TW202200789A - Ｗｐｒｅ突變體構建體、組合物及其方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提出了突變的土撥鼠轉錄後調控元件 (WPRE)。特別地，本發明涉及可以在逆轉錄病毒載體系統中有效表達目的核苷酸的突變 WPRE 序列。本發明還涉及向靶細胞中遞送和表達目的核苷酸的方法。

Description

WPRE　突變體構建體、組合物及其方法
這是一項根據專利合作條約的國際申請，要求於 2020 年 3 月 11 日提交的美國臨時專利申請號 62/988,202 的優先權，其內容透過引用整體併入本文。 對電子方式提交的序列表的引用
序列表的正式副本透過 EFS-Web 以 ASCII 格式序列表電子提交，其檔案名為「3000011-017977_Seq_Listing_ST25.txt」，創建於 2020 年 3 月 8 日，大小為 247,691 位元組，與說明書同時提交。此 ASCII 格式的文檔中包含的序列表是說明書的一部分，在此以引用的方式全文併入。
1.                 領域
本公開涉及一種載體，其包含突變的轉錄後調控元件。特別地，本發明涉及可以在逆轉錄病毒載體系統中有效表達目的核苷酸的突變 WPRE 序列。本發明還涉及在靶細胞中遞送和表達目的核苷酸的方法。
2.                 背景
逆轉錄病毒載體，例如慢病毒載體，已被提出作為遞送系統，用於（尤其是）將目的核苷酸轉移至一個或多個目的位元點。
逆轉錄病毒載體的一個缺點（無論基於逆轉錄病毒還是慢病毒）是它們常常不能產生高水準的基因表達，特別是在體內。轉錄和轉錄後的許多步驟參與調節基因表達。因此，有可能透過添加已知可在轉錄後增加基因表達的元件來增強表達逆轉錄病毒載體遞送的轉基因。一個實例為表達盒內包含內含子 (Choi, T. et al, (1991) Mol. Cell. Biol. 9:3070-3074)。體外和體內進行的許多基因轉移實驗均已證明，存在內含子可以促進基因表達。
其他類型的元件也可用於在轉錄後刺激異源基因表達。這些元件與內含子不同，其優點在於它們無需剪接事件。例如，之前的研究表明，乙型肝炎病毒 (HBV) 轉錄後調控元件 (PRE) 和內含子在功能上等效 (Huang, Z.M. and Yen, T. S. (1995) Mol. Cell. Biol. 15: 3864-3869)。與 HBV 密切相關的土撥鼠肝炎病毒 (WHV) 也帶有 PRE（以下簡稱WPRE；參見美國專利號 6,136,597 和 6,287,814）。WPRE 已顯示比其 HBV 對應物更具活性，這與 HBV PRE 中未發現的其他順式作用序列存在有關。在慢病毒載體中插入 WPRE 導致顯著刺激跨越不同物種的多種細胞中報告基因（如螢光素酶和綠色螢光蛋白 (GFP)）的表達 (Zufferey, R. et al. (1999) J. Virol 73:2886-2892)。刺激與轉導細胞的週期狀態無關。
WPRE 包含三個順式作用序列，其在增強表達水準中的功能起重要作用。但是，它也包含一個大約 180 個鹼基對 (bp) 的片段，其包括 WHV X 蛋白開放閱讀框的 5' 末端，以及與其相關的啟動子。全長 X 蛋白與腫瘤發生有關 (Flajolet, M. et al. (1998) J. Virol. 72:6175-6180)。由於病毒 DNA 插入宿主基因組而導致 myc 家族致癌基因順式啟動已知是 WHV 介導致癌作用的關鍵機制 (Buendia, M.A. (1994) In C. Brechot (ed.), Primary liver cancer: etiological and progression factors, p. 211-224:CRC Press, Boca Raton, Fla.; Fourel, G. (1994) In F. Tronche and M. Yaniv (ed.), Liver gene expression, p. 297-343; R. G. Landes Company, Austin, Tex.)。WHV X 蛋白的致瘤可能性引起將 WPRE 納入逆轉錄病毒載體的擔憂，特別是對於體內應用。
之前的研究表明，WPRE 內 X 蛋白開放閱讀框 (ORF) 突變降低了 X 蛋白的致瘤活性，從而提高了其納入逆轉錄病毒載體的安全性特徵（參見，例如，US 7,419,829；Donello, J.E. et al. (1998) J. Virol. 72(6):5085-5092；Schambach, A. et al.(2006) Gene Ther.13: 641-645；Zanta-Boussif, M.A. et al.(2009) Gene Ther.16: 605-619；Ou L. et al.(2016) Mol. Gen. Metab. Rep. 8:87-93）。但是，已在各種突變體 WPRE 中觀察到了對異源基因表達轉錄後刺激的不一致作用。通常，引入 WPRE 的突變程度越大，突變體 WPRE 刺激轉錄後異源基因表達的效果就越差。
因此，仍需要安全有效的 WPRE 用於逆轉錄病毒載體。
一方面，本申請涉及突變 WPRE 序列，其用於，例如，逆轉錄病毒載體（其中 WHV X 蛋白表達減弱或不存在）。在一些實施方案中，WPRE 內任何開放閱讀框 (ORF) 的起始密碼子發生突變，WHV X 蛋白啟動子被刪除，且 WHV X 蛋白 OFR 被刪除。在一些實施方案中，WHV X 蛋白啟動子和 WHV X 蛋白起始密碼子突變。
在一些實施方案中，突變的 WPRE 序列在對應於根據 SEQ ID NO: 1 所述的 WT WPRE核苷酸序列內核苷酸位置 106-108、152-154、245-247、272-274、283-285、362-364 和 603-605 的一個或多個起始密碼子處包含突變。在一些實施方案中，突變的 WPRE 序列在對應於根據 SEQ ID NO: 2 所述的 WT WPRE核苷酸序列內核苷酸位置 70-72、108-110、121-123、138-140、187-189 和 428-430 的一個或多個起始密碼子處包含突變。
起始密碼子可以在一個或多個起始密碼子內的一個、兩個或所有三個位置處突變。如果一個以上的起始密碼子突變，則每個起始密碼子突變可以彼此獨立。也就是說，WPRE 內突變的每個起始密碼子不需要以相同的方式發生突變。在一些實施方案中，一個或多個起始密碼子中的每一個在起始密碼子內的一個位置處突變。例如，起始密碼子的第一個核苷酸可以由「A」突變為「C」、「G」或「T」；或者起始密碼子的第二個核苷酸可以由「T」突變為「A」、「C」或「G」，或者起始密碼子的第三個核苷酸可以由「G」突變為「A」、「C」或「T」。在一些實施方案中，一個或多個起始密碼子由「ATG」突變為「TTG」。在一些實施方案中，一個或多個起始密碼子中的每一個由「ATG」突變為「TTG」。
在一些實施方案中，突變體 WPRE 序列選自 SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO: 4。
本申請還提出了包含本發明突變體 WPRE 的載體，例如逆轉錄病毒或慢病毒載體。此類載體可用於功能基因組學、藥物發現、靶驗證、產生蛋白質（例如治療性蛋白質、疫苗、單克隆抗體）、基因療法和治療性療法，例如用於適應性細胞療法的基因遞送系統。
在一些方面，提供了慢病毒轉導載體，以及用於其製備的構建體，可用於把可表達的目的核苷酸序列 (NOI) 引入宿主細胞。慢病毒轉導載體是一種包膜病毒粒子顆粒，其包含可表達的核苷酸序列，並能夠穿透靶宿主細胞，從而將可表達的序列攜帶進入細胞。包膜的顆粒優選用來自另一種病毒物種（包括非慢病毒）的工程改造或天然病毒包膜蛋白進行假型化處理，其改變了天然慢病毒的宿主範圍和感染性。如下文更詳細所述，轉導載體可用於廣泛的應用中，包括例如用於蛋白質生產（包括疫苗生產）、用於基因治療、用於遞送治療性多肽、用於遞送 siRNA、核酶、反義和其他功能性多核苷酸等。此類轉導載體能夠攜帶單個或多個基因並包括抑制序列（例如，RNAi 或反義序列）。
在一些方面，載體包含一個以上的 NOI。此類載體可以用於例如在宿主細胞中產生多聚體蛋白。在一些方面，載體包含編碼蛋白質 Z1 的第一核苷酸序列 S1 和編碼蛋白質 Z2 的第二核苷酸序列 S2，其中 Z1 和 Z2 形成二聚體。載體可以進一步包含編碼蛋白質 Y1 的第三核苷酸序列 S3 和編碼蛋白質 Y2 的第四核苷酸序列 S4，其中 Y1 和 Y2 形成第二二聚體。
另一方面，載體可以進一步包括編碼 2A 肽的第五核苷酸序列 S5 和編碼連接子肽的第六核苷酸序列 S6，其中 S5 和 S6 位於 S1 和 S2、S1 和 S3、S1 和 S4、S2 和 S3、S2 和 S4 和/或 S3 和 S4 之間。
在一些方面，2A 肽可以選自 P2A (SEQ ID NO: 6)、T2A (SEQ ID NO: 7)、E2A (SEQ ID NO: 8) 或 F2A (SEQ ID NO: 9)。
在一些方面，連接子肽是長度為 3 至 10 個氨基酸長度的任何肽。在一些方面，連接子肽可以為 GSG 或 SGSG (SEQ ID NO: 5)。
另一方面，所述載體可以進一步包含編碼弗林蛋白酶肽 (SEQ ID NO: 10) 的第七核苷酸序列 S7，所述弗林蛋白酶肽位於 S1 和 S2、S1 和 S3、S1 和 S4、S2 和 S3、S2 和 S4 和/或 S3 和 S4 之間。
另一方面，載體可以進一步包括控制 S1、S2、S3、S4、S5、S6 和/或 S7 轉錄的啟動子序列，其中所述啟動子序列選自巨細胞病毒 (CMV) 啟動子、磷酸甘油酸酯激酶 (PGK) 啟動子、髓磷脂鹼性蛋白 (MBP) 啟動子、神經膠質纖維酸性蛋白 (GFAP) 啟動子、包含骨髓增生性肉瘤病毒增強子的修飾 MoMuLV LTR (MNDU3)、泛素 C 啟動子、EF-1 α 啟動子或鼠幹細胞病毒 (MSCV) 啟動子。
在一些方面，第一二聚體 Z1Z2 可以選自 SEQ ID NO: 13 和 14、15 和 16、17 和 18、19 和 20、21 和 22、23 和 24、25 和 26、25 和 92、91 和 92、27 和 28、29 和 30、31 和 32、33 和 34、35 和 36、37 和 38、39 和 40、41 和 42、43 和 44、45 和 46、47 和 48、49 和 50、51 和 52、53 和 54、55 和 56、57 和 58、59 和 60、61 和 62、63 和 64、65 和 66、67 和 68、69 和 70、71 和 72、73 和 74、75 和 76、77 和 78、79 和 80、81 和 82、83 和 84、85 和 86、87 和 88 或 89 和 90。
在一些方面，第二二聚體 Y1Y2 在 SEQ ID NO: 11 和 12 中列出。
另一方面，病毒載體選自腺病毒、痘病毒、α 病毒、暈病毒、黃病毒、棒狀病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、皰疹病毒、副粘病毒或微小核糖核酸病毒。
另一方面，載體用病毒的包膜蛋白進行假型化處理，所述病毒選自天然貓內源性病毒 (RD114)、RD114 的嵌合版本 (RD114TR)、長臂猿白血病病毒 (GALV)、GALV 的嵌合版本 (GALV-TR)、雙嗜性鼠白血病病毒 (MLV 4070A)、桿狀病毒 (GP64)、水皰性口炎病毒 (VSV-G)、雞瘟病毒 (FPV)、埃博拉病毒 (EboV)、狒狒逆轉錄病毒包膜糖蛋白 (BaEV) 或淋巴細胞性脈絡膜腦膜炎病毒 (LCMV)。
一方面，本公開涉及一種製備用於免疫療法的 T 細胞的方法，包括從人體受試者的血液樣本中分離 T 細胞、在存在氨基二膦酸鹽的情況下啟動分離的 T 細胞、用本文所述的載體轉導啟動的 T 細胞、擴增轉導的 T 細胞。
另一方面，可以從白細胞分離術人樣本中分離 T 細胞。
另一方面，氨基二膦酸鹽可選自帕米膦酸、阿侖膦酸、唑來膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、恩加膦酸、其鹽和/或其水合物。
另一方面，可用 OKT3 和抗 CD28 啟動 T 細胞。
另一方面，所述啟動可以進一步在存在人重組白介素 2 (IL-2)、人重組白介素 15 (IL-15)、人重組白介素 7 (IL-7) 的情況下進行。
另一方面，擴增可以在存在 IL-2 和 IL-15 或 IL-15 和 IL-7 的情況下進行。
另一方面，T 細胞可以為 γδ T 細胞或 γδ T 細胞。
另一方面，第一二聚體 Z1Z2 和第二二聚體 Y1Y2 在擴增的 T 細胞表面上共表達。
另一方面，本公開涉及透過以上方面的方法製備的擴增 T 細胞群。
在一些方面，所述組合物進一步包括佐劑。
在一些方面、佐劑選自抗-CD40 抗體、咪喹莫特、雷西喹莫特、GM-CSF、環磷醯胺、舒尼替尼、貝伐單抗、阿特珠單抗、干擾素-α、干擾素-β、CpG 寡核苷酸和衍生物、聚 (I:C) 和衍生物、RNA、西地那非、含聚（丙交酯-共-乙交酯）(PLG) 的顆粒製劑、病毒體、白介素 (IL)-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL -12、IL-13、IL-15、IL-21 和 IL-23 中之一或多者。
一方面，本公開涉及一種治療癌症患者的方法，其包括向所述患者施用包含本文所述擴增 T 細胞群體的組合物，其中所述 T 細胞殺滅表面提呈與 MHC 分子複合的肽的癌細胞，其中所述肽選自 SEQ ID NO: 99-256 中的任何一個，其中所述癌症選自非小細胞肺癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、子宮癌、梅克爾細胞癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、結直腸癌、膀胱癌、腎癌、白血病、卵巢癌、食道癌、腦癌、胃癌和攝護腺癌組成的組。
一方面，本公開涉及本文所述的 T 細胞或包含本文所述擴增 T 細胞群的組合物，用於治療癌症，其中所述癌症選自非小細胞肺癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、子宮癌、梅克爾細胞癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、結直腸癌、膀胱癌、腎癌、白血病、卵巢癌、食道癌、腦癌、胃癌和攝護腺癌組成的組。
另一方面，本發明涉及本文所述的 T 細胞或包含本文所述 T 細胞的組合物在製備藥物中的用途。
另一方面，本發明涉及本文所述的 T 細胞或包含本文所述 T 細胞的組合物在製備用於治療癌症（特別是治療本文上述癌症）的藥物中的用途。
一方面，本公開涉及一種在癌症患者中引發免疫應答的方法，其包括向所述患者施用包含本文所述擴增 T 細胞群體的組合物，其中所述 T 細胞殺滅表面提呈與 MHC 分子複合的肽的癌細胞，其中所述肽選自 SEQ ID NO: 99-256 中的任何一個，其中所述癌症選自非小細胞肺癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、子宮癌、梅克爾細胞癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、結直腸癌、膀胱癌、腎癌、白血病、卵巢癌、食道癌、腦癌、胃癌和攝護腺癌組成的組。
另一方面，免疫應答包含細胞毒性 T 細胞應答。
最後，本發明還提出了套件，其包含至少一種本發明的載體。在一實施方案中，套件包含至少一種本發明的載體、任選地包裝材料、以及任選地包含於包裝材料內的標籤或藥物說明書。
一方面，本公開涉及一種製備用於免疫療法的 T 細胞的方法，包括從人體受試者的血液樣本中分離 T 細胞，在存在他汀類藥物的情況下啟動分離的 T 細胞，用本公開的載體轉導啟動的 T 細胞（其中所述載體可以用本文所述的任何包膜蛋白，包括水皰性口炎病毒 (VSV-G) 和RD114TR）進行假型化處理），並擴增轉導的 T 細胞。
另一方面，T 細胞可包括 CD4+ T 細胞、CD8+ T 細胞、γδ T 細胞和/或天然殺傷 T 細胞。
另一方面，他汀類藥物可以選自阿托伐他汀、西伐他汀、達伐他汀、氟吲他汀、氟伐他汀、美伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、維洛他汀和瑞舒伐他汀。
在進一步描述本公開之前，應當理解的是，本公開不限於以下所述的本公開特定實施方案，因為可能對特定實施方案作出變化並且仍在所附請求項的範圍內。還應當理解的是，所用的術語用於描述特定實施方案之目的，而不是為了限制。相反，本公開的範圍由所附請求項確定。
如本文所用，術語「可操作地連接」意指所述的組分處於允許它們以其預期方式起作用的關係。
如本文所用，術語「自裂解 2A 肽」系指共同翻譯作用的相對短肽（長約 20 個氨基酸的量級，取決於來源的病毒），透過阻止甘氨酸和最後一個脯氨酸之間的正常肽鍵的形成而導致核糖體跳至下一個密碼子，而新生肽在 Gly 和 Pro 之間裂解。裂解後，短 2A 肽維持與「上游」蛋白的 C 端融合，而脯氨酸被添加至「下游」蛋白的 N 端。自裂解 2A 肽可以選自豬鐵士古病毒1 (P2A)、馬鼻炎 A 病毒 (E2A)、明脈扁刺蛾病毒 (T2A)、口蹄疫病毒 (F2A) 或其任意組合（參見例如，Kim et al., PLOS One 6:e18556, 2011，其內容包括 2A 核酸和氨基酸序列，透過引用整體併入本文）。透過在自裂解 2A 序列之前添加連接子序列（例如 GSG 或 SGSG (SEQ ID NO: 5)），這可以使生物活性蛋白（例如 TCR）有效合成。
如本文所用，術語「啟動子」系指允許基因轉錄的通常位於基因上游（朝向有義鏈的 5' 區域）的 DNA 的調節區。啟動子包含稱為轉錄因子的蛋白質識別的特定 DNA 序列和應答元件。這些因子與啟動子序列結合，募集 RNA 聚合酶——從基因編碼區合成 RNA 的酶。例如，本文使用的啟動子序列可以選自巨細胞病毒 (CMV) 啟動子、磷酸甘油酸酯激酶 (PGK) 啟動子、髓磷脂鹼性蛋白 (MBP) 啟動子、神經膠質纖維酸性蛋白 (GFAP) 啟動子、包含骨髓增生性肉瘤病毒增強子的修飾 MoMuLV LTR (MNDU3)、泛素 C 啟動子、EF-1 α 啟動子或鼠幹細胞病毒 (MSCV) 啟動子。
本文所用的術語「順反子」系指 DNA 分子的一部分，其指定一條多肽鏈的形成，即編碼一條多肽鏈。例如，「雙順反子」系指 DNA 分子的兩個部分，其指定兩條多肽鏈的形成，即編碼兩條多肽鏈。「三順反子」系指 DNA 分子的三個部分，其指定三條多肽鏈的形成，即編碼三條多肽鏈；以此類推。
本文所用的術語「多順反子 RNA」或「多順反子 mRNA」系指包含基因資訊以翻譯成幾種蛋白質的 RNA。相反，單順反子 RNA 包含僅翻譯單個蛋白質的基因資訊。在本公開背景下，從慢病毒轉錄的多順反子 RNA 可翻譯為兩種蛋白質，例如 TCRα 鏈和 TCRβ 鏈。
本文所用的術語「串聯排列」系指基因在核酸序列上的單個文檔中相鄰、一個在另一個之後或後面排列。基因在核酸序列上相鄰連接在一起，每個基因的編碼鏈（有義鏈）在核酸序列上連接在一起。
本文所用的術語「有義鏈」系指被翻譯或可翻譯成蛋白質的基因 DNA 鏈。當基因相對於核酸序列中的啟動子沿「有義方向」定向時，「有義鏈」位於啟動子下游的 5' 端，其中編碼蛋白質的核酸的第一個密碼子位於啟動子的近端，而最後一個密碼子位於啟動子的遠端。
本文所用的術語「病毒載體」系指核酸載體構建體，其包括至少一種病毒來源的元件，有被包裝入病毒載體顆粒的能力，並編碼至少一種外源核酸。載體和/或顆粒可用於在體外或體內將任何核酸轉移至細胞之目的。多種形式的病毒載體為本領域已知。術語「病毒粒子」指單個感染性病毒顆粒。「病毒載體」、「病毒載體顆粒」和「病毒顆粒」也指具有其 DNA 或 RNA 核心和蛋白質外殼如同其存在於細胞外部的完整病毒顆粒。例如，病毒載體可選自腺病毒、痘病毒、α 病毒、暈病毒、黃病毒、棒狀病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、皰疹病毒、副粘病毒或微小核糖核酸病毒。
術語「T 細胞」或「T 淋巴細胞」是本領域公認的，包括胸腺細胞、幼稚 T 淋巴細胞、未成熟 T 淋巴細胞、成熟 T 淋巴細胞、靜置 T 淋巴細胞或啟動 T 淋巴細胞。適用於特定實施方案的示例性 T 細胞群包括但不限於輔助性 T 細胞（HTL；CD4+ T 細胞）、細胞毒性 T 細胞（CTL；CD8+ T 細胞）、CD4+CD8+ T 細胞、CD4-CD8− T 細胞、自然殺傷 T 細胞、γδ T 細胞或其他任何子集的 T 細胞。適用於特定實施方案的其他示例性 T 細胞群包括但不限於表達以下一種或多種標誌物的 T 細胞：CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD127、CD197 和 HLA-DR，如果需要，可透過陽性或陰性選擇技術進一步分離。
術語「他汀類藥物」，「伐他汀類藥物」或在本文中可互換使用的「3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶 A (HMG-CoA) 還原酶抑制劑」系指抑制酶 3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶 A (HMG-CoA) 還原酶的藥劑。該酶參與 HMG-CoA 轉化為甲羥戊酸，這是膽固醇生物合成的步驟之一。此類抑制很容易根據本領域技術人員眾所周知的標準測定方法確定。
可根據本公開使用的優選他汀類藥物包括：阿托伐他汀，其公開於美國專利號 4,681,893；阿托伐他汀鈣，公開於美國專利號 5,273,995；西伐他汀，公開於美國專利號 5,502,199；達伐他汀，公開於美國專利號 5,316,765；氟吲他汀，公開於美國專利號 4,915,954；氟伐他汀，公開於美國專利號 4,739,073；洛伐他汀，公開於美國專利號 4,231,938；美伐他汀，公開於美國專利號 3,983,140；普伐他汀，公開於美國專利號 4,346,227；辛伐他汀，公開於美國專利號 4,444,784；維洛他汀，公開於美國專利號 4,448,784和美國專利號 4,450,171；瑞舒伐他汀，公開於美國專利號 6,858,618 和美國專利號 7,511,140。這些專利中的每一項內容均透過引用整體併入本文。優選的 3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶 A 還原酶抑制劑可包括阿托伐他汀、阿托伐他汀鈣（也稱為立普妥®）、洛伐他汀（也稱為 Mevacor®）、普伐他汀（也稱為 Pravachol®）、辛伐他汀（也稱為舒降之®）和瑞舒伐他汀。
轉錄後調控元件
土撥鼠肝炎病毒 (WHV) 轉錄後調控元件 (WPRE) 可以增強來自多種不同載體類型的表達，包括慢病毒載體（美國專利號 6,136,597；6,287,814；Zufferey, R., et al.(1999).J. Virol. 73:2886-92）。若不希望受到理論的束縛，這種增強被認為是由於在轉錄後水準上 RNA 加工改善所致，從而導致核轉錄本水準提高。mRNA 穩定性增加兩倍也有助於這種增強（Zufferey, R., et al. 同上）。據報告，含 WPRE 的轉錄本與不含 WPRE 的轉錄本相比，蛋白質表達增強水準約為 2 至 5 倍，且與轉錄本水準提高密切相關。這已經用許多不同的轉基因得到了證明（Zufferey, R., et al. 同上）。
WPRE 包含三個順式作用序列，其在增強表達水準中的功能起重要作用。另外，它包含約一個 180 bp 的片段，其包含 WHVX 蛋白 ORF 的 5' 端（全長 ORF 為 425 bp）及其相關的啟動子。來自 X 啟動子啟始的轉錄本翻譯導致形成代表 X 蛋白 NH2 末端 60 個氨基酸的蛋白。這種截短的 X 蛋白可以促進腫瘤發生，特別是，如果截短的 X 蛋白序列在特定位點整合至宿主細胞基因組中 (Balsano, C. et al., (1991) Biochem. Biophys Res. Commun. 176:985-92; Flajolet, M. et al.(1998) J. Virol. 72:6175-80; Zheng, Y.W., et al.(1994) J. Biol. Chem. 269:22593-8: Runkel, L., et al.(1993) Virology 197:529-36)。因此，如果截短的 X 蛋白被遞送至目的細胞中，則其表達可促進腫瘤發生，從而排除野生型 WPRE 序列的安全使用。
本文所用的 WPRE 的「X 區」定義為包含 X 蛋白 ORF 的至少前 60 個氨基酸，包括翻譯起始密碼子及其相關啟動子。「X 蛋白」在本文中定義為由本文所述的 X 蛋白 ORF 編碼的截短 X 蛋白。
本發明人已將突變引入 WPRE 序列中，以防止 X 蛋白的表達。在一些方面，這些突變被引入與 WPRE 序列一起出現的一個或多個起始密碼子。在一些方面，X 蛋白啟動子和 ORF 從 WPRE 序列中刪除，形成截短的 WPRE 序列。另一方面，X 蛋白啟動子和 X 蛋白起始密碼子突變。
本文所用的「突變」可包含一次或多次核苷酸刪除、添加或取代。
在一些方面，突變的 WPRE 序列在對應於根據 SEQ ID NO: 1 所述的 WT WPRE核苷酸序列內核苷酸位置 106-108、152-154、245-247、272-274、283-285、362-364 和 603-605 的一個或多個起始密碼子處包含突變。在一些方面，突變的 WPRE 序列在對應於根據 SEQ ID NO: 1 所述的 WT WPRE核苷酸序列內核苷酸位置 106-108、152-154、245-247、272-274、283-285、362-364 和 603-605 的一個、兩個、三個、四個、五個、六個或全部七個起始密碼子處包含突變。在一些方面，突變的 WPRE 序列在對應於根據 SEQ ID NO: 1 所述的 WT WPRE核苷酸序列內核苷酸位置 106-108、152-154、245-247、272-274、283-285、362-364 和 603-605 的每個起始密碼子處包含突變。
另一方面，突變的 WPRE 序列在對應於根據 SEQ ID NO: 2 所述的 WT WPRE核苷酸序列內核苷酸位置 70-72、108-110、121-123、138-140、187-189 和 428-430 的一個或多個起始密碼子處包含突變。在一些方面，突變的 WPRE 序列在對應於根據 SEQ ID NO: 2 所述的 WT WPRE核苷酸序列內核苷酸位置 70-72、108-110、121-123、138-140、187-189 和 428-430 的一個、兩個、三個、四個、五個或全部六個起始密碼子處包含突變。在一些方面，突變的 WPRE 序列在對應於根據 SEQ ID NO: 2 所述的 WT WPRE核苷酸序列內核苷酸位置 70-72、108-110、121-123、138-140、187-189 和 428-430 的每個起始密碼子處包含突變。
一個或多個起始密碼子可以在起始密碼子內的一個、兩個或所有三個位置處突變。如果一個以上的起始密碼子突變，則每個起始密碼子突變可以彼此獨立。也就是說，WPRE 內突變的每個起始密碼子不需要以相同的方式發生突變。在一些實施方案中，一個或多個起始密碼子中的每一個在起始密碼子內的一個位置處突變。例如，起始密碼子的第一個核苷酸可以由「A」突變為「C」、「G」或「T」；或者起始密碼子的第二個核苷酸可以由「T」突變為「A」、「C」或「G」，或者起始密碼子的第三個核苷酸可以由「G」突變為「A」、「C」或「T」。
在一些實施方案中，一個或多個起始密碼子中的每一個在起始密碼子內的兩個或所有三個位置處突變。例如，起始密碼子的第一個核苷酸可以由「A」突變為「C」、「G」或「T」；和/或起始密碼子的第二個核苷酸可以由「T」突變為「A」、「C」或「G」，和/或起始密碼子的第三個核苷酸可以由「G」突變為「A」、「C」或「T」。
在一些實施方案中，一個或多個起始密碼子由「ATG」突變為「TTG」。在一些實施方案中，一個或多個起始密碼子中的每一個由「ATG」突變為「TTG」。
一方面，突變體 WPRE 序列選自 SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO: 4。另一方面，突變體 WPRE 序列與 SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO: 4 具有至少約 80%、至少約 85%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性。在一些方面，突變體 WPRE 序列與 SEQ ID NO: 3 具有 95% 或更高、96% 或更高、97% 或更高、98% 或更高、99% 或更高或 100% 的同一性，其中突變體 WPRE 序列不包含「ATG」。在一些方面，突變體 WPRE 序列與 SEQ ID NO: 3 具有 95% 或更高、96% 或更高、97% 或更高、98% 或更高、99% 或更高或 100% 的同一性，其中突變體 WPRE 序列不包含「ATG」，但核苷酸位置 65-67 處除外。
在一些方面，WPRE 序列與 SEQ ID NO: 4 具有 95% 或更高、96% 或更高、97% 或更高、98% 或更高、99% 或更高或 100% 的同一性，其中核苷酸位置 413-417 為「ATCAT」，而核苷酸位置 428-430 不是「ATG」。
逆轉錄病毒
使用病毒載體進行基因或細胞治療的概念在例如 Verma and Somia (1997) Nature 389:239-242 一文中得到認可，其內容被整體併入。
一方面，病毒系指天然存在的病毒以及人造病毒。根據本公開一些實施方案的病毒可能是包膜病毒或無包膜病毒。細小病毒（例如 AAV）是無包膜病毒的實例。在一優選實施方案中，病毒可能是包膜病毒。在優選實施方案中，病毒可能是逆轉錄病毒，特別是慢病毒。可以促進真核細胞病毒感染的病毒包膜蛋白可能包括 HIV-1 衍生慢病毒載體 (LV)，這些載體用水皰性口炎病毒 (VSV-G) 的包膜糖蛋白 (GP)、修飾的貓內源性逆轉錄病毒 (RD114TR) (SEQ ID NO: 95) 和修飾的長臂猿白血病病毒 (GALVTR) 處理成為假型。這些包膜蛋白可以有效地促進其他病毒的進入，例如細小病毒，包括腺相關病毒 (AAV)，從而證明它們的廣泛效率。例如，可使用其他病毒包膜蛋白，包括 Moloney 鼠白血病病毒 (MLV) 4070 env（如 Merten et al.,J. Virol . 79:834-840, 2005 一文中所述；其內容透過引用併入本文）、RD114 env、嵌合包膜蛋白 RD114pro 或 RDpro（透過用 HIV-1 基質/衣殼 (MA/CA) 切割序列取代 RD114 的 R 肽切割序列構建的 RD114-HIV嵌合體，如 Bell et al.Experimental Biology and Medicine 2010; 235:1269–1276 一文中所述；其內容透過引用併入本文）、桿狀病毒 GP64 env（如 Wang et al.J. Virol . 81:10869-10878, 2007 一文中所述；其內容透過引用併入本文）或 GALV env（如 Merten et al.,J. Virol . 79:834-840, 2005 一文中所述；其內容透過引用併入本文）或其衍生物。
本文所用的術語「逆轉錄病毒」包括但不限於鼠白血病病毒 (MLV)、人免疫缺陷病毒 (HIV)、馬傳染性貧血病毒 (EIAV)、小鼠乳腺腫瘤病毒 (MMTV)、Rous 肉瘤病毒 (RSV)、Fujinami 肉瘤病毒 (FuSV)、Moloney 鼠白血病病毒 (Mo-MLV)、FBR 鼠骨肉瘤病毒 (FBR MSV)、Moloney 鼠肉瘤病毒 (Mo-MSV)、Abelson 鼠白血病病毒 (A-MLV)、29 型禽骨髓增生病病毒 (MC29) 和禽成紅細胞病病毒 (AEV) 以及所有其他逆轉錄病毒（包括慢病毒）。
