TW202146428A - 基於重組痘病毒之抗SARS-CoV-2病毒疫苗 - Google Patents

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賽斯 萊德曼
史考特 Ｊ 戈貝爾
大衛 伊凡斯
芮恩 諾伊斯
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美商托尼克斯醫藥控股公司
史考特 Ｊ 戈貝爾
加拿大亞伯大州立大學理事會
大衛 伊凡斯
芮恩 諾伊斯
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Abstract

本發明在各種態樣中係關於一種重組痘病毒，其包含編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸；用於產生此類病毒之方法及此類病毒之用途。該等重組痘病毒尤其適用作抗SARS-CoV-2病毒之保護性病毒疫苗。

Description

基於重組痘病毒之抗SARS-CoV-2病毒疫苗
2019年12月31日，武漢市衛生健康委員會(Wuhan Health Commission)報導了在中國武漢市(the city of Wuhan, China)之非典型肺炎病例集群。第一名患者在2019年12月中旬開始經歷疾病症狀。發現臨床分離物含有新冠狀病毒。截至2020年1月28日，存在超過4,500例試驗室確診病例，已知死亡＞100例。新冠狀病毒目前稱為SARS-CoV-2或2019-nCoV且與嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(SARS-CoV)相關，但在核苷酸含量上僅有大致80%相似度。Ralph等人，J Infect Dev Ctries. 2020年1月31日; 14(1):3-17。
冠狀病毒為包膜單股RNA病毒，其具有長度在25.5至約32 kb範圍內之正義RNA基因體。球形病毒粒子之直徑介於70至120 nm範圍內，具有四種結構蛋白。
儘管目前已投入大量精力至提供用於SARS-CoV-2之疫苗及遞送載體的方法中，但仍需要提供抗此冠狀病毒之另外且改良的方法。
本發明之一態樣提供一種重組痘病毒，其包含編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸；用於產生此類病毒之方法及此類病毒(例如作為免疫原)在抗SARS-CoV-2病毒之免疫原性調配物中之用途。本發明之另一態樣提供一種重組合成痘病毒，其包含編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸；用於產生此類病毒之方法及此類病毒(例如作為免疫原)在抗SARS-CoV-2病毒之免疫原性調配物中之用途。在一些實施例中，合成痘病毒係自化學合成之DNA組裝及複製，其為安全的、可複製的且不含污染物。由於化學基因體合成並不視天然模板而定，因此病毒基因體之大量結構性及功能性修飾係可能的。當天然模板不可用於習知分子生物學方法之遺傳複製或修飾時，化學基因體合成尤其適用。
在一個態樣中，本發明係關於重組痘病毒，其包含編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸，其中SARS-CoV-2蛋白質係選自由以下組成之群：刺突蛋白(spike protein) (S)、膜蛋白(M)及核衣殼蛋白(N)或該等蛋白質中之兩者或更多者的組合。
在另一態樣中，本發明係關於包含本發明之重組痘病毒的醫藥組合物。
在另一態樣中，本發明係關於感染本發明之重組痘病毒的細胞。
在另一態樣中，本發明係關於用於選擇表現SARS-CoV-2病毒蛋白質之細胞的方法，其包含使該細胞感染本發明之重組痘病毒且選擇表現該SARS-CoV-2病毒蛋白質之經感染細胞。
在另一態樣中，本發明係關於在有需要或處於風險下之個體中誘導抗SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，其包含向該個體投與免疫學上有效量之本發明之重組痘病毒。
在另一態樣中，本發明係關於產生本發明之重組痘病毒之方法，該等方法包含：(a)使宿主細胞感染痘病毒；(b)使步驟(a)之經感染細胞轉染有編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸以產生重組痘病毒；及(c)選擇重組痘病毒，其中編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸在轉染後位於痘病毒之對於複製痘病毒非必需的區域中。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2020年2月26日申請的美國臨時申請案第62/981,997號及2020年11月16日申請的美國臨時申請案第63/114,514號之優先權及益處，該等申請案之內容特此以全文引用之方式併入。序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且其以全文引用之方式併入本文中。該ASCII複本於2021年2月24日創建，命名為104545-0047-WO1_SL.txt且大小為766,785個位元組。一般技術
除非本文中另外定義，否則本申請案中所用之科學及技術術語應具有一般技術者通常所理解之含義。一般而言，與本文所述之藥理學、細胞及組織培養、分子生物學、細胞及癌症生物學、神經生物學、神經化學、病毒學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質及核酸化學結合使用之命名法及其技術為此項技術中彼等熟知且常用者。在有衝突之情況下，將以本說明書(包括定義)為準。
除非另外指明，否則本發明之實踐將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學、病毒學及免疫學之習知技術，其完全處於熟習此項技術者之範圍內。此類技術在以下文獻中經充分解釋，諸如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版(Sambrook等人，1989) Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait編，1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis編，1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R.I. Freshney編，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather及P.E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle，J.B. Griffiths及D.G. Newell編，1993-1998) J. Wiley and Sons；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller及M.P. Calos編，1987)；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel等人編，1987)；PCR:  The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等人編，1994)；Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002)；Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998)；Coligan等人，Short Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY (2003)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley及Sons, 1999)。
酶促反應及純化技術係根據製造商之說明書如此項技術中通常所為或如本文所描述執行。與本文所述之分析化學、生物化學、免疫學、分子生物學、合成有機化學、及醫學與醫藥化學結合使用之命名法、及其實驗室程序及技術為此項技術中熟知且常用者。標準技術係用於化學合成及化學分析。
在貫穿本說明書及實施例中，措詞「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」之變體應理解為暗示包括所述整數或整數群但不排除任何其他整數或整數群。
術語「包括」用以意謂「包括(但不限於)」。「包括」及「包括(但不限於)」可互換地使用。
在術語「例如(e.g./for example)」之後的任何實例並不意謂為窮盡性或限制性的。
除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。
冠詞「一(a/an)」及「該(the)」本文中所用以指代物品之文法目標中之一個或超過一個(亦即，至少一個)。舉例而言，「一元件」意謂一個元件或超過一個元件。本文中，對「約」一個值或參數之提及包括(及描述)針對該值或參數本身之實施例。舉例而言，涉及「約X」之描述包括「X」之描述。數值範圍包括限定該範圍之數值。
儘管闡述本發明之廣泛範疇之數值範圍及參數為近似值，但特定實例中所闡述之數值儘可能精確地報導。然而，任何數值均固有地含有因其對應測試量測中發現之標準差必然會引起的某些誤差。此外，本文所揭示之所有範圍應理解為涵蓋其中所包含之任何及所有子範圍。舉例而言，1至10之陳述範圍應視為包括最小值1與最大值10之間(且包括端值)之任何及全部子範圍；亦即，以最小值1或更大值(例如1至6.1)開始且以最大值10或更小值(例如5.5至10)結束之全部子範圍。
例示性方法及材料描述於本文中，但類似或等效於本文所述之彼等的方法及材料亦可用於實踐或測試本申請案。該等材料、方法及實例僅為說明性的且不意欲為限制性的。 定義 除非另外指示，否則以下術語應理解為具有以下含義：
術語「嵌合」或「經工程改造」或「經修飾」(例如，嵌合痘病毒、經工程改造之多肽、經修飾之多肽、經工程改造之核酸、經修飾之核酸)或其語法變體在本文中可互換地使用以指代相對天然序列而已經操控以具有一或多個變化之非天然序列。
如本文中所使用，術語「用於複製之必需基因」或「用於複製之必需區域」係指對於複製生物體必不可少的彼等基因或區域且因此視為生命基礎。在病毒之背景下，若基因或區域之缺失引起病毒效價在單或多步生長曲線中減小超過10倍，則該基因或區域視為必需的(亦即，在細胞培養中起作用)。認為大部分必需基因編碼維持中央代謝之蛋白質，複製DNA，將基因轉譯成蛋白質，維持基礎細胞結構且介導進入或離開細胞之轉運過程。參與病毒粒子產生、肌蛋白尾部形成及細胞外病毒粒子釋放之基因通常亦視為必需的。兩種主要策略已用於鑑別全基因體基礎上之必需基因：使用轉座子進行基因之定向缺失及無規突變誘發。在第一種情況下，以系統方式使個別基因(或ORF)自基因體完全缺失。在無規突變誘發中，將轉座子無規插入於基因體中儘可能多的位置中，旨在使標靶基因失活。仍能夠存活或生長之插入突變體並不在必需基因中。(Zhang, R., 2009及Gerdes, S., 2006)。
如本文中所用，術語「表現卡匣」或「轉錄單元」定義含有一或多個待轉錄基因之核酸序列區域。編碼待轉錄基因之核苷酸序列以及含有表現卡匣內所含之調節元件的聚核苷酸序列彼此可操作地連接。基因自啟動子轉錄且藉由至少一個聚腺苷酸化信號終止轉錄。在一些實施例中，自一個啟動子轉錄一或多種基因中之每一者。在一些實施例中，自一個單一啟動子轉錄一或多個基因。在此情況下，不同基因至少以轉錄方式連接。可自每一轉錄單元(多順反子轉錄單元)轉錄及表現超過一種蛋白質或產物。每一轉錄單元將包含用於轉錄及轉譯該單元內所含之任一選定序列所必需的調節元件。每一轉錄單元可含有相同或不同的調節元件。
「同源」在其所有語法形式及拼寫變體下係指擁有「共同進化源」之兩個蛋白質之間的關係，包括來自相同生物物種之超家族之蛋白質以及來自不同生物物種之同源蛋白質。如由其序列相似性反映，無論關於一致性百分比或根據特定殘基或基元及保存位置之存在，此類蛋白質(及其編碼核酸)具有序列同源性。「同源」亦可指代對病毒而言為天然之核酸。
在通常的用法及本申請案中，在經諸如「高度」之副詞修飾時，術語「同源」可指序列相似性且可與共同進化源相關或不相關。
「異源」在其所有語法形式及拼寫變化下可指對病毒而言為非天然之核酸。其意謂源自與生物體之核酸不同的物種或不同的病毒株，其核酸描述為相對於該生物體之核酸為異源的。在一非限制性實例中，synVACV之病毒基因體包含異源末端髮夾環。彼等異源末端髮夾環可源自不同病毒物種或源自不同VACV病毒株。
如本文中所用，「宿主細胞」包括可為或已為用於本發明之病毒之接受體的個別細胞或細胞培養物。宿主細胞包括單個宿主細胞之後代，且由於天然、偶然或故意突變，後代可未必與初始母細胞完全一致(在形態或基因體DNA補體方面)。宿主細胞包括用本發明之痘病毒活體內轉染及/或轉化之細胞。
「免疫有效量」係指待投與之包含至少一種抗原或其免疫原性部分之目標組合物之量，其能夠在宿主細胞中引發免疫反應或對組合物之抗體介導之免疫反應。如本文中所揭示，重組痘病毒之免疫學上有效量係指遞送SARS-CoV-2病毒蛋白質且引發抗該SARS-CoV-2病毒蛋白質之免疫反應必需的痘病毒粒子之量。在一些實施例中，本發明之重組痘病毒之免疫學上有效量為在102 至109 PFU範圍內之量。在一些實施例中，本發明之重組痘病毒之免疫學上有效量為約103 至105 PFU。在一些實施例中，本發明之重組痘病毒之免疫學上有效量為約105 PFU。
如本文中所用，術語「操作性連接(operative linkage)」及「以操作方式連結(operatively linked)」(或「可操作地連接(operably linked)」)或其變化形式在提及兩種或更多種組分(諸如序列元件)之併接之情況下可互換使用，其中組分經配置以使得兩種組分均正常起作用，且使得組分中之至少一者可介導施加於其他組分中之至少一者之功能成為可能。舉例而言，編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸可經可操作地連接至啟動子。編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸序列可以順式形式與痘病毒特異性啟動子核酸序列可操作地連結，但不需要直接與其鄰接。舉例而言，連接子序列可位於兩個序列之間。
如本文中所用，片語「感染倍率」或「MOI」為每一感染細胞之平均病毒數。MOI係藉由添加之病毒數(添加毫升×溶菌斑形成單位(PFU))除以添加之細胞數(添加毫升×細胞/毫升)來測定。
術語「患者」、「個體(subject/individual)」在本文中可互換使用且係指人類或非人類動物。此等術語包括哺乳動物，諸如人類、靈長類動物、家畜動物(包括牛、豬、駱駝等)、伴侶動物(例如，犬科動物、貓科動物等)及嚙齒動物(例如，小鼠及大鼠)。
如此項技術中已知，如在本文中可互換地使用之「聚核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸鏈，且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼及/或其類似物或可藉由DNA或RNA聚合酶併入鏈中之任何受質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，可在鏈組裝之前或之後賦予對核苷酸結構之修飾。核苷酸之序列可間雜有非核苷酸組分。聚核苷酸可在聚合後，諸如藉由結合標記組分而經進一步修飾。其他類型之修飾包括例如「封端」，用類似物取代天然存在之核苷酸中之一或多者；核苷酸間修飾，諸如具有不帶電鍵之彼等(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等)及具有帶電鍵之彼等(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含有諸如蛋白質之側接部分的彼等(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等)、具有嵌入劑之彼等(例如吖啶、補骨脂素等)、含有螯合劑之彼等(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)、含有烷基化劑之彼等、具有經修飾鍵之彼等(例如α變旋異構核酸等)；以及未經修飾形式之聚核苷酸。此外，一般存在於糖中之任一羥基可例如藉由膦酸酯基、磷酸酯基置換，由標準保護基保護，或經活化以製備與另外的核苷酸之額外鍵聯，或可與固體支撐物結合。5'及3'端OH可經磷酸化或經1至20個碳原子之胺或有機封端基團取代。其他羥基亦可衍生成標準保護基。聚核苷酸亦可含有此項技術中一般已知之類似形式的核糖或去氧核糖，包括例如2'-O-甲基-核糖、2'-O-烯丙基、2'-氟-核糖或2'-疊氮基-核糖；碳環糖類似物，α-或β-變旋異構糖、差向異構糖(諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖)、哌喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖(sedoheptuloses)；非環狀類似物及無鹼基核苷類似物(諸如甲基核糖苷)。一或多個磷酸二酯鍵可藉由替代性鍵聯基團置換。此等替代性鍵聯基團包括(但不限於)磷酸經P(O)S (「硫代酸酯」)、P(S)S (「二硫代酸酯」)、(O)NR2 (「醯胺」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2 (「甲縮醛」)置換之實施例，其中各R或R'獨立地為H或視情況含有醚及(-O-)鍵之經取代或未經取代之烷基(1至20個C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳醛基。聚核苷酸中並非所有鍵均需要相同。前述描述適用於本文所提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。
術語「多肽」、「寡肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用以指代任何長度之胺基酸鏈。鏈可為直鏈或分支鏈，其可包含經修飾胺基酸及/或可間雜有非胺基酸。術語亦涵蓋已經天然或干預修飾之胺基酸鏈；例如雙硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化，或任何其他操作或修飾，諸如與標記組分結合。定義內亦包括例如含有胺基酸之一或多種類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及此項技術中已知之其他修飾的多肽。應理解，多肽可作為單一鏈或相關鏈出現。
關於參考多肽(或核苷酸)序列之「序列一致性百分比(%)」或「與…一致之序列%」經定義為候選序列中之與參考多肽(核苷酸)序列中之胺基酸殘基(或核酸)一致之胺基酸殘基(或核酸)之百分比，視需要為獲得最大序列一致性百分比，在比對序列且引入間隙後，且未將任何保守性取代考慮作為序列一致性之部分。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的，可以在此項技術內之各種方式實現比對，例如使用公開可獲得的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可判定適用於比對序列之參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何演算法。
如在本文中其他地方所概述，病毒基因體之某些位置可改變。如本文所使用之「位置」意謂基因體序列中之位置。對應位置一般經由與其他親本序列比對來測定。
如本文所用，「純化」及其語法變體係指自含有多肽及一或多種雜質之混合物中移除(無論完全或部分)至少一種雜質，進而改良組合物中之多肽之純度水準(亦即，藉由減小組合物中之雜質量(ppm))。如本文中所用，在病毒之背景下，「純化」係指大體上不含來自衍生病毒之細胞或組織源之細胞材料及培養基的病毒。措辭「大體上不含細胞材料」包括其中病毒與細胞之細胞組分分離的病毒製劑，該病毒係自該細胞分離或以重組方式產生。因此，大體上不含細胞材料之病毒包括具有小於約30%、20%、10%或5%(乾重)細胞蛋白質(在本文中亦被稱作「污染性蛋白質」)之蛋白質製劑。病毒亦可大體上不含培養基，亦即培養基表示小於約20%、10%或5%之病毒製劑體積。可使用熟習此項技術者已知之常規方法「純化」病毒，包括(但不限於)層析及離心。
如本文中所使用，術語「重組痘病毒」係指在其藉由人工操控病毒基因體產生，亦即藉由重組DNA技術產生之基因體中包含外源或異源序列之痘病毒。重組痘病毒含有編碼所關注多肽之外源聚核苷酸序列。在一些實施例中，重組痘病毒包含編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸。
如本文中所使用，術語「救援痘病毒」或「救援病毒」或「救援系統」係指依賴於輔助病毒以藉由組裝片段化基因體同時整合靶向基因或表現卡匣來提供產生重組病毒必需之機構的病毒或系統。Rice等人Viruses. 2011年3月; 3(3): 217-232。
如本文中所用，在多肽之背景下，術語「殘基」係指直鏈多肽鏈中之胺基酸單元。此為在由α-胺基酸(亦即，NH2-CHR-COOH)形成多肽中移除水之後的各胺基酸(亦即，-NH-CHR-C-)之剩餘物。
術語「序列相似性」在其所有語法形式下係指可共用或可不共用共同進化源之核酸或胺基酸序列之間的一致性或對應性程度。
如本文中所用，「合成病毒」係指最初源自合成DNA (例如，化學合成DNA、PCR擴增DNA、經工程改造之DNA、包含核苷類似物之聚核苷酸等或其組合)之病毒且包括其後代，且由於天然、偶然或故意突變，後代可未必與初始母代合成病毒完全一致(在形態學或基因體DNA互補序列中)。在一些實施例中，合成病毒係指大體上所有病毒基因體最初源自合成DNA (例如，化學合成DNA、PCR擴增DNA、經工程改造之DNA、包含核苷類似物之聚核苷酸等或其組合)之病毒。在一較佳實施例中，合成病毒源自化學合成DNA。
如本文中所用，「大體上純的」係指至少50%純(亦即，無污染物)、更佳至少90%純、更佳至少95%純、又更佳至少98%純、且最佳至少99%純之材料。
如本文中所用，術語「疫苗」係指包含在動物體內誘導免疫反應之至少一種免疫學上地活性組分及可能(但不一定)增強活性組分之免疫活性之一或多種額外組分的組合物。疫苗可另外包含醫藥組合物典型之其他組分。疫苗之免疫學上地活性組分可包含呈其原始形式或呈滅毒粒子(經修飾之活疫苗)形式之完整病毒粒子或藉由適當方法失活之粒子(殺滅或失活疫苗)。在其他實施例中，疫苗之免疫學上地活性組分可包含最佳刺激免疫系統之生物體(次單位疫苗)之適當元件。免疫學上地活性組分可為病毒包膜之蛋白質。免疫學上地活性組分可為形成核蛋白殼之一部分之蛋白質。在一些實施例中，抗SARS-CoV-2之疫苗之免疫學上地活性組分為包膜蛋白。此類蛋白質之非限制性實例為刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)及血球凝集素-酯酶蛋白質(HE)。在一些實施例中，抗SARS-CoV-2之疫苗之免疫學上地活性組分為核衣殼蛋白(N)。
如本文中所用，術語「病毒載體」描述藉由重組DNA技術以使得其進入宿主細胞能夠引起特定生物活性，例如表現由載體承載之外來目標基因的方式操控之經遺傳修飾之病毒。病毒載體在目標細胞、組織或生物體中可為或可不為複製勝任型。病毒載體可併入來自任何已知生物體之基因體的序列。序列可以其天然形式併入或可以任何方式修飾以獲得所需活性。舉例而言，序列可包含插入、缺失或取代。病毒載體亦可併入用於外源聚核苷酸序列之插入位點。在一些實施例中，病毒載體為痘病毒。在一些實施例中，病毒載體為馬痘病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為合成馬痘病毒載體。
如本文中所用，術語「野生型病毒」、「野生型基因體」、「野生型蛋白質」或「野生型核酸」係指天然存在於特定群體(例如，特定病毒物種等)內之胺基或核酸序列。
本文中所述之各實施例可單獨地或與本文中所述之任何其他實施例組合使用。 概述
痘病毒為在經感染細胞之細胞質中複製的較大(約200 kbp) DNA病毒。正痘病毒(OPV)屬包含感染不同宿主之能力極不同之多種痘病毒。舉例而言，痘瘡病毒(VACV)可感染廣泛的宿主群，而天花病毒(VARV) (天花病原體)僅感染人類。許多(非全部)痘病毒之共同特徵為其在宿主內能夠非基因地「再活化」。非遺傳再活化係指感染一種痘病毒之細胞可促進回收本身將不具有感染性的第二「死亡」病毒(例如藉由熱失活之病毒)的過程。
經純化之痘病毒DNA不具感染性，因為病毒生命週期需要經封裝在病毒粒子中的編碼病毒之RNA聚合酶轉錄早期基因。然而，若將病毒DNA轉染至先前或隨後感染輔助痘病毒之細胞中，提供反式轉錄、複製及封裝經轉染基因體所需的必需因素，則可克服此缺陷(Sam CK, Dumbell KR. Expression of poxvirus DNA in coinfected cells and marker rescue of thermosensitive mutants by subgenomic fragments of DNA. Ann Virol (Inst Past). 1981;132:135-50)。儘管此產生混合病毒後代，但可藉由在支持兩種病毒傳播之細胞株中執行再活化反應，且接著藉由將病毒混合物接種於並不支持輔助病毒之生長之細胞上以消除輔助病毒而獲得所需病毒(Scheiflinger F, Dorner F, Falkner FG. Construction of chimeric vaccinia viruses by molecular cloning and packaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992;89(21):9977-81)。 製備痘病毒
揭示於US 2018/0251736及WO 2019/213452 (其全部揭示內容以引用之方式併入本文中)中之合成痘病毒中之任一者可用於本發明中。
在一個態樣中，本發明提供重組痘病毒，其包含編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸，其中SARS-CoV-2蛋白質係選自由以下組成之群：刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)及核衣殼蛋白(N)或該等蛋白質中之兩者或更多者的組合。
在一些實施例中，痘病毒屬於脊椎動物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae subfamily )。在一些實施例中，痘病毒屬於選自以下之脊椎動物痘病毒亞科屬：禽痘病毒屬(Avipoxvirus )、羊痘病毒(Capripoxvirus )、鹿痘病毒(Cervidpoxvirus )、鱷魚痘病毒(Crocodylipoxvirus )、野兔痘病毒(Leporipoxvirus )、軟疣痘病毒(Molluscipoxvirus )、正痘病毒(Orthopoxvirus )、副痘病毒(Parapoxvirus )、豬痘病毒(Suipoxvirus )或亞塔痘病毒(Yatapoxvirus )。在一些實施例中，重組痘病毒為正痘病毒(Orthopoxvirus )。在一些實施例中，正痘病毒係選自由以下組成之群：駱駝痘病毒(CMLV)、牛痘病毒(cowpox virus；CPXV)、鼠痘病毒(ECTV，「鼠痘劑」)、馬痘病毒(HPXV)、猴痘病毒(MPXV)、兔痘病毒(RPXV)、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦森伊修病病毒(Uasin Gishu disease virus)、痘瘡病毒(vaccinia virus；VACV)、天花病毒(VARV)及田鼠痘病毒(VPV)。在一些實施例中，痘病毒為副痘病毒。在一些實施例中，副痘病毒係選自羊傳染性膿皰病毒(ORFV)、偽牛痘病毒(PCPV)、牛丘疹性口炎病毒(BPSV)、松鼠副痘病毒(SPPV)、紅鹿副痘病毒、Ausdyk病毒、羚羊觸染性膿皰病病毒、馴鹿副痘病毒或海豹痘病毒。在一些實施例中，痘病毒為軟疣痘病毒。在一些實施例中，軟疣痘病毒為傳染性軟疣病毒(MCV)。在一些實施例中，痘病毒為亞塔痘病毒屬。在一些實施例中，亞塔痘病毒屬係選自特納河痘病毒(Tanapox virus)或亞巴猴腫瘤病毒(Yaba monkey tumor virus；YMTV)。在一些實施例中，痘病毒為羊痘病毒。在一些實施例中，羊痘病毒係選自綿羊痘病毒、山羊痘病毒或粗皮病(lumpy skin disease)病毒。在一些實施例中，痘病毒為豬痘病毒。在一些實施例中，豬痘病毒(Suipoxvirus)為豬痘病毒(swinepox virus)。在一些實施例中，痘病毒為野兔痘病毒。在一些實施例中，野兔痘病毒係選自黏液瘤病毒、休普氏纖維瘤病毒(Shope fibroma virus；SFV)、松鼠纖維瘤病毒或野兔纖維瘤病毒。在一些實施例中，痘病毒為HPXV。在一些實施例中，馬痘病毒為病毒株MNR-76。在其他實施例中，痘病毒為VACV。在一些實施例中，VACV係選自由以下組成之病毒株群：Western Reserve、Western Reserve純系3、Tian Tian、Tian Tian純系TP5、Tian Tian純系TP3、NYCBH、NYCBH純系Acambis 2000、Wyeth、Copenhagen、Lister、Lister 107、Lister-LO、Lister GL-ONC1、Lister GL-ONC2、Lister GL-ONC3、Lister GL-ONC4、Lister CTC1、Lister IMG2 (Turbo FP635)、IHD-W、LC16m18、Lederle、Tashkent純系TKT3、Tashkent純系TKT4、USSR、Evans、Praha、L-IVP、V-VET1或LIVP 6.1.1、Ikeda、EM-63、Malbran、Duke、3737、CV-1、Connaught Laboratories、Serro 2、CM-01、NYCBH Dryvax純系DPP13、NYCBH Dryvax純系DPP15、NYCBH Dryvax純系DPP20、NYCBH Dryvax純系DPP17、NYCBH Dryvax純系DPP21、VACV-IOC、安卡拉絨膜尿囊痘瘡病毒(Chorioallantoid Vaccinia virus Ankara；CVA)、改良之安卡拉痘瘡病毒(Modified vaccinia Ankara；MVA)及MVA-BN。仍不斷發現新型痘病毒(例如，正痘病毒)。應理解，本發明之痘病毒可基於此類新發現之痘病毒。
化學病毒基因體合成開拓將大量有用修飾引入至所得基因體或其特定部分中之可能。該等修飾可提高選殖產生病毒的便利性、為重組基因產物的引入提供位點、提高鑑別再活化之病毒純系的便利性及/或賦予許多其他有用特徵(例如引入所需抗原、產生溶瘤病毒等)。在一些實施例中，修飾可包括一或多個毒性因子之減弱或缺失。在一些實施例中，修飾可包括添加或插入一或多種毒性調節基因或基因編碼調節因子。
傳統上，痘病毒之末端髮夾已難以進行選殖及定序。因此，一些經發佈基因體序列(例如，VACV、ACAM 2000及HPXV MNR-76)並不完整。HPXV基因體之經發佈序列同樣不完整，可能在末端端部缺失約60 bp。在一例示性實施例中，129 nt ssDNA片段係使用VACV末端髮夾之經發佈序列作為指導來化學合成，且經接合至包含HPXV基因體之左右端的dsDNA片段上。在一些實施例中，本發明之痘病毒之末端髮夾源自VACV。在一些實施例中，末端髮夾源自CMLV、CPXV、ECTV、HPXV、MPXV、RPXV、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦森伊修病病毒或VPV。在一些實施例中，末端髮夾係基於任何痘病毒之末端髮夾，其基因體已完全定序或其天然分離物可用於基因體定序。在一些實施例中，痘病毒為包含VACV之末端髮夾的HPXV合成版本(GenBank寄存編號KY349117；參見US 2018/0251736，其以引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，引入痘病毒基因體中之修飾可包括缺失一或多個限制位點。在一些實施例中，修飾可包括引入一或多個限制位點。在一些實施例中，基因體缺失或添加至基因體之限制位點可選自以下限制位點中之一或多者，諸如(但不限於)AanI 、 AarI 、 AasI 、 AatI 、 AatII 、 AbaSI 、 AbsI 、 Acc65I 、 AccI 、 AccII 、 AccIII 、 AciI 、 AclI 、 AcuI 、 AfeI 、 AflII 、 AflIII 、 AgeI 、 AhdI 、 AleI 、 AluI 、 AlwI 、 AlwNI 、 ApaI 、 ApaLI 、 ApeKI 、 ApoI 、 AscI 、 AseI 、 AsiSI 、 AvaI 、 AvaII 、 AvrII 、 BaeGI 、 BaeI 、 BamHI BanI 、 BanII 、 BbsI 、 BbvCI 、 BbvI 、 BccI 、 BceAI 、 BcgI 、 BciVI 、 BclI 、 BcoDI 、 BfaI 、 BfuAI 、 BfuCI 、 BglI 、 BglII 、 BlpI 、 BmgBI 、 BmrI 、 BmtI 、 BpmI 、 Bpu10I 、 BpuEI 、 BsaAI 、 BsaBI 、 BsaHI 、 BsaI 、 BsaJI 、 BsaWI 、 BsaXI 、 BseRI 、 BseYI 、 BsgI 、 BsiEI 、 BsiHKAI 、 BsiWI 、 BslI 、 BsmAI 、 BsmBI 、 BsmFI 、 BsmI 、 BsoBI 、 Bsp1286I 、 BspCNI 、 BspDI 、 BspEI 、 BspHI 、 BspMI 、 BspQI 、 BsrBI 、 BsrDI 、 BsrFαI 、 BsrGI 、 BsrI 、 BssHII 、 BssSαI 、 BstAPI 、 BstBI 、 BstEII 、 BstNI 、 BstUI 、 BstXI 、 BstYI 、 BstZ17I 、 Bsu36I 、 BtgI 、 BtgZI 、 BtsαI 、 BtsCI 、 BtsIMutI 、 Cac8I 、 ClaI 、 CspCI 、 CviAII 、 CviKI-1 、 CviQI 、 DdeI 、 DpnI 、 DpnII 、 DraI 、 DrdI 、 EaeI 、 EagI 、 EarI 、 EciI 、 Eco53kI 、 EcoNI 、 EcoO109I 、 EcoP15I 、 EcoRI 、 EcoRV 、 FatI 、 FauI 、 Fnu4HI 、 FokI 、 FseI 、 FspEI 、 FspI 、 HaeII 、 HaeIII 、 HgaI 、 HhaI 、 HincII 、 HindIII 、 HinfI 、 HinP1I 、 HpaI 、 HpaII 、 HphI 、 Hpy166II 、 Hpy188I 、 Hpy188III 、 Hpy99I 、 HpyAV 、 HpyCH4III 、 HpyCH4IV 、 HpyCH4V 、 I-CeuI 、 I-SceI 、 KasI 、 KpnI 、 LpnPI 、 MboI 、 MboII 、 MfeI 、 MluCI 、 MluI 、 MlyI 、 MmeI 、 MnlI 、 MscI 、 MseI 、 MslI 、 MspA1I 、 MspI 、 MspJI 、 MwoI 、 NaeI 、 NarI 、 NciI 、 NcoI 、 NdeI 、 NgoMIV 、 NheI 、 NlaIII 、 NlaIV 、 NmeAIII 、 NotI 、 NruI 、 NsiI 、 NspI 、 PacI 、 PaeR7I 、 PciI 、 PflFI 、 PflMI 、 PleI 、 PluTI 、 PmeI 、 PmlI 、 PpuMI 、 PshAI 、 PsiI 、 PspGI 、 PspOMI 、 PspXI 、 PstI 、 PvuI 、 PvuII 、 RsaI 、 RsrII 、 SacI 、 SacII 、 SalI 、 SapI 、 Sau3AI 、 Sau96I 、 SbfI 、 ScrFI 、 SexAI 、 SfaNI 、 SfcI 、 SfiI 、 SfoI 、 SgrAI 、 SmaI 、 SmlI 、 SnaBI 、 SpeI 、 SphI 、 SrfI 、 SspI 、 StuI 、 StyD4I 、 StyI 、 SwaI 、 TaqαI 、 TfiI 、 TseI 、 Tsp45I 、 TspMI 、 TspRI 、 Tth111I 、 XbaI 、 XcmI 、 XhoI 、 XmaI 、 XmnI 或 ZraI 。應理解，可將任何所需限制位點或限制位點之組合插入至基因體中或自基因體中突變及/或消除。在一些實施例中，病毒基因體缺失一或多個AarI 位點。在一些實施例中，病毒基因體缺失一或多個Bsa I位點。在一些實施例中，自基因體徹底地消除一或多個限制位點(例如可消除病毒基因體中之所有AarI 位點)。在一些實施例中，將一或多個AvaI 限制位點引入至病毒基因體中。在一些實施例中，將一或多個StuI 位點引入至病毒基因體中。在一些實施例中，一或多種修飾可包括併入重組工程改造目標，包括(但不限於)loxP 或FRT位點。
在一些實施例中，痘病毒修飾可包括引入螢光標記物，諸如(但不限於)綠色螢光蛋白(GFP)、增強之GFP、黃色螢光蛋白(YFP)、青色/藍色螢光蛋白(BFP)、紅色螢光蛋白(RFP)或其變異體等；可選擇標記物，諸如(但不限於)抗藥性標記物(例如，大腸桿菌(E. coli)黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因(gpt )、白黑鏈黴菌嘌呤黴素乙醯基轉移酶基因(pac )、新黴素磷酸轉移酶基因I (nptI )、新黴素磷酸轉移酶基因II (nptII )、潮黴素磷酸轉移酶(hpt )、sh ble基因等)；蛋白質或肽標記物，諸如(但不限於) MBP (麥芽糖結合蛋白)、CBD (纖維素結合域)、GST (麩胱甘肽-S-轉移酶)、Poly(His)、FLAG、V5、c-Myc、HA (紅血球凝集素)、NE-標籤、CAT (氯黴素乙醯基轉移酶)、DHFR (二氫葉酸還原酶)、HSV (單純疱疹病毒)、VSV-G (水泡性口炎病毒糖蛋白)、螢光素酶、蛋白質A、蛋白質G、抗生蛋白鏈菌素、T7、硫化還原蛋白、酵母2-雜交標籤，諸如B42、GAL4、LexA或VP16；局部化標籤，諸如NLS標籤、SNAP標籤、Myr標籤等。應理解，可使用此項技術中已知的其他可選擇標記物及/或標籤。在一些實施例中，修飾包括一或多個可選標記物來幫助選擇再活化之純系(例如螢光標記物，諸如YFP，藥物選擇標記物，諸如gpt 等)以幫助選擇再活化之病毒純系。在一些實施例中，一或多個可選擇標記物在選擇步驟之後自再活化純系中缺失。
在一些實施例中，痘病毒為合成馬痘病毒(scHPXV)。在一些實施例中，合成馬痘病毒已藉由重組合病毒基因體之重疊DNA片段來產生且在先前感染輔助病毒之細胞中進行功能性痘病毒之再活化。簡言之，涵蓋馬痘之所有或大體上所有病毒基因體之重疊DNA片段經化學合成且經轉染至感染輔助病毒之細胞中。培養經轉染細胞以產生包含輔助病毒及再活化馬痘病毒之混合病毒後代。接著，將混合病毒後代接種於不支持輔助病毒生長但允許合成痘病毒生長之宿主細胞上，以消除輔助病毒且回收合成痘病毒。
在一些實施例中，大體上所有合成痘病毒基因體皆源自化學合成DNA。在一些實施例中，約40%、約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、超過99%或100%之合成痘病毒基因體源自化學合成DNA。在一些實施例中，痘病毒基因體係源自化學合成DNA及天然存在之DNA的組合。
用於產生合成痘病毒之重疊DNA片段的數目將視痘病毒基因體之大小而定。諸如一方面重組效率隨片段數目增加而降低且另一方面隨著片段數目減少而難以合成極大DNA片段之實際考慮因素亦將告知所用的重疊片段之數目。在一些實施例中，合成痘病毒基因體可合成為單一片段。在一些實施例中，合成痘病毒基因體係由2至14個重疊DNA片段組裝。在一些實施例中，合成痘病毒基因體係由4至12個重疊DNA片段組裝。在一些實施例中，合成痘病毒基因體係由6至10個重疊DNA片段組裝。在一些實施例中，合成痘病毒基因體係由8至12個重疊DNA片段組裝。在一些實施例中，合成痘病毒基因體係由10個重疊DNA片段組裝。在本發明之一例示性實施例中，合成馬痘病毒(scHPXV)係由10個經化學合成之重疊雙股DNA片段再活化。在一些實施例中，涵蓋痘病毒基因體之全部片段均為化學合成的。在一些實施例中，片段中之一或多者為化學合成的且片段中之一或多者源自天然存在之DNA (例如藉由PCR擴增或藉由公認重組DNA技術)。
