CN115667535A - Wpre突变体构建体、组合物及其方法 - Google Patents

Wpre突变体构建体、组合物及其方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供突变的土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。具体而言，本发明涉及可在逆转录病毒载体系统中有效表达感兴趣的核苷酸的突变的WPRE序列。本发明还涉及向靶细胞递送和表达感兴趣的核苷酸的方法。

Description

WPRE突变体构建体、组合物及其方法
【技术领域】
相关申请的交叉引用
这是一项根据专利合作条约的国际申请，要求于2020年3月11日提交的美国临时专利申请号62/988,202的优先权，其内容透过引用整体并入本文。对电子方式提交的序列表的引用
序列表的正式副本透过EFS-Web以ASCII格式序列表电子提交，其档案名为“3000011-017977_Seq_Listing_ST25.txt”，创建于2020年3月8日，大小为247,691位元组，与说明书同时提交。此ASCII格式的文档中包含的序列表是说明书的一部分，在此以引用的方式全文并入。
背景
1.领域
本公开涉及一种载体，其包含突变的转录后调控元件。特别地，本发明涉及可以在逆转录病毒载体系统中有效表达目的核苷酸的突变WPRE序列。本发明还涉及在靶细胞中递送和表达目的核苷酸的方法。
2.背景
逆转录病毒载体，例如慢病毒载体，已被提出作为递送系统，用于(尤其是)将目的核苷酸转移至一个或多个目的位元点。
逆转录病毒载体的一个缺点(无论基于逆转录病毒还是慢病毒)是它们常常不能产生高水平的基因表达，特别是在体内。转录和转录后的许多步骤参与调节基因表达。因此，有可能透过添加已知可在转录后增加基因表达的元件来增强表达逆转录病毒载体递送的转基因。一个实例为表达盒内包含内含子(Choi,T.et al,(1991)Mol.Cell.Biol.9:3070-3074)。体外和体内进行的许多基因转移实验均已证明，存在内含子可以促进基因表达。
其他类型的元件也可用于在转录后刺激异源基因表达。这些元件与内含子不同，其优点在于它们无需剪接事件。例如，之前的研究表明，乙型肝炎病毒(HBV)转录后调控元件(PRE)和内含子在功能上等效(Huang,Z.M.and Yen,T.S.(1995)Mol.Cell.Biol.15:3864-3869)。与HBV密切相关的土拨鼠肝炎病毒(WHV)也带有PRE(以下简称WPRE；参见美国专利号6,136,597和6,287,814)。WPRE已显示比其HBV对应物更具活性，这与HBVPRE中未发现的其他顺式作用序列存在有关。在慢病毒载体中插入WPRE导致显著刺激跨越不同物种的多种细胞中报告基因(如萤光素酶和绿色萤光蛋白(GFP))的表达(Zufferey,R.et al.(1999)J.Virol 73:2886-2892)。刺激与转导细胞的周期状态无关。
WPRE包含三个顺式作用序列，其在增强表达水平中的功能起重要作用。但是，它也包含一个大约180个碱基对(bp)的片段，其包括WHV X蛋白开放阅读框的5'末端，以及与其相关的启动子。全长X蛋白与肿瘤发生有关(Flajolet,M.et al.(1998)J.Virol.72:6175-6180)。由于病毒DNA插入宿主基因组而导致myc家族致癌基因顺式启动已知是WHV介导致癌作用的关键机制(Buendia,M.A.(1994)In C.Brechot(ed.),Primary liver cancer:etiological and progression factors,p.211-224:CRC Press,Boca Raton,Fla.；Fourel,G.(1994)In F.Tronche and M.Yaniv(ed.),Liver gene expression,p.297-343；R.G.Landes Company,Austin,Tex.)。WHV X蛋白的致瘤可能性引起将WPRE纳入逆转录病毒载体的担忧，特别是对于体内应用。
之前的研究表明，WPRE内X蛋白开放阅读框(ORF)突变降低了X蛋白的致瘤活性，从而提高了其纳入逆转录病毒载体的安全性特征(参见，例如，US 7,419,829；Donello,J.E.et al.(1998)J.Virol.72(6):5085-5092；Schambach,A.et al.(2006)Gene Ther.13:641-645；Zanta-Boussif,M.A.et al.(2009)Gene Ther.16:605-619；Ou L.et al.(2016)Mol.Gen.Metab.Rep.8:87-93)。但是，已在各种突变体WPRE中观察到了对异源基因表达转录后刺激的不一致作用。通常，引入WPRE的突变程度越大，突变体WPRE刺激转录后异源基因表达的效果就越差。
因此，仍需要安全有效的WPRE用于逆转录病毒载体。
简要
一方面，本申请涉及突变WPRE序列，其用于，例如，逆转录病毒载体(其中WHV X蛋白表达减弱或不存在)。在一些实施方案中，WPRE内任何开放阅读框(ORF)的起始密码子发生突变，WHV X蛋白启动子被删除，且WHV X蛋白OFR被删除。在一些实施方案中，WHV X蛋白启动子和WHV X蛋白起始密码子突变。
在一些实施方案中，突变的WPRE序列在对应于根据SEQ ID NO:1所述的WT WPRE核苷酸序列内核苷酸位置106-108、152-154、245-247、272-274、283-285、362-364和603-605的一个或多个起始密码子处包含突变。在一些实施方案中，突变的WPRE序列在对应于根据SEQ ID NO:2所述的WT WPRE核苷酸序列内核苷酸位置70-72、108-110、121-123、138-140、187-189和428-430的一个或多个起始密码子处包含突变。
起始密码子可以在一个或多个起始密码子内的一个、两个或所有三个位置处突变。如果一个以上的起始密码子突变，则每个起始密码子突变可以彼此独立。也就是说，WPRE内突变的每个起始密码子不需要以相同的方式发生突变。在一些实施方案中，一个或多个起始密码子中的每一个在起始密码子内的一个位置处突变。例如，起始密码子的第一个核苷酸可以由“A”突变为“C”、“G”或“T”；或者起始密码子的第二个核苷酸可以由“T”突变为“A”、“C”或“G”，或者起始密码子的第三个核苷酸可以由“G”突变为“A”、“C”或“T”。在一些实施方案中，一个或多个起始密码子由“ATG”突变为“TTG”。在一些实施方案中，一个或多个起始密码子中的每一个由“ATG”突变为“TTG”。
在一些实施方案中，突变体WPRE序列选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
本申请还提出了包含本发明突变体WPRE的载体，例如逆转录病毒或慢病毒载体。此类载体可用于功能基因组学、药物发现、靶验证、产生蛋白质(例如治疗性蛋白质、疫苗、单克隆抗体)、基因疗法和治疗性疗法，例如用于适应性细胞疗法的基因递送系统。
在一些方面，提供了慢病毒转导载体，以及用于其制备的构建体，可用于把可表达的目的核苷酸序列(NOI)引入宿主细胞。慢病毒转导载体是一种包膜病毒粒子颗粒，其包含可表达的核苷酸序列，并能够穿透靶宿主细胞，从而将可表达的序列携带进入细胞。包膜的颗粒优选用来自另一种病毒物种(包括非慢病毒)的工程改造或天然病毒包膜蛋白进行假型化处理，其改变了天然慢病毒的宿主范围和感染性。如下文更详细所述，转导载体可用于广泛的应用中，包括例如用于蛋白质生产(包括疫苗生产)、用于基因治疗、用于递送治疗性多肽、用于递送siRNA、核酶、反义和其他功能性多核苷酸等。此类转导载体能够携带单个或多个基因并包括抑制序列(例如，RNAi或反义序列)。
在一些方面，载体包含一个以上的NOI。此类载体可以用于例如在宿主细胞中产生多聚体蛋白。在一些方面，载体包含编码蛋白质Z1的第一核苷酸序列S1和编码蛋白质Z2的第二核苷酸序列S2，其中Z1和Z2形成二聚体。载体可以进一步包含编码蛋白质Y1的第三核苷酸序列S3和编码蛋白质Y2的第四核苷酸序列S4，其中Y1和Y2形成第二二聚体。
另一方面，载体可以进一步包括编码2A肽的第五核苷酸序列S5和编码连接子肽的第六核苷酸序列S6，其中S5和S6位于S1和S2、S1和S3、S1和S4、S2和S3、S2和S4和/或S3和S4之间。
在一些方面，2A肽可以选自P2A(SEQ ID NO:6)、T2A(SEQ ID NO:7)、E2A(SEQ IDNO:8)或F2A(SEQ ID NO:9)。
在一些方面，连接子肽是长度为3至10个氨基酸长度的任何肽。在一些方面，连接子肽可以为GSG或SGSG(SEQ ID NO:5)。
另一方面，所述载体可以进一步包含编码弗林蛋白酶肽(SEQ ID NO:10)的第七核苷酸序列S7，所述弗林蛋白酶肽位于S1和S2、S1和S3、S1和S4、S2和S3、S2和S4和/或S3和S4之间。
另一方面，载体可以进一步包括控制S1、S2、S3、S4、S5、S6和/或S7转录的启动子序列，其中所述启动子序列选自巨细胞病毒(CMV)启动子、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子、髓磷脂碱性蛋白(MBP)启动子、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、包含骨髓增生性肉瘤病毒增强子的修饰MoMuLV LTR(MNDU3)、泛素C启动子、EF-1α启动子或鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。
在一些方面，第一二聚体Z1Z2可以选自SEQ ID NO:13和14、15和16、17和18、19和20、21和22、23和24、25和26、25和92、91和92、27和28、29和30、31和32、33和34、35和36、37和38、39和40、41和42、43和44、45和46、47和48、49和50、51和52、53和54、55和56、57和58、59和60、61和62、63和64、65和66、67和68、69和70、71和72、73和74、75和76、77和78、79和80、81和82、83和84、85和86、87和88或89和90。
在一些方面，第二二聚体Y1Y2在SEQ ID NO:11和12中列出。
另一方面，病毒载体选自腺病毒、痘病毒、α病毒、晕病毒、黄病毒、棒状病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、副粘病毒或微小核糖核酸病毒。
另一方面，载体用病毒的包膜蛋白进行假型化处理，所述病毒选自天然猫内源性病毒(RD114)、RD114的嵌合版本(RD114TR)、长臂猿白血病病毒(GALV)、GALV的嵌合版本(GALV-TR)、双嗜性鼠白血病病毒(MLV 4070A)、杆状病毒(GP64)、水疱性口炎病毒(VSV-G)、鸡瘟病毒(FPV)、埃博拉病毒(EboV)、狒狒逆转录病毒包膜糖蛋白(BaEV)或淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒(LCMV)。
一方面，本公开涉及一种制备用于免疫疗法的T细胞的方法，包括从人体受试者的血液样本中分离T细胞、在存在氨基二膦酸盐的情况下启动分离的T细胞、用本文所述的载体转导启动的T细胞、扩增转导的T细胞。
另一方面，可以从白细胞分离术人样本中分离T细胞。
另一方面，氨基二膦酸盐可选自帕米膦酸、阿仑膦酸、唑来膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、恩加膦酸、其盐和/或其水合物。
另一方面，可用OKT3和抗CD28启动T细胞。
另一方面，所述启动可以进一步在存在人重组白介素2(IL-2)、人重组白介素15(IL-15)、人重组白介素7(IL-7)的情况下进行。
另一方面，扩增可以在存在IL-2和IL-15或IL-15和IL-7的情况下进行。
另一方面，T细胞可以为γδT细胞或αβT细胞。
另一方面，第一二聚体Z1Z2和第二二聚体Y1Y2在扩增的T细胞表面上共表达。
另一方面，本公开涉及透过以上方面的方法制备的扩增T细胞群。
在一些方面，所述组合物进一步包括佐剂。
在一些方面、佐剂选自抗-CD40抗体、咪喹莫特、雷西喹莫特、GM-CSF、环磷醯胺、舒尼替尼、贝伐单抗、阿特珠单抗、干扰素-α、干扰素-β、CpG寡核苷酸和衍生物、聚(I:C)和衍生物、RNA、西地那非、含聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)的颗粒制剂、病毒体、白介素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21和IL-23中之一或多者。
一方面，本公开涉及一种治疗癌症患者的方法，其包括向所述患者施用包含本文所述扩增T细胞群体的组合物，其中所述T细胞杀灭表面提呈与MHC分子复合的肽的癌细胞，其中所述肽选自SEQ ID NO:99-256中的任何一个，其中所述癌症选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、子宫癌、梅克尔细胞癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、结直肠癌、膀胱癌、肾癌、白血病、卵巢癌、食道癌、脑癌、胃癌和前列腺癌组成的组。
一方面，本公开涉及本文所述的T细胞或包含本文所述扩增T细胞群的组合物，用于治疗癌症，其中所述癌症选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、子宫癌、梅克尔细胞癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、结直肠癌、膀胱癌、肾癌、白血病、卵巢癌、食道癌、脑癌、胃癌和前列腺癌组成的组。
另一方面，本发明涉及本文所述的T细胞或包含本文所述T细胞的组合物在制备药物中的用途。
另一方面，本发明涉及本文所述的T细胞或包含本文所述T细胞的组合物在制备用于治疗癌症(特别是治疗本文上述癌症)的药物中的用途。
一方面，本公开涉及一种在癌症患者中引发免疫应答的方法，其包括向所述患者施用包含本文所述扩增T细胞群体的组合物，其中所述T细胞杀灭表面提呈与MHC分子复合的肽的癌细胞，其中所述肽选自SEQ ID NO:99-256中的任何一个，其中所述癌症选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、子宫癌、梅克尔细胞癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、结直肠癌、膀胱癌、肾癌、白血病、卵巢癌、食道癌、脑癌、胃癌和前列腺癌组成的组。
另一方面，免疫应答包含细胞毒性T细胞应答。
最后，本发明还提出了套件，其包含至少一种本发明的载体。在一实施方案中，套件包含至少一种本发明的载体、任选地包装材料、以及任选地包含于包装材料内的标签或药物说明书。
一方面，本公开涉及一种制备用于免疫疗法的T细胞的方法，包括从人体受试者的血液样本中分离T细胞，在存在他汀类药物的情况下启动分离的T细胞，用本公开的载体转导启动的T细胞(其中所述载体可以用本文所述的任何包膜蛋白，包括水疱性口炎病毒(VSV-G)和RD114TR)进行假型化处理)，并扩增转导的T细胞。
另一方面，T细胞可包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、γδT细胞和/或天然杀伤T细胞。
另一方面，他汀类药物可以选自阿托伐他汀、西伐他汀、达伐他汀、氟吲他汀、氟伐他汀、美伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、维洛他汀和瑞舒伐他汀。
图式简单说明
图1显示了以下WPRE的比对：衍生自GenBank登录号J02440.1中提出的土拨鼠肝炎病毒基因组的野生型(WT)WPRE(SEQ ID NO:1)、衍生自GenBank登录号J04514.1中提出的土拨鼠乙型肝炎病毒(毒株WHV8)的WT WPRE(SEQ ID NO:2)、其中X蛋白启动子和起始密码子突变的突变体WPRE(SEQ ID NO:4)、以及其中WPRE内多个起始密码子突变并且X蛋白启动子和ORF都被删除的突变体WPRE(SEQ ID NO:3)。
图2显示了以下WPRE的比对：衍生自GenBank登录号J02440.1中提出的土拨鼠肝炎病毒基因组的野生型(WT)WPRE(SEQ ID NO:1)、以及其中WPRE内多个起始密码子突变并且X蛋白启动子和ORF都被删除的突变体WPRE(SEQ ID NO:3)。X蛋白启动子带下划线，X蛋白起始密码子为斜体字。
图3显示了根据本公开一些实施方案所述载体构建体的示意图。
图4显示了根据本公开一些实施方案的示例性慢病毒构建体。
图5显示了用根据本公开一些实施方案所述的慢病毒构建体转导后获得的HEK-293 T滴度。变体A包含野生型(WT)WPRE(阳性对照)；变体B不包含WPRE(阴性对照)；变体C包含突变体WPRE，其中X蛋白启动子和起始密码子突变(SEQ ID NO:4)；变体D包含突变体WPRE，其中起始密码子突变并且X蛋白启动子和ORF都被删除(SEQ ID NO:3)。
图6显示了用根据本公开一些实施方案所述的R4-B4慢病毒构建体转导后六天TCR在CD8+细胞表面上的表达。使用慢病毒滴定法检测四聚体在两个单独供体中的表达：A图中的供体#1和B图中的供体#2。X轴显示对数病毒稀释因子。变体A包含野生型(WT)WPRE(阳性对照)；变体B不包含WPRE(阴性对照)；变体C包含突变体WPRE，其中X蛋白启动子和起始密码子突变(SEQ ID NO:4)；变体D包含突变体WPRE，其中起始密码子突变并且X蛋白启动子和ORF都被删除(SEQ ID NO:3)。
图7显示了用根据本公开一些实施方案所述的R4-A1B4慢病毒构建体转导后六天TCR在CD8+细胞表面上的表达。使用慢病毒滴定法检测四聚体在两个单独供体中的表达：A图中的供体#1和B图中的供体#2。X轴显示对数病毒稀释因子。变体A包含野生型(WT)WPRE(阳性对照)；变体B不包含WPRE(阴性对照)；变体C包含突变体WPRE，其中X蛋白启动子和起始密码子突变(SEQ ID NO:4)；变体D包含突变体WPRE，其中起始密码子突变并且X蛋白启动子和ORF都被删除(SEQ ID NO:3)。
图8显示了用根据本公开一些实施方案所述的R4-B4慢病毒构建体转导后六天TCR在CD8+细胞(A)或CD4+细胞(B)表面上的表达。使用慢病毒滴定法检测四聚体的表达。X轴显示对数病毒稀释因子。变体A包含野生型(WT)WPRE(阳性对照)；变体B不包含WPRE(阴性对照)；变体C包含突变体WPRE，其中X蛋白启动子和起始密码子突变(SEQ ID NO:4)；变体D包含突变体WPRE，其中起始密码子突变并且X蛋白启动子和ORF都被删除(SEQ ID NO:3)。
图9显示了用根据本公开一些实施方案所述的R4-A1B4慢病毒构建体转导后六天TCR在CD8+细胞(A)或CD4+细胞(B)表面上的表达。使用慢病毒滴定法检测四聚体的表达。X轴显示对数病毒稀释因子。变体A包含野生型(WT)WPRE(阳性对照)；变体B不包含WPRE(阴性对照)；变体C包含突变体WPRE，其中X蛋白启动子和起始密码子突变(SEQ ID NO:4)；变体D包含突变体WPRE，其中起始密码子突变并且X蛋白启动子和ORF都被删除(SEQ ID NO:3)。
图10显示扩增倍数不受WPRE突变影响。对于在最佳MOI下检测的所有慢病毒构建体，细胞活力均高于90％(未显示资料)。X轴显示的慢病毒缩写描述可见图4。简而言之，每个构建体缩写中的最后一个字母对应于所使用的WPRE。变体A包含野生型(WT)WPRE(阳性对照)；变体B不包含WPRE(阴性对照)；变体C包含突变体WPRE，其中X蛋白启动子和起始密码子突变(SEQ ID NO:4)；变体D包含突变体WPRE，其中起始密码子突变并且X蛋白启动子和ORF都被删除(SEQ ID NO:3)。
图11显示WPRE突变体不改变标准化为载体拷贝数的TCR四聚体表达。呈现的资料为所有供体的平均值+/-标准差(SD)。A图仅显示CD8+四聚体+的结果。B图显示了总CD3+四聚体+的结果。A＝野生型(WT)WPRE(阳性对照)；B＝不包含WPRE(阴性对照)；C＝突变体WPRE，其中X蛋白启动子和起始密码子突变(SEQ ID NO:4)；D＝突变体WPRE，其中起始密码子突变并且X蛋白启动子和ORF都被删除(SEQ ID NO:3)。
图12显示，WPRE突变体表现出被标准化为病毒滴度的可相比TCR四聚体表达。呈现的资料为所有供体的平均值+/-标准差(SD)。A＝野生型(WT)WPRE(阳性对照)；B＝不包含WPRE(阴性对照)；C＝突变体WPRE，其中X蛋白启动子和起始密码子突变(SEQ ID NO:4)；D＝突变体WPRE，其中起始密码子突变并且X蛋白启动子和ORF都被删除(SEQ ID NO:3)。
图13显示，WPRE突变体表现出透过流式细胞术所确定的可相比TCR四聚体表面表达。A图显示了CD4-CD8+/四聚体+的数据。B图显示了CD4+CD8-/四聚体+的数据。A＝野生型(WT)WPRE(阳性对照)；B＝不包含WPRE(阴性对照)；C＝突变体WPRE，其中X蛋白启动子和起始密码子突变(SEQ ID NO:4)；D＝突变体WPRE，其中起始密码子突变并且X蛋白启动子和ORF都被删除(SEQ ID NO:3)。
图14显示了存在靶阳性肿瘤细胞的情况下CD4+或CD8+T细胞的细胞因子产生情况。A图显示了CD8+T细胞中干扰素-γ(IFN-γ)的产生情况。B图显示了CD4+T细胞中IFN-γ的产生情况。C图显示了C8+T细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的产生情况。D图显示了CD4+T细胞中TNF-α的产生情况。MCF7＝阴性；SW982＝460CpC。X轴显示的慢病毒缩写描述可见图4。简而言之，每个构建体缩写中的最后一个字母对应于所使用的WPRE。变体A包含野生型(WT)WPRE(阳性对照)；变体B不包含WPRE(阴性对照)；变体C包含突变体WPRE，其中X蛋白启动子和起始密码子突变(SEQ ID NO:4)；变体D包含突变体WPRE，其中起始密码子突变并且X蛋白启动子和ORF都被删除(SEQ ID NO:3)。
图15显示了根据本公开一个实施方案的γδT细胞制造工艺。γδT细胞的制造可能包括收集或获得白细胞或PBMC(例如，白细胞分离术产物)，从PBMC或白细胞分离术产物中消耗αβT细胞，然后启动、转导和扩增γδT细胞。
图16显示了根据本公开另一实施方案所述的T细胞制造工艺。T细胞制造可包括收集或获得白细胞或PBMC，例如白细胞分离术产物，然后启动、转导和扩增T细胞。
图17显示了根据本公开一实施方案所述的γδT细胞制造工艺。
图18A显示了根据本公开一实施方案，WPRE对γδT细胞中转基因表达的影响。
图18B显示了根据本公开另一实施方案，WPRE对γδT细胞中转基因表达的影响。
图19A显示了根据本公开另一实施方案，WPRE对γδT细胞中转基因表达的影响。
图19B显示了根据本公开另一实施方案，WPRE对γδT细胞中转基因表达的影响。
图20显示了根据本公开一实施方案，WPRE对γδT细胞中整合转基因拷贝数的影响。
图21显示了根据本公开一实施方案，WPRE对γδT细胞中转基因表达/整合转基因拷贝数比的影响。
图22显示了根据本公开另一实施方案，WPRE对γδT细胞中转基因表达/整合转基因拷贝数比的影响。
图23显示了根据本公开另一实施方案，WPRE对γδT细胞中转基因表达的影响。
图24显示了根据本公开另一实施方案，WPRE对γδT细胞中转基因表达/整合转基因拷贝数比的影响。
图25显示了根据本公开另一实施方案，WPRE对γδT细胞中转基因表达/整合转基因拷贝数比的影响。
详细说明
在进一步描述本公开之前，应当理解的是，本公开不限于以下所述的本公开特定实施方案，因为可能对特定实施方案作出变化并且仍在所附权利要求的范围内。还应当理解的是，所用的术语用于描述特定实施方案之目的，而不是为了限制。相反，本公开的范围由所附权利要求确定。
如本文所用，术语“可操作地连接”意指所述的组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系。
如本文所用，术语“自裂解2A肽”系指共同翻译作用的相对短肽(长约20个氨基酸的量级，取决于来源的病毒)，透过阻止甘氨酸和最后一个脯氨酸之间的正常肽键的形成而导致核糖体跳至下一个密码子，而新生肽在Gly和Pro之间裂解。裂解后，短2A肽维持与“上游”蛋白的C端融合，而脯氨酸被添加至“下游”蛋白的N端。自裂解2A肽可以选自猪铁士古病毒1(P2A)、马鼻炎A病毒(E2A)、明脉扁刺蛾病毒(T2A)、口蹄疫病毒(F2A)或其任意组合(参见例如，Kim et al.,PLOS One 6:e18556,2011，其内容包括2A核酸和氨基酸序列，透过引用整体并入本文)。透过在自裂解2A序列之前添加连接子序列(例如GSG或SGSG(SEQ ID NO:5))，这可以使生物活性蛋白(例如TCR)有效合成。
如本文所用，术语“启动子”系指允许基因转录的通常位于基因上游(朝向有义链的5'区域)的DNA的调节区。启动子包含称为转录因子的蛋白质识别的特定DNA序列和应答元件。这些因子与启动子序列结合，募集RNA聚合酶——从基因编码区合成RNA的酶。例如，本文使用的启动子序列可以选自巨细胞病毒(CMV)启动子、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子、髓磷脂碱性蛋白(MBP)启动子、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、包含骨髓增生性肉瘤病毒增强子的修饰MoMuLV LTR(MNDU3)、泛素C启动子、EF-1α启动子或鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。
本文所用的术语“顺反子”系指DNA分子的一部分，其指定一条多肽链的形成，即编码一条多肽链。例如，“双顺反子”系指DNA分子的两个部分，其指定两条多肽链的形成，即编码两条多肽链。“三顺反子”系指DNA分子的三个部分，其指定三条多肽链的形成，即编码三条多肽链；以此类推。
本文所用的术语“多顺反子RNA”或“多顺反子mRNA”系指包含基因资讯以翻译成几种蛋白质的RNA。相反，单顺反子RNA包含仅翻译单个蛋白质的基因资讯。在本公开背景下，从慢病毒转录的多顺反子RNA可翻译为两种蛋白质，例如TCRα链和TCRβ链。
本文所用的术语“串联排列”系指基因在核酸序列上的单个文档中相邻、一个在另一个之后或后面排列。基因在核酸序列上相邻连接在一起，每个基因的编码链(有义链)在核酸序列上连接在一起。
本文所用的术语“有义链”系指被翻译或可翻译成蛋白质的基因DNA链。当基因相对于核酸序列中的启动子沿“有义方向”定向时，“有义链”位于启动子下游的5'端，其中编码蛋白质的核酸的第一个密码子位于启动子的近端，而最后一个密码子位于启动子的远端。
本文所用的术语“病毒载体”系指核酸载体构建体，其包括至少一种病毒来源的元件，有被包装入病毒载体颗粒的能力，并编码至少一种外源核酸。载体和/或颗粒可用于在体外或体内将任何核酸转移至细胞之目的。多种形式的病毒载体为本领域已知。术语“病毒粒子”指单个感染性病毒颗粒。“病毒载体”、“病毒载体颗粒”和“病毒颗粒”也指具有其DNA或RNA核心和蛋白质外壳如同其存在于细胞外部的完整病毒颗粒。例如，病毒载体可选自腺病毒、痘病毒、α病毒、晕病毒、黄病毒、棒状病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、副粘病毒或微小核糖核酸病毒。
术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域公认的，包括胸腺细胞、幼稚T淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静置T淋巴细胞或启动T淋巴细胞。适用于特定实施方案的示例性T细胞群包括但不限于辅助性T细胞(HTL；CD4+T细胞)、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞、CD4-CD8-T细胞、自然杀伤T细胞、γδT细胞或其他任何子集的T细胞。适用于特定实施方案的其他示例性T细胞群包括但不限于表达以下一种或多种标志物的T细胞：CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD127、CD197和HLA-DR，如果需要，可透过阳性或阴性选择技术进一步分离。
术语“他汀类药物”，“伐他汀类药物”或在本文中可互换使用的“3-羟基-3-甲基戊二醯辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂”系指抑制酶3-羟基-3-甲基戊二醯辅酶A(HMG-CoA)还原酶的药剂。该酶参与HMG-CoA转化为甲羟戊酸，这是胆固醇生物合成的步骤之一。此类抑制很容易根据本领域技术人员众所周知的标准测定方法确定。
可根据本公开使用的优选他汀类药物包括：阿托伐他汀，其公开于美国专利号4,681,893；阿托伐他汀钙，公开于美国专利号5,273,995；西伐他汀，公开于美国专利号5,502,199；达伐他汀，公开于美国专利号5,316,765；氟吲他汀，公开于美国专利号4,915,954；氟伐他汀，公开于美国专利号4,739,073；洛伐他汀，公开于美国专利号4,231,938；美伐他汀，公开于美国专利号3,983,140；普伐他汀，公开于美国专利号4,346,227；辛伐他汀，公开于美国专利号4,444,784；维洛他汀，公开于美国专利号4,448,784和美国专利号4,450,171；瑞舒伐他汀，公开于美国专利号6,858,618和美国专利号7,511,140。这些专利中的每一项内容均透过引用整体并入本文。优选的3-羟基-3-甲基戊二醯辅酶A还原酶抑制剂可包括阿托伐他汀、阿托伐他汀钙(也称为
Figure GDA0003987788970000221
)、洛伐他汀(也称为
Figure GDA0003987788970000231
)、普伐他汀(也称为
Figure GDA0003987788970000232
)、辛伐他汀(也称为
Figure GDA0003987788970000233
)和瑞舒伐他汀。
转录后调控元件
土拨鼠肝炎病毒(WHV)转录后调控元件(WPRE)可以增强来自多种不同载体类型的表达，包括慢病毒载体(美国专利号6,136,597；6,287,814；Zufferey,R.,et al.(1999).J.Virol.73:2886-92)。若不希望受到理论的束缚，这种增强被认为是由于在转录后水平上RNA加工改善所致，从而导致核转录本水平提高。mRNA稳定性增加两倍也有助于这种增强(Zufferey,R.,et al.同上)。据报告，含WPRE的转录本与不含WPRE的转录本相比，蛋白质表达增强水平约为2至5倍，且与转录本水平提高密切相关。这已经用许多不同的转基因得到了证明(Zufferey,R.,et al.同上)。
WPRE包含三个顺式作用序列，其在增强表达水平中的功能起重要作用。另外，它包含约一个180bp的片段，其包含WHVX蛋白ORF的5'端(全长ORF为425bp)及其相关的启动子。来自X启动子启始的转录本翻译导致形成代表X蛋白NH2末端60个氨基酸的蛋白。这种截短的X蛋白可以促进肿瘤发生，特别是，如果截短的X蛋白序列在特定位点整合至宿主细胞基因组中(Balsano,C.et al.,(1991)Biochem.Biophys Res.Commun.176:985-92；Flajolet,M.et al.(1998)J.Virol.72:6175-80；Zheng,Y.W.,et al.(1994)J.Biol.Chem.269:22593-8:Runkel,L.,et al.(1993)Virology197:529-36)。因此，如果截短的X蛋白被递送至目的细胞中，则其表达可促进肿瘤发生，从而排除野生型WPRE序列的安全使用。
本文所用的WPRE的“X区”定义为包含X蛋白ORF的至少前60个氨基酸，包括翻译起始密码子及其相关启动子。“X蛋白”在本文中定义为由本文所述的X蛋白ORF编码的截短X蛋白。
本发明人已将突变引入WPRE序列中，以防止X蛋白的表达。在一些方面，这些突变被引入与WPRE序列一起出现的一个或多个起始密码子。在一些方面，X蛋白启动子和ORF从WPRE序列中删除，形成截短的WPRE序列。另一方面，X蛋白启动子和X蛋白起始密码子突变。
本文所用的“突变”可包含一次或多次核苷酸删除、添加或取代。
在一些方面，突变的WPRE序列在对应于根据SEQ ID NO:1所述的WT WPRE核苷酸序列内核苷酸位置106-108、152-154、245-247、272-274、283-285、362-364和603-605的一个或多个起始密码子处包含突变。在一些方面，突变的WPRE序列在对应于根据SEQ ID NO:1所述的WT WPRE核苷酸序列内核苷酸位置106-108、152-154、245-247、272-274、283-285、362-364和603-605的一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个起始密码子处包含突变。在一些方面，突变的WPRE序列在对应于根据SEQ ID NO:1所述的WT WPRE核苷酸序列内核苷酸位置106-108、152-154、245-247、272-274、283-285、362-364和603-605的每个起始密码子处包含突变。
另一方面，突变的WPRE序列在对应于根据SEQ ID NO:2所述的WT WPRE核苷酸序列内核苷酸位置70-72、108-110、121-123、138-140、187-189和428-430的一个或多个起始密码子处包含突变。在一些方面，突变的WPRE序列在对应于根据SEQ ID NO:2所述的WT WPRE核苷酸序列内核苷酸位置70-72、108-110、121-123、138-140、187-189和428-430的一个、两个、三个、四个、五个或全部六个起始密码子处包含突变。在一些方面，突变的WPRE序列在对应于根据SEQ ID NO:2所述的WT WPRE核苷酸序列内核苷酸位置70-72、108-110、121-123、138-140、187-189和428-430的每个起始密码子处包含突变。
一个或多个起始密码子可以在起始密码子内的一个、两个或所有三个位置处突变。如果一个以上的起始密码子突变，则每个起始密码子突变可以彼此独立。也就是说，WPRE内突变的每个起始密码子不需要以相同的方式发生突变。在一些实施方案中，一个或多个起始密码子中的每一个在起始密码子内的一个位置处突变。例如，起始密码子的第一个核苷酸可以由“A”突变为“C“、“G”或“T”；或者起始密码子的第二个核苷酸可以由“T”突变为“A”、“C”或“G”，或者起始密码子的第三个核苷酸可以由“G”突变为“A”、“C”或“T”。
在一些实施方案中，一个或多个起始密码子中的每一个在起始密码子内的两个或所有三个位置处突变。例如，起始密码子的第一个核苷酸可以由“A”突变为“C”、“G”或“T”；和/或起始密码子的第二个核苷酸可以由“T”突变为“A”、“C”或“G”，和/或起始密码子的第三个核苷酸可以由“G”突变为“A”、“C”或“T”。
在一些实施方案中，一个或多个起始密码子由“ATG”突变为“TTG”。在一些实施方案中，一个或多个起始密码子中的每一个由“ATG”突变为“TTG”。
一方面，突变体WPRE序列选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。另一方面，突变体WPRE序列与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的同一性。在一些方面，突变体WPRE序列与SEQ ID NO:3具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高或100％的同一性，其中突变体WPRE序列不包含“ATG”。在一些方面，突变体WPRE序列与SEQ ID NO:3具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高或100％的同一性，其中突变体WPRE序列不包含“ATG”，但核苷酸位置65-67处除外。
在一些方面，WPRE序列与SEQ ID NO:4具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高或100％的同一性，其中核苷酸位置413-417为“ATCAT”，而核苷酸位置428-430不是“ATG”。
逆转录病毒
使用病毒载体进行基因或细胞治疗的概念在例如Verma and Somia(1997)Nature389:239-242一文中得到认可，其内容被整体并入。
一方面，病毒系指天然存在的病毒以及人造病毒。根据本公开一些实施方案的病毒可能是包膜病毒或无包膜病毒。细小病毒(例如AAV)是无包膜病毒的实例。在一优选实施方案中，病毒可能是包膜病毒。在优选实施方案中，病毒可能是逆转录病毒，特别是慢病毒。可以促进真核细胞病毒感染的病毒包膜蛋白可能包括HIV-1衍生慢病毒载体(LV)，这些载体用水疱性口炎病毒(VSV-G)的包膜糖蛋白(GP)、修饰的猫内源性逆转录病毒(RD114TR)(SEQ ID NO:95)和修饰的长臂猿白血病病毒(GALVTR)处理成为假型。这些包膜蛋白可以有效地促进其他病毒的进入，例如细小病毒，包括腺相关病毒(AAV)，从而证明它们的广泛效率。例如，可使用其他病毒包膜蛋白，包括Moloney鼠白血病病毒(MLV)4070env(如Mertenet al.,J.Virol.79:834-840,2005一文中所述；其内容透过引用并入本文)、RD114env、嵌合包膜蛋白RD114pro或RDpro(透过用HIV-1基质/衣壳(MA/CA)切割序列取代RD114的R肽切割序列构建的RD114-HIV嵌合体，如Bell et al.Experimental Biology and Medicine2010；235:1269–1276一文中所述；其内容透过引用并入本文)、杆状病毒GP64env(如Wanget al.J.Virol.81:10869-10878,2007一文中所述；其内容透过引用并入本文)或GALV env(如Merten et al.,J.Virol.79:834-840,2005一文中所述；其内容透过引用并入本文)或其衍生物。