逆轉錄病毒的詳細列表可見 Coffin et al. (「Retroviruses' 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds:JM Coffin, S M Hughes, H E Varmus pp 758-763) 一文。
慢病毒也屬於逆轉錄病毒家族，但是它們可以感染分裂細胞和非分裂細胞。
慢病毒組可分為「靈長類」和「非靈長類」。靈長類慢病毒的實例包括人類免疫缺陷病毒 (HIV)。非靈長類慢病毒組包括原型「慢病毒」維斯納/梅迪病毒 (VMV)，以及相關的羊關節炎腦炎病毒 (CAEV)、馬傳染性貧血病毒 (EIAV) 和最近描述的貓免疫缺陷病毒 (FIV) 和牛免疫缺陷病毒 (BIV)。
一些慢病毒的基因組結構詳細資訊可見例如 NCBI Genbank 資料庫（即分別為 GenBank 登錄號AF033819 和 AF033820）。HIV 變體的詳細資訊也可參見 Los Alamos 國家實驗室維護的 HIV 資料庫。
感染過程中，逆轉錄病毒最初附著於特定的細胞表面受體。進入易感宿主細胞後，逆轉錄病毒 RNA 基因組隨後透過病毒編碼的逆轉錄酶複製成 DNA，所述逆轉錄酶攜帶於親本病毒內部。此 DNA 被運輸至宿主細胞核，在此處隨後整合至宿主基因組。在此階段，通常將其稱為前病毒。前病毒在細胞分裂過程中在宿主染色體中穩定，並像其他細胞基因一樣被轉錄。前病毒編碼產生更多病毒所需的蛋白質和其他因子，這可以透過有時稱為「出芽」的工藝離開細胞。
每個逆轉錄病毒基因組包含稱為 gag、pol 和 env 的基因，其編碼病毒粒子蛋白和酶。這些基因的兩端側翼有稱為長末端重複序列 (LTR) 的區域。LTR 負責前病毒整合和轉錄。它們還充當增強子-啟動子序列。也就是說，LTR 可以控制病毒基因的表達。逆轉錄病毒 RNA 的衣殼化透過位於病毒基因組 5' 端的 psi 序列實現。
LTR 本身為同一的序列，可以分為三個元件，稱為 U3、R 和 U5。U3 源自RNA 3' 末端的獨特序列。R 衍生自 RNA 兩端重複的序列，U5 衍生自 RNA 5' 末端獨特的序列。在不同的逆轉錄病毒中，這三個元件的尺寸可能有很大差異。
對於病毒基因組，轉錄啟始的位點位於左側 LTR 的 U3 和 R 之間的邊界處，而聚 (A) 添加（終止）的位點位於右側 LTR 的 R 和 U5 之間的邊界處。U3 包含前病毒的大多數轉錄控制元件，包括對細胞轉錄啟動蛋白以及某些情況下對病毒轉錄啟動蛋白有反應的啟動子和多個增強子序列。一些逆轉錄病毒具有以下一種或多種基因，這些基因編碼參與基因表達調控的蛋白質：tat、rev、tax 和 rex。
關於結構基因 gag、pol 和 env 本身，gag 編碼病毒的內部結構蛋白。Gag 蛋白經過蛋白水解加工為成熟蛋白 MA（基質）、CA（衣殼）和 NC（核衣殼）。Pol 基因編碼逆轉錄酶 (RT)，其中包含 DNA 聚合酶、相關的 RNase H 和整合酶 (IN)，它們介導基因組的複製。Env 基因編碼病毒粒子的表面 (SU) 糖蛋白和跨膜 (TM) 蛋白，它們形成與細胞受體蛋白特異性相互作用的複合體。這種相互作用透過病毒膜與細胞膜融合而最終導致感染。
逆轉錄病毒也可以包含「附加」基因，其編碼 gag、pol 和 env 以外的蛋白質。在 HIV 中，附加基因的實例包括 vif、vpr、vpx、vpu、tat、rev 和 nef 中的一種或多種。EIAV 包含例如附加基因 S2 和 dUTPase。
附加基因編碼的蛋白質具有多種功能，其中一些可能與細胞蛋白質提供的功能重複。例如，在 EIAV 中，tat 充當病毒 LTR 的轉錄啟動因子。它與稱為 TAR 的穩定莖環 RNA 二級結構結合。Rev 透過 rev 反應元件 (RRE) 調節和協調病毒基因的表達。這兩種蛋白質的作用機制被認為與靈長類病毒的類似機制大致相似。S2 的功能未知，但似乎並非必需。另外，EIAV 蛋白 Ttm 已被確定，其由跨膜蛋白開始處與 env 編碼序列剪接的 tat 的第一個外顯子編碼。
遞送系統
逆轉錄病毒載體系統已被提出作為遞送系統，用於（尤其是）將目的核苷酸 (NOI) 轉移至一個或多個目的位元點。轉移可在體外、離體、體內或其組合方式中進行。逆轉錄病毒載體系統已被用於研究逆轉錄病毒生命週期的各個方面，包括受體使用、逆轉錄和 RNA 包裝（Miller 的綜述，1992 Curr Top Microbiol Immunol 158:1-24，其內容透過引用併入本文）。
重組逆轉錄病毒載體顆粒能夠用 NOI 轉導受體細胞。進入細胞內之後，來自載體顆粒的 RNA 基因組被逆轉錄為 DNA，並整合入受體細胞的 DNA 中。
本文所用的術語「載體基因組」系指逆轉錄病毒載體顆粒中存在的 RNA 構建體和/或整合的 DNA 構建體。此術語還包括能夠編碼此類 RNA 基因組的單獨或分離的 DNA構建體。逆轉錄病毒或慢病毒基因組應包含至少一個可衍生自逆轉錄病毒或慢病毒的組成部分。術語「可衍生」在其正常意義上意指核苷酸序列或其一部分，這不一定需要從病毒（如慢病毒）獲得，而是可以從其衍生而來。舉例來說，所述序列可以合成製備或透過使用重組 DNA 技術製備。優選地，基因組包含 psi 區域（或能夠引起衣殼化的類似組分）。
病毒載體基因組優選為有「複製缺陷」，這意指基因組不單獨包含足夠的基因資訊以使獨立複製能夠在受體細胞內產生感染性病毒顆粒。在一優選實施方案中，基因組缺乏功能性 env、gag 或 pol 基因。
病毒載體基因組可以包含一些或全部的長末端重複序列 (LTR)。優選地，基因組包含 LTR 的至少一部分或類似序列，其能夠介導前病毒整合和轉錄。所述序列還可以包含或充當增強子-啟動子序列。
根據本發明一些方面的病毒載體基因組可以作為成套部分提供。例如，所述套件可包含 (i) 含有 NOI 和內部調控序列，例如啟動子或 IRES 序列的一個或多個質粒；(ii) 具有合適限制酶識別位元點的逆轉錄病毒基因組構建體，用於將 NOI 和內部調控序列克隆入病毒基因組。
已經認識到的是，在共同引入同一細胞的單獨 DNA 序列上單獨表達產生逆轉錄病毒載體顆粒所需的組分將產生攜帶缺陷逆轉錄病毒基因組（攜帶治療基因）的逆轉錄病毒顆粒。此細胞稱為生產細胞。
有兩種常見的程序可產生生產細胞。一種是將編碼逆轉錄病毒 Gag、Pol 和 Env 蛋白的序列導入細胞並穩定整合至細胞基因組；產生稱為包裝細胞系的穩定細胞系。包裝細胞系產生包裝逆轉錄病毒 RNA 所需的蛋白質，但由於缺少 psi 區域，因此無法形成衣殼化。但是，當具有 psi 區域的載體基因組被引入包裝細胞系時，輔助蛋白即可包裝 psi 陽性重組載體 RNA，以產生重組病毒原液。這可用來將 NOI 轉導入受體細胞。基因組缺少製造病毒蛋白所需的所有基因的重組病毒只能感染一次，不能繁殖。因此，NOI 被引入宿主細胞基因組而未產生潛在有害的逆轉錄病毒。可用的包裝細胞系的摘要見「逆轉錄病毒」一書（1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds:J M Coffin, S M Hughes, H E Varmus pp 449，其內容透過引用整體併入）。
本發明還提出了包含本發明病毒載體基因組的包裝細胞系。例如，包裝細胞系可以用包含基因組的病毒載體系統轉導，或者用攜帶能夠編碼 RNA 基因組的 DNA 構建體的質粒轉染。本發明還提出了由此類細胞產生的逆轉錄病毒（或慢病毒）載體顆粒。
第二種方法是將產生逆轉錄病毒載體顆粒所需的三個不同的 DNA 序列，即，env 編碼序列、gag-pol 編碼序列和包含一個或多個 NOI 的缺陷逆轉錄病毒基因組同時透過暫態轉染引入細胞內，所述程序稱為暫態三重轉染 (Landau & Littman 1992; Pear et al. 1993)。三重轉染程序已經被優化 (Soneoka et al. 1995; Finer et al.1994)。WO 94/29438 描述了使用這種多重 DNA 暫態轉染方法在體外產生生產細胞。
補充載體基因組所需的病毒系統組分可存在於一種或多種用於轉染入細胞中的「生產質粒」上。
本發明還提出了用於生產逆轉錄病毒來源的顆粒的載體系統，其包含 (i) 根據本發明一些方面所述的逆轉錄病毒基因組；(ii) 編碼逆轉錄病毒 gag 和 pol 蛋白的核苷酸序列；(iii) 編碼並非由 (ii) 的核苷酸序列編碼的其他必需病毒包裝組分的核苷酸序列。
一方面，編碼 Vpr、Vif、Tat、Nef 或類似輔助基因中至少一者的核酸序列（來自顆粒所衍生自的逆轉錄病毒）被破壞，例如，所述核酸序列無法編碼功能性 Vpr、Vif、Tat、Nef 或類似輔助蛋白，或從系統中刪除。
本發明還提出了用此類載體系統轉染的細胞和由此類細胞產生的逆轉錄病毒載體顆粒。優選地，gag-pol 序列進行了密碼子優化，以用於特定的生產細胞（見下文）。
由 iii) 的核苷酸序列編碼的 env 蛋白可以為同源逆轉錄病毒或慢病毒 env 蛋白。或者，它可以為異源 env，也可以來自非逆轉錄病毒或慢病毒的 env（參見「假型化」下的內容）。
術語「病毒載體系統」通常用於表示成套部分，當與病毒顆粒生產的其他必需組分組合時可用於在宿主細胞中產生病毒顆粒。例如，逆轉錄病毒載體基因組可能缺少病毒複製所需的一個或多個基因。可以在套件中組合例如在一個或多個生產質粒上的另外的一個或多個互補核苷酸序列。透過基因組與生產質粒共轉染，應可以為生產感染性病毒顆粒提供所需的組分。
或者，互補核苷酸序列可以穩定地存在於套件中包括的包裝細胞系內。
本發明還涉及逆轉錄病毒載體系統，其能夠遞送 RNA 基因組至受體細胞，其中所述基因組長於慢病毒的野生型基因組。
在一些方面，載體系統的 RNA 基因組比野生型基因組有多至 5%，優選為多至 10% 或甚至多至 30% 以上的鹼基。優選地，RNA 基因組比野生型基因組長約 10%。例如，野生型 EIAV 包含約 8kb 的 RNA 基因組。本發明的 EIAV 載體系統可具有至多（優選約）8.8kb 的 RNA 基因組。
在一些方面，本發明的逆轉錄病毒載體系統為自滅活 (SIN) 載體系統。例如，自滅活逆轉錄病毒載體系統已透過刪除轉錄增強子或 3' LTR 的 U3 區域中的增強子和啟動子來構建。經過一輪載體逆轉錄和整合後，這些變化被複製入 5' 和 3' LTR 中，從而產生了無轉錄活性的前病毒。但是，此類載體中 LTR 以內的任何啟動子仍具有轉錄活性。這種策略已被用於消除病毒 LTR 中增強子和啟動子對內部基因轉錄的影響。此類影響包括增加轉錄或抑制轉錄。這種策略也可以用於消除從3 'LTR到基因組 DNA 的下游轉錄。這在人類基因治療中尤為重要，在該治療中，防止內源性致癌基因的不定啟動可能很重要。
在一些方面，使用重組酶輔助機制，其促進從本發明生產細胞中產生高滴度調節慢病毒載體。
在一些方面，本公開包括轉導 T 細胞的方法，其包括：從至少一個供體、患者或個體獲得 T 細胞；用抗 CD3 抗體和/或抗 CD28 抗體啟動 T 細胞；用病毒載體轉導啟動的 T 細胞；以及任選地擴增轉導的 T 細胞；任選地測量在多個體積濃度下表達轉基因的擴增 T 細胞數量和/或每個 T 細胞中整合轉基因的拷貝數；以及任選地確定產生表達轉基因的擴增 T 細胞最大平均數量和/或整合轉基因的最大平均拷貝數且來自多個健康供體的每個擴增 T 細胞中不超過五個拷貝的體積濃度，並且在確定的體積濃度下用病毒載體轉導從患者中獲得的 T 細胞用於免疫治療，如 US20190216852 中所述（其內容透過引用整體併入本文）。
在一些方面，多個體積濃度為約 0.01 μl/約 106 個細胞至約 1 ml/約 106 個細胞；約 0.01 μl/約 2 x 106 個細胞至約 1 ml/約 2 x 106 個細胞；約 0.01 μl/約 5 x 106 個細胞至約 1 ml/約 5 x 106 個細胞；約 0.01 μl/約 107 個細胞至約 1 ml/約 107 個細胞；約 1 μl/約 107 個細胞至約 500 μl/約 107 個細胞；約 5 μl/約 107 個細胞至約 150 μl/約 107 個細胞；或者約 8 μl/約 107 個細胞至約 12 μl/約 107 個細胞。
本文所用的術語「重組酶輔助系統」包括但不限於使用噬菌體 P1 的 Cre 重組酶/loxP 識別位點或釀酒酵母的位點特異性 FLP 重組酶的系統，其催化 34bp FLP 識別目標 (FRT) 之間的重組事件。
催化 34bp FLP 識別目標 (FRT) 之間重組事件的釀酒酵母的位點特異性 FLP 重組酶已被配置成 DNA 構建體，以利用重組酶輔助重組事件產生高水準的生產細胞系 (Karreman et al. (1996) NAR 24:1616-1624)。已使用噬菌體 P1 的 Cre 重組酶/loxP 識別位點開發了類似的系統 (Vanin et al. (1997) J. Virol 71:7820–7826)。這被配置成慢病毒基因組，從而產生高滴度慢病毒生產細胞系。
透過使用生產/包裝細胞系，可以繁殖和分離一定量的逆轉錄病毒載體顆粒（例如，製備合適滴度的逆轉錄病毒載體顆粒），以用於隨後轉導於例如目的位元點（如特定器官或組織）或目的細胞（如 T 細胞）中。生產細胞系通常更適合於大規模生產載體顆粒。
與包裝細胞方法相比，暫態轉染具有某些優點。在這方面，暫態轉染避免了產生穩定的載體生產細胞系所需的較長時間，並且在載體基因組或逆轉錄病毒包裝組分對細胞有毒性時使用。如果載體基因組編碼有毒的基因或干擾宿主細胞複製的基因（例如細胞週期抑制劑或誘導凋亡的基因），則可能很難生成穩定的載體生產細胞系，但暫態轉染可用於在細胞死亡之前產生載體。另外，已經使用暫態轉染開發了細胞系，產生的載體滴度水準與從穩定的載體生產細胞系獲得的水準可相比 (Pear et al. 1993, PNAS 90:8392-8396)。
生產細胞/包裝細胞可以為任何合適的細胞類型。生產細胞通常為哺乳動物細胞，但是可以為例如昆蟲細胞。
本文所用的術語「生產細胞」或「載體生產細胞」系指包含產生逆轉錄病毒載體顆粒所需所有元件的細胞。
在一些方面，生產細胞可獲得自穩定的生產細胞系、衍生的穩定生產細胞系或衍生的生產細胞系。
本文所用的術語「衍生的生產細胞系」為轉導的生產細胞系，其已針對標誌物基因的高表達進行了篩選和選擇。此類細胞系支援逆轉錄病毒基因組的高水準表達。術語「衍生的生產細胞系」與術語「衍生的穩定生產細胞系」和術語「穩定的生產細胞系」可互換使用。
在一些方面，衍生的生產細胞系包括但不限於逆轉錄病毒和/或慢病毒生產細胞。
在一些方面，包膜蛋白序列和核衣殼序列均在生產和/或包裝細胞中穩定地整合。但是，這些序列中的一個或多個也可能以附加體形式存在，並且基因表達可能來自附加體。
本文所用的術語「包裝細胞」系指含有 RNA 基因組中缺少生產感染性重組病毒所需那些元件的細胞。通常，此類包裝細胞包含一個或多個生產質粒，其能夠表達病毒結構蛋白（如密碼子優化的 gag-pol 和 env），但不包含包裝信號。
術語「包裝信號」可互換稱為「包裝序列」或「psi」，用於指病毒顆粒形成期間逆轉錄病毒 RNA 鏈衣殼化所需的非編碼、順式作用序列。在 HIV-1 中，此序列已定位至從主要剪接供體位點 (SD) 上游延伸至至少 gag 起始密碼子的基因座。
適合與上述載體構建體一起使用的包裝細胞系可容易製備（也參見 WO 92/05266，其內容透過引用併入本文），並用於產生用於生產逆轉錄病毒載體顆粒的生產細胞系。如上所述，「逆轉錄病毒」一書中給出了可用包裝細胞系的摘要。
同樣，如上所述，簡單包裝細胞系（包含刪除包裝信號的前病毒）被發現可透過重組導致快速產生不希望的複製勝任病毒。為了提高安全性，已經產生了第二代細胞系，其中前病毒的3' LTR 被刪除。在此類細胞中，產生野生型病毒需要進行兩次重組。進一步改進涉及將 gag-pol 基因和 env 基因引入不同的構建體，即所謂的第三代包裝細胞系。這些構建體被依次引入，以防止轉染過程中發生重組。
在一些方面，包裝細胞系為第二代包裝細胞系或第三代包裝細胞系。
在這些分裂構建體（第三代細胞系）中，可以透過改變密碼子來實現進一步減少重組。此技術基於基因代碼的冗餘，旨在減少單獨構建體之間的同源性，例如，減少 gag-pol 和 env 開放閱讀框中重疊區域之間的同源性。
包裝細胞系可用於提供封裝和提供膜蛋白所需的基因產物，以產生高滴度的載體顆粒。包裝細胞可以為體外培養的細胞，如組織培養細胞系。合適的細胞系包括但不限於哺乳動物細胞，如鼠成纖維細胞衍生的細胞系或人細胞系。在一些方面，包裝細胞系為靈長類或人細胞系，例如：HEK293、293-T、TE671、HT1080。
期望在實驗和實際應用中均使用高滴度病毒製劑。增加病毒滴度的技術包括使用 psi 加包裝信號（如上所述）和病毒原液濃縮。
本文所用的術語「高滴度」意指能夠轉導靶位點（如細胞）的有效量逆轉錄病毒載體或顆粒。
本文所用的術語「有效量」意指足以在靶位點誘導 NOI 表達的逆轉錄病毒或慢病毒載體或載體顆粒量。
用於生產/包裝細胞的高滴度病毒製劑通常為每 mL 105 至 107 量級的逆轉錄病毒顆粒。另一方面，所述製劑具有至少 108 TU/mL，優選為 108 至 109 TU/mL，更優選為至少 109 TU/mL（滴度以在標準 D17 細胞系上滴定的每 mL 轉導單位 (TU/mL) 表示）。可以使用其他濃縮方法，如，超濾或與基質結合和從基質上洗脫。
NOI 編碼的表達產物可以為細胞分泌的蛋白質。或者，NOI 表達產物不經分泌並且在細胞內具有活性。對於某些應用，優選為 NOI 表達產物表現出旁側效應或遠端旁側效應；其是一個細胞中表達產物的產生，導致對其他相關擁有共同表型的相鄰或遠端（例如，轉移性）細胞的調節 (Zennou et al., (2000) Cell 101: 173; Folleuzi et al., (2000) Nat. Genetics 25:217; Zennou et al., (2001) Nat. Biotechnol. 19:446)，其各自內容透過引用整體併入本文。
存在被稱為中央多嘌呤區 (cPPT) 的序列可提高基因遞送至非分裂細胞的效率。例如，這種順式作用元件位於病毒聚合酶編碼區元件中。在一些方面，本發明的病毒基因組包含 cPPT 序列。
此外，病毒基因組可包含翻譯增強子。
NOI 可以透過操作連接至一個或多個啟動子/增強子元件。一種或多種 NOI 的轉錄可以在病毒 LTR 或啟動子增強子元件的控制下。在一些方面，啟動子為強病毒啟動子，如 CMV，或者為細胞組成型啟動子，如 PGK、β-肌動蛋白或 EF1α。啟動子可以調控或具有組織特異性。表達控制也可透過使用諸如四環素系統之類的系統來實現，所述系統打開或關閉基因表達，以回應外部藥物（例如，四環素或其類似物）。
假型化
設計逆轉錄病毒載體系統時，期望工程改造比起天然病毒具有不同靶細胞特異性的顆粒，以使得能夠將基因物質遞送至擴增或改變的細胞類型範圍。實現此目的的一種方式是透過工程改造病毒包膜蛋白以改變其特異性。另一種方法是將異源包膜蛋白引入載體顆粒，以替代或添加至病毒的天然包膜蛋白。
術語假型化意指將異源 env 基因（例如來自另一種病毒的 env 基因）摻入至少一部分、或取代一部分、或替代全部的病毒基因組的 env 基因。假型化不是新現象，實例可見 WO 99/61639、WO-A-98/05759、WO-A-98/05754、WO-A-97/17457、WO-A-96/09400、WO -A-91/00047 和 Mebatsion et al. (1997) Cell 90:841-847，其各自內容透過引用整體併入本文。
在一些方面，載體系統用編碼至少一部分狂犬病 G 蛋白的基因進行假型化處理。狂犬病 G 假型化逆轉錄病毒載體的實例可參見 WO99/ 61639。另一方面，用編碼至少一部分 VSV-G 蛋白的基因對載體系統進行假型化處理。VSV-G假型化逆轉錄病毒載體的實例可參見美國專利號5,817,491，其內容透過引用整體併入本文。另一方面，載體用病毒的包膜蛋白進行假型化處理，所述病毒選自天然貓內源性病毒 (RD114)、RD114 的嵌合版本（RD114TR；SEQ ID NO: 95）、長臂猿白血病病毒 (GALV)、GALV 的嵌合版本 (GALV-TR)、雙嗜性鼠白血病病毒 (MLV 4070A)、桿狀病毒 (GP64)、水皰性口炎病毒 (VSV-G)、雞瘟病毒 (FPV)、埃博拉病毒 (EboV)、狒狒逆轉錄病毒包膜糖蛋白 (BaEV) 或淋巴細胞性脈絡膜腦膜炎病毒 (LCMV)。
已得到證明的是，逆轉錄病毒或慢病毒最小系統可以從 HIV、SIV、FIV 和 EIAV 病毒構建。此類系統不需要任何的額外基因 vif、vpr、vpx、Vpu、tat、rev 和 nef 進行載體生產或轉導分裂和非分裂細胞。還證明了可以構建 EIAV 最小載體系統，其不需要 S2 用於載體生產或轉導分裂和非分裂細胞。刪除額外基因是有利的。首先，它允許在沒有慢病毒（例如 HIV）感染中的疾病相關基因的情況下產生載體。特別是，tat 與疾病有關。其次，刪除額外基因使載體可以包裝更多異源 DNA。第三，可以省略功能未知的基因（如 S2），從而降低引起不良作用的風險。WO-A-99732646 和 WO-A-98/17815 中公開了最小慢病毒載體的實例，其內容透過引用整體併入本文。
逆轉錄病毒載體生產系統不存在功能性輔助基因意指所述系統產生的逆轉錄病毒載體顆粒中也將不存在那些功能基因。此外，以其他方式由那些基因編碼並摻入載體顆粒的任何輔助蛋白將不存在於載體顆粒中。在已知的逆轉錄病毒載體生產系統中，輔助基因可作為編碼 DNA 的載體基因組的一部分或與包裝組分一起存在。輔助基因在載體生產系統中的位置部分取決於其與其他逆轉錄病毒組分的關係。例如，vif 通常為包裝細胞中 gag-pol 包裝盒的一部分。因此，為了本發明目的而去除功能性輔助基因可能涉及從包裝組分或載體基因組或可能兩者中將其去除。
去除功能性輔助基因可能無需整體去除基因。通常情況下，去除部分基因或以其他方式破壞基因就足夠。本文中不存在功能性輔助基因理解為意指所述基因不以其能夠編碼功能性輔助蛋白的形式存在。
在一些方面，載體顆粒所基於的慢病毒中通常存在的功能性 vpr 和 tat 基因或類似基因皆缺失。這兩個輔助基因與對於基因或細胞治療載體特別不希望的慢病毒特徵有關。但是，除了上述前提之外，本發明不限於在根據本發明用於生產基於 HIV-1 的載體顆粒的系統中不存在的輔助基因組合，三個或更優選為四個基因的任意組合可能不以其功能形式存在。最優選地，所有五個輔助基因 vpr、vif、tat、nef 和 vpu 均不以其功能形式存在。同樣地，對於與其他慢病毒有關的系統，最優選的情況是：所有輔助基因均不以其功能形式存在（rev 除外，除非被一種類似於 rev/RRE 系統的系統替代，否則其優選為存在）。
因此，在一些方面，根據本發明的遞送系統至少沒有 tat 和 S2（如果為 EIAV 載體系統），並且可能也沒有 vif、vpr、vpx、vpu 和 nef。優選地，本發明的系統也沒有 rev。之前，rev 被認為在某些逆轉錄病毒基因組中對於有效產生病毒至關重要。例如，如果出現 HIV，認為應該包括 rev 和 RRE 序列。但是，已經發現的是，可透過密碼子優化（見下文）或用其他功能等效系統（如 MPMV 系統）替代來減少或消除對 rev 和 RRE 的要求。由於密碼子優化的 gag-pol 表達不依賴於 rev，因此可以從 gag-pol 表達盒中除去 RRE，從而消除了與載體基因組上所含任何 RRE 重組的可能。
在一些方面，本發明的病毒基因組缺乏 Rev 應答元件 (RRE)。另一方面，編碼 Rev 的核酸序列或其功能等同物被破壞，使得所述核酸序列不能編碼功能性 Rev 或從載體基因組中被去除。
在某些方面，本發明中使用的系統基於所謂的「最小系統」，其中一些或所有額外基因已被去除。優選地，本發明的病毒載體具有最小的病毒基因組。
本文所用的術語「最小病毒基因組」意指對病毒載體進行了操作，以去除非必需元件並保留必需元件，以提供感染、轉導和遞送 NOI 至靶宿主細胞所需的功能。優選地，具有最小病毒基因組的病毒載體為最小慢病毒載體。
密碼子優化
密碼子優化之前已在 WO 99/41397 中進行了描述，其內容透過引用整體併入本文。不同的細胞在使用特定密碼子時有所不同。密碼子偏倚對應於細胞類型中特定 tRNA 的相對豐度偏倚。透過改變序列中的密碼子以與相應 tRNA 的相對豐度匹配，可以增加表達。同理，可以透過有意選擇已知相應 tRNA 在特定細胞類型中稀有的密碼子來減少表達。因此，可提供附加程度的翻譯控制。
許多病毒，包括 HIV 和其他慢病毒，使用大量稀有密碼子和透過改變這些稀有密碼子以對應於常用的哺乳動物密碼子，可實現在哺乳動物生產細胞中提高包裝組分表達。密碼子使用表在本領域中對於哺乳動物細胞以及多種其他生物體是已知的。
密碼子優化具有許多其他優點。由於其序列改變，編碼生產細胞/包裝細胞中組裝病毒顆粒所需的病毒顆粒包裝組分的核苷酸序列使從中消除 RNA 不穩定序列 (INS)。同時，保留了用於包裝組分的氨基酸序列編碼序列，以使序列編碼的病毒組分保持相同或至少足夠相似，從而不損害包裝組分的功能。密碼子優化還克服了用於導出的 Rev/RRE 要求，從而使優化序列獨立於 Rev。密碼子優化還減少了載體系統內不同構建體之間的同源重組（例如，gag-pol 和 env 開放閱讀框中重疊區域之間）。因此，密碼子優化的總體效果為病毒滴度顯著增加和安全性改善。
一方面，僅與 INS 有關的密碼子被密碼子優化。但是，在更優選和實用的實施方案中，對序列整體進行了密碼子優化，例外為包含移碼位點的序列。
gag-pol 基因包含兩個分別編碼 gag 和 pol 蛋白的重疊閱讀框。兩種蛋白質的表達取決於翻譯過程中的移碼。這種移碼是由於翻譯過程中核糖體「滑動」導致發生的。這種滑動被認為至少部分是由核糖體滯留的 RNA 二級結構所致。此類二級結構存在於 gag-pol 基因移碼位點的下游。對於 HIV，重疊區域從 gag 起始位置（其中核苷酸 1 為 gag ATG 的 A）下游的核苷酸 1222 延伸至 gag 的末端 (nt 1503)。因此，跨越移碼位元點和兩個閱讀框的重疊區域的 281 bp 片段優選不進行密碼子優化。保留此片段可更有效地表達 gag-pol 蛋白。
例如，可對最佳密碼子使用進行衍生，以適應便利的限制性位點，並且可將保守氨基酸變化引入 gag-pol 蛋白。
在一些方面，密碼子優化基於高度表達的哺乳動物基因。可能更改第三和有時第二和第三鹼基。
由於基因代碼的簡併性質，將理解的是，技術人員可以實現許多 gag-pol 序列。並且，描述了許多逆轉錄病毒變體，可用作產生密碼子優化 gag-pol 序列的起點。慢病毒基因組可能差異較大。例如，有許多仍在起作用的 HIV-1 類種 (quasi-species)。EIAV 也是這種情況。這些變體可用於增強轉導過程的特定部分。HIV 變體的詳細資訊也可參見 Los Alamos 國家實驗室維護的 HIV 資料庫。EIAV 克隆的詳細資訊可參見美國國立衛生研究院維護的 NCBI 資料庫。
密碼子優化 gag-pol 序列的策略可用於任何逆轉錄病毒相關情況。這將適用於所有慢病毒，包括 EIAV、FIV、BIV、CAEV、VMR、SIV、HIV-1 和 HIV-2。此外，此方法可用於增加來自 HTLV-1、HTLV-2、HFV、HSRV 和人類內源性逆轉錄病毒 (HERV)、MLV 和其他逆轉錄病毒的基因表達。
密碼子優化可使 gag-pol 表達不依賴 Rev。但是，為了能夠在逆轉錄病毒載體中使用抗 rev 或 RRE 因子，有必要使病毒載體產生系統完全獨立於 Rev/RRE。因此，基因組也應該修飾。這可透過優化載體基因組組分來實現。有利情況是，這些修飾還可以導致產生更安全的系統，其在生產細胞和轉導細胞兩者中沒有所有其他蛋白質。
如上所述，逆轉錄病毒載體的包裝組分包括 gag、pol 和 env 基因的表達產物。另外，有效的包裝取決於 4 個莖環的短序列及隨後來自 gag 和 env 的部分序列（「包裝信號」）。因此，在逆轉錄病毒載體基因組中包括刪除的 gag 序列（包裝構建體上的完整 gag 序列除外）將優化載體滴度。迄今為止，已報告有效包裝需要仍保留 env 序列的載體中 gag 的 255 至 360 個核苷酸，或者需要特定剪接供體突變、gag 和 env 刪除組合中 gag 的約 40 個核苷酸。已發現 gag 中除 N-末端約 360 個核苷酸以外的所有核苷酸刪除會導致載體滴度增加。因此，優選情況為，逆轉錄病毒載體基因組包括 gag 序列，其包含一個或更多刪除，更優選為 gag 序列包含可衍生自 N 端的約 360 個核苷酸。
NOI
在本發明中，術語 NOI（目的核苷酸序列）包括任何合適的核苷酸序列，其不一定是完整的天然存在 DNA 或 RNA 序列。因此，例如，NOI 可以為合成的 RNA/DNA 序列、密碼子優化的 RNA/DNA 序列、重組的 RNA/DNA 序列（即透過使用重組 DNA 技術製備）、cDNA 序列或部分基因組 DNA 序列，包括其組合。所述序列不必為編碼區。如果為編碼區域，則不必是整個編碼區域。另外，RNA/DNA 序列可以為有義方向或反義方向。優選情況是，其為有義方向。優選情況是，所述序列為 cDNA、包含 cDNA或轉錄自 cDNA。
NOI，也稱為異源序列、異源基因或轉基因，可以為任何無限制的目的異源序列，例如包括編碼治療性蛋白質、酶和抗體等的序列；siRNA；反義 microRNA、適體；核酶、任何基因抑制或沉寂序列；以及透過慢病毒轉導載體遞送至宿主細胞的任何序列，例如選擇基因、標誌物基因和治療基因中的任何一個或多個。
NOI 可以為在疾病過程中具有潛在意義的候選基因。因此，例如，本發明的載體系統可以用於靶標驗證目的。
NOI 可以進行治療或診斷應用。合適的 NOI 包括但不限於：編碼酶、細胞因子、趨化因子、激素、抗體、抗氧化劑分子、工程化改造免疫球蛋白樣分子、單鏈抗體、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫調節分子、反義 RNA、小干擾 RNA (siRNA)、靶蛋白的反式顯性負性突變體、毒素、條件毒素、抗原、抗原受體、嵌合抗原受體、T 細胞受體、腫瘤抑制物蛋白、生長因子、膜蛋白、促血管和抗血管生成蛋白和肽、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶及其衍生物（例如，含有相關的報告基因組）的序列。NOI 也可以編碼前藥啟動酶。在用於研究的背景下，NOI 還可以編碼報告基因，例如但不限於綠色螢光蛋白 (GFP)、螢光素酶、β-半乳糖苷酶或抗生素（例如氨苄青黴素、新黴素、博來黴素、Zeocin、氯黴素、潮黴素、卡那黴素等）的耐藥基因。
NOI 可以編碼全部或部分目的蛋白（「POI」) 或其突變體、同源物或變體。例如，NOI 可以編碼能夠以與野生型蛋白類似的方式在體內起作用的 POI 片段。
術語「突變體」包括 POI，其包括來自野生型序列的一個或多個氨基酸變體。例如，突變體可包含一次或多次氨基酸添加、刪除或取代。
在本文中，「同源物」意指與 NOI 具有一定同源性的實體，或編碼與 POI 具有一定程度同源性的蛋白的實體。在本文中，「同源性」可以等同於「同一性」。
一方面，本文所述的載體、構建體或序列可包含參考序列的至少約 80%、至少約 85%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99%。「與參考序列至少 85% 相同」的序列系指其全長與參考序列全長具有 85% 或更高序列同一性，特別是 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的序列。一方面，本文所述的載體、構建體或序列可包含 SEQ ID NO: 1 – 95 中任何一個的至少約 80%、至少約 85%、至少約 90%、至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99%。