在一些實施例中，末端髮夾環經單獨合成且接合至包含痘病毒基因體之左右端之片段上。在一些實施例中，末端髮夾環可源自天然存在之模板。在一些實施例中，合成痘病毒之末端髮夾源自VACV。在一些實施例中，重組合成痘病毒之末端髮夾源自CMLV、CPXV、ECTV、HPXV、MPXV、RPXV、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒(Taterapox virus)、瓦森伊修病病毒或VPV。在一些實施例中，重組scHPXV之末端髮夾源自VACV。在一些實施例中，重組scHPXV之末端髮夾源自CMLV、CPXV、ECTV、HPXV、MPXV、RPXV、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦森伊修病病毒或VPV。在一些實施例中，痘病毒之末端髮夾係基於任何痘病毒之末端髮夾，其基因體已經完全定序或其天然分離物可用於基因體定序。
用於產生本發明之痘病毒之重疊片段之大小將視痘病毒基因體之大小而定。應理解，片段大小可廣泛變化，且諸如化學合成極大DNA片段的能力之各種實際考慮因素將告知片段大小的選擇。在一些實施例中，片段大小範圍為約2000 bp至約50000 bp。在一些實施例中，片段大小範圍為約3000 bp至約45000 bp。在一些實施例中，片段大小範圍為約4000 bp至約40000 bp。在一些實施例中，片段大小範圍為約5000 bp至約35000 bp。在一些實施例中，最大片段為約20000 bp、21000 bp、22000 bp、23000 bp、24 000 bp、25000 bp、26000 bp、27000 bp、28000 bp、29000 bp、30000 bp、31000 bp、32000 bp、33000 bp、34000 bp、35000 bp、36000 bp、37000 bp、38000 bp、39000 bp、40000 bp、41000 bp、42000 bp、43000 bp、44000 bp、45000 bp、46000 bp、47000 bp、48000 bp、49000 bp或50000 bp。在一些實施例中，scHPXV係由大小在約8500 bp至約32000 bp內變化之10個化學合成之重疊雙股DNA片段(表 2 )再活化。
本發明之痘病毒可在允許病毒生長至允許使用本文所述之重組痘病毒的效價的任何受質中繁殖。本發明之痘病毒可在容易感染痘病毒之細胞(例如禽類細胞、蝙蝠細胞、牛細胞、駱駝細胞、金絲雀細胞、貓細胞、鹿細胞、馬細胞、家禽細胞、沙鼠細胞、山羊細胞、人類細胞、猴細胞、豬細胞、家兔細胞、浣熊細胞、海豹細胞、綿羊細胞、臭鼬細胞、田鼠細胞等)中生長。在一些實施例中，痘病毒在哺乳動物細胞中生長。此類方法為熟習此項技術者所熟知的。代表性哺乳動物細胞包括(但不限於) BHK、BGMK、BRL3A、BSC-40、CEF、CEK、CHO、COS、CVI、HaCaT、HEL、HeLa細胞、HEK293、人類骨骼骨肉瘤細胞株143B、MDCK、NIH/3T3、Vero細胞等。對於病毒分離，通常地藉由熟知澄清程序(例如諸如梯度離心及管柱層析)將重組痘病毒自細胞培養物中移除並與細胞組分分離，且可視需要使用熟習此項技術者熟知之程序(例如溶菌斑分析)進一步純化。在一些實施例中，痘病毒在Vero細胞中生長。在一些實施例中，痘病毒在BSC-40細胞中生長。
在一些實施例中，產生合成痘病毒之方法包含以下步驟：(i)化學合成對應於痘病毒之大體上所有病毒基因體的重疊DNA片段，且視情況化學合成自另一病毒或另一病毒株之末端髮夾環；(ii)將重疊DNA片段轉染至感染輔助病毒之細胞；(iii)培養該等細胞以在該等細胞中產生輔助病毒及合成痘病毒粒子之混合物；以及(iv)將混合物接種於對痘病毒具有特異性之宿主細胞上以回收合成痘病毒。
在一些實施例中，產生合成馬痘病毒之方法包含以下步驟：(i)化學合成對應於馬痘病毒之大體上所有病毒基因體的重疊DNA片段且化學合成自另一痘病毒(諸如VACV、病毒株WB或NYCBH純系ACAM 2000)之末端髮夾環；(ii)將重疊DNA片段轉染至感染輔助病毒之細胞；(iii)培養該等細胞以在該等細胞中產生輔助病毒及合成馬痘病毒粒子之混合物；以及(iv)將混合物接種於對馬痘病毒具有特異性之宿主細胞上以回收合成馬痘病毒。
在一些實施例中，痘病毒為合成馬痘病毒。在一些實施例中，合成馬痘病毒基因體係基於針對馬痘病毒所描述之經發佈基因體序列(GenBank寄存號DQ792504)且末端髮夾係基於類似於VACV病毒株NYCBH純系ACAM2000之經發佈基因體序列(GenBank寄存號MN974380)。在一些實施例中，合成馬痘病毒包含以寄存編號KY349117寄存於GenBank之序列；參見US 2018/0251736，其以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，合成馬痘病毒之特徵為編碼SARS-CoV-2病毒S蛋白質之核酸包含SEQ ID NO:43中所闡述之序列。
在一些實施例中，痘病毒為合成重組痘瘡病毒(synVACV)。在一些實施例中，合成痘瘡基因體係基於針對VACV病毒株NYCBH純系ACAM2000所描述之經發佈基因體序列(GenBank寄存號AY313847；Osborne JD等人，Vaccine. 2007; 25(52):8807-32)。在一些實施例中，合成痘瘡基因體係基於類似於VACV病毒株NYCBH純系ACAM2000之經發佈基因體序列(GenBank寄存號MN974380；參見WO 2019/213452，其以引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，合成痘瘡病毒包含以寄存編號MN974381寄存於GenBank之序列(參見WO 2019/213452，其以引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，合成痘瘡病毒之特徵為編碼SARS-CoV-2病毒S蛋白質之核酸包含SEQ ID NO: 44中所闡述之序列。 產生包含 SARS-CoV-2 蛋白質之重組痘病毒
揭示於US 2018/0251736及WO 2019/213452中之合成性痘病毒中之任一者可用於產生如本文中所揭示之包含SARS-CoV-2蛋白質之重組痘病毒。
在一個態樣中，本發明係關於一種重組痘病毒，其包含編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸，其中SARS-CoV-2蛋白質係選自由以下組成之群：刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)及核衣殼蛋白(N)或該等蛋白質中之兩者或更多者的組合。在一些實施例中，SARS-CoV-2病毒之核苷酸序列為經發佈基因體序列中之任一者，包括(但不限於)武漢病毒株、英國病毒株B.1.1.7病毒株、南非B. 1.351病毒株、巴西B.1.1.28病毒株、其他新出現變異體及其任一變異體之基因體序列。在一些實施例中，SARS-CoV-2病毒之核苷酸序列係選自由以下組成之群：GenBank寄存編號NC045512.2、LC521925.1、MN988668.1、MN985325.1、MN975262.1、MN938384.1、LR757998.1、LR757996.1、LR757995.1及MN908947.3。在一些實施例中，SARS-CoV-2病毒之核苷酸序列之特徵為Genbank寄存編號MN988668.1中所示之序列；SEQ ID NO: 46。在一些實施例中，SARS-CoV-2病毒之核苷酸序列進一步選自由以下組成之群：QQX99439 (例如，B.1.1.7英國(United Kingdom)變異體)、TEGALLY (例如，B.1.351南非變異體)、YP_009724390 (例如，武漢變異體)及FARIA (例如，B.1.1.28巴西變異體)。
SARS-CoV-2病毒之病毒包膜由特徵刺突狀糖蛋白(S)以及包膜(E)及膜(M)蛋白質覆蓋。S蛋白質介導宿主細胞連接及進入。包含由核衣殼蛋白(N)包裹之病毒基因體之螺旋核蛋白殼駐存於病毒包膜內。在一些實施例中，痘病毒或合成痘病毒包含編碼SARS-CoV-2包膜蛋白之核酸。此類蛋白質之非限制性實例為刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)及血球凝集素-酯酶蛋白質(HE)。在一些實施例中，痘病毒或合成痘病毒包含編碼S蛋白質(SEQ ID NO: 9)之核酸。在一些實施例中，痘病毒或合成痘病毒包含編碼S蛋白質(SEQ ID NO: 47)之核酸。在一些實施例中，痘病毒或合成痘病毒包含編碼M蛋白質(SEQ ID NO: 10)之核酸。在一些實施例中，痘病毒或合成痘病毒包含編碼M蛋白質(SEQ ID NO: 48)之核酸。在一些實施例中，痘病毒或合成痘病毒包含編碼N蛋白質(SEQ ID NO: 11)之核酸。在一些實施例中，痘病毒或合成痘病毒包含編碼N蛋白質(SEQ ID NO: 49)之核酸。在一些實施例中，痘病毒或合成痘病毒包含編碼HE蛋白質(蛋白質E或武漢-HU-1之HE，寄存號LC521925.1；SEQ ID NO: 12)之核酸。在一些實施例中，痘病毒或合成痘病毒包含S蛋白質及M蛋白質之組合。在一些實施例中，痘病毒或合成痘病毒包含S蛋白質及N蛋白質之組合。在一些實施例中，痘病毒或合成痘病毒包含M蛋白質及N蛋白質之組合。
在一些實施例中，SARS-CoV-2病毒為武漢海產食品市場肺炎病毒2019-nCoV分離物。GenBank寄存號LC521925.1；SEQ ID NO: 13。在一些實施例中，SARS-CoV-2病毒為武漢海產食品市場肺炎病毒2019-nCoV分離物。GenBank寄存號MN988668.1；SEQ ID NO: 46。
在一些實施例中，SARS-CoV-2病毒蛋白質之胺基酸序列相對於野生型蛋白質經修飾。
在一些實施例中，編碼S蛋白質之核苷酸序列相對於野生型核苷酸序列經修飾。在一些實施例中，S蛋白質之胺基酸序列相對於野生型蛋白質(Wuhan-HU-1之蛋白質S，寄存號LC521925.1；SEQ ID NO: 9)經修飾。在一些實施例中，S蛋白質之胺基酸序列相對於野生型蛋白質(Wuhan-HU-1之蛋白質S，寄存號MN988668.1；SEQ ID NO: 47)經修飾。在一些實施例中，S蛋白質之胺基酸序列相對於野生型蛋白質(Wuhan-HU-1之蛋白質S，寄存號NC_045512.2；SEQ ID NO: 53)經修飾。在一些實施例中，SARS-CoV-2病毒蛋白質之胺基酸序列相對於野生型蛋白質經修飾，使得經修飾蛋白質經調適以感染小鼠。參見Roberts等人，PLoS Pathog 3(1): e5. 數位物件識別碼：10.1371；其以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，相對於野生型蛋白質(SEQ ID NO:47)，S蛋白質中之位置459之酪胺酸經組胺酸(Y459H)取代。在一些實施例中，S蛋白質包含使得抗體依賴性增強之一或多種突變。在一些實施例中，相對於野生型蛋白質(SEQ ID NO:47)，S蛋白質中之位置614之天冬胺酸經甘胺酸(D614G)取代。參見Korber等人，bioRxiv 2020.04.29.069054；其以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，S蛋白質包含HR1區之融合核心中之一或多種突變。在一些實施例中，相對於野生型蛋白質(SEQ ID NO:47)，S蛋白質中之位置943之絲胺酸經脯胺酸(S943P)取代。在一些實施例中，S蛋白質包含使呈抗原最佳融合前構形之S蛋白質穩定之一或多種突變，其促成增強的表現、構形均一性及誘導強效抗體反應。在一些實施例中，使呈融合前構形之S蛋白質穩定之突變位於中央螺旋之開端處。參見Pallesen等人，Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114(35)；其以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，相對於野生型蛋白質(SEQ ID NO:47)，S蛋白質中之位置986之離胺酸經脯胺酸(K986P)取代。在一些實施例中，相對於野生型蛋白質(SEQ ID NO:47)，S蛋白質中之位置987之纈胺酸經脯胺酸(V987P)取代。在一些實施例中，相對於野生型蛋白質(SEQ ID NO: 47)，S蛋白質包含以下取代中之任一者：Y459H、D614G、S943P、K986P及V987P或其組合。
在一些實施例中，M蛋白質之胺基酸序列相對於野生型蛋白質(Wuhan-HU-1之蛋白質M，寄存號LC521925.1；SEQ ID NO: 10)經修飾。在一些實施例中，M蛋白質之胺基酸序列相對於野生型蛋白質(Wuhan-HU-1之蛋白質M，寄存號MN988668.1；SEQ ID NO: 48)經修飾。在一些實施例中，相對於野生型蛋白質，M蛋白質中之位置11之麩胺酸經離胺酸取代。在一些實施例中，相對於野生型蛋白質(SEQ ID NO: 10)，M蛋白質中之位置11之麩胺酸經離胺酸取代。在一些實施例中，相對於野生型蛋白質(SEQ ID NO: 48)，M蛋白質中之位置11之麩胺酸經離胺酸取代。
在一些實施例中，N蛋白質之胺基酸序列相對於野生型蛋白質(Wuhan-HU-1之蛋白質N，寄存號LC521925.1；SEQ ID NO: 11)經修飾。在一些實施例中，N蛋白質之胺基酸序列相對於野生型蛋白質(Wuhan-HU-1之蛋白質N，寄存號MN988668.1；SEQ ID NO: 49)經修飾。
在一些實施例中，編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸序列相對於野生型蛋白質經修飾。在一些實施例中，編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸序列相對於野生型蛋白質(SEQ ID NO: 9)經修飾。在一些實施例中，編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸序列相對於野生型蛋白質(SEQ ID NO: 47)經修飾。在一些實施例中，編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸序列相對於野生型蛋白質經修飾以有效表現痘病毒中之轉殖基因。在一些實施例中，移除含痘瘡早期轉錄終止信號(ETTS)之異源基因編碼序列(TTTTTNT；亦稱作T5 NT (SEQ ID NO: 14))。參見Earl等人，Journal of Virology, 1990；2448-2451；其以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，痘病毒基因體保留兩種重疊內源性ETTS。在一些實施例中，相對於編碼SARS-CoV-2病毒之S蛋白質(Wuhan-HU-1之蛋白質，寄存號MN988668.1；SEQ ID NO: 47)之核序列，含有痘瘡早期轉錄終止信號之異源基因編碼序列(TTTTTNT；亦稱作T5 NT (SEQ ID NO: 14))經移除。
在一些實施例中，編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，啟動子為痘病毒特異性啟動子。在一些實施例中，啟動子位於轉殖基因表現卡匣之左側接臂與ATG之間。在一些實施例中，痘病毒啟動子為痘瘡病毒早期啟動子。在一些實施例中，痘病毒啟動子為最佳化痘瘡病毒早期啟動子(AAAATTGAAANNNTANNNNNNNNNNNNNNNNNN；SEQ ID NO: 3)。在一些實施例中，痘病毒啟動子為合成痘瘡病毒晚期啟動子(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTNNNNNNTAAATG；SEQ ID NO: 4)。在一些實施例中，痘病毒啟動子為重疊合成早期/晚期啟動子(AAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATA；SEQ ID NO: 5)。參見圖 8 。參見Chakrabarti等人，BioTechniques 23:1094-1097；其以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，痘瘡病毒晚期啟動子核苷酸序列包含SEQ ID NO: 6中所闡述之序列(TTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATA)。在一些實施例中，痘瘡病毒晚期啟動子為SEQ ID NO: 6中所闡述之序列。在一些實施例中，痘瘡病毒晚期啟動子核苷酸序列包含SEQ ID NO: 7中所闡述之序列(AAAATTGAAAAAATA)。在一些實施例中，痘病毒啟動子為包含SEQ ID NO: 8中所闡述之序列之重疊合成早期/晚期啟動子(TTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATATCCGGT AAAATTGAAAAAATA)。在一些實施例中，痘病毒啟動子為包含早期啟動子之38至160個核苷酸3'之核酸間隔子序列且位於RNA起始位點與ATG之間的重疊合成早期/晚期啟動子。在一些實施例中，間隔子為160個核苷酸長，使得表現量提高。參見圖 9 。參見Di Pilato等人，Journal of General Virology (2015), 96, 2360-2371；其以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，痘瘡病毒晚期啟動子及間隔子包含SEQ ID NO: 39中所闡述之序列。在一些實施例中，痘瘡病毒晚期啟動子及間隔子為SEQ ID NO: 39中所闡述之序列。
在一些實施例中，將SARS-CoV-2之蛋白質插入至複製之非必需基因中。在一些實施例中，將SARS-CoV-2蛋白質插入至馬痘病毒或合成馬痘病毒之胸苷激酶(TK)基因座(基因ID HPXV095；位置992077-92610；SEQ ID NO: 1)中。在一些實施例中，將SARS-CoV-2蛋白質插入至痘瘡病毒或合成痘瘡病毒之胸苷激酶(TK)基因座(基因ID synVACV_105；位置83823-84344；SEQ ID NO: 2)中。TK基因座為所關注之外來基因提供穩定插入位點。TK基因座亦提供選擇標記以鑑別已插入編碼SARS-CoV-2蛋白質之核酸之彼等純系。已插入編碼SARS-CoV-2蛋白質之核酸的純系由於不具有TK基因而不能夠在5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU) (其為嘧啶脫氧核苷胸苷之類似物)存在下生長。
一種產生本發明之包含SARS-CoV-2病毒之S蛋白質的重組痘病毒之例示性方法包含： a) 使細胞(例如，Vero細胞或BSC-40細胞)感染痘病毒(諸如馬痘病毒)。 b)獲得表現卡匣，其包含：包含編碼S蛋白質之核苷酸序列之核苷酸片段，其中所得S蛋白質包含以下胺基酸取代中之任一者：(i) Y459H，使得其經調適用於感染小鼠；(ii) D614G；(iii) S943P；(iv) K986P或(v) V987P或其組合；且其中編碼S蛋白質之核苷酸序列包含缺失兩個T5NT (SEQ ID NO: 14)序列。 c) 獲得包含痘瘡病毒早期/晚期啟動子之核苷酸片段且將其安置在經修飾S蛋白質之上游。包含痘瘡病毒早期/晚期啟動子及經工程改造之S基因之此表現卡匣稱作「經工程改造之SARS-CoV-2 S基因表現卡匣」。 d)使經感染細胞(例如，Vero細胞或BSC-40細胞)轉染有包含「經工程改造之SARS-CoV-2 S基因表現卡匣」之PCR產生核苷酸片段。輔助病毒催化共用側接同源序列(左右臂之間的序列)之片段之間的重組合。因此，將經由左同源序列(HPXV094) (臂)與右同源序列(HPXV096) (臂)之間的重組合來將表現卡匣插入至TK基因中。左右臂為側接TK基因座之大致400 bp序列且對待產生之痘病毒為特異性的。參見圖 10 。 本發明之方法
揭示於US 2018/0251736及WO 2019/213452中之合成痘病毒中之任一者可用於本文所揭示之方法中之任一者中。
本發明中所描述之包含編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸的重組痘病毒中之任一者可用於本文所揭示之方法中之任一者中。
在一個態樣中，本發明係關於一種用於選擇表現SARS-CoV-2病毒蛋白質之細胞之方法，其包含使該細胞感染本發明之重組痘病毒且選擇表現該SARS-CoV-2病毒蛋白質之經感染細胞。
在另一態樣中，本發明係關於一種在個體中誘導抗SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，其包含向該個體投與免疫學上有效量之本發明之重組痘病毒。
在另一態樣中，本發明係關於一種產生本發明之重組痘病毒之方法，該方法包含： (a)    使宿主細胞感染痘病毒； (b)    使步驟(a)之經感染細胞轉染有編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸以產生重組痘病毒；及 (c)    選擇重組痘病毒，其中編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸在轉染後位於痘病毒之對於複製痘病毒非必需的區域中。
在一些實施例中，本發明之重組痘病毒用作表現SARS-CoV-2病毒蛋白質之疫苗。評估重組痘病毒之安全性、免疫原性及保護能力之方法為此項技術中已知的。參見Kremer M等人，2012. 第59-92頁.In Isaacs SN (版), Vaccinia virus and poxvirology,第890卷. Humana Press, Totowa, NJ。在一些實施例中，免疫接種係經由皮下途徑進行。在一些實施例中，免疫接種係經由肌肉內途徑進行。在一些實施例中，免疫接種係經由鼻內途徑進行。在一些實施例中，免疫接種係經由劃痕法進行。在一些實施例中，使用約104 與約108 PFU之間的範圍的重組痘病毒。在一些實施例中，使用約104 、約105 、約106 、約107 或約108 PFU之重組痘病毒來進行免疫接種。在一些實施例中，使用約105 PFU之重組痘病毒以進行免疫接種。醫師將能夠判定用於每一個體之足夠PFU劑量。在一些實施例中，向個體投與一種劑量。在一些實施例中，向個體投與超過一種劑量。
在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導個體之抗SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，該方法包含向該個體投與免疫學上有效量之重組痘病毒或醫藥組合物。在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導個體之抗SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，其中免疫學上有效量之重組痘病毒係藉由劃痕法進行投與。在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導個體之抗SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，其中免疫反應包含能夠中和SARS-CoV-2病毒之抗體。在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導個體之抗SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，其中免疫學上有效量之重組痘病毒能夠保護個體免受SARS-CoV-2病毒感染。在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導個體之抗SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，其中免疫學上有效量之重組痘病毒減輕或預防個體在SARS-CoV-2感染之後的病毒進展。在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導個體之抗SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，其中免疫反應為T細胞免疫反應。
在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，該方法包含向該個體投與免疫學上有效量之重組痘病毒或醫藥組合物。在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，其中該免疫學上有效量之重組痘病毒係藉由劃痕法進行投與。在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，其中該免疫反應包含能夠中和SARS-CoV-2病毒及痘病毒之抗體。在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，其中免疫學上有效量之重組痘病毒能夠保護個體免受SARS-CoV-2病毒及天花病毒感染。在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，其中免疫學上有效量之重組痘病毒減輕或預防個體之SARS-CoV-2病毒感染及/或痘病毒感染之進展。在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，其中免疫反應為T細胞免疫反應。在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，其中痘病毒為痘瘡病毒、天花、馬痘病毒或猴痘病毒。
在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導抗SARS-CoV-2病毒之T細胞免疫性的方法，該方法包含向該個體投與免疫學上有效量之重組痘病毒或醫藥組合物。在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導抗SARS-CoV-2病毒之T細胞免疫性的方法，其中該免疫學上有效量之重組痘病毒係藉由劃痕法進行投與。在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導抗SARS-CoV-2病毒之T細胞免疫性的方法，其中免疫學上有效量之重組痘病毒能夠保護個體免受SARS-CoV-2病毒感染。在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導抗SARS-CoV-2病毒之T細胞免疫性的方法，其中免疫學上有效量之重組痘病毒減輕或預防個體在SARS-CoV-2感染之後的病毒進展。
在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之T細胞免疫性的方法，該方法包含向個體投與免疫學上有效量之重組痘病毒或醫藥組合物。在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之T細胞免疫性的方法，其中該免疫學上有效量之重組痘病毒係藉由劃痕法進行投與。在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之T細胞免疫性的方法，其中免疫學上有效量之重組痘病毒能夠保護個體免受SARS-CoV-2病毒及痘病毒感染。在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之T細胞免疫性的方法，其中免疫學上有效量之重組痘病毒減輕或預防個體在SARS-CoV-2感染及/或天花病毒感染之後的病毒進展。在一些實施例中，重組痘病毒適用於誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之T細胞免疫性的方法，其中痘病毒為痘瘡病毒、天花、馬痘病毒或猴痘病毒。
在一些實施例中，重組痘病毒適用於減輕或預防有需要或處於風險下之個體之SARS-CoV-2病毒感染之進展的方法，該方法包含向該個體投與免疫學上有效量之重組痘病毒或醫藥組合物。
在一些實施例中，重組痘病毒適用於減輕或預防處於風險下之個體之SARS-CoV-2病毒及痘病毒感染之進展的方法，該方法包含向該個體投與免疫學上有效量之重組痘病毒或醫藥組合物。在一些實施例中，重組痘病毒適用於減輕或預防SARS-CoV-2病毒及痘病毒感染之進展的方法，其中痘病毒為痘瘡病毒、天花、馬痘病毒或猴痘病毒。
在一些實施例中，重組痘病毒適用於抗SARS-CoV-2病毒之疫苗，該疫苗包含重組病毒或醫藥組合物。
在一些實施例中，重組痘病毒適用於抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之二價疫苗，該二價疫苗包含重組病毒或醫藥組合物。在一些實施例中，重組痘病毒適用於抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之二價疫苗，其中痘病毒為痘瘡病毒、天花、馬痘病毒或猴痘病毒。表 1. 本發明之一些序列之編譯。
合成包含編碼SARS-CoV-2病毒S蛋白質之核酸的馬痘病毒。SEQ ID NO: 43 1 ATTTACGGATTCACCAATAAAAATAAACTAGAGAAACTTAGTACTAATAAGGAAC 55 56 TAGAATCGTATAGTTCTAGCCCTCTTCAAGAACCCATTAGGTTAAATGATTTTCT 110 111 GGGACTATTGGAATGTATTAAAAAGAATATTCCTCTAACAGATATTCCGACAAAG 165 166 GATTGATTACTATAAATGGAGAATGTTCCTAATGTATACTTTAATCCTGTGTTTA 220 221 TAGAGCCCACGTTTAAACATTCTTTATTAAGTGTTTATAAACACAGATTAATAGT 275 276 TTTATTTGAAGTATTCATTGTATTCATTCTAATATATGTATTTTTTAGATCTGAA 330 331 TTAAATATGTTCTTCATGCCTAAACGAAAAATACCCGATCCTATTGATAGATTAC 385 386 GACGTGCTAATCTAGCGTGTGAAGACGATAAGTTAATGATCTATGGATTACCATG 440 441 GATGACAACTCAAACATCTGCGTTATCAATAAATAGTAAACCGATAGTGTATAAA 495 496 GATTGTGCAAAGCTTTTGCGATCAATAAATGGATCACAACCAGTATCTCTTAACG 550 551 ATGTTCTTCGCAGATGATGATTCATTTTTTAAGTATTTGGCTAGTCAAGATGATG 605 606 AATCTTCATTATCTGATATATTGCAAATCACTCAATATCTAGACTTTCTGTTATT 660 661 ATTATTGATCCAATCAAAAAATAAATTAGAAGCCGTGGGTCATTGTTATGAATCT 715 716 CTTTCAGAGGAATACAGACAATTGACAAAATTCACAGACTTTCAAGATTTTAAAA 770 771 AACTGTTTAACAAGGTCCCTATTGTTACAGATGGAAGGGTCAAACTTAATAAAGG 825 826 ATATTTGTTCGACTTTGTGATTAGTTTGATGCGATTCAAAAAAGAATCCTCTCTA 880 881 GCTACCACCGCAATAGATCCTATTAGATACATAGATCCTCGTCGTGATATCGCAT 935 936 TTTCTAACGTGATGGATATATTAAAGTTGAATAAAGTGAACAATAATTAATTCTT 990 991 TATTGTCATCTTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATATCCGGTAAAATTGAAA 1045 1046 AAATATACACTAATTAGCGTCTCGTTTCAGACGCTAGCTCGAGGTTGGGAGCTCT 1100 1101 CCGGATCCAAGCTTATCGATTTCGAACCCGGGGTACCGAATTCCTCGAGGTTGGG 1155 1156 AGCTCTCCGGATCCAAGCTTATCGATTTCGAACCCGGGGTACCGAATTCCTCGAG 1210 1211 ATGTTTATTTTCTTATTATTTCTTACTCTCACTAGTGGTAGTGACCTTGACCGGT 1265 1266 GCACCACTTTTGATGATGTTCAAGCTCCTAATTACACTCAACATACTTCATCTAT 1320 1321 GAGGGGGGTTTACTATCCTGATGAAATTTTTAGATCAGACACTCTTTATTTAACT 1375 1376 CAGGATTTATTTCTTCCATTTTATTCTAATGTTACAGGGTTTCATACTATTAATC 1430 1431 ATACGTTTGGCAACCCTGTCATACCTTTTAAGGATGGTATTTATTTTGCTGCCAC 1485 1486 AGAGAAATCAAATGTTGTCCGTGGTTGGGTTTTTGGTTCTACCATGAACAACAAG 1540 1541 TCACAGTCGGTGATTATTATTAACAATTCTACTAATGTTGTTATACGAGCATGTA 1595 1596 ACTTTGAATTGTGTGACAACCCTTTCTTTGCTGTTTCTAAACCCATGGGTACACA 1650 1651 GACACATACTATGATATTCGATAATGCATTTAATTGCACTTTCGAGTACATATCT 1705 1706 GATGCCTTTTCGCTTGATGTTTCAGAAAAGTCAGGTAATTTTAAACACTTACGAG 1760 1761 AGTTTGTGTTTAAAAATAAAGATGGGTTTCTCTATGTTTATAAGGGCTATCAACC 1815 1816 TATAGATGTAGTTCGTGATCTACCTTCTGGTTTTAACACTTTGAAACCTATTTTT 1870 1871 AAGTTGCCTCTTGGTATTAACATTACAAATTTTAGAGCCATTCTTACAGCCTTTT 1925 1926 CACCTGCTCAAGACATTTGGGGCACGTCAGCTGCAGCCTATTTTGTTGGCTATTT 1980 1981 AAAGCCAACTACATTTATGCTCAAGTATGATGAAAATGGTACAATCACAGATGCT 2035 2036 GTTGATTGTTCTCAAAATCCACTTGCTGAACTCAAATGCTCTGTTAAGAGCTTTG 2090 2091 AGATTGACAAAGGAATTTACCAGACCTCTAATTTCAGGGTTGTTCCCTCAGGAGA 2145 2146 TGTTGTGAGATTCCCTAATATTACAAACTTGTGTCCTTTTGGAGAGGTTTTTAAT 2200 2201 GCTACTAAATTCCCTTCTGTCTATGCATGGGAGAGAAAAAAAATTTCTAATTGTG 2255 2256 TTGCTGATTACTCTGTGCTCTACAACTCAACATTCTTTTCAACCTTTAAGTGCTA 2310 2311 TGGCGTTTCTGCCACTAAGTTGAATGATCTTTGCTTCTCCAATGTCTATGCAGAT 2365 2366 TCTTTTGTAGTCAAGGGAGATGATGTAAGACAAATAGCGCCAGGACAAACTGGTG 2420 2421 TTATTGCTGATTATAATTATAAATTGCCAGATGATTTCATGGGTTGTGTCCTTGC 2475 2476 TTGGAATACTAGGAACATTGATGCTACTTCAACTGGTAATCATAATTATAAATAT 2530 2531 AGGTATCTTAGACATGGCAAGCTTAGGCCCTTTGAGAGAGACATATCTAATGTGC 2585 2586 CTTTCTCCCCTGATGGCAAACCTTGCACCCCACCTGCTCTTAATTGTTATTGGCC 2640 2641 ATTAAATGATTATGGTTTTTACACCACTACTGGCATTGGCTACCAACCTTACAGA 2695 2696 GTTGTAGTACTTTCTTTTGAACTTTTAAATGCACCGGCCACGGTTTGTGGACCAA 2750 2751 AATTATCCACTGACCTTATTAAGAACCAGTGTGTCAATTTTAATTTTAATGGACT 2805 2806 CACTGGTACTGGTGTGTTAACTCCTTCTTCAAAGAGATTTCAACCATTTCAACAA 2860 2861 TTTGGCCGTGATGTTTCTGATTTCACTGATTCCGTTCGAGATCCTAAAACATCTG 2915 2916 AAATATTAGACATTTCACCTTGCTCTTTTGGGGGTGTAAGTGTAATTACACCTGG 2970 2971 AACAAATGCTTCATCTGAAGTTGCTGTTCTATATCAAGATGTTAACTGCACTGAT 3025 3026 GTTTCTACAGCAATTCATGCAGATCAACTCACACCAGCTTGGCGCATATATTCTA 3080 3081 CTGGAAACAATGTATTCCAGACTCAAGCAGGCTGTCTTATAGGAGCTGAGCATGT 3135 3136 CGACACTTCTTATGAGTGCGACATTCCTATTGGAGCTGGCATTTGTGCTAGTTAC 3190 3191 CATACAGTTTCTTTATTACGTAGTACTAGCCAAAAATCTATTGTGGCTTATACTA 3245 3246 TGTCTTTAGGTGCTGATAGTTCAATTGCTTACTCTAATAACACCATTGCTATACC 3300 3301 TACTAACTTTTCAATTAGCATTACTACAGAAGTAATGCCTGTTTCTATGGCTAAA 3355 3356 ACCTCCGTAGATTGTAATATGTACATCTGCGGAGATTCTACTGAATGTGCTAATT 3410 3411 TGCTTCTCCAATATGGTAGCTTTTGCACACAACTAAATCGTGCACTCTCAGGTAT 3465 3466 TGCTGCTGAACAGGATCGCAACACACGTGAAGTGTTCGCTCAAGTCAAACAAATG 3520 3521 TACAAAACCCCAACTTTGAAATATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTAC 3575 3576 CTGACCCTCTAAAGCCAACTAAGAGGTCTTTTATTGAGGACTTGCTCTTTAATAA 3630 3631 GGTGACACTCGCTGATGCTGGCTTCATGAAGCAATATGGCGAATGCCTAGGTGAT 3685 3686 ATTAATGCTAGAGATCTCATTTGTGCGCAGAAGTTCAATGGACTTACAGTGTTGC 3740 3741 CACCTCTGCTCACTGATGATATGATTGCTGCCTACACTGCTGCTCTAGTTAGTGG 3795 3796 TACTGCCACTGCTGGATGGACATTTGGTGCTGGCGCTGCTCTTCAAATACCTTTT 3850 3851 GCTATGCAAATGGCATATAGGTTCAATGGCATTGGAGTTACCCAAAATGTTCTCT 3905 3906 ATGAGAACCAAAAACAAATCGCCAACCAATTTAACAAGGCGATTAGTCAAATTCA 3960 3961 AGAATCACTTACAACAACATCAACTGCATTGGGCAAGCTGCAAGACGTTGTTAAC 4015 4016 CAGAATGCTCAAGCATTAAACACACTTGTTAAACAACTTAGCTCTAATTTTGGTG 4070 4071 CAATTTCAAGTGTGCTAAATGATATCCTTTCGCGACTTGATAAAGTCGAGGCGGA 4125 4126 GGTACAAATTGACAGGTTAATTACAGGCAGACTTCAAAGCCTTCAAACCTATGTA 4180 4181 ACACAACAACTAATCAGGGCTGCTGAAATCAGGGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTA 4235 4236 CTAAAATGTCTGAGTGTGTTCTTGGACAATCAAAAAGAGTTGACTTTTGTGGAAA 4290 4291 GGGCTACCACCTTATGTCCTTCCCACAAGCAGCCCCGCATGGTGTTGTCTTCCTA 4345 4346 CATGTCACGTATGTGCCATCCCAGGAGAGGAACTTCACCACAGCGCCAGCAATTT 4400 4401 GTCATGAAGGCAAAGCATACTTCCCTCGTGAAGGTGTTTTCGTGTTTAATGGCAC 4455 4456 TTCTTGGTTTATTACACAGAGGAACTTCTTTTCTCCACAAATAATTACTACAGAC 4510 4511 AATACATTTGTCTCAGGAAATTGTGATGTCGTTATTGGCATCATTAACAACACAG 4565 4566 TTTATGATCCTCTGCAACCTGAGCTCGACTCATTCAAAGAAGAGCTGGACAAGTA 4620 4621 CTTCAAAAATCATACATCACCAGATGTTGATCTTGGCGACATTTCAGGCATTAAC 4675 4676 GCTTCTGTCGTCAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTCGCTAAAA 4730 4731 ATTTAAATGAATCACTCATTGACCTTCAAGAATTGGGAAAATATGAGCAATATAT 4785 4786 TAAATGGCCTTGGTATGTTTGGCTCGGCTTCATTGCTGGACTAATTGCCATCGTC 4840 4841 ATGGTTACAATCTTGCTTTGTTGCATGACTAGTTGTTGCAGTTGCCTCAAGGGTG 4895 4896 CATGCTCTTGTGGTTCTTGCTGCAAGTTTGATGAGGATGACTCTGAGCCAGTTCT 4950 4951 CAAGGGTGTCAAATTACATTACACATAATATTATATTTTTTATCTAAAAAACTAA 5005 5006 AAATAAACATTGATTAAATTTTAATATAATACTTAAAAATGGATGTTGTGTCGTT 5060 5061 AGATAAACCGTTTATGTATTTTGAGGAAATTGATAATGAGTTAGATTACGAACCA 5115 5116 GAAAGTGCAAATGAGGTCGCAAAAAAACTACCGTATCAAGGACAGTTAAAACTAT 5170 5171 TACTAGGAGAATTATTTTTTCTTAGTAAGTTACAGCGACACGGTATATTAGATGG 5225 5226 TGCCACCGTAGTGTATATAGGATCGGCTCCTGGTACACATATACGTTATTTGAGA 5280 5281 GATCATTTCTATAATTTAGGAATGATTATCAAATGGATGCTAATTGACGGACGCC 5335 5336 ATCATGATCCTATTCTAAATGGATTGCGTGATGTGACTCTAGTGACTCGGTTCGT 5390 5391 TGATGAGGAATATCTACGATCCATCAAAAAACAACTGCATCCTTCTAAGATTATT 5445 5446 TTAATTTCTGATGTAAGATCCAAACGAGGAGGAAATGAACCTAGTACGGCGGATT 5500 5501 TACTAAGTAATTACGCTCTACAAAATGTCATGATTAGTATTTTAAACCCCGTGGC 5555 5556 ATCTAGTCTTAAATGGAGATGCCCGTTTCCAGATCAATGGATCAAGGACTTTTAT 5610 5611 ATCCCACACGGTAATAAAATGTTACAACCTTTTGCTCCTTCATATTCAGCTGAAA 5665 5666 TGAGATTATTAAGTATTTATACCGGTGAGAACATGAGACTGACTCGAGTTACCAA 5720 5721 ATTAGACGCTGTAAATTATGAAAAAAAGATGTACTACCTTAATAAGATCGTCCGT 5775 5776 AACAAAGTAGTTGTTAACTTTGATTATCCTAATCAGGAATATGACTATTTTCACA 5830 5831 TGTACTTTATGCTGAGGACCGTATACTGCAATAAAACATTTCCTACTACTAAAGC 5885 5886 AAAGGTACTATTTCTACAACAATCTATATTTCGTTTCTTAAATATTCCAACAACA 5940 5941 TCAACTGAAAAAGTTAGTCATGAACCAATACAACGTAA 5978
