，發酵過程添加中藥液進行發酵能有效促進本申請的保鮮劑的抗氧化能力。
五、保鮮實驗：
實驗1：蛋白多糖對海產品保鮮效果
①蛋白多糖對污染菌的抑菌效果
實驗組：按照“重點參數步驟探索”正交實驗的最佳條件，即(中藥添加量3%，菌種添加量12%，發酵時間12h)製備蛋白多糖；
控制組：採用MRS培養基生產得到的蛋白多糖；
對照組：純新鮮蠔汁。
本抑菌試驗物件包含常見海產品的污染菌例如大腸桿菌(E.Coli)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，志賀菌(Shigella)及沙門氏菌(Salmonella)等。首先以營養培養基(NB)進行24h震盪培養四種污染菌，分別吸取適量菌液均勻塗抹於營養瓊脂培養基(NA)。在平板上打4個孔洞後，將蛋白多糖溶液注入孔洞中，靜置3min，放入37℃培養箱中過夜，次日測量抑菌圈直徑並記錄。抑菌圈直徑>20mm為極敏，抑菌圈直徑15~20mm為高敏，抑菌圈直徑為10~15mm為中敏，抑菌圈直徑<10mm為低敏，無抑菌圈為不敏感。
實驗結果如表7所示：
表7 蛋白多糖抑菌效果
Figure 110112844-A0101-12-0024-7
注：抑菌圈單位：mm；--，表無抑菌效果。英文a，b表示同一行比較具有統計學的顯著差異(P<0.05)。
由表7可知，實驗組抑菌圈對污染菌的大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，志賀菌及沙門氏菌分別為18.4±0.5mm為高敏，8.7±0.8mm為低敏，10.8±0.6mm為中敏，13.6±0.4mm為中敏，可知，實驗組皆顯著比控制組與對照組的抑菌圈大，具有統計學的顯著差異(P<0.05)。顯示添加中藥發酵蛋白多糖的實驗組皆顯著比控制組與對照組的抑菌效果為大，具有統計學顯著差異(P<0.05)。由於大腸桿菌為海產品普遍的污染菌，繁殖力強，對環境的適應力強，因此抑菌效果也相對顯著。同樣沙門氏菌引起的食物中毒常列為榜首，中國內陸地區也以沙門氏菌為首位。但由於沙門氏菌在水中不易繁殖，因此對沙門氏菌的抑菌效果也較為顯著。金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次於大腸桿菌。由於金黃色葡萄球菌的細胞壁含90%的肽聚糖和10%的磷壁酸，具有較強的對抗抑菌效果，因此不論實驗組或控制組皆顯示抑菌能力與效果最小。志賀菌一般對營養要求不高，因此也極易生長成為污染菌，相對抑菌效果也顯著，故蛋白多糖對四種海產品污染菌的抑菌能力依次為大腸桿菌>沙門氏菌>志賀菌>金黃色葡萄球菌。
②蛋白多糖的等溫吸濕曲線
如圖5，本申請蛋白多糖的等溫吸濕曲線顯示，該保鮮劑具有高水分含量與低水活性轉捩點的等溫吸濕曲線，這表明該蛋白多糖具有高保水性，低水活性特質，可保鮮兼防腐效果，在等溫吸濕曲線的轉捩點上，保水含量可達7.0%，而水活性僅為0.65，可防止細菌，酵母菌，黴菌等 微生物污染。
③對海產品的保鮮研究
按如下組別設計實驗組：
實驗組(OPT組)：按照“重點參數步驟探索”正交實驗的最佳條件，即(中藥添加量3%，菌種添加量12%，發酵時間12h)的生產方法生產得到的保鮮劑；
對照組(MRS組)：採用MRS培養基生產得到的保鮮劑；
空白組：蒸餾水。
將實驗組與對照組的保鮮劑配成10mg/mL的保鮮劑溶液；
羅非魚保鮮：將新鮮羅非魚切片絞碎後分別浸泡到實驗組、對照組和空白組的溶液中，常溫放置10min；
牡蠣保鮮：將新鮮牡蠣去殼後洗淨、絞碎，浸泡到實驗組、對照組和空白組的溶液中，常溫放置10min；
對蝦保鮮：將新鮮對蝦去殼後洗淨、絞碎，浸泡到實驗組、對照組和空白組的溶液中，常溫放置10min；
蛤蜊保鮮：將新鮮蛤蜊去殼後洗淨、絞碎，浸泡到實驗組、對照組和空白組的溶液中，常溫放置10min；
青蟹保鮮：將新鮮青蟹去殼後洗淨、絞碎，浸泡到實驗組、對照組和空白組的溶液中，常溫放置10min。
水分測定：使用HE53/02水分測定儀直接測定其水份含量；
水活度測定：使用水分活度測定儀直接測定其水分活度。測定結果如表8所示：