在本申請的背景下，使用整體成對比對法（即，比較兩個序列的全長）來計算「同一性百分比」或「同一性百分數」。比較兩個或更多個序列同一性的方法是本領域所周知的。例如，可使用 « needle » 程式，其使用 Needleman-Wunsch 整體比對演算法 (Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453) 以找到兩個序列（考慮其全長）的最佳比對方法（包括間隙）。例如，needle 程式可從 ebi.ac.uk 網站上下載，並在以下出版物中進一步描述 (EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp.276—277)。 根據本發明，兩個多肽之間同一性百分比使用 EMBOSS:needle（整體）程式計算，「Gap Open」參數等於 10.0、「Gap Extend」參數等於 0.5、矩陣為 Blosum62。
由與參考序列「至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同」的氨基酸序列組成的蛋白可能包含相對於參考序列的突變，例如缺失、插入和/或取代。在發生取代時，由與參考序列至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的氨基酸序列組成的蛋白可能對應於衍生自其他物種的同源序列（不同於參考序列）。
「氨基酸取代」可以是保守的也可以是非保守的。優選情況是，取代為保守取代，其中一個氨基酸被具有相似結構和/或化學性質的另一氨基酸所取代。
在一實施方案中，保守取代可能包括由 Dayhoff 在「The Atlas of Protein Sequence and Structure. Vol. 5」Natl .Biomedical Research 中所述的取代，其內容透過引用整體併入本文。例如，一方面，屬於以下組之一的氨基酸可彼此交換，因此構成保守交換：第 1 組：丙氨酸 (A)、脯氨酸 (P)、甘氨酸 (G)、天冬醯胺 (N)、絲氨酸 (S)、蘇氨酸 (T)；第 2 組：半胱氨酸 (C)、絲氨酸 (S)、酪氨酸 (Y)、蘇氨酸 (T)；第 3 組：纈氨酸 (V)、異亮氨酸 (I)、亮氨酸 (L)、甲硫氨酸 (M)、丙氨酸 (A)、苯丙氨酸 (F)；第 4 組：賴氨酸 (K)、精氨酸 (R)、組氨酸 (H)；第 5 組：苯丙氨酸 (F)、酪氨酸 (Y)、色氨酸 (W)、組氨酸 (H)；和第 6 組：天冬氨酸 (D)、谷氨酸 (E)。一方面，保守氨基酸取代可選自以下取代：T→A、G→A、A→I、T→V、A→M、T→I、A→V、T→G 和/或 T→S。
在另一實施方案中，保守氨基酸取代可包括用相同類別的另一個氨基酸取代一種氨基酸，例如，(1) 非極性：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp；(2) 不帶電的極性：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln；(3) 酸性：Asp、Glu；和 (4) 鹼性：Lys、Arg、His。其他保守氨基酸取代也可以按如下進行：(1) 芳香族：Phe、Tyr、His；(2) 質子供體：Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp；和 (3) 質子受體：Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln（參見例如美國專利號 10,106,805，其內容透過引用整體併入本文）。
在另一方實施方案中，保守取代可以根據表 A 進行。用於預測蛋白質修飾耐受性的方法可參見，例如，Guo et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., USA , 101(25):9205-9210 (2004)，其內容透過引用整體併入。
表 A：保守的氨基酸取代
Figure 02_image001
一方面，本文所述的序列可包括 1、2、3、4、5、10、15、20、25 或 30 個氨基酸或核苷酸突變、取代、刪除。另一方面，SEQ ID NO: 1-95 中的任何一個均可包括 1、2、3、4、5、10、15、20、25 或 30 個突變、取代、刪除。再一方面，突變或取代為保守氨基酸取代。
在另一實施方案中，保守取代可能為表 B 中「保守取代」標題下所示的取代。如果此類取代導致生物活性改變，則可能引入表 B 中稱為「示例性取代」的重大改變，並且在需要時篩選產品。
表 B：氨基酸取代
Figure 02_image003
內部核糖體進入位點 (IRES)
本發明的病毒基因組包含至少一個，但可以任選地包含兩個或更多個 NOI。為了表達兩個或多個 NOI，載體基因組內可能有兩個或多個轉錄單位，每個 NOI 一個。但是，從文獻中清楚地看出，如果逆轉錄病毒載體在基因上保持簡單，則它們可達到最高的滴度和最有效的基因表達特性 (PCT/GB96/01230; Bowtell et al., 1988 J. Virol. 62, 2464; Correll et al., 1994 Blood 84, 1812; Emerman and Temin 1984 Cell 39, 459; Ghattas et al., 1991 Mol. Cell. Biol. 11, 5848; Hantzopoulos et al., 1989 PNAS 86,3519; Hatzoglou et al., 1991 J. Biol. Chem 266,8416; Hatzoglou et al., 1988.J.Biol.Chem 263, 17798; Li et al., 1992 Hum. Gen. Ther. 3, 381; McLachlin et al., 1993 Virol.195, 1; Overell et al., 1988 Mol.Cell Biol.8, 1803; Scharfman et al., 1991 PNAS 88, 4626; Vile et al., 1994 Gene Ther 1,307; Xu et al., 1989 Virol.171, 331; Yee et al., 1987 PNAS 84, 5197)。因此，優選使用內部核糖體進入位點 (IRES) 來啟始多順反子（或如本文所用，「多順反子」(multi-cistronic))）訊息中第二（和後續）編碼序列的翻譯 (Adam et al.1991 J. Virol. 65, 4985)。
將 IRES 元件插入逆轉錄病毒載體與逆轉錄病毒複製週期相容，並允許從單個啟動子表達多個編碼區 (Adam et al. (as above); Koo et al.(1992) Virology 186:669-675; Chen et al.1993 J. Virol 67:2142-2148)。IRES 元件首先在小核糖核酸病毒的非翻譯的 5' 末端發現，它們可促進病毒蛋白的 cap 非依賴性翻譯 (Jang et al.(1990) Enzyme 44; 292-309)。當位於 RNA 中開放閱讀框之間時，IRES 元件透過在 IRES 元件促進核糖體進入，然後下游啟始翻譯，從而使下游開放閱讀框有效翻譯。
術語「順反子」系指 DNA 分子的一部分，其指定一條多肽鏈的形成，即編碼一條多肽鏈。例如，「雙順反子」系指 DNA 分子的兩個部分，其指定兩條多肽鏈的形成，即編碼兩條多肽鏈。「三順反子」系指 DNA 分子的三個部分，其指定三個多肽鏈的形成，即編碼三個多肽鏈；以此類推。術語「多順反子RNA」系指包含基因資訊以翻譯為幾種蛋白質的 RNA。相反，單順反子 RNA 包含僅翻譯單個蛋白質的基因資訊。在本公開背景下，從慢病毒轉錄的多順反子 RNA 可翻譯為兩種蛋白質，例如 TCRα 鏈和 TCRβ 鏈。
Mountford 和 Smith提出了關於 IRES的綜述 (TIG May 1995 vol 11, No 5:179-184)。許多不同的 IRES 序列均已知，包括來自腦心肌炎病毒 (EMCV) (Ghattas, I.R., et al., Mol. Cell. Biol., 11:5848-5859 (1991))；BiP 蛋白 (Macejak and Sarnow, Nature 353:91 (1991))；果蠅觸角基因（外顯子 d 和 e）(Oh, et al., Genes & Development, 6:1643-1653 (1992)) 以及脊髓灰質炎病毒 (PV) (Pelletier and Sonenberg, Nature 334: 320-325 (1988)) 的序列，同時也請參閱 Mountford and Smith, TIG 11, 179-184 (1985)。
根據 WO-A-97/14809，IRES 序列通常見於基因的 5' 非編碼區。除了文獻中的那些外，還可透過尋找影響表達的基因序列然後確定該序列影響 DNA（即充當啟動子或增強子）還是僅影響RNA（充當 IRES 序列）從而根據經驗找到它們。
來自 PV、EMCV 和豬水皰病病毒的 IRES 元件之前已被用於逆轉錄病毒載體（Coffin et al，如上）。
術語「IRES」包括充當或改善 IRES 功能的任何序列或序列的組合。所述 IRES 可以為病毒起源（如 EMVC IRES、PV IRES 或 FM​​DV 2A樣序列）或細胞起源（如 FGF2 IRES、NRF IRES、Notch 2 IRES 或 EIF4 IRES）。
為了讓 IRES 能夠啟始每個 NOI 的翻譯，其應該位於載體基因組中 NOI 之間或之前。例如，對於 NOI 中包含的多順反子序列，基因組可以如下：
[NOI1 -IRES1 ] ...NOI n ，n = 任何整數
對於雙順反子和三順反子序列，順序可以如下：
NOI1 -IRES1 -NOI2
NOI1 -IRES1 -NOI2 -IRES2 -NOI3
也可以使用 IRES 和 NOI 的替代配置。例如，包含 IRES 和 NOI 的轉錄本不需要從同一啟動子驅動。
此排列的示例可以為：
IRES1 -NOI1 -啟動子-NOI2 -IRES2 -NOI3 。
在一些方面，在利用具有一個以上 IRES 和 NOI 的內部盒的任何構建體中，IRES 可以具有不同的起源，即彼此異源。例如，一個 IRES 可能來自 EMCV，另一個 IRES 可能來自脊髓灰質炎病毒。
自一個載體表達多個基因的其他方法
儘管 IRES 是從一個載體共表達多個基因的有效方法，但是其他方法也有用，並且可單獨使用或與 IRES 結合使用。這些包括在載體中使用多個內部啟動子 (Overell et al., Mol Cell Biol.8: 1803-8 (1988))，或使用替代剪接模式導致多個 RNA物種衍生自表達不同基因的單個病毒基因組。此策略之前已單獨用於兩個基因 (Cepko et al.Cell 37: 1053 (1984))。
例如，可以將多個克隆位點 (MCS) 進一步摻入載體中，以便於 NOI 插入。此 MCS 有利於引入任何啟動子、單個基因、兩個基因以及任選地基因抑制序列，例如反義、核酶、shRNA、RNAi、microRNA、適體、反式顯性突變體蛋白等。一優選實施方案為已被修飾之目的基因的表達，以便其核苷酸序列相對於細胞中的內源基因具有密碼子簡併性，另外，同一載體表達能夠抑制或沉寂目的天然基因的基因抑制或沉寂序列。這種方法在理解各種蛋白結構域的功能方面具有巨大的實用性，方法是透過表達已在這些結構域中修飾的目的蛋白，同時表達基因抑制或沉寂序列，其可抑制或沉寂天然非修飾目的基因的表達。這種應用還可用於治療疾病的基因治療方法。例如，表達靶向於 β-血紅蛋白的 RNAi 的慢病毒載體可以抑制或沉寂鐮狀細胞性貧血患者的鐮狀血紅蛋白。同一慢病毒載體還可以表達正常的血紅蛋白分子，所述分子已在 RNAi 靶向的位元點處進行了密碼子簡併。這樣，表達鐮刀球蛋白的紅系細胞可以抑制鐮刀球蛋白的表達，同時表達天然血紅蛋白並糾正基因異常。慢病毒載體可被遞送至幹細胞群中，這會產生表達血紅蛋白的紅系細胞，最終變為紅細胞。這種方法可用於治療多種疾病，包括癌症、遺傳病和傳染病。
轉導的細胞
本發明還涉及已用包含根據本發明所述病毒基因組的載體系統轉導的細胞。
細胞可以透過任何合適的方式在體內、體外或離體進行轉導。例如，如果細胞是來自哺乳動物受試者的細胞，則可以將所述細胞從所述受試者中移除並進行轉導以準備重新植入受試者中（離體轉導）。備選地，細胞可以根據標準技術使用本發明的載體系統透過體內直接基因轉移進行轉導（例如，透過注射表達 NOI 的載體原液）。如果細胞是在培養液穩定的細胞系一部分（即，可以存活許多傳代，並可在體外倍增），則可透過標準技術在體外進行轉導，例如，將細胞暴露至含有表達 NOI 的載體的病毒上清液。
細胞可以為任何易於轉導的細胞。如果載體系統能夠轉導非分裂細胞（例如，如果為慢病毒系統），則所述細胞可以為非分裂細胞。
一方面，本公開涉及免疫細胞（例如淋巴細胞、嗜中性粒細胞和/或單核細胞）的啟動、轉導和/或擴增。在一些方面，免疫細胞為淋巴細胞，諸如 T 細胞（例如，腫瘤浸潤淋巴細胞、CD8+ T 細胞、CD4+ T 細胞和 γδ T 細胞）、B 細胞和/或 NK 細胞，它們可用於轉基因表達。另一方面，本公開內容涉及 γδT 細胞的啟動、轉導和表達，同時消耗 α-和/或 β-TCR 陽性細胞。
一方面，在沒有預先消耗特定細胞群（例如，單核細胞、αβ T 細胞、B 細胞和 NK 細胞）的情況下可活化和擴增全部的 PBMC 群。另一方面，γδ T 細胞可從體外培養的複雜樣本中分離。另一方面，可以在特異性活化和擴增之前產生富集的 γδ T 細胞群。另一方面，可以在不存在天然或工程化 APC 的情況下進行 γδ T 細胞的活化和擴增。另一方面，可以使用固定的 T 細胞有絲分裂原（包括 TCR 特異的抗體）和其他 TCR 活化劑（包括凝集素）對來自腫瘤樣本的 T 細胞進行分離和擴增。另一方面，可在不存在 T 細胞有絲分裂原（包括 TCR 特異的抗體）和其他 TCR 活化劑（包括凝集素）的情況下對來自腫瘤樣本的 T 細胞進行分離和擴增。
一方面，T 細胞分離自受試者（例如人受試者）的白細胞分離產物。另一方面，T 細胞不是從外周血單核細胞 (PBMC) 中分離的。
T 細胞製備可透過使用 US20190247433 中公開的方法來進行，其內容透過引用整體併入本文。
一方面，本公開提出了轉導 T 細胞的方法，包括解凍冷凍的 PBMC、靜置解凍的PBMC、用抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體啟動培養 PBMC 中的 T 細胞、用病毒載體轉導啟動的 T 細胞、擴增轉導的 T 細胞以及獲得擴增的 T 細胞。
另一方面，本公開涉及一種製備 T 細胞群的方法，包括獲得新鮮的 PBMC（即PBMC不是透過解凍冷凍保存的 PBMC 來獲得）、用抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體啟動新鮮 PBMC 中的 T 細胞、用病毒載體轉導啟動的 T 細胞、擴增轉導的 T 細胞以及收穫擴增的 T 細胞。
在本公開的另一項實施方案中，對於新鮮 PBMC（即，未冷凍的 PBMC），可能無需靜置。因此，未靜置的新鮮 PBMC 可透過抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體啟動，之後透過病毒載體轉導，以獲得轉導的 T 細胞。
另一方面，解凍、靜置、啟動、轉導、擴增和/或獲得可能在封閉系統中進行。
另一方面，啟動、轉導、擴增和收穫可能在封閉或半封閉的系統中進行。
另一方面，封閉系統可能為 CliniMACS、ProdigyTM 、WAVE (XURITM ) 生物反應器、 WAVE (XURITM ) 生物反應器與 BioSafe SepaxTM II 組合、G-Rex/GatheRexTM 封閉系統或 G-Rex/GatheRexTM 封閉系統與 BioSafe SepaxTM II 組合。
為了產生過繼免疫療法療效改善的 T 細胞，T 細胞製備可透過使用 US20190292520 中公開的方法來進行，其內容透過引用整體併入本文。
一方面，產生過繼免疫療法療效改善的 T 細胞的方法可包括：從至少一名健康的供體、患者或個體獲得 T 細胞、啟動 T 細胞、用病毒載體轉導啟動的 T 細胞、在啟動後將轉導的 T 細胞擴增約 3 天至約 5 天、收集擴增的轉導 T 細胞以注入至少一名健康的供體、患者或個體中，其中 T 細胞擴增約 3 天至約 5 天後過繼免疫療法的療效相對於在啟動後擴增約 7 天或更長時間的啟動和轉導 T 細胞改善。
另一方面，擴增 T 細胞表現為幼稚 T 細胞 (TN) 和/或幹記憶 T 細胞 (Tscm)/T 中樞記憶 (Tcm) 表型。
另一方面，產生過繼免疫療法療效改善的 T 細胞的方法可以包括：從患者或供體中獲得 CD8+ T 細胞群、確定所獲得細胞群中 CD28+ CD8+ T 細胞的百分比、用抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體啟動所確定的細胞群（其中確定的細胞群包含至少約 50%、至少約 55%、至少約 60%、至少約 65%、至少約 70%、至少約 75%、至少約 80%、至少約 85%、至少約 90%、至少約 91%、至少約 92%、至少約 93%、至少約 94%、至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的 CD28+ CD8+ T 細胞）、用病毒載體轉導啟動的 T 細胞群、以及擴增轉導的 T 細胞群。
另一方面，本公開涉及用於產生免疫療法療效改善的 T 細胞的離體方法，包括：確定分離的 CD8+ T 細胞群中 CD28+ CD8+ T 細胞的百分比、用抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體啟動所確定的細胞群（前提是確定的細胞群包含至少 50%、至少 55%、至少 60%、至少 65%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 91%、至少 92%、至少 93%、至少 94%、至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98% 或至少 99% 的 CD28+ CD8+ T 細胞）、用病毒載體轉導啟動的 T 細胞群、以及擴增轉導的 T 細胞群。
另一方面，本公開涉及用於產生免疫療法療效改善的 T 細胞的方法，包括：從患者或供體中獲得 CD8+ T 細胞群、確定所獲得細胞群中 CD28+ CD8+ T 細胞的百分比、在不存在抗 CD28 抗體的情況下用抗 CD3 抗體啟動所確定的 TCR 細胞群（前提是確定的細胞群包含小於約 50%、小於約 45%、小於約 40%、小於約 35%、小於約 30%、小於約 25%、小於約 20%、小於約 15%、小於約 10%、小於約 9%、小於約 8%、小於約 7%、小於約 6%、小於約 5%、小於約 4%、小於約 3%、小於約 2% 或小於約 1% 的 CD28+ CD8+ T 細胞）、用病毒載體轉導啟動的 T 細胞群、以及擴增轉導的 T 細胞群。
另一方面，本公開涉及用於產生免疫療法療效改善的T 細胞的離體方法，包括：確定分離的 CD8+ T 細胞群中 CD28+ CD8+ T 細胞的百分比、在不存在抗 CD28 抗體的情況下用抗 CD3 抗體啟動所確定的 TCR 細胞群（前提是確定的細胞群包含小於約 50%、小於約 45%、小於約 40%、小於約 35%、小於約 30%、小於約 25%、小於約 20%、小於約 15%、小於約 10%、小於約 9%、小於約 8%、小於約 7%、小於約 6%、小於約 5%、小於約 4%、小於約 3%、小於約 2% 或小於約 1% 的 CD28+ CD8+ T 細胞）、用病毒載體轉導啟動的 T 細胞群、以及擴增轉導的 T 細胞群。
另一方面，轉導和擴增可在存在至少一種細胞因子的情況下進行。
一方面，分離的 γδ T 細胞可以快速擴增，以應對與一種或多種抗原接觸。一些 γδ T 細胞（例如 Vγ9Vδ2+ T 細胞）可以在組織培養期間在體外快速擴增，以應對與一些抗原（如：異戊二烯基焦磷酸酯、烷基胺和代謝物或微生物提取物）接觸。刺激的 γδ T 細胞可以表現出許多抗原呈遞、共刺激和黏附分子，其可以促進從複雜樣本中分離 γδ T 細胞。複合樣本中的 γδ T 細胞可以用至少一種抗原在體外刺激 1 天、2 天、3 天、4 天、5 天、6 天、7 天或其他合適的時間段。用合適的抗原刺激 γδ T 細胞可以在體外擴增 γδ T 細胞群。
可用於在體外刺激複雜樣本中 γδ T 細胞擴增的抗原非限制性實例可包括異戊烯-焦磷酸鹽，例如異戊烯焦磷酸鹽 (IPP)、烷基胺、人微生物病原體代謝物、共生細菌代謝物、甲基-3-丁烯基-1-焦磷酸 (2M3B1PP)、(E)-4-羥基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸鹽 (HMB-PP)、焦磷酸乙酯 (EPP)、法呢基焦磷酸鹽 (FPP)、二甲基烯丙基磷酸鹽 (DMAP)、二甲基烯丙基焦磷酸鹽 (DMAPP)、乙基三磷酸腺苷 (EPPPA)、香葉基焦磷酸鹽 (GPP)、香葉基香葉基焦磷酸鹽 (GGPP)、異戊烯基三磷酸腺苷 (IPPPA)、磷酸單乙基酯 (MEP)、焦磷酸單乙酯 (MEPP)、3-甲醯基-1-丁基焦磷酸鹽 (TUBAg 1)、X-焦磷酸鹽 (TUBAg 2)、3-甲醯基-1-丁基-尿苷三磷酸鹽 (TUBAg 3)、3-甲醯基-1-丁基-去氧胸苷三磷酸 (TUBAg 4)、單乙基烷基胺、烯丙基焦磷酸鹽、巴豆醯基焦磷酸鹽、二甲基烯丙基-γ-尿苷三磷酸鹽、巴豆醯基-γ-尿苷三磷酸鹽、烯丙基-γ-尿苷三磷酸鹽、乙胺、異丁胺、仲丁胺、異戊胺和含氮二膦酸鹽。
可以使用本文所述的活化和共刺激劑進行 γδ T 細胞的活化和擴增，以觸發特異性 γδ T 細胞增殖和持久性群體。一方面，來自不同培養物的 γδ T 細胞的活化和擴增可以實現不同的克隆或混合多克隆群體亞群。另一方面，不同的激動劑可用於鑒定提供特異性 γδ 啟動信號的劑。另一方面，提供特異性 γδ 啟動信號的劑可以是針對 γδ TCR 的不同單克隆抗體 (MAb)。另一方面，可以使用伴隨共刺激劑以幫助觸發特異性 γδ T 細胞增殖而不誘導細胞能量和細胞凋亡。這些共刺激劑可包括與 γδ 細胞上表達的受體結合的配體，如NKG2D、CD161、CD70、JAML、DNAX 輔助分子-1 (DNAM-1)、ICOS、CD27、CD137、CD30、HVEM、SLAM、CD122、DAP 和 CD28。另一方面，共刺激劑可以是對 CD2 和 CD3 分子上的獨特表位特異的抗體。當在 αβ 或 γδ T 細胞上表達時，CD2 和 CD3 可具有不同的構象結構。另一方面，CD3 和 CD2 的特異性抗體可導致 γδ T 細胞的不同活化。
在 γδ T 細胞改造之前，可以離體擴增 γδ T 細胞群。可用於促進體外 γδ T 細胞群擴增的試劑非限制性實例可能包括抗 CD3 或抗 CD2、抗 CD27、抗 CD30、抗 CD70、抗 OX40 抗體、IL-2、IL-15、IL-12、IL-9、IL-33、IL-18 或 IL-21、CD70（CD27 配體）、植物血凝素 (PHA)、刀豆蛋白 A (ConA)、商陸 (PWM)、蛋白質花生凝集素 (PNA)、大豆凝集素 (SBA)、扁豆凝集素 (LCA)、豌豆凝集素 (PSA)、蝸牛凝集素 (HPA)、蠶豆凝集素 (VGA) 或其他能夠刺激 T 細胞增殖的合適有絲分裂原。
一方面，改造（或轉導）的 γδ T 細胞可以在不受抗原呈遞細胞或氨基二膦酸鹽的刺激下離體擴增。本公開的抗原反應性改造 T 細胞可以離體和體內擴增。另一方面，本公開內容的改造 γδ T 細胞的活性群體可以離體擴增，而無需抗原呈遞細胞、抗原肽、非肽分子或小分子化合物（例如，氨基二膦酸鹽）的抗原刺激，但是使用某些抗體、細胞因子、有絲分裂原或融合蛋白，例如：IL-17 Fc 融合、MICA Fc 融合和 CD70 Fc 融合。可用於擴增 γδ T 細胞群抗體實例可能包括抗 CD3、抗 CD27、抗 CD30、抗 CD70、抗 OX40、抗 NKG2D 或抗CD2 抗體，細胞因子的實例可能包括 IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-18、IL-9、IL-7 和/或 IL-33，有絲分裂原的實例可能包括CD70 人 CD27 的配體、植物血凝素 (PHA)、刀豆蛋白 A (ConA)、商陸有絲分裂原 (PWM)、蛋白質花生凝集素 (PNA)、大豆凝集素 (SBA)、扁豆凝集素 (LCA)、豌豆凝集素 (PSA)、蝸牛凝集素 (HPA)、蠶豆凝集素 (VGA) 或其他能夠刺激 T 細胞增殖的合適有絲分裂原。另一方面，改造 γδ T 細胞群可在少於 60 天、少於 48 天、少於 36天、少於 24 天、少於 12 天或少於 6 天內擴增。另一方面，工程化改造 γδ T 細胞群可擴增約 7 天至約 49 天、約 7 天至約 42 天、約 7 天至約 35 天、約 7 天至約 28 天、約 7 天至約 21 天或約 7 天至約 14 天。
另一方面，本公開內容提供了用於離體擴增用於過繼轉移療法的改造 T 細胞群的方法。本公開內容的改造 T 細胞可離體擴增。本公開內容的改造 T 細胞可在不經 APC 活化或不與 APC 和氨基磷酸鹽共培養下在體外擴增。
透過 T 細胞的基因工程可以增強 T 細胞識別廣譜抗原的能力。一方面，可以改造 T 細胞以提供識別體內選擇抗原的通用同種異體療法。T 細胞的基因改造可能包括穩定整合表達腫瘤識別部分的構建體，例如：αβ TCR、γδ TCR、嵌合抗原受體 (CAR)，其將抗原結合和 T 細胞啟動功能組合為單一的受體、其抗原結合片段或淋巴細胞啟動結構域組合為分離 T 細胞、細胞因子（例如，IL-15、IL-12、IL-2、IL-7、IL-21、IL-18、IL-19、IL-33、IL-4、IL-9、IL-23 或 IL1β）的基因組，以在體外和體內增強 T 細胞增殖、存活和功能。分離 T 細胞的基因改造還可能包括從分離 T 細胞的基因組中的一個或多個內源基因（例如，MHC 基因座）中刪除或破壞基因表達。
嵌合抗原受體 (CAR)
本公開的實施方案可以包括將編碼一種或多種 CAR 的核酸引入 T 細胞。T 細胞可以為 αβ T 細胞、γδ T 細胞或天然殺傷 T 細胞。在各種實施方案中，本公開提出了採用設計用於表達將細胞毒性重定向至腫瘤細胞的 CAR 的載體進行基因學工程改造的 T 細胞。CAR 分子將針對靶抗原（例如，腫瘤抗原）的基於抗體的特異性與啟動 T 細胞受體的細胞內結構域相結合，以產生表現出特異性抗腫瘤細胞免疫活性的嵌合蛋白。本文所用的術語「嵌合」描述由不同蛋白質或不同來源 DNA 的部分組成。
CAR 可以包含與特異性靶抗原結合的細胞外結構域（也稱為結合結構域或抗原特異性結合結構域）、跨膜結構域和細胞內信號傳導結構域。CAR 的主要特徵可能是其能夠重新定向免疫效應細胞特異性，從而觸發增殖、細胞因子產生、吞噬作用或產生可以主要組織相容性 (MHC) 非依賴方式介導靶抗原表達細胞的細胞死亡的分子，利用單克隆抗體、可溶性配體或細胞特異性共受體的細胞特異性靶向作用能力。
在特定的實施方案中，CAR 可以包含細胞外結合結構域，其包括但不限於抗體或其抗原結合片段、系鏈配體、或共受體的細胞外結構域，其與腫瘤相關抗原 (TAA) 或腫瘤特異性抗原 (TSA) 的靶向抗原特異性結合。在某些實施方案中，TAA 或 TSA 可以在血液癌細胞上表達。在另一實施方案中，TAA 或 TSA 可以在實體瘤細胞上表達。在特定的實施方案中，實體瘤可以是膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌、除非小細胞肺癌以外的肺癌、乳腺癌、攝護腺癌、胰腺癌、肝癌、結腸癌、胃癌、脾癌、皮膚癌、除膠質母細胞瘤以外的腦癌、腎癌、甲狀腺癌等等。
在特定實施方案中，TAA 或 TSA 可以選自由 α 葉酸受體、5T4、ανβ6 整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR 家族，包括 ErbB2 (HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒 AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3 (GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1 、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D 配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs 和 VEGFR2 組成的組。
CAR 的結合結構域
在特定的實施方案中，本文考慮的 CAR 包含與腫瘤細胞上表達的靶多肽（例如，靶抗原）特異性結合的細胞外結合結構域。
本文所用的術語「結合結構域」、「細胞外結構域」、「細胞外結合結構域」、「抗原特異性結合結構域」和「細胞外抗原特異性結合結構域」可以互換使用，並提供能與目標靶抗原特異性結合的 CAR。結合結構域可以包括具有特異性識別並結合生物分子（例如，細胞表面受體或腫瘤蛋白、脂質、多糖或其他細胞表面靶分子或其組分）能力的任何蛋白、多肽、寡肽或肽。結合結構域可包括用於目的生物分子的任何天然存在、合成、半合成或重組產生的結合伴侶。
在特定實施方案中，CAR 的細胞外結合結構域可包括抗體或其抗原結合片段。「抗體」系指結合劑，其為至少包含一條輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區的多肽，其特異性地識別並結合靶抗原的表位，例如肽、脂質、多糖或含有抗原決定簇的核酸，例如被免疫細胞識別者。抗體可包括其抗原結合片段。所述術語還可以包括基因工程改造的形式，如嵌合抗體（例如，人源化鼠抗體）、異源綴合物抗體（例如，雙特異性抗體）及其抗原結合片段。另請參閱 Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997。
在特定實施方案中，靶抗原可以為 α 葉酸受體、5T4、ανβ6 整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR 家族，包括 ErbB2 (HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒 AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3 (GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1 、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D 配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs 或 VEGFR2 多肽的表位。
輕鏈和重鏈可變區可以包含被三個高變區打斷的「框架」區，高變區也稱為「互補決定區」或「CDR」。CDR 可透過常規方法定義或鑒定，例如透過根據 Kabat et al (Wu, TT and Kabat, E. A., J Exp Med. 132(2):211-50, (1970); Borden, P. and Kabat E. A., PNAS, 84:2440-2443 (1987) 所述的序列；（請參閱 Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991, which is hereby incorporated by reference), or by structure according to Chothia et al (Choithia, C. and Lesk, A.M., J Mol.Biol, 196(4):901-917 (1987), Choithia, C. et al, Nature, 342:877 - 883 (1989))。上述參考文獻的內容透過引用整體併入本文。不同輕鏈或重鏈的框架區序列在諸如人之類的物種中可能是相對保守的。抗體的框架區是組成性輕鏈和重鏈的組合框架區，可用於在三維空間中定位和排列 CDR。CDR 主要負責與抗原表位結合。每條鏈的 CDR 通常可以稱為 CDR1、CDR2 和 CDR3，從 N 端開始依次編號，並且通常還可以透過特定 CDR 所在位置的鏈來識別。因此，位於抗體重鏈可變結構域中的 CDR 可以稱為 CDRH1、CDRH2 和 CDRH3，而位於抗體輕鏈可變結構域中的 CDR 稱為 CDRL1、CDRL2 和 CDRL3。具有不同特異性（即，針對不同抗原的不同組合位點）的抗體可能具有不同 CDR。儘管不同的抗體之間 CDR 不同，但 CDR 內僅有限數量的氨基酸位置直接參與抗原結合。CDR 內的這些位置稱為特異性決定殘基 (SDR)。