合成包含編碼SARS-CoV-2病毒S蛋白質之核酸的痘瘡病毒。SEQ ID NO: 44 1 ATTTACGGATTCACCAATAAAAATAAACTAGAGAAACTTAGTACTAATAAGGAAC 55 56 TAGAATCGTATAGTTCTAGCCCTCTTCAAGAACCCATTAGGTTAAATGATTTTCT 110 111 GGGACTATTGGAATGTGTTAAAAAGAATATTCCTCTAACAGATATTCCGACAAAG 165 166 GATTGATTACTATAAATGGAGAATGTTCCTAATGTATACTTTAATCCTGTGTTTA 220 221 TAGAGCCCACGTTTAAACATTCTTTATTAAGTGTTTATAAACACAGATTAATAGT 275 276 TTTATTTGAAGTATTCGTTGTATTCATTCTAATATATGTATTTTTTAGATCTGAA 330 331 TTAAATATGTTCTTCATGCCTAAACGAAAAATACCCGATCCTATTGATAGATTAC 385 386 GACGTGCTAATCTAGCGTGTGAAGACGATAAATTAATGATCTATGGATTACCATG 440 441 GATGACAACTCAAACATCTGCGTTATCAATAAATAGTAAACCGATAGTGTATAAA 495 496 GATTGTGCAAAGCTTTTGCGATCAATAAATGGATCACAACCAGTATCTCTTAACG 550 551 ATGTTCTTCGCAGATGATGATTCATTTTTTAAGTATTTGGCTAGTCAAGATGATG 605 606 AATCTTCATTATCTGATATATTGCAAATCACTCAATATCTAGACTTTCTGTTATT 660 661 ATTATTGATCCAATCAAAAAATAAATTAGAAGCCGTGGGTCATTGTTATGAATCT 715 716 CTTTCAGAGGAATACAGACAATTGACAAAATTCACAGACTCTCAAGATTTTAAAA 770 771 AACTGTTTAACAAGGTCCCTATTGTTACAGATGGAAGGGTCAAACTTAATAAAGG 825 826 ATATTTGTTCGACTTTGTGATTAGTTTGATGCGATTCAAAAAAGAATCAGCTCTA 880 881 GCTACCACCGCAATAGATCCTGTTAGATACATAGATCCTCGTCGCGATATCGCAT 935 936 TTTCTAACGTGATGGATATATTAAAGTCGAATAAAGTGAACAATAATTAATTCTT 990 991 TATTGTCATCTTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATATCCGGTAAAATTGAAA 1045 1046 AAATATACACTAATTAGCGTCTCGTTTCAGACGCTAGCTCGAGGTTGGGAGCTCT 1100 1101 CCGGATCCAAGCTTATCGATTTCGAACCCGGGGTACCGAATTCCTCGAGGTTGGG 1155 1156 AGCTCTCCGGATCCAAGCTTATCGATTTCGAACCCGGGGTACCGAATTCCTCGAG 1210 1211 ATGTTTATTTTCTTATTATTTCTTACTCTCACTAGTGGTAGTGACCTTGACCGGT 1265 1266 GCACCACTTTTGATGATGTTCAAGCTCCTAATTACACTCAACATACTTCATCTAT 1320 1321 GAGGGGGGTTTACTATCCTGATGAAATTTTTAGATCAGACACTCTTTATTTAACT 1375 1376 CAGGATTTATTTCTTCCATTTTATTCTAATGTTACAGGGTTTCATACTATTAATC 1430 1431 ATACGTTTGGCAACCCTGTCATACCTTTTAAGGATGGTATTTATTTTGCTGCCAC 1485 1486 AGAGAAATCAAATGTTGTCCGTGGTTGGGTTTTTGGTTCTACCATGAACAACAAG 1540 1541 TCACAGTCGGTGATTATTATTAACAATTCTACTAATGTTGTTATACGAGCATGTA 1595 1596 ACTTTGAATTGTGTGACAACCCTTTCTTTGCTGTTTCTAAACCCATGGGTACACA 1650 1651 GACACATACTATGATATTCGATAATGCATTTAATTGCACTTTCGAGTACATATCT 1705 1706 GATGCCTTTTCGCTTGATGTTTCAGAAAAGTCAGGTAATTTTAAACACTTACGAG 1760 1761 AGTTTGTGTTTAAAAATAAAGATGGGTTTCTCTATGTTTATAAGGGCTATCAACC 1815 1816 TATAGATGTAGTTCGTGATCTACCTTCTGGTTTTAACACTTTGAAACCTATTTTT 1870 1871 AAGTTGCCTCTTGGTATTAACATTACAAATTTTAGAGCCATTCTTACAGCCTTTT 1925 1926 CACCTGCTCAAGACATTTGGGGCACGTCAGCTGCAGCCTATTTTGTTGGCTATTT 1980 1981 AAAGCCAACTACATTTATGCTCAAGTATGATGAAAATGGTACAATCACAGATGCT 2035 2036 GTTGATTGTTCTCAAAATCCACTTGCTGAACTCAAATGCTCTGTTAAGAGCTTTG 2090 2091 AGATTGACAAAGGAATTTACCAGACCTCTAATTTCAGGGTTGTTCCCTCAGGAGA 2145 2146 TGTTGTGAGATTCCCTAATATTACAAACTTGTGTCCTTTTGGAGAGGTTTTTAAT 2200 2201 GCTACTAAATTCCCTTCTGTCTATGCATGGGAGAGAAAAAAAATTTCTAATTGTG 2255 2256 TTGCTGATTACTCTGTGCTCTACAACTCAACATTCTTTTCAACCTTTAAGTGCTA 2310 2311 TGGCGTTTCTGCCACTAAGTTGAATGATCTTTGCTTCTCCAATGTCTATGCAGAT 2365 2366 TCTTTTGTAGTCAAGGGAGATGATGTAAGACAAATAGCGCCAGGACAAACTGGTG 2420 2421 TTATTGCTGATTATAATTATAAATTGCCAGATGATTTCATGGGTTGTGTCCTTGC 2475 2476 TTGGAATACTAGGAACATTGATGCTACTTCAACTGGTAATCATAATTATAAATAT 2530 2531 AGGTATCTTAGACATGGCAAGCTTAGGCCCTTTGAGAGAGACATATCTAATGTGC 2585 2586 CTTTCTCCCCTGATGGCAAACCTTGCACCCCACCTGCTCTTAATTGTTATTGGCC 2640 2641 ATTAAATGATTATGGTTTTTACACCACTACTGGCATTGGCTACCAACCTTACAGA 2695 2696 GTTGTAGTACTTTCTTTTGAACTTTTAAATGCACCGGCCACGGTTTGTGGACCAA 2750 2751 AATTATCCACTGACCTTATTAAGAACCAGTGTGTCAATTTTAATTTTAATGGACT 2805 2806 CACTGGTACTGGTGTGTTAACTCCTTCTTCAAAGAGATTTCAACCATTTCAACAA 2860 2861 TTTGGCCGTGATGTTTCTGATTTCACTGATTCCGTTCGAGATCCTAAAACATCTG 2915 2916 AAATATTAGACATTTCACCTTGCTCTTTTGGGGGTGTAAGTGTAATTACACCTGG 2970 2971 AACAAATGCTTCATCTGAAGTTGCTGTTCTATATCAAGATGTTAACTGCACTGAT 3025 3026 GTTTCTACAGCAATTCATGCAGATCAACTCACACCAGCTTGGCGCATATATTCTA 3080 3081 CTGGAAACAATGTATTCCAGACTCAAGCAGGCTGTCTTATAGGAGCTGAGCATGT 3135 3136 CGACACTTCTTATGAGTGCGACATTCCTATTGGAGCTGGCATTTGTGCTAGTTAC 3190 3191 CATACAGTTTCTTTATTACGTAGTACTAGCCAAAAATCTATTGTGGCTTATACTA 3245 3246 TGTCTTTAGGTGCTGATAGTTCAATTGCTTACTCTAATAACACCATTGCTATACC 3300 3301 TACTAACTTTTCAATTAGCATTACTACAGAAGTAATGCCTGTTTCTATGGCTAAA 3355 3356 ACCTCCGTAGATTGTAATATGTACATCTGCGGAGATTCTACTGAATGTGCTAATT 3410 3411 TGCTTCTCCAATATGGTAGCTTTTGCACACAACTAAATCGTGCACTCTCAGGTAT 3465 3466 TGCTGCTGAACAGGATCGCAACACACGTGAAGTGTTCGCTCAAGTCAAACAAATG 3520 3521 TACAAAACCCCAACTTTGAAATATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTAC 3575 3576 CTGACCCTCTAAAGCCAACTAAGAGGTCTTTTATTGAGGACTTGCTCTTTAATAA 3630 3631 GGTGACACTCGCTGATGCTGGCTTCATGAAGCAATATGGCGAATGCCTAGGTGAT 3685 3686 ATTAATGCTAGAGATCTCATTTGTGCGCAGAAGTTCAATGGACTTACAGTGTTGC 3740 3741 CACCTCTGCTCACTGATGATATGATTGCTGCCTACACTGCTGCTCTAGTTAGTGG 3795 3796 TACTGCCACTGCTGGATGGACATTTGGTGCTGGCGCTGCTCTTCAAATACCTTTT 3850 3851 GCTATGCAAATGGCATATAGGTTCAATGGCATTGGAGTTACCCAAAATGTTCTCT 3905 3906 ATGAGAACCAAAAACAAATCGCCAACCAATTTAACAAGGCGATTAGTCAAATTCA 3960 3961 AGAATCACTTACAACAACATCAACTGCATTGGGCAAGCTGCAAGACGTTGTTAAC 4015 4016 CAGAATGCTCAAGCATTAAACACACTTGTTAAACAACTTAGCTCTAATTTTGGTG 4070 4071 CAATTTCAAGTGTGCTAAATGATATCCTTTCGCGACTTGATAAAGTCGAGGCGGA 4125 4126 GGTACAAATTGACAGGTTAATTACAGGCAGACTTCAAAGCCTTCAAACCTATGTA 4180 4181 ACACAACAACTAATCAGGGCTGCTGAAATCAGGGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTA 4235 4236 CTAAAATGTCTGAGTGTGTTCTTGGACAATCAAAAAGAGTTGACTTTTGTGGAAA 4290 4291 GGGCTACCACCTTATGTCCTTCCCACAAGCAGCCCCGCATGGTGTTGTCTTCCTA 4345 4346 CATGTCACGTATGTGCCATCCCAGGAGAGGAACTTCACCACAGCGCCAGCAATTT 4400 4401 GTCATGAAGGCAAAGCATACTTCCCTCGTGAAGGTGTTTTCGTGTTTAATGGCAC 4455 4456 TTCTTGGTTTATTACACAGAGGAACTTCTTTTCTCCACAAATAATTACTACAGAC 4510 4511 AATACATTTGTCTCAGGAAATTGTGATGTCGTTATTGGCATCATTAACAACACAG 4565 4566 TTTATGATCCTCTGCAACCTGAGCTCGACTCATTCAAAGAAGAGCTGGACAAGTA 4620 4621 CTTCAAAAATCATACATCACCAGATGTTGATCTTGGCGACATTTCAGGCATTAAC 4675 4676 GCTTCTGTCGTCAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTCGCTAAAA 4730 4731 ATTTAAATGAATCACTCATTGACCTTCAAGAATTGGGAAAATATGAGCAATATAT 4785 4786 TAAATGGCCTTGGTATGTTTGGCTCGGCTTCATTGCTGGACTAATTGCCATCGTC 4840 4841 ATGGTTACAATCTTGCTTTGTTGCATGACTAGTTGTTGCAGTTGCCTCAAGGGTG 4895 4896 CATGCTCTTGTGGTTCTTGCTGCAAGTTTGATGAGGATGACTCTGAGCCAGTTCT 4950 4951 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AACAAAGTAGTTGTTAACTTTGATTATCCTAATCAGGAATATGACTATTTTCACA 5830 5831 TGTACTTTATGCTGAGGACCGTGTACTGCAATAAAACATTTCCTACTACTAAAGC 5885 5886 AAAGGTACTATTTCTACAACAATCTATATTTCGTTTCTTAAATATTCCAACAACA 5940 5941 TCAACTGAAAAAGTTAGTCATGAACCAATACAACGTAA 5978   
編碼S蛋白質(21562-25383) Gene Bank寄存編號MN988668或(21579-25400) Gene Bank寄存編號NC_045512之核酸。SEQ ID NO: 45 21562 atgtttgtt tttcttgttt tattgccact agtctctagt     21601 cagtgtgtta atcttacaac cagaactcaa ttaccccctg catacactaa ttctttcaca     21661 cgtggtgttt attaccctga caaagttttc agatcctcag ttttacattc aactcaggac     21721 ttgttcttac ctttcttttc caatgttact tggttccatg ctatacatgt ctctgggacc     21781 aatggtacta agaggtttga taaccctgtc ctaccattta atgatggtgt ttattttgct     21841 tccactgaga agtctaacat aataagaggc tggatttttg gtactacttt agattcgaag     21901 acccagtccc tacttattgt taataacgct actaatgttg ttattaaagt ctgtgaattt     21961 caattttgta atgatccatt tttgggtgtt tattaccaca aaaacaacaa aagttggatg     22021 gaaagtgagt tcagagttta ttctagtgcg aataattgca cttttgaata tgtctctcag     22081 ccttttctta tggaccttga aggaaaacag ggtaatttca aaaatcttag ggaatttgtg     22141 tttaagaata ttgatggtta ttttaaaata tattctaagc acacgcctat taatttagtg     22201 cgtgatctcc ctcagggttt ttcggcttta gaaccattgg tagatttgcc aataggtatt     22261 aacatcacta ggtttcaaac tttacttgct ttacatagaa gttatttgac tcctggtgat     22321 tcttcttcag gttggacagc tggtgctgca gcttattatg tgggttatct tcaacctagg     22381 acttttctat taaaatataa tgaaaatgga accattacag atgctgtaga ctgtgcactt     22441 gaccctctct cagaaacaaa gtgtacgttg aaatccttca ctgtagaaaa aggaatctat     22501 caaacttcta actttagagt ccaaccaaca gaatctattg ttagatttcc taatattaca     22561 aacttgtgcc cttttggtga agtttttaac gccaccagat ttgcatctgt ttatgcttgg     22621 aacaggaaga gaatcagcaa ctgtgttgct gattattctg tcctatataa ttccgcatca     22681 ttttccactt ttaagtgtta tggagtgtct cctactaaat taaatgatct ctgctttact     22741 aatgtctatg cagattcatt tgtaattaga ggtgatgaag tcagacaaat cgctccaggg     22801 caaactggaa agattgctga ttataattat aaattaccag atgattttac aggctgcgtt     22861 atagcttgga attctaacaa tcttgattct aaggttggtg gtaattataa ttacctgtat     22921 agattgttta ggaagtctaa tctcaaacct tttgagagag atatttcaac tgaaatctat     22981 caggccggta gcacaccttg taatggtgtt gaaggtttta attgttactt tcctttacaa     23041 tcatatggtt tccaacccac taatggtgtt ggttaccaac catacagagt agtagtactt     23101 tcttttgaac ttctacatgc accagcaact gtttgtggac ctaaaaagtc tactaatttg     23161 gttaaaaaca aatgtgtcaa tttcaacttc aatggtttaa caggcacagg tgttcttact     23221 gagtctaaca aaaagtttct gcctttccaa caatttggca gagacattgc tgacactact     23281 gatgctgtcc gtgatccaca gacacttgag attcttgaca ttacaccatg ttcttttggt     23341 ggtgtcagtg ttataacacc aggaacaaat acttctaacc aggttgctgt tctttatcag     23401 gatgttaact gcacagaagt ccctgttgct attcatgcag atcaacttac tcctacttgg     23461 cgtgtttatt ctacaggttc taatgttttt caaacacgtg caggctgttt aataggggct     23521 gaacatgtca acaactcata tgagtgtgac atacccattg gtgcaggtat atgcgctagt     23581 tatcagactc agactaattc tcctcggcgg gcacgtagtg tagctagtca atccatcatt     23641 gcctacacta tgtcacttgg tgcagaaaat tcagttgctt actctaataa ctctattgcc     23701 atacccacaa attttactat tagtgttacc acagaaattc taccagtgtc tatgaccaag     23761 acatcagtag attgtacaat gtacatttgt ggtgattcaa ctgaatgcag caatcttttg     23821 ttgcaatatg gcagtttttg tacacaatta aaccgtgctt taactggaat agctgttgaa     23881 caagacaaaa acacccaaga agtttttgca caagtcaaac aaatttacaa aacaccacca     23941 attaaagatt ttggtggttt taatttttca caaatattac cagatccatc aaaaccaagc     24001 aagaggtcat ttattgaaga tctacttttc aacaaagtga cacttgcaga tgctggcttc     24061 atcaaacaat atggtgattg ccttggtgat attgctgcta gagacctcat ttgtgcacaa     24121 aagtttaacg gccttactgt tttgccacct ttgctcacag atgaaatgat tgctcaatac     24181 acttctgcac tgttagcggg tacaatcact tctggttgga cctttggtgc aggtgctgca     24241 ttacaaatac catttgctat gcaaatggct tataggttta atggtattgg agttacacag     24301 aatgttctct atgagaacca aaaattgatt gccaaccaat ttaatagtgc tattggcaaa     24361 attcaagact cactttcttc cacagcaagt gcacttggaa aacttcaaga tgtggtcaac     24421 caaaatgcac aagctttaaa cacgcttgtt aaacaactta gctccaattt tggtgcaatt     24481 tcaagtgttt taaatgatat cctttcacgt cttgacaaag ttgaggctga agtgcaaatt     24541 gataggttga tcacaggcag acttcaaagt ttgcagacat atgtgactca acaattaatt     24601 agagctgcag aaatcagagc ttctgctaat cttgctgcta ctaaaatgtc agagtgtgta     24661 cttggacaat caaaaagagt tgatttttgt ggaaagggct atcatcttat gtccttccct     24721 cagtcagcac ctcatggtgt agtcttcttg catgtgactt atgtccctgc acaagaaaag     24781 aacttcacaa ctgctcctgc catttgtcat gatggaaaag cacactttcc tcgtgaaggt     24841 gtctttgttt caaatggcac acactggttt gtaacacaaa ggaattttta tgaaccacaa     24901 atcattacta cagacaacac atttgtgtct ggtaactgtg atgttgtaat aggaattgtc     24961 aacaacacag tttatgatcc tttgcaacct gaattagact cattcaagga ggagttagat     25021 aaatatttta agaatcatac atcaccagat gttgatttag gtgacatctc tggcattaat     25081 gcttcagttg taaacattca aaaagaaatt gaccgcctca atgaggttgc caagaattta     25141 aatgaatctc tcatcgatct ccaagaactt ggaaagtatg agcagtatat aaaatggcca     25201 tggtacattt ggctaggttt tatagctggc ttgattgcca tagtaatggt gacaattatg     25261 ctttgctgta tgaccagttg ctgtagttgt ctcaagggct gttgttcttg tggatcctgc     25321 tgcaaatttg atgaagacga ctctgagcca gtgctcaaag gagtcaaatt acattacaca     25381 taa
SARS-CoV2分離物2019-nCoV WHU01、完整基因體之核苷酸序列。GenBank寄存編號MN988668.1。SEQ ID NO: 46 1 ttaaaggttt ataccttccc aggtaacaaa ccaaccaact ttcgatctct tgtagatctg        61 ttctctaaac gaactttaaa atctgtgtgg ctgtcactcg gctgcatgct tagtgcactc       121 acgcagtata attaataact aattactgtc gttgacagga cacgagtaac tcgtctatct       181 tctgcaggct gcttacggtt tcgtccgtgt tgcagccgat catcagcaca tctaggtttc       241 gtccgggtgt gaccgaaagg taagatggag agccttgtcc ctggtttcaa cgagaaaaca       301 cacgtccaac tcagtttgcc tgttttacag gttcgcgacg tgctcgtacg tggctttgga       361 gactccgtgg aggaggtctt atcagaggca cgtcaacatc ttaaagatgg cacttgtggc       421 ttagtagaag ttgaaaaagg cgttttgcct caacttgaac agccctatgt gttcatcaaa       481 cgttcggatg ctcgaactgc acctcatggt catgttatgg ttgagctggt agcagaactc       541 gaaggcattc agtacggtcg tagtggtgag acacttggtg tccttgtccc tcatgtgggc       601 gaaataccag tggcttaccg caaggttctt cttcgtaaga acggtaataa aggagctggt       661 ggccatagtt acggcgccga tctaaagtca tttgacttag gcgacgagct tggcactgat       721 ccttatgaag 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aacttagaca acctgagagc taataacact      7861 aaaggttcat tgcctattaa tgttatagtt tttgatggta aatcaaaatg tgaagaatca      7921 tctgcaaaat cagcgtctgt ttactacagt cagcttatgt gtcaacctat actgttacta      7981 gatcaggcat tagtgtctga tgttggtgat agtgcggaag ttgcagttaa aatgtttgat      8041 gcttacgtta atacgttttc atcaactttt aacgtaccaa tggaaaaact caaaacacta      8101 gttgcaactg cagaagctga acttgcaaag aatgtgtcct tagacaatgt cttatctact      8161 tttatttcag cagctcggca agggtttgtt gattcagatg tagaaactaa agatgttgtt      8221 gaatgtctta aattgtcaca tcaatctgac atagaagtta ctggcgatag ttgtaataac      8281 tatatgctca cctataacaa agttgaaaac atgacacccc gtgaccttgg tgcttgtatt      8341 gactgtagtg cgcgtcatat taatgcgcag gtagcaaaaa gtcacaacat tgctttgata      8401 tggaacgtta aagatttcat gtcattgtct gaacaactac gaaaacaaat acgtagtgct      8461 gctaaaaaga ataacttacc ttttaagttg acatgtgcaa ctactagaca agttgttaat      8521 gttgtaacaa caaagatagc acttaagggt ggtaaaattg ttaataattg gttgaagcag      8581 ttaattaaag ttacacttgt gttccttttt gttgctgcta 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aaaagaacaa tcaagggtac acaccactgg ttgttactca caattttgac ttcactttta     11041 gttttagtcc agagtactca atggtctttg ttcttttttt tgtatgaaaa tgccttttta     11101 ccttttgcta tgggtattat tgctatgtct gcttttgcaa tgatgtttgt caaacataag     11161 catgcatttc tctgtttgtt tttgttacct tctcttgcca ctgtagctta ttttaatatg     11221 gtctatatgc ctgctagttg ggtgatgcgt attatgacat ggttggatat ggttgatact     11281 agtttgtctg gttttaagct aaaagactgt gttatgtatg catcagctgt agtgttacta     11341 atccttatga cagcaagaac tgtgtatgat gatggtgcta ggagagtgtg gacacttatg     11401 aatgtcttga cactcgttta taaagtttat tatggtaatg ctttagatca agccatttcc     11461 atgtgggctc ttataatctc tgttacttct aactactcag gtgtagttac aactgtcatg     11521 tttttggcca gaggtattgt ttttatgtgt gttgagtatt gccctatttt cttcataact     11581 ggtaatacac ttcagtgtat aatgctagtt tattgtttct taggctattt ttgtacttgt     11641 tactttggcc tcttttgttt actcaaccgc tactttagac tgactcttgg tgtttatgat     11701 tacttagttt ctacacagga gtttagatat atgaattcac agggactact cccacccaag     11761 aatagcatag 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acaggttgta gatgcagata gtaaaattgt tcaacttagt     12601 gaaattagta tggacaattc acctaattta gcatggcctc ttattgtaac agctttaagg     12661 gccaattctg ctgtcaaatt acagaataat gagcttagtc ctgttgcact acgacagatg     12721 tcttgtgctg ccggtactac acaaactgct tgcactgatg acaatgcgtt agcttactac     12781 aacacaacaa agggaggtag gtttgtactt gcactgttat ccgatttaca ggatttgaaa     12841 tgggctagat tccctaagag tgatggaact ggtactatct atacagaact ggaaccacct     12901 tgtaggtttg ttacagacac acctaaaggt cctaaagtga agtatttata ctttattaaa     12961 ggattaaaca acctaaatag aggtatggta cttggtagtt tagctgccac agtacgtcta     13021 caagctggta atgcaacaga agtgcctgcc aattcaactg tattatcttt ctgtgctttt     13081 gctgtagatg ctgctaaagc ttacaaagat tatctagcta gtgggggaca accaatcact     13141 aattgtgtta agatgttgtg tacacacact ggtactggtc aggcaataac agttacaccg     13201 gaagccaata tggatcaaga atcctttggt ggtgcatcgt gttgtctgta ctgccgttgc     13261 cacatagatc atccaaatcc taaaggattt tgtgacttaa aaggtaagta tgtacaaata     13321 cctacaactt gtgctaatga ccctgtgggt tttacactta aaaacacagt ctgtaccgtc     13381 tgcggtatgt ggaaaggtta tggctgtagt tgtgatcaac tccgcgaacc catgcttcag     13441 tcagctgatg cacaatcgtt tttaaacggg tttgcggtgt aagtgcagcc cgtcttacac     13501 cgtgcggcac aggcactagt actgatgtcg tatacagggc ttttgacatc tacaatgata     13561 aagtagctgg ttttgctaaa