本文所用的术语“逆转录病毒”包括但不限于鼠白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、Rous肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、Moloney鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、Moloney鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)、29型禽骨髓增生病病毒(MC29)和禽成红细胞病病毒(AEV)以及所有其他逆转录病毒(包括慢病毒)。
逆转录病毒的详细列表可见Coffin et al.(“Retroviruses'1997 Cold SpringHarbour Laboratory Press Eds:JM Coffin,S M Hughes,H E Varmus pp 758-763”)一文。
慢病毒也属于逆转录病毒家族，但是它们可以感染分裂细胞和非分裂细胞。
慢病毒组可分为“灵长类”和“非灵长类”。灵长类慢病毒的实例包括人类免疫缺陷病毒(HIV)。非灵长类慢病毒组包括原型“慢病毒”维斯纳/梅迪病毒(VMV)，以及相关的羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和最近描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
一些慢病毒的基因组结构详细资讯可见例如NCBI Genbank资料库(即分别为GenBank登录号AF033819和AF033820)。HIV变体的详细资讯也可参见Los Alamos国家实验室维护的HIV资料库。
感染过程中，逆转录病毒最初附着于特定的细胞表面受体。进入易感宿主细胞后，逆转录病毒RNA基因组随后透过病毒编码的逆转录酶复制成DNA，所述逆转录酶携带于亲本病毒内部。此DNA被运输至宿主细胞核，在此处随后整合至宿主基因组。在此阶段，通常将其称为前病毒。前病毒在细胞分裂过程中在宿主染色体中稳定，并像其他细胞基因一样被转录。前病毒编码产生更多病毒所需的蛋白质和其他因子，这可以透过有时称为“出芽”的工艺离开细胞。
每个逆转录病毒基因组包含称为gag、pol和env的基因，其编码病毒粒子蛋白和酶。这些基因的两端侧翼有称为长末端重复序列(LTR)的区域。LTR负责前病毒整合和转录。它们还充当增强子-启动子序列。也就是说，LTR可以控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNA的衣壳化透过位于病毒基因组5'端的psi序列实现。
LTR本身为同一的序列，可以分为三个元件，称为U3、R和U5。U3源自RNA 3'末端的独特序列。R衍生自RNA两端重复的序列，U5衍生自RNA 5'末端独特的序列。在不同的逆转录病毒中，这三个元件的尺寸可能有很大差异。
对于病毒基因组，转录启始的位点位于左侧LTR的U3和R之间的边界处，而聚(A)添加(终止)的位点位于右侧LTR的R和U5之间的边界处。U3包含前病毒的大多数转录控制元件，包括对细胞转录启动蛋白以及某些情况下对病毒转录启动蛋白有反应的启动子和多个增强子序列。一些逆转录病毒具有以下一种或多种基因，这些基因编码参与基因表达调控的蛋白质：tat、rev、tax和rex。
关于结构基因gag、pol和env本身，gag编码病毒的内部结构蛋白。Gag蛋白经过蛋白水解加工为成熟蛋白MA(基质)、CA(衣壳)和NC(核衣壳)。Pol基因编码逆转录酶(RT)，其中包含DNA聚合酶、相关的RNase H和整合酶(IN)，它们介导基因组的复制。Env基因编码病毒粒子的表面(SU)糖蛋白和跨膜(TM)蛋白，它们形成与细胞受体蛋白特异性相互作用的复合体。这种相互作用透过病毒膜与细胞膜融合而最终导致感染。
逆转录病毒也可以包含“附加”基因，其编码gag、pol和env以外的蛋白质。在HIV中，附加基因的实例包括vif、vpr、vpx、vpu、tat、rev和nef中的一种或多种。EIAV包含例如附加基因S2和dUTPase。
附加基因编码的蛋白质具有多种功能，其中一些可能与细胞蛋白质提供的功能重复。例如，在EIAV中，tat充当病毒LTR的转录启动因子。它与称为TAR的稳定茎环RNA二级结构结合。Rev透过rev反应元件(RRE)调节和协调病毒基因的表达。这两种蛋白质的作用机制被认为与灵长类病毒的类似机制大致相似。S2的功能未知，但似乎并非必需。另外，EIAV蛋白Ttm已被确定，其由跨膜蛋白开始处与env编码序列剪接的tat的第一个外显子编码。
递送系统
逆转录病毒载体系统已被提出作为递送系统，用于(尤其是)将目的核苷酸(NOI)转移至一个或多个目的位元点。转移可在体外、离体、体内或其组合方式中进行。逆转录病毒载体系统已被用于研究逆转录病毒生命周期的各个方面，包括受体使用、逆转录和RNA包装(Miller的综述，1992 Curr Top Microbiol Immunol 158:1-24，其内容透过引用并入本文)。
重组逆转录病毒载体颗粒能够用NOI转导受体细胞。进入细胞内之后，来自载体颗粒的RNA基因组被逆转录为DNA，并整合入受体细胞的DNA中。
本文所用的术语“载体基因组”系指逆转录病毒载体颗粒中存在的RNA构建体和/或整合的DNA构建体。此术语还包括能够编码此类RNA基因组的单独或分离的DNA构建体。逆转录病毒或慢病毒基因组应包含至少一个可衍生自逆转录病毒或慢病毒的组成部分。术语“可衍生”在其正常意义上意指核苷酸序列或其一部分，这不一定需要从病毒(如慢病毒)获得，而是可以从其衍生而来。举例来说，所述序列可以合成制备或透过使用重组DNA技术制备。优选地，基因组包含psi区域(或能够引起衣壳化的类似组分)。
病毒载体基因组优选为有“复制缺陷”，这意指基因组不单独包含足够的基因资讯以使独立复制能够在受体细胞内产生感染性病毒颗粒。在一优选实施方案中，基因组缺乏功能性env、gag或pol基因。
病毒载体基因组可以包含一些或全部的长末端重复序列(LTR)。优选地，基因组包含LTR的至少一部分或类似序列，其能够介导前病毒整合和转录。所述序列还可以包含或充当增强子-启动子序列。
根据本发明一些方面的病毒载体基因组可以作为成套部分提供。例如，所述套件可包含(i)含有NOI和内部调控序列，例如启动子或IRES序列的一个或多个质粒；(ii)具有合适限制酶识别位元点的逆转录病毒基因组构建体，用于将NOI和内部调控序列克隆入病毒基因组。
已经认识到的是，在共同引入同一细胞的单独DNA序列上单独表达产生逆转录病毒载体颗粒所需的组分将产生携带缺陷逆转录病毒基因组(携带治疗基因)的逆转录病毒颗粒。此细胞称为生产细胞。
有两种常见的程序可产生生产细胞。一种是将编码逆转录病毒Gag、Pol和Env蛋白的序列导入细胞并稳定整合至细胞基因组；产生称为包装细胞系的稳定细胞系。包装细胞系产生包装逆转录病毒RNA所需的蛋白质，但由于缺少psi区域，因此无法形成衣壳化。但是，当具有psi区域的载体基因组被引入包装细胞系时，辅助蛋白即可包装psi阳性重组载体RNA，以产生重组病毒原液。这可用来将NOI转导入受体细胞。基因组缺少制造病毒蛋白所需的所有基因的重组病毒只能感染一次，不能繁殖。因此，NOI被引入宿主细胞基因组而未产生潜在有害的逆转录病毒。可用的包装细胞系的摘要见“逆转录病毒”一书(1997 ColdSpring Harbour Laboratory Press Eds:J M Coffin,S M Hughes,H E Varmus pp 449，其内容透过引用整体并入)。
本发明还提出了包含本发明病毒载体基因组的包装细胞系。例如，包装细胞系可以用包含基因组的病毒载体系统转导，或者用携带能够编码RNA基因组的DNA构建体的质粒转染。本发明还提出了由此类细胞产生的逆转录病毒(或慢病毒)载体颗粒。
第二种方法是将产生逆转录病毒载体颗粒所需的三个不同的DNA序列，即，env编码序列、gag-pol编码序列和包含一个或多个NOI的缺陷逆转录病毒基因组同时透过暂态转染引入细胞内，所述程序称为暂态三重转染(Landau&Littman 1992；Pear et al.1993)。三重转染程序已经被优化(Soneoka et al.1995；Finer et al.1994)。WO 94/29438描述了使用这种多重DNA暂态转染方法在体外产生生产细胞。
补充载体基因组所需的病毒系统组分可存在于一种或多种用于转染入细胞中的“生产质粒”上。
本发明还提出了用于生产逆转录病毒来源的颗粒的载体系统，其包含(i)根据本发明一些方面所述的逆转录病毒基因组；(ii)编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列；(iii)编码并非由(ii)的核苷酸序列编码的其他必需病毒包装组分的核苷酸序列。
一方面，编码Vpr、Vif、Tat、Nef或类似辅助基因中至少一者的核酸序列(来自颗粒所衍生自的逆转录病毒)被破坏，例如，所述核酸序列无法编码功能性Vpr、Vif、Tat、Nef或类似辅助蛋白，或从系统中删除。
本发明还提出了用此类载体系统转染的细胞和由此类细胞产生的逆转录病毒载体颗粒。优选地，gag-pol序列进行了密码子优化，以用于特定的生产细胞(见下文)。
由iii)的核苷酸序列编码的env蛋白可以为同源逆转录病毒或慢病毒env蛋白。或者，它可以为异源env，也可以来自非逆转录病毒或慢病毒的env(参见“假型化”下的内容)。
术语“病毒载体系统”通常用于表示成套部分，当与病毒颗粒生产的其他必需组分组合时可用于在宿主细胞中产生病毒颗粒。例如，逆转录病毒载体基因组可能缺少病毒复制所需的一个或多个基因。可以在套件中组合例如在一个或多个生产质粒上的另外的一个或多个互补核苷酸序列。透过基因组与生产质粒共转染，应可以为生产感染性病毒颗粒提供所需的组分。
或者，互补核苷酸序列可以稳定地存在于套件中包括的包装细胞系内。
本发明还涉及逆转录病毒载体系统，其能够递送RNA基因组至受体细胞，其中所述基因组长于慢病毒的野生型基因组。
在一些方面，载体系统的RNA基因组比野生型基因组有多至5％，优选为多至10％或什至多至30％以上的碱基。优选地，RNA基因组比野生型基因组长约10％。例如，野生型EIAV包含约8kb的RNA基因组。本发明的EIAV载体系统可具有至多(优选约)8.8kb的RNA基因组。
在一些方面，本发明的逆转录病毒载体系统为自灭活(SIN)载体系统。例如，自灭活逆转录病毒载体系统已透过删除转录增强子或3'LTR的U3区域中的增强子和启动子来构建。经过一轮载体逆转录和整合后，这些变化被复制入5'和3'LTR中，从而产生了无转录活性的前病毒。但是，此类载体中LTR以内的任何启动子仍具有转录活性。这种策略已被用于消除病毒LTR中增强子和启动子对内部基因转录的影响。此类影响包括增加转录或抑制转录。这种策略也可以用于消除从3'LTR到基因组DNA的下游转录。这在人类基因治疗中尤为重要，在该治疗中，防止内源性致癌基因的不定启动可能很重要。
在一些方面，使用重组酶辅助机制，其促进从本发明生产细胞中产生高滴度调节慢病毒载体。
在一些方面，本公开包括转导T细胞的方法，其包括：从至少一个供体、患者或个体获得T细胞；用抗CD3抗体和/或抗CD28抗体启动T细胞；用病毒载体转导启动的T细胞；以及任选地扩增转导的T细胞；任选地测量在多个体积浓度下表达转基因的扩增T细胞数量和/或每个T细胞中整合转基因的拷贝数；以及任选地确定产生表达转基因的扩增T细胞最大平均数量和/或整合转基因的最大平均拷贝数且来自多个健康供体的每个扩增T细胞中不超过五个拷贝的体积浓度，并且在确定的体积浓度下用病毒载体转导从患者中获得的T细胞用于免疫治疗，如US20190216852中所述(其内容透过引用整体并入本文)。
在一些方面，多个体积浓度为约0.01μl/约106个细胞至约1ml/约106个细胞；约0.01μl/约2x106个细胞至约1ml/约2x106个细胞；约0.01μl/约5x106个细胞至约1ml/约5x106个细胞；约0.01μl/约107个细胞至约1ml/约107个细胞；约1μl/约107个细胞至约500μl/约107个细胞；约5μl/约107个细胞至约150μl/约107个细胞；或者约8μl/约107个细胞至约12μl/约107个细胞。
本文所用的术语“重组酶辅助系统”包括但不限于使用噬菌体P1的Cre重组酶/loxP识别位点或酿酒酵母的位点特异性FLP重组酶的系统，其催化34bp FLP识别目标(FRT)之间的重组事件。
催化34bp FLP识别目标(FRT)之间重组事件的酿酒酵母的位点特异性FLP重组酶已被配置成DNA构建体，以利用重组酶辅助重组事件产生高水平的生产细胞系(Karremanet al.(1996)NAR 24:1616-1624)。已使用噬菌体P1的Cre重组酶/loxP识别位点开发了类似的系统(Vanin et al.(1997)J.Virol 71:7820–7826)。这被配置成慢病毒基因组，从而产生高滴度慢病毒生产细胞系。
透过使用生产/包装细胞系，可以繁殖和分离一定量的逆转录病毒载体颗粒(例如，制备合适滴度的逆转录病毒载体颗粒)，以用于随后转导于例如目的位元点(如特定器官或组织)或目的细胞(如T细胞)中。生产细胞系通常更适合于大规模生产载体颗粒。
与包装细胞方法相比，暂态转染具有某些优点。在这方面，暂态转染避免了产生稳定的载体生产细胞系所需的较长时间，并且在载体基因组或逆转录病毒包装组分对细胞有毒性时使用。如果载体基因组编码有毒的基因或干扰宿主细胞复制的基因(例如细胞周期抑制剂或诱导凋亡的基因)，则可能很难生成稳定的载体生产细胞系，但暂态转染可用于在细胞死亡之前产生载体。另外，已经使用暂态转染开发了细胞系，产生的载体滴度水平与从稳定的载体生产细胞系获得的水平可相比(Pear et al.1993,PNAS 90:8392-8396)。
生产细胞/包装细胞可以为任何合适的细胞类型。生产细胞通常为哺乳动物细胞，但是可以为例如昆虫细胞。
本文所用的术语“生产细胞”或“载体生产细胞”系指包含产生逆转录病毒载体颗粒所需所有元件的细胞。
在一些方面，生产细胞可获得自稳定的生产细胞系、衍生的稳定生产细胞系或衍生的生产细胞系。
本文所用的术语“衍生的生产细胞系”为转导的生产细胞系，其已针对标志物基因的高表达进行了筛选和选择。此类细胞系支援逆转录病毒基因组的高水平表达。术语“衍生的生产细胞系”与术语“衍生的稳定生产细胞系”和术语“稳定的生产细胞系”可互换使用。
在一些方面，衍生的生产细胞系包括但不限于逆转录病毒和/或慢病毒生产细胞。
在一些方面，包膜蛋白序列和核衣壳序列均在生产和/或包装细胞中稳定地整合。但是，这些序列中的一个或多个也可能以附加体形式存在，并且基因表达可能来自附加体。
本文所用的术语“包装细胞”系指含有RNA基因组中缺少生产感染性重组病毒所需那些元件的细胞。通常，此类包装细胞包含一个或多个生产质粒，其能够表达病毒结构蛋白(如密码子优化的gag-pol和env)，但不包含包装信号。
术语“包装信号”可互换称为“包装序列”或“psi”，用于指病毒颗粒形成期间逆转录病毒RNA链衣壳化所需的非编码、顺式作用序列。在HIV-1中，此序列已定位至从主要剪接供体位点(SD)上游延伸至至少gag起始密码子的基因座。
适合与上述载体构建体一起使用的包装细胞系可容易制备(也参见WO 92/05266，其内容透过引用并入本文)，并用于产生用于生产逆转录病毒载体颗粒的生产细胞系。如上所述，“逆转录病毒”一书中给出了可用包装细胞系的摘要。
同样，如上所述，简单包装细胞系(包含删除包装信号的前病毒)被发现可透过重组导致快速产生不希望的复制胜任病毒。为了提高安全性，已经产生了第二代细胞系，其中前病毒的3'LTR被删除。在此类细胞中，产生野生型病毒需要进行两次重组。进一步改进涉及将gag-pol基因和env基因引入不同的构建体，即所谓的第三代包装细胞系。这些构建体被依次引入，以防止转染过程中发生重组。
在一些方面，包装细胞系为第二代包装细胞系或第三代包装细胞系。
在这些分裂构建体(第三代细胞系)中，可以透过改变密码子来实现进一步减少重组。此技术基于基因代码的冗余，旨在减少单独构建体之间的同源性，例如，减少gag-pol和env开放阅读框中重叠区域之间的同源性。
包装细胞系可用于提供封装和提供膜蛋白所需的基因产物，以产生高滴度的载体颗粒。包装细胞可以为体外培养的细胞，如组织培养细胞系。合适的细胞系包括但不限于哺乳动物细胞，如鼠成纤维细胞衍生的细胞系或人细胞系。在一些方面，包装细胞系为灵长类或人细胞系，例如：HEK293、293-T、TE671、HT1080。
期望在实验和实际应用中均使用高滴度病毒制剂。增加病毒滴度的技术包括使用psi加包装信号(如上所述)和病毒原液浓缩。
本文所用的术语“高滴度”意指能够转导靶位点(如细胞)的有效量逆转录病毒载体或颗粒。
本文所用的术语“有效量”意指足以在靶位点诱导NOI表达的逆转录病毒或慢病毒载体或载体颗粒量。
用于生产/包装细胞的高滴度病毒制剂通常为每mL 105至107量级的逆转录病毒颗粒。另一方面，所述制剂具有至少108TU/mL，优选为108至109TU/mL，更优选为至少109TU/mL(滴度以在标准D17细胞系上滴定的每mL转导单位(TU/mL)表示)。可以使用其他浓缩方法，如，超滤或与基质结合和从基质上洗脱。
NOI编码的表达产物可以为细胞分泌的蛋白质。或者，NOI表达产物不经分泌并且在细胞内具有活性。对于某些应用，优选为NOI表达产物表现出旁侧效应或远端旁侧效应；其是一个细胞中表达产物的产生，导致对其他相关拥有共同表型的相邻或远端(例如，转移性)细胞的调节(Zennou et al.,(2000)Cell 101:173；Folleuzi et al.,(2000)Nat.Genetics 25:217；Zennou et al.,(2001)Nat.Biotechnol.19:446)，其各自内容透过引用整体并入本文。
存在被称为中央多嘌呤区(cPPT)的序列可提高基因递送至非分裂细胞的效率。例如，这种顺式作用元件位于病毒聚合酶编码区元件中。在一些方面，本发明的病毒基因组包含cPPT序列。
此外，病毒基因组可包含翻译增强子。
NOI可以透过操作连接至一个或多个启动子/增强子元件。一种或多种NOI的转录可以在病毒LTR或启动子增强子元件的控制下。在一些方面，启动子为强病毒启动子，如CMV，或者为细胞组成型启动子，如PGK、β-肌动蛋白或EF1α。启动子可以调控或具有组织特异性。表达控制也可透过使用诸如四环素系统之类的系统来实现，所述系统打开或关闭基因表达，以回应外部药物(例如，四环素或其类似物)。
假型化
设计逆转录病毒载体系统时，期望工程改造比起天然病毒具有不同靶细胞特异性的颗粒，以使得能够将基因物质递送至扩增或改变的细胞类型范围。实现此目的的一种方式是透过工程改造病毒包膜蛋白以改变其特异性。另一种方法是将异源包膜蛋白引入载体颗粒，以替代或添加至病毒的天然包膜蛋白。
术语假型化意指将异源env基因(例如来自另一种病毒的env基因)掺入至少一部分、或取代一部分、或替代全部的病毒基因组的env基因。假型化不是新现象，实例可见WO99/61639、WO-A-98/05759、WO-A-98/05754、WO-A-97/17457、WO-A-96/09400、WO-A-91/00047和Mebatsion et al.(1997)Cell 90:841-847，其各自内容透过引用整体并入本文。
在一些方面，载体系统用编码至少一部分狂犬病G蛋白的基因进行假型化处理。狂犬病G假型化逆转录病毒载体的实例可参见WO99/61639。另一方面，用编码至少一部分VSV-G蛋白的基因对载体系统进行假型化处理。VSV-G假型化逆转录病毒载体的实例可参见美国专利号5,817,491，其内容透过引用整体并入本文。另一方面，载体用病毒的包膜蛋白进行假型化处理，所述病毒选自天然猫内源性病毒(RD114)、RD114的嵌合版本(RD114TR；SEQ IDNO:95)、长臂猿白血病病毒(GALV)、GALV的嵌合版本(GALV-TR)、双嗜性鼠白血病病毒(MLV4070A)、杆状病毒(GP64)、水疱性口炎病毒(VSV-G)、鸡瘟病毒(FPV)、埃博拉病毒(EboV)、狒狒逆转录病毒包膜糖蛋白(BaEV)或淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒(LCMV)。
已得到证明的是，逆转录病毒或慢病毒最小系统可以从HIV、SIV、FIV和EIAV病毒构建。此类系统不需要任何的额外基因vif、vpr、vpx、Vpu、tat、rev和nef进行载体生产或转导分裂和非分裂细胞。还证明了可以构建EIAV最小载体系统，其不需要S2用于载体生产或转导分裂和非分裂细胞。删除额外基因是有利的。首先，它允许在没有慢病毒(例如HIV)感染中的疾病相关基因的情况下产生载体。特别是，tat与疾病有关。其次，删除额外基因使载体可以包装更多异源DNA。第三，可以省略功能未知的基因(如S2)，从而降低引起不良作用的风险。WO-A-99732646和WO-A-98/17815中公开了最小慢病毒载体的实例，其内容透过引用整体并入本文。
逆转录病毒载体生产系统不存在功能性辅助基因意指所述系统产生的逆转录病毒载体颗粒中也将不存在那些功能基因。此外，以其他方式由那些基因编码并掺入载体颗粒的任何辅助蛋白将不存在于载体颗粒中。在已知的逆转录病毒载体生产系统中，辅助基因可作为编码DNA的载体基因组的一部分或与包装组分一起存在。辅助基因在载体生产系统中的位置部分取决于其与其他逆转录病毒组分的关系。例如，vif通常为包装细胞中gag-pol包装盒的一部分。因此，为了本发明目的而去除功能性辅助基因可能涉及从包装组分或载体基因组或可能两者中将其去除。
去除功能性辅助基因可能无需整体去除基因。通常情况下，去除部分基因或以其他方式破坏基因就足够。本文中不存在功能性辅助基因理解为意指所述基因不以其能够编码功能性辅助蛋白的形式存在。
在一些方面，载体颗粒所基于的慢病毒中通常存在的功能性vpr和tat基因或类似基因皆缺失。这两个辅助基因与对于基因或细胞治疗载体特别不希望的慢病毒特征有关。但是，除了上述前提之外，本发明不限于在根据本发明用于生产基于HIV-1的载体颗粒的系统中不存在的辅助基因组合，三个或更优选为四个基因的任意组合可能不以其功能形式存在。最优选地，所有五个辅助基因vpr、vif、tat、nef和vpu均不以其功能形式存在。同样地，对于与其他慢病毒有关的系统，最优选的情况是：所有辅助基因均不以其功能形式存在(rev除外，除非被一种类似于rev/RRE系统的系统替代，否则其优选为存在)。
因此，在一些方面，根据本发明的递送系统至少没有tat和S2(如果为EIAV载体系统)，并且可能也没有vif、vpr、vpx、vpu和nef。优选地，本发明的系统也没有rev。之前，rev被认为在某些逆转录病毒基因组中对于有效产生病毒至关重要。例如，如果出现HIV，认为应该包括rev和RRE序列。但是，已经发现的是，可透过密码子优化(见下文)或用其他功能等效系统(如MPMV系统)替代来减少或消除对rev和RRE的要求。由于密码子优化的gag-pol表达不依赖于rev，因此可以从gag-pol表达盒中除去RRE，从而消除了与载体基因组上所含任何RRE重组的可能。
在一些方面，本发明的病毒基因组缺乏Rev应答元件(RRE)。另一方面，编码Rev的核酸序列或其功能等同物被破坏，使得所述核酸序列不能编码功能性Rev或从载体基因组中被去除。
在某些方面，本发明中使用的系统基于所谓的“最小系统”，其中一些或所有额外基因已被去除。优选地，本发明的病毒载体具有最小的病毒基因组。
本文所用的术语“最小病毒基因组”意指对病毒载体进行了操作，以去除非必需元件并保留必需元件，以提供感染、转导和递送NOI至靶宿主细胞所需的功能。优选地，具有最小病毒基因组的病毒载体为最小慢病毒载体。
密码子优化
密码子优化之前已在WO 99/41397中进行了描述，其内容透过引用整体并入本文。不同的细胞在使用特定密码子时有所不同。密码子偏倚对应于细胞类型中特定tRNA的相对丰度偏倚。透过改变序列中的密码子以与相应tRNA的相对丰度匹配，可以增加表达。同理，可以透过有意选择已知相应tRNA在特定细胞类型中稀有的密码子来减少表达。因此，可提供附加程度的翻译控制。
许多病毒，包括HIV和其他慢病毒，使用大量稀有密码子和透过改变这些稀有密码子以对应于常用的哺乳动物密码子，可实现在哺乳动物生产细胞中提高包装组分表达。密码子使用表在本领域中对于哺乳动物细胞以及多种其他生物体是已知的。
密码子优化具有许多其他优点。由于其序列改变，编码生产细胞/包装细胞中组装病毒颗粒所需的病毒颗粒包装组分的核苷酸序列使从中消除RNA不稳定序列(INS)。同时，保留了用于包装组分的氨基酸序列编码序列，以使序列编码的病毒组分保持相同或至少足够相似，从而不损害包装组分的功能。密码子优化还克服了用于导出的Rev/RRE要求，从而使优化序列独立于Rev。密码子优化还减少了载体系统内不同构建体之间的同源重组(例如，gag-pol和env开放阅读框中重叠区域之间)。因此，密码子优化的总体效果为病毒滴度显著增加和安全性改善。
一方面，仅与INS有关的密码子被密码子优化。但是，在更优选和实用的实施方案中，对序列整体进行了密码子优化，例外为包含移码位点的序列。
Gag-pol基因包含两个分别编码gag和pol蛋白的重叠阅读框。两种蛋白质的表达取决于翻译过程中的移码。这种移码是由于翻译过程中核糖体“滑动”导致发生的。这种滑动被认为至少部分是由核糖体滞留的RNA二级结构所致。此类二级结构存在于gag-pol基因移码位点的下游。对于HIV，重叠区域从gag起始位置(其中核苷酸1为gag ATG的A)下游的核苷酸1222延伸至gag的末端(nt 1503)。因此，跨越移码位元点和两个阅读框的重叠区域的281bp片段优选不进行密码子优化。保留此片段可更有效地表达gag-pol蛋白。
例如，可对最佳密码子使用进行衍生，以适应便利的限制性位点，并且可将保守氨基酸变化引入gag-pol蛋白。
在一些方面，密码子优化基于高度表达的哺乳动物基因。可能更改第三和有时第二和第三碱基。
由于基因代码的简并性质，将理解的是，技术人员可以实现许多gag-pol序列。并且，描述了许多逆转录病毒变体，可用作产生密码子优化gag-pol序列的起点。慢病毒基因组可能差异较大。例如，有许多仍在起作用的HIV-1类种(quasi-species)。EIAV也是这种情况。这些变体可用于增强转导过程的特定部分。HIV变体的详细资讯也可参见Los Alamos国家实验室维护的HIV资料库。EIAV克隆的详细资讯可参见美国国立卫生研究院维护的NCBI资料库。
密码子优化gag-pol序列的策略可用于任何逆转录病毒相关情况。这将适用于所有慢病毒，包括EIAV、FIV、BIV、CAEV、VMR、SIV、HIV-1和HIV-2。此外，此方法可用于增加来自HTLV-1、HTLV-2、HFV、HSRV和人类内源性逆转录病毒(HERV)、MLV和其他逆转录病毒的基因表达。
密码子优化可使gag-pol表达不依赖Rev。但是，为了能够在逆转录病毒载体中使用抗rev或RRE因子，有必要使病毒载体产生系统完全独立于Rev/RRE。因此，基因组也应该修饰。这可透过优化载体基因组组分来实现。有利情况是，这些修饰还可以导致产生更安全的系统，其在生产细胞和转导细胞两者中没有所有其他蛋白质。
如上所述，逆转录病毒载体的包装组分包括gag、pol和env基因的表达产物。另外，有效的包装取决于4个茎环的短序列及随后来自gag和env的部分序列(“包装信号”)。因此，在逆转录病毒载体基因组中包括删除的gag序列(包装构建体上的完整gag序列除外)将优化载体滴度。迄今为止，已报告有效包装需要仍保留env序列的载体中gag的255至360个核苷酸，或者需要特定剪接供体突变、gag和env删除组合中gag的约40个核苷酸。已发现gag中除N-末端约360个核苷酸以外的所有核苷酸删除会导致载体滴度增加。因此，优选情况为，逆转录病毒载体基因组包括gag序列，其包含一个或更多删除，更优选为gag序列包含可衍生自N端的约360个核苷酸。
NOI
在本发明中，术语NOI(目的核苷酸序列)包括任何合适的核苷酸序列，其不一定是完整的天然存在DNA或RNA序列。因此，例如，NOI可以为合成的RNA/DNA序列、密码子优化的RNA/DNA序列、重组的RNA/DNA序列(即透过使用重组DNA技术制备)、cDNA序列或部分基因组DNA序列，包括其组合。所述序列不必为编码区。如果为编码区域，则不必是整个编码区域。另外，RNA/DNA序列可以为有义方向或反义方向。优选情况是，其为有义方向。优选情况是，所述序列为cDNA、包含cDNA或转录自cDNA。
NOI，也称为异源序列、异源基因或转基因，可以为任何无限制的目的异源序列，例如包括编码治疗性蛋白质、酶和抗体等的序列；siRNA；反义microRNA、适体；核酶、任何基因抑制或沉寂序列；以及透过慢病毒转导载体递送至宿主细胞的任何序列，例如选择基因、标志物基因和治疗基因中的任何一个或多个。
NOI可以为在疾病过程中具有潜在意义的候选基因。因此，例如，本发明的载体系统可以用于靶标验证目的。
NOI可以进行治疗或诊断应用。合适的NOI包括但不限于：编码酶、细胞因子、趋化因子、激素、抗体、抗氧化剂分子、工程化改造免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫调节分子、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)、靶蛋白的反式显性负性突变体、毒素、条件毒素、抗原、抗原受体、嵌合抗原受体、T细胞受体、肿瘤抑制物蛋白、生长因子、膜蛋白、促血管和抗血管生成蛋白和肽、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶及其衍生物(例如，含有相关的报告基因组)的序列。NOI也可以编码前药启动酶。在用于研究的背景下，NOI还可以编码报告基因，例如但不限于绿色萤光蛋白(GFP)、萤光素酶、β-半乳糖苷酶或抗生素(例如氨苄青霉素、新霉素、博来霉素、Zeocin、氯霉素、潮霉素、卡那霉素等)的耐药基因。
NOI可以编码全部或部分目的蛋白“POI”)或其突变体、同源物或变体。例如，NOI可以编码能够以与野生型蛋白类似的方式在体内起作用的POI片段。
术语“突变体”包括POI，其包括来自野生型序列的一个或多个氨基酸变体。例如，突变体可包含一次或多次氨基酸添加、删除或取代。
在本文中，“同源物”意指与NOI具有一定同源性的实体，或编码与POI具有一定程度同源性的蛋白的实体。在本文中，“同源性”可以等同于“同一性”。
一方面，本文所述的载体、构建体或序列可包含参考序列的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。“与参考序列至少85％相同”的序列系指其全长与参考序列全长具有85％或更高序列同一性，特别是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。一方面，本文所述的载体、构建体或序列可包含SEQ ID NO:1–95中任何一个的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
在本申请的背景下，使用整体成对比对法(即，比较两个序列的全长)来计算“同一性百分比”或“同一性百分数”。比较两个或更多个序列同一性的方法是本领域所周知的。例如，可使用《needle》程式，其使用Needleman-Wunsch整体比对演算法(Needleman andWunsch,1970 J.Mol.Biol.48:443-453)以找到两个序列(考虑其全长)的最佳比对方法(包括间隙)。例如，needle程式可从ebi.ac.uk网站上下载，并在以下出版物中进一步描述(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice,P.Longden,I.and Bleasby,A.Trends in Genetics 16,(6)pp.276—277)。根据本发明，两个多肽之间同一性百分比使用EMBOSS:needle(整体)程式计算，“Gap Open”参数等于10.0、“Gap Extend”参数等于0.5、矩阵为Blosum62。
由与参考序列“至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同”的氨基酸序列组成的蛋白可能包含相对于参考序列的突变，例如缺失、插入和/或取代。在发生取代时，由与参考序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列组成的蛋白可能对应于衍生自其他物种的同源序列(不同于参考序列)。
“氨基酸取代”可以是保守的也可以是非保守的。优选情况是，取代为保守取代，其中一个氨基酸被具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸所取代。
在一实施方案中，保守取代可能包括由Dayhoff在“The Atlas of ProteinSequence and Structure.Vol.5”Natl.Biomedical Research中所述的取代，其内容透过引用整体并入本文。例如，一方面，属于以下组之一的氨基酸可彼此交换，因此构成保守交换：第1组：丙氨酸(A)、脯氨酸(P)、甘氨酸(G)、天冬醯胺(N)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；第2组：半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)、苏氨酸(T)；第3组：缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)；第4组：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)；第5组：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、组氨酸(H)；和第6组：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)。一方面，保守氨基酸取代可选自以下取代：T→A、G→A、A→I、T→V、A→M、T→I、A→V、T→G和/或T→S。
在另一實施方案中，保守氨基酸取代可包括用相同類別的另一個氨基酸取代一種氨基酸，例如，(1)非極性：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp；(2)不帶電的極性：Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；和(4)鹼性：Lys、Arg、His。其他保守氨基酸取代也可以按如下進行：(1)芳香族：Phe、Tyr、His；(2)質子供體：Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp；和(3)質子受體：Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln(參見例如美國專利號10,106,805，其內容透過引用整體併入本文)。
在另一方实施方案中，保守取代可以根据表A进行。用于预测蛋白质修饰耐受性的方法可参见，例如，Guo et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,101(25):9205-9210(2004)，其内容透过引用整体并入。
表A：保守的氨基酸取代
Figure GDA0003987788970000551
一方面，本文所述的序列可包括1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个氨基酸或核苷酸突变、取代、删除。另一方面，SEQ ID NO:1-95中的任何一个均可包括1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个突变、取代、删除。再一方面，突变或取代为保守氨基酸取代。
在另一实施方案中，保守取代可能为表B中“保守取代”标题下所示的取代。如果此类取代导致生物活性改变，则可能引入表B中称为“示例性取代”的重大改变，并且在需要时筛选产品。
表B：氨基酸取代
Figure GDA0003987788970000561
内部核糖体进入位点(IRES)
本发明的病毒基因组包含至少一个，但可以任选地包含两个或更多个NOI。为了表达两个或多个NOI，载体基因组内可能有两个或多个转录单位，每个NOI一个。但是，从文献中清楚地看出，如果逆转录病毒载体在基因上保持简单，则它们可达到最高的滴度和最有效的基因表达特性(PCT/GB96/01230；Bowtell et al.,1988 J.Virol.62,2464；Correllet al.,1994 Blood 84,1812；Emerman and Temin 1984 Cell 39,459；Ghattas et al.,1991 Mol.Cell.Biol.11,5848；Hantzopoulos et al.,1989 PNAS 86,3519；Hatzoglou etal.,1991 J.Biol.Chem 266,8416；Hatzoglou et al.,1988.J.Biol.Chem 263,17798；Liet al.,1992 Hum.Gen.Ther.3,381；McLachlin et al.,1993 Virol.195,1；Overell etal.,1988 Mol.Cell Biol.8,1803；Scharfman et al.,1991 PNAS 88,4626；Vile et al.,1994 Gene Ther 1,307；Xu et al.,1989 Virol.171,331；Yee et al.,1987 PNAS 84,5197)。因此，优选使用内部核糖体进入位点(IRES)来启始多顺反子(或如本文所用，“多顺反子”(multi-cistronic)))讯息中第二(和后续)编码序列的翻译(Adam et al.1991J.Virol.65,4985)。