提及「VH」或「VH」系指免疫球蛋白重鏈的可變區，包括抗體、Fv、scFv、dsFv、Fab 或其他抗體片段的可變區。提及「VL」或「VL」系指免疫球蛋白輕鏈的可變區，包括抗體、Fv、scFv、dsFv、Fab 或其他抗體片段的可變區。
「單克隆抗體」是由 B 淋巴細胞的單個克隆或由轉染了單個抗體輕鏈和重鏈基因的細胞產生的抗體。單克隆抗體可以透過本領域技術人員已知的方法來產生，例如，透過將骨髓瘤細胞與免疫脾細胞融合而製備雜交抗體形成細胞。單克隆抗體可以包括人源化單克隆抗體。
「嵌合抗體」具有來自一種物種（例如人）的框架殘基和來自另一物種（諸如小鼠）的 CDR（通常賦予抗原結合特性）。在特定優選的實施方案中，本文公開的 CAR 可以包含是嵌合抗體或其抗原結合片段的抗原特異性結合結構域。
在某些實施方案中，抗體可以是與腫瘤細胞上表面蛋白特異性結合的人源化抗體（例如人源化單克隆抗體）。「人源化」抗體為免疫球蛋白，包括人框架區和來自非人（例如小鼠、大鼠或合成的）免疫球蛋白的一個或多個 CDR。人源化抗體可以透過基因工程改造構建（例如，參見美國專利號 5,585,089，其內容透過引用整體併入本文）。
在實施方案中，CAR 的細胞外結合結構域可包含抗體或其抗原結合片段，包括但不限於駱駝 Ig（駱駝科抗體 (VHH)）、Ig NAR、Fab 片段、Fab' 片段、F(ab)'2 片段、F(ab)'3 片段、Fv、單鏈 Fv 抗體（「scFv」）、bis-scFv、(scFv)2、微型抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、二硫鍵穩定的 Fv 蛋白（「dsFv」）和單結構域抗體（sdAb、納米抗體）。
本文所用的「駱駝 Ig」或「駱駝科 VHH」系指重鏈抗體的最小已知抗原結合單位（Koch-Nolte, et al, FASEB J., 21:3490-3498 (2007)，其內容透過引用整體併入本文）。「重鏈抗體」或「駱駝科抗體」系指含有兩個 VH 結構域且無輕鏈的抗體（Riechmann L. et al, J. Immunol. Methods 231:25-38 (1999)；WO94/04678；W094/25591；美國專利號 6,005,079；其內容透過引用整體併入本文）。
「IgNAR」或「免疫球蛋白新抗原受體」系指來自鯊魚免疫庫的一類抗體，其由一個可變新抗原受體 (VNAR) 結構域和五個恒定新抗原受體 (CNAR) 結構域的同二聚體組成。
抗體的木瓜蛋白酶消化產生兩種相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，每個片段都有一個抗原結合位點和殘餘「Fc」片段，其名稱反映了其能夠容易結晶。Fab 片段包含重鏈和輕鏈可變結構域，還包含輕鏈的恒定結構域和重鏈的第一恒定結構域 (CH1)。Fab' 片段與 Fab 片段的區別在於，在重鏈 CH1 結構域的羧基末端添加了一些殘基，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸。Fab′-SH 是本文中 Fab′ 的名稱，其中恒定結構域的半胱氨酸殘基帶有游離硫醇基。F(ab')2 抗體片段最初生成為成對 Fab' 片段，在它們之間有鉸鏈半胱氨酸。抗體片段的其他化學偶聯也是已知的。
「Fv」是包含完整抗原結合位點的最小抗體片段。在單鏈 Fv (scFv) 物種中，一個重鏈和一個輕鏈可變結構域可以透過柔性肽連接子共價連接，這樣，輕鏈和重鏈就可以締合成類似於兩鏈 Fv 物種的「二聚體」結構。
術語「雙抗體」是指具有兩個抗原結合位點的抗體片段，該片段包含與相同多肽鏈 (VH-VL) 內輕鏈可變結構域 (VL) 連接的重鏈可變結構域 (VH)。透過使用太短以至於無法允許同一條鏈上兩個結構域之間配對的連接子，所述結構域被迫與另一條鏈的互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點。雙抗體可以是二價的或雙特異性的。雙抗體在，例如， EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al, Nat. Med. 9:129-134 (2003)；和 Hollinger et al, PNAS USA 90: 6444-6448 (1993) 中更詳細的描述。 三抗體和四抗體也在 Hudson et al, Nat. Med. 9:129-134 (2003) 中進行了描述。上述參考文獻的內容透過引用整體併入本文。
「單結構域抗體」或「sdAb」或「納米抗體」系指由抗體重鏈的可變區（VH 結構域）或抗體輕鏈的可變區（VL 結構域）組成的抗體片段（Holt, L., et al, Trends in Biotechnology, 21(11):484-490，該文中的內容透過引用整體併入本文）。
「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體的 VH 和 VL 結構域，其中這些結構域以單個多肽鏈和任一方向（例如 VL-VH 或 VH-VL）存在。通常情況下，scFv 多肽進一步包括 VH 和 VL 結構域之間的多肽連接子，其使得 scFv 能夠形成所需的抗原結合結構。有關 scFv 的綜述，請參見，例如，Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp.269-315，該文中的內容透過引用整體併入本文。
在某些實施方案中，scFv 與 α 葉酸受體、5T4、ανβ6 整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CALX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR 家族，包括 ErbB2 (HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒 AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3 (GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1 、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D 配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs 或 VEGFR2 多肽結合。
CAR 的連接子
在某些實施方案中，CAR 可以在各個結構域之間，例如在 VH 和 VL 結構域之間包含連接子殘基，其被添加以適當地間隔和構象分子。CAR 可以包含一個、兩個、三個、四個或五個或五個以上的連接子。在特定實施方案中，連接子的長度可以為約 1 至約 25 個氨基酸、約 5 至約 20 個氨基酸或約 10 至約 20 個氨基酸，或任何中間的氨基酸長度。在一些實施方案中，連接子的長度可以為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 個或更多氨基酸。連接子的說明性示例包括甘氨酸聚合物 (G)n；甘氨酸-絲氨酸聚合物 (Gi_sSi_5)n，其中 n 為至少一個、兩個、三個、四個或五個的整數；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-絲氨酸聚合物；和本領域已知的其他柔性連接子。甘氨酸和甘氨酸-絲氨酸聚合物相對而言是非結構化的，因此可能能夠充當融合蛋白（例如 CAR）的結構域之間的中性系鏈。甘氨酸可能甚至比丙氨酸進入更多的 phi-psi 空間，並且與具有較長側鏈的殘基相比所受的限制要少得多（請參閱 Scheraga, Rev. Computational Chem.11173-142 (1992)，該文中的內容透過引用整體併入本文）。普通技術人員可認識到，在特定實施例中，CAR 的設計可以包括可能是全部或部分柔性的連接子，使得所述連接子可以包括柔性連接子以及賦予柔性較差結構的一個或多個部分，以提供所需的 CAR 結構。
在特定實施方案中，CAR 可以包括 scFV，其可以進一步包含可變區連接序列。「可變區連接序列」是一個氨基酸序列，其將重鏈可變區連接至輕鏈可變區，並提供與兩個亞結合結構域相互作用相容的間隔子功能，從而獲得的多肽與可能包含相同輕鏈和重鏈可變區的抗體一樣，對同一靶分子保留特異性結合親和力。在一實施方案中，可變區連接序列的長度可以為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 個或更多個氨基酸。在一特定實施方案中，可變區連接序列可以包含甘氨酸-絲氨酸聚合物 (Gi_sSi_5)n，其中 n 為至少 1、2、3、4 或 5 的整數。在另一實施方案中，可變區連接序列包含一個 (G4 S)3 氨基酸連接子。
CAR 的間隔子結構域
在特定實施方案中，CAR 的結合結構域可跟隨一個或多個「間隔子結構域」，其是指使抗原結合結構域遠離效應細胞表面以實現適當的細胞/細胞接觸、抗原結合和啟動的區域（Patel et al, Gene Therapy, 1999; 6:412-419，該文中的內容透過引用整體併入本文）。間隔子結構域可以來自天然、合成、半合成或重組來源。在某些實施方案中，間隔子結構域可以為免疫球蛋白的一部分，包括但不限於一個或多個重鏈恒定區，例如，CH2 和 CH3。間隔子結構域可以包括天然存在的免疫球蛋白鉸鏈區或改變的免疫球蛋白鉸鏈區的氨基酸序列。在一實施方案中，間隔子結構域可以包括 IgG1 的 CH2 和 CH3。
CAR 的鉸鏈結構域
CAR 的結合結構域通常可跟隨一個或多個「鉸鏈結構域」，其可以在使抗原結合結構域遠離效應細胞表面定位以實現適當的細胞/細胞接觸、抗原結合和啟動中起作用。CAR 通常可以包括結合結構域和跨膜結構域 (TM) 之間的一個或多個鉸鏈結構域。鉸鏈結構域可以來自天然、合成、半合成或重組來源。鉸鏈結構域可以包括天然存在的免疫球蛋白鉸鏈區或改變的免疫球蛋白鉸鏈區的氨基酸序列。適用於 CAR 的示例性鉸鏈結構域可能包括源自 1 型膜蛋白（例如，CD8a、CD4、CD28 和 CD7）的細胞外區的鉸鏈區，其可能為這些分子的野生型鉸鏈區，也可能被改變。在另一實施方案中，鉸鏈結構域可以包括 CD8α 鉸鏈區。
CAR 的跨膜 (TM) 結構域
「跨膜結構域」可以是 CAR 的一部分，其可以融合細胞外結合部分和細胞內信號傳導結構域，並且將 CAR 錨定至免疫效應細胞的質膜。TM 結構域可以來自天然、合成、半合成或重組來源。示例性 TM 結構域可以衍生自 T 細胞受體、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137 和 CD154 的 α、β 或 ζ 鏈（至少包括其跨膜區）。在一實施方案中，CAR 可以包含衍生自 CD8a 的 TM 結構域。在另一實施方案中，本文考慮的 CAR 包含衍生自 CD8α 的 TM 結構域和短寡肽或多肽連接子，優選長度為 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個氨基酸，其連接 CAR 的 TM 結構域和細胞內信號傳導結構域。甘氨酸-絲氨酸連接子提供了特別合適的連接子。
CAR 的細胞內信號傳導結構域
在特定實施方案中，CAR 可以包含細胞內信號傳導結構域。「細胞內信號傳導結構域」系指 CAR 的一部分，其參與結合於靶抗原的有效 CAR 的訊息轉導至免疫效應細胞內部以引發效應細胞功能，例如啟動、細胞因子產生、增殖和細胞毒性活性，包括向 CAR 結合的靶細胞釋放細胞毒性因子，或用結合於細胞外 CAR 結構域的抗原引發其他細胞反應。
術語「效應子功能」系指細胞的專門功能。例如，T 細胞的效應子功能可以是溶細胞活性或幫助或包括細胞因子分泌的活性。因此，術語「細胞內信號傳導結構域」是指蛋白質的一部分，其可以轉導效應子功能信號並指導細胞執行專門的功能。雖然通常可以使用整個細胞內信號傳導結構域，但是在很多情況下，不必使用整個結構域。就可以使用細胞內信號傳導結構域的截短部分程度而言，可使用此類截短部分代替整個結構域，只要可以轉導效應子功能信號即可。術語細胞內信號傳導結構域可指包括足以轉導效應子功能信號的細胞內信號傳導結構域的任何截短部分。
已知僅透過 TCR 產生的信號不足以完全啟動 T 細胞，並且還可能需要次級或共刺激信號。因此，可以說 T 細胞啟動是由以下兩類不同細胞內信號傳導結構域介導的：透過 TCR（例如，TCR/CD3 複合體）啟始抗原依賴性主要啟動的一級信號傳導結構域；以抗原非依賴性方式作用從而提供次級或共刺激信號的共刺激信號傳導結構域。在優選實施方案中，CAR 可以包括細胞內信號傳導結構域，其可包含一個或多個「共刺激信號傳導結構域」和「一級信號傳導結構域」。一級信號傳導結構域可以以刺激性方式或抑制性方式調節 TCR 複合體的一級啟動。以刺激方式起作用的一級信號傳導結構域可能包含信號傳導基序，稱為基於免疫受體酪氨酸的啟動基序或 ITAM。在本發明中特別使用且包含 ITAM 的一級信號傳導結構域的說明性示例可以包括衍生自 TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b 和 CD66d 的結構域。在特定優選實施方案中，CAR 可以包括 CD3ζ 一級信號傳導結構域和一個或多個共刺激信號傳導結構域。細胞內一級信號傳導和共刺激信號傳導結構域可以以任何順序串聯連接至跨膜結構域的羧基末端。
CAR 可以包含一個或多個共刺激信號傳導結構域，以增強表達 CAR 受體的 T 細胞的療效和擴增。本文所用的術語「共刺激信號傳導結構域」或「共刺激結構域」系指共刺激分子的細胞內信號傳導結構域。此類共刺激分子的說明性示例可以包括 CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD30、CD40、PD-1、ICOS (CD278)、CTLA4、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、TRIM、LCK3、SLAM、DAP10、LAG3、HVEM、NKD2C 和 CD83。在一實施方案中，CAR 可以包含一個或多個選自由 CD28、CD137 和 CD134 組成組的共刺激信號傳導結構域以及一個 CD3ζ 一級信號傳導結構域。
在一實施方案中，CAR 可以包含 scFv，其與 α 葉酸受體、5T4、ανβ6 整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CALX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR 家族，包括 ErbB2 (HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒 AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3 (GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-Al+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D 配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs 或 VEGFR2 多肽結合；源於選自以下組成組的多肽的跨膜結構域：CD8α；CD4、CD45、PD1 和 CD152；以及一個或多個細胞內共刺激信號傳導結構域，其選自由以下組成的組：CD28、CD54、CD134、CD137、CD152、CD273、CD274 和 CD278；和 CD3ζ 一級信號傳導結構域。
在另一實施方案中，CAR 可以包含 scFv，其與 α 葉酸受體、5T4、ανβ6 整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CALX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR 家族，包括 ErbB2 (HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒 AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3 (GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1 、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D 配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs 或 VEGFR2 多肽結合；鉸鏈結構域，其選自由以下組成的組：IgG1 鉸鏈/CH2/CH3 和 CD8α 以及 CD8α；源於選自由以下組成組的多肽的跨膜結構域：CD8α；CD4、CD45、PD1 和 CD152；以及一個或多個細胞內共刺激信號傳導結構域，其選自由以下組成的組：CD28、CD 134 和 CD 137；和 CD3ζ 一級信號傳導結構域。
在再一實施方案中，CAR 可以包含 scFv，進一步包括連接子，其與 α 葉酸受體、5T4、ανβ6 整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR 家族，包括 ErbB2 (HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒 AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3 (GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1 、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D 配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs 或 VEGFR2 多肽結合；鉸鏈結構域，其選自由以下組成的組：IgG1 鉸鏈/CH2/CH3 和 CD8α 以及 CD8α；跨膜結構域，其包含源自選自由以下組成組的多肽的 TM 結構域：CD8a；CD4、CD45、PD1 和 CD 152，以及一個短寡肽或多肽連接子，優選長度為 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個氨基酸之間，其將 TM 結構域連接至 CAR 的細胞內信號傳導結構域；一個或多個細胞內共刺激信號傳導結構域，選自由以下組成的組：CD28、CD 134 和 CD137；和 CD3ζ 一級信號傳導結構域。
在一特定實施方案中，CAR 可以包含 scFv，其與 α 葉酸受體、5T4、ανβ6 整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR 家族，包括 ErbB2 (HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒 AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3 (GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1 、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D 配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs 或 VEGFR2 多肽結合；含有 CD8α 多肽的鉸鏈結構域；含有約 3 個氨基酸的多肽連接子的 CD8α 跨膜結構域；一個或多個細胞內共刺激信號傳導結構域，其選自由以下組成的組：CD28、CD134 和 CD137；和 CD3ζ 一級信號傳導結構域。
可用各種方法產生改造 T 細胞。例如，編碼包含腫瘤識別或其他類型識別部分的表達盒的多核苷酸可透過轉座子/轉座酶系統或基於病毒的基因轉移系統（例如，慢病毒或逆轉錄病毒系統）或其他合適的方法，如：轉染、電穿孔、轉導、脂質轉染、磷酸鈣 (CaPO4)、納米改造物質（如 Ormosil），病毒傳遞方法，包括腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、腺相關病毒或其他合適的方法穩定地引入 T 細胞。許多病毒方法已用於人基因治療，例如 WO 1993020221 中描述的方法，其內容透過引用整體併入本文。可用於改造 T 細胞的病毒方法的非限制性實例可包括 γ-逆轉錄病毒、腺病毒、慢病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒、痘病毒或腺病毒相關病毒方法。
一方面，本文所述的構建體和載體與 2018 年 11 月 26 日提交的美國專利 16/200,308中描述的方法一起使用，其內容透過引用整體併入本文。
盒
本發明可使用包含一個或多個 NOI 的盒，在兩個或多個 NOI 的情況下，可透過 IRES 進行可操作地連接。這些盒可用於在生產細胞中生產載體基因組的方法。
本發明還提出了包含此類盒的表達載體。用此類表達載體轉染合適的細胞應可形成表達由盒中 NOI 所編碼的每個 POI 的細胞。本發明還提出了此類轉染細胞。
盒克隆入表達載體並用所述載體轉染細胞（以表達盒）可以透過本領域眾所周知的技術進行（例如，Sambrook et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 一書以及其他實驗室教科書的描述內容）。
在某些方面，所述盒包含啟動子。
在某些方面，所述盒包含一個 NOI。如上面詳細描述的，NOI 可以為任何 NOI。例如，NOI 可以進行治療或診斷應用。合適的 NOI 包括但不限於：編碼酶、細胞因子、趨化因子、激素、抗體、抗氧化劑分子、工程化改造免疫球蛋白樣分子、單鏈抗體、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫調節分子、反義 RNA、小干擾 RNA (siRNA)、靶蛋白的反式顯性負性突變體、毒素、條件毒素、抗原、抗原受體、嵌合抗原受體、T 細胞受體、腫瘤抑制物蛋白、生長因子、膜蛋白、促血管和抗血管生成蛋白和肽、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶及其衍生物（例如，含有相關的報告基因組）的序列。
在某些方面，所述盒包含兩個或更多 NOI。包含兩個或更多 NOI 的盒可以為雙順反子或三順反子，並且可以包含以下元件：
啟動子-(NOI1 )-(IRES1 )-(NOI2 )
啟動子-(NOI1 )-(IRES1 )-(NOI2 )-(IRES2 )-(NOI3 )
在一些實施方案中，單個慢病毒盒可用於產生表達一種或多種蛋白質的單個慢病毒載體。特別地，單個慢病毒盒可用於產生單個慢病毒載體，其表達來自單個多順反子 mRNA 的兩個不同二聚體的至少四個個體單體蛋白，從而在細胞表面上共表達二聚體。例如，整合單拷貝慢病毒載體已被證明可足以轉化 γδ T 細胞，以共表達 TCRαβ 和 CD8αβ。
一方面，本公開涉及在單個載體內包含多順反子盒的載體，其能夠表達多於一個、多於兩個、多於三個、多於四個基因、多於五個基因或多於六個基因，其中這些基因編碼的多肽可以彼此相互作用，或可以形成二聚體。二聚體可以為同二聚體（即兩種相同的蛋白質形成二聚體），或異二聚體（即兩個結構上不同的蛋白質形成二聚體）。
一方面，慢病毒載體可包含編碼蛋白質 Z1 的第一核苷酸序列S1、編碼蛋白質 Z2 的第二核苷酸序列 S2、編碼蛋白質 Y1 的第三核苷酸序列 S3 和編碼蛋白質 Y2 的第四核苷酸序列 S4，其中 Z1 和 Z2 形成第一二聚體、Y1 和 Y2 形成第二二聚體，其中第一二聚體 Z1Z2 與第二二聚體 Y1Y2 不同。
一方面，第一個慢病毒載體可包含編碼二聚體 Z1Z2 的雙順反子盒（2 合 1），第二個慢病毒載體可包含編碼二聚體 Y1Y2 的雙順反子盒（2 合 1）。在2 合 1 載體中，S1 和 S2 可以按 S1-S2 或 S2-S1 的 5' 至 3' 方向串聯排列。同樣，在2 合 1 載體中，S3 和 S4 可以按 S3-S4 或 S4-S3 的 5' 至 3' 方向串聯排列。Z1 和 Z2 或 Y1 和 Y2 可以被一個或多個自裂解 2A 肽分開。
另一方面，單個慢病毒載體（4 合 1）可以編碼不同的二聚體 Z1Z2 和 Y1Y2，其中 Z1、Z2、Y1 和 Y2 可以被一個或多個自裂解 2A 肽分開。例如，S1、S2、S3 和 S4 可以以選自 S1-S2-S3-S4、S1-S2-S4-S3、S1-S3-S2-S4、S1-S3-S4-S2、S1-S4-S3-S2、S1-S4-S2-S3、S2-S1-S3-S4、S2-S1-S4-S3、S2-S3-S1-S4、S2-S3-S4-S1、S2-S4-S3-S1、S2-S4-S1-S3、S3-S1-S2-S4、S3-S1-S4-S2、S3-S2-S1-S4、S3-S2-S4-S1、S3-S4-S1-S2、S3-S4-S2-S1、S4-S1-S2-S3、S4-S1-S3-S2、S4-S2-S1-S3、S4-S2-S3-S1、S4-S3-S1-S2 或 S4-S3-S2-S1 的 5' 至 3' 方向串聯排列。
一方面，二聚體 Z1Z2 和/或二聚體 Y1Y2 可以為具有 TCRα 鏈和 TCRβ 鏈的TCR或具有 TCRγ 鏈和 TCRδ 鏈的 TCR。
一方面，能夠與本文所述的構建體、方法和實施方案一起使用的 TCR 和抗原結合蛋白包括，例如，表 3 中列出的那些 (SEQ ID NO: 13-92) 以及美國專利公開號 20170267738、美國專利公開號 20170312350、美國專利公開號 20180051080、美國專利公開號 20180164315、美國專利公開號 20180161396、美國專利公開號 20180162922、美國專利公開號 20180273602、美國專利公開號 20190016801、美國專利公開號 20190002556 和 美國專利公開號 20190135914 中描述的那些TCR 和抗原結合蛋白，這些這些專利公開內容及其中描述的序列表透過引用整體併入本文。
一方面，能夠與本文所述構建體、方法和實施方案一起使用的 TCR 和抗原結合蛋白包括，例如，與「靶抗原 (TA) 肽」結合的 TCR 和抗原結合蛋白。
在本發明背景下使用的「靶抗原 (TA) 肽」系指從感染或腫瘤物質中分離和鑒定的肽，例如，從結核病患者或從愛潑斯坦-巴爾病毒感染者或癌症患者中分離的物質。TA 肽的來源蛋白在感染細胞或腫瘤細胞中接受抗原加工，接著透過 MHC 分子在細胞表面提呈，該細胞（特別是 TA肽/MHC 複合體）因此可被宿主的免疫效應細胞（例如 T 細胞或 NKT 細胞）識別。本發明背景下的 TA 肽包含 10、12 或 14（諸如 8 至 14、8 至 12，例如，9 至 11）個氨基酸或由其組成。在本發明背景下，當提及特異性 TA 肽時，其稱為 TA-C。TA 抗原肽（例如，TA-C 肽）的實例為病毒抗原肽、細菌抗原肽或腫瘤相關抗原 (TAA) 抗原肽，優選為 TAA 抗原肽。因此，在一實施方案中，TA 抗原肽，特別是 TA-C，為病毒肽、細菌肽或腫瘤相關抗原 (TAA) 抗原肽，優選為 TAA 抗原肽。
本發明背景下的「病毒抗原肽」為 MHC 分子提呈於患病細胞表面上且為病毒來源的抗原肽，即，該細胞通常被所述病毒感染。此類病毒抗原肽已經在人類免疫缺陷病毒 (HIV)、人巨細胞病毒 (HCMV)、巨細胞病毒 (CMV)、人乳頭瘤病毒 (HPV)、乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV)、人乳頭瘤病毒感染 (HPV)、愛潑斯坦-巴爾病毒 (EBV)、流感病毒的感染背景下發現。因此，本發明背景下的病毒抗原肽可為選自由 HIV 抗原肽、HCMV 抗原肽、CMV 抗原肽、HPV 抗原肽、HBV 抗原肽、HCV 抗原肽、EBV 抗原肽、流感抗原肽（優選為 HIV、HBV、流感和 HCMV 抗原肽）組成的組中的抗原肽。
能夠與本文所述方法和實施方案一起使用的病毒抗原肽包括下表中所述的那些病毒抗原肽。一方面，能夠與本文描述方法和實施方案一起使用的病毒抗原肽包括至少一種病毒抗原肽，其包含選自 SEQ ID NO: 96 至 SEQ ID NO: 98 的氨基酸序列中的氨基酸序列或由其組成，如下表 1 所示。 表 1：病毒抗原肽列表
SEQ ID NO： 肽 病毒 MHC
96 SLYNTVATL HIV HLA-A*02:01
97 GILGFVFTL 甲型流感 HLA-A*02:01
98 NLVPMVATV HCMV HLA-A*02:01
本發明背景下的「細菌抗原肽」為 MHC 分子提呈於患病細胞表面上且為細菌來源的抗原肽，即，該細胞通常被所述細菌感染。此類細菌抗原肽已經在例如結核分枝桿菌感染背景下發現。因此，本發明背景下的細菌抗原肽可為結核分枝桿菌抗原肽。
「腫瘤相關抗原 (TAA) 肽」在本文中也稱為「TAA 肽」，是指從腫瘤材料中分離和鑒定的肽，並且在腫瘤細胞中進行抗原加工，從而可被宿主的免疫效應細胞識別。TAA 肽包含 10、12 或 14（諸如 8 至 14、8 至 12，例如，9 至 11）個氨基酸或由其組成。本發明背景下的 TAA 肽可為例如癌症/睾丸 (CT) 抗原肽。癌症/睾丸 (CT) 抗原肽的實例為氨基酸序列 SEQ ID NO: 216 的 MAGE-A 抗原肽和氨基酸序列 SEQ ID NO: 148 的 PRAME 抗原肽。本發明背景下的 TAA 肽包含 T 細胞表位，在一般情況下也可以稱為 TAA 肽，在本發明提及一種特異性 TAA 肽的背景下也可稱為 TAA 肽 C。
一方面，能夠與本文所述的方法和實施方案一起使用的腫瘤相關抗原 (TAA) 肽包括，例如，美國專利公開號 20160187351、美國專利公開號 20170165335、美國專利公開號 20170035807、美國專利公開號 20160280759、美國專利公開號 20160287687、美國專利公開號 20160346371、美國專利公開號 20160368965、美國專利公開號 20170022251、美國專利公開號 20170002055、美國專利公開號 20170029486、美國專利公開號 20170037089、美國專利公開號 20170136108、美國專利公開號 20170101473、美國專利公開號 20170096461、美國專利公開號 20170165337、美國專利公開號 20170189505、美國專利公開號 20170173132、美國專利公開號 20170296640、美國專利公開號 20170253633、美國專利公開號 20170260249、美國專利公開號 20180051080 和美國專利公開號 20180164315 所述的 TAA 肽，本文所述的這些專利公開內容和序列表透過引用整體併入本文。
一方面，本文所述的雙特異性抗原結合蛋白，特別是本發明背景下的抗原結合位點 B，可選擇性地識別提呈上述一種或多種專利和出版物中所述的 TAA 肽的細胞。另一方面，能夠與本文描述的方法和實施方案一起使用的 TAA 包括至少一個 TAA，其由選自 SEQ ID NO: 99 至 256，優選為 SEQ ID NO: 148 和 216 的氨基酸序列中的氨基酸序列組成。一方面，雙特異性抗原結合蛋白，特別是雙特異性抗原結合蛋白的抗原結合位點 B，可選擇性地識別提呈 TAA 肽/MHC 複合體的細胞，其中 TAA 肽包含 SEQ ID NO: 99 至 256 的氨基酸序列或本文所述專利或申請中描述的任何氨基酸序列（優選為 SEQ ID NO: 148 和 216）或由其組成。