ttcctaaaaa ctaattgttg tcgcttccaa gaaaaggacg     13621 aagatgacaa tttaattgat tcttactttg tagttaagag acacactttc tctaactacc     13681 aacatgaaga aacaatttat aatttactta aggattgtcc agctgttgct aaacatgact     13741 tctttaagtt tagaatagac ggtgacatgg taccacatat atcacgtcaa cgtcttacta     13801 aatacacaat ggcagacctc gtctatgctt taaggcattt tgatgaaggt aattgtgaca     13861 cattaaaaga aatacttgtc acatacaatt gttgtgatga tgattatttc aataaaaagg     13921 actggtatga ttttgtagaa aacccagata tattacgcgt atacgccaac ttaggtgaac     13981 gtgtacgcca agctttgtta aaaacagtac aattctgtga tgccatgcga aatgctggta     14041 ttgttggtgt actgacatta gataatcaag atctcaatgg taactggtat gatttcggtg     14101 atttcataca aaccacgcca ggtagtggag ttcctgttgt 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    15721 atgctgttgt gtgtttcaat agcacttatg catctcaagg tctagtggct agcataaaga     15781 actttaagtc agttctttat tatcaaaaca atgtttttat gtctgaagca aaatgttgga     15841 ctgagactga ccttactaaa ggacctcatg aattttgctc tcaacataca atgctagtta     15901 aacagggtga tgattatgtg taccttcctt acccagatcc atcaagaatc ctaggggccg     15961 gctgttttgt agatgatatc gtaaaaacag atggtacact tatgattgaa cggttcgtgt     16021 ctttagctat agatgcttac ccacttacta aacatcctaa tcaggagtat gctgatgtct     16081 ttcatttgta cttacaatac ataagaaagc tacatgatga gttaacagga cacatgttag     16141 acatgtattc tgttatgctt actaatgata acacttcaag gtattgggaa cctgagtttt     16201 atgaggctat gtacacaccg catacagtct tacaggctgt tggggcttgt gttctttgca     16261 attcacagac ttcattaaga tgtggtgctt gcatacgtag accattctta tgttgtaaat     16321 gctgttacga ccatgtcata tcaacatcac ataaattagt cttgtctgtt aatccgtatg     16381 tttgcaatgc tccaggttgt gatgtcacag atgtgactca actttactta ggaggtatga     16441 gctattattg taaatcacat aaaccaccca ttagttttcc attgtgtgct aatggacaag     16501 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ggtgtctagc tgtccacgag tgctttgtta     18901 agcgtgttga ctggactatt gaatatccta taattggtga tgaactgaag attaatgcgg     18961 cttgtagaaa ggttcaacac atggttgtta aagctgcatt attagcagac aaattcccag     19021 ttcttcacga cattggtaac cctaaagcta ttaagtgtgt acctcaagct gatgtagaat     19081 ggaagttcta tgatgcacag ccttgtagtg acaaagctta taaaatagaa gaattattct     19141 attcttatgc cacacattct gacaaattca cagatggtgt atgcctattt tggaattgca     19201 atgtcgatag atatcctgct aattccattg tttgtagatt tgacactaga gtgctatcta     19261 accttaactt gcctggttgt gatggtggca gtttgtatgt aaataaacat gcattccaca     19321 caccagcttt tgataaaagt gcttttgtta atttaaaaca attaccattt ttctattact     19381 ctgacagtcc atgtgagtct catggaaaac aagtagtgtc agatatagat tatgtaccac     19441 taaagtctgc tacgtgtata acacgttgca atttaggtgg tgctgtctgt agacatcatg     19501 ctaatgagta cagattgtat ctcgatgctt ataacatgat gatctcagct ggctttagct     19561 tgtgggttta caaacaattt gatacttata acctctggaa cacttttaca agacttcaga     19621 gtttagaaaa tgtggctttt aatgttgtaa ataagggaca ctttgatgga caacagggtg     19681 aagtaccagt ttctatcatt aataacactg tttacacaaa agttgatggt gttgatgtag     19741 aattgtttga aaataaaaca acattacctg ttaatgtagc atttgagctt tgggctaagc     19801 gcaacattaa accagtacca gaggtgaaaa tactcaataa tttgggtgtg gacattgctg     19861 ctaatactgt gatctgggac tacaaaagag atgctccagc acatatatct actattggtg     19921 tttgttctat gactgacata gccaagaaac caactgaaac gatttgtgca ccactcactg     19981 tcttttttga tggtagagtt gatggtcaag tagacttatt tagaaatgcc cgtaatggtg     20041 ttcttattac agaaggtagt gttaaaggtt tacaaccatc tgtaggtccc aaacaagcta     20101 gtcttaatgg agtcacatta attggagaag ccgtaaaaac acagttcaat tattataaga     20161 aagttgatgg tgttgtccaa caattacctg aaacttactt tactcagagt agaaatttac     20221 aagaatttaa acccaggagt caaatggaaa ttgatttctt agaattagct atggatgaat     20281 tcattgaacg gtataaatta gaaggctatg ccttcgaaca tatcgtttat ggagatttta     20341 gtcatagtca gttaggtggt ttacatctac tgattggact agctaaacgt tttaaggaat     20401 caccttttga attagaagat tttattccta tggacagtac agttaaaaac tatttcataa     20461 cagatgcgca aacaggttca tctaagtgtg tgtgttctgt tattgattta ttacttgatg     20521 attttgttga aataataaaa tcccaagatt tatctgtagt ttctaaggtt gtcaaagtga     20581 ctattgacta tacagaaatt tcatttatgc tttggtgtaa agatggccat gtagaaacat     20641 tttacccaaa attacaatct agtcaagcgt ggcaaccggg tgttgctatg cctaatcttt     20701 acaaaatgca aagaatgcta ttagaaaagt gtgaccttca aaattatggt gatagtgcaa     20761 cattacctaa aggcataatg atgaatgtcg caaaatatac tcaactgtgt caatatttaa     20821 acacattaac attagctgta ccctataata tgagagttat acattttggt gctggttctg     20881 ataaaggagt tgcaccaggt acagctgttt taagacagtg gttgcctacg ggtacgctgc     20941 ttgtcgattc agatcttaat gactttgtct ctgatgcaga ttcaactttg attggtgatt     21001 gtgcaactgt acatacagct aataaatggg atctcattat tagtgatatg tacgacccta     21061 agactaaaaa tgttacaaaa gaaaatgact ctaaagaggg ttttttcact tacatttgtg     21121 ggtttataca acaaaagcta gctcttggag gttccgtggc tataaagata acagaacatt     21181 cttggaatgc tgatctttat aagctcatgg gacacttcgc atggtggaca gcctttgtta     21241 ctaatgtgaa tgcgtcatca tctgaagcat ttttaattgg atgtaattat cttggcaaac     21301 cacgcgaaca aatagatggt tatgtcatgc atgcaaatta catattttgg aggaatacaa     21361 atccaattca gttgtcttcc tattctttat ttgacatgag taaatttccc cttaaattaa     21421 ggggtactgc tgttatgtct ttaaaagaag gtcaaatcaa tgatatgatt ttatctcttc     21481 ttagtaaagg tagacttata attagagaaa acaacagagt tgttatttct agtgatgttc     21541 ttgttaacaa ctaaacgaac aatgtttgtt tttcttgttt tattgccact agtctctagt     21601 cagtgtgtta atcttacaac cagaactcaa ttaccccctg catacactaa ttctttcaca     21661 cgtggtgttt attaccctga caaagttttc agatcctcag ttttacattc aactcaggac     21721 ttgttcttac ctttcttttc caatgttact tggttccatg ctatacatgt ctctgggacc     21781 aatggtacta agaggtttga taaccctgtc ctaccattta atgatggtgt ttattttgct     21841 tccactgaga agtctaacat aataagaggc tggatttttg gtactacttt agattcgaag     21901 acccagtccc tacttattgt taataacgct actaatgttg ttattaaagt ctgtgaattt     21961 caattttgta atgatccatt tttgggtgtt tattaccaca aaaacaacaa aagttggatg     22021 gaaagtgagt tcagagttta ttctagtgcg aataattgca cttttgaata tgtctctcag     22081 ccttttctta tggaccttga aggaaaacag ggtaatttca aaaatcttag ggaatttgtg     22141 tttaagaata ttgatggtta ttttaaaata tattctaagc acacgcctat taatttagtg     22201 cgtgatctcc ctcagggttt ttcggcttta gaaccattgg tagatttgcc aataggtatt     22261 aacatcacta ggtttcaaac tttacttgct ttacatagaa gttatttgac tcctggtgat     22321 tcttcttcag gttggacagc tggtgctgca gcttattatg tgggttatct tcaacctagg     22381 acttttctat taaaatataa tgaaaatgga accattacag atgctgtaga ctgtgcactt     22441 gaccctctct cagaaacaaa gtgtacgttg aaatccttca ctgtagaaaa aggaatctat     22501 caaacttcta actttagagt ccaaccaaca gaatctattg ttagatttcc taatattaca     22561 aacttgtgcc cttttggtga agtttttaac gccaccagat ttgcatctgt ttatgcttgg     22621 aacaggaaga gaatcagcaa ctgtgttgct gattattctg tcctatataa ttccgcatca     22681 ttttccactt ttaagtgtta tggagtgtct cctactaaat taaatgatct ctgctttact     22741 aatgtctatg cagattcatt tgtaattaga ggtgatgaag tcagacaaat cgctccaggg     22801 caaactggaa agattgctga ttataattat aaattaccag atgattttac aggctgcgtt     22861 atagcttgga attctaacaa tcttgattct aaggttggtg gtaattataa ttacctgtat     22921 agattgttta ggaagtctaa tctcaaacct tttgagagag atatttcaac tgaaatctat     22981 caggccggta gcacaccttg taatggtgtt gaaggtttta attgttactt tcctttacaa     23041 tcatatggtt tccaacccac taatggtgtt ggttaccaac catacagagt agtagtactt     23101 tcttttgaac ttctacatgc accagcaact gtttgtggac ctaaaaagtc tactaatttg     23161 gttaaaaaca aatgtgtcaa tttcaacttc aatggtttaa caggcacagg tgttcttact     23221 gagtctaaca aaaagtttct gcctttccaa caatttggca gagacattgc tgacactact     23281 gatgctgtcc gtgatccaca gacacttgag attcttgaca ttacaccatg ttcttttggt     23341 ggtgtcagtg ttataacacc aggaacaaat acttctaacc aggttgctgt tctttatcag     23401 gatgttaact gcacagaagt ccctgttgct attcatgcag atcaacttac tcctacttgg     23461 cgtgtttatt ctacaggttc taatgttttt caaacacgtg caggctgttt aataggggct     23521 gaacatgtca acaactcata tgagtgtgac atacccattg gtgcaggtat atgcgctagt     23581 tatcagactc agactaattc tcctcggcgg gcacgtagtg tagctagtca atccatcatt     23641 gcctacacta tgtcacttgg tgcagaaaat tcagttgctt actctaataa ctctattgcc     23701 atacccacaa attttactat tagtgttacc acagaaattc taccagtgtc tatgaccaag     23761 acatcagtag attgtacaat gtacatttgt ggtgattcaa ctgaatgcag caatcttttg     23821 ttgcaatatg gcagtttttg tacacaatta aaccgtgctt taactggaat agctgttgaa     23881 caagacaaaa acacccaaga agtttttgca caagtcaaac aaatttacaa aacaccacca     23941 attaaagatt ttggtggttt taatttttca caaatattac cagatccatc aaaaccaagc     24001 aagaggtcat ttattgaaga tctacttttc aacaaagtga cacttgcaga tgctggcttc     24061 atcaaacaat atggtgattg ccttggtgat attgctgcta gagacctcat ttgtgcacaa     24121 aagtttaacg gccttactgt tttgccacct ttgctcacag atgaaatgat tgctcaatac     24181 acttctgcac tgttagcggg tacaatcact tctggttgga cctttggtgc aggtgctgca     24241 ttacaaatac catttgctat gcaaatggct tataggttta atggtattgg agttacacag     24301 aatgttctct atgagaacca aaaattgatt gccaaccaat ttaatagtgc tattggcaaa     24361 attcaagact cactttcttc cacagcaagt 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agcagtatat aaaatggcca     25201 tggtacattt ggctaggttt tatagctggc ttgattgcca tagtaatggt gacaattatg     25261 ctttgctgta tgaccagttg ctgtagttgt ctcaagggct gttgttcttg tggatcctgc     25321 tgcaaatttg atgaagacga ctctgagcca gtgctcaaag gagtcaaatt acattacaca     25381 taaacgaact tatggatttg tttatgagaa tcttcacaat tggaactgta actttgaagc     25441 aaggtgaaat caaggatgct actccttcag attttgttcg cgctactgca acgataccga     25501 tacaagcctc actccctttc ggatggctta ttgttggcgt tgcacttctt gctgtttttc     25561 agagcgcttc caaaatcata accctcaaaa agagatggca actagcactc tccaagggtg     25621 ttcactttgt ttgcaacttg ctgttgttgt ttgtaacagt ttactcacac cttttgctcg     25681 ttgctgctgg ccttgaagcc ccttttctct atctttatgc tttagtctac ttcttgcaga     25741 gtataaactt tgtaagaata ataatgaggc tttggctttg ctggaaatgc cgttccaaaa     25801 acccattact ttatgatgcc aactattttc tttgctggca tactaattgt tacgactatt     25861 gtatacctta caatagtgta acttcttcaa ttgtcattac ttcaggtgat ggcacaacaa     25921 gtcctatttc tgaacatgac taccagattg gtggttatac tgaaaaatgg gaatctggag     25981 taaaagactg tgttgtatta cacagttact tcacttcaga ctattaccag ctgtactcaa     26041 ctcaattgag tacagacact ggtgttgaac atgttacctt cttcatctac aataaaattg     26101 ttgatgagcc tgaagaacat gtccaaattc acacaatcga cggttcatcc ggagttgtta     26161 atccagtaat ggaaccaatt tatgatgaac cgacgacgac tactagcgtg cctttgtaag     26221 cacaagctga tgagtacgaa cttatgtact cattcgtttc ggaagagaca ggtacgttaa     26281 tagttaatag cgtacttctt tttcttgctt tcgtggtatt cttgctagtt acactagcca     26341 tccttactgc gcttcgattg tgtgcgtact gctgcaatat tgttaacgtg agtcttgtaa     26401 aaccttcttt ttacgtttac tctcgtgtta aaaatctgaa ttcttctaga gttcctgatc     26461 ttctggtcta aacgaactaa atattatatt agtttttctg tttggaactt taattttagc     26521 catggcagat tccaacggta ctattaccgt tgaagagctt aaaaagctcc ttgaacaatg     26581 gaacctagta ataggtttcc tattccttac atggatttgt cttctacaat ttgcctatgc     26641 caacaggaat aggtttttgt atataattaa gttaattttc ctctggctgt tatggccagt     26701 aactttagct tgttttgtgc ttgctgctgt ttacagaata aattggatca ccggtggaat 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來自MN988668寄存編號之S蛋白質之胺基酸序列。SEQ ID NO: 47 1 MFVFLVLLPL VSSQCVNLTT RTQLPPAYTN SFTRGVYYPD KVFRSSVLHS TQDLFLPFFS NVTWFHAIHV SGTNGTKRFD       81 NPVLPFNDGV YFASTEKSNI IRGWIFGTTL DSKTQSLLIV NNATNVVIKV CEFQFCNDPF LGVYYHKNNK SWMESEFRVY      161 SSANNCTFEY VSQPFLMDLE GKQGNFKNLR EFVFKNIDGY FKIYSKHTPI NLVRDLPQGF SALEPLVDLP IGINITRFQT      241 LLALHRSYLT PGDSSSGWTA GAAAYYVGYL QPRTFLLKYN ENGTITDAVD CALDPLSETK CTLKSFTVEK GIYQTSNFRV      321 QPTESIVRFP NITNLCPFGE VFNATRFASV YAWNRKRISN CVADYSVLYN SASFSTFKCY GVSPTKLNDL CFTNVYADSF      401 VIRGDEVRQI APGQTGKIAD YNYKLPDDFT GCVIAWNSNN LDSKVGGNYN YLYRLFRKSN LKPFERDIST EIYQAGSTPC      481 NGVEGFNCYF PLQSYGFQPT NGVGYQPYRV VVLSFELLHA PATVCGPKKS TNLVKNKCVN FNFNGLTGTG VLTESNKKFL      561 PFQQFGRDIA DTTDAVRDPQ TLEILDITPC SFGGVSVITP GTNTSNQVAV LYQDVNCTEV PVAIHADQLT PTWRVYSTGS      641 NVFQTRAGCL IGAEHVNNSY ECDIPIGAGI CASYQTQTNS PRRARSVASQ SIIAYTMSLG AENSVAYSNN SIAIPTNFTI      721 SVTTEILPVS MTKTSVDCTM YICGDSTECS NLLLQYGSFC TQLNRALTGI AVEQDKNTQE VFAQVKQIYK TPPIKDFGGF      801 NFSQILPDPS KPSKRSFIED LLFNKVTLAD AGFIKQYGDC LGDIAARDLI CAQKFNGLTV LPPLLTDEMI AQYTSALLAG      881 TITSGWTFGA GAALQIPFAM QMAYRFNGIG VTQNVLYENQ KLIANQFNSA IGKIQDSLSS TASALGKLQD VVNQNAQALN      961 TLVKQLSSNF GAISSVLNDI LSRLDKVEAE VQIDRLITGR LQSLQTYVTQ QLIRAAEIRA SANLAATKMS ECVLGQSKRV     1041 DFCGKGYHLM SFPQSAPHGV VFLHVTYVPA QEKNFTTAPA ICHDGKAHFP REGVFVSNGT HWFVTQRNFY EPQIITTDNT     1121 FVSGNCDVVI GIVNNTVYDP LQPELDSFKE ELDKYFKNHT SPDVDLGDIS GINASVVNIQ KEIDRLNEVA KNLNESLIDL     1201 QELGKYEQYI KWPWYIWLGF IAGLIAIVMV TIMLCCMTSC CSCLKGCCSC GSCCKFDEDD SEPVLKGVKL HYT
來自MN988668寄存編號之M蛋白質之胺基酸序列。SEQ ID NO: 48 MADSNGTITVEELKKLLEQWNLVIGFLFLTWICLLQFAYANRNR FLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLVGLMWLSYFIASFRL FARTRSMWSFNPETNILLNVPLHGTILTRPLLESELVIGAVILRGHLRIAGHHLGRCD IKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIA LLVQ
來自MN988668寄存編號之N蛋白質之胺基酸序列。SEQ ID NO: 49 MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQG LPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMK DLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQ LPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAA LALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGR RGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYT GAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTV TLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA
SARS-CoV-2-Spike-co之核苷酸序列(經密碼子最佳化以用於VACV表現)。SEQ ID NO: 50 aGCGGCCGCaaaattgaaattttattttttttttttggaatataaataATGTTCGTGTTCCTAGTCCTACTACCGCTAGT CTCTTCCCAGTGTGTAAACCTAACAACGAGAACACAACTACCACCGGCGTACACCAATTCTTTCACAAGAGGAGTATATT ACCCGGACAAGGTGTTCAGATCCTCCGTACTACATTCTACCCAGGACCTATTCCTACCGTTCTTCTCTAACGTAACATGG TTCCACGCGATCCATGTCTCTGGAACAAACGGAACGAAGAGATTCGATAACCCGGTCTTGCCGTTCAACGATGGTGTATA CTTTGCGTCCACCGAGAAGTCCAACATCATCAGAGGATGGATCTTCGGAACCACCTTGGATTCTAAGACCCAGTCCTTGC TAATCGTCAACAACGCGACCAACGTCGTCATCAAAGTCTGCGAATTCCAGTTCTGTAACGACCCGTTTTTGGGAGTCTAC TACCACAAGAACAACAAGTCCTGGATGGAATCCGAGTTCAGAGTCTACTCTTCCGCGAACAACTGCACCTTCGAATATGT ATCTCAGCCGTTCCTAATGGACCTAGAGGGAAAGCAGGGAAACTTCAAGAACCTAAGAGAGTTCGTATTCAAGAACATCG ACGGATACTTCAAGATCTACTCCAAGCACACCCCGATCAACCTAGTTAGAGATCTACCGCAAGGATTCTCTGCGCTAGAA CCGTTAGTAGATTTGCCGATCGGAATCAACATCACCAGATTCCAGACACTACTAGCGCTACACAGATCTTACCTAACGCC GGGAGATTCTTCTTCTGGATGGACTGCTGGTGCTGCGGCTTATTATGTAGGATACCTACAGCCGAGAACCTTCCTATTGA AGTACAACGAAAACGGAACCATCACCGATGCCGTAGATTGTGCTCTAGATCCGCTATCCGAAACGAAGTGCACCCTAAAG TCTTTCACCGTCGAGAAGGGAATCTACCAGACCTCCAACTTTAGAGTACAGCCGACCGAATCCATCGTCAGATTTCCGAA CATCACGAACCTATGTCCGTTCGGAGAAGTGTTCAACGCGACAAGATTTGCGTCTGTCTATGCGTGGAACAGAAAAAGAA TCAGTAACTGCGTCGCGGACTACTCCGTCCTATACAACTCTGCCTCTTTCTCCACGTTCAAATGCTACGGTGTATCCCCG ACAAAGCTAAACGATCTATGCTTCACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTAATCAGAGGAGATGAAGTTAGACAGATTGC GCCGGGACAAACTGGAAAGATCGCGGATTATAACTACAAGCTACCGGACGACTTCACCGGATGTGTAATTGCGTGGAATT CGAACAACCTAGACTCCAAAGTCGGAGGAAACTACAACTACTTGTACAGACTATTCAGAAAGTCCAACCTAAAGCCGTTC GAGAGAGACATCTCCACCGAAATCTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCCC GCTACAGTCTTACGGATTTCAACCGACAAACGGTGTAGGATATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTAC TACATGCTCCGGCGACAGTATGTGGACCGAAAAAGTCTACCAACCTAGTCAAGAACAAATGCGTCAACTTTAACTTCAAC GGACTAACCGGAACCGGTGTCCTAACCGAATCTAACAAGAAGTTTCTACCGTTCCAGCAGTTCGGAAGAGATATCGCGGA TACAACAGACGCTGTCAGAGATCCGCAAACCTTGGAGATCCTAGATATCACCCCGTGTTCTTTCGGTGGTGTCTCTGTAA TTACTCCGGGAACGAACACCTCCAATCAAGTAGCGGTACTATACCAGGACGTGAACTGTACAGAAGTACCGGTAGCTATT CACGCGGATCAACTAACACCAACTTGGAGAGTGTACTCCACCGGATCTAACGTATTCCAAACAAGAGCGGGATGTCTAAT CGGAGCGGAACACGTAAACAACTCCTACGAATGTGATATCCCGATTGGAGCGGGAATCTGTGCGTCTTACCAAACACAAA CAAACTCCCCGAGAAGAGCGAGATCTGTAGCCTCTCAATCTATTATCGCCTACACCATGTCCTTGGGAGCCGAAAATTCT GTCGCGTACTCCAACAATTCTATCGCGATCCCGACAAACTTCACCATCTCTGTAACAACCGAGATCCTACCGGTGTCTAT GACCAAGACATCTGTCGATTGCACCATGTACATCTGCGGAGATTCCACCGAGTGCTCCAACCTACTACTACAGTACGGAT CTTTCTGTACCCAGCTAAACAGAGCGTTGACTGGAATCGCTGTAGAGCAGGATAAGAACACCCAAGAGGTATTCGCGCAA GTCAAGCAGATCTATAAGACTCCGCCGATCAAGGACTTCGGAGGTTTTAACTTCTCTCAGATCTTGCCGGATCCGTCCAA ACCGTCTAAGAGATCTTTCATCGAGGACCTACTATTCAACAAAGTCACCCTAGCTGACGCGGGATTCATCAAACAATACG GAGATTGCTTGGGAGACATTGCGGCGAGAGATCTAATTTGCGCGCAGAAGTTTAACGGATTGACAGTACTACCGCCGCTA CTAACCGATGAGATGATTGCGCAGTACACGTCTGCTCTATTGGCGGGAACAATTACAAGTGGATGGACATTTGGAGCCGG TGCCGCTCTACAAATTCCGTTTGCTATGCAAATGGCGTACAGATTCAACGGAATCGGAGTAACCCAGAACGTCTTGTACG AGAACCAGAAGCTAATCGCGAACCAGTTCAATTCCGCGATCGGAAAGATCCAGGACAGTCTATCTTCTACTGCTTCGGCG TTGGGAAAGCTACAGGATGTAGTAAATCAAAACGCGCAGGCGCTAAACACCTTGGTCAAGCAACTATCCTCTAACTTCGG AGCGATCTCGTCCGTCCTAAACGACATCTTATCCAGACTAGATAAGGTCGAAGCGGAGGTCCAGATCGATAGACTAATCA CTGGAAGATTGCAGTCCCTACAGACCTACGTAACACAGCAACTAATTAGAGCGGCGGAGATTAGAGCCTCTGCTAATCTA GCTGCGACCAAGATGTCCGAATGTGTCTTGGGACAATCCAAGAGAGTCGACTTTTGCGGAAAGGGATACCACCTAATGTC TTTTCCACAATCTGCGCCGCATGGTGTCGTATTCCTACATGTAACATATGTGCCGGCGCAAGAAAAGAACTTTACAACAG CTCCAGCGATCTGCCATGATGGAAAAGCTCATTTTCCGAGAGAGGGAGTCTTTGTCTCTAACGGAACTCATTGGTTCGTC ACCCAGAGAAACTTTTACGAGCCGCAGATCATCACCACCGACAACACATTTGTTTCGGGAAACTGCGACGTGGTCATCGG AATCGTAAACAATACCGTCTACGATCCGTTGCAGCCGGAACTAGACTCCTTCAAAGAAGAGTTGGACAAGTACTTTAAGA ACCACACCTCTCCGGATGTCGACTTGGGAGATATTTCTGGAATCAACGCGTCCGTCGTCAACATCCAGAAAGAAATCGAT AGATTGAACGAGGTCGCGAAGAACTTGAACGAGTCCCTAATCGACCTACAAGAGCTAGGAAAATACGAGCAGTACATCAA GTGGCCGTGGTACATTTGGCTAGGATTCATTGCTGGACTAATTGCGATCGTCATGGTCACCATCATGCTATGCTGTATGA CCTCCTGTTGCTCCTGTCTAAAGGGATGTTGTTCCTGCGGATCCTGTTGCAAGTTCGATGAAGATGATAGTGAACCGGTC CTAAAGGGTGTCAAGCTACACTACACATAAAAGCTT
用於SARS-CoV-2刺突插入之HPXV095基因座靶標之核苷酸序列。SEQ ID NO: 51 tttggctagtcaagatgatgaatcttcattatctgatatattgcaaatcactcaatatctagactttctgttattattat tgatccaatcaaaaaataaattagaagccgtgggtcattgttatgaatctctttcagaggaatacagacaattgacaaaa ttcacagactttcaagattttaaaaaactgtttaacaaggtccctattgttacagatggaagggtcaaacttaataaagg atatttgttcgactttgtgattagtttgatgcgattcaaaaaagaatcctctctagctaccaccgcaatagatcctatta gatacatagatcctcgtcgtgatatcgcattttctaacgtgatggatatattaaagttgaataaagtgaacaataattaa ttctttattgtcatcGGATCCCACgatGTGctaGACtctctcGTCtacGCGGCCGCaActgagagaccAAGCTTGTCGAC tattatattttttatctaaaaaactaaaaataaacattgattaaattttaatataatacttaaaaatggatgttgtgtcg ttagataaaccgtttatgtattttgaggaaattgataatgagttagattacgaaccagaaagtgcaaatgaggtcgcaaa aaaactaccgtatcaaggacagttaaaactattactaggagaattattttttcttagtaagttacagcgacacggtatat tagatggtgccaccgtagtgtatataggatcggctcctggtacacatatacgttatttgagagatcatttctataattta ggaatgattatcaaatggatgctaattgacggacgccatcatgatcctattctaaatggattgcgtgatgtgactctagt