将IRES元件插入逆转录病毒载体与逆转录病毒复制周期相容，并允许从单个启动子表达多个编码区(Adam et al.(as above)；Koo et al.(1992)Virology 186:669-675；Chen et al.1993 J.Virol 67:2142-2148)。IRES元件首先在小核糖核酸病毒的非翻译的5'末端发现，它们可促进病毒蛋白的cap非依赖性翻译(Jang et al.(1990)Enzyme 44；292-309)。当位于RNA中开放阅读框之间时，IRES元件透过在IRES元件促进核糖体进入，然后下游启始翻译，从而使下游开放阅读框有效翻译。
术语“顺反子”系指DNA分子的一部分，其指定一条多肽链的形成，即编码一条多肽链。例如，“双顺反子”系指DNA分子的两个部分，其指定两条多肽链的形成，即编码两条多肽链。“三顺反子”系指DNA分子的三个部分，其指定三个多肽链的形成，即编码三个多肽链；以此类推。术语“多顺反子RNA”系指包含基因资讯以翻译为几种蛋白质的RNA。相反，单顺反子RNA包含仅翻译单个蛋白质的基因资讯。在本公开背景下，从慢病毒转录的多顺反子RNA可翻译为两种蛋白质，例如TCRα链和TCRβ链。
Mountford和Smith提出了关于IRES的综述(TIG May 1995 vol 11,No 5:179-184)。许多不同的IRES序列均已知，包括来自脑心肌炎病毒(EMCV)(Ghattas,I.R.,et al.,Mol.Cell.Biol.,11:5848-5859(1991))；BiP蛋白(Macejak and Sarnow,Nature 353:91(1991))；果蝇触角基因(外显子d和e)(Oh,et al.,Genes&Development,6:1643-1653(1992))以及脊髓灰质炎病毒(PV)(Pelletier and Sonenberg,Nature 334:320-325(1988))的序列，同时也请参阅Mountford and Smith,TIG 11,179-184(1985)。
根据WO-A-97/14809，IRES序列通常见于基因的5'非编码区。除了文献中的那些外，还可透过寻找影响表达的基因序列然后确定该序列影响DNA(即充当启动子或增强子)还是仅影响RNA(充当IRES序列)从而根据经验找到它们。
来自PV、EMCV和猪水疱病病毒的IRES元件之前已被用于逆转录病毒载体(Coffinet al，如上)。
术语“IRES”包括充当或改善IRES功能的任何序列或序列的组合。所述IRES可以为病毒起源(如EMVC IRES、PV IRES或FMDV 2A样序列)或细胞起源(如FGF2 IRES、NRF IRES、Notch 2 IRES或EIF4 IRES)。
为了让IRES能够启始每个NOI的翻译，其应该位于载体基因组中NOI之间或之前。例如，对于NOI中包含的多顺反子序列，基因组可以如下：
[NOI1-IRES1]...NOIn，n＝任何整数
对于双顺反子和三顺反子序列，顺序可以如下：
NOI1-IRES1-NOI2
NOI1-IRES1-NOI2-IRES2-NOI3
也可以使用IRES和NOI的替代配置。例如，包含IRES和NOI的转录本不需要从同一启动子驱动。
此排列的示例可以为：
IRES1-NOI1-启动子-NOI2-IRES2-NOI3。
在一些方面，在利用具有一个以上IRES和NOI的内部盒的任何构建体中，IRES可以具有不同的起源，即彼此异源。例如，一个IRES可能来自EMCV，另一个IRES可能来自脊髓灰质炎病毒。
自一个载体表达多个基因的其他方法
尽管IRES是从一个载体共表达多个基因的有效方法，但是其他方法也有用，并且可单独使用或与IRES结合使用。这些包括在载体中使用多个内部启动子(Overell et al.,Mol Cell Biol.8:1803-8(1988))，或使用替代剪接模式导致多个RNA物种衍生自表达不同基因的单个病毒基因组。此策略之前已单独用于两个基因(Cepko et al.Cell 37:1053(1984))。
例如，可以将多个克隆位点(MCS)进一步掺入载体中，以便于NOI插入。此MCS有利于引入任何启动子、单个基因、两个基因以及任选地基因抑制序列，例如反义、核酶、shRNA、RNAi、microRNA、适体、反式显性突变体蛋白等。一优选实施方案为已被修饰之目的基因的表达，以便其核苷酸序列相对于细胞中的内源基因具有密码子简并性，另外，同一载体表达能够抑制或沉寂目的天然基因的基因抑制或沉寂序列。这种方法在理解各种蛋白结构域的功能方面具有巨大的实用性，方法是透过表达已在这些结构域中修饰的目的蛋白，同时表达基因抑制或沉寂序列，其可抑制或沉寂天然非修饰目的基因的表达。这种应用还可用于治疗疾病的基因治疗方法。例如，表达靶向于β-血红蛋白的RNAi的慢病毒载体可以抑制或沉寂镰状细胞性贫血患者的镰状血红蛋白。同一慢病毒载体还可以表达正常的血红蛋白分子，所述分子已在RNAi靶向的位元点处进行了密码子简并。这样，表达镰刀球蛋白的红系细胞可以抑制镰刀球蛋白的表达，同时表达天然血红蛋白并纠正基因异常。慢病毒载体可被递送至干细胞群中，这会产生表达血红蛋白的红系细胞，最终变为红细胞。这种方法可用于治疗多种疾病，包括癌症、遗传病和传染病。
转导的细胞
本发明还涉及已用包含根据本发明所述病毒基因组的载体系统转导的细胞。
细胞可以透过任何合适的方式在体内、体外或离体进行转导。例如，如果细胞是来自哺乳动物受试者的细胞，则可以将所述细胞从所述受试者中移除并进行转导以准备重新植入受试者中(离体转导)。备选地，细胞可以根据标准技术使用本发明的载体系统透过体内直接基因转移进行转导(例如，透过注射表达NOI的载体原液)。如果细胞是在培养液稳定的细胞系一部分(即，可以存活许多传代，并可在体外倍增)，则可透过标准技术在体外进行转导，例如，将细胞暴露至含有表达NOI的载体的病毒上清液。
细胞可以为任何易于转导的细胞。如果载体系统能够转导非分裂细胞(例如，如果为慢病毒系统)，则所述细胞可以为非分裂细胞。
一方面，本公开涉及免疫细胞(例如淋巴细胞、嗜中性粒细胞和/或单核细胞)的启动、转导和/或扩增。在一些方面，免疫细胞为淋巴细胞，诸如T细胞(例如，肿瘤浸润淋巴细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞和γδT细胞)、B细胞和/或NK细胞，它们可用于转基因表达。另一方面，本公开内容涉及γδT细胞的启动、转导和表达，同时消耗α-和/或β-TCR阳性细胞。
一方面，在没有预先消耗特定细胞群(例如，单核细胞、αβT细胞、B细胞和NK细胞)的情况下可活化和扩增全部的PBMC群。另一方面，γδT细胞可从体外培养的复杂样本中分离。另一方面，可以在特异性活化和扩增之前产生富集的γδT细胞群。另一方面，可以在不存在天然或工程化APC的情况下进行γδT细胞的活化和扩增。另一方面，可以使用固定的T细胞有丝分裂原(包括TCR特异的抗体)和其他TCR活化剂(包括凝集素)对来自肿瘤样本的T细胞进行分离和扩增。另一方面，可在不存在T细胞有丝分裂原(包括TCR特异的抗体)和其他TCR活化剂(包括凝集素)的情况下对来自肿瘤样本的T细胞进行分离和扩增。
一方面，T细胞分离自受试者(例如人受试者)的白细胞分离产物。另一方面，T细胞不是从外周血单核细胞(PBMC)中分离的。
T细胞制备可透过使用US20190247433中公开的方法来进行，其内容透过引用整体并入本文。
一方面，本公开提出了转导T细胞的方法，包括解冻冷冻的PBMC、静置解冻的PBMC、用抗CD3抗体和抗CD28抗体启动培养PBMC中的T细胞、用病毒载体转导启动的T细胞、扩增转导的T细胞以及获得扩增的T细胞。
另一方面，本公开涉及一种制备T细胞群的方法，包括获得新鲜的PBMC(即PBMC不是透过解冻冷冻保存的PBMC来获得)、用抗CD3抗体和抗CD28抗体启动新鲜PBMC中的T细胞、用病毒载体转导启动的T细胞、扩增转导的T细胞以及收获扩增的T细胞。
在本公开的另一项实施方案中，对于新鲜PBMC(即，未冷冻的PBMC)，可能无需静置。因此，未静置的新鲜PBMC可透过抗CD3抗体和抗CD28抗体启动，之后透过病毒载体转导，以获得转导的T细胞。
另一方面，解冻、静置、启动、转导、扩增和/或获得可能在封闭系统中进行。
另一方面，启动、转导、扩增和收获可能在封闭或半封闭的系统中进行。
另一方面，封闭系统可能为CliniMACS、ProdigyTM、WAVE(XURITM)生物反应器、WAVE(XURITM)生物反应器与BioSafe SepaxTM II组合、G-Rex/GatheRexTM封闭系统或G-Rex/GatheRexTM封闭系统与BioSafe SepaxTM II组合。
为了产生过继免疫疗法疗效改善的T细胞，T细胞制备可透过使用US20190292520中公开的方法来进行，其内容透过引用整体并入本文。
一方面，产生过继免疫疗法疗效改善的T细胞的方法可包括：从至少一名健康的供体、患者或个体获得T细胞、启动T细胞、用病毒载体转导启动的T细胞、在启动后将转导的T细胞扩增约3天至约5天、收集扩增的转导T细胞以注入至少一名健康的供体、患者或个体中，其中T细胞扩增约3天至约5天后过继免疫疗法的疗效相对于在启动后扩增约7天或更长时间的启动和转导T细胞改善。
另一方面，扩增T细胞表现为幼稚T细胞(TN)和/或干记忆T细胞(Tscm)/T中枢记忆(Tcm)表型。
另一方面，产生过继免疫疗法疗效改善的T细胞的方法可以包括：从患者或供体中获得CD8+T细胞群、确定所获得细胞群中CD28+CD8+T细胞的百分比、用抗CD3抗体和抗CD28抗体启动所确定的细胞群(其中确定的细胞群包含至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的CD28+CD8+T细胞)、用病毒载体转导启动的T细胞群、以及扩增转导的T细胞群。
另一方面，本公开涉及用于产生免疫疗法疗效改善的T细胞的离体方法，包括：确定分离的CD8+T细胞群中CD28+CD8+T细胞的百分比、用抗CD3抗体和抗CD28抗体启动所确定的细胞群(前提是确定的细胞群包含至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的CD28+CD8+T细胞)、用病毒载体转导启动的T细胞群、以及扩增转导的T细胞群。
另一方面，本公开涉及用于产生免疫疗法疗效改善的T细胞的方法，包括：从患者或供体中获得CD8+T细胞群、确定所获得细胞群中CD28+CD8+T细胞的百分比、在不存在抗CD28抗体的情况下用抗CD3抗体启动所确定的TCR细胞群(前提是确定的细胞群包含小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％的CD28+CD8+T细胞)、用病毒载体转导启动的T细胞群、以及扩增转导的T细胞群。
另一方面，本公开涉及用于产生免疫疗法疗效改善的T细胞的离体方法，包括：确定分离的CD8+T细胞群中CD28+CD8+T细胞的百分比、在不存在抗CD28抗体的情况下用抗CD3抗体启动所确定的TCR细胞群(前提是确定的细胞群包含小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％的CD28+CD8+T细胞)、用病毒载体转导启动的T细胞群、以及扩增转导的T细胞群。
另一方面，转导和扩增可在存在至少一种细胞因子的情况下进行。
一方面，分离的γδT细胞可以快速扩增，以应对与一种或多种抗原接触。一些γδT细胞(例如Vγ9Vδ2+T细胞)可以在组织培养期间在体外快速扩增，以应对与一些抗原(如：异戊二烯基焦磷酸酯、烷基胺和代谢物或微生物提取物)接触。刺激的γδT细胞可以表现出许多抗原呈递、共刺激和黏附分子，其可以促进从复杂样本中分离γδT细胞。复合样本中的γδT细胞可以用至少一种抗原在体外刺激1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或其他合适的时间段。用合适的抗原刺激γδT细胞可以在体外扩增γδT细胞群。
可用于在体外刺激复杂样本中γδT细胞扩增的抗原非限制性实例可包括异戊烯-焦磷酸盐，例如异戊烯焦磷酸盐(IPP)、烷基胺、人微生物病原体代谢物、共生细菌代谢物、甲基-3-丁烯基-1-焦磷酸(2M3B1PP)、(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸盐(HMB-PP)、焦磷酸乙酯(EPP)、法呢基焦磷酸盐(FPP)、二甲基烯丙基磷酸盐(DMAP)、二甲基烯丙基焦磷酸盐(DMAPP)、乙基三磷酸腺苷(EPPPA)、香叶基焦磷酸盐(GPP)、香叶基香叶基焦磷酸盐(GGPP)、异戊烯基三磷酸腺苷(IPPPA)、磷酸单乙基酯(MEP)、焦磷酸单乙酯(MEPP)、3-甲醯基-1-丁基焦磷酸盐(TUBAg1)、X-焦磷酸盐(TUBAg2)、3-甲醯基-1-丁基-尿苷三磷酸盐(TUBAg3)、3-甲醯基-1-丁基-去氧胸苷三磷酸(TUBAg4)、单乙基烷基胺、烯丙基焦磷酸盐、巴豆醯基焦磷酸盐、二甲基烯丙基-γ-尿苷三磷酸盐、巴豆醯基-γ-尿苷三磷酸盐、烯丙基-γ-尿苷三磷酸盐、乙胺、异丁胺、仲丁胺、异戊胺和含氮二膦酸盐。
可以使用本文所述的活化和共刺激剂进行γδT细胞的活化和扩增，以触发特异性γδT细胞增殖和持久性群体。一方面，来自不同培养物的γδT细胞的活化和扩增可以实现不同的克隆或混合多克隆群体亚群。另一方面，不同的激动剂可用于鉴定提供特异性γδ启动信号的剂。另一方面，提供特异性γδ启动信号的剂可以是针对γδTCR的不同单克隆抗体(MAb)。另一方面，可以使用伴随共刺激剂以帮助触发特异性γδT细胞增殖而不诱导细胞能量和细胞凋亡。这些共刺激剂可包括与γδ细胞上表达的受体结合的配体，如NKG2D、CD161、CD70、JAML、DNAX辅助分子-1(DNAM-1)、ICOS、CD27、CD137、CD30、HVEM、SLAM、CD122、DAP和CD28。另一方面，共刺激剂可以是对CD2和CD3分子上的独特表位特异的抗体。当在αβ或γδT细胞上表达时，CD2和CD3可具有不同的构象结构。另一方面，CD3和CD2的特异性抗体可导致γδT细胞的不同活化。
在γδT细胞改造之前，可以离体扩增γδT细胞群。可用于促进体外γδT细胞群扩增的试剂非限制性实例可能包括抗CD3或抗CD2、抗CD27、抗CD30、抗CD70、抗OX40抗体、IL-2、IL-15、IL-12、IL-9、IL-33、IL-18或IL-21、CD70(CD27配体)、植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA)、商陆(PWM)、蛋白质花生凝集素(PNA)、大豆凝集素(SBA)、扁豆凝集素(LCA)、豌豆凝集素(PSA)、蜗牛凝集素(HPA)、蚕豆凝集素(VGA)或其他能够刺激T细胞增殖的合适有丝分裂原。
一方面，改造(或转导)的γδT细胞可以在不受抗原呈递细胞或氨基二膦酸盐的刺激下离体扩增。本公开的抗原反应性改造T细胞可以离体和体内扩增。另一方面，本公开内容的改造γδT细胞的活性群体可以离体扩增，而无需抗原呈递细胞、抗原肽、非肽分子或小分子化合物(例如，氨基二膦酸盐)的抗原刺激，但是使用某些抗体、细胞因子、有丝分裂原或融合蛋白，例如：IL-17Fc融合、MICAFc融合和CD70Fc融合。可用于扩增γδT细胞群抗体实例可能包括抗CD3、抗CD27、抗CD30、抗CD70、抗OX40、抗NKG2D或抗CD2抗体，细胞因子的实例可能包括IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-18、IL-9、IL-7和/或IL-33，有丝分裂原的实例可能包括CD70人CD27的配体、植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA)、商陆有丝分裂原(PWM)、蛋白质花生凝集素(PNA)、大豆凝集素(SBA)、扁豆凝集素(LCA)、豌豆凝集素(PSA)、蜗牛凝集素(HPA)、蚕豆凝集素(VGA)或其他能够刺激T细胞增殖的合适有丝分裂原。另一方面，改造γδT细胞群可在少于60天、少于48天、少于36天、少于24天、少于12天或少于6天内扩增。另一方面，工程化改造γδT细胞群可扩增约7天至约49天、约7天至约42天、约7天至约35天、约7天至约28天、约7天至约21天或约7天至约14天。
另一方面，本公开内容提供了用于离体扩增用于过继转移疗法的改造T细胞群的方法。本公开内容的改造T细胞可离体扩增。本公开内容的改造T细胞可在不经APC活化或不与APC和氨基磷酸盐共培养下在体外扩增。
透过T细胞的基因工程可以增强T细胞识别广谱抗原的能力。一方面，可以改造T细胞以提供识别体内选择抗原的通用同种异体疗法。T细胞的基因改造可能包括稳定整合表达肿瘤识别部分的构建体，例如：αβTCR、γδTCR、嵌合抗原受体(CAR)，其将抗原结合和T细胞启动功能组合为单一的受体、其抗原结合片段或淋巴细胞启动结构域组合为分离T细胞、细胞因子(例如，IL-15、IL-12、IL-2、IL-7、IL-21、IL-18、IL-19、IL-33、IL-4、IL-9、IL-23或IL1β)的基因组，以在体外和体内增强T细胞增殖、存活和功能。分离T细胞的基因改造还可能包括从分离T细胞的基因组中的一个或多个内源基因(例如，MHC基因座)中删除或破坏基因表达。
嵌合抗原受体(CAR)
本公开的实施方案可以包括将编码一种或多种CAR的核酸引入T细胞。T细胞可以为αβT细胞、γδT细胞或天然杀伤T细胞。在各种实施方案中，本公开提出了采用设计用于表达将细胞毒性重定向至肿瘤细胞的CAR的载体进行基因学工程改造的T细胞。CAR分子将针对靶抗原(例如，肿瘤抗原)的基于抗体的特异性与启动T细胞受体的细胞内结构域相结合，以产生表现出特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白。本文所用的术语“嵌合”描述由不同蛋白质或不同来源DNA的部分组成。
CAR可以包含与特异性靶抗原结合的细胞外结构域(也称为结合结构域或抗原特异性结合结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。CAR的主要特征可能是其能够重新定向免疫效应细胞特异性，从而触发增殖、细胞因子产生、吞噬作用或产生可以主要组织相容性(MHC)非依赖方式介导靶抗原表达细胞的细胞死亡的分子，利用单克隆抗体、可溶性配体或细胞特异性共受体的细胞特异性靶向作用能力。
在特定的实施方案中，CAR可以包含细胞外结合结构域，其包括但不限于抗体或其抗原结合片段、系链配体、或共受体的细胞外结构域，其与肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)的靶向抗原特异性结合。在某些实施方案中，TAA或TSA可以在血液癌细胞上表达。在另一实施方案中，TAA或TSA可以在实体瘤细胞上表达。在特定的实施方案中，实体瘤可以是胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、除非小细胞肺癌以外的肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌、脾癌、皮肤癌、除胶质母细胞瘤以外的脑癌、肾癌、甲状腺癌等等。
在特定实施方案中，TAA或TSA可以选自由α叶酸受体、5T4、ανβ6整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR家族，包括ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs和VEGFR2组成的组。
CAR的结合结构域
在特定的实施方案中，本文考虑的CAR包含与肿瘤细胞上表达的靶多肽(例如，靶抗原)特异性结合的细胞外结合结构域。
本文所用的术语“结合结构域”、“细胞外结构域”、“细胞外结合结构域”、“抗原特异性结合结构域”和“细胞外抗原特异性结合结构域”可以互换使用，并提供能与目标靶抗原特异性结合的CAR。结合结构域可以包括具有特异性识别并结合生物分子(例如，细胞表面受体或肿瘤蛋白、脂质、多糖或其他细胞表面靶分子或其组分)能力的任何蛋白、多肽、寡肽或肽。结合结构域可包括用于目的生物分子的任何天然存在、合成、半合成或重组产生的结合伴侣。
在特定实施方案中，CAR的细胞外结合结构域可包括抗体或其抗原结合片段。“抗体”系指结合剂，其为至少包含一条轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽，其特异性地识别并结合靶抗原的表位，例如肽、脂质、多糖或含有抗原决定簇的核酸，例如被免疫细胞识别者。抗体可包括其抗原结合片段。所述术语还可以包括基因工程改造的形式，如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、异源缀合物抗体(例如，双特异性抗体)及其抗原结合片段。另请参阅Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)；Kuby,J.,Immunology,3rd Ed.,W.H.Freeman&Co.,New York,1997。
在特定实施方案中，靶抗原可以为α叶酸受体、5T4、ανβ6整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR家族，包括ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs或VEGFR2多肽的表位。
轻链和重链可变区可以包含被三个高变区打断的“框架”区，高变区也称为“互补决定区”或“CDR”。CDR可透过常规方法定义或鉴定，例如透过根据Kabat et al(Wu,TT andKabat,E.A.,J Exp Med.132(2):211-50,(1970)；Borden,P.and Kabat E.A.,PNAS,84:2440-2443(1987)所述的序列；(请参阅Kabat et al,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,1991,whichis hereby incorporated by reference),or by structure according to Chothia etal(Choithia,C.and Lesk,A.M.,J Mol.Biol,196(4):901-917(1987),Choithia,C.et al,Nature,342:877-883(1989))。上述参考文献的内容透过引用整体并入本文。不同轻链或重链的框架区序列在诸如人之类的物种中可能是相对保守的。抗体的框架区是组成性轻链和重链的组合框架区，可用于在三维空间中定位和排列CDR。CDR主要负责与抗原表位结合。每条链的CDR通常可以称为CDR1、CDR2和CDR3，从N端开始依次编号，并且通常还可以透过特定CDR所在位置的链来识别。因此，位于抗体重链可变结构域中的CDR可以称为CDRH1、CDRH2和CDRH3，而位于抗体轻链可变结构域中的CDR称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同组合位点)的抗体可能具有不同CDR。尽管不同的抗体之间CDR不同，但CDR内仅有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。
提及“VH”或“VH”系指免疫球蛋白重链的可变区，包括抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或其他抗体片段的可变区。提及“VL”或“VL”系指免疫球蛋白轻链的可变区，包括抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或其他抗体片段的可变区。
“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单个克隆或由转染了单个抗体轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体可以透过本领域技术人员已知的方法来产生，例如，透过将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞融合而制备杂交抗体形成细胞。单克隆抗体可以包括人源化单克隆抗体。
“嵌合抗体”具有来自一种物种(例如人)的框架残基和来自另一物种(诸如小鼠)的CDR(通常赋予抗原结合特性)。在特定优选的实施方案中，本文公开的CAR可以包含是嵌合抗体或其抗原结合片段的抗原特异性结合结构域。
在某些实施方案中，抗体可以是与肿瘤细胞上表面蛋白特异性结合的人源化抗体(例如人源化单克隆抗体)。“人源化”抗体为免疫球蛋白，包括人框架区和来自非人(例如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一个或多个CDR。人源化抗体可以透过基因工程改造构建(例如，参见美国专利号5,585,089，其内容透过引用整体并入本文)。
在实施方案中，CAR的细胞外结合结构域可包含抗体或其抗原结合片段，包括但不限于骆驼Ig(骆驼科抗体(VHH))、Ig NAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fv、单链Fv抗体(“scFv”)、bis-scFv、(scFv)2、微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb、纳米抗体)。
本文所用的“骆驼Ig”或“骆驼科VHH”系指重链抗体的最小已知抗原结合单位(Koch-Nolte,et al,FASEBJ.,21:3490-3498(2007)，其内容透过引用整体并入本文)。“重链抗体”或“骆驼科抗体”系指含有两个VH结构域且无轻链的抗体(Riechmann L.et al,J.Immunol.Methods 231:25-38(1999)；WO94/04678；W094/25591；美国专利号6,005,079；其内容透过引用整体并入本文)。
“IgNAR”或“免疫球蛋白新抗原受体”系指来自鲨鱼免疫库的一类抗体，其由一个可变新抗原受体(VNAR)结构域和五个恒定新抗原受体(CNAR)结构域的同二聚体组成。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两种相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段都有一个抗原结合位点和残余“Fc”片段，其名称反映了其能够容易结晶。Fab片段包含重链和轻链可变结构域，还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的区别在于，在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中Fab′的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基。F(ab')2抗体片段最初生成为成对Fab'片段，在它们之间有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在单链Fv(scFv)物种中，一个重链和一个轻链可变结构域可以透过柔性肽连接子共价连接，这样，轻链和重链就可以缔合成类似于两链Fv物种的“二聚体”结构。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段包含与相同多肽链(VH-VL)内轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。透过使用太短以至于无法允许同一条链上两个结构域之间配对的连接子，所述结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体在，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger et al,PNASUSA 90:6444-6448(1993)中更详细的描述。三抗体和四抗体也在Hudson et al,Nat.Med.9:129-134(2003)中进行了描述。上述参考文献的内容透过引用整体并入本文。
“单结构域抗体”或“sdAb”或“纳米抗体”系指由抗体重链的可变区(VH结构域)或抗体轻链的可变区(VL结构域)组成的抗体片段(Holt,L.,et al,Trends inBiotechnology,21(11):484-490，该文中的内容透过引用整体并入本文)。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域以单个多肽链和任一方向(例如VL-VH或VH-VL)存在。通常情况下，scFv多肽进一步包括VH和VL结构域之间的多肽连接子，其使得scFv能够形成所需的抗原结合结构。有关scFv的综述，请参见，例如，Pluckthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag,New York,1994),pp.269-315，该文中的内容透过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，scFv与α叶酸受体、5T4、ανβ6整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CALX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR家族，包括ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs或VEGFR2多肽结合。
CAR的连接子
在某些实施方案中，CAR可以在各个结构域之间，例如在VH和VL结构域之间包含连接子残基，其被添加以适当地间隔和构象分子。CAR可以包含一个、两个、三个、四个或五个或五个以上的连接子。在特定实施方案中，连接子的长度可以为约1至约25个氨基酸、约5至约20个氨基酸或约10至约20个氨基酸，或任何中间的氨基酸长度。在一些实施方案中，连接子的长度可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多氨基酸。连接子的说明性示例包括甘氨酸聚合物(G)n；甘氨酸-丝氨酸聚合物(Gi_sSi_5)n，其中n为至少一个、两个、三个、四个或五个的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；和本领域已知的其他柔性连接子。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物相对而言是非结构化的，因此可能能够充当融合蛋白(例如CAR)的结构域之间的中性系链。甘氨酸可能甚至比丙氨酸进入更多的phi-psi空间，并且与具有较长侧链的残基相比所受的限制要少得多(请参阅Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992)，该文中的内容透过引用整体并入本文)。普通技术人员可认识到，在特定实施例中，CAR的设计可以包括可能是全部或部分柔性的连接子，使得所述连接子可以包括柔性连接子以及赋予柔性较差结构的一个或多个部分，以提供所需的CAR结构。
在特定实施方案中，CAR可以包括scFV，其可以进一步包含可变区连接序列。“可变区连接序列”是一个氨基酸序列，其将重链可变区连接至轻链可变区，并提供与两个亚结合结构域相互作用相容的间隔子功能，从而获得的多肽与可能包含相同轻链和重链可变区的抗体一样，对同一靶分子保留特异性结合亲和力。在一实施方案中，可变区连接序列的长度可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸。在一特定实施方案中，可变区连接序列可以包含甘氨酸-丝氨酸聚合物(Gi_sSi_5)n，其中n为至少1、2、3、4或5的整数。在另一实施方案中，可变区连接序列包含一个(G4S)3氨基酸连接子。
CAR的间隔子结构域
在特定实施方案中，CAR的结合结构域可跟随一个或多个“间隔子结构域”，其是指使抗原结合结构域远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和启动的区域(Patel et al,Gene Therapy,1999；6:412-419，该文中的内容透过引用整体并入本文)。间隔子结构域可以来自天然、合成、半合成或重组来源。在某些实施方案中，间隔子结构域可以为免疫球蛋白的一部分，包括但不限于一个或多个重链恒定区，例如，CH2和CH3。间隔子结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。在一实施方案中，间隔子结构域可以包括IgG1的CH2和CH3。
CAR的铰链结构域
CAR的结合结构域通常可跟随一个或多个“铰链结构域”，其可以在使抗原结合结构域远离效应细胞表面定位以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和启动中起作用。CAR通常可以包括结合结构域和跨膜结构域(TM)之间的一个或多个铰链结构域。铰链结构域可以来自天然、合成、半合成或重组来源。铰链结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。适用于CAR的示例性铰链结构域可能包括源自1型膜蛋白(例如，CD8a、CD4、CD28和CD7)的细胞外区的铰链区，其可能为这些分子的野生型铰链区，也可能被改变。在另一实施方案中，铰链结构域可以包括CD8α铰链区。
CAR的跨膜(TM)结构域
“跨膜结构域”可以是CAR的一部分，其可以融合细胞外结合部分和细胞内信号传导结构域，并且将CAR锚定至免疫效应细胞的质膜。TM结构域可以来自天然、合成、半合成或重组来源。示例性TM结构域可以衍生自T细胞受体、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154的α、β或ζ链(至少包括其跨膜区)。在一实施方案中，CAR可以包含衍生自CD8a的TM结构域。在另一实施方案中，本文考虑的CAR包含衍生自CD8α的TM结构域和短寡肽或多肽连接子，优选长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，其连接CAR的TM结构域和细胞内信号传导结构域。甘氨酸-丝氨酸连接子提供了特别合适的连接子。
CAR的细胞内信号传导结构域
在特定实施方案中，CAR可以包含细胞内信号传导结构域。“细胞内信号传导结构域”系指CAR的一部分，其参与结合于靶抗原的有效CAR的讯息转导至免疫效应细胞内部以引发效应细胞功能，例如启动、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性，包括向CAR结合的靶细胞释放细胞毒性因子，或用结合于细胞外CAR结构域的抗原引发其他细胞反应。
术语“效应子功能”系指细胞的专门功能。例如，T细胞的效应子功能可以是溶细胞活性或帮助或包括细胞因子分泌的活性。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的一部分，其可以转导效应子功能信号并指导细胞执行专门的功能。虽然通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但是在很多情况下，不必使用整个结构域。就可以使用细胞内信号传导结构域的截短部分程度而言，可使用此类截短部分代替整个结构域，只要可以转导效应子功能信号即可。术语细胞内信号传导结构域可指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
已知仅透过TCR产生的信号不足以完全启动T细胞，并且还可能需要次级或共刺激信号。因此，可以说T细胞启动是由以下两类不同细胞内信号传导结构域介导的：透过TCR(例如，TCR/CD3复合体)启始抗原依赖性主要启动的一级信号传导结构域；以抗原非依赖性方式作用从而提供次级或共刺激信号的共刺激信号传导结构域。在优选实施方案中，CAR可以包括细胞内信号传导结构域，其可包含一个或多个“共刺激信号传导结构域”和“一级信号传导结构域”。一级信号传导结构域可以以刺激性方式或抑制性方式调节TCR复合体的一级启动。以刺激方式起作用的一级信号传导结构域可能包含信号传导基序，称为基于免疫受体酪氨酸的启动基序或ITAM。在本发明中特别使用且包含ITAM的一级信号传导结构域的说明性示例可以包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的结构域。在特定优选实施方案中，CAR可以包括CD3ζ一级信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域。细胞内一级信号传导和共刺激信号传导结构域可以以任何顺序串联连接至跨膜结构域的羧基末端。
CAR可以包含一个或多个共刺激信号传导结构域，以增强表达CAR受体的T细胞的疗效和扩增。本文所用的术语“共刺激信号传导结构域”或“共刺激结构域”系指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。此类共刺激分子的说明性示例可以包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD30、CD40、PD-1、ICOS(CD278)、CTLA4、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、TRIM、LCK3、SLAM、DAP10、LAG3、HVEM、NKD2C和CD83。在一实施方案中，CAR可以包含一个或多个选自由CD28、CD137和CD134组成组的共刺激信号传导结构域以及一个CD3ζ一级信号传导结构域。