此外，在本發明背景下的 TA 抗原肽為 MHC-I 類分子或 MHC-II 類分子（優選為 MHC-I 類分子）的特異性配體。
在本發明背景下，TAA 抗原肽 C 優選為選自由 SEQ ID NO: 99 至 256 的氨基酸序列組成的 TAA 抗原肽組，優選為包含 SEQ ID NO: 148 的氨基酸序列「SLLQHLIGL」或由其組成的 PRAME 抗原肽，或包含 SEQ ID NO: 216 的氨基酸序列「KVLEHVVRV」或由其組成的 MAGE-A 抗原肽，更優選為 SEQ ID NO: 216，其中 MHC 優選為 HLA-A*02。
另一方面，二聚體 Z1Z2 和/或二聚體 Y1Y2 可以為選自 R11KEA（SEQ ID NO: 13 和 14）、R20P1H7（SEQ ID NO: 15 和 16）、R7P1D5（SEQ ID NO: 17 和 18）、R10P2G12（SEQ ID NO: 19 和 20）、R10P1A7（SEQ ID NO: 21 和 22）、R4P1D10（SEQ ID NO: 23 和 24）、R4P3F9（SEQ ID NO: 25 和 26）、R4P3F9-B4（SEQ ID NO: 25 和 92）、R4P3F9-A1B4（SEQ ID NO: 91 和 92）、R4P3H3（SEQ ID NO: 27 和 28）、R36P3F9（SEQ ID NO: 29 和 30）、R52P2G11（SEQ ID NO: 31 和 32）、R53P2A9（SEQ ID NO: 33 和 34）、R26P1A9（SEQ ID NO: 35 和 36）、R26P2A6（SEQ ID NO: 37 和 38）、R26P3H1（SEQ ID NO: 39 和 40）、R35P3A4（SEQ ID NO: 41 和 42）、R37P1C9（SEQ ID NO: 43 和 44）、R37P1H1（SEQ ID NO: 45 和 46）、R42P3A9（SEQ ID NO: 47 和 48）、R43P3F2（SEQ ID NO: 49 和 50）、R43P3G5（SEQ ID NO: 51 和 52）、R59P2E7（SEQ ID NO: 53 和 54）、R11P3D3（SEQ ID NO: 55 和 56）、R16P1C10（SEQ ID NO: 57 和 58）、R16P1E8（SEQ ID NO: 59 和 60）、R17P1A9（SEQ ID NO: 61 和 62）、R17P1D7（SEQ ID NO: 63 和 64）、R17P1G3（SEQ ID NO: 65 和 66）、R17P2B6（SEQ ID NO: 67 和 68）、R11P3D3KE（SEQ ID NO: 69 和 70）、R39P1C12（SEQ ID NO: 71 和 72）、R39P1F5（SEQ ID NO: 73 和 74）、R40P1C2（SEQ ID NO: 75 和 76）、R41P3E6（SEQ ID NO: 77 和 78）、R43P3G4（SEQ ID NO: 79 和 80）、R44P3B3（SEQ ID NO: 81 和 82）、R44P3E7（SEQ ID NO: 83 和 84）、R49P2B7（SEQ ID NO: 85 和 86）、R55P1G7（SEQ ID NO: 87 和 88）或 R59P2A7（SEQ ID NO: 89 和 90）的 TCRα 鏈和 TCRβ 鏈。
表 2 顯示了肽與 MHC 分子複合時，與哪些 TCR 結合的肽的實例。 表 2
TCR 名稱 肽 (SEQ ID NO:)
R20P1H7, R7P1D5, R10P2G12 KVLEHVVRV (SEQ ID NO: 216)
R10P1A7 KIQEILTQV (SEQ ID NO: 124)
R4P1D10, R4P3F9, R4P3H3 FLLDGSANV (SEQ ID NO: 239)
R36P3F9, R52P2G11, R53P2A9 ILQDGQFLV (SEQ ID NO: 194)
R26P1A9, R26P2A6, R26P3H1, R35P3A4, R37P1C9, R37P1H1, R42P3A9, R43P3F2, R43P3G5, R59P2E7 KVLEYVIKV (SEQ ID NO: 203)
R11KEA, R11P3D3, R16P1C10, R16P1E8, R17P1A9, R17P1D7, R17P1G3, R17P2B6, R11P3D3KE SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 148)
R39P1C12, R39P1F5, R40P1C2, R41P3E6, R43P3G4, R44P3B3, R44P3E7, R49P2B7, R55P1G7, R59P2A7 ALSVLRLAL (SEQ ID NO: 249)
一方面，能夠與本文所述的方法和實施方案一起使用的腫瘤相關抗原 (TAA) 肽包括，例如，表 4 中所列的那些以及美國專利公開號 20160187351、美國專利公開號 20170165335、美國專利公開號 20170035807、美國專利公開號 20160280759、美國專利公開號 20160287687、美國專利公開號 20160346371、美國專利公開號 20160368965、美國專利公開號 20170022251、美國專利公開號 20170002055、美國專利公開號 20170029486、美國專利公開號 20170037089、美國專利公開號 20170136108、美國專利公開號 20170101473、美國專利公開號 20170096461、美國專利公開號 20170165337、美國專利公開號 20170189505、美國專利公開號 20170173132、美國專利公開號 20170296640、美國專利公開號 20170253633、美國專利公開號 20170260249、美國專利公開號 20180051080 和美國專利公開號 20180164315 所述的那些 TAA 肽，每個這些專利公開內容和序列表透過引用整體併入本文。
另一方面，二聚體 Z1Z2 和/或二聚體 Y1Y2 可以為 T 細胞二聚體信號傳導模組，例如 CD3δ/ε、CD3γ/ε 和 CD247ζ/ζ 或 ζ/η、TCRα 可變區 (Vα) 和 TCRβ 可變區 (Vβ) 的二聚體、免疫球蛋白重鏈可變區 (VH) 和免疫球蛋白輕鏈可變區 (VL) 的二聚體、Vα 和 VH 的二聚體、Vα 和 VL 的二聚體、Vβ 和 VH 的二聚體或 Vβ 和 VL 的二聚體。
另一方面，二聚體 Z1Z2 和/或二聚體 Y1Y2 可以為 TCR 共受體，例如 CD8α鏈和 CD8β 鏈、CD4α 鏈和 CD4β 鏈，或任何其他合適的二聚膜受體，優選為 CD8+ T 細胞和/或 CD4+ T 細胞中表達的那些。
在一些方面，二聚體 Z1Z2 為 TCR，二聚體 Y1Y2 為 TCR 共受體。
弗林蛋白酶為普遍存在的枯草桿菌蛋白酶樣前蛋白轉化酶，其天然底物包括某些血清蛋白和生長因子受體，例如胰島素樣生長因子受體。弗林蛋白酶裂解的共有序列為 RXXR (SEQ ID NO: 93)，但是實際裂解的潛力取決於底物三級結構和識別位元點緊鄰的氨基酸。添加弗林蛋白酶裂解位點加上連接子序列（例如 GSG 或 SGSG (SEQ ID NO: 5)）可以實現高效的基因表達。
一方面，串聯排列的弗林蛋白酶-連接子-2A 肽的核苷酸序列可以位於 Z1 和 Z2之間、Z1 和 Y1 之間、Z1 和 Y2 之間、Z2 和 Y1 之間、Z2 和 Y2 之間和/或 Y1 和 Y2 之間。弗林蛋白酶可以具有 RXXR (SEQ ID NO: 93) 的共有序列，例如 RAKR (SEQ ID NO: 10)。連接子序列可以為 3 至 10 個氨基酸長，例如 3 至 8 個氨基酸長、3 至 5 個氨基酸長或 3 至 4 個氨基酸長。在一些方面，連接子序列可以為 SGS、GGGS (SEQ ID NO: 257)、GGGGS (SEQ ID NO: 258)、GGSGG (SEQ ID NO: 259)、TVAAP (SEQ ID NO: 260)、TVLRT (SEQ ID NO: 261)、TVSSAS (SEQ ID NO: 262)。在一些方面，連接子序列可以為 GSG 或 SGSG (SEQ ID NO: 5)。2A 肽可以選自 P2A (SEQ ID NO: 3)、T2A (SEQ ID NO: 4)、E2A (SEQ ID NO: 5)、F2A (SEQ ID NO: 6) 或其任何組合。
另一方面，串聯排列的連接子-2A 肽的核苷酸序列可以位於 Z1 和 Z2之間、Z1 和 Y1 之間、Z1 和 Y2 之間、Z2 和 Y1 之間、Z2 和 Y2 之間和/或 Y1 和 Y2 之間。連接子序列可以為 GSG 或 SGSG (SEQ ID NO: 5)。2A 肽可以選自 P2A (SEQ ID NO: 6)、T2A (SEQ ID NO: 7)、E2A (SEQ ID NO: 8)、F2A (SEQ ID NO: 9) 或其任何組合。
治療性組合物
本發明還提出了一種治療性組合物，其包含本文所述的轉導細胞群，如轉導的 T 細胞。
本公開的組合物還可包含一種或多種佐劑。佐劑是那些非特異性地增強或加強免疫反應的物質（例如，透過 CD8-陽性 T 細胞和輔助 T (TH) 細胞介導的對一種抗原的免疫應答，因此被視為對本發明的藥劑有用。         適合的佐劑包括（但不僅限於）1018ISS、鋁鹽、AMPLIVAX®、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、鞭毛蛋白或鞭毛蛋白衍生的 TLR5 配體、FLT3 配體、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特 (ALDARA®)、resiquimod、ImuFact IMP321、白細胞介素 IL-2、IL-13、IL-21、干擾素 α 或 β，或其聚乙二醇衍生物、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、ISCOMs、JuvImmune®、LipoVac、MALP2、MF59、單磷醯脂A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、水包油和油包水乳狀液、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、OspA、PepTel® 載體系統、基於聚丙交酯複合乙交酯 [PLG] 和右旋糖苷微粒、重組人乳鐵傳遞蛋白 SRL172、病毒體和其他病毒樣顆粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、源自皂角苷、分支桿菌提取物和細菌細胞壁合成模擬物的 Aquila 公司的 QS21 刺激子，以及其他專有佐劑，如：Ribi's Detox、Quil 或 Superfos。優選佐劑如：弗氏佐劑或 GM-CSF。前人對一些樹突狀細胞特異性免疫佐劑（如 MF59）及其製備進行了描述 (Allison and Krummel, 1995)。也可使用細胞因子。一些細胞因子直接影響樹突狀細胞向淋巴組織遷移（如，TNF-），加速樹突狀細胞成熟為 T 淋巴細胞的有效抗原提呈細胞（如， GM-CSF、IL-1 和 IL-4）（美國 5849589號專利，特別以其完整引用形式併入本文），並充當免疫佐劑（如 IL-12、IL-15、IL-23、IL-7、IFN-α、IFN-β）(Gabrilovich et al., 1996)。
據報告，CpG 免疫刺激寡核苷酸可提高佐劑在疫苗中的作用。如果沒有理論的約束，CpG 寡核苷酸可透過 Toll 樣受體 (TLR)（主要為 TLR9）啟動先天（非適應性）免疫系統從而起作用。CpG 引發的 TLR9 活化作用提高了對各種抗原的抗原特異性體液和細胞反應，這些抗原包括肽或蛋白抗原、活病毒或被殺死的病毒、樹突狀細胞疫苗、自體細胞疫苗以及預防性和治療性疫苗中的多糖結合物。更重要的是，它會增強樹突狀細胞的成熟和分化，甚至在 CD4 T 細胞幫助不存在下導致 TH1 細胞的活化增強以及細胞毒性 T 淋巴細胞 (CTL) 生成加強。由 TLR9 刺激所誘發的 TH1 偏移甚至在有疫苗佐劑的存在下也能維持，這些佐劑如：正常促進 TH2 偏移的明礬或弗氏不完全佐劑 (IFA)。CpG 寡核苷酸與其他佐劑一起製備或聯合給藥，或在如微粒、納米粒子、脂肪乳或類似製劑的配方中時表現出甚至更強的佐劑活性，當抗原相對較弱時，這些對誘發強反應尤為必要。它們還能加速免疫反應，使抗原劑量減少約兩個數量級，產生與一些實驗中不含CpG 的全劑量疫苗可相比的抗體反應 (Krieg, 2006)。美國 6406705 B1 號專利對組合使用 CpG 寡核苷酸、非核酸佐劑和抗原以誘導抗原特異性免疫反應進行了描述。一種 CpG TLR9 拮抗劑為 Mologen 公司（德國柏林）的 dSLIM（雙幹環免疫調節劑），這是本發明藥物組合物的優選成分。也可使用其他如 TLR 結合分子，如：RNA 結合 TLR7、TLR8 和/或 TLR9。
其他有用的佐劑例子包括（但不限於）化學修飾性 CpG（如 CpR、Idera）、dsRNA 模擬物，如，Poly(I:C) 及其衍生物（如：AmpliGen®、Hiltonol®,、多聚-(ICLC)、多聚 (IC-R)、多聚 (I:C12U)）、非 CpG 細菌性 DNA 或 RNA 以及免疫活性小分子和抗體，如：環磷醯胺、舒尼替單抗、免疫檢查點抑制劑（包括ipilimumab、nivolumab、pembrolizumab、atezolizumab、avelumab、durvalumab 和 cemiplimab）、貝伐單抗®、西樂葆、NCX-4016、西地那非、他達拉非、伐地那非、索拉非尼、替莫唑胺、替西羅莫司、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、VEGF Trap、ZD2171、AZD2171、抗-CTLA4、免疫系統的其他抗體靶向性主要結構（如：抗-CD40、抗-TGF β、抗-TNF α 受體）和 SC58175，這些藥物都可能有治療作用和/或充當佐劑。技術人員無需過度實驗就很容易確定本發明中有用的佐劑和添加劑的數量和濃度。
優選的佐劑為抗-CD40、咪喹莫特、雷西喹莫特、GM-CSF、環磷醯胺、舒尼替尼、貝伐單抗、阿特珠單抗、干擾素-α、干擾素-β、CpG 寡核苷酸和衍生物、聚 (I:C) 和衍生物、RNA、西地那非、含聚（丙交酯-共-乙交酯）(PLG) 的顆粒製劑、病毒體和/或白介素 (IL)-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL -12、IL-13、IL-15、IL-21 和 IL-23。
本發明藥物組合物的一個優選實施方案中，佐劑從由集落刺激因子組成組中選擇，如粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF，沙格司亭）、環磷醯胺、咪喹莫特、resiquimod 和干擾素-α。
本發明藥物組合物的一個優選實施方案中，佐劑從由集落刺激因子組成組中選擇，如粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF，沙格司亭）、環磷醯胺、咪喹莫特和 resimiquimod。在本發明藥物組合物的一個優選實施方案中，佐劑為環磷醯胺、咪喹莫特或 resiquimod。更優選的佐劑是 Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、聚-ICLC (Hiltonol®) 和抗 CD40 mAB 或其組合物。
多肽的製造方法
本發明還涉及產生表達蛋白（例如，治療性蛋白質）的重組宿主細胞的方法，所述方法包括由以下組成的步驟：(i) 在體外或離體將本發明的載體引入勝任宿主細胞，(ii) 體外或離體培養獲得的重組宿主細胞，和 (iii)，任選地，選擇表達和/或分泌所述蛋白質的細胞。
本發明還提出了使用載體（例如本文公開的慢病毒轉導載體）來生產多肽的方法和此類方法的產物。所述方法可包含以下步驟中的一個或多個，例如，用慢病毒轉導載體轉導宿主細胞以形成轉導的宿主細胞，其中所述載體包含編碼目的異源多肽的可表達異源多核苷酸；在有效產生所述目的多肽的條件下培養所述轉導的宿主細胞；當多肽分泌入培養基中時，從所述宿主（例如從培養基）中分離多肽。編碼多肽的異源多核苷酸序列可以包含轉錄、翻譯和/或分泌入培養基中所需的任何其他序列（例如，分泌序列）。根據本發明可以轉導任何細胞系，包括例如 CHO（如 CHO DG44）和 HEK 293（如 HEK293F）。
轉導載體可以常規製備，包括根據本文所述的方法。例如，可以在有效產生功能性轉導載體的條件下，用輔助質粒（含有合適的包膜和 gag/pol 前體）和含有異源 NOI 的轉移載體來轉化生產細胞系。可以選擇具有轉導將製備多肽之靶宿主細胞能力的包膜蛋白。
宿主細胞的實例包括例如哺乳動物細胞系（例如，Vero 細胞、CHO 細胞、3T3 細胞、COS 細胞等）以及原代或建立的細胞培養物（例如，由淋巴母細胞、成纖維細胞、胚胎細胞、上皮細胞、神經細胞、脂肪細胞等形成的）。實例還包括：小鼠 SP2/0-Ag14 細胞 (ATCC CRL1581)、小鼠 P3X63-Ag8.653 細胞 (ATCC CRL1580)、CHO 細胞（其中二氫葉酸還原酶基因（下稱「DHFR基因」）有缺陷，Urlaub G et al; 1980），大鼠 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 細胞（ATCC CRL1662，下稱「YB2/0 細胞」）等。對於一些治療性抗體，可優選 YB2/0 細胞，這是因為當嵌合或人源化抗體在該細胞中表達時，其 ADCC 活性增強。
一方面，宿主細胞可包括 T 細胞，例如，CD4+ T 細胞、CD8+ T 細胞、γδ T 細胞和/或天然殺傷 T 細胞。
另一方面，宿主細胞可包括自然殺傷 (NK) 細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和/或癌細胞。
另一方面，宿主細胞可以不包括 NK 細胞。
另一方面，宿主細胞可以不包括癌細胞。
特別地，對於表達治療性蛋白質，例如二聚體治療性蛋白質，所述表達載體可以為其中編碼一個多肽（鏈）的基因和編碼另一多肽（鏈）的基因存在於分開的載體上的類型或其中兩個基因都存在於同一載體上的類型（串聯型）中的任一種。從構建抗體或 TCR 表達載體的容易程度、引入動物細胞的容易程度以及動物細胞中抗體 H 和 L 鏈或 α 和 β 鏈表達水準之間的平衡方面考慮，優選串聯型表達載體 (Shitara K et al.J Immunol Methods.1994 Jan. 3; 167(1-2):271-8)。
為了製備流感疫苗，優選以下細胞系和相應的包膜蛋白，例如，HEK293 或 CHO；VSV-G、ampho、Mokola 和 Paramyxoviridae（例如，請參閱 ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/fs_param.htm）。
可以表達任何合適或所需的異源序列，包括例如疫苗、干擾素（α、β、γ、ε）、促紅細胞生成素、因子 VIII、凝血因子、抗體及其片段（例如，包括單鏈、Fab 和人源化）、胰島素、趨化因子、細胞因子、生長因子、血管生成調節因子、細胞凋亡調節因子等。可以常規製備單鏈抗體（例如，單鏈可變片段或「scFv」）。
在本發明的某些實施方案中，慢病毒轉導載體可以用於製備用作疫苗的抗原製劑。根據本發明可以製備任何合適的抗原，包括從傳染性蛋白顆粒、病毒、分枝桿菌、原生動物（例如惡性瘧原蟲（瘧疾））、錐蟲、細菌（例如鏈球菌、奈瑟氏球菌等）中獲得的抗原，等等。
可以用包含一個或多個異源 NOI 的單個慢病毒載體或用多個慢病毒載體轉導宿主細胞，其中每個載體包含相同或不同的異源 NOI。例如，可以透過在分開的載體上表達各個亞基，但用所有載體感染同一宿主細胞，從而在宿主細胞內發生組裝來製備多亞基抗原（包括細胞內和細胞表面的多亞基組分）。
疫苗通常包含多種抗原組分，例如，衍生自不同蛋白質和/或相同蛋白質的不同表位元區域。例如，針對病毒性疾病的疫苗可包含一個或多個從病毒獲得的多肽序列，其中當將其施用於宿主時，可引發針對病毒激發的免疫原性或保護性應答。
如上所述，本發明還可以用於製備多肽多聚體，例如其中產生的抗原製劑由一種以上的多肽組成。例如，病毒衣殼可以由一個以上的多肽亞基組成。透過用攜帶不同病毒包膜序列的載體轉導宿主細胞，當蛋白質在細胞中表達時，可以自組裝為三維結構，其包含一個以上的蛋白質亞基（例如，以其天然構型存在）。所述結構可以具有功能活性，包括抗原活性、酶活性、細胞結合活性等。此外，當在合適的細胞系中表達時，它們可以分泌至細胞培養基中，從而促進純化。例如，當使用慢病毒轉導載體將流感 N 和 H 衣殼蛋白以及任選 M 蛋白（見下文）引入生產細胞系時，可在細胞中形成空衣殼或病毒樣顆粒 (VLP)，然後分泌到培養基中。此類 VLP 可以常規分離和純化，然後作為流感疫苗施用。例如，VLP 為不包含大量（例如，空的）病毒 RNA 的自組裝衣殼。VLP 優選能夠引發免疫應答，可有效地提供至少某種程度的保護以抵抗天然感染性病毒顆粒的激發，或者至少引發對抗其之抗體。
當前，有許多可用的病毒疫苗，包括針對諸如麻疹、腮腺炎、肝炎（A 和 B 型）、風疹、流感、脊髓灰質炎、天花、水痘、腺病毒、日本腦炎、狂犬病、埃博拉病毒等疾病的疫苗。本發明可用於製備針對任何上述疾病的疫苗。
根據本發明可產生疫苗的病毒實例包括例如正粘病毒、流感病毒 A（包括其 HA 和 NA 蛋白變化的所有毒株，例如（非限制性實例），H1N1、H1N2、H2N2、H3N2、H7N7 和 H3N8）；乙型流感、丙型流感、托高土病毒（包括 Dhori、Batken 病毒、SiAR 126 病毒）和 isa 病毒（例如、傳染性鮭魚貧血病毒）。這些包括從所有物種類型中分離或傳播的流感，包括從無脊椎動物、脊椎動物、哺乳動物、人類、非人類靈長類動物、猴子、豬、牛和其他牲畜、鳥類、家禽（如火雞、雞、鵪鶉和鴨子）、野鳥（包括水生和陸生鳥類）、爬行動物等之分離物。這些還包括例如透過突變、抗原漂移、抗原轉移、重組等而發生變化的現有毒株，尤其是毒力和/或物種種間傳播（例如、人與人之間傳播）增加的毒株。
特別關注的是大流行和/或交叉物種的流感病毒，這是因為它們具有廣泛的宿主範圍，或由於在感染宿主中重組，和/或由於自然發生或定向突變。例如，H5N1（指病毒上存在的表面抗原亞型，血凝素 5 型和神經氨酸酶 1 型）為 A 型禽流感的亞型，其引起了亞洲家禽流感的爆發。截至 2005 年 11 月，超過 1.2 億隻禽類因感染而死亡或被殺死，以防止感染進一步擴散。此病毒還傳播到人類宿主（「禽流感」），與高致死率有關。
流感抗原製劑（例如疫苗）可包含在流感病毒粒子中天然存在的一種或多種多肽。但是，它優選不包含會產生天然病原性病毒的所有多肽基因。這些包括，例如，血凝素（由 HA 基因編碼）、神經氨酸酶（由 NA 基因編碼）、核蛋白（由 NA 基因編碼）、基質 (M1) 蛋白（由 M 基因編碼）、M2（由 M 基因編碼）、非結構性蛋白（由 NS 基因編碼）和聚合酶。天然存在的病毒粒子被包裹在脂質雙層中，所述脂質雙層用完整蛋白 H 和 N「點綴」（「衣殼層」）。基質蛋白 (M1) 在病毒膜下方形成蛋白層（「基質層」），並參與病毒的組裝、穩定性和完整性。例如，參見 Harris et al., Virol.289:34-44, 2001。M2 蛋白為膜蛋白離子通道。本發明的 VLP 可以包含 H、N 以及任選 M1 和 M2 蛋白。所述蛋白質的序列為本領域已知和/或可在 GenBank 中確定。例如，參見 Widjaja et al. J. Virol., 78:8771-8779, 2004，瞭解 M1 和 M2 序列。
這些可以單獨地或在同一質粒上克隆至轉移載體中，並用於產生轉導載體。在本發明的一實施方案中，可以製備多個轉導載體，其中每個包含獨特的流感基因序列（例如，編碼 H、N 和 M1 以產生三種不同的轉導載體）。當此類載體在同一宿主細胞（例如 CHO 或 HEK293）中共表達時，會產生自組裝 VLP，其可以分泌到培養基中，透過離心收集，然後作為疫苗施用。
本發明的轉導載體可導致高水準的異源蛋白生產，例如當此類蛋白質被分泌到培養基中時，每 ml 未加工培養基約 0.1 至 0.3 mg/ml 至約 5-10 mg/ml 或更多的重組異源蛋白。
本申請還提出了產生抗體的方法。例如，提出了無需雜交瘤或動物模型即可產生單克隆抗體（例如人、小鼠和其他哺乳動物類型）的方法。在一非限制性實例中，表達致癌蛋白的慢病毒載體在來自先前用抗原刺激的小鼠的外周血 B 細胞中被轉導。這些載體有效地轉導小鼠細胞，使其成為抗體產生細胞。在第二個非限制性實例中，工程改造了兩個慢病毒載體，一個表達重抗體鏈，第二個載體表達輕抗體鏈。基因的恒定區衍生自人（或其他物種，如需要）免疫球蛋白基因（例如，IgG、IgM 或其他類型的 Ig）。基因的可變區被修飾或簡併以產生多樣性。簡併序列可以透過本領域已知的任何合適技術獲得，並克隆到慢病毒載體中，以創建表達重或輕免疫球蛋白分子的慢病毒載體文庫。可以透過用兩種載體轉導細胞以產生同時包含重鏈和輕鏈的功能性抗體來產生抗體。可以選擇並篩選轉導和表達細胞與抗原的結合，然後可分離陽性克隆並進行多輪親和力成熟處理。
此方法的優點是以無偏移方法產生抗體。其他方法，例如傳統的雜交瘤和 Xenomouse 技術，依賴於已對特定抗體克隆進行了克隆選擇和刪除的 B 細胞，因為它們對內源性（例如，小鼠組織）具有反應性。這些刪除克隆中的一些抗體可能有價值，因為它們可與人抗原發生交叉反應。所述方法的優點是：沒有分子抗體克隆刪除，並且它們都以無偏倚的方法進行了分析，並且為完全人源化（如果需要人源化）抗體分子。慢病毒載體的另一優點是：可以將基因以高複數轉導至細胞中，從而在一個細胞中產生多種抗體類型。這減少了創建包含非常多樣抗原結合位點的文庫所需的細胞數量。第二個優點是：將重基因和輕基因置於不同的慢病毒載體，以便透過高於 1 的感染複數轉導細胞可以產生額外的多樣性。例如，如果每個表達重鏈和輕鏈的慢病毒載體以 MOI 10 用於轉導細胞，那麼每個細胞中產生的抗體組合數量為 100。因此，在 96 孔板中，單個孔中大約有 10,000 個細胞，用這種方法可以產生的可能變體數量在 96 孔板的單孔中為 1,000,000。因此，利用這種方法可以大規模產生大量抗體變體。所述方法不限於針對每個細胞的每個構建體使用 10 的MOI，也可以根據需要使用更高的 MOI。例如，如果使用 100 的MOI，則每個細胞可產生 10,000 個變體抗體，而 96 孔板的每個孔可產生 10,000,000,000 個變體。因此，每個 96 孔板可產生 1x1012 個變體抗體分子，其可用於針對靶抗原進行篩選，對此，本領域有已知許多方法（例如，ELISA）。一旦鑒定出可產生所需抗體反應的特定孔，則可透過有限稀釋法克隆細胞，以找到表達正確抗體的細胞克隆。一旦鑒定出此克隆，則可以使用 PCR 克隆出表達抗體重鏈和輕鏈的載體。然後，可以將載體 DNA 用輔助構建體轉染以產生載體。或者，可以用輔助構建體直接轉染細胞的此克隆（PEI、磷酸鈣、脂質轉染或本領域已知的其他轉染方法），以產生變體慢病毒載體。然後，可以滴定產生的載體，之後以較低的 MOI、但更多數量的細胞轉導到細胞上，以分離出產生目的抗體的克隆。分離出細胞克隆後，則可以透過以更高感染複數轉導細胞來產生更高滴度的抗體，同樣的方法不僅限於完整抗體分子，還可以應用於單鏈抗體、抗體片段、噬菌體展示和其他抗體樣分子，這些都是本領域已知的。除了表達抗體之外，載體還可以表達其他基因以增加單克隆抗體的生產或增加其產量。此類基因可以為癌基因，例如 ras 和 myc，但是也可以使用其他基因，例如抗凋亡基因，例如 Bcl-2。此外，此類載體可用於從已暴露於抗原的動物血液中的 B 細胞產生單克隆抗體。例如，可以透過使用癌基因或基因沉寂 RNA 的組合，將暴露於抗原的小鼠的 B 細胞轉化為骨髓瘤細胞。此類基因包括例如：生長因子，包括例如雙調蛋白、B 淋巴細胞刺激物、白介素 16 (IL16)、胸腺生成素、TRAIL、Apo-2、前 B 細胞集落增強因子、內皮細胞分化相關因子 1 (EDF1)、內皮單核細胞活化多肽 II、巨噬細胞遷移抑制因子 MIF、自然殺傷細胞增強因子 (NKEFA)、骨形態發生蛋白 8（成骨蛋白 2）、骨形態發生蛋白 6、結締組織生長因子 (CTGF)、CGI-149 蛋白（神經內分泌分化因子）、細胞因子 A3（巨噬細胞炎性蛋白 1-α)、成膠質細胞瘤細胞分化相關蛋白 (GBDR1)、肝腫瘤源性生長因子、神經介素 U-25前體、任何腫瘤基因、癌基因、原癌基因或細胞調節基因（參見 condor.bcm.tmc.edu/oncogene）、血管內皮生長因子 (VEGF)、血管內皮生長因子 B (VEGF-B)、T 細胞特異性 RANTES 前體、胸腺樹突狀細胞衍生因子 1；受體，例如啟動素 A 受體 II型 (ACVR2)、β 信號序列受體 (SSR2)、CD14 單核細胞 LPS 受體、CD36（膠原蛋白 1 型/血小板反應蛋白受體）樣 2、CD44R（Hermes 抗原 gp90 歸巢受體）、G 蛋白偶聯受體 9、趨化因子 C x C 受體 4、集落刺激因子 2 受體 β (CSF2RB)、FLT-3 受體酪氨酸激酶、類似於暫態受體電位 C 前體、殺傷細胞凝集素樣受體亞家族 B、低密度脂蛋白受體基因、低親和力 Fc-γ 受體IIC、MCP-1 受體、單核細胞趨化蛋白 1 受體 (CCR2)、核受體亞家族 4 組 A 成員 1、孤兒 G 蛋白偶聯受體 GPRC5D、過氧化物酶體增殖啟動受體 γ、Pheromore相關受體（大鼠）、血管加壓素啟動鈣移動推定受體、視黃酸 x 受體、Toll 樣受體 6、跨膜啟動劑和 CAML 相互作用劑 (TACI)、B 細胞成熟肽 (BCMA)、CSF-1 受體、干擾素（α、β 和 γ）受體 1 (IFNAR1)。
治療方法
本文提供的載體可用於多種治療方法。
在一些方面，提出了用於治療用途的慢病毒載體，其表達天然或融合多肽，其包含人趨化因子和病毒或細菌抗原（例如 HIV、白喉毒素抗原）、趨化因子（例如 IP-10、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MIP 1、RANTES、SDF-1、MIG 和/或 MDC）或促凋亡蛋白（這是一種自殺基因蛋白或可促進炎症反應的蛋白）中的任何單個或組合。
此外，本發明提出了受試者中產生免疫應答的方法，其包括向受試者施用本發明的任何單個或融合多肽，例如，趨化因子和人免疫缺陷病毒 (HIV) 抗原或趨化因子、促凋亡基因、自殺基因和腫瘤抗原，它們作為蛋白質或編碼從慢病毒載體表達的個體或融合多肽的核酸。還提出了一種治療受試者癌症的方法，其包含向受試者施用表達本發明的任何個體或融合多肽（例如趨化因子和腫瘤抗原）的慢病毒載體，它們作為蛋白質或編碼融合多肽的核酸。
進一步提出了一種治療或預防受試者中 HIV 感染的方法，其包含對受試者施用源自以下蛋白質的以下肽的任何組合：趨化因子、自殺基因、HIV 蛋白、細胞因子、細胞表面蛋白、腫瘤抗原或影響細胞中 HIV 產生的任何細胞基因（透過過度表達細胞基因或透過 RNAi 抑制其表達等），所有均從慢病毒載體提供和表達。
在一些方面，可以施用本文所述的包含工程化改造的免疫細胞，例如 T 細胞（例如，γδ T 細胞）的組合物，以用於預防和/或治療。在治療應用中，藥物組合物可以以足以治癒或至少部分阻止疾病或病症症狀的量給予已患有疾病或病症的受試者。還可給予改造免疫細胞以減少病症發展、感染或惡化的可能性。用於治療用途的有效量改造免疫細胞群可能根據疾病或病症的嚴重程度和病程、先前療法、受試者的健康狀況、體重和/或對藥物的反應和/或治療醫師的判斷而不同。