用於SARS-CoV-2刺突插入之HPXV200基因座靶標之核苷酸序列。SEQ ID NO: 52 gagtattctaggtgtttctatagaatgtaagaagtcAtcgacattacttacttttttgaccgtgcgtaaaatgacCcgag tatttaatagatttccagatatggcttattatcgaggagactgtttaaaagccgtttatgtaacaatgacttataaaaat actaaaactggagagactgattacacgtacctctctaatgggggttgcctgcatactatcgtaatggggtcgatggttga ttattgattagtatattccttattctttttattcacacaaaaagaacatttttataaacatgaaaccactgtctaaatgt aattatgatcttgatttatagatgaagatcagcctttagaggattttaaccagtatgtttaatatgaaaaaaataaacat aacatattttgagattaagcgctattgtgcttaattattttgctctataaactgaatatatagccacaattattgacggg cttgtttatgaccggcaatcGGATCCCACgatGTGctaGACtctctcGTCtacGCGGCCGCaActgagagaccAAGCTTG TCGACtaaaatagtttaactcttttaaaaccagtttggtactggaatttcagttcattactcgttgagaaattgatgatt tttttaaaatgatattacttttatatgcttgcatcgcagaatgatattcacaagtattattaaaaatgagtatcggtagt tacattaccatatcatccatgctcatatggatctccatccattatataatcaatgatacatgtattaaaatactttccga ataagtcttttaaatattgtattaattatgaaaaactatgctatgcgagtatgatgcaaagatgtttaatgatacgatac tagattttatctctagcgagagatgtcgttagaatcatttatcataactacgtttaataataattcatcaacgaatatcg ataacatgtgtcatttatactttaaatacgttaaagtctgtccgtcttctctattgtttagactgtttgtagaatgctgt gatataaacaaactagtagaaggta
SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 (寄存號NC_045512.2)之核苷酸序列。SEQ ID NO: 53 1 attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct        61 gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact       121 cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc       181 ttctgcaggc tgcttacggt ttcgtccgtg ttgcagccga tcatcagcac atctaggttt       241 cgtccgggtg tgaccgaaag gtaagatgga gagccttgtc cctggtttca acgagaaaac       301 acacgtccaa ctcagtttgc ctgttttaca ggttcgcgac gtgctcgtac gtggctttgg       361 agactccgtg gaggaggtct tatcagaggc acgtcaacat cttaaagatg gcacttgtgg       421 cttagtagaa gttgaaaaag gcgttttgcc tcaacttgaa cagccctatg tgttcatcaa       481 acgttcggat gctcgaactg cacctcatgg tcatgttatg gttgagctgg tagcagaact       541 cgaaggcatt cagtacggtc gtagtggtga gacacttggt gtccttgtcc ctcatgtggg       601 cgaaatacca gtggcttacc gcaaggttct tcttcgtaag aacggtaata aaggagctgg       661 tggccatagt tacggcgccg atctaaagtc atttgactta ggcgacgagc ttggcactga       721 tccttatgaa gattttcaag aaaactggaa cactaaacat agcagtggtg ttacccgtga       781 actcatgcgt gagcttaacg gaggggcata cactcgctat gtcgataaca acttctgtgg       841 ccctgatggc taccctcttg agtgcattaa agaccttcta gcacgtgctg gtaaagcttc       901 atgcactttg tccgaacaac tggactttat tgacactaag aggggtgtat actgctgccg       961 tgaacatgag catgaaattg cttggtacac ggaacgttct gaaaagagct atgaattgca      1021 gacacctttt gaaattaaat tggcaaagaa atttgacacc ttcaatgggg aatgtccaaa      1081 ttttgtattt cccttaaatt ccataatcaa gactattcaa ccaagggttg aaaagaaaaa      1141 gcttgatggc tttatgggta gaattcgatc tgtctatcca gttgcgtcac caaatgaatg      1201 caaccaaatg tgcctttcaa ctctcatgaa gtgtgatcat tgtggtgaaa cttcatggca      1261 gacgggcgat tttgttaaag ccacttgcga attttgtggc actgagaatt tgactaaaga      1321 aggtgccact acttgtggtt acttacccca aaatgctgtt gttaaaattt attgtccagc      1381 atgtcacaat tcagaagtag gacctgagca tagtcttgcc gaataccata atgaatctgg      1441 cttgaaaacc attcttcgta agggtggtcg cactattgcc tttggaggct gtgtgttctc      1501 ttatgttggt tgccataaca agtgtgccta ttgggttcca cgtgctagcg ctaacatagg      1561 ttgtaaccat acaggtgttg ttggagaagg ttccgaaggt cttaatgaca accttcttga      1621 aatactccaa aaagagaaag tcaacatcaa tattgttggt gactttaaac ttaatgaaga      1681 gatcgccatt attttggcat ctttttctgc ttccacaagt gcttttgtgg aaactgtgaa      1741 aggtttggat tataaagcat tcaaacaaat tgttgaatcc tgtggtaatt ttaaagttac      1801 aaaaggaaaa gctaaaaaag gtgcctggaa tattggtgaa cagaaatcaa tactgagtcc      1861 tctttatgca tttgcatcag aggctgctcg tgttgtacga tcaattttct cccgcactct      1921 tgaaactgct caaaattctg tgcgtgtttt acagaaggcc gctataacaa tactagatgg      1981 aatttcacag tattcactga gactcattga tgctatgatg ttcacatctg atttggctac      2041 taacaatcta gttgtaatgg cctacattac aggtggtgtt gttcagttga cttcgcagtg      2101 gctaactaac atctttggca ctgtttatga aaaactcaaa cccgtccttg attggcttga      2161 agagaagttt aaggaaggtg tagagtttct tagagacggt tgggaaattg ttaaatttat      2221 ctcaacctgt gcttgtgaaa ttgtcggtgg acaaattgtc acctgtgcaa aggaaattaa      2281 ggagagtgtt cagacattct ttaagcttgt aaataaattt ttggctttgt gtgctgactc      2341 tatcattatt ggtggagcta aacttaaagc cttgaattta ggtgaaacat ttgtcacgca      2401 ctcaaaggga ttgtacagaa agtgtgttaa atccagagaa gaaactggcc tactcatgcc      2461 tctaaaagcc ccaaaagaaa ttatcttctt agagggagaa acacttccca cagaagtgtt      2521 aacagaggaa gttgtcttga aaactggtga tttacaacca ttagaacaac ctactagtga      2581 agctgttgaa gctccattgg ttggtacacc agtttgtatt aacgggctta tgttgctcga      2641 aatcaaagac acagaaaagt actgtgccct tgcacctaat atgatggtaa caaacaatac      2701 cttcacactc aaaggcggtg caccaacaaa ggttactttt ggtgatgaca ctgtgataga      2761 agtgcaaggt tacaagagtg tgaatatcac ttttgaactt gatgaaagga ttgataaagt      2821 acttaatgag aagtgctctg cctatacagt tgaactcggt acagaagtaa atgagttcgc      2881 ctgtgttgtg gcagatgctg tcataaaaac tttgcaacca gtatctgaat tacttacacc      2941 actgggcatt gatttagatg agtggagtat ggctacatac tacttatttg atgagtctgg      3001 tgagtttaaa ttggcttcac atatgtattg ttctttctac cctccagatg aggatgaaga      3061 agaaggtgat tgtgaagaag aagagtttga gccatcaact caatatgagt atggtactga      3121 agatgattac caaggtaaac ctttggaatt tggtgccact tctgctgctc ttcaacctga      3181 agaagagcaa gaagaagatt ggttagatga tgatagtcaa caaactgttg gtcaacaaga      3241 cggcagtgag gacaatcaga caactactat tcaaacaatt gttgaggttc aacctcaatt      3301 agagatggaa cttacaccag ttgttcagac tattgaagtg aatagtttta gtggttattt      3361 aaaacttact gacaatgtat acattaaaaa tgcagacatt gtggaagaag ctaaaaaggt      3421 aaaaccaaca gtggttgtta atgcagccaa tgtttacctt aaacatggag gaggtgttgc      3481 aggagcctta aataaggcta ctaacaatgc catgcaagtt gaatctgatg attacatagc      3541 tactaatgga ccacttaaag tgggtggtag ttgtgtttta agcggacaca atcttgctaa      3601 acactgtctt catgttgtcg gcccaaatgt taacaaaggt gaagacattc aacttcttaa      3661 gagtgcttat gaaaatttta atcagcacga agttctactt gcaccattat tatcagctgg      3721 tatttttggt gctgacccta tacattcttt aagagtttgt gtagatactg ttcgcacaaa      3781 tgtctactta gctgtctttg ataaaaatct ctatgacaaa cttgtttcaa gctttttgga      3841 aatgaagagt gaaaagcaag ttgaacaaaa gatcgctgag attcctaaag aggaagttaa      3901 gccatttata actgaaagta aaccttcagt tgaacagaga aaacaagatg ataagaaaat      3961 caaagcttgt gttgaagaag ttacaacaac tctggaagaa actaagttcc tcacagaaaa      4021 cttgttactt tatattgaca ttaatggcaa tcttcatcca gattctgcca ctcttgttag      4081 tgacattgac atcactttct taaagaaaga tgctccatat atagtgggtg atgttgttca      4141 agagggtgtt ttaactgctg tggttatacc tactaaaaag gctggtggca ctactgaaat      4201 gctagcgaaa gctttgagaa aagtgccaac agacaattat ataaccactt acccgggtca      4261 gggtttaaat ggttacactg tagaggaggc aaagacagtg cttaaaaagt gtaaaagtgc      4321 cttttacatt ctaccatcta ttatctctaa tgagaagcaa gaaattcttg gaactgtttc      4381 ttggaatttg cgagaaatgc ttgcacatgc agaagaaaca cgcaaattaa tgcctgtctg      4441 tgtggaaact aaagccatag tttcaactat acagcgtaaa tataagggta ttaaaataca      4501 agagggtgtg gttgattatg gtgctagatt ttacttttac accagtaaaa caactgtagc      4561 gtcacttatc aacacactta acgatctaaa tgaaactctt gttacaatgc cacttggcta      4621 tgtaacacat ggcttaaatt tggaagaagc tgctcggtat atgagatctc tcaaagtgcc      4681 agctacagtt tctgtttctt cacctgatgc tgttacagcg tataatggtt atcttacttc      4741 ttcttctaaa acacctgaag aacattttat tgaaaccatc tcacttgctg gttcctataa      4801 agattggtcc tattctggac aatctacaca actaggtata gaatttctta agagaggtga      4861 taaaagtgta tattacacta gtaatcctac cacattccac ctagatggtg aagttatcac      4921 ctttgacaat cttaagacac ttctttcttt gagagaagtg aggactatta aggtgtttac      4981 aacagtagac aacattaacc tccacacgca agttgtggac atgtcaatga catatggaca      5041 acagtttggt ccaacttatt tggatggagc tgatgttact aaaataaaac ctcataattc      5101 acatgaaggt aaaacatttt atgttttacc taatgatgac actctacgtg ttgaggcttt      5161 tgagtactac cacacaactg atcctagttt tctgggtagg tacatgtcag cattaaatca      5221 cactaaaaag tggaaatacc cacaagttaa tggtttaact tctattaaat gggcagataa      5281 caactgttat cttgccactg cattgttaac actccaacaa atagagttga agtttaatcc      5341 acctgctcta caagatgctt attacagagc aagggctggt gaagctgcta acttttgtgc      5401 acttatctta gcctactgta ataagacagt aggtgagtta ggtgatgtta gagaaacaat      5461 gagttacttg tttcaacatg ccaatttaga ttcttgcaaa agagtcttga acgtggtgtg      5521 taaaacttgt ggacaacagc agacaaccct taagggtgta gaagctgtta tgtacatggg      5581 cacactttct tatgaacaat ttaagaaagg tgttcagata ccttgtacgt gtggtaaaca      5641 agctacaaaa tatctagtac aacaggagtc accttttgtt atgatgtcag caccacctgc      5701 tcagtatgaa cttaagcatg gtacatttac ttgtgctagt gagtacactg gtaattacca      5761 gtgtggtcac tataaacata taacttctaa agaaactttg tattgcatag acggtgcttt      5821 acttacaaag tcctcagaat acaaaggtcc tattacggat gttttctaca aagaaaacag      5881 ttacacaaca accataaaac cagttactta taaattggat ggtgttgttt gtacagaaat      5941 tgaccctaag ttggacaatt attataagaa agacaattct tatttcacag agcaaccaat      6001 tgatcttgta ccaaaccaac catatccaaa cgcaagcttc gataatttta agtttgtatg      6061 tgataatatc aaatttgctg atgatttaaa ccagttaact ggttataaga aacctgcttc      6121 aagagagctt aaagttacat ttttccctga cttaaatggt gatgtggtgg ctattgatta      6181 taaacactac acaccctctt ttaagaaagg agctaaattg ttacataaac ctattgtttg      6241 gcatgttaac aatgcaacta ataaagccac gtataaacca aatacctggt gtatacgttg      6301 tctttggagc acaaaaccag ttgaaacatc aaattcgttt gatgtactga agtcagagga      6361 cgcgcaggga atggataatc ttgcctgcga agatctaaaa ccagtctctg aagaagtagt      6421 ggaaaatcct accatacaga aagacgttct tgagtgtaat gtgaaaacta ccgaagttgt      6481 aggagacatt atacttaaac cagcaaataa tagtttaaaa attacagaag aggttggcca      6541 cacagatcta atggctgctt atgtagacaa ttctagtctt actattaaga aacctaatga      6601 attatctaga gtattaggtt tgaaaaccct tgctactcat ggtttagctg ctgttaatag      6661 tgtcccttgg gatactatag ctaattatgc taagcctttt cttaacaaag ttgttagtac      6721 aactactaac atagttacac ggtgtttaaa ccgtgtttgt actaattata tgccttattt      6781 ctttacttta ttgctacaat tgtgtacttt tactagaagt acaaattcta gaattaaagc      6841 atctatgccg actactatag caaagaatac tgttaagagt gtcggtaaat tttgtctaga      6901 ggcttcattt aattatttga agtcacctaa tttttctaaa ctgataaata ttataatttg      6961 gtttttacta ttaagtgttt gcctaggttc tttaatctac tcaaccgctg ctttaggtgt      7021 tttaatgtct aatttaggca tgccttctta ctgtactggt tacagagaag gctatttgaa      7081 ctctactaat gtcactattg caacctactg tactggttct ataccttgta gtgtttgtct      7141 tagtggttta gattctttag acacctatcc ttctttagaa actatacaaa ttaccatttc      7201 atcttttaaa tgggatttaa ctgcttttgg cttagttgca gagtggtttt tggcatatat      7261 tcttttcact aggtttttct atgtacttgg attggctgca atcatgcaat tgtttttcag      7321 ctattttgca gtacatttta ttagtaattc ttggcttatg tggttaataa ttaatcttgt      7381 acaaatggcc ccgatttcag ctatggttag aatgtacatc ttctttgcat cattttatta      7441 tgtatggaaa agttatgtgc atgttgtaga cggttgtaat tcatcaactt gtatgatgtg      7501 ttacaaacgt aatagagcaa caagagtcga atgtacaact attgttaatg gtgttagaag      7561 gtccttttat gtctatgcta atggaggtaa aggcttttgc aaactacaca attggaattg      7621 tgttaattgt gatacattct gtgctggtag tacatttatt agtgatgaag ttgcgagaga      7681 cttgtcacta cagtttaaaa gaccaataaa tcctactgac cagtcttctt acatcgttga      7741 tagtgttaca gtgaagaatg gttccatcca tctttacttt gataaagctg gtcaaaagac      7801 ttatgaaaga cattctctct ctcattttgt taacttagac 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     9421 tgtagctatc gtagtaacat gccttgccta ctattttatg aggtttagaa gagcttttgg      9481 tgaatacagt catgtagttg cctttaatac tttactattc cttatgtcat tcactgtact      9541 ctgtttaaca ccagtttact cattcttacc tggtgtttat tctgttattt acttgtactt      9601 gacattttat cttactaatg atgtttcttt tttagcacat attcagtgga tggttatgtt      9661 cacaccttta gtacctttct ggataacaat tgcttatatc atttgtattt ccacaaagca      9721 tttctattgg ttctttagta attacctaaa gagacgtgta gtctttaatg gtgtttcctt      9781 tagtactttt gaagaagctg cgctgtgcac ctttttgtta aataaagaaa tgtatctaaa      9841 gttgcgtagt gatgtgctat tacctcttac gcaatataat agatacttag ctctttataa      9901 taagtacaag tattttagtg gagcaatgga tacaactagc tacagagaag ctgcttgttg      9961 tcatctcgca aaggctctca atgacttcag taactcaggt tctgatgttc tttaccaacc     10021 accacaaacc tctatcacct cagctgtttt gcagagtggt tttagaaaaa tggcattccc     10081 atctggtaaa gttgagggtt gtatggtaca agtaacttgt ggtacaacta cacttaacgg     10141 tctttggctt gatgacgtag tttactgtcc aagacatgtg atctgcacct ctgaagacat     10201 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    20461 acagatgcgc aaacaggttc atctaagtgt gtgtgttctg ttattgattt attacttgat     20521 gattttgttg aaataataaa atcccaagat ttatctgtag tttctaaggt tgtcaaagtg     20581 actattgact atacagaaat ttcatttatg ctttggtgta aagatggcca tgtagaaaca     20641 ttttacccaa aattacaatc tagtcaagcg tggcaaccgg gtgttgctat gcctaatctt     20701 tacaaaatgc aaagaatgct attagaaaag tgtgaccttc aaaattatgg tgatagtgca     20761 acattaccta aaggcataat gatgaatgtc gcaaaatata ctcaactgtg tcaatattta     20821 aacacattaa cattagctgt accctataat atgagagtta tacattttgg tgctggttct     20881 gataaaggag ttgcaccagg tacagctgtt ttaagacagt ggttgcctac gggtacgctg     20941 cttgtcgatt cagatcttaa tgactttgtc tctgatgcag attcaacttt gattggtgat     21001 tgtgcaactg tacatacagc taataaatgg gatctcatta ttagtgatat gtacgaccct     21061 aagactaaaa atgttacaaa agaaaatgac tctaaagagg gttttttcac ttacatttgt     21121 gggtttatac aacaaaagct agctcttgga ggttccgtgg ctataaagat aacagaacat     21181 tcttggaatg ctgatcttta taagctcatg ggacacttcg catggtggac agcctttgtt     21241 actaatgtga atgcgtcatc atctgaagca tttttaattg gatgtaatta tcttggcaaa     21301 ccacgcgaac aaatagatgg ttatgtcatg catgcaaatt acatattttg gaggaataca     21361 aatccaattc agttgtcttc ctattcttta tttgacatga gtaaatttcc ccttaaatta     21421 aggggtactg ctgttatgtc tttaaaagaa ggtcaaatca atgatatgat tttatctctt     21481 cttagtaaag gtagacttat aattagagaa aacaacagag ttgttatttc tagtgatgtt     21541 cttgttaaca actaaacgaa caatgtttgt ttttcttgtt ttattgccac tagtctctag     21601 tcagtgtgtt aatcttacaa ccagaactca attaccccct gcatacacta attctttcac     21661 acgtggtgtt tattaccctg acaaagtttt cagatcctca gttttacatt caactcagga     21721 cttgttctta cctttctttt ccaatgttac ttggttccat gctatacatg tctctgggac     21781 caatggtact aagaggtttg ataaccctgt cctaccattt aatgatggtg tttattttgc     21841 ttccactgag aagtctaaca taataagagg ctggattttt ggtactactt tagattcgaa     21901 gacccagtcc ctacttattg ttaataacgc tactaatgtt gttattaaag tctgtgaatt     21961 tcaattttgt aatgatccat ttttgggtgt ttattaccac aaaaacaaca aaagttggat     22021 ggaaagtgag ttcagagttt attctagtgc gaataattgc acttttgaat atgtctctca     22081 gccttttctt atggaccttg aaggaaaaca gggtaatttc aaaaatctta gggaatttgt     22141 gtttaagaat attgatggtt attttaaaat atattctaag cacacgccta ttaatttagt     22201 gcgtgatctc cctcagggtt tttcggcttt agaaccattg gtagatttgc caataggtat     22261 taacatcact aggtttcaaa ctttacttgc tttacataga agttatttga ctcctggtga     22321 ttcttcttca ggttggacag ctggtgctgc agcttattat gtgggttatc ttcaacctag     22381 gacttttcta ttaaaatata atgaaaatgg aaccattaca gatgctgtag actgtgcact     22441 tgaccctctc tcagaaacaa agtgtacgtt gaaatccttc actgtagaaa aaggaatcta     22501 tcaaacttct aactttagag tccaaccaac agaatctatt gttagatttc ctaatattac     22561 aaacttgtgc ccttttggtg aagtttttaa cgccaccaga tttgcatctg tttatgcttg     22621 gaacaggaag agaatcagca actgtgttgc tgattattct gtcctatata attccgcatc     22681 attttccact tttaagtgtt atggagtgtc tcctactaaa ttaaatgatc tctgctttac     22741 taatgtctat gcagattcat ttgtaattag aggtgatgaa gtcagacaaa tcgctccagg     22801 gcaaactgga aagattgctg attataatta taaattacca gatgatttta caggctgcgt     22861 tatagcttgg aattctaaca atcttgattc taaggttggt ggtaattata attacctgta     22921 tagattgttt aggaagtcta atctcaaacc ttttgagaga gatatttcaa ctgaaatcta     22981 tcaggccggt agcacacctt gtaatggtgt tgaaggtttt aattgttact ttcctttaca     23041 atcatatggt ttccaaccca ctaatggtgt tggttaccaa ccatacagag tagtagtact     23101 ttcttttgaa cttctacatg caccagcaac tgtttgtgga cctaaaaagt ctactaattt     23161 ggttaaaaac aaatgtgtca atttcaactt caatggttta acaggcacag gtgttcttac     23221 tgagtctaac aaaaagtttc tgcctttcca acaatttggc agagacattg ctgacactac     23281 tgatgctgtc cgtgatccac agacacttga gattcttgac attacaccat gttcttttgg     23341 tggtgtcagt gttataacac caggaacaaa tacttctaac caggttgctg ttctttatca     23401 ggatgttaac tgcacagaag tccctgttgc tattcatgca gatcaactta ctcctacttg     23461 gcgtgtttat tctacaggtt ctaatgtttt tcaaacacgt gcaggctgtt taataggggc     23521 tgaacatgtc aacaactcat atgagtgtga catacccatt ggtgcaggta tatgcgctag     23581 ttatcagact cagactaatt ctcctcggcg ggcacgtagt gtagctagtc aatccatcat     23641 tgcctacact atgtcacttg gtgcagaaaa ttcagttgct tactctaata actctattgc     23701 catacccaca aattttacta ttagtgttac cacagaaatt ctaccagtgt ctatgaccaa     23761 gacatcagta gattgtacaa tgtacatttg tggtgattca actgaatgca gcaatctttt     23821 gttgcaatat ggcagttttt gtacacaatt aaaccgtgct ttaactggaa tagctgttga     23881 acaagacaaa aacacccaag aagtttttgc acaagtcaaa caaatttaca aaacaccacc     23941 aattaaagat tttggtggtt ttaatttttc acaaatatta ccagatccat caaaaccaag     24001 caagaggtca tttattgaag atctactttt caacaaagtg acacttgcag atgctggctt     24061 catcaaacaa tatggtgatt gccttggtga tattgctgct agagacctca tttgtgcaca     24121 aaagtttaac ggccttactg ttttgccacc tttgctcaca gatgaaatga ttgctcaata     24181 cacttctgca ctgttagcgg gtacaatcac ttctggttgg acctttggtg caggtgctgc     24241 attacaaata ccatttgcta tgcaaatggc ttataggttt aatggtattg gagttacaca     24301 gaatgttctc tatgagaacc aaaaattgat tgccaaccaa tttaatagtg ctattggcaa     24361 aattcaagac tcactttctt ccacagcaag tgcacttgga 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taaaatggcc     25201 atggtacatt tggctaggtt ttatagctgg cttgattgcc atagtaatgg tgacaattat     25261 gctttgctgt atgaccagtt gctgtagttg tctcaagggc tgttgttctt gtggatcctg     25321 ctgcaaattt gatgaagacg actctgagcc agtgctcaaa ggagtcaaat tacattacac     25381 ataaacgaac ttatggattt gtttatgaga atcttcacaa ttggaactgt aactttgaag     25441 caaggtgaaa tcaaggatgc