在一实施方案中，CAR可以包含scFv，其与α叶酸受体、5T4、ανβ6整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CALX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR家族，包括ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-Al+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs或VEGFR2多肽结合；源于选自以下组成组的多肽的跨膜结构域：CD8α；CD4、CD45、PD1和CD152；以及一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域，其选自由以下组成的组：CD28、CD54、CD134、CD137、CD152、CD273、CD274和CD278；和CD3ζ一级信号传导结构域。
在另一实施方案中，CAR可以包含scFv，其与α叶酸受体、5T4、ανβ6整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CALX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR家族，包括ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs或VEGFR2多肽结合；铰链结构域，其选自由以下组成的组：IgG1铰链/CH2/CH3和CD8α以及CD8α；源于选自由以下组成组的多肽的跨膜结构域：CD8α；CD4、CD45、PD1和CD152；以及一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域，其选自由以下组成的组：CD28、CD 134和CD 137；和CD3ζ一级信号传导结构域。
在再一实施方案中，CAR可以包含scFv，进一步包括连接子，其与α叶酸受体、5T4、ανβ6整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR家族，包括ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs或VEGFR2多肽结合；铰链结构域，其选自由以下组成的组：IgG1铰链/CH2/CH3和CD8α以及CD8α；跨膜结构域，其包含源自选自由以下组成组的多肽的TM结构域：CD8a；CD4、CD45、PD1和CD 152，以及一个短寡肽或多肽连接子，优选长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸之间，其将TM结构域连接至CAR的细胞内信号传导结构域；一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域，选自由以下组成的组：CD28、CD 134和CD137；和CD3ζ一级信号传导结构域。
在一特定实施方案中，CAR可以包含scFv，其与α叶酸受体、5T4、ανβ6整合蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR家族，包括ErbB2(HER2)、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、*Glypican-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEMs或VEGFR2多肽结合；含有CD8α多肽的铰链结构域；含有约3个氨基酸的多肽连接子的CD8α跨膜结构域；一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域，其选自由以下组成的组：CD28、CD134和CD137；和CD3ζ一级信号传导结构域。
可用各种方法产生改造T细胞。例如，编码包含肿瘤识别或其他类型识别部分的表达盒的多核苷酸可透过转座子/转座酶系统或基于病毒的基因转移系统(例如，慢病毒或逆转录病毒系统)或其他合适的方法，如：转染、电穿孔、转导、脂质转染、磷酸钙(CaPO4)、纳米改造物质(如Ormosil)，病毒传递方法，包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒或其他合适的方法稳定地引入T细胞。许多病毒方法已用于人基因治疗，例如WO 1993020221中描述的方法，其内容透过引用整体并入本文。可用于改造T细胞的病毒方法的非限制性实例可包括γ-逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒或腺病毒相关病毒方法。
一方面，本文所述的构建体和载体与2018年11月26日提交的美国专利16/200,308中描述的方法一起使用，其内容透过引用整体并入本文。
盒
本发明可使用包含一个或多个NOI的盒，在两个或多个NOI的情况下，可透过IRES进行可操作地连接。这些盒可用于在生产细胞中生产载体基因组的方法。
本发明还提出了包含此类盒的表达载体。用此类表达载体转染合适的细胞应可形成表达由盒中NOI所编码的每个POI的细胞。本发明还提出了此类转染细胞。
盒克隆入表达载体并用所述载体转染细胞(以表达盒)可以透过本领域众所周知的技术进行(例如，Sambrook et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2ndEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)一书以及其他实验室教科书的描述内容)。
在某些方面，所述盒包含启动子。
在某些方面，所述盒包含一个NOI。如上面详细描述的，NOI可以为任何NOI。例如，NOI可以进行治疗或诊断应用。合适的NOI包括但不限于：编码酶、细胞因子、趋化因子、激素、抗体、抗氧化剂分子、工程化改造免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫调节分子、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)、靶蛋白的反式显性负性突变体、毒素、条件毒素、抗原、抗原受体、嵌合抗原受体、T细胞受体、肿瘤抑制物蛋白、生长因子、膜蛋白、促血管和抗血管生成蛋白和肽、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶及其衍生物(例如，含有相关的报告基因组)的序列。
在某些方面，所述盒包含两个或更多NOI。包含两个或更多NOI的盒可以为双顺反子或三顺反子，并且可以包含以下元件：
启动子-(NOI1)-(IRES1)-(NOI2)
启动子-(NOI1)-(IRES1)-(NOI2)-(IRES2)-(NOI3)
在一些实施方案中，单个慢病毒盒可用于产生表达一种或多种蛋白质的单个慢病毒载体。特别地，单个慢病毒盒可用于产生单个慢病毒载体，其表达来自单个多顺反子mRNA的两个不同二聚体的至少四个个体单体蛋白，从而在细胞表面上共表达二聚体。例如，整合单拷贝慢病毒载体已被证明可足以转化γδT细胞，以共表达TCRαβ和CD8αβ。
一方面，本公开涉及在单个载体内包含多顺反子盒的载体，其能够表达多于一个、多于两个、多于三个、多于四个基因、多于五个基因或多于六个基因，其中这些基因编码的多肽可以彼此相互作用，或可以形成二聚体。二聚体可以为同二聚体(即两种相同的蛋白质形成二聚体)，或异二聚体(即两个结构上不同的蛋白质形成二聚体)。
一方面，慢病毒载体可包含编码蛋白质Z1的第一核苷酸序列S1、编码蛋白质Z2的第二核苷酸序列S2、编码蛋白质Y1的第三核苷酸序列S3和编码蛋白质Y2的第四核苷酸序列S4，其中Z1和Z2形成第一二聚体、Y1和Y2形成第二二聚体，其中第一二聚体Z1Z2与第二二聚体Y1Y2不同。
一方面，第一个慢病毒载体可包含编码二聚体Z1Z2的双顺反子盒(2合1)，第二个慢病毒载体可包含编码二聚体Y1Y2的双顺反子盒(2合1)。在2合1载体中，S1和S2可以按S1-S2或S2-S1的5'至3'方向串联排列。同样，在2合1载体中，S3和S4可以按S3-S4或S4-S3的5'至3'方向串联排列。Z1和Z2或Y1和Y2可以被一个或多个自裂解2A肽分开。
另一方面，单个慢病毒载体(4合1)可以编码不同的二聚体Z1Z2和Y1Y2，其中Z1、Z2、Y1和Y2可以被一个或多个自裂解2A肽分开。例如，S1、S2、S3和S4可以以选自S1-S2-S3-S4、S1-S2-S4-S3、S1-S3-S2-S4、S1-S3-S4-S2、S1-S4-S3-S2、S1-S4-S2-S3、S2-S1-S3-S4、S2-S1-S4-S3、S2-S3-S1-S4、S2-S3-S4-S1、S2-S4-S3-S1、S2-S4-S1-S3、S3-S1-S2-S4、S3-S1-S4-S2、S3-S2-S1-S4、S3-S2-S4-S1、S3-S4-S1-S2、S3-S4-S2-S1、S4-S1-S2-S3、S4-S1-S3-S2、S4-S2-S1-S3、S4-S2-S3-S1、S4-S3-S1-S2或S4-S3-S2-S1的5'至3'方向串联排列。
一方面，二聚体Z1Z2和/或二聚体Y1Y2可以为具有TCRα链和TCRβ链的TCR或具有TCRγ链和TCRδ链的TCR。
一方面，能够与本文所述的构建体、方法和实施方案一起使用的TCR和抗原结合蛋白包括，例如，表3中列出的那些(SEQ ID NO:13-92)以及美国专利公开号20170267738、美国专利公开号20170312350、美国专利公开号20180051080、美国专利公开号20180164315、美国专利公开号20180161396、美国专利公开号20180162922、美国专利公开号20180273602、美国专利公开号20190016801、美国专利公开号20190002556和美国专利公开号20190135914中描述的那些TCR和抗原结合蛋白，这些这些专利公开内容及其中描述的序列表透过引用整体并入本文。
一方面，能够与本文所述构建体、方法和实施方案一起使用的TCR和抗原结合蛋白包括，例如，与“靶抗原(TA)肽”结合的TCR和抗原结合蛋白。
在本发明背景下使用的“靶抗原(TA)肽”系指从感染或肿瘤物质中分离和鉴定的肽，例如，从结核病患者或从爱泼斯坦-巴尔病毒感染者或癌症患者中分离的物质。TA肽的来源蛋白在感染细胞或肿瘤细胞中接受抗原加工，接着透过MHC分子在细胞表面提呈，该细胞(特别是TA肽/MHC复合体)因此可被宿主的免疫效应细胞(例如T细胞或NKT细胞)识别。本发明背景下的TA肽包含10、12或14(诸如8至14、8至12，例如，9至11)个氨基酸或由其组成。在本发明背景下，当提及特异性TA肽时，其称为TA-C。TA抗原肽(例如，TA-C肽)的实例为病毒抗原肽、细菌抗原肽或肿瘤相关抗原(TAA)抗原肽，优选为TAA抗原肽。因此，在一实施方案中，TA抗原肽，特别是TA-C，为病毒肽、细菌肽或肿瘤相关抗原(TAA)抗原肽，优选为TAA抗原肽。
本发明背景下的“病毒抗原肽”为MHC分子提呈于患病细胞表面上且为病毒来源的抗原肽，即，该细胞通常被所述病毒感染。此类病毒抗原肽已经在人类免疫缺陷病毒(HIV)、人巨细胞病毒(HCMV)、巨细胞病毒(CMV)、人乳头瘤病毒(HPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒感染(HPV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、流感病毒的感染背景下发现。因此，本发明背景下的病毒抗原肽可为选自由HIV抗原肽、HCMV抗原肽、CMV抗原肽、HPV抗原肽、HBV抗原肽、HCV抗原肽、EBV抗原肽、流感抗原肽(优选为HIV、HBV、流感和HCMV抗原肽)组成的组中的抗原肽。
能够与本文所述方法和实施方案一起使用的病毒抗原肽包括下表中所述的那些病毒抗原肽。一方面，能够与本文描述方法和实施方案一起使用的病毒抗原肽包括至少一种病毒抗原肽，其包含选自SEQ ID NO:96至SEQ ID NO:98的氨基酸序列中的氨基酸序列或由其组成，如下表1所示。
表1：病毒抗原肽列表
Figure GDA0003987788970000941
Figure GDA0003987788970000951
本发明背景下的“细菌抗原肽”为MHC分子提呈于患病细胞表面上且为细菌来源的抗原肽，即，该细胞通常被所述细菌感染。此类细菌抗原肽已经在例如结核分枝杆菌感染背景下发现。因此，本发明背景下的细菌抗原肽可为结核分枝杆菌抗原肽。
“肿瘤相关抗原(TAA)肽”在本文中也称为“TAA肽”，是指从肿瘤材料中分离和鉴定的肽，并且在肿瘤细胞中进行抗原加工，从而可被宿主的免疫效应细胞识别。TAA肽包含10、12或14(诸如8至14、8至12，例如，9至11)个氨基酸或由其组成。本发明背景下的TAA肽可为例如癌症/睾丸(CT)抗原肽。癌症/睾丸(CT)抗原肽的实例为氨基酸序列SEQ ID NO:216的MAGE-A抗原肽和氨基酸序列SEQ ID NO:148的PRAME抗原肽。本发明背景下的TAA肽包含T细胞表位，在一般情况下也可以称为TAA肽，在本发明提及一种特异性TAA肽的背景下也可称为TAA肽C。
一方面，能够与本文所述的方法和实施方案一起使用的肿瘤相关抗原(TAA)肽包括，例如，美国专利公开号20160187351、美国专利公开号20170165335、美国专利公开号20170035807、美国专利公开号20160280759、美国专利公开号20160287687、美国专利公开号20160346371、美国专利公开号20160368965、美国专利公开号20170022251、美国专利公开号20170002055、美国专利公开号20170029486、美国专利公开号20170037089、美国专利公开号20170136108、美国专利公开号20170101473、美国专利公开号20170096461、美国专利公开号20170165337、美国专利公开号20170189505、美国专利公开号20170173132、美国专利公开号20170296640、美国专利公开号20170253633、美国专利公开号20170260249、美国专利公开号20180051080和美国专利公开号20180164315所述的TAA肽，本文所述的这些专利公开内容和序列表透过引用整体并入本文。
一方面，本文所述的双特异性抗原结合蛋白，特别是本发明背景下的抗原结合位点B，可选择性地识别提呈上述一种或多种专利和出版物中所述的TAA肽的细胞。另一方面，能够与本文描述的方法和实施方案一起使用的TAA包括至少一个TAA，其由选自SEQ ID NO:99至256，优选为SEQ ID NO:148和216的氨基酸序列中的氨基酸序列组成。一方面，双特异性抗原结合蛋白，特别是双特异性抗原结合蛋白的抗原结合位点B，可选择性地识别提呈TAA肽/MHC复合体的细胞，其中TAA肽包含SEQ ID NO:99至256的氨基酸序列或本文所述专利或申请中描述的任何氨基酸序列(优选为SEQ ID NO:148和216)或由其组成。
此外，在本发明背景下的TA抗原肽为MHC-I类分子或MHC-II类分子(优选为MHC-I类分子)的特异性配体。
在本发明背景下，TAA抗原肽C优选为选自由SEQ ID NO:99至256的氨基酸序列组成的TAA抗原肽组，优选为包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列“SLLQHLIGL”或由其组成的PRAME抗原肽，或包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列“KVLEHVVRV”或由其组成的MAGE-A抗原肽，更优选为SEQ ID NO:216，其中MHC优选为HLA-A*02。
另一方面，二聚体Z1Z2和/或二聚体Y1Y2可以为选自R11KEA(SEQ ID NO:13和14)、R20P1H7(SEQ ID NO:15和16)、R7P1D5(SEQ ID NO:17和18)、R10P2G12(SEQ ID NO:19和20)、R10P1A7(SEQ ID NO:21和22)、R4P1D10(SEQ ID NO:23和24)、R4P3F9(SEQ ID NO:25和26)、R4P3F9-B4(SEQ ID NO:25和92)、R4P3F9-A1B4(SEQ ID NO:91和92)、R4P3H3(SEQ IDNO:27和28)、R36P3F9(SEQ ID NO:29和30)、R52P2G11(SEQ ID NO:31和32)、R53P2A9(SEQID NO:33和34)、R26P1A9(SEQ ID NO:35和36)、R26P2A6(SEQ ID NO:37和38)、R26P3H1(SEQID NO:39和40)、R35P3A4(SEQ ID NO:41和42)、R37P1C9(SEQ ID NO:43和44)、R37P1H1(SEQID NO:45和46)、R42P3A9(SEQ ID NO:47和48)、R43P3F2(SEQ ID NO:49和50)、R43P3G5(SEQID NO:51和52)、R59P2E7(SEQ ID NO:53和54)、R11P3D3(SEQ ID NO:55和56)、R16P1C10(SEQ ID NO:57和58)、R16P1E8(SEQ ID NO:59和60)、R17P1A9(SEQ ID NO:61和62)、R17P1D7(SEQ ID NO:63和64)、R17P1G3(SEQ ID NO:65和66)、R17P2B6(SEQ ID NO:67和68)、R11P3D3KE(SEQ ID NO:69和70)、R39P1C12(SEQ ID NO:71和72)、R39P1F5(SEQ ID NO:73和74)、R40P1C2(SEQ ID NO:75和76)、R41P3E6(SEQ ID NO:77和78)、R43P3G4(SEQ IDNO:79和80)、R44P3B3(SEQ ID NO:81和82)、R44P3E7(SEQ ID NO:83和84)、R49P2B7(SEQ IDNO:85和86)、R55P1G7(SEQ ID NO:87和88)或R59P2A7(SEQ ID NO:89和90)的TCRα链和TCRβ链。
表2显示了肽与MHC分子复合时，与哪些TCR结合的肽的实例。
表2
Figure GDA0003987788970000991
一方面，能够与本文所述的方法和实施方案一起使用的肿瘤相关抗原(TAA)肽包括，例如，表4中所列的那些以及美国专利公开号20160187351、美国专利公开号20170165335、美国专利公开号20170035807、美国专利公开号20160280759、美国专利公开号20160287687、美国专利公开号20160346371、美国专利公开号20160368965、美国专利公开号20170022251、美国专利公开号20170002055、美国专利公开号20170029486、美国专利公开号20170037089、美国专利公开号20170136108、美国专利公开号20170101473、美国专利公开号20170096461、美国专利公开号20170165337、美国专利公开号20170189505、美国专利公开号20170173132、美国专利公开号20170296640、美国专利公开号20170253633、美国专利公开号20170260249、美国专利公开号20180051080和美国专利公开号20180164315所述的那些TAA肽，每个这些专利公开内容和序列表透过引用整体并入本文。
另一方面，二聚体Z1Z2和/或二聚体Y1Y2可以为T细胞二聚体信号传导模组，例如CD3δ/ε、CD3γ/ε和CD247ζ/ζ或ζ/η、TCRα可变区(Vα)和TCRβ可变区(Vβ)的二聚体、免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)的二聚体、Vα和VH的二聚体、Vα和VL的二聚体、Vβ和VH的二聚体或Vβ和VL的二聚体。
另一方面，二聚体Z1Z2和/或二聚体Y1Y2可以为TCR共受体，例如CD8α链和CD8β链、CD4α链和CD4β链，或任何其他合适的二聚膜受体，优选为CD8+T细胞和/或CD4+T细胞中表达的那些。
在一些方面，二聚体Z1Z2为TCR，二聚体Y1Y2为TCR共受体。
弗林蛋白酶为普遍存在的枯草杆菌蛋白酶样前蛋白转化酶，其天然底物包括某些血清蛋白和生长因子受体，例如胰岛素样生长因子受体。弗林蛋白酶裂解的共有序列为RXXR(SEQ ID NO:93)，但是实际裂解的潜力取决于底物三级结构和识别位元点紧邻的氨基酸。添加弗林蛋白酶裂解位点加上连接子序列(例如GSG或SGSG(SEQ ID NO:5))可以实现高效的基因表达。
一方面，串联排列的弗林蛋白酶-连接子-2A肽的核苷酸序列可以位于Z1和Z2之间、Z1和Y1之间、Z1和Y2之间、Z2和Y1之间、Z2和Y2之间和/或Y1和Y2之间。弗林蛋白酶可以具有RXXR(SEQ ID NO:93)的共有序列，例如RAKR(SEQ ID NO:10)。连接子序列可以为3至10个氨基酸长，例如3至8个氨基酸长、3至5个氨基酸长或3至4个氨基酸长。在一些方面，连接子序列可以为SGS、GGGS(SEQ ID NO:257)、GGGGS(SEQ ID NO:258)、GGSGG(SEQ ID NO:259)、TVAAP(SEQ ID NO:260)、TVLRT(SEQ ID NO:261)、TVSSAS(SEQ ID NO:262)。在一些方面，连接子序列可以为GSG或SGSG(SEQ ID NO:5)。2A肽可以选自P2A(SEQ ID NO:3)、T2A(SEQ ID NO:4)、E2A(SEQ ID NO:5)、F2A(SEQ ID NO:6)或其任何组合。
另一方面，串联排列的连接子-2A肽的核苷酸序列可以位于Z1和Z2之间、Z1和Y1之间、Z1和Y2之间、Z2和Y1之间、Z2和Y2之间和/或Y1和Y2之间。连接子序列可以为GSG或SGSG(SEQ ID NO:5)。2A肽可以选自P2A(SEQ ID NO:6)、T2A(SEQ ID NO:7)、E2A(SEQ ID NO:8)、F2A(SEQ ID NO:9)或其任何组合。
治疗性组合物
本发明还提出了一种治疗性组合物，其包含本文所述的转导细胞群，如转导的T细胞。
本公开的组合物还可包含一种或多种佐剂。佐剂是那些非特异性地增强或加强免疫反应的物质(例如，透过CD8-阳性T细胞和辅助T(TH)细胞介导的对一种抗原的免疫应答，因此被视为对本发明的药剂有用。适合的佐剂包括(但不仅限于)1018ISS、铝盐、
Figure GDA0003987788970001021
AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、鞭毛蛋白或鞭毛蛋白衍生的TLR5配体、FLT3配体、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特
Figure GDA0003987788970001031
resiquimod、ImuFact IMP321、白细胞介素IL-2、IL-13、IL-21、干扰素α或β，或其聚乙二醇衍生物、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、ISCOMs、
Figure GDA0003987788970001032
LipoVac、MALP2、MF59、单磷醯脂A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、水包油和油包水乳状液、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、OspA、
Figure GDA0003987788970001033
载体系统、基于聚丙交酯复合乙交酯[PLG]和右旋糖苷微粒、重组人乳铁传递蛋白SRL172、病毒体和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、源自皂角苷、分支杆菌提取物和细菌细胞壁合成模拟物的Aquila公司的QS21刺激子，以及其他专有佐剂，如：Ribi's Detox、Quil或Superfos。优选佐剂如：弗氏佐剂或GM-CSF。前人对一些树突状细胞特异性免疫佐剂(如MF59)及其制备进行了描述(Allison and Krummel,1995)。也可使用细胞因子。一些细胞因子直接影响树突状细胞向淋巴组织迁移(如，TNF-)，加速树突状细胞成熟为T淋巴细胞的有效抗原提呈细胞(如，GM-CSF、IL-1和IL-4)(美国5849589号专利，特别以其完整引用形式并入本文)，并充当免疫佐剂(如IL-12、IL-15、IL-23、IL-7、IFN-α、IFN-β)(Gabrilovich et al.,1996)。
据报告，CpG免疫刺激寡核苷酸可提高佐剂在疫苗中的作用。如果没有理论的约束，CpG寡核苷酸可透过Toll样受体(TLR)(主要为TLR9)启动先天(非适应性)免疫系统从而起作用。CpG引发的TLR9活化作用提高了对各种抗原的抗原特异性体液和细胞反应，这些抗原包括肽或蛋白抗原、活病毒或被杀死的病毒、树突状细胞疫苗、自体细胞疫苗以及预防性和治疗性疫苗中的多糖结合物。更重要的是，它会增强树突状细胞的成熟和分化，甚至在CD4T细胞帮助不存在下导致TH1细胞的活化增强以及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)生成加强。由TLR9刺激所诱发的TH1偏移甚至在有疫苗佐剂的存在下也能维持，这些佐剂如：正常促进TH2偏移的明矾或弗氏不完全佐剂(IFA)。CpG寡核苷酸与其他佐剂一起制备或联合给药，或在如微粒、纳米粒子、脂肪乳或类似制剂的配方中时表现出甚至更强的佐剂活性，当抗原相对较弱时，这些对诱发强反应尤为必要。它们还能加速免疫反应，使抗原剂量减少约两个数量级，产生与一些实验中不含CpG的全剂量疫苗可相比的抗体反应(Krieg,2006)。美国6406705 B1号专利对组合使用CpG寡核苷酸、非核酸佐剂和抗原以诱导抗原特异性免疫反应进行了描述。一种CpG TLR9拮抗剂为Mologen公司(德国柏林)的dSLIM(双干环免疫调节剂)，这是本发明药物组合物的优选成分。也可使用其他如TLR结合分子，如：RNA结合TLR7、TLR8和/或TLR9。
其他有用的佐剂例子包括(但不限于)化学修饰性CpG(如CpR、Idera)、dsRNA模拟物，如，Poly(I:C)及其衍生物(如：
Figure GDA0003987788970001051
Figure GDA0003987788970001052
多聚-(ICLC)、多聚(IC-R)、多聚(I:C12U))、非CpG细菌性DNA或RNA以及免疫活性小分子和抗体，如：环磷醯胺、舒尼替单抗、免疫检查点抑制剂(包括ipilimumab、nivolumab、pembrolizumab、atezolizumab、avelumab、durvalumab和cemiplimab)、
Figure GDA0003987788970001053
西乐葆、NCX-4016、西地那非、他达拉非、伐地那非、索拉非尼、替莫唑胺、替西罗莫司、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、VEGFTrap、ZD2171、AZD2171、抗-CTLA4、免疫系统的其他抗体靶向性主要结构(如：抗-CD40、抗-TGFβ、抗-TNFα受体)和SC58175，这些药物都可能有治疗作用和/或充当佐剂。技术人员无需过度实验就很容易确定本发明中有用的佐剂和添加剂的数量和浓度。
优选的佐剂为抗-CD40、咪喹莫特、雷西喹莫特、GM-CSF、环磷醯胺、舒尼替尼、贝伐单抗、阿特珠单抗、干扰素-α、干扰素-β、CpG寡核苷酸和衍生物、聚(I:C)和衍生物、RNA、西地那非、含聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)的颗粒制剂、病毒体和/或白介素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21和IL-23。
本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂从由集落刺激因子组成组中选择，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭)、环磷醯胺、咪喹莫特、resiquimod和干扰素-α。
本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂从由集落刺激因子组成组中选择，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭)、环磷醯胺、咪喹莫特和resimiquimod。在本发明药物组合物的一个优选实施方案中，佐剂为环磷醯胺、咪喹莫特或resiquimod。更优选的佐剂是Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA50V、Montanide ISA-51、聚-ICLC
Figure GDA0003987788970001061
和抗CD40 mAB或其组合物。
多肽的制造方法
本发明还涉及产生表达蛋白(例如，治疗性蛋白质)的重组宿主细胞的方法，所述方法包括由以下组成的步骤：(i)在体外或离体将本发明的载体引入胜任宿主细胞，(ii)体外或离体培养获得的重组宿主细胞，和(iii)，任选地，选择表达和/或分泌所述蛋白质的细胞。
本发明还提出了使用载体(例如本文公开的慢病毒转导载体)来生产多肽的方法和此类方法的产物。所述方法可包含以下步骤中的一个或多个，例如，用慢病毒转导载体转导宿主细胞以形成转导的宿主细胞，其中所述载体包含编码目的异源多肽的可表达异源多核苷酸；在有效产生所述目的多肽的条件下培养所述转导的宿主细胞；当多肽分泌入培养基中时，从所述宿主(例如从培养基)中分离多肽。编码多肽的异源多核苷酸序列可以包含转录、翻译和/或分泌入培养基中所需的任何其他序列(例如，分泌序列)。根据本发明可以转导任何细胞系，包括例如CHO(如CHO DG44)和HEK 293(如HEK293F)。
转导载体可以常规制备，包括根据本文所述的方法。例如，可以在有效产生功能性转导载体的条件下，用辅助质粒(含有合适的包膜和gag/pol前体)和含有异源NOI的转移载体来转化生产细胞系。可以选择具有转导将制备多肽之靶宿主细胞能力的包膜蛋白。
宿主细胞的实例包括例如哺乳动物细胞系(例如，Vero细胞、CHO细胞、3T3细胞、COS细胞等)以及原代或建立的细胞培养物(例如，由淋巴母细胞、成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等形成的)。实例还包括：小鼠SP2/0-Ag14细胞(ATCCCRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580)、CHO细胞(其中二氢叶酸还原酶基因(下称“DHFR基因”)有缺陷，Urlaub G et al；1980)，大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC CRL1662，下称“YB2/0细胞”)等。对于一些治疗性抗体，可优选YB2/0细胞，这是因为当嵌合或人源化抗体在该细胞中表达时，其ADCC活性增强。
一方面，宿主细胞可包括T细胞，例如，CD4+T细胞、CD8+T细胞、γδT细胞和/或天然杀伤T细胞。
另一方面，宿主细胞可包括自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞、巨噬细胞和/或癌细胞。
另一方面，宿主细胞可以不包括NK细胞。
另一方面，宿主细胞可以不包括癌细胞。
特别地，对于表达治疗性蛋白质，例如二聚体治疗性蛋白质，所述表达载体可以为其中编码一个多肽(链)的基因和编码另一多肽(链)的基因存在于分开的载体上的类型或其中两个基因都存在于同一载体上的类型(串联型)中的任一种。从构建抗体或TCR表达载体的容易程度、引入动物细胞的容易程度以及动物细胞中抗体H和L链或α和β链表达水平之间的平衡方面考虑，优选串联型表达载体(Shitara K et al.J Immunol Methods.1994Jan.3；167(1-2):271-8)。
为了制备流感疫苗，优选以下细胞系和相应的包膜蛋白，例如，HEK293或CHO；VSV-G、ampho、Mokola和Paramyxoviridae(例如，请参阅ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/fs_param.htm)。
可以表达任何合适或所需的异源序列，包括例如疫苗、干扰素(α、β、γ、ε)、促红细胞生成素、因子VIII、凝血因子、抗体及其片段(例如，包括单链、Fab和人源化)、胰岛素、趋化因子、细胞因子、生长因子、血管生成调节因子、细胞凋亡调节因子等。可以常规制备单链抗体(例如，单链可变片段或“scFv”)。
在本发明的某些实施方案中，慢病毒转导载体可以用于制备用作疫苗的抗原制剂。根据本发明可以制备任何合适的抗原，包括从传染性蛋白颗粒、病毒、分枝杆菌、原生动物(例如恶性疟原虫(疟疾))、锥虫、细菌(例如链球菌、奈瑟氏球菌等)中获得的抗原，等等。
可以用包含一个或多个异源NOI的单个慢病毒载体或用多个慢病毒载体转导宿主细胞，其中每个载体包含相同或不同的异源NOI。例如，可以透过在分开的载体上表达各个亚基，但用所有载体感染同一宿主细胞，从而在宿主细胞内发生组装来制备多亚基抗原(包括细胞内和细胞表面的多亚基组分)。
疫苗通常包含多种抗原组分，例如，衍生自不同蛋白质和/或相同蛋白质的不同表位元区域。例如，针对病毒性疾病的疫苗可包含一个或多个从病毒获得的多肽序列，其中当将其施用于宿主时，可引发针对病毒激发的免疫原性或保护性应答。
如上所述，本发明还可以用于制备多肽多聚体，例如其中产生的抗原制剂由一种以上的多肽组成。例如，病毒衣壳可以由一个以上的多肽亚基组成。透过用携带不同病毒包膜序列的载体转导宿主细胞，当蛋白质在细胞中表达时，可以自组装为三维结构，其包含一个以上的蛋白质亚基(例如，以其天然构型存在)。所述结构可以具有功能活性，包括抗原活性、酶活性、细胞结合活性等。此外，当在合适的细胞系中表达时，它们可以分泌至细胞培养基中，从而促进纯化。例如，当使用慢病毒转导载体将流感N和H衣壳蛋白以及任选M蛋白(见下文)引入生产细胞系时，可在细胞中形成空衣壳或病毒样颗粒(VLP)，然后分泌到培养基中。此类VLP可以常规分离和纯化，然后作为流感疫苗施用。例如，VLP为不包含大量(例如，空的)病毒RNA的自组装衣壳。VLP优选能够引发免疫应答，可有效地提供至少某种程度的保护以抵抗天然感染性病毒颗粒的激发，或者至少引发对抗其之抗体。
当前，有许多可用的病毒疫苗，包括针对诸如麻疹、腮腺炎、肝炎(A和B型)、风疹、流感、脊髓灰质炎、天花、水痘、腺病毒、日本脑炎、狂犬病、埃博拉病毒等疾病的疫苗。本发明可用于制备针对任何上述疾病的疫苗。
根据本发明可产生疫苗的病毒实例包括例如正粘病毒、流感病毒A(包括其HA和NA蛋白变化的所有毒株，例如(非限制性实例)，H1N1、H1N2、H2N2、H3N2、H7N7和H3N8)；乙型流感、丙型流感、托高土病毒(包括Dhori、Batken病毒、SiAR 126病毒)和isa病毒(例如、传染性鲑鱼贫血病毒)。这些包括从所有物种类型中分离或传播的流感，包括从无脊椎动物、脊椎动物、哺乳动物、人类、非人类灵长类动物、猴子、猪、牛和其他牲畜、鸟类、家禽(如火鸡、鸡、鹌鹑和鸭子)、野鸟(包括水生和陆生鸟类)、爬行动物等之分离物。这些还包括例如透过突变、抗原漂移、抗原转移、重组等而发生变化的现有毒株，尤其是毒力和/或物种种间传播(例如、人与人之间传播)增加的毒株。
特别关注的是大流行和/或交叉物种的流感病毒，这是因为它们具有广泛的宿主范围，或由于在感染宿主中重组，和/或由于自然发生或定向突变。例如，H5N1(指病毒上存在的表面抗原亚型，血凝素5型和神经氨酸酶1型)为A型禽流感的亚型，其引起了亚洲家禽流感的爆发。截至2005年11月，超过1.2亿只禽类因感染而死亡或被杀死，以防止感染进一步扩散。此病毒还传播到人类宿主(“禽流感”)，与高致死率有关。
流感抗原制剂(例如疫苗)可包含在流感病毒粒子中天然存在的一种或多种多肽。但是，它优选不包含会产生天然病原性病毒的所有多肽基因。这些包括，例如，血凝素(由HA基因编码)、神经氨酸酶(由NA基因编码)、核蛋白(由NA基因编码)、基质(M1)蛋白(由M基因编码)、M2(由M基因编码)、非结构性蛋白(由NS基因编码)和聚合酶。天然存在的病毒粒子被包裹在脂质双层中，所述脂质双层用完整蛋白H和N“点缀”(“衣壳层”)。基质蛋白(M1)在病毒膜下方形成蛋白层(“基质层”)，并参与病毒的组装、稳定性和完整性。例如，参见Harriset al.,Virol.289:34-44,2001。M2蛋白为膜蛋白离子通道。本发明的VLP可以包含H、N以及任选M1和M2蛋白。所述蛋白质的序列为本领域已知和/或可在GenBank中确定。例如，参见Widjaja et al.J.Virol.,78:8771-8779,2004，了解M1和M2序列。
这些可以单独地或在同一质粒上克隆至转移载体中，并用于产生转导载体。在本发明的一实施方案中，可以制备多个转导载体，其中每个包含独特的流感基因序列(例如，编码H、N和M1以产生三种不同的转导载体)。当此类载体在同一宿主细胞(例如CHO或HEK293)中共表达时，会产生自组装VLP，其可以分泌到培养基中，透过离心收集，然后作为疫苗施用。
本发明的转导载体可导致高水平的异源蛋白生产，例如当此类蛋白质被分泌到培养基中时，每ml未加工培养基约0.1至0.3mg/ml至约5-10mg/ml或更多的重组异源蛋白。