本公開內容的改造免疫細胞（如 T 細胞）可用於治療需要治療病症（例如，本文所述的癌症）的受試者。
用工程改造的免疫細胞（例如工程改造的 T 細胞）治療受試者病症（例如疾病）的方法，可包括向受試者施用治療有效量的工程改造免疫細胞，例如工程改造的 T 細胞。本公開的工程改造免疫細胞，例如工程改造 T 細胞，可以以各種方案（例如，時間、濃度、劑量、治療間隔和/或製劑）施用。在接受本公開的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）之前，還可以用，例如，化學療法、放射療法或兩者的組合對受試者進行預處理。在施用於受試者之前，還可以冷凍或冷凍保存工程改造的免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）群。工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）群可包括表達相同、不同或相同和不同腫瘤識別部分組合的兩種或更多種細胞。例如，工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）群可包括幾種不同的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞），其被設計用於識別不同抗原或相同抗原的不同表位。
本公開的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）可用於治療各種病症。一方面，本公開的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）可用於治療癌症，包括實體瘤和惡性血液病。癌症的非限制性實例包括：急性淋巴細胞白血病、急性髓性白血病、腎上腺皮質癌、AIDS 相關癌症、AIDS 相關淋巴瘤、肛門癌、闌尾癌、星形細胞瘤、神經母細胞瘤、基底細胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦腫瘤（如：小腦星形細胞瘤、腦星形細胞瘤/惡性膠質瘤、室管膜瘤、成神經管細胞瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤、視覺通路和下丘腦膠質瘤）、乳腺癌、支氣管腺瘤、伯基特淋巴瘤、原發性未知癌、中樞神經系統淋巴瘤、小腦星形細胞瘤、宮頸癌、兒童癌症、慢性淋巴細胞白血病、慢性粒細胞白血病、慢性骨髓增生性疾病、結腸癌、皮膚 T 細胞淋巴瘤、結締組織增生性小圓細胞瘤、子宮內膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因氏肉瘤、生殖細胞腫瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸道類癌腫瘤、胃腸道間質瘤、膠質瘤、毛細胞白血病、頭頸癌、心臟癌、肝細胞癌（肝癌）、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼內黑色素瘤、胰島細胞癌、卡波西肉瘤、腎癌、喉癌、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌（如：非小細胞和小細胞肺癌）、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨惡性纖維組織細胞瘤/骨肉瘤、成神經管細胞瘤、黑色素瘤、間皮瘤、原發灶隱匿的轉移性鱗狀頸癌、口腔癌、多發性內分泌腫瘤徵候群、骨髓增生異常徵候群、骨髓性白血病、鼻腔和副鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨惡性纖維組織細胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖細胞腫瘤、胰腺癌、胰腺癌胰島細胞、副鼻竇和鼻腔癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、咽癌、嗜鉻細胞瘤、松果體星形細胞瘤、松果體生殖細胞瘤、垂體腺瘤、胸膜肺母細胞瘤、漿細胞瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、攝護腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂和輸尿管移行細胞癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮膚癌、默克爾細胞皮膚癌、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、T 細胞淋巴瘤、喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲狀腺癌、滋養細胞腫瘤（妊娠）、原發部位未知癌、尿道癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症和腎母細胞瘤。
一方面，本公開的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）可用於治療傳染病。另一方面，本公開的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）可用於治療傳染病，傳染病可由病毒引起。再一方面，本公開的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）可用於治療免疫疾病，例如，自身免疫疾病。
可以在病症臨床發作之前、發作期間和發作之後向受試者提供本公開的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）治療。在疾病臨床發作後 1 天、1 週、6 個月、12 個月或 2 年後，可向受試者提供治療。在疾病臨床發作後可能提供給受試者治療超過 1 天、1 週、1 個月、6 個月、12 個月、2 年、3 年、4 年、5 年、6 年、7 年、8 年、9 年、10 年或更長時間。在疾病臨床發作後可能提供給受試者治療少於 1 天、1 週、1 個月、6 個月、12 個月或 2 年。治療還可能包括在臨床試驗中治療人受試者。治療可包括向受試者施用包含本公開的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）的藥物組合物。
另一方面，向受試者施用本公開的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）可以調節受試者體內內源性淋巴細胞的活性。另一方面，向受試者施用工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）可以向內源性 T 細胞提供抗原並且可增強免疫應答。另一方面，記憶 T 細胞可以為 CD4+ T 細胞。另一方面，記憶 T 細胞可以為 CD8+ T 細胞。另一方面，向受試者施用本公開的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）可啟動另一種免疫細胞的細胞毒性。另一方面，其他免疫細胞可以為 CD8+ T 細胞。另一方面，其他免疫細胞可以為天然殺傷 T 細胞。另一方面，向受試者施用本公開的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）可抑制調節性 T 細胞。另一方面，調節性 T 細胞可以為 FOX3+ Treg 細胞。另一方面，調節性 T 細胞可以為 FOX3- Treg 細胞。其活性可透過本公開的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）調節的細胞非限制性實例可能包括：造血幹細胞；B 細胞；CD4；CD8；紅血球；白血球；樹突細胞，包括樹突抗原呈遞細胞；白細胞；巨噬細胞；記憶 B 細胞；記憶 T 細胞；單核細胞；自然殺傷細胞；中性粒細胞；T 輔助細胞；和 T 殺傷細胞。
在大多數骨髓移植期間，環磷醯胺與全身照射組合可常規用於防止受試者免疫系統對移植體的造血幹細胞 (HSC) 產生排斥。一方面，可以進行供體骨髓與白細胞介素-2 (IL-2) 離體孵育以增強供體骨髓中殺傷性淋巴細胞的產生。白細胞介素-2 (IL-2) 是野生型淋巴細胞生長、增殖和分化所必需的細胞因子。目前關於將 γδ T 細胞過繼轉移到人體中的研究可能需要共同施用 γδ T 細胞和白細胞介素-2。然而，低劑量和高劑量的 IL-2 都可能具有高度的毒副作用。IL-2 毒性可在多個器官/系統中表現出來，最顯著的是心臟、肺、腎和中樞神經系統。另一方面，本公開內容提供了用於向受試者施用改造 γδ T 細胞而不共同施用天然細胞因子或其修飾形式（例如 IL-2、IL-15、IL-12、IL-21）的方法。另一方面，改造的 γδ T 細胞可以在不與 IL-2 共同施用的情況下施用於受試者。另一方面，改造的 γδ T 細胞可以在手術期間施用於受試者，例如，骨髓移植而不共同施用 IL-2。
給藥方法
可以以任何順序或同時向受試者施用一種或多種工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）群。如果同時施用，多重工程改造免疫細胞（例如，T 細胞）可以為單次統一的形式，例如：靜脈內注射，或以多形式提供，例如，多次靜脈內輸注、皮下注射、注射或丸劑。工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）可以一起包裝或單獨包裝在單個包裝或多個包裝中。可以以多劑量給予一種或所有工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）。如果不是同時施用，多次劑量之間的時間間隔可能有多達大約一週、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月或大約一年的不同。另一方面，工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）可以在施用於受試者後在受試者體內（活體內）擴增。可以冷凍工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）以提供細胞以相同的細胞製劑進行多次治療。本公開的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）和包含該細胞的藥物組合物可以作為套件包裝。套件可包括關於工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）和包含該細胞的組合物的使用說明（例如，書面說明書）。
另一方面，治療癌症的方法包括向受試者施用治療有效量的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞），其中所述給藥治療癌症。在另一實施方案中，治療有效量的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）可以施用至少約 10 秒、30 秒、1 分鐘、10 分鐘、30 分鐘、1 小時、2 小時、3 小時、4 小時、5 小時、6 小時、12 小時、24 小時、2 天、3 天、4 天、5 天、6 天、1 週、2 週、3 週、1 個月、2 個月、3 個月、4 個月、5 個月、6 個月或 1 年。另一方面，治療有效量的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）可以施用至少一週。另一方面，治療有效量的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）可以施用至少兩週。
本文所述的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）可以在疾病或病症發生之前、發生期間或發生之後施用，並且施用含有工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）的藥物組合物的時間可能不同。例如，工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）可以用作預防劑，並且可以連續給予有病症或疾病傾向的受試者，以減少疾病或病症發生的可能性。可以在症狀發作期間或盡可能快地給予受試者工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）。工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）的給予可以在症狀發作後立即、症狀發作的前 3 小時內、症狀發作的前 6 小時內、症狀發作的前 24 小時內、症狀發作的前 48 小時內或症狀發作後的任何一段時間內立即啟始。初始施用可透過任何實用的途徑，例如：透過本文描述的任何途徑使用本文描述的任何製劑給予。另一方面，本公開的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）可以是靜脈內施用。一種或多種劑量的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）可在癌症、傳染病、免疫疾病、敗血症或骨髓移植開始後可實行時儘快施用，並持續一段用於治療免疫疾病所需的時間，例如，從約 24 小時到約 48小時、從約 48 小時到約 1 週、從約 1 週到約 2 週、從約 2 週到約 1 個月、從約 1 個月到約 3 個月。對於癌症治療，可以在癌症發作後數年和其他治療之前或之後施用一劑或多劑量的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）。另一方面，工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）可以施用至少約 10 分鐘、30 分鐘、1 小時、2 小時、3 小時、4 小時、5 小時、6 小時、12 小時、24 小時、至少 48 小時、至少 72 小時、至少 96 小時、至少 1 週、至少 2 週、至少 3 週、至少 4 週、至少 1 個月、至少 2 個月、至少 3 個月、至少 4 個月、至少 5 個月、至少 6 個月、至少 7 個月、至少 8 個月、至少 9 個月、至少 10 個月、至少 11 個月、至少 12 個月、至少 1 年、至少 2 年、至少 3 年、至少 4 年或至少 5 年。每個受試者的治療時間可能不同。
保存
一方面，免疫細胞（例如，T 細胞）可以在冷凍介質中配製並置於低溫儲存裝置（例如：液氮冷凍器（-196℃）或超低溫冷凍器（-65℃、-80℃、-120℃ 或 -150℃）中長期儲存至少約 1 個月、2 個月、3 個月、4 個月、5 個月、6 個月、1 年、2 年、3 年或至少 5 年。冷凍介質可以含有二甲基亞碸 (DMSO) 和/或氯化鈉 (NaCl) 和/或右旋糖和/或硫酸葡聚糖和/或羥乙基澱粉 (HES) 以及生理pH緩衝劑，以將 pH 保持在約 6.0 至約 6.5、約 6.5 至約 7.0、約 7.0 至約 7.5、約 7.5 至約 8.0 或約 6.5 至約 7.5 之間。冷凍保存的免疫細胞（例如，T 細胞）可以解凍並透過用本文所述的抗體、蛋白質、肽和/或細胞因子刺激進行進一步加工。冷凍保存的免疫細胞（例如，T 細胞）可以解凍並用本文所述的病毒載體（包括逆轉錄病毒、腺相關病毒 (AAV) 和慢病毒載體）或非病毒手段（包括 RNA、DNA，例如轉座子和蛋白質）進行基因修飾。可以進一步冷凍保存修飾的免疫細胞（例如，修飾的 T 細胞）以產生至少約 1、5、10、100、150、200、500 個小瓶量的細胞庫，每 mL 冷凍介質中至少約 101 、102 、103 、104 、105 、106 、107 、108 、109 或至少約 1010 個細胞。冷凍保存的細胞庫可以保留其功能並且可以解凍並進一步刺激和擴增。另一方面，可以在合適的封閉容器（例如：細胞培養袋和/或生物反應器）中刺激和擴增解凍的細胞，以產生大量細胞作為同種異體細胞產物。冷凍保存的免疫細胞（例如，T 細胞）可以在低溫儲存條件下維持其生物學功能至少約 6 個月、7 個月、8 個月、9 個月、10 個月、11 個月、12 個月、13 個月、15 個月、18 個月、20 個月、24 個月、30 個月、36 個月、40 個月、50 個月或至少約 60 個月。另一方面，製劑中不使用防腐劑。冷凍保存的免疫細胞（例如，T 細胞）可以解凍並作為同種異體現成的細胞產物輸注到多個患者中。
一方面，本文所述的工程改造免疫細胞（例如，工程改造的 T 細胞）可能存在於組合物中，含量為至少 1×103 個細胞/ml、至少 2×103 個細胞/ml、至少 3×103 個細胞/ml、至少 4×103 個細胞/ml、至少 5×103 個細胞/ml、至少 6×103 個細胞/ml、至少 7×103 個細胞/ml、至少 8×103 個細胞/ml、至少 9×103 個細胞/ml、至少 1×104 個細胞/ml、至少 2×104 個細胞/ml、至少 3×104 個細胞/ml、至少 4×104 個細胞/ml、至少 5×104 個細胞/ml、至少 6×104 個細胞/ml、至少 7×104 個細胞/ml、至少 8×104 個細胞/ml、至少 9×104 個細胞/ml、至少 1×105 個細胞/ml、至少 2×105 個細胞/ml、至少 3×105 個細胞/ml、至少 4×105 個細胞/ml、至少 5×105 個細胞/ml、至少 6×105 個細胞/ml、至少 7×105 個細胞/ml、至少 8×105 個細胞/ml、至少 9×105 個細胞/ml、至少 1×106 個細胞/ml、至少 2×106 個細胞/ml、至少 3×106 個細胞/ml、至少 4×106 個細胞/ml、至少 5×106 個細胞/ml、至少 6×106 個細胞/ml、至少 7×106 個細胞/ml、至少 8×106 個細胞/ml、至少 9×106 個細胞/ml、至少 1×107 個細胞/ml、至少 2×107 個細胞/ml、至少 3×107 個細胞/ml、至少 4×107 個細胞/ml、至少 5×107 個細胞/ml、至少 6×107 個細胞/ml、至少 7×107 個細胞/ml、至少 8×107 個細胞/ml、至少 9×107 個細胞/ml、至少 1×108 個細胞/ml、至少 2×108 個細胞/ml、至少 3×108 個細胞/ml、至少 4×108 個細胞/ml、至少 5×108 個細胞/ml、至少 6×108 個細胞/ml、至少 7×108 個細胞/ml、至少 8×108 個細胞/ml、至少 9×108 個細胞/ml、至少 1×109 個細胞/ml 或更多、從約 1×103 個細胞/ml 至約至少 1×108 個細胞/ml、從約 1×105 個細胞/ml 至約至少 1×108 個細胞/ml 或從約 1×106 個細胞/ml 至約至少 1×108 個細胞/ml。
一方面，根據本公開內容的一個方面，本文描述的方法可以用於產生自體或同種異體產物。
實施例 1
表 3. DNA 和蛋白質序列
SEQ ID NO： 描述 序列
1 衍生自 GenBank 登記號 J02440.1 的 WT WPRE gagcatcttaccgccatttatacccatatttgttctgtttttcttgatttgggtatacatttaaatgttaataaaacaaaatggtggggcaatcatttacattttatgggatatgtaattactagttcaggtgtattgccacaagacaaacatgttaagaaactttcccgttatttacgctctgttcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctcccgatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccaactggatcctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggctctcaatccagcggacctcccttcccgaggccttctgccggttctgcggcctctcccgcgtcttcgctttcggcctccgacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg
2 衍生自 GenBank 登記號 J04514.1 的 WT WPRE cagtctgacgtacgcgtaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcc
3 突變體 WPRE gagcatcttaccgccatttatacccatatttgttctgtttttcttgatttgggtatacatttaaatgttaataaaacaaaatggtggggcaatcatttacattttttgggatatgtaattactagttcaggtgtattgccacaagacaaacttgttaagaaactttcccgttatttacgctctgttcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactttgttgctccttttacgctgtgtggatttgctgctttattgcctctgtatcttgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttttgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctcccgatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtc
4 突變體 WPRE   cagtctgacgtacgcgtaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcc
5 連接子 SGSG
6 P2A ATNFSLLKQAGDVEENPGP
7 T2A EGRGSLLTCGDVEENPGP
8 E2A QCTNYALLKLAGDVESNPGP
9 F2A VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
10 弗林蛋白酶 RAKR
11 CD8 α 鏈 MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV
12 CD8 β 鏈 MRPRLWLLLAAQLTVLHGNSVLQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPITLGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCCRRRRARLRFMKQPQGEGISGTFVPQCLHGYYSNTTTSQKLLNPWILKT
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26 R4P3F9 β 鏈 MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
27 R4P3H3 α 鏈 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVKAGNQFYFGTGTSLTVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
28 R4P3H3 β 鏈 MGTRLLCWVVLGFLGTDHTGAGVSQSPRYKVAKRGQDVALRCDPISGHVSLFWYQQALGQGPEFLTYFQNEAQLDKSGLPSDRFFAERPEGSVSTLKIQRTQQEDSAVYLCASSLLTSGGDNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
29 R36P3F9 α 鏈 METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATVSNYQLIWGAGTKLIIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
30 R36P3F9 β 鏈   MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLRQIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASSSTSGGLSGETQYFGPGTRLLVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
31 R52P2G11 α 鏈 MKKHLTTFLVILWLYFYRGNGKNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTIMTFSENTKSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSAYGKLQFGAGTQVVVTPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
32 R52P2G11 β 鏈 MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSLGSPDGNQPQHFGDGTRLSILEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
33 R53P2A9 α 鏈 MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCAYNSYAGGTSYGKLTFGQGTILTVHPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
34 R53P2A9 β 鏈 MGPGLLCWVLLCLLGAGPVDAGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSPISGHKSVSWYQQVLGQGPQFIFQYYEKEERGRGNFPDRFSARQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASSLDGTSEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
35 R26P1A9 α 鏈 METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCLIGASGSRLTFGEGTQLTVNPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
36 R26P1A9 β 鏈 MGSWTLCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSYFGWNEKLFFGSGTQLSVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
37 R26P2A6 α 鏈 MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSAFQYFMWYRQYSRKGPELLMYTYSSGNKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYLCAMSDVSGGYNKLIFGAGTRLAVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
38 R26P2A6 β 鏈 MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLRQIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASTTPDGTDEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
39 R26P3H1 α 鏈 MASAPISMLAMLFTLSGLRAQSVAQPEDQVNVAEGNPLTVKCTYSVSGNPYLFWYVQYPNRGLQFLLKYITGDNLVKGSYGFEAEFNKSQTSFHLKKPSALVSDSALYFCAVRDMNRDDKIIFGKGTRLHILPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
40 R26P3H1 β 鏈 MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSRAEGGEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
41 R35P3A4 α 鏈 MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQELGKRPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAASPTGGYNKLIFGAGTRLAVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
42 R35P3A4 β 鏈 MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSLGGASQEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
43 R37P1C9 α 鏈 MKLVTSITVLLSLGIMGDAKTTQPNSMESNEEEPVHLPCNHSTISGTDYIHWYRQLPSQGPEYVIHGLTSNVNNRMASLAIAEDRKSSTLILHRATLRDAAVYYCILFNFNKFYFGSGTKLNVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
44 R37P1C9 β 鏈 MGPGLLHWMALCLLGTGHGDAMVIQNPRYQVTQFGKPVTLSCSQTLNHNVMYWYQQKSSQAPKLLFHYYDKDFNNEADTPDNFQSRRPNTSFCFLDIRSPGLGDAAMYLCATSSGETNEKLFFGSGTQLSVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
45 R37P1H1 α 鏈 MTRVSLLWAVVVSTCLESGMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESNYYLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDTAMYFCAFGYSGGGADGLTFGKGTHLIIQPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
46 R37P1H1 β 鏈 MGPGLLCWALLCLLGAGLVDAGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSPKSGHDTVSWYQQALGQGPQFIFQYYEEEERQRGNFPDRFSGHQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASSNEGQGWEAEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
47 R42P3A9 α 鏈 MKRILGALLGLLSAQVCCVRGIQVEQSPPDLILQEGANSTLRCNFSDSVNNLQWFHQNPWGQLINLFYIPSGTKQNGRLSATTVATERYSLLYISSSQTTDSGVYFCAVHNFNKFYFGSGTKLNVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