tactccttca gattttgttc gcgctactgc aacgataccg     25501 atacaagcct cactcccttt cggatggctt attgttggcg ttgcacttct tgctgttttt     25561 cagagcgctt ccaaaatcat aaccctcaaa aagagatggc aactagcact ctccaagggt     25621 gttcactttg tttgcaactt gctgttgttg tttgtaacag tttactcaca ccttttgctc     25681 gttgctgctg gccttgaagc cccttttctc tatctttatg ctttagtcta cttcttgcag     25741 agtataaact ttgtaagaat aataatgagg ctttggcttt gctggaaatg ccgttccaaa     25801 aacccattac tttatgatgc caactatttt ctttgctggc atactaattg ttacgactat     25861 tgtatacctt acaatagtgt aacttcttca attgtcatta cttcaggtga tggcacaaca     25921 agtcctattt ctgaacatga ctaccagatt ggtggttata ctgaaaaatg ggaatctgga     25981 gtaaaagact gtgttgtatt acacagttac ttcacttcag actattacca gctgtactca     26041 actcaattga gtacagacac tggtgttgaa catgttacct tcttcatcta caataaaatt     26101 gttgatgagc ctgaagaaca tgtccaaatt cacacaatcg acggttcatc cggagttgtt     26161 aatccagtaa tggaaccaat ttatgatgaa ccgacgacga ctactagcgt gcctttgtaa     26221 gcacaagctg atgagtacga acttatgtac tcattcgttt cggaagagac aggtacgtta     26281 atagttaata gcgtacttct ttttcttgct ttcgtggtat tcttgctagt tacactagcc     26341 atccttactg cgcttcgatt gtgtgcgtac tgctgcaata ttgttaacgt gagtcttgta     26401 aaaccttctt tttacgttta ctctcgtgtt aaaaatctga attcttctag agttcctgat     26461 cttctggtct aaacgaacta aatattatat tagtttttct gtttggaact ttaattttag     26521 ccatggcaga ttccaacggt actattaccg ttgaagagct taaaaagctc cttgaacaat     26581 ggaacctagt aataggtttc ctattcctta catggatttg tcttctacaa tttgcctatg     26641 ccaacaggaa taggtttttg tatataatta agttaatttt cctctggctg ttatggccag     26701 taactttagc ttgttttgtg cttgctgctg tttacagaat aaattggatc accggtggaa     26761 ttgctatcgc aatggcttgt cttgtaggct tgatgtggct cagctacttc attgcttctt     26821 tcagactgtt tgcgcgtacg cgttccatgt ggtcattcaa tccagaaact aacattcttc     26881 tcaacgtgcc actccatggc actattctga ccagaccgct tctagaaagt gaactcgtaa     26941 tcggagctgt gatccttcgt ggacatcttc gtattgctgg acaccatcta ggacgctgtg     27001 acatcaagga cctgcctaaa gaaatcactg ttgctacatc acgaacgctt tcttattaca     27061 aattgggagc ttcgcagcgt gtagcaggtg actcaggttt tgctgcatac agtcgctaca     27121 ggattggcaa ctataaatta aacacagacc attccagtag cagtgacaat attgctttgc     27181 ttgtacagta agtgacaaca gatgtttcat ctcgttgact ttcaggttac tatagcagag     27241 atattactaa ttattatgag gacttttaaa gtttccattt ggaatcttga ttacatcata     27301 aacctcataa ttaaaaattt atctaagtca ctaactgaga ataaatattc tcaattagat     27361 gaagagcaac caatggagat tgattaaacg aacatgaaaa ttattctttt cttggcactg     27421 ataacactcg ctacttgtga gctttatcac taccaagagt gtgttagagg tacaacagta     27481 cttttaaaag aaccttgctc ttctggaaca tacgagggca attcaccatt tcatcctcta     27541 gctgataaca aatttgcact gacttgcttt agcactcaat ttgcttttgc ttgtcctgac     27601 ggcgtaaaac acgtctatca gttacgtgcc agatcagttt cacctaaact gttcatcaga     27661 caagaggaag ttcaagaact ttactctcca atttttctta ttgttgcggc aatagtgttt     27721 ataacacttt gcttcacact caaaagaaag acagaatgat tgaactttca ttaattgact     27781 tctatttgtg ctttttagcc tttctgctat tccttgtttt aattatgctt attatctttt     27841 ggttctcact tgaactgcaa gatcataatg aaacttgtca cgcctaaacg aacatgaaat     27901 ttcttgtttt cttaggaatc atcacaactg tagctgcatt tcaccaagaa tgtagtttac     27961 agtcatgtac tcaacatcaa ccatatgtag ttgatgaccc gtgtcctatt cacttctatt     28021 ctaaatggta tattagagta ggagctagaa aatcagcacc tttaattgaa ttgtgcgtgg     28081 atgaggctgg ttctaaatca cccattcagt acatcgatat cggtaattat acagtttcct     28141 gtttaccttt tacaattaat tgccaggaac ctaaattggg tagtcttgta gtgcgttgtt     28201 cgttctatga agacttttta gagtatcatg acgttcgtgt tgttttagat ttcatctaaa     28261 cgaacaaact aaaatgtctg ataatggacc ccaaaatcag cgaaatgcac cccgcattac     28321 gtttggtgga ccctcagatt caactggcag taaccagaat ggagaacgca gtggggcgcg     28381 atcaaaacaa cgtcggcccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcaccgctct     28441 cactcaacat ggcaaggaag accttaaatt ccctcgagga caaggcgttc caattaacac     28501 caatagcagt ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctaccagac gaattcgtgg     28561 tggtgacggt aaaatgaaag atctcagtcc aagatggtat ttctactacc taggaactgg     28621 gccagaagct ggacttccct atggtgctaa caaagacggc atcatatggg ttgcaactga     28681 gggagccttg aatacaccaa aagatcacat tggcacccgc aatcctgcta acaatgctgc     28741 aatcgtgcta caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagaagggag     28801 cagaggcggc agtcaagcct cttctcgttc ctcatcacgt agtcgcaaca gttcaagaaa     28861 ttcaactcca ggcagcagta ggggaacttc tcctgctaga atggctggca atggcggtga     28921 tgctgctctt gctttgctgc tgcttgacag attgaaccag cttgagagca aaatgtctgg     28981 taaaggccaa caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg aggcttctaa     29041 gaagcctcgg caaaaacgta ctgccactaa agcatacaat gtaacacaag ctttcggcag     29101 acgtggtcca gaacaaaccc aaggaaattt tggggaccag gaactaatca gacaaggaac     29161 tgattacaaa cattggccgc aaattgcaca atttgccccc agcgcttcag cgttcttcgg     29221 aatgtcgcgc attggcatgg aagtcacacc ttcgggaacg tggttgacct acacaggtgc     29281 catcaaattg gatgacaaag atccaaattt caaagatcaa gtcattttgc tgaataagca     29341 tattgacgca tacaaaacat tcccaccaac agagcctaaa aaggacaaaa agaagaaggc     29401 tgatgaaact caagccttac cgcagagaca gaagaaacag caaactgtga ctcttcttcc     29461 tgctgcagat ttggatgatt tctccaaaca attgcaacaa tccatgagca gtgctgactc     29521 aactcaggcc taaactcatg cagaccacac aaggcagatg ggctatataa acgttttcgc     29581 ttttccgttt acgatatata gtctactctt gtgcagaatg aattctcgta actacatagc     29641 acaagtagat gtagttaact ttaatctcac atagcaatct ttaatcagtg tgtaacatta     29701 gggaggactt gaaagagcca ccacattttc accgaggcca cgcggagtac gatcgagtgt     29761 acagtgaaca atgctaggga gagctgccta tatggaagag ccctaatgtg taaaattaat     29821 tttagtagtg ctatccccat gtgattttaa tagcttctta ggagaatgac aaaaaaaaaa     29881 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa
TK基因座中之SARS-CoV-2刺突蛋白之核苷酸序列。SEQ ID NO: 54 1 ttggctagtc aagatgatga atcttcatta tctgatatat tgcaaatcac tcaatatcta        61 gactttctgt tattattatt gatccaatca aaaaataaat tagaagccgt gggtcattgt       121 tatgaatctc tttcagagga atacagacaa ttgacaaaat tcacagactt tcaagatttt       181 aaaaaactgt ttaacaaggt ccctattgtt acagatggaa gggtcaaact taataaagga       241 tatttgttcg actttgtgat tagtttgatg cgattcaaaa aagaatcctc tctagctacc       301 accgcaatag atcctattag atacatagat cctcgtcgtg atatcgcatt ttctaacgtg       361 atggatatat taaagttgaa taaagtgaac aataattaat tctttattgt catcggatcc       421 cacgatgtgc tagactctct cgtctacgcg gccgcaaaaa ttgaaatttt attttttttt       481 tttggaatat aaataatgtt cgtgttccta gtcctactac cgctagtctc ttcccagtgt       541 gtaaacctaa caacgagaac acaactacca ccggcgtaca ccaattcttt cacaagagga       601 gtatattacc cggacaaggt gttcagatcc tccgtactac attctaccca ggacctattc       661 ctaccgttct tctctaacgt aacatggttc cacgcgatcc atgtctctgg aacaaacgga       721 acgaagagat tcgataaccc ggtcttgccg ttcaacgatg gtgtatactt tgcgtccacc       781 gagaagtcca acatcatcag aggatggatc ttcggaacca ccttggattc taagacccag       841 tccttgctaa tcgtcaacaa cgcgaccaac gtcgtcatca aagtctgcga attccagttc       901 tgtaacgacc cgtttttggg agtctactac cacaagaaca acaagtcctg gatggaatcc       961 gagttcagag tctactcttc cgcgaacaac tgcaccttcg aatatgtatc tcagccgttc      1021 ctaatggacc tagagggaaa gcagggaaac ttcaagaacc taagagagtt cgtattcaag      1081 aacatcgacg gatacttcaa gatctactcc aagcacaccc cgatcaacct agttagagat      1141 ctaccgcaag gattctctgc gctagaaccg ttagtagatt tgccgatcgg aatcaacatc      1201 accagattcc agacactact agcgctacac agatcttacc taacgccggg agattcttct      1261 tctggatgga ctgctggtgc tgcggcttat tatgtaggat acctacagcc gagaaccttc      1321 ctattgaagt acaacgaaaa cggaaccatc accgatgccg tagattgtgc tctagatccg      1381 ctatccgaaa cgaagtgcac cctaaagtct ttcaccgtcg agaagggaat ctaccagacc      1441 tccaacttta gagtacagcc gaccgaatcc atcgtcagat ttccgaacat cacgaaccta      1501 tgtccgttcg gagaagtgtt caacgcgaca agatttgcgt ctgtctatgc gtggaacaga      1561 aaaagaatca gtaactgcgt cgcggactac tccgtcctat acaactctgc ctctttctcc      1621 acgttcaaat gctacggtgt atccccgaca aagctaaacg atctatgctt caccaacgtc      1681 tacgcggact ccttcgtaat cagaggagat gaagttagac agattgcgcc gggacaaact      1741 ggaaagatcg cggattataa ctacaagcta ccggacgact tcaccggatg tgtaattgcg      1801 tggaattcga acaacctaga ctccaaagtc ggaggaaact acaactactt gtacagacta      1861 ttcagaaagt ccaacctaaa gccgttcgag agagacatct ccaccgaaat ctatcaggct      1921 ggatctacac cgtgtaatgg tgtcgaagga ttcaactgct acttcccgct acagtcttac      1981 ggatttcaac cgacaaacgg tgtaggatat cagccgtaca gagtcgtcgt actatccttc      2041 gaactactac atgctccggc gacagtatgt ggaccgaaaa agtctaccaa cctagtcaag      2101 aacaaatgcg tcaactttaa cttcaacgga ctaaccggaa ccggtgtcct aaccgaatct      2161 aacaagaagt ttctaccgtt ccagcagttc ggaagagata tcgcggatac aacagacgct      2221 gtcagagatc cgcaaacctt ggagatccta gatatcaccc cgtgttcttt cggtggtgtc      2281 tctgtaatta ctccgggaac gaacacctcc aatcaagtag cggtactata ccaggacgtg      2341 aactgtacag aagtaccggt agctattcac gcggatcaac taacaccaac ttggagagtg      2401 tactccaccg gatctaacgt attccaaaca agagcgggat gtctaatcgg agcggaacac      2461 gtaaacaact cctacgaatg tgatatcccg attggagcgg gaatctgtgc gtcttaccaa      2521 acacaaacaa actccccgag aagagcgaga tctgtagcct ctcaatctat tatcgcctac      2581 accatgtcct tgggagccga aaattctgtc gcgtactcca acaattctat cgcgatcccg      2641 acaaacttca ccatctctgt aacaaccgag atcctaccgg tgtctatgac caagacatct      2701 gtcgattgca ccatgtacat ctgcggagat tccaccgagt gctccaacct actactacag      2761 tacggatctt tctgtaccca gctaaacaga gcgttgactg gaatcgctgt agagcaggat      2821 aagaacaccc aagaggtatt cgcgcaagtc aagcagatct ataagactcc gccgatcaag      2881 gacttcggag gttttaactt ctctcagatc ttgccggatc cgtccaaacc gtctaagaga      2941 tctttcatcg aggacctact attcaacaaa gtcaccctag ctgacgcggg attcatcaaa      3001 caatacggag attgcttggg agacattgcg gcgagagatc taatttgcgc gcagaagttt      3061 aacggattga cagtactacc gccgctacta accgatgaga tgattgcgca gtacacgtct      3121 gctctattgg cgggaacaat tacaagtgga tggacatttg gagccggtgc cgctctacaa      3181 attccgtttg ctatgcaaat ggcgtacaga ttcaacggaa tcggagtaac ccagaacgtc      3241 ttgtacgaga accagaagct aatcgcgaac cagttcaatt ccgcgatcgg aaagatccag      3301 gacagtctat cttctactgc ttcggcgttg ggaaagctac aggatgtagt aaatcaaaac      3361 gcgcaggcgc taaacacctt ggtcaagcaa ctatcctcta acttcggagc gatctcgtcc      3421 gtcctaaacg acatcttatc cagactagat aaggtcgaag cggaggtcca gatcgataga      3481 ctaatcactg gaagattgca gtccctacag acctacgtaa cacagcaact aattagagcg      3541 gcggagatta gagcctctgc taatctagct gcgaccaaga tgtccgaatg tgtcttggga      3601 caatccaaga gagtcgactt ttgcggaaag ggataccacc taatgtcttt tccacaatct      3661 gcgccgcatg gtgtcgtatt cctacatgta acatatgtgc cggcgcaaga aaagaacttt      3721 acaacagctc cagcgatctg ccatgatgga aaagctcatt ttccgagaga gggagtcttt      3781 gtctctaacg gaactcattg gttcgtcacc cagagaaact tttacgagcc gcagatcatc      3841 accaccgaca acacatttgt ttcgggaaac tgcgacgtgg tcatcggaat cgtaaacaat      3901 accgtctacg atccgttgca gccggaacta gactccttca aagaagagtt ggacaagtac      3961 tttaagaacc acacctctcc ggatgtcgac ttgggagata tttctggaat caacgcgtcc      4021 gtcgtcaaca tccagaaaga aatcgataga ttgaacgagg tcgcgaagaa cttgaacgag      4081 tccctaatcg acctacaaga gctaggaaaa tacgagcagt acatcaagtg gccgtggtac      4141 atttggctag gattcattgc tggactaatt gcgatcgtca tggtcaccat catgctatgc      4201 tgtatgacct cctgttgctc ctgtctaaag ggatgttgtt cctgcggatc ctgttgcaag      4261 ttcgatgaag atgatagtga accggtccta aagggtgtca agctacacta cacataaaag      4321 cttgtcgact attatatttt ttatctaaaa aactaaaaat aaacattgat taaattttaa      4381 tataatactt aaaaatggat gttgtgtcgt tagataaacc gtttatgtat tttgaggaaa      4441 ttgataatga gttagattac gaaccagaaa gtgcaaatga ggtcgcaaaa aaactaccgt      4501 atcaaggaca gttaaaacta ttactaggag aattattttt tcttagtaag ttacagcgac      4561 acggtatatt agatggtgcc accgtagtgt atataggatc ggctcctggt acacatatac      4621 gttatttgag agatcatttc tataatttag gaatgattat caaatggatg ctaattgacg      4681 gacgccatca tgatcctatt ctaaatggat tgcgtgatgt gactctagta tggtcatag
HPXV200 (B22R)基因座中之SARS-CoV-2刺突蛋白之核苷酸序列。SEQ ID NO: 55 1 gagtattcta ggtgtttcta tagaatgtaa gaagtcatcg acattactta cttttttgac        61 cgtgcgtaaa atgacccgag tatttaatag atttccagat atggcttatt atcgaggaga       121 ctgtttaaaa gccgtttatg taacaatgac ttataaaaat actaaaactg gagagactga       181 ttacacgtac ctctctaatg ggggttgcct gcatactatc gtaatggggt cgatggttga       241 ttattgatta gtatattcct tattcttttt attcacacaa aaagaacatt tttataaaca       301 tgaaaccact gtctaaatgt aattatgatc ttgatttata gatgaagatc agcctttaga       361 ggattttaac cagtatgttt aatatgaaaa aaataaacat aacatatttt gagattaagc       421 gctattgtgc ttaattattt tgctctataa actgaatata tagccacaat tattgacggg       481 cttgtttatg accggcaatc ggatcccacg atgtgctaga ctctctcgtc tacgcggccg       541 caaaaattga aattttattt tttttttttg gaatataaat aatgttcgtg ttcctagtcc       601 tactaccgct agtctcttcc cagtgtgtaa acctaacaac gagaacacaa ctaccaccgg       661 cgtacaccaa ttctttcaca agaggagtat attacccgga caaggtgttc agatcctccg       721 tactacattc tacccaggac ctattcctac cgttcttctc taacgtaaca tggttccacg       781 cgatccatgt ctctggaaca aacggaacga agagattcga taacccggtc ttgccgttca       841 acgatggtgt atactttgcg tccaccgaga agtccaacat catcagagga tggatcttcg       901 gaaccacctt ggattctaag acccagtcct tgctaatcgt caacaacgcg accaacgtcg       961 tcatcaaagt ctgcgaattc cagttctgta acgacccgtt tttgggagtc tactaccaca      1021 agaacaacaa gtcctggatg gaatccgagt tcagagtcta ctcttccgcg aacaactgca      1081 ccttcgaata tgtatctcag ccgttcctaa tggacctaga gggaaagcag ggaaacttca      1141 agaacctaag agagttcgta ttcaagaaca tcgacggata cttcaagatc tactccaagc      1201 acaccccgat caacctagtt agagatctac cgcaaggatt ctctgcgcta gaaccgttag      1261 tagatttgcc gatcggaatc aacatcacca gattccagac actactagcg ctacacagat      1321 cttacctaac gccgggagat tcttcttctg gatggactgc tggtgctgcg gcttattatg      1381 taggatacct acagccgaga accttcctat tgaagtacaa cgaaaacgga accatcaccg      1441 atgccgtaga ttgtgctcta gatccgctat ccgaaacgaa gtgcacccta aagtctttca      1501 ccgtcgagaa gggaatctac cagacctcca actttagagt acagccgacc gaatccatcg      1561 tcagatttcc gaacatcacg aacctatgtc cgttcggaga agtgttcaac gcgacaagat      1621 ttgcgtctgt ctatgcgtgg aacagaaaaa gaatcagtaa ctgcgtcgcg gactactccg      1681 tcctatacaa ctctgcctct ttctccacgt tcaaatgcta cggtgtatcc ccgacaaagc      1741 taaacgatct atgcttcacc aacgtctacg cggactcctt cgtaatcaga ggagatgaag      1801 ttagacagat tgcgccggga caaactggaa agatcgcgga ttataactac aagctaccgg      1861 acgacttcac cggatgtgta attgcgtgga attcgaacaa cctagactcc aaagtcggag      1921 gaaactacaa ctacttgtac agactattca gaaagtccaa cctaaagccg ttcgagagag      1981 acatctccac cgaaatctat caggctggat ctacaccgtg taatggtgtc gaaggattca      2041 actgctactt cccgctacag tcttacggat ttcaaccgac aaacggtgta ggatatcagc      2101 cgtacagagt cgtcgtacta tccttcgaac tactacatgc tccggcgaca gtatgtggac      2161 cgaaaaagtc taccaaccta gtcaagaaca aatgcgtcaa ctttaacttc aacggactaa      2221 ccggaaccgg tgtcctaacc gaatctaaca agaagtttct accgttccag cagttcggaa      2281 gagatatcgc ggatacaaca gacgctgtca gagatccgca aaccttggag atcctagata      2341 tcaccccgtg ttctttcggt ggtgtctctg taattactcc gggaacgaac acctccaatc      2401 aagtagcggt actataccag gacgtgaact gtacagaagt accggtagct attcacgcgg      2461 atcaactaac accaacttgg agagtgtact ccaccggatc taacgtattc caaacaagag      2521 cgggatgtct aatcggagcg gaacacgtaa acaactccta cgaatgtgat atcccgattg      2581 gagcgggaat ctgtgcgtct taccaaacac aaacaaactc cccgagaaga gcgagatctg      2641 tagcctctca atctattatc gcctacacca tgtccttggg agccgaaaat tctgtcgcgt      2701 actccaacaa ttctatcgcg atcccgacaa acttcaccat ctctgtaaca accgagatcc      2761 taccggtgtc tatgaccaag acatctgtcg attgcaccat gtacatctgc ggagattcca      2821 ccgagtgctc caacctacta ctacagtacg gatctttctg tacccagcta aacagagcgt      2881 tgactggaat cgctgtagag caggataaga acacccaaga ggtattcgcg caagtcaagc      2941 agatctataa gactccgccg atcaaggact tcggaggttt taacttctct cagatcttgc      3001 cggatccgtc caaaccgtct aagagatctt tcatcgagga cctactattc aacaaagtca      3061 ccctagctga cgcgggattc atcaaacaat acggagattg cttgggagac attgcggcga      3121 gagatctaat ttgcgcgcag aagtttaacg gattgacagt actaccgccg ctactaaccg      3181 atgagatgat tgcgcagtac acgtctgctc tattggcggg aacaattaca agtggatgga      3241 catttggagc cggtgccgct ctacaaattc cgtttgctat gcaaatggcg tacagattca      3301 acggaatcgg agtaacccag aacgtcttgt acgagaacca gaagctaatc gcgaaccagt      3361 tcaattccgc gatcggaaag atccaggaca gtctatcttc tactgcttcg gcgttgggaa      3421 agctacagga tgtagtaaat caaaacgcgc aggcgctaaa caccttggtc aagcaactat      3481 cctctaactt cggagcgatc tcgtccgtcc taaacgacat cttatccaga ctagataagg      3541 tcgaagcgga ggtccagatc gatagactaa tcactggaag attgcagtcc ctacagacct      3601 acgtaacaca gcaactaatt agagcggcgg agattagagc ctctgctaat ctagctgcga      3661 ccaagatgtc cgaatgtgtc ttgggacaat ccaagagagt cgacttttgc ggaaagggat      3721 accacctaat gtcttttcca caatctgcgc cgcatggtgt cgtattccta catgtaacat      3781 atgtgccggc gcaagaaaag aactttacaa cagctccagc gatctgccat gatggaaaag      3841 ctcattttcc gagagaggga gtctttgtct ctaacggaac tcattggttc gtcacccaga      3901 gaaactttta cgagccgcag atcatcacca ccgacaacac atttgtttcg ggaaactgcg      3961 acgtggtcat cggaatcgta aacaataccg tctacgatcc gttgcagccg gaactagact      4021 ccttcaaaga agagttggac aagtacttta agaaccacac ctctccggat gtcgacttgg      4081 gagatatttc tggaatcaac gcgtccgtcg tcaacatcca gaaagaaatc gatagattga      4141 acgaggtcgc gaagaacttg aacgagtccc taatcgacct acaagagcta ggaaaatacg      4201 agcagtacat caagtggccg tggtacattt ggctaggatt cattgctgga ctaattgcga      4261 tcgtcatggt caccatcatg ctatgctgta tgacctcctg ttgctcctgt ctaaagggat      4321 gttgttcctg cggatcctgt tgcaagttcg atgaagatga tagtgaaccg gtcctaaagg      4381 gtgtcaagct acactacaca taaaagcttg tcgactaaaa tagtttaact cttttaaaac      4441 cagtttggta ctggaatttc agttcattac tcgttgagaa attgatgatt tttttaaaat      4501 gatattactt ttatatgctt gcatcgcaga atgatattca caagtattat taaaaatgag      4561 tatcggtagt tacattacca tatcatccat gctcatatgg atctccatcc attatataat      4621 caatgataca tgtattaaaa tactttccga ataagtcttt taaatattgt attaattatg      4681 aaaaactatg ctatgcgagt atgatgcaaa gatgtttaat gatacgatac tagattttat      4741 ctctagcgag agatgtcgtt agaatcattt atcataacta cgtttaataa taattcatca      4801 acgaatatcg ataacatgtg tcatttatac tttaaatacg ttaaagtctg tccgtcttct      4861 ctattgttta gactgtttgt agaatgctgt gatataaaca aactagtaga aggta