本申请还提出了产生抗体的方法。例如，提出了无需杂交瘤或动物模型即可产生单克隆抗体(例如人、小鼠和其他哺乳动物类型)的方法。在一非限制性实例中，表达致癌蛋白的慢病毒载体在来自先前用抗原刺激的小鼠的外周血B细胞中被转导。这些载体有效地转导小鼠细胞，使其成为抗体产生细胞。在第二个非限制性实例中，工程改造了两个慢病毒载体，一个表达重抗体链，第二个载体表达轻抗体链。基因的恒定区衍生自人(或其他物种，如需要)免疫球蛋白基因(例如，IgG、IgM或其他类型的Ig)。基因的可变区被修饰或简并以产生多样性。简并序列可以透过本领域已知的任何合适技术获得，并克隆到慢病毒载体中，以创建表达重或轻免疫球蛋白分子的慢病毒载体文库。可以透过用两种载体转导细胞以产生同时包含重链和轻链的功能性抗体来产生抗体。可以选择并筛选转导和表达细胞与抗原的结合，然后可分离阳性克隆并进行多轮亲和力成熟处理。
此方法的优点是以无偏移方法产生抗体。其他方法，例如传统的杂交瘤和Xenomouse技术，依赖于已对特定抗体克隆进行了克隆选择和删除的B细胞，因为它们对内源性(例如，小鼠组织)具有反应性。这些删除克隆中的一些抗体可能有价值，因为它们可与人抗原发生交叉反应。所述方法的优点是：没有分子抗体克隆删除，并且它们都以无偏倚的方法进行了分析，并且为完全人源化(如果需要人源化)抗体分子。慢病毒载体的另一优点是：可以将基因以高复数转导至细胞中，从而在一个细胞中产生多种抗体类型。这减少了创建包含非常多样抗原结合位点的文库所需的细胞数量。第二个优点是：将重基因和轻基因置于不同的慢病毒载体，以便透过高于1的感染复数转导细胞可以产生额外的多样性。例如，如果每个表达重链和轻链的慢病毒载体以MOI 10用于转导细胞，那么每个细胞中产生的抗体组合数量为100。因此，在96孔板中，单个孔中大约有10,000个细胞，用这种方法可以产生的可能变体数量在96孔板的单孔中为1,000,000。因此，利用这种方法可以大规模产生大量抗体变体。所述方法不限于针对每个细胞的每个构建体使用10的MOI，也可以根据需要使用更高的MOI。例如，如果使用100的MOI，则每个细胞可产生10,000个变体抗体，而96孔板的每个孔可产生10,000,000,000个变体。因此，每个96孔板可产生1x1012个变体抗体分子，其可用于针对靶抗原进行筛选，对此，本领域有已知许多方法(例如，ELISA)。一旦鉴定出可产生所需抗体反应的特定孔，则可透过有限稀释法克隆细胞，以找到表达正确抗体的细胞克隆。一旦鉴定出此克隆，则可以使用PCR克隆出表达抗体重链和轻链的载体。然后，可以将载体DNA用辅助构建体转染以产生载体。或者，可以用辅助构建体直接转染细胞的此克隆(PEI、磷酸钙、脂质转染或本领域已知的其他转染方法)，以产生变体慢病毒载体。然后，可以滴定产生的载体，之后以较低的MOI、但更多数量的细胞转导到细胞上，以分离出产生目的抗体的克隆。分离出细胞克隆后，则可以透过以更高感染复数转导细胞来产生更高滴度的抗体，同样的方法不仅限于完整抗体分子，还可以应用于单链抗体、抗体片段、噬菌体展示和其他抗体样分子，这些都是本领域已知的。除了表达抗体之外，载体还可以表达其他基因以增加单克隆抗体的生产或增加其产量。此类基因可以为癌基因，例如ras和myc，但是也可以使用其他基因，例如抗凋亡基因，例如Bcl-2。此外，此类载体可用于从已暴露于抗原的动物血液中的B细胞产生单克隆抗体。例如，可以透过使用癌基因或基因沉寂RNA的组合，将暴露于抗原的小鼠的B细胞转化为骨髓瘤细胞。此类基因包括例如：生长因子，包括例如双调蛋白、B淋巴细胞刺激物、白介素16(IL16)、胸腺生成素、TRAIL、Apo-2、前B细胞集落增强因子、内皮细胞分化相关因子1(EDF1)、内皮单核细胞活化多肽II、巨噬细胞迁移抑制因子MIF、自然杀伤细胞增强因子(NKEFA)、骨形态发生蛋白8(成骨蛋白2)、骨形态发生蛋白6、结缔组织生长因子(CTGF)、CGI-149蛋白(神经内分泌分化因子)、细胞因子A3(巨噬细胞炎性蛋白1-α)、成胶质细胞瘤细胞分化相关蛋白(GBDR1)、肝肿瘤源性生长因子、神经介素U-25前体、任何肿瘤基因、癌基因、原癌基因或细胞调节基因(参见condor.bcm.tmc.edu/oncogene)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子B(VEGF-B)、T细胞特异性RANTES前体、胸腺树突状细胞衍生因子1；受体，例如启动素A受体II型(ACVR2)、β信号序列受体(SSR2)、CD14单核细胞LPS受体、CD36(胶原蛋白1型/血小板反应蛋白受体)样2、CD44R(Hermes抗原gp90归巢受体)、G蛋白偶联受体9、趋化因子CxC受体4、集落刺激因子2受体β(CSF2RB)、FLT-3受体酪氨酸激酶、类似于暂态受体电位C前体、杀伤细胞凝集素样受体亚家族B、低密度脂蛋白受体基因、低亲和力Fc-γ受体IIC、MCP-1受体、单核细胞趋化蛋白1受体(CCR2)、核受体亚家族4组A成员1、孤儿G蛋白偶联受体GPRC5D、过氧化物酶体增殖启动受体γ、Pheromore相关受体(大鼠)、血管加压素启动钙移动推定受体、视黄酸x受体、Toll样受体6、跨膜启动剂和CAML相互作用剂(TACI)、B细胞成熟肽(BCMA)、CSF-1受体、干扰素(α、β和γ)受体1(IFNAR1)。
治疗方法
本文提供的载体可用于多种治疗方法。
在一些方面，提出了用于治疗用途的慢病毒载体，其表达天然或融合多肽，其包含人趋化因子和病毒或细菌抗原(例如HIV、白喉毒素抗原)、趋化因子(例如IP-10、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MIP1、RANTES、SDF-1、MIG和/或MDC)或促凋亡蛋白(这是一种自杀基因蛋白或可促进炎症反应的蛋白)中的任何单个或组合。
此外，本发明提出了受试者中产生免疫应答的方法，其包括向受试者施用本发明的任何单个或融合多肽，例如，趋化因子和人免疫缺陷病毒(HIV)抗原或趋化因子、促凋亡基因、自杀基因和肿瘤抗原，它们作为蛋白质或编码从慢病毒载体表达的个体或融合多肽的核酸。还提出了一种治疗受试者癌症的方法，其包含向受试者施用表达本发明的任何个体或融合多肽(例如趋化因子和肿瘤抗原)的慢病毒载体，它们作为蛋白质或编码融合多肽的核酸。
进一步提出了一种治疗或预防受试者中HIV感染的方法，其包含对受试者施用源自以下蛋白质的以下肽的任何组合：趋化因子、自杀基因、HIV蛋白、细胞因子、细胞表面蛋白、肿瘤抗原或影响细胞中HIV产生的任何细胞基因(透过过度表达细胞基因或透过RNAi抑制其表达等)，所有均从慢病毒载体提供和表达。
在一些方面，可以施用本文所述的包含工程化改造的免疫细胞，例如T细胞(例如，γδT细胞)的组合物，以用于预防和/或治疗。在治疗应用中，药物组合物可以以足以治愈或至少部分阻止疾病或病症症状的量给予已患有疾病或病症的受试者。还可给予改造免疫细胞以减少病症发展、感染或恶化的可能性。用于治疗用途的有效量改造免疫细胞群可能根据疾病或病症的严重程度和病程、先前疗法、受试者的健康状况、体重和/或对药物的反应和/或治疗医师的判断而不同。
本公开内容的改造免疫细胞(如T细胞)可用于治疗需要治疗病症(例如，本文所述的癌症)的受试者。
用工程改造的免疫细胞(例如工程改造的T细胞)治疗受试者病症(例如疾病)的方法，可包括向受试者施用治疗有效量的工程改造免疫细胞，例如工程改造的T细胞。本公开的工程改造免疫细胞，例如工程改造T细胞，可以以各种方案(例如，时间、浓度、剂量、治疗间隔和/或制剂)施用。在接受本公开的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)之前，还可以用，例如，化学疗法、放射疗法或两者的组合对受试者进行预处理。在施用于受试者之前，还可以冷冻或冷冻保存工程改造的免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)群。工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)群可包括表达相同、不同或相同和不同肿瘤识别部分组合的两种或更多种细胞。例如，工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)群可包括几种不同的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)，其被设计用于识别不同抗原或相同抗原的不同表位。
本公开的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)可用于治疗各种病症。一方面，本公开的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)可用于治疗癌症，包括实体瘤和恶性血液病。癌症的非限制性实例包括：急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、神经母细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤(如：小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特淋巴瘤、原发性未知癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、结缔组织增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因氏肉瘤、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌(肝癌)、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌(如：非小细胞和小细胞肺癌)、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、原发灶隐匿的转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤征候群、骨髓增生异常征候群、骨髓性白血病、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、胰腺癌、胰腺癌胰岛细胞、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、浆细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、默克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤(妊娠)、原发部位未知癌、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
一方面，本公开的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)可用于治疗传染病。另一方面，本公开的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)可用于治疗传染病，传染病可由病毒引起。再一方面，本公开的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)可用于治疗免疫疾病，例如，自身免疫疾病。
可以在病症临床发作之前、发作期间和发作之后向受试者提供本公开的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)治疗。在疾病临床发作后1天、1周、6个月、12个月或2年后，可向受试者提供治疗。在疾病临床发作后可能提供给受试者治疗超过1天、1周、1个月、6个月、12个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更长时间。在疾病临床发作后可能提供给受试者治疗少于1天、1周、1个月、6个月、12个月或2年。治疗还可能包括在临床试验中治疗人受试者。治疗可包括向受试者施用包含本公开的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)的药物组合物。
另一方面，向受试者施用本公开的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)可以调节受试者体内内源性淋巴细胞的活性。另一方面，向受试者施用工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)可以向内源性T细胞提供抗原并且可增强免疫应答。另一方面，记忆T细胞可以为CD4+T细胞。另一方面，记忆T细胞可以为CD8+T细胞。另一方面，向受试者施用本公开的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)可启动另一种免疫细胞的细胞毒性。另一方面，其他免疫细胞可以为CD8+T细胞。另一方面，其他免疫细胞可以为天然杀伤T细胞。另一方面，向受试者施用本公开的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)可抑制调节性T细胞。另一方面，调节性T细胞可以为FOX3+Treg细胞。另一方面，调节性T细胞可以为FOX3-Treg细胞。其活性可透过本公开的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)调节的细胞非限制性实例可能包括：造血干细胞；B细胞；CD4；CD8；红血球；白血球；树突细胞，包括树突抗原呈递细胞；白细胞；巨噬细胞；记忆B细胞；记忆T细胞；单核细胞；自然杀伤细胞；中性粒细胞；T辅助细胞；和T杀伤细胞。
在大多数骨髓移植期间，环磷醯胺与全身照射组合可常规用于防止受试者免疫系统对移植体的造血干细胞(HSC)产生排斥。一方面，可以进行供体骨髓与白细胞介素-2(IL-2)离体孵育以增强供体骨髓中杀伤性淋巴细胞的产生。白细胞介素-2(IL-2)是野生型淋巴细胞生长、增殖和分化所必需的细胞因子。目前关于将γδT细胞过继转移到人体中的研究可能需要共同施用γδT细胞和白细胞介素-2。然而，低剂量和高剂量的IL-2都可能具有高度的毒副作用。IL-2毒性可在多个器官/系统中表现出来，最显著的是心脏、肺、肾和中枢神经系统。另一方面，本公开内容提供了用于向受试者施用改造γδT细胞而不共同施用天然细胞因子或其修饰形式(例如IL-2、IL-15、IL-12、IL-21)的方法。另一方面，改造的γδT细胞可以在不与IL-2共同施用的情况下施用于受试者。另一方面，改造的γδT细胞可以在手术期间施用于受试者，例如，骨髓移植而不共同施用IL-2。
给药方法
可以以任何顺序或同时向受试者施用一种或多种工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)群。如果同时施用，多重工程改造免疫细胞(例如，T细胞)可以为单次统一的形式，例如：静脉内注射，或以多形式提供，例如，多次静脉内输注、皮下注射、注射或丸剂。工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)可以一起包装或单独包装在单个包装或多个包装中。可以以多剂量给予一种或所有工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)。如果不是同时施用，多次剂量之间的时间间隔可能有多达大约一周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或大约一年的不同。另一方面，工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)可以在施用于受试者后在受试者体内(活体内)扩增。可以冷冻工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)以提供细胞以相同的细胞制剂进行多次治疗。本公开的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)和包含该细胞的药物组合物可以作为套件包装。套件可包括关于工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)和包含该细胞的组合物的使用说明(例如，书面说明书)。
另一方面，治疗癌症的方法包括向受试者施用治疗有效量的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)，其中所述给药治疗癌症。在另一实施方案中，治疗有效量的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)可以施用至少约10秒、30秒、1分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或1年。另一方面，治疗有效量的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)可以施用至少一周。另一方面，治疗有效量的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)可以施用至少两周。
本文所述的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)可以在疾病或病症发生之前、发生期间或发生之后施用，并且施用含有工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)的药物组合物的时间可能不同。例如，工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)可以用作预防剂，并且可以连续给予有病症或疾病倾向的受试者，以减少疾病或病症发生的可能性。可以在症状发作期间或尽可能快地给予受试者工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)。工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)的给予可以在症状发作后立即、症状发作的前3小时内、症状发作的前6小时内、症状发作的前24小时内、症状发作的前48小时内或症状发作后的任何一段时间内立即启始。初始施用可透过任何实用的途径，例如：透过本文描述的任何途径使用本文描述的任何制剂给予。另一方面，本公开的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)可以是静脉内施用。一种或多种剂量的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)可在癌症、传染病、免疫疾病、败血症或骨髓移植开始后可实行时尽快施用，并持续一段用于治疗免疫疾病所需的时间，例如，从约24小时到约48小时、从约48小时到约1周、从约1周到约2周、从约2周到约1个月、从约1个月到约3个月。对于癌症治疗，可以在癌症发作后数年和其他治疗之前或之后施用一剂或多剂量的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)。另一方面，工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)可以施用至少约10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年或至少5年。每个受试者的治疗时间可能不同。
保存
一方面，免疫细胞(例如，T细胞)可以在冷冻介质中配制并置于低温储存装置(例如：液氮冷冻器(-196℃)或超低温冷冻器(-65℃、-80℃、-120℃或-150℃)中长期储存至少约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、3年或至少5年。冷冻介质可以含有二甲基亚碸(DMSO)和/或氯化钠(NaCl)和/或右旋糖和/或硫酸葡聚糖和/或羟乙基淀粉(HES)以及生理pH缓冲剂，以将pH保持在约6.0至约6.5、约6.5至约7.0、约7.0至约7.5、约7.5至约8.0或约6.5至约7.5之间。冷冻保存的免疫细胞(例如，T细胞)可以解冻并透过用本文所述的抗体、蛋白质、肽和/或细胞因子刺激进行进一步加工。冷冻保存的免疫细胞(例如，T细胞)可以解冻并用本文所述的病毒载体(包括逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)和慢病毒载体)或非病毒手段(包括RNA、DNA，例如转座子和蛋白质)进行基因修饰。可以进一步冷冻保存修饰的免疫细胞(例如，修饰的T细胞)以产生至少约1、5、10、100、150、200、500个小瓶量的细胞库，每mL冷冻介质中至少约101、102、103、104、105、106、107、108、109或至少约1010个细胞。冷冻保存的细胞库可以保留其功能并且可以解冻并进一步刺激和扩增。另一方面，可以在合适的封闭容器(例如：细胞培养袋和/或生物反应器)中刺激和扩增解冻的细胞，以产生大量细胞作为同种异体细胞产物。冷冻保存的免疫细胞(例如，T细胞)可以在低温储存条件下维持其生物学功能至少约6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、15个月、18个月、20个月、24个月、30个月、36个月、40个月、50个月或至少约60个月。另一方面，制剂中不使用防腐剂。冷冻保存的免疫细胞(例如，T细胞)可以解冻并作为同种异体现成的细胞产物输注到多个患者中。
一方面，本文所述的工程改造免疫细胞(例如，工程改造的T细胞)可能存在于组合物中，含量为至少1×103个细胞/ml、至少2×103个细胞/ml、至少3×103个细胞/ml、至少4×103个细胞/ml、至少5×103个细胞/ml、至少6×103个细胞/ml、至少7×103个细胞/ml、至少8×103个细胞/ml、至少9×103个细胞/ml、至少1×104个细胞/ml、至少2×104个细胞/ml、至少3×104个细胞/ml、至少4×104个细胞/ml、至少5×104个细胞/ml、至少6×104个细胞/ml、至少7×104个细胞/ml、至少8×104个细胞/ml、至少9×104个细胞/ml、至少1×105个细胞/ml、至少2×105个细胞/ml、至少3×105个细胞/ml、至少4×105个细胞/ml、至少5×105个细胞/ml、至少6×105个细胞/ml、至少7×105个细胞/ml、至少8×105个细胞/ml、至少9×105个细胞/ml、至少1×106个细胞/ml、至少2×106个细胞/ml、至少3×106个细胞/ml、至少4×106个细胞/ml、至少5×106个细胞/ml、至少6×106个细胞/ml、至少7×106个细胞/ml、至少8×106个细胞/ml、至少9×106个细胞/ml、至少1×107个细胞/ml、至少2×107个细胞/ml、至少3×107个细胞/ml、至少4×107个细胞/ml、至少5×107个细胞/ml、至少6×107个细胞/ml、至少7×107个细胞/ml、至少8×107个细胞/ml、至少9×107个细胞/ml、至少1×108个细胞/ml、至少2×108个细胞/ml、至少3×108个细胞/ml、至少4×108个细胞/ml、至少5×108个细胞/ml、至少6×108个细胞/ml、至少7×108个细胞/ml、至少8×108个细胞/ml、至少9×108个细胞/ml、至少1×109个细胞/ml或更多、从约1×103个细胞/ml至约至少1×108个细胞/ml、从约1×105个细胞/ml至约至少1×108个细胞/ml或从约1×106个细胞/ml至约至少1×108个细胞/ml。
一方面，根据本公开内容的一个方面，本文描述的方法可以用于产生自体或同种异体产物。
实施例
实施例1
表3.DNA和蛋白质序列
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表4.TAA肽序列
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实施例2
WPRE突变体的产生
野生型WPRE序列用于慢病毒构建体，以稳定和增强基因的转录。由于一些报告得出结论认为WPRE内的蛋白质(X蛋白)可导致肿瘤发生，因此美国FDA建议在临床试验中用于基因和细胞疗法的慢病毒构建体可以找到使用野生型WPRE的替代方法。我们相信满足FDA要求将使我们的T细胞产品能够用于临床试验，并有可能避免慢病毒载体设计某些方面的安全性问题。
探索了两种单独的WPRE突变策略，以尝试开发不表达功能性X蛋白而同时保持WPRE对基因表达的转录后增强作用的WPRE突变体。
开发了一种变体，其中X蛋白的启动子区域和X蛋白的起始密码子均突变(SEQ IDNO:4)。
开发了另一种变体，其中删除了X蛋白启动子和完整推定序列，以及突变WPRE中大于25aa的任何ORF的起始密码子(SEQ ID NO:3)。
实施例3
慢病毒构建体
本文使用的表达盒示意图见图3。
图4提供了在下文详述的实验中使用的慢病毒构建体中所使用盒的描述，用以检查WPRE突变体的疗效。
本文使用的慢病毒载体包含之前显示可增强载体功能的几种元件，包括用于改善复制和核输入的中央多嘌呤区(cPPT)、来自鼠干细胞病毒(MSCV)的启动子(SEQ ID NO:94)，其已被证明可以减少某些细胞类型的载体沉寂，并且骨架具有删除的3'-LTR自灭活(SIN)载体设计，可以提高安全性、维持基因表达和抗沉寂特性(Yang et al.Gene Therapy(2008)15,1411–1423)，其内容透过引用整体并入本文。
本文使用的慢病毒载体编码TCRα链和TCRβ链。特别地，本文使用的载体编码R4P3F9α和β链(SEQ ID NO:25和26)及其变体。以缩写“R4”开头的本文所述的载体编码野生型R4P3F9α和β链(SEQ ID NO:25和26)；以缩写“R4-B4”开头的载体编码野生型R4P3F9α链(SEQ ID NO:25)和变体R4P3F9β链(SEQ ID NO:92)；以缩写“R4-A1B4”开头的载体编码变体R4P3F9α链(SEQ ID NO:91)和变体R4P3F9β链(SEQ ID NO:92)(图4)。
对于上述的每个TCRαβ二聚体，检测了四个单独的WPRE变体。“变体A”是根据SEQID NO:2所述的野生型WPRE(阳性对照)；“变体B”不包含WPRE(阴性对照)；“变体C”包含根据SEQ ID NO:4所述的突变体WPRE，其中X蛋白启动子和起始密码子已突变；“变体D”包含根据SEQ ID NO:3所述的突变体WPRE，其中位于整个WPRE序列中的起始密码子已突变，X蛋白启动子和ORF已被删除。
实施例4
WPRE突变对T细胞中慢病毒构建体疗效的影响
T细胞在第0天从供体获得，于第1天启动，于第2天用上述实施例3中所述的各种慢病毒载体转导，于第6天收获用于检测。透过流式细胞术确定TCR表面表达，并透过qPCR确定载体拷贝数。
图5显示了用根据本公开一些实施方案所述的慢病毒构建体转导后获得的HEK-293T滴度。使用含有突变体WPRE的慢病毒构建体(LV-C和LV-D)而获得的滴度与使用含有野生型(WT)WPRE的慢病毒构建体(LV-A)而获得的滴度相似。
图6显示了用根据本公开一些实施方案所述的R4-B4慢病毒构建体转导后六天TCR在CD8+细胞表面上的表达。使用慢病毒滴定法检测四聚体在两个单独供体中的表达：A图中的供体#1和B图中的供体#2。X轴显示对数病毒稀释因子。令人惊讶的是，与用包含WT WPRE(变体A)或不包含WPRE(变体B)的慢病毒构建体转导的CD8+细胞相比，用含有突变体WPRE(变体C与D)的慢病毒构建体转导的CD8+细胞中TCR表达更高。
图7显示了用根据本公开一些实施方案所述的R4-A1B4慢病毒构建体转导后六天TCR在CD8+细胞表面上的表达。使用慢病毒滴定法检测四聚体在两个单独供体中的表达：A图中的供体#1和B图中的供体#2。X轴显示对数病毒稀释因子。与图6中所示的R4-B4载体结果相似，TCR表达在用包含变体D(根据SEQ ID NO:3所述的突变体WPRE)的慢病毒构建体转导的CD8+细胞中最高。
图8显示了用根据本公开一些实施方案所述的R4-B4慢病毒构建体转导后六天TCR在CD8+细胞(A)或CD4+细胞(B)表面上的表达。使用慢病毒滴定法检测四聚体的表达。X轴显示对数病毒稀释因子。这些结果进一步说明，与用包含WT WPRE(变体A)或不包含WPRE(变体B)的慢病毒构建体转导的CD8+细胞和CD4+细胞相比，用含有突变体WPRE(变体C与D)的慢病毒构建体转导的细胞中TCR表达更高。
图9显示了用根据本公开一些实施方案所述的R4-A1B4慢病毒构建体转导后六天TCR在CD8+细胞(A)或CD4+细胞(B)表面上的表达。使用慢病毒滴定法检测四聚体的表达。X轴显示对数病毒稀释因子。与图6-8中所示的结果相似，TCR表达在用包含变体D(根据SEQID NO:3所述的突变体WPRE)的慢病毒构建体转导的CD8+和CD4+细胞中最高。IMA203为表达R11KE TCR并包含WT WPRE用作阴性对照的慢病毒构建体。
倍数扩增不受WPRE突变影响(图10)。对于在最佳MOI下检测的所有慢病毒构建体，细胞活力均高于90％(未显示资料)。
WPRE突变体表现出可相比的TCR四聚体表面表达，其被标准化为载体拷贝数(图11)或标准化为病毒滴度(图12)。
类似地，图13显示，WPRE突变体表现出透过流式细胞术所确定的可相比的TCR四聚体表面表达。A图显示了CD4-CD8+/四聚体+的数据。B图显示了CD4+CD8-/四聚体+的数据。
图14显示了存在靶阳性肿瘤细胞的情况下CD4+或CD8+T细胞的细胞因子产生情况。A图显示了CD8+T细胞中干扰素-γ(IFN-γ)的产生情况。B图显示了CD4+T细胞中IFN-γ的产生情况。C图显示了C8+T细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的产生情况。D图显示了CD4+T细胞中TNF-α的产生情况。MCF7＝阴性；SW982＝460CpC。
实施例5
γδT细胞制造
为了分离γδT细胞，一方面，γδT细胞可从受试者或受试者的复杂样本中分离。一方面，复杂样本可能是外周血样本、脐带血样本、肿瘤、干细胞前体、肿瘤活组织检查物、组织、淋巴，或直接接触外部环境的受试者的上皮部位样本或源自干前体细胞的样本。γδT细胞可能直接从受试者的复杂样本中分离，例如，透过用流式细胞术技术分选表达一种或多种细胞表面标志物的γδT细胞。野生型γδT细胞可表现出许多可与γδT细胞相关的抗原识别、抗原呈递、共刺激和黏附分子。一种或多种细胞表面标志物，例如，特异性γδTCR、抗原识别、抗原呈递、配体、黏附分子或共刺激分子可用于从复杂样本中分离野生型γδT细胞。与γδT细胞相关或由其表达的各种分子可用于从复杂样本中分离γδT细胞，例如，分离Vδ1+、Vδ2+、Vδ3+细胞或其任何组合的混合群。
例如，可从受试者中收集外周血单核细胞，例如，采用血液成分单采机(包括Ficoll-PaqueTM PLUS(GE Healthcare)系统或其他合适的装置/系统。例如，可采用流式细胞术技术从收集的样本中纯化γδT细胞或所需的γδT细胞亚群。脐带血细胞也可在受试者出生期间从脐带血中获得。
在收集的γδT细胞上表达的细胞表面标志物的阳性和/或阴性选择可用于直接分离γδT细胞或来自外周血样本、脐带血样本、肿瘤、肿瘤活组织检查、组织、淋巴或来自受试者上皮样本的表达相似细胞表面标志物的γδT细胞群。例如，可以基于CD2、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD44、Kit、TCRα、TCRβ、TCRα、TCRδ、NKG2D、CD70、CD27、CD30、CD16、CD337(NKp30)、CD336(NKp46)、OX40、CD46、CCR7和其他合适的细胞表面标志物的阳性或阴性表达从复杂样本中分离γδT细胞。
图15显示了根据本公开内容实施方案的γδT细胞制造。此过程可能包括从白细胞分离术产物中收集或获得白细胞或PBMC。白细胞分离术可能包括从供体收集全血并使用血液成分单采机分离组分。血液成分单采机分离出所需的血液组分，并将其余部分返回供体的血液循环。例如，可以使用血液成分单采设备收集白细胞、血浆和血小板，并将红细胞和中性粒细胞返回供体的血液循环。市售白细胞分离术产品可用于该程序。另一种方法是从血沉棕黄层获得白细胞。为了分离血沉棕黄层，从供体获得抗凝全血并离心。离心后，将血液分离成血浆、红细胞和血沉棕黄层。血沉棕黄层是位于血浆和红细胞层之间的层。与血沉棕黄层收集相比，白细胞分离术收集可以获得更高的纯度和显著增加的单核细胞含量。白细胞分离术可能获得的单核细胞含量通常比血沉棕黄层获得的单核细胞含量高20倍。为了富集单核细胞，可能需要使用Ficoll梯度进行进一步分离。
为了从PBMC中消耗αβT细胞，可透过磁分离将表达αβTCR的细胞与PBMC分离，例如，使用涂覆有抗αβTCR抗体的
Figure GDA0003987788970002111
磁珠，然后冷冻保存αβTCR-T细胞消耗的PBMC。为了制造“现成的”T细胞产品，可在存在氨基二膦酸盐(例如，唑来膦酸盐)和/或异戊烯焦磷酸盐(IPP)和/或细胞因子(例如白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素15(IL-15)和/或白细胞介素18(IL-18))和/或其他活化剂(例如，Toll样受体2(TLR2)配体)的情况下小/中等规模(例如，在24至4-6孔板或T75/T175烧瓶中)或大规模(例如，在50ml-100升袋中)解冻和活化冷冻保存的αβTCR-T细胞消耗的PBMC，持续1-10天，例如2-7天。
图15显示了活化T细胞可以透过用病毒载体(例如：慢病毒载体)转导，将相关外源基因(例如：针对特定癌抗原和CD8的αβTCR)表达到分离γδT细胞中来进行改造。转导可以进行一次或多次以实现小规模(例如24至4-6孔板)或中/大规模的稳定转基因表达1/2至5天，例如1天。
图16进一步显示了转导或改造的γδT细胞的扩增可在存在细胞因子(例如：IL-2、IL-15、IL-18等)的情况下以小/中等规模(例如：烧瓶/G-Rex)或大规模(例如：50ml-100升袋)进行，持续7-35天，例如7-28天。然后可将扩增转导的T细胞产物冷冻保存为“现成的”T细胞产物，用于输注到患者体内。
实施例6
比较用具有不同WPRE的慢病毒载体(LV)转导的γδT细胞
图17显示了γδT细胞制造工艺的实例，其中比较了用表达TCR(结合至SLLQHLIGL(SEQ ID NO:148)/MHC复合体)和CD8且具有不同WPRE的LV转导的γδT细胞。简言之，在第0天，在存在唑来膦酸盐和细胞因子的情况下启动γδT细胞，然后在第2天用表达TCR和CD8且具有野生型(WT)WPRE(SEQ ID NO:2)(A)、无WPRE(B)、WPREmut1(SEQ ID NO:4)(C)或WPREmut2(SEQ ID NO:3)(D)的LV在3.75μl、7.50μl、15μl、30μl、60μl或120μlLV/1x106细胞下进行转导。批号1和批号2的LV滴度见表5。
表5
Figure GDA0003987788970002121
Figure GDA0003987788970002131
表5显示来自批号1的LV的滴度比来自批号2的LV的滴度高约10倍。在第3天，扩增转导的细胞。在第9天，计数细胞并透过FACS分析以测量表达TCR/CD8的γδT细胞和整合转基因的拷贝数。
来自批号1的LV
在FACS分析中，抗Vβ8抗体和抗CD8α抗体用于染色TCR+CD8α+γδT细胞。图18A显示Vβ8+CD8α+γδT细胞的百分比随着转导中使用的LV量增加而增加。在用具有野生型(WT)WPRE(A)、无WPRE(B)、WPRE mut1(C)和WPRE mut2(D)的LV转导的γδT细胞之间，转导效率无显著差异。未转导(NT)细胞作为阴性对照。SLLQHLIGL(SEQ ID NO:148)/MHC四聚体和抗CD8α抗体用于染色TCR+CD8α+γδT细胞。图18B显示四聚体+CD8α+γδT细胞的百分比随着转导中使用的LV量增加而增加。在用具有野生型(WT)WPRE(A)、无WPRE(B)、WPRE mut1(C)和WPREmut2(D)的LV转导的γδT细胞之间，转导效率无显著差异。未转导(NT)细胞作为阴性对照。然后将转导效率标准化为WTWPRE的转导效率。就Vβ8+CD8α+γδT细胞％(图19A)和四聚体+CD8α+γδT细胞％(图19B)而言，在用具有野生型(WT)WPRE(A)、无WPRE(B)、WPRE mut1(C)和WPRE mut2(D)的LV转导的γδT细胞之间的标准化转导效率无显著差异。这些结果表明，在用具有WT WPRE、WPRE mut1、WPRE mut2和无WPRE的LV转导的γδT细胞之间，转导效率可相比。
图20显示了γδT细胞中的整合转基因拷贝数通常随着转导中使用的LV量增加而增加。在用具有野生型(WT)WPRE(A)、无WPRE(B)、WPRE mut1(C)和WPRE mut2(D)的LV转导的γδT细胞之间，整合转基因的拷贝数无显著差异。在120μl/1x106细胞下，用无WPRE(B)的LV转导的γδT细胞似乎比具有不同WPRE的LV转导的整合转基因拷贝数略高。然后确定转导效率/拷贝数比。图21显示Vβ8+CD8α+％/拷贝数比在用具有WT WPRE、WPRE mut1、WPRE mut2和无WPRE的LV转导的γδT细胞之间可相比。同样，图22显示在用具有WT WPRE、WPRE mut1、WPRE mut2和无WPRE的LV转导的γδT细胞之间，四聚体+CD8α+％/拷贝数比可相比。
来自批号2的LV
如表5所示，来自批号1的LV滴度比来自批号2的LV滴度高约10倍。通常，由于LV滴度较低，因此来自批号2的LV转导的转导效率低于来自批号1的LV。图23显示，在120μl LV/1x106细胞下，从不具有WPRE的LV转导的供体4和5获得的γδT细胞的Vβ8+CD8α+γδT细胞％更高(分别为11.7％和7.91％)，高于WT WPRE转导(分别为6.90％和4.98％)、WPRE mut1转导(分别为6.01％和3.71％)和WPRE mut2转导(分别为4.67％和3.60％)。