48 R42P3A9 β 鏈 MLSPDLPDSAWNTRLLCHVMLCLLGAVSVAAGVIQSPRHLIKEKRETATLKCYPIPRHDTVYWYQQGPGQDPQFLISFYEKMQSDKGSIPDRFSAQQFSDYHSELNMSSLELGDSALYFCASSLLGQGYNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
49 R43P3F2 α 鏈 MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYLFWYKQPPSGELVFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCALSNNNAGNMLTFGGGTRLMVKPHIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
50 R43P3F2 β 鏈 MLSPDLPDSAWNTRLLCHVMLCLLGAVSVAAGVIQSPRHLIKEKRETATLKCYPIPRHDTVYWYQQGPGQDPQFLISFYEKMQSDKGSIPDRFSAQQFSDYHSELNMSSLELGDSALYFCASSPTGTSGYNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
51 R43P3G5 α 鏈 MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYALHWYRWETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCALNRDDKIIFGKGTRLHILPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
52 R43P3G5 β 鏈 MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYLCASRLPSRTYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
53 R59P2E7 α 鏈 METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVNSDYKLSFGAGTTVTVRANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
54 R59P2E7 β 鏈 MLSPDLPDSAWNTRLLCHVMLCLLGAVSVAAGVIQSPRHLIKEKRETATLKCYPIPRHDTVYWYQQGPGQDPQFLISFYEKMQSDKGSIPDRFSAQQFSDYHSELNMSSLELGDSALYFCASSLGLGTGDYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
55 R11P3D3 α 鏈 MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYALHWYRWETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCALYNNNDMRFGAGTRLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
56 R11P3D3 β 鏈 MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGSTDTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATlLYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
57 R16P1C10 α 鏈 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAVISNFGNEKLTFGTGTRLTIIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
58 R16P1C10 β 鏈 MGSRLLCWVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSPWDSPNEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
59 R16P1E8 α 鏈 MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSAFQYFMWYRQYSRKGPELLMYTYSSGNKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYLCAMSEAAGNKLTFGGGTRVLVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
60 R16P1E8 β 鏈 MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSYTNQGEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
61 R17P1A9 α 鏈 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVLNQAGTALIFGKGTTLSVSSNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
62 R17P1A9 β 鏈 MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSAETGPWLGNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
63 R17P1D7 α 鏈 MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCAYRWAQGGSEKLVFGKGTKLTVNPYIQKPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
64 R17P1D7 β 鏈 MTIRLLCYMGFYFLGAGLMEADIYQTPRYLVIGTGKKITLECSQTMGHDKMYWYQQDPGMELHLIHYSYGVNSTEKGDLSSESTVSRIRTEHFPLTLESARPSHTSQYLCATELWSSGGTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
65 R17P1G3 α 鏈 IMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVGPSGTYKYIFGTGTRLKVLANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
66 R17P1G3 β 鏈 MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLRQIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASSPGGSGNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
67 R17P2B6 α 鏈 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVVSGGGADGLTFGKGTHLIIQPYIQKPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
68 R17P2B6 β 鏈 MLSPDLPDSAWNTRLLCHVMLCLLGAVSVAAGVIQSPRHLIKEKRETATLKCYPIPRHDTVYWYQQGPGQDPQFLISFYEKMQSDKGSIPDRFSAQQFSDYHSELNMSSLELGDSALYFCASSLGRGGQPQHFGDGTRLSILEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
69 R11P3D3KE α 鏈 MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYALHWYRKETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCALYNNNDMRFGAGTRLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
70 R11P3D3KE β 鏈 NNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSPGSTDTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATlLYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
71 R39P1C12 α 鏈 TYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEIDNQGGKLIFGQGTELSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
72 R39P1C12 β 鏈 MGPGLLCWALLCLLGAGLVDAGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSPKSGHDTVSWYQQALGQGPQFIFQYYEEEERQRGNFPDRFSGHQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASSQLNTEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
73 R39P1F5 α 鏈 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVNNARLMFGDGTQLVVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
74 R39P1F5 β 鏈 MDTWLVCWAIFSLLKAGLTEPEVTQTPSHQVTQMGQEVILRCVPISNHLYFYWYRQILGQKVEFLVSFYNNEISEKSEIFDDQFSVERPDGSNFTLKIRSTKLEDSAMYFCASSGQGANEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
75 R40P1C2 α 鏈 MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCAYLNYQLIWGAGTKLIIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
76 R40P1C2 β 鏈 MDTWLVCWAIFSLLKAGLTEPEVTQTPSHQVTQMGQEVILRCVPISNHLYFYWYRQILGQKVEFLVSFYNNEISEKSEIFDDQFSVERPDGSNFTLKIRSTKLEDSAMYFCASSEMTAVGQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
77 R41P3E6 α 鏈 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFT AQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAFSGYALNFGKGTSLLVTPHIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
78 R41P3E6 β 鏈 MDTWLVCWAIFSLLKAGLTEPEVTQTPSHQVTQMGQEVILRCVPISNHLYFYWYRQILGQKVEFLVSFYNNEISEKSEIFDDQFSVERPDGSNFTLKIRSTKLEDSAMYFCASSQYTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
79 R43P3G4 α 鏈 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVNGGDMRFGAGTRLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
80 R43P3G4 β 鏈 MDTWLVCWAIFSLLKAGLTEPEVTQTPSHQVTQMGQEVILRCVPISNHLYFYWYRQILGQKVEFLVSFYNNEISEKSEIFDDQFSVERPDGSNFTLKIRSTKLEDSAMYFCASSGQGALEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
81 R44P3B3 α 鏈 MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASGLYNQGGKLIFGQGTELSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
82 R44P3B3 β 鏈 MGCRLLCCVVFCLLQAGPLDTAVSQTPKYLVTQMGNDKSIKCEQNLGHDTMYWYKQDSKKFLKIMFSYNNKELIINETVPNRFSPKSPDKAHLNLHINSLELGDSAVYFCASSLGDRGYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
83 R44P3E7 α 鏈 MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEINNNARLMFGDGTQLVVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
84 R44P3E7 β 鏈 MLSPDLPDSAWNTRLLCHVMLCLLGAVSVAAGVIQSPRHLIKEKRETATLKCYPIPRHDTVYWYQQGPGQDPQFLISFYEKMQSDKGSIPDRFSAQQFSDYHSELNMSSLELGDSALYFCASSPPDQNTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
85 R49P2B7 α 鏈 MLLLLVPVLEVIFTLGGTRAQSVTQLGSHVSVSEGALVLLRCNYSSSVPPYLFWYVQYPNQGLQLLLKYTTGATLVKGINGFEAEFKKSETSFHLTKPSAHMSDAAEYFCAVRIFGNEKLTFGTGTRLTIIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
86 R49P2B7 β 鏈 MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYLCASSLMGELTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
87 R55P1G7 α 鏈 MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSAFQYFMWYRQYSRKGPELLMYTYSSGNKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYLCAMMGDTGTASKLTFGTGTRLQVTLDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
88 R55P1G7 β 鏈 MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYLCASSFGGYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
89 R59P2A7 α 鏈 VKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
90 R59P2A7 β 鏈 MLCSLLALLLGTFFGVRSQTIHQWPATLVQPVGSPLSLECTVEGTSNPNLYWYRQAAGRGLQLLFYSVGIGQISSEVPQNLSASRPQDRQFILSSKKLLLSDSGFYLCAWSGLVAEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
91 變體 R4P3F9 α 鏈 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRRSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
92 變體 R4P3F9 β 鏈 MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPAMDHPYVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
93 弗林蛋白酶共有序列   RXXR
94 MSCV 啟動子 tgaaagaccccacctgtaggtttggcaagctagcttaagtaacgccattttgcaaggcatggaaaatacataactgagaatagagaagttcagatcaaggttaggaacagagagacagcagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggtccccagatgcggtcccgccctcagcagtttctagagaaccatcagatgtttccagggtgccccaaggacctgaaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagttcgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgagctcaataaaagagcccacaacccctcact
95 RD114TR MKLPTGMVILCSLIIVRAGFDDPRKAIALVQKQHGKPCECSGGQVSEAPPNSIQQVTCPGKTAYLMTNQKWKCRVTPKISPSGGELQNCPCNTFQDSMHSSCYTEYRQCRRINKTYYTATLLKIRSGSLNEVQILQNPNQLLQSPCRGSINQPVCWSATAPIHISDGGGPLDTKRVWTVQKRLEQIHKAMTPELQYHPLALPKVRDDLSLDARTFDILNTTFRLLQMSNFSLAQDCWLCLKLGTPTPLAIPTPSLTYSLADSLANASCQIIPPLLVQPMQFSNSSCLSSPFINDTEQIDLGAVTFTNCTSVANVSSPLCALNGSVFLCGNNMAYTYLPQNWTRLCVQASLLPDIDINPGDEPVPIPAIDHYIHRPKRAVQFIPLLAGLGITAAFTTGATGLGVSVTQYTKLSHQLISDVQVLSGTIQDLQDQVDSLAEVVLQNRRGLDLLTAEQGGICLALQEKCCFYANKSGIVRNKIRTLQEELQKRRESLASNPLWTGLQGFLPYLLPLLGPLLTLLLILTIGPCVFNRLVQFVKDRISVVQALVLTQQYHQLKPL
表 4. TAA 肽序列
SEQ ID NO： 氨基酸序列 SEQ ID NO： 氨基酸序列 SEQ ID NO： 氨基酸序列
99 YLYDSETKNA 152 LLWGHPRVALA 205 SLLNQPKAV
100 HLMDQPLSV 153 VLDGKVAVV 206 KMSELQTYV
101 GLLKKINSV 154 GLLGKVTSV 207 ALLEQTGDMSL
102 FLVDGSSAL 155 KMISAIPTL 208 VIIKGLEEITV
103 FLFDGSANLV 156 GLLETTGLLAT 209 KQFEGTVEI
104 FLYKIIDEL 157 TLNTLDINL 210 KLQEEIPVL
105 FILDSAETTTL 158 VIIKGLEEI 211 GLAEFQENV
106 SVDVSPPKV 159 YLEDGFAYV 212 NVAEIVIHI
107 VADKIHSV 160 KIWEELSVLEV 213 ALAGIVTNV
108 IVDDLTINL 161 LLIPFTIFM 214 NLLIDDKGTIKL
109 GLLEELVTV 162 ISLDEVAVSL 215 VLMQDSRLYL
110 TLDGAAVNQV 163 KISDFGLATV 216 KVLEHVVRV
111 SVLEKEIYSI 164 KLIGNIHGNEV 217 LLWGNLPEI
112 LLDPKTIFL 165 ILLSVLHQL 218 SLMEKNQSL
113 YTFSGDVQL 166 LDSEALLTL 219 KLLAVIHEL
114 YLMDDFSSL 167 VLQENSSDYQSNL 220 ALGDKFLLRV
115 KVWSDVTPL 168 HLLGEGAFAQV 221 FLMKNSDLYGA
116 LLWGHPRVALA 169 SLVENIHVL 222 KLIDHQGLYL
117 KIWEELSVLEV 170 YTFSGDVQL 223 GPGIFPPPPPQP
118 LLIPFTIFM 171 SLSEKSPEV 224 ALNESLVEC
119 FLIENLLAA 172 AMFPDTIPRV 225 GLAALAVHL
120 LLWGHPRVALA 173 FLIENLLAA 226 LLLEAVWHL
121 FLLEREQLL 174 FTAEFLEKV 227 SIIEYLPTL
122 SLAETIFIV 175 ALYGNVQQV 228 TLHDQVHLL
123 TLLEGISRA 176 LFQSRIAGV 229 SLLMWITQC
124 KIQEILTQV 177 ILAEEPIYIRV 230 FLLDKPQDLSI
125 VIFEGEPMYL 178 FLLEREQLL 231 YLLDMPLWYL
126 SLFESLEYL 179 LLLPLELSLA 232 GLLDCPIFL
127 SLLNQPKAV 180 SLAETIFIV 233 VLIEYNFSI
128 GLAEFQENV 181 AILNVDEKNQV 234 TLYNPERTITV
129 KLLAVIHEL 182 RLFEEVLGV 235 AVPPPPSSV
130 TLHDQVHLL 183 YLDEVAFML 236 KLQEELNKV
131 TLYNPERTITV 184 KLIDEDEPLFL 237 KLMDPGSLPPL
132 KLQEKIQEL 185 KLFEKSTGL 238 ALIVSLPYL
133 SVLEKEIYSI 186 SLLEVNEASSV 239 FLLDGSANV
134 RVIDDSLVVGV 187 GVYDGREHTV 240 ALDPSGNQLI
135 VLFGELPAL 188 GLYPVTLVGV 241 ILIKHLVKV
136 GLVDIMVHL 189 ALLSSVAEA 242 VLLDTILQL
137 FLNAIETAL 190 TLLEGISRA 243 HLIAEIHTA
138 ALLQALMEL 191 SLIEESEEL 244 SMNGGVFAV
139 ALSSSQAEV 192 ALYVQAPTV 245 MLAEKLLQA
140 SLITGQDLLSV 193 KLIYKDLVSV 246 YMLDIFHEV
141 QLIEKNWLL 194 ILQDGQFLV 247 ALWLPTDSATV
142 LLDPKTIFL 195 SLLDYEVSI 248 GLASRILDA
143 RLHDENILL 196 LLGDSSFFL 249 ALSVLRLAL
144 YTFSGDVQL 197 VIFEGEPMYL 250 SYVKVLHHL
145 GLPSATTTV 198 ALSYILPYL 251 VYLPKIPSW
146 GLLPSAESIKL 199 FLFVDPELV 252 NYEDHFPLL
147 KTASINQNV 200 SEWGSPHAAVP 253 VYIAELEKI
148 SLLQHLIGL 201 ALSELERVL 254 VHFEDTGKTLLF
149 YLMDDFSSL 202 SLFESLEYL 255 VLSPFILTL
150 LMYPYIYHV 203 KVLEYVIKV 256 HLLEGSVGV
151 KVWSDVTPL 204 VLLNEILEQV    
實施例 2
WPRE 突變體的產生
野生型 WPRE 序列用於慢病毒構建體，以穩定和增強基因的轉錄。由於一些報告得出結論認為 WPRE 內的蛋白質（X 蛋白）可導致腫瘤發生，因此美國 FDA 建議在臨床試驗中用於基因和細胞療法的慢病毒構建體可以找到使用野生型 WPRE 的替代方法。我們相信滿足 FDA 要求將使我們的 T 細胞產品能夠用於臨床試驗，並有可能避免慢病毒載體設計某些方面的安全性問題。
探索了兩種單獨的 WPRE 突變策略，以嘗試開發不表達功能性 X 蛋白而同時保持 WPRE 對基因表達的轉錄後增強作用的 WPRE 突變體。
開發了一種變體，其中 X 蛋白的啟動子區域和 X 蛋白的起始密碼子均突變 (SEQ ID NO: 4)。
開發了另一種變體，其中刪除了 X 蛋白啟動子和完整推定序列，以及突變 WPRE 中大於 25aa 的任何 ORF 的起始密碼子 (SEQ ID NO: 3)。
實施例 3
慢病毒構建體
本文使用的表達盒示意圖見圖 3。
圖 4 提供了在下文詳述的實驗中使用的慢病毒構建體中所使用盒的描述，用以檢查 WPRE 突變體的療效。
本文使用的慢病毒載體包含之前顯示可增強載體功能的幾種元件，包括用於改善複製和核輸入的中央多嘌呤區 (cPPT)、來自鼠幹細胞病毒 (MSCV) 的啟動子 (SEQ ID NO: 94 )，其已被證明可以減少某些細胞類型的載體沉寂，並且骨架具有刪除的 3'-LTR 自滅活 (SIN) 載體設計，可以提高安全性、維持基因表達和抗沉寂特性 (Yang et al.Gene Therapy (2008) 15, 1411–1423），其內容透過引用整體併入本文。
本文使用的慢病毒載體編碼 TCRα 鏈和 TCRβ 鏈。特別地，本文使用的載體編碼 R4P3F9α 和 β 鏈（SEQ ID NO: 25 和 26）及其變體。以縮寫「R4」開頭的本文所述的載體編碼野生型 R4P3F9α 和 β 鏈（SEQ ID NO: 25 和 26）；以縮寫「R4-B4」開頭的載體編碼野生型 R4P3F9α 鏈 (SEQ ID NO: 25) 和變體 R4P3F9 β 鏈 (SEQ ID NO: 92)；以縮寫「R4-A1B4」開頭的載體編碼變體 R4P3F9α 鏈 (SEQ ID NO: 91) 和變體 R4P3F9 β 鏈 (SEQ ID NO: 92)（圖 4）。
對於上述的每個 TCRαβ 二聚體，檢測了四個單獨的 WPRE 變體。「變體 A」是根據 SEQ ID NO: 2 所述的野生型 WPRE（陽性對照）；「變體 B」不包含 WPRE（陰性對照）；「變體 C」包含根據 SEQ ID NO: 4 所述的突變體 WPRE，其中 X 蛋白啟動子和起始密碼子已突變；「變體 D」包含根據 SEQ ID NO: 3 所述的突變體 WPRE，其中位於整個 WPRE 序列中的起始密碼子已突變，X 蛋白啟動子和 ORF 已被刪除。
實施例 4
WPRE 突變對 T 細胞中慢病毒構建體療效的影響
T 細胞在第 0 天從供體獲得，於第 1 天啟動，於第 2 天用上述實施例 3 中所述的各種慢病毒載體轉導，於第 6 天收穫用於檢測。透過流式細胞術確定 TCR 表面表達，並透過 qPCR 確定載體拷貝數。
圖 5 顯示了用根據本公開一些實施方案所述的慢病毒構建體轉導後獲得的 HEK-293 T 滴度。使用含有突變體 WPRE 的慢病毒構建體 (LV-C和LV-D) 而獲得的滴度與使用含有野生型 (WT) WPRE 的慢病毒構建體 (LV-A) 而獲得的滴度相似。
圖 6 顯示了用根據本公開一些實施方案所述的 R4-B4 慢病毒構建體轉導後六天 TCR 在 CD8+ 細胞表面上的表達。使用慢病毒滴定法檢測四聚體在兩個單獨供體中的表達：A 圖中的供體 #1 和 B 圖中的供體 #2。X 軸顯示對數病毒稀釋因子。令人驚訝的是，與用包含 WT WPRE（變體 A）或不包含 WPRE（變體 B）的慢病毒構建體轉導的CD8+ 細胞相比，用含有突變體 WPRE（變體C 與 D）的慢病毒構建體轉導的 CD8+ 細胞中 TCR 表達更高。
圖 7 顯示了用根據本公開一些實施方案所述的 R4-A1B4 慢病毒構建體轉導後六天 TCR 在 CD8+ 細胞表面上的表達。使用慢病毒滴定法檢測四聚體在兩個單獨供體中的表達：A 圖中的供體 #1 和 B 圖中的供體 #2。X 軸顯示對數病毒稀釋因子。與圖 6 中所示的 R4-B4 載體結果相似，TCR 表達在用包含變體 D（根據 SEQ ID NO: 3 所述的突變體 WPRE）的慢病毒構建體轉導的 CD8+ 細胞中最高。
圖 8 顯示了用根據本公開一些實施方案所述的 R4-B4 慢病毒構建體轉導後六天 TCR 在 CD8+ 細胞 (A) 或 CD4+ 細胞 (B) 表面上的表達。使用慢病毒滴定法檢測四聚體的表達。X 軸顯示對數病毒稀釋因子。這些結果進一步說明，與用包含 WT WPRE（變體 A）或不包含 WPRE（變體 B）的慢病毒構建體轉導的CD8+ 細胞和 CD4+ 細胞相比，用含有突變體 WPRE（變體C 與 D）的慢病毒構建體轉導的細胞中 TCR 表達更高。
圖 9 顯示了用根據本公開一些實施方案所述的 R4-A1B4 慢病毒構建體轉導後六天 TCR 在 CD8+ 細胞 (A) 或 CD4+ 細胞 (B) 表面上的表達。使用慢病毒滴定法檢測四聚體的表達。X 軸顯示對數病毒稀釋因子。與圖 6-8 中所示的結果相似，TCR 表達在用包含變體 D（根據 SEQ ID NO: 3 所述的突變體 WPRE）的慢病毒構建體轉導的 CD8+ 和 CD4+ 細胞中最高。IMA203 為表達 R11KE TCR 並包含 WT WPRE 用作陰性對照的慢病毒構建體。
倍數擴增不受 WPRE 突變影響（圖 10）。對於在最佳 MOI 下檢測的所有慢病毒構建體，細胞活力均高於 90%（未顯示資料）。
WPRE 突變體表現出可相比的 TCR 四聚體表面表達，其被標準化為載體拷貝數（圖 11）或標準化為病毒滴度（圖 12）。
類似地，圖 13 顯示，WPRE 突變體表現出透過流式細胞術所確定的可相比的 TCR 四聚體表面表達。A 圖顯示了 CD4-CD8+/四聚體+ 的數據。B 圖顯示了 CD4+CD8-/四聚體+ 的數據。
圖 14 顯示了存在靶陽性腫瘤細胞的情況下 CD4+ 或 CD8+ T 細胞的細胞因子產生情況。A 圖顯示了 CD8+ T 細胞中干擾素-γ (IFN-γ) 的產生情況。B 圖顯示了 CD4+ T 細胞中 IFN-γ 的產生情況。C 圖顯示了 C8+ T 細胞中腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 的產生情況。D 圖顯示了 CD4+ T 細胞中 TNF-α 的產生情況。MCF7 = 陰性；SW982 = 460 CpC。