HPXV Delta TK左臂及右臂之核苷酸序列(SEQ ID NO: 62) 1 atttacggat tcaccaataa aaataaacta gagaaactta gtactaataa ggaactagaa        61 tcgtatagtt ctagccctct tcaagaaccc attaggttaa atgattttct gggactattg       121 gaatgtatta aaaagaatat tcctctaaca gatattccga caaaggattg attactataa       181 atggagaatg ttcctaatgt atactttaat cctgtgttta tagagcccac gtttaaacat       241 tctttattaa gtgtttataa acacagatta atagttttat ttgaagtatt cattgtattc       301 attctaatat atgtattttt tagatctgaa ttaaatatgt tcttcatgcc taaacgaaaa       361 atacccgatc ctattgatag attacgacgt gctaatctag cgtgtgaaga cgataagtta       421 atgatctatg gattaccatg gatgacaact caaacatctg cgttatcaat aaatagtaaa       481 ccgatagtgt ataaagattg tgcaaagctt ttgcgatcaa taaatggatc acaaccagta       541 tctcttaacg atgttcttcg cagatgatga ttcatttttt aagtatttgg ctagtcaaga       601 tgatgaatct tcattatctg atatattgca aatcactcaa tatctagact ttctgttatt       661 attattgatc caatcaaaaa ataaattaga agccgtgggt cattgttatg aatctctttc       721 agaggaatac agacaattga caaaattcac agactttcaa gattttaaaa aactgtttaa       781 caaggtccct attgttacag atggaagggt caaacttaat aaaggatatt tgttcgactt       841 tgtgattagt ttgatgcgat tcaaaaaaga atcctctcta gctaccaccg caatagatcc       901 tattagatac atagatcctc gtcgtgatat cgcattttct aacgtgatgg atatattaaa       961 gttgaataaa gtgaacaata attaattctt tattgtcatc tattatattt tttatctaaa      1021 aaactaaaaa taaacattga ttaaatttta atataatact taaaaatgga tgttgtgtcg      1081 ttagataaac cgtttatgta ttttgaggaa attgataatg agttagatta cgaaccagaa      1141 agtgcaaatg aggtcgcaaa aaaactaccg tatcaaggac agttaaaact attactagga      1201 gaattatttt ttcttagtaa gttacagcga cacggtatat tagatggtgc caccgtagtg      1261 tatataggat cggctcctgg tacacatata cgttatttga gagatcattt ctataattta      1321 ggaatgatta tcaaatggat gctaattgac ggacgccatc atgatcctat tctaaatgga      1381 ttgcgtgatg tgactctagt gactcggttc gttgatgagg aatatctacg atccatcaaa      1441 aaacaactgc atccttctaa gattatttta atttctgatg taagatccaa acgaggagga      1501 aatgaaccta gtacggcgga tttactaagt aattacgctc tacaaaatgt catgattagt      1561 attttaaacc ccgtggcatc tagtcttaaa tggagatgcc cgtttccaga tcaatggatc      1621 aaggactttt atatcccaca cggtaataaa atgttacaac cttttgctcc ttcatattca      1681 gctgaaatga gattattaag tatttatacc ggtgagaaca tgagactgac tcgagttacc      1741 aaattagacg ctgtaaatta tgaaaaaaag atgtactacc ttaataagat cgtccgtaac      1801 aaagtagttg ttaactttga ttatcctaat caggaatatg actattttca catgtacttt      1861 atgctgagga ccgtatactg caataaaaca tttcctacta ctaaagcaaa ggtactattt      1921 ctacaacaat ctatatttcg tttcttaaat attccaacaa catcaactga aaaagttagt      1981 catgaaccaa tacaacgtaa
HPXV_COVID-19_Spike_Delta_T5NT之核苷酸序列(SEQ ID NO: 63) 1 atttacggat tcaccaataa aaataaacta gagaaactta gtactaataa ggaactagaa        61 tcgtatagtt ctagccctct tcaagaaccc attaggttaa atgattttct gggactattg       121 gaatgtatta aaaagaatat tcctctaaca gatattccga caaaggattg attactataa       181 atggagaatg ttcctaatgt atactttaat cctgtgttta tagagcccac gtttaaacat       241 tctttattaa gtgtttataa acacagatta atagttttat ttgaagtatt cattgtattc       301 attctaatat atgtattttt tagatctgaa ttaaatatgt tcttcatgcc taaacgaaaa       361 atacccgatc ctattgatag attacgacgt gctaatctag cgtgtgaaga cgataagtta       421 atgatctatg gattaccatg gatgacaact caaacatctg cgttatcaat aaatagtaaa       481 ccgatagtgt ataaagattg tgcaaagctt ttgcgatcaa taaatggatc acaaccagta       541 tctcttaacg atgttcttcg cagatgatga ttcatttttt aagtatttgg ctagtcaaga       601 tgatgaatct tcattatctg atatattgca aatcactcaa tatctagact ttctgttatt       661 attattgatc caatcaaaaa ataaattaga agccgtgggt cattgttatg aatctctttc       721 agaggaatac agacaattga caaaattcac agactttcaa gattttaaaa aactgtttaa       781 caaggtccct attgttacag atggaagggt caaacttaat aaaggatatt tgttcgactt       841 tgtgattagt ttgatgcgat tcaaaaaaga atcctctcta gctaccaccg caatagatcc       901 tattagatac atagatcctc gtcgtgatat cgcattttct aacgtgatgg atatattaaa       961 gttgaataaa gtgaacaata attaattctt tattgtcatc ttttattttt tttttttgga      1021 atataaatat ccggtaaaat tgaaaaaata tacactaatt agcgtctcgt ttcagacgct      1081 agctcgaggt tgggagctct ccggatccaa gcttatcgat ttcgaacccg gggtaccgaa      1141 ttcctcgagg ttgggagctc tccggatcca agcttatcga tttcgaaccc ggggtaccga      1201 attcctcgag atgtttgttt tccttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa      1261 tcttacaacc agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta      1321 ttaccctgac aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc      1381 tttcttttcc aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa      1441 gaggtttgat aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa      1501 gtctaacata ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct      1561 acttattgtt aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa      1621 tgatccattt ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt      1681 cagagtttat tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat      1741 ggaccttgaa ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat      1801 tgatggttat tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc      1861 tcagggtttt tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag      1921 gtttcaaact ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg      1981 ttggacagct ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt      2041 aaaatataat gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc      2101 agaaacaaag tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa      2161 ctttagagtc caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc      2221 ttttggtgaa gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag      2281 aatcagcaac tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt      2341 taagtgttat ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc      2401 agattcattt gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa      2461 gattgctgat tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa      2521 ttctaacaat cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag      2581 gaagtctaat ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag      2641 cacaccttgt aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt      2701 ccaacccact aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact      2761 tctacatgca ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa      2821 atgtgtcaat ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa      2881 aaagtttctg cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg      2941 tgatccacag acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt      3001 tataacacca ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg      3061 cacagaagtc cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc 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atttgctatg caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta      3961 tgagaaccaa aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc      4021 actttcttcc acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca      4081 agctttaaac acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt      4141 aaatgatatc ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat      4201 cacaggcaga cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga      4261 aatcagagct tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc      4321 aaaaagagtt gatttctgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc      4381 tcatggtgta gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac      4441 tgctcctgcc atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc      4501 aaatggcaca cactggtttg taacacaaag gaacttttat gaaccacaaa tcattactac      4561 agacaacaca tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt      4621 ttatgatcct ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa      4681 gaatcataca tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt      4741 aaacattcaa aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct      4801 catcgatctc caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg      4861 gctaggtttt atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat      4921 gaccagttgc tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga      4981 tgaagacgac tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aatattatat      5041 tttttatcta aaaaactaaa aataaacatt gattaaattt taatataata cttaaaaatg      5101 gatgttgtgt cgttagataa accgtttatg tattttgagg aaattgataa tgagttagat      5161 tacgaaccag aaagtgcaaa tgaggtcgca aaaaaactac cgtatcaagg acagttaaaa      5221 ctattactag gagaattatt ttttcttagt aagttacagc gacacggtat attagatggt      5281 gccaccgtag tgtatatagg atcggctcct ggtacacata tacgttattt gagagatcat      5341 ttctataatt taggaatgat tatcaaatgg atgctaattg acggacgcca tcatgatcct      5401 attctaaatg gattgcgtga tgtgactcta gtgactcggt tcgttgatga ggaatatcta      5461 cgatccatca aaaaacaact 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HPXV_SARS_Ad_Spike_Delta_T5NT之核苷酸序列(SEQ ID NO: 64) 1 atttacggat tcaccaataa aaataaacta gagaaactta gtactaataa ggaactagaa        61 tcgtatagtt ctagccctct tcaagaaccc attaggttaa atgattttct gggactattg       121 gaatgtatta aaaagaatat tcctctaaca gatattccga caaaggattg attactataa       181 atggagaatg ttcctaatgt atactttaat cctgtgttta tagagcccac gtttaaacat       241 tctttattaa gtgtttataa acacagatta atagttttat ttgaagtatt cattgtattc       301 attctaatat atgtattttt tagatctgaa ttaaatatgt tcttcatgcc taaacgaaaa       361 atacccgatc ctattgatag attacgacgt gctaatctag cgtgtgaaga cgataagtta       421 atgatctatg gattaccatg gatgacaact caaacatctg cgttatcaat aaatagtaaa       481 ccgatagtgt ataaagattg tgcaaagctt ttgcgatcaa taaatggatc acaaccagta       541 tctcttaacg atgttcttcg cagatgatga ttcatttttt aagtatttgg ctagtcaaga       601 tgatgaatct tcattatctg atatattgca aatcactcaa tatctagact ttctgttatt       661 attattgatc caatcaaaaa ataaattaga agccgtgggt cattgttatg aatctctttc       721 agaggaatac agacaattga caaaattcac agactttcaa gattttaaaa aactgtttaa       781 caaggtccct attgttacag atggaagggt caaacttaat aaaggatatt tgttcgactt       841 tgtgattagt ttgatgcgat tcaaaaaaga atcctctcta gctaccaccg caatagatcc       901 tattagatac atagatcctc gtcgtgatat cgcattttct aacgtgatgg atatattaaa       961 gttgaataaa gtgaacaata attaattctt tattgtcatc ttttattttt tttttttgga      1021 atataaatat ccggtaaaat tgaaaaaata tacactaatt agcgtctcgt ttcagacgct      1081 agctcgaggt tgggagctct ccggatccaa gcttatcgat ttcgaacccg gggtaccgaa      1141 ttcctcgagg ttgggagctc tccggatcca agcttatcga tttcgaaccc ggggtaccga      1201 attcctcgag atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga      1261 ccggtgcacc acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat      1321 gaggggggtt tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga      1381 tttatttctt ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg      1441 caaccctgtc atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt      1501 tgtccgtggt tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag 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synVACV_SARS_Ad_Spike_deltaT5NT之核苷酸序列(SEQ ID NO: 65) 1 atttacggat tcaccaataa aaataaacta gagaaactta gtactaataa ggaactagaa        61 tcgtatagtt ctagccctct tcaagaaccc attaggttaa atgattttct gggactattg       121 gaatgtgtta aaaagaatat tcctctaaca gatattccga caaaggattg attactataa       181 atggagaatg ttcctaatgt atactttaat cctgtgttta tagagcccac gtttaaacat       241 tctttattaa gtgtttataa acacagatta atagttttat ttgaagtatt cgttgtattc       301 attctaatat atgtattttt tagatctgaa ttaaatatgt tcttcatgcc taaacgaaaa       361 atacccgatc ctattgatag attacgacgt gctaatctag cgtgtgaaga cgataaatta       421 atgatctatg gattaccatg gatgacaact caaacatctg cgttatcaat aaatagtaaa       481 ccgatagtgt ataaagattg tgcaaagctt ttgcgatcaa taaatggatc acaaccagta       541 tctcttaacg atgttcttcg cagatgatga ttcatttttt aagtatttgg ctagtcaaga       601 tgatgaatct tcattatctg atatattgca aatcactcaa tatctagact ttctgttatt       661 attattgatc caatcaaaaa ataaattaga agccgtgggt cattgttatg aatctctttc       721 agaggaatac agacaattga caaaattcac 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     3121 aggagctgag catgtcgaca cttcttatga gtgcgacatt cctattggag ctggcatttg      3181 tgctagttac catacagttt ctttattacg tagtactagc caaaaatcta ttgtggctta      3241 tactatgtct ttaggtgctg atagttcaat tgcttactct aataacacca ttgctatacc      3301 tactaacttt tcaattagca ttactacaga agtaatgcct gtttctatgg ctaaaacctc      3361 cgtagattgt aatatgtaca tctgcggaga ttctactgaa tgtgctaatt tgcttctcca      3421 atatggtagc ttttgcacac aactaaatcg tgcactctca ggtattgctg ctgaacagga      3481 tcgcaacaca cgtgaagtgt tcgctcaagt caaacaaatg tacaaaaccc caactttgaa      3541 atattttggt ggttttaatt tttcacaaat attacctgac cctctaaagc caactaagag      3601 gtcttttatt gaggacttgc tctttaataa ggtgacactc gctgatgctg gcttcatgaa      3661 gcaatatggc gaatgcctag gtgatattaa tgctagagat ctcatttgtg cgcagaagtt      3721 caatggactt acagtgttgc cacctctgct cactgatgat atgattgctg cctacactgc      3781 tgctctagtt agtggtactg ccactgctgg atggacattt ggtgctggcg ctgctcttca      3841 aatacctttt gctatgcaaa tggcatatag gttcaatggc attggagtta cccaaaatgt      3901 tctctatgag aaccaaaaac aaatcgccaa ccaatttaac aaggcgatta gtcaaattca      3961 agaatcactt acaacaacat caactgcatt gggcaagctg caagacgttg ttaaccagaa      4021 tgctcaagca ttaaacacac ttgttaaaca acttagctct aattttggtg caatttcaag      4081 tgtgctaaat gatatccttt cgcgacttga taaagtcgag gcggaggtac aaattgacag      4141 gttaattaca ggcagacttc aaagccttca aacctatgta acacaacaac taatcagggc      4201 tgctgaaatc agggcttctg ctaatcttgc tgctactaaa atgtctgagt gtgttcttgg      4261 acaatcaaaa agagttgact tttgtggaaa gggctaccac cttatgtcct tcccacaagc      4321 agccccgcat ggtgttgtct tcctacatgt cacgtatgtg ccatcccagg agaggaactt      4381 caccacagcg ccagcaattt gtcatgaagg caaagcatac ttccctcgtg aaggtgtttt      4441 cgtgtttaat ggcacttctt ggtttattac acagaggaac ttcttttctc cacaaataat      4501 tactacagac aatacatttg tctcaggaaa ttgtgatgtc gttattggca tcattaacaa      4561 cacagtttat gatcctctgc aacctgagct cgactcattc aaagaagagc tggacaagta      4621 cttcaaaaat catacatcac cagatgttga tcttggcgac atttcaggca ttaacgcttc      4681 tgtcgtcaac attcaaaaag aaattgaccg cctcaatgag gtcgctaaaa atttaaatga      4741 atcactcatt gaccttcaag aattgggaaa atatgagcaa tatattaaat ggccttggta      4801 tgtttggctc ggcttcattg ctggactaat tgccatcgtc atggttacaa tcttgctttg      4861 ttgcatgact agttgttgca gttgcctcaa gggtgcatgc tcttgtggtt cttgctgcaa      4921 gtttgatgag gatgactctg agccagttct caagggtgtc aaattacatt acacataata      4981 ttatattttt tatctaaaaa actaaaaata aacattgatt aaattttaat ataatactta      5041 aaaatggatg ttgtgtcgtt agataaaccg tttatgtatt ttgaggaaat tgataatgag      5101 ttagattacg aaccagaaag tgcaaatgag gtcgcaaaaa aactgccgta tcaaggacag      5161 ttaaaactat tactaggaga attatttttt cttagtaagt tacagcgaca cggtatatta      5221 gatggtgcca ccgtagtgta tataggatct gctcccggta cacatatacg ttatttgaga      5281 gatcatttct ataatttagg agtgatcatc aaatggatgc taattgacgg ccgccatcat      5341 gatcctattt taaatggatt gcgtgatgtg actctagtga ctcggttcgt tgatgaggaa      5401 tatctacgat ccatcaaaaa acaactgcat ccttctaaga ttattttaat ttctgatgtg      5461 agatccaaac gaggaggaaa tgaacctagt acggcggatt tactaagtaa ttacgctcta      5521 caaaatgtca tgattagtat tttaaacccc gtggcatcta gtcttaaatg gagatgcccg      5581 tttccagatc aatggatcaa ggacttttat atcccacacg gtaataaaat gttacaacct      5641 tttgctcctt catattcagc tgaaatgaga ttattaagta tttataccgg tgagaacatg      5701 agactgactc gagttaccaa attagacgct gtaaattatg aaaaaaagat gtactacctt      5761 aataagatcg tccgtaacaa agtagttgtt aactttgatt atcctaatca ggaatatgac      5821 tattttcaca tgtactttat gctgaggacc gtgtactgca ataaaacatt tcctactact      5881 aaagcaaagg tactatttct acaacaatct atatttcgtt tcttaaatat tccaacaaca      5941 tcaactgaaa aagttagtca tgaaccaata caacgtaa
實例 實例 1. 產生合成馬痘病毒
根據揭示於2018/0251736中之方法產生合成馬痘病毒(scHPXV)，其以全文引用之方式併入本文中。
合成HPXV基因體之設計係基於先前所描述之HPXV基因體序列(病毒株MNR-76；GenBank寄存號DQ792504) (Tulman ER, Delhon G, Afonso CL, Lu Z, Zsak L, Sandybaev NT,等人，Genome of horsepox virus. Journal of virology. 2006;80(18):9244-58)。212,633 bp基因體分成10個重疊片段。此等片段經設計使得其與每一鄰接片段共用至少1.0 kbp重疊序列(亦即同源性)，以提供同源重組將驅動全長基因體之組裝的位點。所產生片段展示於表 2 中。此等重疊序列將提供充足同源性以在共轉染片段之間準確地進行重組。表 2 ：用於產生合成HPXV之HPXV基因體片段。指示每一片段之大小及在HPXV基因體內之位置。
片段名稱 大小(bp) HPXV [DQ792504] 內之位置(bp)
GA_左ITR (SEQ ID NO: 15) 10,095 41 - 10,135
GA_片段1A (SEQ ID NO: 16) 16,257 8505 - 24,761
GA_片段1B (SEQ ID NO: 17) 16,287 23764 - 40,050
GA_片段2 (SEQ ID NO: 18) 31,946 38,705 - 70,650
GA_片段3 (SEQ ID NO: 19) 25,566 68,608 - 94,173
GA_片段4 (SEQ ID NO: 20) 28,662 92,587 - 121,248
GA_片段5 (SEQ ID NO: 21) 30,252 119,577 - 149,828
GA_片段6 (SEQ ID NO: 22) 30,000 147,651 - 177,650
GA_片段7 (SEQ ID NO: 23) 28,754 176,412 - 205,165
GA_右ITR (SEQ ID NO: 24) 8,484 204,110 - 212,593
所得合成HPXV已以寄存編號KY349117寄存於GenBank中。
將痘病毒早期晚期啟動子控制下之yfp/gpt卡匣引入至GA_片段_3內之HPXV095/J2R基因座中，使得在螢光顯微鏡下將容易觀察到HPXV (scHPXV YFP-gpt::095)之再活化。先前已描述SFV催化之痘病毒DNA之重組及再活化以組裝重組痘病毒(Yao XD等人Journal of virology. 2003;77(13):7281-90；及Yao XD等人Methods Mol Biol. 2004;269:51-64；每一者之全部揭示內容以引用之方式併入本文中)。若干生物學特徵使其成為引人注目之模型系統。第一，SFV具有較窄的宿主範圍，高效地感染家兔細胞及某些猴細胞株，如BGMK。其可感染如BSC-40之細胞，但在該等細胞上生長極差。第二，與正痘病毒相比，其生長得更慢，需要約4至5天以在單層細胞中形成轉化「病灶」，此為與在培養1至2天內產生溶菌斑的正痘病毒極不同的特徵。野兔痘病毒與正痘病毒之間的此生長差異允許藉由在BGMK細胞中執行再活化分析且將後代接種於BSC-40細胞上來區分此等病毒。在一些實施例中，可使用其他輔助病毒(諸如(但不限於)禽痘病毒)。在一些實施例中，可使用不同細胞組合。
BGMK細胞以0.5的MOI經感染SFV且接著在2 h後用5 μg經消化之GA_HPXV片段轉染。轉染後五天，所有感染性粒子藉由細胞裂解回收且再接種於BSC-40細胞上，BSC-40細胞僅高效地支持HPXV生長。在螢光顯微鏡下觀測所得再活化之scHPXV YFP-gpt::095溶菌斑。觀測係藉由Frag_3內之HPXV095/J2R基因座中之yfp/gpt可選標記實現。在轉染48 h內，在BSC-40單層中偵測到病毒溶菌斑。回收scHPXV YFP-gpt::095之效率視多種因素而定，包括DNA轉染效率，但範圍至多為數個PFU/μg轉染DNA。
將痘病毒早期晚期啟動子控制下之yfp/gpt卡匣也引入至GA_片段_7內之HPXV200基因座中，使得在螢光顯微鏡下將容易觀測HPXV (scHPXV YFP-gpt::200)之再活化。先前已描述SFV催化之痘病毒DNA之重組及再活化以組裝重組痘病毒(Yao XD等人Journal of virology. 2003;77(13):7281-90；及Yao XD等人Methods Mol Biol. 2004;269:51-64；每一者之全部揭示內容以引用之方式併入本文中)。若干生物學特徵使其成為引人注目之模型系統。第一，SFV具有較窄的宿主範圍，高效地感染家兔細胞及某些猴細胞株，如BGMK。其可感染如BSC-40之細胞，但在該等細胞上生長極差。第二，與正痘病毒屬相比，其生長更慢，需要約4至5天以在單層細胞中形成轉化「病灶」，此為與1至2天內在培養物中產生溶菌斑之正痘病毒屬極不同的特徵。野兔痘病毒與正痘病毒之間的此生長差異允許藉由在BGMK細胞中執行再活化分析且將後代接種於BSC-40細胞上來區分此等病毒。在一些實施例中，可使用其他輔助病毒(諸如(但不限於)禽痘病毒)。在一些實施例中，可使用不同細胞組合。