表6显示了从具有WT WPRE、无WPRE、WPRE mut1和WPRE mut2的LV转导的供体4和5获得的γδT细胞的整合转基因拷贝数。总体而言，由于LV滴度低，整合转基因的拷贝数低于批号1。
表6
Figure GDA0003987788970002151
Figure GDA0003987788970002161
Figure GDA0003987788970002171
Figure GDA0003987788970002181
图24显示，在120μl LV/1x106细胞下，在用具有WT WPRE(A)、WPREmut1(C)、WPREmut2(D)和无WPRE(B)的LV转导的获得自供体4和5的γδT细胞之间，四聚体+CD8α+％/拷贝数比可相比。图25显示了在120μl LV/1x106细胞下，获得自供体3、4和5的合并资料。这些合并结果显示，在用具有WT WPRE(A)、WPRE mut1(C)、WPRE mut2(D)和无WPRE(B)的LV转导的γδT细胞中，四聚体+CD8α+％/拷贝数比可相比。用无WPRE的LV转导的γδT细胞似乎比用具有不同WPRE的LV转导的γδT细胞的四聚体+CD8α+％/拷贝数比变化小。
本专利说明书中引用的所有参考文献均透过引用并入本文，如同每篇参考文献被具体和单独地指出透过引用并入。任何参考文献的引用均为其在申请日之前的公开内容，不应解释为认可本公开内容无权凭借之前的发明而先于此类参考文献。
应当理解，上述每个元素或者两个或更多个元素一起也可以在与上述类型不同的其他类型方法中找到有用的应用。在无进一步分析的情况下，前述内容同样充分地揭示本公开的要点，其他人可以透过应用当前知识，容易地将其适用于各种应用场合而不会遗漏从现有技术观点来看公平构成所附权利要求中阐述的本公开的通用或具体方面基本特点的特征。前述实施方案仅作为示例呈现；本公开内容的范围仅透过以下权利要求进行限制。
序列名单
<110> 伊玛提克斯美国公司
<120> WPRE 突变体构建体、组合物及其方法
<130> 3000011-017001
<150> US 62/988,202
<151> 2020-03-11
<160> 262
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 784
<212> DNA
<213> 土拨鼠肝炎病毒
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(784)
<223> 来自 GenBank 登记号的 WT WPRE J02442.1
<400> 1
gagcatctta ccgccattta tacccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat 60
ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac attttatggg atatgtaatt 120
actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aactttcccg ttatttacgc 180
tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tgatattctt 240
aactatgttg ctccttttac gctgtgtgga tatgctgctt taatgcctct gtatcatgct 300
attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 360
tatgaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac 420
gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct 480
ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 540
ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt cggggaagct gacgtccttt 600
ccatggctgc tcgcctgtgt tgccaactgg atcctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc 660
ccttcggctc tcaatccagc ggacctccct tcccgaggcc ttctgccggt tctgcggcct 720
ctcccgcgtc ttcgctttcg gcctccgacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg 780
cctg 784
<210> 2
<211> 590
<212> DNA
<213> 土拨鼠乙型肝炎病毒
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(590)
<223> 来自 GenBank 登记号的 WT WPRE J04514.1
<400> 2
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 590
<210> 3
<211> 581
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体 WPRE
<400> 3
gagcatctta ccgccattta tacccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat 60
ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac attttttggg atatgtaatt 120
actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa cttgttaaga aactttcccg ttatttacgc 180
tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tgatattctt 240
aactttgttg ctccttttac gctgtgtgga tttgctgctt tattgcctct gtatcttgct 300
attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 360
tttgaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac 420
gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct 480
ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 540
ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt c 581
<210> 4
<211> 607
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体 WPRE
<400> 4
cagtctgacg tacgcgtaat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta 60
ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc 120
atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt 180
ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg 240
ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt 300
tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct 360
ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg aaatcatcgt 420
cctttccttg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg tccttctgct 480
acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc 540
ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct 600
ccccgcc 607
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子序列
<400> 5
Ser Gly Ser Gly
1
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A 肽
<400> 6
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A 肽
<400> 7
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 8
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A 肽
<400> 8
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 9
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A 肽
<400> 9
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶
<400> 10
Arg Ala Lys Arg
1
<210> 11
<211> 235
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr
20 25 30
Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser
35 40 45
Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala
50 55 60
Ala Ser Pro Thr Phe Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala
65 70 75 80
Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp
85 90 95
Thr Phe Val Leu Thr Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr
100 105 110
Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe
115 120 125
Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
130 135 140
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
145 150 155 160
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
165 170 175
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
180 185 190
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His
195 200 205
Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser
210 215 220
Gly Asp Lys Pro Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val
225 230 235
<210> 12
<211> 243
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Met Arg Pro Arg Leu Trp Leu Leu Leu Ala Ala Gln Leu Thr Val Leu
1 5 10 15
His Gly Asn Ser Val Leu Gln Gln Thr Pro Ala Tyr Ile Lys Val Gln
20 25 30
Thr Asn Lys Met Val Met Leu Ser Cys Glu Ala Lys Ile Ser Leu Ser
35 40 45
Asn Met Arg Ile Tyr Trp Leu Arg Gln Arg Gln Ala Pro Ser Ser Asp
50 55 60
Ser His His Glu Phe Leu Ala Leu Trp Asp Ser Ala Lys Gly Thr Ile
65 70 75 80
His Gly Glu Glu Val Glu Gln Glu Lys Ile Ala Val Phe Arg Asp Ala
85 90 95
Ser Arg Phe Ile Leu Asn Leu Thr Ser Val Lys Pro Glu Asp Ser Gly
100 105 110
Ile Tyr Phe Cys Met Ile Val Gly Ser Pro Glu Leu Thr Phe Gly Lys
115 120 125
Gly Thr Gln Leu Ser Val Val Asp Phe Leu Pro Thr Thr Ala Gln Pro
130 135 140
Thr Lys Lys Ser Thr Leu Lys Lys Arg Val Cys Arg Leu Pro Arg Pro
145 150 155 160
Glu Thr Gln Lys Gly Pro Leu Cys Ser Pro Ile Thr Leu Gly Leu Leu
165 170 175
Val Ala Gly Val Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly Val Ala Ile His
180 185 190
Leu Cys Cys Arg Arg Arg Arg Ala Arg Leu Arg Phe Met Lys Gln Pro
195 200 205
Gln Gly Glu Gly Ile Ser Gly Thr Phe Val Pro Gln Cys Leu His Gly
210 215 220
Tyr Tyr Ser Asn Thr Thr Thr Ser Gln Lys Leu Leu Asn Pro Trp Ile
225 230 235 240
Leu Lys Thr
<210> 13
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R11KEA α 链
<400> 13
Met Glu Lys Asn Pro Leu Ala Ala Pro Leu Leu Ile Leu Trp Phe His
1 5 10 15
Leu Asp Cys Val Ser Ser Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser
20 25 30
Leu His Val Gln Glu Gly Asp Ser Thr Asn Phe Thr Cys Ser Phe Pro
35 40 45
Ser Ser Asn Phe Tyr Ala Leu His Trp Tyr Arg Lys Glu Thr Ala Lys
50 55 60
Ser Pro Glu Ala Leu Phe Val Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu Lys Lys
65 70 75 80
Lys Gly Arg Ile Ser Ala Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr
85 90 95
Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys
100 105 110
Ala Leu Tyr Asn Asn Asn Asp Met Arg Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu
130 135 140
Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe
145 150 155 160
Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile
165 170 175
Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn
180 185 190
Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala
195 200 205
Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu
210 215 220
Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr
225 230 235 240
Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu
245 250 255
Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser
260 265 270
Ser
<210> 14
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R11KE β 链
<400> 14
Met Asp Ser Trp Thr Phe Cys Cys Val Ser Leu Cys Ile Leu Val Ala
1 5 10 15
Lys His Thr Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr
20 25 30
Glu Met Gly Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His
35 40 45
Asn Ser Leu Phe Trp Tyr Arg Glu Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu
50 55 60
Leu Ile Tyr Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro
65 70 75 80
Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu
85 90 95
Lys Ile Gln Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Ser Ser Pro Gly Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg
115 120 125
Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
130 135 140
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
145 150 155 160
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser
165 170 175
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro
180 185 190
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
195 200 205
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
210 215 220
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
225 230 235 240
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
245 250 255
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln
260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
275 280 285
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
290 295 300
Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 15
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R20P1H7 α 链
<400> 15
Met Glu Lys Met Leu Glu Cys Ala Phe Ile Val Leu Trp Leu Gln Leu
1 5 10 15
Gly Trp Leu Ser Gly Glu Asp Gln Val Thr Gln Ser Pro Glu Ala Leu
20 25 30
Arg Leu Gln Glu Gly Glu Ser Ser Ser Leu Asn Cys Ser Tyr Thr Val
35 40 45
Ser Gly Leu Arg Gly Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Pro Glu Phe Leu Phe Thr Leu Tyr Ser Ala Gly Glu Glu Lys Glu Lys
65 70 75 80
Glu Arg Leu Lys Ala Thr Leu Thr Lys Lys Glu Ser Phe Leu His Ile
85 90 95
Thr Ala Pro Lys Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Gln
100 105 110
Gly Glu Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Met
115 120 125
Leu Leu Val Ser Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
130 135 140
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
145 150 155 160
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
165 170 175
Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
180 185 190
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
195 200 205
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro
210 215 220
Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
225 230 235 240
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu
245 250 255
Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
260 265 270
Ser Ser
<210> 16
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R20P1H7 β 链
<400> 16
Met Gly Pro Gln Leu Leu Gly Tyr Val Val Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Pro Leu Glu Ala Gln Val Thr Gln Asn Pro Arg Tyr Leu Ile Thr
20 25 30
Val Thr Gly Lys Lys Leu Thr Val Thr Cys Ser Gln Asn Met Asn His
35 40 45
Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Gln
50 55 60
Ile Tyr Tyr Ser Met Asn Val Glu Val Thr Asp Lys Gly Asp Val Pro
65 70 75 80
Glu Gly Tyr Lys Val Ser Arg Lys Glu Lys Arg Asn Phe Pro Leu Ile
85 90 95
Leu Glu Ser Pro Ser Pro Asn Gln Thr Ser Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Leu Gly Pro Gly Leu Ala Ala Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro
130 135 140
Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val
165 170 175
Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser
180 185 190
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Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu
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Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val
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Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser
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Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu
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Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser
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Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu
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Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met
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Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
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<400> 29
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Ala Arg Val Asn Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser
20 25 30
Ile Gln Glu Gly Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser
35 40 45
Ile Asn Asn Leu Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val
50 55 60
His Leu Ile Leu Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Thr Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile
85 90 95
Thr Ala Ser Arg Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Val
100 105 110
Ser Asn Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys
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Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
130 135 140
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
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Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
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Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
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305 310
<210> 41
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R35P3A4 α 链
<400> 41
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Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile
165 170 175
Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn
180 185 190
Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala
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Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu
210 215 220
Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr
225 230 235 240
Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu
245 250 255
Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser
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Ser
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Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro
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Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg
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Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gln Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg
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145 150 155 160
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165 170 175
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245 250 255
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260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
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245 250 255
Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265 270
<210> 54
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<212> PRT
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<220>
<223> R59P2E7 β 链
<400> 54
Met Leu Ser Pro Asp Leu Pro Asp Ser Ala Trp Asn Thr Arg Leu Leu
1 5 10 15
Cys His Val Met Leu Cys Leu Leu Gly Ala Val Ser Val Ala Ala Gly
20 25 30
Val Ile Gln Ser Pro Arg His Leu Ile Lys Glu Lys Arg Glu Thr Ala
35 40 45
Thr Leu Lys Cys Tyr Pro Ile Pro Arg His Asp Thr Val Tyr Trp Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Pro Gly Gln Asp Pro Gln Phe Leu Ile Ser Phe Tyr Glu
65 70 75 80
Lys Met Gln Ser Asp Lys Gly Ser Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala Gln
85 90 95
Gln Phe Ser Asp Tyr His Ser Glu Leu Asn Met Ser Ser Leu Glu Leu
100 105 110
Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Gly Leu Gly Thr
115 120 125
Gly Asp Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Val
130 135 140
Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
145 150 155 160
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
165 170 175
Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
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210 215 220
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
225 230 235 240
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
245 250 255
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
260 265 270
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