表8 海產品的水份含量和水活性
Figure 110112844-A0101-12-0026-9
注：表中a、b、c表示在實驗組OPT，對照組MRS及空白組中差異具有統計學意義(P<0.05)。
從表8可以看出，實驗組(OPT)的水份含量均顯著高於對照組(MRS)與空白組(P<0.05)；實驗組(OPT)的水份含量均顯著低於對照組(MRS)與空白組(P<0.05)；實驗組的保水能力優於對照組的水份含量，能更好地保存羅非魚的鮮度，也說明了最優組合中藥培養基可促進乳酸菌發酵粗蛋白多糖對海產品的保水能力。
實驗2：蛋白多糖果汁的保鮮效果
①總菌落數試驗
實驗組：按照“重點參數步驟探索”正交實驗的最佳條件，即(中藥添加量3%、菌種添加量12%、發酵時間12h)製備蛋白多糖採用實施例1製備的蛋白多糖保鮮劑。
控制組：採用MRS培養基生產得到的保鮮劑，即製備方法為：將微生物菌種按照說明書直接接種到MRS培養基中，在40℃條件下培養12h得到發酵產物，然後將發酵產物進行過濾、收集濾液在5000r/min轉速下離心20min，收集上清液，用減壓濃縮機將上清液濃縮至原體積的1/3後，向濃縮液中加入等體積濃度為95%的乙醇溶液混勻，於4℃下靜置24h至沉澱析出，於5000r/min轉速下離心20min，取沉澱物經透析純化，再將透析液真空冷凍乾燥、磨粉；得到粗品生物保鮮劑。
對照組：純新鮮果汁。
將保鮮劑按照10mg/mL的添加量添加到實驗組和控制組的果汁；實驗組、控制組和對照組的果汁相同，均選用百香果汁，即百香果榨汁後按實驗組與控制組各添加相應的保鮮劑，對照組不添加保鮮劑，然後三組皆經過巴氏滅菌、熱封罐包裝，將3組果汁在常溫下保藏，到第12個月，以平板計數法統計並觀察的污染菌總菌落數與大腸桿菌數，具體情況見表9：
表9 果汁涼茶保藏期限達12個月的總菌落數與大腸桿菌數
Figure 110112844-A0101-12-0027-10
注：英文a，b，c表示同一行比較具有統計學的顯著差異(P<0.05)。
由表9可見，12個月後實驗組的菌落數低於控制組和對照組，具有顯著差異(P<0.05)，本申請的保鮮劑具有很好的保鮮效果。
實驗3：蛋白多糖對果凍的保鮮效果
①總菌落數試驗
實驗組：按照“重點參數步驟探索”正交實驗的最佳條件，即(中藥添加量3%、菌種添加量12%、發酵時間12h)製備蛋白多糖採用實施例1製備的蛋白多糖保鮮劑。
控制組：採用MRS培養基生產得到的保鮮劑，即製備方法為：將微生物菌種按照說明書直接接種到MRS培養基中，在40℃條件下培養12h得到發酵產物，然後將發酵產物進行過濾、收集濾液在5000r/min轉速下離心20min，收集上清液，用減壓濃縮機將上清液濃縮至原體積的1/3後，向濃縮液中加入等體積濃度為95%的乙醇溶液混勻，於4℃下靜置24h至沉澱析出，於5000r/min轉速下離心20min，取沉澱物經透析純化，再將透析液真空冷凍乾燥、磨粉；得到粗品生物保鮮劑。
對照組：純優酪乳仙草凍。
將保鮮劑按照10mg/mL的添加量添加到實驗組和控制組的 果凍中，實驗組、控制組和對照組的果凍相同，主料為奶粉和瓊脂，實驗組和控制組按照要求添加相應的保鮮劑，對照組不添加，製備完成後三組皆經過巴氏滅菌、無菌包裝；將3組優酪乳仙草凍在常溫下保藏12個月，以平板計數法統計並觀察在保藏期限達12個月的污染菌總菌落數與大腸桿菌數。具體見表10：
表10 優酪乳仙草凍保藏期限達12個月的總菌落數與大腸桿菌數
Figure 110112844-A0101-12-0028-11
注：英文a，b，c表示同一行比較具有統計學的顯著差異(p<0.05)。
由表10可見，12個月後實驗組的菌落數低於控制組和對照組，具有顯著差異(P<0.05)，本申請的保鮮劑具有很好的保鮮效果。
綜上所述，使用本申請的方法生產的保鮮劑，其起到活性保鮮成分的是蛋白多糖，該成分具有良好的抗氧化功能和抑菌效果，同時還具有良好的保水效果，應用廣泛，同時還能起到保水效果，能提高食品的新鮮度。