實施例 5
γδ T 細胞製造
為了分離 γδ T 細胞，一方面， γδ T 細胞可從受試者或受試者的複雜樣本中分離。一方面，複雜樣本可能是外周血樣本、臍帶血樣本、腫瘤、幹細胞前體、腫瘤活組織檢查物、組織、淋巴，或直接接觸外部環境的受試者的上皮部位樣本或源自幹前體細胞的樣本。γδ T 細胞可能直接從受試者的複雜樣本中分離，例如，透過用流式細胞術技術分選表達一種或多種細胞表面標誌物的 γδ T 細胞。野生型 γδ T 細胞可表現出許多可與 γδ T 細胞相關的抗原識別、抗原呈遞、共刺激和黏附分子。一種或多種細胞表面標誌物，例如，特異性 γδ TCR、抗原識別、抗原呈遞、配體、黏附分子或共刺激分子可用於從複雜樣本中分離野生型 γδ T 細胞。與 γδ T 細胞相關或由其表達的各種分子可用於從複雜樣本中分離 γδ T 細胞，例如，分離 Vδ1+、Vδ2+、Vδ3+ 細胞或其任何組合的混合群。
例如，可從受試者中收集外周血單核細胞，例如，採用血液成分單采機（包括 Ficoll-Paque™ PLUS (GE Healthcare) 系統或其他合適的裝置/系統。例如，可採用流式細胞術技術從收集的樣本中純化 γδ T 細胞或所需的 γδ T 細胞亞群。臍帶血細胞也可在受試者出生期間從臍帶血中獲得。
在收集的 γδ T細胞上表達的細胞表面標誌物的陽性和/或陰性選擇可用於直接分離 γδ T細胞或來自外周血樣本、臍帶血樣本、腫瘤、腫瘤活組織檢查、組織、淋巴或來自受試者上皮樣本的表達相似細胞表面標誌物的 γδ T 細胞群。例如，可以基於 CD2、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD44、Kit、TCR α、TCR β、TCR α、TCR δ、NKG2D、CD70、CD27、CD30、CD16、CD337 (NKp30)、CD336 (NKp46)、OX40、CD46、CCR7 和其他合適的細胞表面標誌物的陽性或陰性表達從複雜樣本中分離 γδ T 細胞。
圖 15 顯示了根據本公開內容實施方案的 γδ T 細胞製造。此過程可能包括從白細胞分離術產物中收集或獲得白細胞或 PBMC。白細胞分離術可能包括從供體收集全血並使用血液成分單采機分離組分。血液成分單采機分離出所需的血液組分，並將其餘部分返回供體的血液循環。例如，可以使用血液成分單采設備收集白細胞、血漿和血小板，並將紅細胞和中性粒細胞返回供體的血液循環。市售白細胞分離術產品可用於該程序。另一種方法是從血沉棕黃層獲得白細胞。為了分離血沉棕黃層，從供體獲得抗凝全血並離心。離心後，將血液分離成血漿、紅細胞和血沉棕黃層。血沉棕黃層是位於血漿和紅細胞層之間的層。與血沉棕黃層收集相比，白細胞分離術收集可以獲得更高的純度和顯著增加的單核細胞含量。白細胞分離術可能獲得的單核細胞含量通常比血沉棕黃層獲得的單核細胞含量高 20 倍。為了富集單核細胞，可能需要使用 Ficoll 梯度進行進一步分離。
為了從 PBMC 中消耗 αβ T 細胞，可透過磁分離將表達 αβ TCR 的細胞與 PBMC 分離，例如，使用塗覆有抗 αβ TCR 抗體的 CliniMACS® 磁珠，然後冷凍保存αβ TCR-T 細胞消耗的PBMC。為了製造「現成的」T 細胞產品，可在存在氨基二膦酸鹽（例如，唑來膦酸鹽）和/或異戊烯焦磷酸鹽 (IPP) 和/或細胞因子（例如白細胞介素2 (IL-2)、白細胞介素15 (IL-15) 和/或白細胞介素18 (IL-18)）和/或其他活化劑（例如，Toll 樣受體2 (TLR2) 配體）的情況下小/中等規模（例如，在 24 至 4-6 孔板或 T75/T175 燒瓶中）或大規模（例如，在 50ml-100 升袋中）解凍和活化冷凍保存的 αβ TCR-T 細胞消耗的PBMC，持續 1-10 天，例如 2-7 天。
圖 15 顯示了活化 T 細胞可以透過用病毒載體（例如：慢病毒載體）轉導，將相關外源基因（例如：針對特定癌抗原和 CD8 的 αβ TCR）表達到分離 γδ T 細胞中來進行改造。轉導可以進行一次或多次以實現小規模（例如 24 至 4-6 孔板）或中/大規模的穩定轉基因表達 1/2 至 5 天，例如 1 天。
圖 16 進一步顯示了轉導或改造的 γδ T 細胞的擴增可在存在細胞因子（例如：IL-2、IL-15、IL-18 等）的情況下以小/中等規模（例如：燒瓶/G-Rex）或大規模（例如：50ml-100 升袋）進行，持續 7-35 天，例如 7-28 天。然後可將擴增轉導的 T 細胞產物冷凍保存為「現成的」T 細胞產物，用於輸注到患者體內。
實施例 6
比較用具有不同 WPRE 的慢病毒載體 (LV) 轉導的 γδ T 細胞
圖 17 顯示了 γδ T 細胞製造工藝的實例，其中比較了用表達 TCR（結合至 SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 148)/MHC 複合體）和 CD8 且具有不同 WPRE 的 LV 轉導的 γδ T 細胞。簡言之，在第 0 天，在存在唑來膦酸鹽和細胞因子的情況下啟動 γδ T 細胞，然後在第 2 天用表達 TCR 和 CD8且具有野生型 (WT) WPRE (SEQ ID NO: 2) (A)、無WPRE (B)、WPREmut1 (SEQ ID NO:4) (C) 或 WPREmut2 (SEQ ID NO:3) (D) 的 LV在 3.75 µl、7.50 µl、15 µl、30 µl、60 µl 或 120 µl LV/1 x 106 細胞下進行轉導。批號 1 和批號 2 的 LV 滴度見表 5。 表 5
LV 批號 1 滴度 批號 2 滴度
WT WPRE   1.8 x 108 IU/ml 7.56 x 107 IU/ml
WPREmut1 1.4 x 108 IU/ml 6.47 x 107 IU/ml
WPREmut2 1.5 x 108 IU/ml 5.11 x 107 IU/ml
無 WPRE 2.3 x 108 IU/ml 5.85 x 107 IU/ml
表 5 顯示來自批號 1 的 LV 的滴度比來自批號 2 的 LV 的滴度高約 10 倍。在第 3 天，擴增轉導的細胞。在第 9 天，計數細胞並透過 FACS 分析以測量表達TCR/CD8 的 γδ T 細胞和整合轉基因的拷貝數。
來自批號 1 的 LV
在 FACS 分析中，抗 Vβ8 抗體和抗 CD8α 抗體用於染色 TCR+CD8α+ γδ T 細胞。圖 18A 顯示 Vβ8+CD8α+ γδ T 細胞的百分比隨著轉導中使用的 LV 量增加而增加。在用具有野生型 (WT) WPRE (A)、無 WPRE (B)、WPRE mut1 (C) 和 WPRE mut2 (D) 的 LV 轉導的 γδ T 細胞之間，轉導效率無顯著差異。未轉導 (NT) 細胞作為陰性對照。SLLQHLIGL (SEQ ID NO:148)/MHC 四聚體和抗 CD8α 抗體用於染色 TCR+CD8α+ γδ T 細胞。圖 18B 顯示四聚體+CD8α+ γδ T 細胞的百分比隨著轉導中使用的 LV 量增加而增加。在用具有野生型 (WT) WPRE (A)、無 WPRE (B)、WPRE mut1 (C) 和 WPRE mut2 (D) 的 LV 轉導的 γδ T 細胞之間，轉導效率無顯著差異。未轉導 (NT) 細胞作為陰性對照。然後將轉導效率標準化為 WT WPRE 的轉導效率。就 Vβ8+CD8α+ γδ T 細胞 %（圖 19A）和四聚體+CD8α+ γδ T 細胞 %（圖 19B）而言，在用具有野生型 (WT) WPRE (A)、無 WPRE (B)、WPRE mut1 (C) 和 WPRE mut2 (D) 的 LV 轉導的 γδ T 細胞之間的標準化轉導效率無顯著差異。這些結果表明，在用具有 WT WPRE、WPRE mut1、WPRE mut2 和無 WPRE 的 LV 轉導的 γδ T 細胞之間，轉導效率可相比。
圖 20 顯示了 γδ T 細胞中的整合轉基因拷貝數通常隨著轉導中使用的 LV 量增加而增加。在用具有野生型 (WT) WPRE (A)、無 WPRE (B)、WPRE mut1 (C) 和 WPRE mut2 (D) 的 LV 轉導的 γδ T 細胞之間，整合轉基因的拷貝數無顯著差異。在120 µl/1 x 106 細胞下，用無 WPRE (B) 的 LV 轉導的 γδ T 細胞似乎比具有不同 WPRE 的 LV 轉導的整合轉基因拷貝數略高。然後確定轉導效率/拷貝數比。圖 21 顯示 Vβ8+CD8α+ %/拷貝數比在用具有 WT WPRE、WPRE mut1、WPRE mut2 和無 WPRE 的 LV 轉導的 γδ T 細胞之間可相比。同樣，圖 22 顯示在用具有 WT WPRE、WPRE mut1、WPRE mut2 和無 WPRE 的 LV 轉導的 γδ T 細胞之間，四聚體+CD8α+ %/拷貝數比可相比。
來自批號 2 的 LV
如​​表 5 所示，來自批號 1 的 LV滴度比來自批號 2 的 LV 滴度高約 10 倍。通常，由於 LV 滴度較低，因此來自批號 2 的 LV 轉導的轉導效率低於來自批號 1 的 LV。圖 23 顯示，在 120 µl LV/1 x 106 細胞下，從不具有 WPRE 的 LV 轉導的供體 4和 5 獲得的 γδ T 細胞的Vβ8+CD8α+ γδ T 細胞 % 更高（分別為 11.7% 和 7.91%），高於 WT WPRE 轉導（分別為 6.90% 和 4.98%）、WPRE mut1 轉導（分別為 6.01% 和 3.71%）和 WPRE mut2 轉導（分別為 4.67% 和 3.60%）。
表 6 顯示了從具有 WT WPRE、無 WPRE、WPRE mut1 和 WPRE mut2 的 LV 轉導的供體 4 和 5 獲得的 γδ T 細胞的整合轉基因拷貝數。總體而言，由於 LV 滴度低，整合轉基因的拷貝數低於批號 1。 表 6
供體 #4
LV 包含 體積 µl/1 x 106 細胞 拷貝數
WT WPRE 120 0.73
60 0.50
30 0.10
15 0.06
7.5 0.15
3.25 0.05
WPREmut1 120 1.11
60 0.78
30 0.42
15 0.18
7.5 0.09
3.25 0.05
WPREmut2 120 0.85
60 0.74
30 0.35
15 0.16
7.5 0.11
3.25 0.06
無 WPRE 120 1.42
60 0.58
30 0.26
15 0.14
7.5 0.11
3.25 0.04
未轉導 不適用 0
供體 #5
LV 包含 體積 µl/1 x 106 細胞 拷貝數
WT WPRE 120 1.22
60 0.43
30 0.18
15 0.10
7.5 0.04
3.25 0.02
WPREmut1 120 0.46
60 0.33
30 0.34
15 0.13
7.5 0.06
3.25 0.04
WPREmut2 120 0.69
60 0.57
30 0.29
15 0.14
7.5 0.12
3.25 0.04
無 WPRE 120 0.68
60 0.55
30 0.27
15 0.32
15 0.20
7.5 0.00
未轉導   不適用 0
圖 24 顯示，在 120 µl LV/1 x 106 細胞下，在用具有 WT WPRE (A)、WPREmut1 (C)、WPREmut2 (D) 和無 WPRE (B) 的 LV 轉導的獲得自供體 4 和 5 的 γδ T 細胞之間，四聚體+CD8α+ %/拷貝數比可相比。圖 25 顯示了在 120 µl LV/1 x 106 細胞下，獲得自供體 3、4 和 5 的合併資料。這些合併結果顯示，在用具有 WT WPRE (A)、WPRE mut1 (C)、WPRE mut2 (D) 和無 WPRE (B) 的 LV 轉導的 γδ T 細胞中，四聚體+CD8α+ %/拷貝數比可相比。用無 WPRE 的 LV 轉導的 γδ T 細胞似乎比用具有不同 WPRE 的 LV 轉導的 γδ T 細胞的四聚體+CD8α+ %/拷貝數比變化小。
本專利說明書中引用的所有參考文獻均透過引用併入本文，如同每篇參考文獻被具體和單獨地指出透過引用併入。任何參考文獻的引用均為其在申請日之前的公開內容，不應解釋為認可本公開內容無權憑藉之前的發明而先於此類參考文獻。
應當理解，上述每個元素或者兩個或更多個元素一起也可以在與上述類型不同的其他類型方法中找到有用的應用。在無進一步分析的情況下，前述內容同樣充分地揭示本公開的要點，其他人可以透過應用當前知識，容易地將其適用於各種應用場合而不會遺漏從現有技術觀點來看公平構成所附請求項中闡述的本公開的通用或具體方面基本特點的特徵。前述實施方案僅作為示例呈現；本公開內容的範圍僅透過以下請求項進行限制。
無
圖 1 顯示了以下 WPRE 的比對：衍生自 GenBank 登錄號 J02440.1 中提出的土撥鼠肝炎病毒基因組的野生型 (WT) WPRE (SEQ ID NO: 1)、衍生自 GenBank 登錄號 J04514.1 中提出的土撥鼠乙型肝炎病毒（毒株 WHV8）的 WT WPRE (SEQ ID NO: 2)、其中 X 蛋白啟動子和起始密碼子突變的突變體 WPRE (SEQ ID NO: 4)、以及其中 WPRE 內多個起始密碼子突變並且 X 蛋白啟動子和 ORF 都被刪除的突變體 WPRE (SEQ ID NO: 3)。
圖 2 顯示了以下 WPRE 的比對：衍生自 GenBank 登錄號 J02440.1 中提出的土撥鼠肝炎病毒基因組的野生型 (WT) WPRE (SEQ ID NO: 1)、以及其中 WPRE 內多個起始密碼子突變並且 X 蛋白啟動子和 ORF 都被刪除的突變體 WPRE (SEQ ID NO: 3)。X 蛋白啟動子帶下劃線，X 蛋白起始密碼子為斜體字。
圖 3 顯示了根據本公開一些實施方案所述載體構建體的示意圖。
圖 4 顯示了根據本公開一些實施方案的示例性慢病毒構建體。
圖 5 顯示了用根據本公開一些實施方案所述的慢病毒構建體轉導後獲得的 HEK-293 T 滴度。變體 A 包含野生型 (WT) WPRE（陽性對照）；變體 B 不包含 WPRE（陰性對照）；變體 C 包含突變體 WPRE，其中 X 蛋白啟動子和起始密碼子突變 (SEQ ID NO: 4)；變體 D 包含突變體 WPRE，其中起始密碼子突變並且 X 蛋白啟動子和 ORF 都被刪除 (SEQ ID NO: 3)。
圖 6 顯示了用根據本公開一些實施方案所述的 R4-B4 慢病毒構建體轉導後六天 TCR 在 CD8+ 細胞表面上的表達。使用慢病毒滴定法檢測四聚體在兩個單獨供體中的表達：A 圖中的供體 #1 和 B 圖中的供體 #2。X 軸顯示對數病毒稀釋因子。變體 A 包含野生型 (WT) WPRE（陽性對照）；變體 B 不包含 WPRE（陰性對照）；變體 C 包含突變體 WPRE，其中 X 蛋白啟動子和起始密碼子突變 (SEQ ID NO: 4)；變體 D 包含突變體 WPRE，其中起始密碼子突變並且 X 蛋白啟動子和 ORF 都被刪除 (SEQ ID NO: 3)。
圖 7 顯示了用根據本公開一些實施方案所述的 R4-A1B4 慢病毒構建體轉導後六天 TCR 在 CD8+ 細胞表面上的表達。使用慢病毒滴定法檢測四聚體在兩個單獨供體中的表達：A 圖中的供體 #1 和 B 圖中的供體 #2。X 軸顯示對數病毒稀釋因子。變體 A 包含野生型 (WT) WPRE（陽性對照）；變體 B 不包含 WPRE（陰性對照）；變體 C 包含突變體 WPRE，其中 X 蛋白啟動子和起始密碼子突變 (SEQ ID NO: 4)；變體 D 包含突變體 WPRE，其中起始密碼子突變並且 X 蛋白啟動子和 ORF 都被刪除 (SEQ ID NO: 3)。
圖 8 顯示了用根據本公開一些實施方案所述的 R4-B4 慢病毒構建體轉導後六天 TCR 在 CD8+ 細胞 (A) 或 CD4+ 細胞 (B) 表面上的表達。使用慢病毒滴定法檢測四聚體的表達。X 軸顯示對數病毒稀釋因子。變體 A 包含野生型 (WT) WPRE（陽性對照）；變體 B 不包含 WPRE（陰性對照）；變體 C 包含突變體 WPRE，其中 X 蛋白啟動子和起始密碼子突變 (SEQ ID NO: 4)；變體 D 包含突變體 WPRE，其中起始密碼子突變並且 X 蛋白啟動子和 ORF 都被刪除 (SEQ ID NO: 3)。
圖 9 顯示了用根據本公開一些實施方案所述的 R4-A1B4 慢病毒構建體轉導後六天 TCR 在 CD8+ 細胞 (A) 或 CD4+ 細胞 (B) 表面上的表達。使用慢病毒滴定法檢測四聚體的表達。X 軸顯示對數病毒稀釋因子。變體 A 包含野生型 (WT) WPRE（陽性對照）；變體 B 不包含 WPRE（陰性對照）；變體 C 包含突變體 WPRE，其中 X 蛋白啟動子和起始密碼子突變 (SEQ ID NO: 4)；變體 D 包含突變體 WPRE，其中起始密碼子突變並且 X 蛋白啟動子和 ORF 都被刪除 (SEQ ID NO: 3)。
圖 10 顯示擴增倍數不受 WPRE 突變影響。對於在最佳 MOI 下檢測的所有慢病毒構建體，細胞活力均高於 90%（未顯示資料）。X 軸顯示的慢病毒縮寫描述可見圖 4。簡而言之，每個構建體縮寫中的最後一個字母對應於所使用的 WPRE。變體 A 包含野生型 (WT) WPRE（陽性對照）；變體 B 不包含 WPRE（陰性對照）；變體 C 包含突變體 WPRE，其中 X 蛋白啟動子和起始密碼子突變 (SEQ ID NO: 4)；變體 D 包含突變體 WPRE，其中起始密碼子突變並且 X 蛋白啟動子和 ORF 都被刪除 (SEQ ID NO: 3)。
圖 11 顯示 WPRE 突變體不改變標準化為載體拷貝數的 TCR 四聚體表達。呈現的資料為所有供體的平均值 +/- 標準差 (SD)。A 圖僅顯示 CD8+ 四聚體+ 的結果。B 圖顯示了總 CD3+ 四聚體+ 的結果。A = 野生型 (WT) WPRE（陽性對照）；B = 不包含 WPRE（陰性對照）；C = 突變體 WPRE，其中 X 蛋白啟動子和起始密碼子突變 (SEQ ID NO: 4)；D = 突變體 WPRE，其中起始密碼子突變並且 X 蛋白啟動子和 ORF 都被刪除 (SEQ ID NO: 3)。
圖 12 顯示，WPRE 突變體表現出被標準化為病毒滴度的可相比 TCR 四聚體表達。呈現的資料為所有供體的平均值 +/- 標準差 (SD)。A = 野生型 (WT) WPRE（陽性對照）；B = 不包含 WPRE（陰性對照）；C = 突變體 WPRE，其中 X 蛋白啟動子和起始密碼子突變 (SEQ ID NO: 4)；D = 突變體 WPRE，其中起始密碼子突變並且 X 蛋白啟動子和 ORF 都被刪除 (SEQ ID NO: 3)。
圖 13 顯示，WPRE 突變體表現出透過流式細胞術所確定的可相比 TCR 四聚體表面表達。A 圖顯示了 CD4-CD8+/四聚體+ 的數據。B 圖顯示了 CD4+CD8-/四聚體+ 的數據。A = 野生型 (WT) WPRE（陽性對照）；B = 不包含 WPRE（陰性對照）；C = 突變體 WPRE，其中 X 蛋白啟動子和起始密碼子突變 (SEQ ID NO: 4)；D = 突變體 WPRE，其中起始密碼子突變並且 X 蛋白啟動子和 ORF 都被刪除 (SEQ ID NO: 3)。
圖 14 顯示了存在靶陽性腫瘤細胞的情況下 CD4+ 或 CD8+ T 細胞的細胞因子產生情況。A 圖顯示了 CD8+ T 細胞中干擾素-γ (IFN-γ) 的產生情況。B 圖顯示了 CD4+ T 細胞中 IFN-γ 的產生情況。C 圖顯示了 C8+ T 細胞中腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 的產生情況。D 圖顯示了 CD4+ T 細胞中 TNF-α 的產生情況。MCF7 = 陰性；SW982 = 460 CpC。X 軸顯示的慢病毒縮寫描述可見圖 4。簡而言之，每個構建體縮寫中的最後一個字母對應於所使用的 WPRE。變體 A 包含野生型 (WT) WPRE（陽性對照）；變體 B 不包含 WPRE（陰性對照）；變體 C 包含突變體 WPRE，其中 X 蛋白啟動子和起始密碼子突變 (SEQ ID NO: 4)；變體 D 包含突變體 WPRE，其中起始密碼子突變並且 X 蛋白啟動子和 ORF 都被刪除 (SEQ ID NO: 3)。
圖 15 顯示了根據本公開一個實施方案的 γδ T細胞製造工藝。γδ T 細胞的製造可能包括收集或獲得白細胞或 PBMC（例如，白細胞分離術產物），從 PBMC 或白細胞分離術產物中消耗 αβ T細胞，然後啟動、轉導和擴增 γδ T 細胞。
圖 16 顯示了根據本公開另一實施方案所述的 T 細胞製造工藝。T 細胞製造可包括收集或獲得白細胞或 PMBC，例如白細胞分離術產物，然後啟動、轉導和擴增 T 細胞。
圖 17 顯示了根據本公開一實施方案所述的 γδ T 細胞製造工藝。
圖 18A 顯示了根據本公開一實施方案，WPRE 對 γδ T 細胞中轉基因表達的影響。
圖 18B 顯示了根據本公開另一實施方案，WPRE 對 γδ T 細胞中轉基因表達的影響。
圖 19A 顯示了根據本公開另一實施方案，WPRE 對 γδ T 細胞中轉基因表達的影響。
圖 19B 顯示了根據本公開另一實施方案，WPRE 對 γδ T 細胞中轉基因表達的影響。
圖 20 顯示了根據本公開一實施方案，WPRE 對 γδ T 細胞中整合轉基因拷貝數的影響。
圖 21 顯示了根據本公開一實施方案，WPRE 對 γδ T 細胞中轉基因表達/整合轉基因拷貝數比的影響。
圖 22 顯示了根據本公開另一實施方案，WPRE 對 γδ T 細胞中轉基因表達/整合轉基因拷貝數比的影響。
圖 23 顯示了根據本公開另一實施方案，WPRE 對 γδ T 細胞中轉基因表達的影響。
圖 24 顯示了根據本公開另一實施方案，WPRE 對 γδ T 細胞中轉基因表達/整合轉基因拷貝數比的影響。
圖 25 顯示了根據本公開另一實施方案，WPRE 對 γδ T 細胞中轉基因表達/整合轉基因拷貝數比的影響。
國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無 國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無
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Claims (34)

  1. 一種載體，其包含突變的土撥鼠轉錄後調控元件 (WPRE)，其中不包含 X蛋白啟動子，並且其中所述突變體 WPRE 不包含 X 蛋白開放閱讀框 (ORF)。
  2. 請求項 1 的載體，其中所述突變體 WPRE 包含一個或多個起始密碼子的突變。
  3. 請求項 1 或 2 的載體，其中所述突變體 WPRE 包含一個或多個起始密碼子的突變，其中所述一個或多個起始密碼子選自對應於根據 SEQ ID NO: 1 所述的野生型 WPRE核苷酸序列內核苷酸位置 106-108、152-154、245-247、272-274、283-285、362-364 和 603-605 的起始密碼子。
  4. 請求項 1 或 2 的載體，其中所述突變體 WPRE 包含一個或多個起始密碼子的突變，其中所述一個或多個起始密碼子選自對應於根據 SEQ ID NO: 2 所述的野生型 WPRE核苷酸序列內核苷酸位置 70-72、108-110、121-123、138-140、187-189 和 428-430 的起始密碼子。
  5. 請求項 2-4 中任一項的載體，其中一個或多個起始密碼子可在起始密碼子內的一個、兩個或所有三個位置處突變。
  6. 請求項 2-5 中任一項的載體，其中一個或多個起始密碼子由 ATG 突變為 TTG。
  7. 請求項 1-6 中任一項的載體，其中突變體 WPRE 序列與 SEQ ID NO: 3 具有 95% 或更高、96% 或更高、97% 或更高、98% 或更高、99% 或更高或 100% 的同一性。
  8. 請求項 1-7 中任一項的載體，其進一步包含編碼選自由以下組成的組中之蛋白質的核苷酸序列：酶、細胞因子、趨化因子、激素、抗體、抗氧化劑分子、工程化改造免疫球蛋白樣分子、單鏈抗體、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫調節分子、反義 RNA、小干擾 RNA (siRNA)、靶蛋白的反式顯性負性突變體、毒素、條件毒素、抗原、抗原受體、嵌合抗原受體、T 細胞受體 (TCR)、腫瘤抑制物蛋白、生長因子、膜蛋白、促血管和抗血管生成蛋白和肽、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶及其衍生物。
  9. 請求項 1-8 中任一項的載體，其包含編碼蛋白質 Z1 的第一核苷酸序列 S1 和編碼蛋白質 Z2 的第二核苷酸序列 S2，其中 Z1 和 Z2 形成第一二聚體。
  10. 請求項 9 的載體，其中第一二聚體 Z1Z2 為 T 細胞二聚體信號傳導模組、TCR、抗體、抗原受體或嵌合抗原受體。
  11. 請求項 9 或 10 的載體，其中第一二聚體 Z1Z2 為與靶抗原 (TA) 肽結合的TCR，並且其中靶抗原 (TA) 肽為病毒肽、細菌肽或腫瘤相關抗原 (TAA) 抗原肽。
  12. 請求項 9-11 中任一項的載體，其中所述第一二聚體 Z1Z2 選自 SEQ ID NO: 13 和 14、15 和 16、17 和 18、19 和 20、21 和 22、23 和 24、25 和 26、25 和 92、91 和 92、27 和 28、29 和 30、31 和 32、33 和 34、35 和 36、37 和 38、39 和 40、41 和 42、43 和 44、45 和 46、47 和 48、49 和 50、51 和 52、53 和 54、55 和 56、57 和 58、59 和 60、61 和 62、63 和 64、65 和 66、67 和 68、69 和 70、71 和 72、73 和 74、75 和 76、77 和 78、79 和 80、81 和 82、83 和 84、85 和 86、87 和 88 或 89 和 90。
  13. 請求項 9-12 中任一項的載體，其進一步包含編碼蛋白質 Z1 的第三核苷酸序列 S3 和編碼蛋白質 Y2 的第四核苷酸序列 S4，其中 Y1 和 Y2 形成第二二聚體，其中所述第一二聚體 Z1Z2 在結構上不同於第二二聚體 Y1Y2。
  14. 請求項 13 的載體，其中第二二聚體 Y1Y2 為 TCR 共受體。
  15. 請求項 13 或 14的載體，其中第二二聚體 Y1Y2 為 SEQ ID NO: 11 和 12。
  16. 請求項 1-15 中任一項的載體，其進一步包含編碼 2A 肽的核苷酸序列和編碼連接子肽的核苷酸序列。
  17. 請求項 1-16 中任一項的載體，其進一步包含編碼弗林蛋白酶肽 (SEQ ID NO:10) 的核苷酸序列。
  18. 請求項 1-17 中任一項的載體，其進一步包含選自巨細胞病毒 (CMV) 啟動子、磷酸甘油酸酯激酶 (PGK) 啟動子、髓磷脂鹼性蛋白 (MBP) 啟動子、神經膠質纖維酸性蛋白 (GFAP) 啟動子、包含骨髓增生性肉瘤病毒增強子的修飾 MoMuLV LTR (MNDU3)、泛素 C 啟動子、EF-1 α 啟動子或鼠幹細胞病毒 (MSCV) 啟動子的啟動子序列。
  19. 請求項 1-18 中任一項的載體，其為選自腺病毒、痘病毒、α 病毒、暈病毒、黃病毒、棒狀病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、皰疹病毒、副粘病毒或微小核糖核酸病毒的病毒載體。
  20. 請求項 19 的載體，其中載體用病毒的包膜蛋白進行假型化處理，所述病毒選自天然貓內源性病毒 (RD114)、RD114 的嵌合版本 (RD114TR)、長臂猿白血病病毒 (GALV)、GALV 的嵌合版本 (GALV-TR)、雙嗜性鼠白血病病毒 (MLV 4070A)、桿狀病毒 (GP64)、水皰性口炎病毒 (VSV-G)、雞瘟病毒 (FPV)、埃博拉病毒 (EboV)、狒狒逆轉錄病毒包膜糖蛋白 (BaEV) 或淋巴細胞性脈絡膜腦膜炎病毒 (LCMV)。
  21. 一種宿主細胞，其用請求項 1-20 中任一項的載體轉導。
  22. 一種生產表達治療蛋白的重組宿主細胞的方法，所述方法包括以下組成的步驟：(i) 在體外或離體將請求項 1-20 中任一項的載體引入勝任宿主細胞，(ii) 體外或離體培養獲得的重組宿主細胞，和 (iii) 任選地，選擇表達和/或分泌所述治療性蛋白質的細胞。
  23. 一種製備用於免疫療法的 T 細胞的方法，包括 從人體受試者的血液樣本中分離 T 細胞， 啟動分離的 T 細胞， 用請求項 1-20 中任一項的載體轉導啟動的 T 細胞，和 擴增轉導的 T 細胞。
  24. 請求項 23 的方法，其中，所述啟動在存在選自帕米膦酸、阿侖膦酸、唑來膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、恩加膦酸、任何前述項的鹽和/或其水合物的氨基二膦酸鹽下進行。
  25. 請求項 23 或 24 的方法，其中所述啟動和/或擴增進一步在存在細胞因子的情況下進行。
  26. 請求項 23-25 中任一項的方法，其中T 細胞為 γδ T 細胞。
  27. 請求項 23-26 中任一項的方法，其中，第一二聚體 Z1Z2 和/或第二二聚體 Y1Y2 在擴增的 T 細胞表面上共表達。
  28. 一種擴增 T 細胞群，其透過請求項 23-27 中任一項的方法製備。
  29. 一種治療癌症患者的方法，其包括向所述患者施用包含請求項 28 的擴增 T 細胞群的組合物， 其中，所述 T 細胞殺滅表面提呈與 MHC 分子複合的肽的癌細胞，其中所述肽選自 SEQ ID NO: 99-256， 其中所述癌症選自非小細胞肺癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、子宮癌、梅克爾細胞癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、結直腸癌、膀胱癌、腎癌、白血病、卵巢癌、食道癌、腦癌、胃癌和攝護腺癌組成的組。
  30. 一種在癌症患者中引發免疫應答的方法，其包括向所述患者施用包含請求項 28 的擴增 T 細胞群的組合物， 其中，所述 T 細胞殺滅表面提呈與 MHC 分子複合的肽的癌細胞，其中所述肽選自 SEQ ID NO: 99-256， 其中所述癌症選自非小細胞肺癌、小細胞肺癌、黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、子宮癌、梅克爾細胞癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、結直腸癌、膀胱癌、腎癌、白血病、卵巢癌、食道癌、腦癌、胃癌和攝護腺癌組成的組。
  31. 一種套件，包括： (i)  請求項 1-20 中任一項的載體和/或請求項 21 的宿主細胞和/或請求項 28 的擴增 T 細胞群； (ii) 任選地包裝材料；以及 (iii) 任選地包含於包裝材料內的標籤或藥物說明書。
  32. 一種製備用於免疫療法的 T 細胞的方法，包括 (i) 從人體受試者的血液樣本中分離 T 細胞， (ii) 在存在他汀類藥物的情況下啟動分離的 T 細胞， (iii) 用請求項 1-20 中任一項的載體轉導啟動的 T 細胞， 其中所述載體用 VSV-G 的包膜蛋白進行假型化處理，以及 (iv) 擴增轉導的 T 細胞。
  33. 請求項 32 的方法，其中，T 細胞包括 CD4+ T 細胞、CD8+ T 細胞、γδ T 細胞和/或天然殺傷 T 細胞。
  34. 請求項 32 或 33 的方法，其中，他汀類藥物選自阿托伐他汀、西伐他汀、達伐他汀、氟吲他汀、氟伐他汀、美伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、維洛他汀和瑞舒伐他汀。
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