275 280 285
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
290 295 300
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
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Phe
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<213> 人工序列
<220>
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Leu Asp Cys Val Ser Ser Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe
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Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala
195 200 205
Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu
210 215 220
Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr
225 230 235 240
Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu
245 250 255
Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser
260 265 270
Ser
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Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
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Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu
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<220>
<223> R16P1E8 β 链
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Ser Val Ser Ser Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu
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Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe
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Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr
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Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu
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Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser
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Ser
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<220>
<223> R17P1A9 β 链
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Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu
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Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro
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Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val
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<213> 人工序列
<220>
<223> R17P1D7 α 链
<400> 63
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<210> 64
<211> 313
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R17P1D7 β 链
<400> 64
Met Thr Ile Arg Leu Leu Cys Tyr Met Gly Phe Tyr Phe Leu Gly Ala
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Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly
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Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala
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Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
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<211> 206
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<213> 人工序列
<220>
<223> R17P1G3 α 链
<400> 65
Ile Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> R17P1G3 β 链
<400> 66
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Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser
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Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
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Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
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Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
180 185 190
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
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Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
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Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn
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Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val
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Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
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130 135 140
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145 150 155 160
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser
165 170 175
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210 215 220
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225 230 235 240
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260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
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Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
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Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser
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Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro
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Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
195 200 205
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
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Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
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Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
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Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu
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<220>
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<400> 88
Met Gly Ile Arg Leu Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Phe Leu Ala Val
1 5 10 15
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Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
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Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
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Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
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Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
290 295 300
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<213> 人工序列
<220>
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165 170 175
Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
180 185 190
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
195 200 205
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro
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Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
225 230 235 240
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu
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Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
260 265 270
Ser Ser
<210> 92
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体 R4P3F9 β 链
<400> 92
Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
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Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Val Glu Ser Ser Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Phe
305
<210> 93
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶共有序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa 可以为任何天然存在氨基酸
<400> 93
Arg Xaa Xaa Arg
1
<210> 94
<211> 367
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠干细胞病毒启动子
<400> 94
tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc tagcttaagt aacgccattt tgcaaggcat 60
ggaaaataca taactgagaa tagagaagtt cagatcaagg ttaggaacag agagacagca 120
gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga 180
acagatggtc cccagatgcg gtcccgccct cagcagtttc tagagaacca tcagatgttt 240
ccagggtgcc ccaaggacct gaaaatgacc ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt 300
cgcttctcgc ttctgttcgc gcgcttctgc tccccgagct caataaaaga gcccacaacc 360
cctcact 367
<210> 95
<211> 559
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RD114TR
<400> 95
Met Lys Leu Pro Thr Gly Met Val Ile Leu Cys Ser Leu Ile Ile Val
1 5 10 15
Arg Ala Gly Phe Asp Asp Pro Arg Lys Ala Ile Ala Leu Val Gln Lys
20 25 30
Gln His Gly Lys Pro Cys Glu Cys Ser Gly Gly Gln Val Ser Glu Ala
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Ile Gln Gln Val Thr Cys Pro Gly Lys Thr Ala Tyr
50 55 60
Leu Met Thr Asn Gln Lys Trp Lys Cys Arg Val Thr Pro Lys Ile Ser
65 70 75 80
Pro Ser Gly Gly Glu Leu Gln Asn Cys Pro Cys Asn Thr Phe Gln Asp
85 90 95
Ser Met His Ser Ser Cys Tyr Thr Glu Tyr Arg Gln Cys Arg Arg Ile
100 105 110
Asn Lys Thr Tyr Tyr Thr Ala Thr Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly Ser
115 120 125
Leu Asn Glu Val Gln Ile Leu Gln Asn Pro Asn Gln Leu Leu Gln Ser
130 135 140
Pro Cys Arg Gly Ser Ile Asn Gln Pro Val Cys Trp Ser Ala Thr Ala
145 150 155 160
Pro Ile His Ile Ser Asp Gly Gly Gly Pro Leu Asp Thr Lys Arg Val
165 170 175
Trp Thr Val Gln Lys Arg Leu Glu Gln Ile His Lys Ala Met Thr Pro
180 185 190
Glu Leu Gln Tyr His Pro Leu Ala Leu Pro Lys Val Arg Asp Asp Leu
195 200 205
Ser Leu Asp Ala Arg Thr Phe Asp Ile Leu Asn Thr Thr Phe Arg Leu
210 215 220
Leu Gln Met Ser Asn Phe Ser Leu Ala Gln Asp Cys Trp Leu Cys Leu
225 230 235 240
Lys Leu Gly Thr Pro Thr Pro Leu Ala Ile Pro Thr Pro Ser Leu Thr
245 250 255
Tyr Ser Leu Ala Asp Ser Leu Ala Asn Ala Ser Cys Gln Ile Ile Pro
260 265 270
Pro Leu Leu Val Gln Pro Met Gln Phe Ser Asn Ser Ser Cys Leu Ser
275 280 285
Ser Pro Phe Ile Asn Asp Thr Glu Gln Ile Asp Leu Gly Ala Val Thr
290 295 300
Phe Thr Asn Cys Thr Ser Val Ala Asn Val Ser Ser Pro Leu Cys Ala
305 310 315 320
Leu Asn Gly Ser Val Phe Leu Cys Gly Asn Asn Met Ala Tyr Thr Tyr
325 330 335
Leu Pro Gln Asn Trp Thr Arg Leu Cys Val Gln Ala Ser Leu Leu Pro
340 345 350
Asp Ile Asp Ile Asn Pro Gly Asp Glu Pro Val Pro Ile Pro Ala Ile
355 360 365
Asp His Tyr Ile His Arg Pro Lys Arg Ala Val Gln Phe Ile Pro Leu
370 375 380
Leu Ala Gly Leu Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Thr Gly Ala Thr Gly
385 390 395 400
Leu Gly Val Ser Val Thr Gln Tyr Thr Lys Leu Ser His Gln Leu Ile
405 410 415
Ser Asp Val Gln Val Leu Ser Gly Thr Ile Gln Asp Leu Gln Asp Gln
420 425 430
Val Asp Ser Leu Ala Glu Val Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp
435 440 445
Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly Ile Cys Leu Ala Leu Gln Glu Lys
450 455 460
Cys Cys Phe Tyr Ala Asn Lys Ser Gly Ile Val Arg Asn Lys Ile Arg
465 470 475 480
Thr Leu Gln Glu Glu Leu Gln Lys Arg Arg Glu Ser Leu Ala Ser Asn
485 490 495
Pro Leu Trp Thr Gly Leu Gln Gly Phe Leu Pro Tyr Leu Leu Pro Leu
500 505 510
Leu Gly Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu Ile Leu Thr Ile Gly Pro Cys
515 520 525
Val Phe Asn Arg Leu Val Gln Phe Val Lys Asp Arg Ile Ser Val Val
530 535 540
Gln Ala Leu Val Leu Thr Gln Gln Tyr His Gln Leu Lys Pro Leu
545 550 555
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 病毒抗原肽
<400> 96
Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu
1 5
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 病毒抗原肽
<400> 97
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 病毒抗原肽
<400> 98
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 99
Tyr Leu Tyr Asp Ser Glu Thr Lys Asn Ala
1 5 10
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 100
His Leu Met Asp Gln Pro Leu Ser Val
1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 101
Gly Leu Leu Lys Lys Ile Asn Ser Val
1 5
<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 102
Phe Leu Val Asp Gly Ser Ser Ala Leu
1 5
<210> 103
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 103
Phe Leu Phe Asp Gly Ser Ala Asn Leu Val
1 5 10
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 104
Phe Leu Tyr Lys Ile Ile Asp Glu Leu
1 5
<210> 105
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 105
Phe Ile Leu Asp Ser Ala Glu Thr Thr Thr Leu
1 5 10
<210> 106
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 106
Ser Val Asp Val Ser Pro Pro Lys Val
1 5
<210> 107
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 107
Val Ala Asp Lys Ile His Ser Val
1 5
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108
Ile Val Asp Asp Leu Thr Ile Asn Leu
1 5
<210> 109
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 109
Gly Leu Leu Glu Glu Leu Val Thr Val
1 5
<210> 110
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 110
Thr Leu Asp Gly Ala Ala Val Asn Gln Val
1 5 10
<210> 111
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 111
Ser Val Leu Glu Lys Glu Ile Tyr Ser Ile
1 5 10
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 112
Leu Leu Asp Pro Lys Thr Ile Phe Leu
1 5
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 113
Tyr Thr Phe Ser Gly Asp Val Gln Leu
1 5
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 114
Tyr Leu Met Asp Asp Phe Ser Ser Leu
1 5
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 115
Lys Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu
1 5
<210> 116
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 116
Leu Leu Trp Gly His Pro Arg Val Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 117
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 117
Lys Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val
1 5 10
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 118
Leu Leu Ile Pro Phe Thr Ile Phe Met
1 5
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 119
Phe Leu Ile Glu Asn Leu Leu Ala Ala
1 5
<210> 120
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 120
Leu Leu Trp Gly His Pro Arg Val Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 121
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 121
Phe Leu Leu Glu Arg Glu Gln Leu Leu
1 5
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 122
Ser Leu Ala Glu Thr Ile Phe Ile Val
1 5
<210> 123
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 123
Thr Leu Leu Glu Gly Ile Ser Arg Ala
1 5
<210> 124
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 124
Lys Ile Gln Glu Ile Leu Thr Gln Val
1 5
<210> 125
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 125
Val Ile Phe Glu Gly Glu Pro Met Tyr Leu
1 5 10
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 126
Ser Leu Phe Glu Ser Leu Glu Tyr Leu
1 5
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 127
Ser Leu Leu Asn Gln Pro Lys Ala Val
1 5
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 128
Gly Leu Ala Glu Phe Gln Glu Asn Val
1 5
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 129
Lys Leu Leu Ala Val Ile His Glu Leu
1 5
<210> 130
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 130
Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu
1 5
<210> 131
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 131
Thr Leu Tyr Asn Pro Glu Arg Thr Ile Thr Val
1 5 10
<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 132
Lys Leu Gln Glu Lys Ile Gln Glu Leu
1 5
<210> 133
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 133
Ser Val Leu Glu Lys Glu Ile Tyr Ser Ile
1 5 10
<210> 134
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 134
Arg Val Ile Asp Asp Ser Leu Val Val Gly Val
1 5 10
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 135
Val Leu Phe Gly Glu Leu Pro Ala Leu
1 5
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 136
Gly Leu Val Asp Ile Met Val His Leu
1 5
<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 137
Phe Leu Asn Ala Ile Glu Thr Ala Leu
1 5
<210> 138
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 138
Ala Leu Leu Gln Ala Leu Met Glu Leu
1 5
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 139
Ala Leu Ser Ser Ser Gln Ala Glu Val
1 5
<210> 140
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 140
Ser Leu Ile Thr Gly Gln Asp Leu Leu Ser Val
1 5 10
<210> 141
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 141
Gln Leu Ile Glu Lys Asn Trp Leu Leu
1 5
<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 142
Leu Leu Asp Pro Lys Thr Ile Phe Leu
1 5
<210> 143
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 143
Arg Leu His Asp Glu Asn Ile Leu Leu
1 5
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 144
Tyr Thr Phe Ser Gly Asp Val Gln Leu
1 5
<210> 145
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 145
Gly Leu Pro Ser Ala Thr Thr Thr Val
1 5
<210> 146
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 146
Gly Leu Leu Pro Ser Ala Glu Ser Ile Lys Leu
1 5 10
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 147
Lys Thr Ala Ser Ile Asn Gln Asn Val
1 5
<210> 148
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 148
Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu
1 5
<210> 149
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 149
Tyr Leu Met Asp Asp Phe Ser Ser Leu
1 5
<210> 150
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 150
Leu Met Tyr Pro Tyr Ile Tyr His Val
1 5
<210> 151
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 151
Lys Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu
1 5
<210> 152
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 152