以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但並不能因此而理解為對本發明範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬於本發明的保護範圍。因此，本發明的保護範圍應以所附權利要求為准。

Claims (10)

  1. 一種生態型生物保鮮劑，其特徵在於，所述保鮮劑為微生物的發酵產物，其發酵方法為：微生物經活化培養基和中藥強化培養基培養後得到強化乳酸菌，然後將強化乳酸菌接種至發酵培養基中制得發酵產物。
  2. 根據權利要求1所述的生態型生物保鮮劑，其特徵在於，所述微生物為嗜熱乳酸桿菌(Lactobacillus thermophilus)、約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)和/或鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)。
  3. 根據權利要求1所述的生態型生物保鮮劑，其特徵在於，所述活化培養基製備方法為：取26g的MRS培養基和7.2g的NB培養基混合後溶於蒸餾水中，並補水至1L制得；pH為5.5-7.0。
  4. 根據權利要求1所述的生態型生物保鮮劑，其特徵在於，所述中藥強化培養基製備方法為：將澱粉混合物溶液和NB培養基按照體積比為1：1製成基礎培養基；再添加3mL/L-6mL/L的中藥混合濃縮液混勻後，將培養基的pH調整為5.5-7.0；所述發酵培養基製備方法為：將澱粉混合物溶液和NB培養基按照體積比為1：1製成基礎培養基；再添加體積百分數為2%-4%的中藥混合濃縮液混勻後，將培養基的pH調整為5.5-7.0。
  5. 根據權利要求4所述的生態型生物保鮮劑，其特徵在於，所述中藥強化培養基與發酵培養基的中藥混合濃縮液相同，製備方法為：將黃柏、黃苓和蘆薈的單味中藥與蒸餾水按照質量比為2：200-300混合，煮沸，並保持沸騰狀態30-40min，然後濃縮至原液的1/2，濃縮後進行冷卻、在5000r/min條件下離心10-15min，收集離心液得到中藥濃縮液I；將離心沉澱物再與蒸餾水再次混合，並重複中藥濃縮液I的製備方法提取中藥濃縮液II，將中藥濃縮液I和中藥濃縮液II合併得到相應的黃柏、黃苓和蘆薈中藥濃縮液；之後將黃柏、黃苓和蘆薈中藥濃縮液按照等體積比混合得到所述中藥混合濃縮液。
  6. 根據權利要求4所述的生態型生物保鮮劑，其特徵在於，所述澱粉混合物溶液的製備方法為：將白米粉、玉米粉、麵粉各自以2： 200-300熬煮20-30min後，在5000-6000r/min轉速下離心15-20min、過濾、取濾液以體積比為1：1：1混合而成。
  7. 一種製備權利要求1-6任意一項生態型生物保鮮劑的方法，其特徵在於，所述方法為將微生物分別接種到活化培養基中活化後，再分別接種到中藥強化培養基中進行強化培養；之後按照等體積比將強化培養後的菌液進行混合，得到複合乳酸菌；再將複合乳酸菌接種到發酵培養基中，在40-42℃下密封培養8-12h後將發酵液經過提取得到生物保鮮劑；所述發酵培養基的複合乳酸菌接種量為10%-14%。
  8. 根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述發酵液提取方法為：在5000-6000r/min轉速下離心15-20min，收集上清液，用減壓濃縮機將上清液濃縮至原體積的1/3後，向濃縮液中加入等體積濃度為95%的乙醇溶液混勻，於4℃下靜置24h至沉澱析出，於5000-6000r/min轉速下離心15-20min，取沉澱物真空冷凍乾燥、磨粉。
  9. 根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述發酵液提取方法還包括，將沉澱物進行透析純化後再進行真空冷凍乾燥、磨粉。
  10. 一種如權利要求1-6任意一項生態型生物保鮮劑和權利要求7-8製備方法製備得到的生態型生物保鮮劑在食品保鮮上的應用。
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