Leu Leu Trp Gly His Pro Arg Val Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 153
Val Leu Asp Gly Lys Val Ala Val Val
1 5
<210> 154
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 154
Gly Leu Leu Gly Lys Val Thr Ser Val
1 5
<210> 155
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 155
Lys Met Ile Ser Ala Ile Pro Thr Leu
1 5
<210> 156
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 156
Gly Leu Leu Glu Thr Thr Gly Leu Leu Ala Thr
1 5 10
<210> 157
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 157
Thr Leu Asn Thr Leu Asp Ile Asn Leu
1 5
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 158
Val Ile Ile Lys Gly Leu Glu Glu Ile
1 5
<210> 159
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 159
Tyr Leu Glu Asp Gly Phe Ala Tyr Val
1 5
<210> 160
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 160
Lys Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val
1 5 10
<210> 161
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 161
Leu Leu Ile Pro Phe Thr Ile Phe Met
1 5
<210> 162
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 162
Ile Ser Leu Asp Glu Val Ala Val Ser Leu
1 5 10
<210> 163
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 163
Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val
1 5 10
<210> 164
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 164
Lys Leu Ile Gly Asn Ile His Gly Asn Glu Val
1 5 10
<210> 165
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 165
Ile Leu Leu Ser Val Leu His Gln Leu
1 5
<210> 166
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 166
Leu Asp Ser Glu Ala Leu Leu Thr Leu
1 5
<210> 167
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 167
Val Leu Gln Glu Asn Ser Ser Asp Tyr Gln Ser Asn Leu
1 5 10
<210> 168
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 168
His Leu Leu Gly Glu Gly Ala Phe Ala Gln Val
1 5 10
<210> 169
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 169
Ser Leu Val Glu Asn Ile His Val Leu
1 5
<210> 170
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 170
Tyr Thr Phe Ser Gly Asp Val Gln Leu
1 5
<210> 171
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 171
Ser Leu Ser Glu Lys Ser Pro Glu Val
1 5
<210> 172
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 172
Ala Met Phe Pro Asp Thr Ile Pro Arg Val
1 5 10
<210> 173
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 173
Phe Leu Ile Glu Asn Leu Leu Ala Ala
1 5
<210> 174
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 174
Phe Thr Ala Glu Phe Leu Glu Lys Val
1 5
<210> 175
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 175
Ala Leu Tyr Gly Asn Val Gln Gln Val
1 5
<210> 176
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 176
Leu Phe Gln Ser Arg Ile Ala Gly Val
1 5
<210> 177
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 177
Ile Leu Ala Glu Glu Pro Ile Tyr Ile Arg Val
1 5 10
<210> 178
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 178
Phe Leu Leu Glu Arg Glu Gln Leu Leu
1 5
<210> 179
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 179
Leu Leu Leu Pro Leu Glu Leu Ser Leu Ala
1 5 10
<210> 180
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 180
Ser Leu Ala Glu Thr Ile Phe Ile Val
1 5
<210> 181
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 181
Ala Ile Leu Asn Val Asp Glu Lys Asn Gln Val
1 5 10
<210> 182
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 182
Arg Leu Phe Glu Glu Val Leu Gly Val
1 5
<210> 183
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 183
Tyr Leu Asp Glu Val Ala Phe Met Leu
1 5
<210> 184
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 184
Lys Leu Ile Asp Glu Asp Glu Pro Leu Phe Leu
1 5 10
<210> 185
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 185
Lys Leu Phe Glu Lys Ser Thr Gly Leu
1 5
<210> 186
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 186
Ser Leu Leu Glu Val Asn Glu Ala Ser Ser Val
1 5 10
<210> 187
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 187
Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val
1 5 10
<210> 188
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 188
Gly Leu Tyr Pro Val Thr Leu Val Gly Val
1 5 10
<210> 189
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 189
Ala Leu Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala
1 5
<210> 190
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 190
Thr Leu Leu Glu Gly Ile Ser Arg Ala
1 5
<210> 191
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 191
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Glu Glu Leu
1 5
<210> 192
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 192
Ala Leu Tyr Val Gln Ala Pro Thr Val
1 5
<210> 193
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 193
Lys Leu Ile Tyr Lys Asp Leu Val Ser Val
1 5 10
<210> 194
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 194
Ile Leu Gln Asp Gly Gln Phe Leu Val
1 5
<210> 195
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 195
Ser Leu Leu Asp Tyr Glu Val Ser Ile
1 5
<210> 196
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 196
Leu Leu Gly Asp Ser Ser Phe Phe Leu
1 5
<210> 197
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 197
Val Ile Phe Glu Gly Glu Pro Met Tyr Leu
1 5 10
<210> 198
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 198
Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Pro Tyr Leu
1 5
<210> 199
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 199
Phe Leu Phe Val Asp Pro Glu Leu Val
1 5
<210> 200
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 200
Ser Glu Trp Gly Ser Pro His Ala Ala Val Pro
1 5 10
<210> 201
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 201
Ala Leu Ser Glu Leu Glu Arg Val Leu
1 5
<210> 202
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 202
Ser Leu Phe Glu Ser Leu Glu Tyr Leu
1 5
<210> 203
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 203
Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val
1 5
<210> 204
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 204
Val Leu Leu Asn Glu Ile Leu Glu Gln Val
1 5 10
<210> 205
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 205
Ser Leu Leu Asn Gln Pro Lys Ala Val
1 5
<210> 206
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 206
Lys Met Ser Glu Leu Gln Thr Tyr Val
1 5
<210> 207
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 207
Ala Leu Leu Glu Gln Thr Gly Asp Met Ser Leu
1 5 10
<210> 208
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 208
Val Ile Ile Lys Gly Leu Glu Glu Ile Thr Val
1 5 10
<210> 209
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 209
Lys Gln Phe Glu Gly Thr Val Glu Ile
1 5
<210> 210
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 210
Lys Leu Gln Glu Glu Ile Pro Val Leu
1 5
<210> 211
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 211
Gly Leu Ala Glu Phe Gln Glu Asn Val
1 5
<210> 212
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 212
Asn Val Ala Glu Ile Val Ile His Ile
1 5
<210> 213
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 213
Ala Leu Ala Gly Ile Val Thr Asn Val
1 5
<210> 214
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 214
Asn Leu Leu Ile Asp Asp Lys Gly Thr Ile Lys Leu
1 5 10
<210> 215
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 215
Val Leu Met Gln Asp Ser Arg Leu Tyr Leu
1 5 10
<210> 216
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 216
Lys Val Leu Glu His Val Val Arg Val
1 5
<210> 217
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 217
Leu Leu Trp Gly Asn Leu Pro Glu Ile
1 5
<210> 218
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 218
Ser Leu Met Glu Lys Asn Gln Ser Leu
1 5
<210> 219
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 219
Lys Leu Leu Ala Val Ile His Glu Leu
1 5
<210> 220
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 220
Ala Leu Gly Asp Lys Phe Leu Leu Arg Val
1 5 10
<210> 221
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 221
Phe Leu Met Lys Asn Ser Asp Leu Tyr Gly Ala
1 5 10
<210> 222
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 222
Lys Leu Ile Asp His Gln Gly Leu Tyr Leu
1 5 10
<210> 223
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 223
Gly Pro Gly Ile Phe Pro Pro Pro Pro Pro Gln Pro
1 5 10
<210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 224
Ala Leu Asn Glu Ser Leu Val Glu Cys
1 5
<210> 225
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 225
Gly Leu Ala Ala Leu Ala Val His Leu
1 5
<210> 226
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 226
Leu Leu Leu Glu Ala Val Trp His Leu
1 5
<210> 227
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 227
Ser Ile Ile Glu Tyr Leu Pro Thr Leu
1 5
<210> 228
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 228
Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu
1 5
<210> 229
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 229
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
1 5
<210> 230
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 230
Phe Leu Leu Asp Lys Pro Gln Asp Leu Ser Ile
1 5 10
<210> 231
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 231
Tyr Leu Leu Asp Met Pro Leu Trp Tyr Leu
1 5 10
<210> 232
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 232
Gly Leu Leu Asp Cys Pro Ile Phe Leu
1 5
<210> 233
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 233
Val Leu Ile Glu Tyr Asn Phe Ser Ile
1 5
<210> 234
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 234
Thr Leu Tyr Asn Pro Glu Arg Thr Ile Thr Val
1 5 10
<210> 235
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 235
Ala Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser Val
1 5
<210> 236
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 236
Lys Leu Gln Glu Glu Leu Asn Lys Val
1 5
<210> 237
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 237
Lys Leu Met Asp Pro Gly Ser Leu Pro Pro Leu
1 5 10
<210> 238
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 238
Ala Leu Ile Val Ser Leu Pro Tyr Leu
1 5
<210> 239
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 239
Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ala Asn Val
1 5
<210> 240
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 240
Ala Leu Asp Pro Ser Gly Asn Gln Leu Ile
1 5 10
<210> 241
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 241
Ile Leu Ile Lys His Leu Val Lys Val
1 5
<210> 242
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 242
Val Leu Leu Asp Thr Ile Leu Gln Leu
1 5
<210> 243
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 243
His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala
1 5
<210> 244
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 244
Ser Met Asn Gly Gly Val Phe Ala Val
1 5
<210> 245
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 245
Met Leu Ala Glu Lys Leu Leu Gln Ala
1 5
<210> 246
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 246
Tyr Met Leu Asp Ile Phe His Glu Val
1 5
<210> 247
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 247
Ala Leu Trp Leu Pro Thr Asp Ser Ala Thr Val
1 5 10
<210> 248
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 248
Gly Leu Ala Ser Arg Ile Leu Asp Ala
1 5
<210> 249
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 249
Ala Leu Ser Val Leu Arg Leu Ala Leu
1 5
<210> 250
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 250
Ser Tyr Val Lys Val Leu His His Leu
1 5
<210> 251
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 251
Val Tyr Leu Pro Lys Ile Pro Ser Trp
1 5
<210> 252
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 252
Asn Tyr Glu Asp His Phe Pro Leu Leu
1 5
<210> 253
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 253
Val Tyr Ile Ala Glu Leu Glu Lys Ile
1 5
<210> 254
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 254
Val His Phe Glu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Leu Phe
1 5 10
<210> 255
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 255
Val Leu Ser Pro Phe Ile Leu Thr Leu
1 5
<210> 256
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 256
His Leu Leu Glu Gly Ser Val Gly Val
1 5
<210> 257
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子肽
<400> 257
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 258
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子肽
<400> 258
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 259
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子肽
<400> 259
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 260
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子肽
<400> 260
Thr Val Ala Ala Pro
1 5
<210> 261
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子肽
<400> 261
Thr Val Leu Arg Thr
1 5
<210> 262
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接子肽
<400> 262
Thr Val Ser Ser Ala Ser
1 5

Claims (34)

1.要求的权利为：
一种载体，其包含突变的土拨鼠转录后调控元件(WPRE)，其中不包含X蛋白启动子，并且其中所述突变体WPRE不包含X蛋白开放阅读框(ORF)。
2.权利要求1的载体，其中所述突变体WPRE包含一个或多个起始密码子的突变。
3.权利要求1或2的载体，其中所述突变体WPRE包含一个或多个起始密码子的突变，其中所述一个或多个起始密码子选自对应于根据SEQ ID NO：1所述的野生型WPRE核苷酸序列内核苷酸位置106-108、152-154、245-247、272-274、283-285、362-364和603-605的起始密码子。
4.权利要求1或2的载体，其中所述突变体WPRE包含一个或多个起始密码子的突变，其中所述一个或多个起始密码子选自对应于根据SEQ ID NO：2所述的野生型WPRE核苷酸序列内核苷酸位置70-72、108-110、121-123、138-140、187-189和428-430的起始密码子。
5.权利要求2-4中任一项的载体，其中一个或多个起始密码子可在起始密码子内的一个、两个或所有三个位置处突变。
6.权利要求2-5中任一项的载体，其中一个或多个起始密码子由ATG突变为TTG。
7.权利要求1-6中任一项的载体，其中突变体WPRE序列与SEQ ID NO：3具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高或100％的同一性。
8.权利要求1-7中任一项的载体，其进一步包含编码选自由以下组成的组中之蛋白质的核苷酸序列：酶、细胞因子、趋化因子、激素、抗体、抗氧化剂分子、工程化改造免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫调节分子、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)、靶蛋白的反式显性负性突变体、毒素、条件毒素、抗原、抗原受体、嵌合抗原受体、T细胞受体(TCR)、肿瘤抑制物蛋白、生长因子、膜蛋白、促血管和抗血管生成蛋白和肽、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶及其衍生物。
9.权利要求1-8中任一项的载体，其包含编码蛋白质Z1的第一核苷酸序列S1和编码蛋白质Z2的第二核苷酸序列S2，其中Z1和Z2形成第一二聚体。
10.权利要求9的载体，其中第一二聚体Z1Z2为T细胞二聚体信号传导模组、TCR、抗体、抗原受体或嵌合抗原受体。
11.权利要求9或10的载体，其中第一二聚体Z1Z2为与靶抗原(TA)肽结合的TCR，并且其中靶抗原(TA)肽为病毒肽、细菌肽或肿瘤相关抗原(TAA)抗原肽。
12.权利要求9-11中任一项的载体，其中所述第一二聚体Z1Z2选自SEQ ID NO：13和14、15和16、17和18、19和20、21和22、23和24、25和26、25和92、91和92、27和28、29和30、31和32、33和34、35和36、37和38、39和40、41和42、43和44、45和46、47和48、49和50、51和52、53和54、55和56、57和58、59和60、61和62、63和64、65和66、67和68、69和70、71和72、73和74、75和76、77和78、79和80、81和82、83和84、85和86、87和88或89和90。
13.权利要求9-12中任一项的载体，其进一步包含编码蛋白质Z1的第三核苷酸序列S3和编码蛋白质Y2的第四核苷酸序列S4，其中Y1和Y2形成第二二聚体，其中所述第一二聚体Z1Z2在结构上不同于第二二聚体Y1Y2。
14.权利要求13的载体，其中第二二聚体Y1Y2为TCR共受体。
15.权利要求13或14的载体，其中第二二聚体Y1Y2为SEQ ID NO：11和12。
16.权利要求1-15中任一项的载体，其进一步包含编码2A肽的核苷酸序列和编码连接子肽的核苷酸序列。
17.权利要求1-16中任一项的载体，其进一步包含编码弗林蛋白酶肽(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列。
18.权利要求1-17中任一项的载体，其进一步包含选自巨细胞病毒(CMV)启动子、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子、髓磷脂碱性蛋白(MBP)启动子、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、包含骨髓增生性肉瘤病毒增强子的修饰MoMuLV LTR(MNDU3)、泛素C启动子、EF-1α启动子或鼠干细胞病毒(MSCV)启动子的启动子序列。
19.权利要求1-18中任一项的载体，其为选自腺病毒、痘病毒、α病毒、晕病毒、黄病毒、棒状病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、副粘病毒或微小核糖核酸病毒的病毒载体。
20.权利要求19的载体，其中载体用病毒的包膜蛋白进行假型化处理，所述病毒选自天然猫内源性病毒(RD114)、RD114的嵌合版本(RD114TR)、长臂猿白血病病毒(GALV)、GALV的嵌合版本(GALV-TR)、双嗜性鼠白血病病毒(MLV 4070A)、杆状病毒(GP64)、水疱性口炎病毒(VSV-G)、鸡瘟病毒(FPV)、埃博拉病毒(EboV)、狒狒逆转录病毒包膜糖蛋白(BaEV)或淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒(LCMV)。
21.一种宿主细胞，其用权利要求1-20中任一项的载体转导。
22.一种生产表达治疗蛋白的重组宿主细胞的方法，所述方法包括以下组成的步骤：(i)在体外或离体将权利要求1-20中任一项的载体引入胜任宿主细胞，(ii)体外或离体培养获得的重组宿主细胞，和(iii)任选地，选择表达和/或分泌所述治疗性蛋白质的细胞。
23.一种制备用于免疫疗法的T细胞的方法，包括
从人体受试者的血液样本中分离T细胞，
启动分离的T细胞，
用权利要求1-20中任一项的载体转导启动的T细胞，和
扩增转导的T细胞。
24.权利要求23的方法，其中，所述启动在存在选自帕米膦酸、阿仑膦酸、唑来膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、恩加膦酸、任何前述项的盐和/或其水合物的氨基二膦酸盐下进行。
25.权利要求23或24的方法，其中所述启动和/或扩增进一步在存在细胞因子的情况下进行。
26.权利要求23-25中任一项的方法，其中T细胞为γδT细胞。
27.权利要求23-26中任一项的方法，其中，第一二聚体Z1Z2和/或第二二聚体Y1Y2在扩增的T细胞表面上共表达。
28.一种扩增T细胞群，其透过权利要求23-27中任一项的方法制备。
29.一种治疗癌症患者的方法，其包括向所述患者施用包含权利要求28的扩增T细胞群的组合物，其中，所述T细胞杀灭表面提呈与MHC分子复合的肽的癌细胞，其中所述肽选自SEQ ID NO：99-256，
其中所述癌症选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、子宫癌、梅克尔细胞癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、结直肠癌、膀胱癌、肾癌、白血病、卵巢癌、食道癌、脑癌、胃癌和前列腺癌组成的组。
30.一种在癌症患者中引发免疫应答的方法，其包括向所述患者施用包含权利要求28的扩增T细胞群的组合物，
其中，所述T细胞杀灭表面提呈与MHC分子复合的肽的癌细胞，其中所述肽选自SEQ IDNO：99-256，
其中所述癌症选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、子宫癌、梅克尔细胞癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、结直肠癌、膀胱癌、肾癌、白血病、卵巢癌、食道癌、脑癌、胃癌和前列腺癌组成的组。
31.一种套件，包括：
(i)权利要求1-20中任一项的载体和/或权利要求21的宿主细胞和/或权利要求28的扩增T细胞群；
(ii)任选地包装材料；以及
(iii)任选地包含于包装材料内的标签或药物说明书。
32.一种制备用于免疫疗法的T细胞的方法，包括
(i)从人体受试者的血液样本中分离T细胞，
(ii)在存在他汀类药物的情况下启动分离的T细胞，
(iii)用权利要求1-20中任一项的载体转导启动的T细胞，
其中所述载体用VSV-G的包膜蛋白进行假型化处理，以及
(iv)扩增转导的T细胞。
33.权利要求32的方法，其中，T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、γδT细胞和/或天然杀伤T细胞。
34.权利要求32或33的方法，其中，他汀类药物选自阿托伐他汀、西伐他汀、达伐他汀、氟吲他汀、氟伐他汀、美伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、维洛他汀和瑞舒伐他汀。
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