BGMK細胞以0.5的MOI經SFV感染且接著在2小時後用5 μg經消化之GA_HPXV片段轉染。轉染後五天，所有感染性粒子藉由細胞裂解回收且再接種於BSC-40細胞上，BSC-40細胞僅高效地支持HPXV生長。在螢光顯微鏡下觀測所得再活化之scHPXV YFP-gpt::200溶菌斑。觀測係藉由Frag_7內之HPXV200基因座中之yfp/gpt可選標記實現。在轉染48小時內，在BSC-40單層中偵測到病毒溶菌斑。回收scHPXV YFP-gpt::200之效率視多種因素而定，包括DNA轉染效率，但範圍至多為數個PFU/μg轉染之DNA。實例 2. 產生合成痘瘡病毒 ， 病毒株 ACAM2000
使用揭示於WO 2019/213452中之方法產生合成痘瘡病毒ACAM2000，該申請案以全文引用之方式併入本文中。
合成VACV (synVACV)基因體之設計係基於先前所描述之VACV ACAM2000基因體序列[GenBank寄存號AY313847] (Osborne JD等人. Vaccine. 2007; 25(52):8807-32)。基因體經劃分成9個重疊片段(圖1)。此等片段經設計使得其與每一鄰接片段共用至少1.0 kbp重疊序列(亦即同源性)，以提供同源重組將驅動全長基因體之組裝的位點(表 3 )。此等重疊序列提供足夠同源性以在共轉染片段之間準確地進行重組(Yao XD, Evans DH. Journal of Virology. 2003;77(13):7281-90)。表 3 ： 用於此研究之VACV ACAM2000基因體片段。描述VACV ACAM2000基因體[GenBank寄存號AY313847]中之大小及序列。
片段名稱 大小(bp) 序列
GA_LITR ACAM2000 18,525 SEQ ID NO: 25
GA_FRAG_1 ACAM2000 24,931 SEQ ID NO: 26
GA_FRAG_2 ACAM2000 23,333 SEQ ID NO: 27
GA_FRAG_3 ACAM2000 26,445 SEQ ID NO: 28
GA_FRAG_4 ACAM2000 26,077 SEQ ID NO: 29
GA_FRAG_5 ACAM2000 24,671 SEQ ID NO: 30
GA_FRAG_6 ACAM2000 25,970 SEQ ID NO: 31
GA_FRAG_7 ACAM2000 28,837 SEQ ID NO: 32
GA_RITR ACAM2000 17,641 SEQ ID NO: 33
所得合成VACV, ACAM 2000已以寄存編號MN974381寄存於GenBank中。實例 3. 產生經工程改造之 SARS-CoV-2 S 蛋白質
合成HPXV (寄存編號KY349117)與合成VACV (寄存編號MN974381)之核苷酸序列比對指示整個4 Kb TK基因座之99%核苷酸序列一致性及TK基因序列之共線性(開始與停止)，其用於構築ΔTK插入基因座或敲除TK基因座。參見圖 3 。
TK基因對於組織培養中之病毒複製為非必需的。亦提供在核苷酸類似物5-溴脫氧尿苷(5-BrdU)存在下用於所關注之外源基因及選擇標記物(TK-)之穩定插入位點。
由於合成HPXV與合成VACV之間的高水準序列一致性，用於產生含有啟動子/基因序列之表現卡匣之PCR序列操控允許使用具有兩個不同救援病毒之相同表現卡匣。為救援包含經工程改造之SARS-CoV-2 S蛋白質之經轉染PCR片段，病毒特異性序列(重組左側臂及右側臂，分別對應於HPXV094及HPXV096)允許將表現卡匣重組至病毒TK基因座中。參見圖 2 及圖 5 。
執行不同SARS-CoV-2分離物之刺突(S)基因的核苷酸序列比對。經比對之病毒分離物為藉助以下寄存編號發佈之病毒分離物：NC045512.2、LC521925.1、MN988668.1、MN985325.1、MN975262.1、MN938384.1、LR757998.1、LR757996.1、LR757995.1及MN908947.3。S基因之比對指示不同病毒分離物之S基因之間的核苷酸量下之100%同源性。所有病毒分離物序列為具有來自中國、日本(Japan)及美國之完整基因體序列條目之分離物。來自分離物序列分析之早期指示似乎指示極小病毒漂移。然而，若最終觀測到漂移，則相同技術可用於經修飾病毒及其蛋白質及核酸序列。
編碼SARS-CoV-2之S蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 47中所闡述之核苷酸序列。SARS-CoV-2未經充分調適用於感染小鼠。因此，引入基因體自適應性突變以調適用於感染小鼠之病毒。特定言之，引入核苷酸序列之突變，該突變產生包含Y459H取代之S蛋白質。表 4 展示SARS-CoV病毒之基因體自適應性突變，該等突變可經調適且引入至SARS-CoV-2病毒之其他區域中。參見Roberts A等人PLoS Pathog. 2007年1月;3(1):e5. 數位物件識別碼：10.1371。
表 4 中列出發現於由十五個通道產生之SARS-CoV病毒(且所得病毒稱作MA15)中且在鼻內接種之後對小鼠為致死性之六種突變。表 4 中之標記如下：ORFa ：開放閱讀框；CDSb ：編碼序列，與蛋白質之胺基酸序列對應之核苷酸序列(位置包括開始及終止密碼子)；nspc ：非結構性蛋白質，ORF 1ab之裂解產物；Mainpro ：主要類3C蛋白酶；Hel：解螺旋酶；RBMd ：受體結合基元(胺基酸424-494)。表 4. SARS-CoV 病毒中之基因體 自適應性突變
   相較於 SARS-CoV (Urbani) ， MA15 中之 突變輪
ORFa CDSb 核苷酸變化 SARS-CoV 蛋白質中之胺基酸變化
1a 265-13413 * 10384 C-＞T H133Y nsp5 fMainpro )c
      * 10793 A-＞C E269A nsp5 (Mainpro )'
      *12814 A-＞G T67A nsp9c
1b 13398-21485 * 16177 C-＞T A4V nsp 13 (Hel)c
S 21492-25259 * 22797 T-＞C Y436H刺突蛋白-RBMd
M 26398-27063 * 26428 G-＞A E11K M蛋白質
在本發明之一個實施例中，為高效表現來自痘病毒載體之轉殖基因，應經由編碼沈默突變誘發來移除含有痘瘡早期轉錄終止信號(ETTS)之異源基因編碼序列，以在感染之早期階段產生全長轉錄本。此等序列具有以下序列：TTTTTNT (T5NT)；SEQ ID NO: 14。移除S蛋白編碼序列中之ETTS可積極地影響穩固免疫反應之產生。參見Earl PL等人J Virol. 1990年5月;64(5):2448-51。
本發明之其他實施例中之S蛋白質(SEQ ID NO: 47)中引入的其他突變之實例為以下：D614G、S943P、K986P及V987P。此等突變中之一或多者可引入彼等實施例中之S蛋白質中。
在經感染細胞之細胞質中發生痘病毒複製。病毒在複製循環期間並不進入經感染細胞之細胞核中且因此並不利用宿主細胞轉錄設備。由於複製之細胞質位置，痘病毒編碼其自身包括病毒RNA聚合酶之轉錄機構()及其自身調節啟動子識別信號。因此，為了真核之高表現量，必須自痘病毒啟動子驅動轉殖基因表現。痘病毒基因表現係由早期、中期及晚期啟動子控制且可定義為早期(感染前8小時)及後期(感染後8小時)。DNA合成發生在感染後8小時且稱為開始晚期基因表現之時間邊界。最高的轉殖基因抗原負荷量通常經由使用早期及晚期啟動子信號的組合達成。用於控制S蛋白質之轉錄之啟動子為包含序列(TTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATATCCGGTAAAATTGAAAAAATA SEQ ID NO: 8)之重疊合成早期/晚期啟動子，該序列包括早期啟動子之160個核苷酸長之間隔子3'且在RNA起始位點與ATG (SEQ ID NO: 42)之間。參見圖 9 。參見Di Pilato等人，Journal of General Virology (2015), 96, 2360-2371；其以全文引用之方式併入本文中。似乎大於50 nt之間隔子將為轉錄機構提供更大間隔，可能加速基因表現，且大於99 nt之間隔子為早期基因表現提供優勢。
所產生之表現卡匣包含經調適用於小鼠感染且其中已在重疊串聯的早期/晚期啟動子之轉錄下移除且控制ETTS序列的經工程改造之SARS-CoV-2 S蛋白質。實例 4. 產生包含經工程改造之 SARS-CoV-2 S 蛋白質之重組痘病毒
產生包含SARS-CoV-2病毒之S蛋白質之重組馬痘病毒的例示性方法經展示於圖 6 及圖 7 中且包含： (a)       如上文所描述，使細胞(例如，Vero細胞或BSC-40細胞)感染救援合成馬痘病毒及救援合成VACV。 (b)       感染後24小時執行使經感染細胞(例如，Vero細胞或BSC-40細胞)轉染有包含「經工程改造之SARS-CoV-2 S基因表現卡匣」之PCR產生的核苷酸片段。表現卡匣之重組經由左右側接臂發生且將表現卡匣插入至TK基因座中。因此，敲除HPXV-095 TK基因座且將表現卡匣插入於TK基因座中。在25℃下30 min之後，添加7.2 ml含有8%胎牛血清之Eagle培養基且在37℃下培育單層3.5小時。接著移除培養基且替換為8 ml含8%胎牛血清之新製Eagle培養基且在37℃下持續培育兩天。自瓶中刮下細胞，藉由離心(2,000×g，5 min)沈澱且再懸浮於0.5 ml含有2.5%胎牛血清之Eagle培養基中。 (c)       感染後48小時採集經轉染細胞且在冷凍/解凍重複循環下釋放包含經工程改造之SARS-CoV-2 S基因之重組合成馬痘病毒及合成VACV的後代病毒。 (d)       選擇重組病毒。藉由用含有25 μg/ml BrdU之1%低熔點瓊脂糖覆蓋下在TK− 細胞(例如，TK− Vero細胞或TK− BSC-40細胞)中進行溶菌斑分析來選擇胸苷激酶陰性痘病毒重組體。在37℃下三天之後，細胞單層經0.005%中性紅染色，使用無菌巴斯德吸管(Pasteur pipette)拾取溶菌斑且置放於0.5 ml含有2.5%胎牛血清之Eagle培養基中。藉由TK− 細胞之生長鑑別重組病毒後代。若SARS-CoV-2 S基因已經插入至病毒胸苷激酶(TK)基因中，則含有經插入DNA之病毒將為TK− 且可基於此依據來選擇(Mackett等人，(1982))。藉由PCR序列分析執行S基因之確認。
一旦已鑑別出重組痘病毒，則可使用多種方法來分析由經插入基因編碼之多肽的表現。此等方法包括(但不限於)黑色溶菌斑分析(在病毒溶菌斑上執行之原位酶免疫分析法)、西方墨點分析、放射免疫沈澱(RIPA)及酶免疫分析(EIA)。可使用識別SARS-CoV-2 S之抗體。
包含編碼SARS-CoV-2病毒S蛋白質之核酸的合成馬痘病毒的一個實施例之序列為SEQ ID NO: 43。包含編碼SARS-CoV-2病毒S蛋白質之核酸的合成痘瘡病毒的一個實施例之序列為SEQ ID NO: 44。實例 5. 使小鼠免疫接種有包含經工程改造之 SARS-CoV-2 S 蛋白質之重組痘病毒
由10日齡胚胎製備之初代雞胚胎纖維母細胞(CEF)細胞在補充有10% FBS之最低必需培養基中生長且用於繁殖及滴定重組痘病毒。
BALB/c小鼠係經由劃痕法、經鼻內、肌肉內或皮下接種進行一次性(one-shot)及初打-加打(prime-boost)疫苗接種105 、106 、107 或108 PFU之表現SARS-CoV-2蛋白質之重組合成馬痘病毒來進行免疫。接種非重組病毒(WT)或磷酸鹽緩衝鹽水(模擬物)之動物用作對照。
免疫接種之後四週，動物係藉由如所描述之104 組織培養50%感染性劑量(TCID50 )之SARS-CoV-2進行鼻內攻擊。(Subbarao, K等人(2004) J. Virol. 78, 3572-3577)。兩天後，移除每組中之四個動物之肺及鼻甲骨且測定SARS-CoV-2效價。實例 6. 使人類免疫接種有重組痘病毒經工程改造之 SARS-CoV-2 S 蛋白質
處於感染SARS-CoV-2 S蛋白質風險下之個體通常使用本發明之重組痘病毒經工程改造之SARS-CoV-2 S蛋白質經由用分叉針進行劃痕來疫苗接種至上臂中(標準劑量，2.5×105 至12.5×105 個溶菌斑形成單位)。重組痘病毒經工程改造之SARS-CoV-2 S蛋白質亦可以單一劑量一次性疫苗(例如，1×106 PFU TNX-1800)形式投與，其中製造每瓶含有100劑量之小瓶。疫苗接種保護人類免於感染。然而，後續疫苗接種可適用於增強免疫性。
先前已描述關於臨床試驗測試疫苗之方法(Sadoff, J.等人(2020) Safety and immunogenicity of the Ad26.COV2.S COVID-19 vaccine candidate: interim results of a phase 1/2a, double-blinded, randomized, placebo-controlled trial, MedRxiv, 第1-28頁；其以全文引用之方式併入本文中)。實施經設計以評估重組痘病毒經工程改造之SARS-CoV-2 S蛋白質之安全性、反應原性及免疫原性之多中心1/2a期隨機、雙盲、安慰劑對照臨床研究。經工程改造之SARS-CoV-2 S蛋白質在健康成年人(18至55歲)及健康老年人(＞ 65歲)中係以單一劑量形式或以間隔(例如) 56天之兩種劑量排程形式以例如每一疫苗接種約5 × 1010 至1 × 1011 個病毒粒子(vp)之間的劑量水準投與。疫苗引發之S特異性抗體量係例如藉由ELISA量測且中和效價係例如在微量中和分析中量測(參見例如實例11中之方法)。CD4+ T-輔助(Th)1及Th2以及CD8+免疫反應係例如藉由胞內細胞介素染色(ICS)評估。實例 7. 產生密碼子最佳化 SARS-CoV-2 刺突蛋白 (SARS-CoV-2-Spike-co)
SARS-CoV-2刺突蛋白(SEQ ID NO: 45)經密碼子最佳化(SARS-CoV-2-Spike-co；SEQ ID NO: 50)以在痘病毒感染期間表現且藉由GenScript合成。合成DNA在核苷酸位置10至48處亦含有痘病毒合成早期/晚期啟動子。合成DNA經次選殖至含有與HPXV095基因座(SEQ ID NO: 51)或HPXV200基因座(SEQ ID NO: 52)之同源性的質體中。使用同源重組以藉由置換先前經插入至合成VACV (synVACV)或合成HPXV (scHPXV)中之可選擇標記物來插入合成DNA。可選擇標記物以黃色螢光蛋白(YFP)與鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(guanine phosphoriosyltransferase；GPT)之間的融合體形式分別插入至HPXV095基因或A2K105基因中(參見如US 2018/0251736中所揭示之方法，其以全文引用的方式併入本文中)。實例 8 ： 產生合成痘瘡病毒 TNX-2200
synVACV (參見實例2) 胸苷激酶(TK)基因座(亦稱為A2K105基因座)中之YFP-GPT可選標記係使用例如與密碼子最佳化SARS-CoV-2刺突(SARS-CoV-2-co)核苷酸序列同源重組來進行置換以產生合成痘瘡病毒TNX-2200。一個例示性程序如下。
大致20微克含有側接大致400個與A2K105基因同源之核苷酸之SARS-CoV-2-Spike-co核苷酸序列的質體係使用限制酶SacI線性化。限制酶消化之後，線性化質體經進一步純化以移除殘餘酶。BSC-40細胞以0.1的MOI感染在A2K105基因座中表現YFP-GPT之synVACV (synVACVΔA2K105yfp-gpt )，保持1小時。感染之後，病毒接種物經OptiMEM培養基置換且在37℃下再培育30分鐘。在總體積2 mL OptiMEM中以1微克DNA: 3 µL脂染胺2000之比率將大致5微克經純化線性化質體與脂染胺2000 (ThermoFisher Scientific)混合。在大致10分鐘培育期間形成DNA-脂質複合物。接著將該複合物添加至感染病毒之BSC-40細胞中。
將BSC-40細胞培育48小時以允許發生同源重組。48小時之後，刮擦培養盤以剝離感染病毒之細胞且將混合物轉移至錐形管中。在-80℃下冷凍及解凍之三個輪次之後，使細胞裂解。將感染/轉染混合物之適當稀釋液(其可在1 × 10-2 至1 × 10-5 的範圍內)接種至BSC-40細胞上，隨後進行瓊脂覆蓋。培育經感染細胞盤直至觀測到非螢光「重組」溶菌斑。此等非螢光溶菌斑經標記，且撿取瓊脂塞且添加至10 mM Tris pH 8.0溶液中。隨後在第二輪感染中使用溶菌斑感染BSC-40細胞。重複此溶菌斑撿取過程及BSC-40細胞感染直至不可在經感染細胞中偵測到YFP (介於4至6輪純化之間)。執行使用擴增A2K105基因座之引子(sA2K J2R側接正向引子5'至3'：ATGCGATTCAAAAAAGAATCAGC (SEQ ID NO: 56)及sA2K J2R側接反向引子5'至3'：CAATTTCCTCAAAATACATAAACGG (SEQ ID NO: 57))之PCR分析來證實SARS-CoV-2刺突基因經插入至A2K105基因座中。
執行西方墨點分析以測試感染synVACVΔA2K105yfp-gpt 或synVACVΔA2K105SARSCoV2-SPIKE-co::nm (TNX-2200)純系1.1.1.1.1或2.1.1.1.1之BSC-40細胞中之SARS-Spike-co蛋白質表現(圖 11 )。BSC-40細胞以MOI 1.0感染指定病毒或無病毒之接種物(模擬物)，且在指定時間點使用RIPA裂解緩衝液採集蛋白質裂解物。SDS-PAGE用於分離蛋白質裂解物且接著將蛋白質轉移至硝化纖維素膜上。隨後使用抗SARS-CoV2刺突(ProSci)或抗VACV 13抗體對膜進行墨點印漬。藉由用可在800 nm或680 nm通道(LI-COR)下偵測到之IRDye二級抗體對膜進行墨點印漬來偵測初級抗體結合。SARS CoV2刺突抗體偵測到不同形式之SARS-CoV-2刺突蛋白，包括全長、經糖基化全長、裂解及多聚形式。
分離來自synVACVΔA2K105SARSCoV2-SPIKE-co::nm (TNX-2200)純系1.1.1.1.1及2.1.1.1.1之病毒基因體DNA且藉由Illumina MiSeq平台使用次世代定序(NGS)對DNA進行定序。定序資料係藉由從頭組裝分析且使用CLC Genomics Workbench軟體(Qiagen)映射至參考軟體。實例 9. 產生合成馬痘病毒 TNX-1800a
synVACV (參見實例7) 胸苷激酶(TK)基因座(亦稱為HPXV095基因座)中之YFP-GPT可選標記係使用例如與密碼子最佳化SARS-CoV-2刺突(SARS-CoV-2-co)核苷酸序列同源重組來進行置換以產生合成痘瘡病毒TNX-1800a。一個例示性程序如下。
大致20微克含有側接大致400個與HPXV095基因同源之核苷酸之SARS-CoV-2-Spike-co核苷酸序列的質體係使用限制酶SacI線性化。限制酶消化之後，線性化質體經進一步純化以移除殘餘酶。BSC-40細胞以0.1的MOI感染在HPXV095基因座中表現YFP-GPT之scHPXV，保持1小時。感染之後，病毒接種物經OptiMEM培養基置換且在37℃下再培育30分鐘。在總體積2 mL OptiMEM中以1微克DNA: 3 µL脂染胺2000之比率將大致5微克經純化線性化質體與脂染胺2000 (ThermoFisher Scientific)混合。在大致10分鐘培育期間形成DNA-脂質複合物。接著將該複合物添加至感染病毒之BSC-40細胞中。
將BSC-40細胞培育48小時至72小時以允許發生同源重組。隨後，刮擦培養盤以剝離感染病毒之細胞且將混合物轉移至錐形管中。-80℃下冷凍及解凍的3個輪次之後，使細胞裂解。將感染/轉染混合物之適當稀釋液(其可在1 × 10-2 至1 × 10-5 的範圍內)接種至BSC-40細胞上，隨後進行瓊脂覆蓋。培育經感染細胞盤直至觀測到非螢光「重組」溶菌斑。此等非螢光溶菌斑經標記，且撿取瓊脂塞且添加至10 mM Tris pH 8.0溶液中。隨後在第二輪感染中使用溶菌斑感染BSC-40細胞。重複此溶菌斑撿取過程及BSC-40細胞感染直至在經感染細胞中不可偵測到YFP (介於4至6輪溶菌斑純化之間)。自HPXV感染細胞中之低效同源重組中分離出一種非螢光溶菌斑。
執行使用擴增HPXV095基因座之引子(sA2K/HPXV J2R側接正向引子5'至3'：TATCGCATTTTCTAACGTGATGG (SEQ ID NO: 58)及sA2K/HPXV J2R側接反向引子5'至3'：CCTCATTTGCACTTTCTGGTTC (SEQ ID NO: 59))之PCR分析來證實SARS-Spike-co基因經插入至HPXV095基因座中。隨後，病毒基因體DNA與蔗糖純化病毒粒子之製劑分離且用於藉由Illumina MiSeq平台之次世代定序。序列資料係藉由從頭組裝分析且使用CLC Genomics Workbench軟體(Qiagen)映射至參考軟體。實例 10. 產生合成馬痘病毒 TNX-1800b
scHPXV (參見實例7) HPXV200基因座(亦稱為天花病毒B22R同源物基因座)中之YFP-GPT可選標記係使用例如與密碼子最佳化SARS-CoV-2刺突(SARS-CoV-2-co)核苷酸序列同源重組來進行置換以產生合成痘瘡病毒TNX-1800b。一個例示性程序如下。
大致20微克含有側接大致400個與HPXV200基因同源之核苷酸之SARS-CoV-2-Spike-co的質體係使用限制酶SacI線性化。限制酶消化之後，線性化質體經進一步純化以移除殘餘酶。BSC-40細胞以0.1的MOI感染在HPXV200基因座中表現YFP-GPT之scHPXV，保持1小時。感染之後，病毒接種物經OptiMEM培養基置換且在37℃下再培育30分鐘。在總體積2 mL OptiMEM中以1微克DNA: 3 µL脂染胺2000之比率將大致5微克經純化線性化質體與脂染胺2000 (ThermoFisher Scientific)混合。在大致10分鐘培育期間形成DNA-脂質複合物。接著將該複合物添加至感染病毒之BSC-40細胞中。
將BSC-40細胞培育48小時至72小時以允許發生同源重組。隨後，刮擦培養盤以剝離感染病毒之細胞且將混合物轉移至錐形管中。在-80℃下冷凍及解凍之三個輪次之後，使細胞裂解。將感染/轉染混合物之適當稀釋液(其可在1 × 10-2 至1 × 10-5 的範圍內)接種至BSC-40細胞上，隨後進行瓊脂覆蓋。培育經感染細胞盤直至觀測到非螢光「重組」溶菌斑。此等非螢光溶菌斑經標記，且撿取瓊脂塞且添加至10 mM Tris pH 8.0溶液中。隨後在第二輪感染中使用此等溶菌斑感染BSC-40細胞。相較於VACV感染細胞，在HPXV-感染細胞中由於低效同源重組而分離出一種非螢光溶菌斑。藉由感染BSC-40細胞重複溶菌斑撿取過程直至不可偵測到YFP (約4至6輪溶菌斑純化)。
執行使用擴增HPXV200基因座之引子(sHPXV 200側接正向引子5'至3'：ATAGCCACAATTATTGACGGGC (SEQ ID NO: 60)及sHPXV 200側接反向引子5'-3'：ggatgatatggtaatgtaactaccgatac (SEQ ID NO: 61))之PCR分析來證實SARS-Spike-co基因經插入至HPXV200基因座中。隨後，病毒基因體DNA與蔗糖純化病毒粒子之製劑分離且用於藉由Illumina MiSeq平台之次世代定序。序列資料係藉由從頭組裝分析且使用CLC Genomics Workbench軟體(Qiagen)映射至參考軟體。實例 11. TNX-1800a 及 TNX-1800b 中之 SARS-CoV-2 刺突蛋白分析
執行西方墨點分析以評估感染TNX-801、TNX-1800a (純系TNX-1800a-1)及TNX-1800b (純系TNX-1800b-2)之BSC-40細胞中之SARS-Spike-co蛋白質表現(圖 12 )。BSC-40細胞以MOI 1.0感染指定病毒且在指定時間點使用RIPA緩衝液採集蛋白質裂解物。SDS-PAGE用於分離蛋白質裂解物且接著將蛋白質轉移至硝化纖維素膜上。隨後使用抗SARS-CoV2刺突(ProSci)、抗VACV 13抗體或抗微管蛋白抗體對膜進行墨點印漬。螢光標記之二級抗體用於偵測初級抗體結合。SARS CoV2刺突抗體偵測到不同形式之SARS-CoV-2刺突蛋白，包括全長、經糖基化全長、裂解及多聚形式。實例 12. 使非洲綠猴免疫接種有重組痘病毒經工程改造之 SARS-CoV-2 S 蛋白質
先前已描述非洲綠猴之免疫接種及測試候選疫苗之方法(Hartman, A. et al. 等人(2020) SARS-CoV-2 infection of African green monkeys result in mild respiratory disease discernible by PET/CT imaging and shedding of infectious virus from both respiratory and gastrointestinal tracts.PLOS Pathogens 16(9): e1008903；其以全文引用之方式併入)。非洲綠猴(AGM)經隨機分成6個群組(n=4)且疫苗接種不同病毒株的合成馬痘病毒(HPXV)。參見表 5 之病毒株及劑量。在第0天，經由使用分叉針進行劃痕來經皮疫苗接種AGM。表 5. 用於 疫苗接種非洲綠猴之 HPXV 病毒株之劑量
群組 動物數目 動物編號 HPXV 病毒株 劑量(PFU)
1 4 1F 16986 1F 16994 1M 16975 1M 16977 TNX-801 2.9 x 106
2 4 2F 16985 2F 16991 2M 16980 2M 16983 TNX-801 1.06 x 106
3 4 3F 16988 3F 16995 3M 16976 3M 16982 TNX-1800b-2 2.9 x 106
4 4 4F 16989 4F 16990 4M 16972 4M 16973 TNX-1800b-2 1.06 x 106
5 4 5F 16992 5F 16993 5M 16979 5M 16981 TNX-1800a-1 0.6 x 106
6 4 6M 16978 6M 16974 6F16987 6F16984 媒劑對照 不適用
不管引發免疫反應(包括T細胞免疫反應)之劑量，在疫苗接種TNX-801、TNX-1800b-2或TNX-1800a-1時，監測AGM之接種部位且在7天之後呈現有皮膚反應，亦稱為「種痘」(圖 13 至 17 )。「種痘」先前已經描述為指示抗痘瘡病毒(諸如天花)之保護免疫性(例如，T細胞免疫性)之正向疫苗反應的生物標記(Jenner, E.,1800,第2版.「An Inquiry into the Causes and Effects of the Variolae Vaccinae, a Disease Discovered in Some of the Western Counties of England, Particularly Gloucestershire, and Known by the Name of The Cow Pox」)。「種痘」為20世紀60年代藉由根除天花(由天花所引起之呼吸傳播性疾病)驗證之功能性T細胞免疫性之措施。疫苗接種TNX-1800b-2或TNX-1800a-1之後位於AGM上之「種痘」之存在預測T細胞免疫反應將由於引入SARS-CoV-S蛋白質、COVID-19抗原而活化。當天然T細胞呈現有抗原(例如，SARS-CoV-2 S蛋白質)時，T細胞免疫反應經活化，從而導致天然T細胞分化及增殖。此反應亦藉由產生記憶體T細胞而產生免疫記憶體，該等記憶體T細胞提供免於相同抗原之後續攻擊之保護及加速免疫反應。在第60天，經疫苗接種之AGM經由氣管內途徑經SARS-CoV-2攻擊，且攻擊顯示疫苗接種提供抗病毒之保護免疫性。在第88天使存活動物安樂死。
AGM經疫苗接種指定HPXV病毒株之後14天執行微量中和分析以評估血清中之抗SARS-CoV-2中和效價。分析最初重複執行兩次且若前兩個重複不在彼此之2倍稀釋內，則執行第三次重複。在等分至主培養盤上之後，血清樣本最初在56℃下加熱不活化，持續30至60分鐘。可將主培養盤在4至8℃下儲存七天或在-20℃下儲存三個月。
在添加血清測試樣本之前18至24小時，將Vero E6細胞(ATCC)以2 × 104 個細胞/孔之濃度接種至96孔盤中。在分析當天，將主培養盤解凍且將九個血清測試樣本在單獨96孔盤/稀釋區塊(第1至9行)上自1:5至1:640進行2倍連續稀釋。另外，各96孔盤/稀釋液區塊含有陽性對照血清(第10行)、病毒對照(第11行)及細胞對照(第12行)。稀釋之後，將等體積之病毒原液(1,000 TCID50/mL)添加至第1至11行。另外，同時設置由陽性對照血清(第1至2行)、陰性對照(第3至4行)、病毒輸入反向效價(第5至6行)、病毒對照(VC；第7至9行)及細胞對照(CC；第10至12行)組成。每一分析使用至少兩個QC培養盤。在5% CO2 培育箱中在37℃下培育測試盤及QC盤2至2.5小時。培育之後，將用於測試盤及QC盤兩者之等分試樣混合物(血清及病毒) (包括對照)轉移至預接種Vero E6細胞之96孔盤上且培育72±4小時。培育之後，自培育箱移除盤且使其靜置在室溫下20至40分鐘。將100 uL Cell Titer-Glo (Promega)添加至盤中之所有孔中，溫和地混合且在室溫下培育10至30分鐘。使用適當光度計讀取螢光。使用下式計算培養盤截止值： (VC孔之平均值+CC孔之平均值)/2 具有高於或低於培養盤截止值之螢光之樣本對於中和抗體分別為陽性及陰性的。個別複製物經指定為最後一次正稀釋之稀釋之倒數的效價(亦即，1:80=報導為效價80)。效價經報導為可接受重複效價之中位效價及幾何平均效價。
表6展示單次疫苗接種14天之後接種疫苗之AGM中所量測之抗SARS-CoV-2中和效價水準。經疫苗接種TNX-1800b-2及TNX1800a-1之AGM產生抗SARS-CoV-2之抗體的中和效價(≥ 1:40效價)。經疫苗接種TNX-801 (不攜載S蛋白質表現卡匣之HPXV)之對照動物及安慰劑組並不產生抗SARS-CoV-2中和效價(＜ 1:10效價)。2.9 × 106 PFU及1.06 × 106 PFU劑量之TNX-801及TNX-1800兩者為良好耐受的。表 6. 經疫苗接種之非洲綠猴之抗 SARS-CoV-2 中和效價
動物編號 HPXV 病毒株 劑量 效價1 效價2 中值 幾何平均效價(GMT)
3M 16982 D15 TNX-1800b-2 2.9 x 106 640 20 NQ NQ
3M 16976 D15 TNX-1800b-2 2.9 x 106 640 320 480 452.55
3F 16988 D15 TNX-1800b-2 2.9 x 106 320 160 240 226.27
3F 16995 D15 TNX-1800b-2 2.9 x 106 640 640 640 640.00
4M 16973 D14 TNX-1800b-2 1.06 x 106 160 160 160 160.00
4M 16972 D14 TNX-1800b-2 1.06 x 106 640 640 640 640.00
4F 16989 D14 TNX-1800b-2 1.06 x 106 80 80 80 80.00
4F 16990 D14 TNX-1800b-2 1.06 x 106 320 320 320 320.00
5M 16979 D14 TNX-1800a-1 0.6 x 106 320 320 320 320.00
5M 16981 D14 TNX-1800a-1 0.6 x 106 640 320 480 452.55
5F 16993 D14 TNX-1800a-1 0.6 x 106 320 320 320 320.00
5F 16992 D14 TNX-1800a-1 0.6 x 106 320 640 480 452.55
實例 13. 感染重組痘病毒經工程改造之 SARS-CoV-2 S 蛋白質之細胞中量測的病毒生長曲線
將BSC-40細胞、HeLa細胞及HEK 293細胞接種至6孔盤中且隨後以0.01的MOI感染TNX-801、TNX-1800、TNX-1200或TNX-2200。感染48小時之後，細胞經固定且用含有結晶紫之5%甲醛染色。感染TNX-801及TNX-1800之BSC-40細胞具有明顯細胞病變效應，而HeLa細胞及HEK 293細胞分別顯示較小細胞病變效應且不顯示細胞病變效應(圖 18 )。感染TNX-1200及TNX-2200之BSC-40細胞、HeLa細胞及HEK293細胞在所有感染細胞株中具有明顯細胞病變效應(圖 18 )。隨感染TNX-801、TNX-1800、TNX-1200或TNX-2200 24、48及72小時之後的時間量測BSC-40細胞、HeLa細胞及HEK 293細胞中之病毒效價(PFU/mL) (圖 19A 至 D )，其對應於如圖18中展現之病毒之細胞病變效應。
BSC-40細胞以0.01的MOI感染HPXV純系(例如，TNX-801、scHPXVΔ095yfp-gpt 、TNX-1800a-1、scHPXVΔ200yfp-gpt 或TNX-1800b-2；(圖 20A 至 B ))或VACV純系(例如，TNX-1200、TNX-2200或synVACVΔA2K105yfp-gpt ；(圖 21A 至 B ))。在0、3、6、12、24、48及72小時量測病毒效價(PFU/mL)以測定感染細胞中之病毒生長。SARS-CoV-2刺突蛋白之存在使HPXV純系病毒生長減緩大致0.5 log，同時使VACV純系病毒生長減緩大致1 log。
感染各種HPXV及VACV純系之Vero細胞及BSC-40細胞中所見之細胞病變效應展示此等細胞株可用於製造病毒(例如，TNX-1800及TNX-801)。 實例 14. 產生 SARS-CoV-2 刺突合成 DNA 表現卡匣及經該卡匣轉染之重組 scHPXV
如圖22中所說明，SARS-CoV-2刺突(S)核苷酸序列(SEQ ID NO: 45)係藉由使用沈默編碼突變誘發移除早期轉錄終止信號(T5 NT) (SEQ ID NO: 14)，由此保持SARS-CoV-2刺突(S)蛋白編碼序列來進行修飾。
選擇異源轉殖基因SARS-CoV-2刺突(S)在合成嵌合(sc)馬痘基因體之DNA核苷酸序列內之插入位點之位置(例如，TK基因座HPXV095；位置992077-92610；SEQ ID NO: 1)。識別接近選定HPXV插入位點之左右之DNA核苷酸序列，其界定左右側接臂(參見圖22)。彼等臂用於驅動救援病毒與異源轉殖基因之間的同源核苷酸位點特異性重組。亦選擇編碼用於驅動高SARS-CoV-2刺突(S)基因表現量之基於痘病毒之啟動子(諸如痘瘡病毒早期/晚期啟動子)之DNA核苷酸序列。
接著合成(例如，藉由商業供應商(例如，Genewiz))一種用於SARS-CoV-2刺突(S)合成表現卡匣之大致6 kb之例示性DNA核苷酸序列，其包含左側接臂、可操作地連接於經修飾之CoVID-SARS-2刺突(S)核酸序列之痘瘡病毒早期/晚期啟動子及右側接臂之DNA核苷酸序列。參見圖22。
接著將SARS-CoV-2刺突(S)合成表現卡匣DNA轉染至感染scHPXV之細胞(例如，BSC-40細胞)中。使用含有BrdU之培養基選擇含有SARS-CoV-2刺突(S)合成表現卡匣之重組馬痘病毒後代，以便防止親本病毒保留原始插入位點病毒基因體DNA序列之病毒擴增。使用連續回合之溶菌斑純化來純化重組病毒。藉由序列分析(例如，PCR序列分析)確認整個SARS-CoV-2刺突(S)異源轉殖基因卡匣中來自經純化病毒之核苷酸序列。參見SEQ ID NO: 63。
可使用馬痘病毒進行類似構築及步驟以產生含有小鼠調適之刺突蛋白表現卡匣之重組scHPXV (參見SEQ ID NO: 64)且使用痘瘡病毒(例如痘瘡TK基因座synVACV 105；位置83823-84344(參見SEQ ID NO: 2))產生含有小鼠調適之刺突蛋白表現卡匣之重組痘瘡病毒(參見SEQ ID NO: 65)。實例 15. 攜載編碼 SARS-CoV-2 S 蛋白質之表現卡匣之重組痘病毒在經 SARS-CoV-2 攻擊之免疫非洲綠猴中之功效
在第0天，非洲綠猴(AGM)經由使用分叉針進行劃痕來經皮接種疫苗，如實例12中所描述。表7展示單次疫苗接種0、7、15、21、29、41及47天之後經疫苗接種之AGM中所量測之抗SARS-CoV-2中和效價水準。經疫苗接種TNX-1800b-2及TNX1800a-1之AGM產生抗SARS-CoV-2之抗體的中和效價(＞ 1:40效價)。經疫苗接種TNX-801 (不攜載S蛋白質表現卡匣之HPXV)之對照動物及安慰劑組並不產生抗SARS-CoV-2中和效價(＜ 1:10效價)。2.9 × 106 PFU及1.06 × 106 PFU劑量之TNX-801及TNX-1800兩者為良好耐受的。表 7. 經疫苗接種之非洲綠猴之抗 SARS-CoV-2 中和效價
HPXV 病毒株 劑量(PFU) 動物編號 第0 天效價 第7 天效價 第15 天效價 第21 天效價 第29 天效價 第41 天效價 第47 天效價
TNX-801 2.9 x 106 1M 16977 1M 16975 1F 16994 1F 16986 不合格 7.07 5.00 5.00 5.00 7.07 5.00 7.07 7.07 2.50 2.50 7.07 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00
TNX-801 1.06 x 106 2M 16980 2M 16983 2F 16985 2F 16991 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 2.50 2.50 3.54 2.50 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00
TNX-1800b-2 2.9 x 106 3M 16982 3M 16976 3F 16988 3F 16995 5.00 7.07 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 113.14 80.00 113.14 320.00 113.14 113.14 160.00 226.27 40.00 40.00 80.00 40.00 56.57 80.00 160.00 56.57 1280.00 640.00 320.00 1280.00
TNX-1800b-2 1.06 x 106 4M 16973 4M 16972 4F 16989 4F 16990 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 113.14 452.55 56.57 320.00 226.27 452.55 28.28 226.27 113.14 320.00 14.14 80.00 80.00 320.00 40.00 160.00 905.10 不合格Q 1280.00 905.10
TNX-1800a-1 0.6 x 106 5M 16979 5M 16981 5F 16993 5F 16992 5.00 5.00 7.07 7.07 5.00 5.00 5.00 5.00 160.00 226.27 113.14 226.27 113.14 160.00 不合格 640.00 113.14 80.00 56.57 不合格 不合格 80.00 56.57 226.27 226.27 452.55 160.00 452.55
媒劑對照 不適用 6M 16978 6M 16974 6F16987 6F16984 5.00 5.00 7.07 7.07 5.00 5.00 5.00 5.00 2.50 3.54 3.54 3.54 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00
在第41天，經疫苗接種之AGM經麻醉且經由1.鼻內及2.氣管內途徑經大致2 × 106 個TCID50 /動物野生型SARS-CoV-2攻擊(亦稱為接種)。病毒體積均勻地分裂於兩種途徑中之每一者之間(每一途徑1 mL，1 × 106 TCID50/mL病毒原液)。對於鼻內途徑，AGM經麻醉且藉由緩慢吸移500 µL至每一鼻孔中隨後吸入來進行接種。對於氣管內途徑，AGM經麻醉且將導管插入至氣管中。在導管之末端大致定位於氣管之中點之後，將含有具有病毒之接種無之注射器與導管連接且將接種物緩慢滴注至氣管中，隨後滴注等體積的PBS來沖洗導管。AGM經接種之後，將動物返回至其飼養籠中且監測自麻醉之恢復。
在第41天及第47天自經接種AGM收集口咽拭子標本及氣管灌洗標本。藉由RT-qPCR方法處理標本以量測SARS-CoV-2複本數。表8展示來自口咽拭子標本之SARS-CoV-2複本數。表9展示來自氣管灌洗標本之SARS-CoV-2複本數。在第47天，經疫苗接種TNX-1800b-2及TNX-1800a-1之AGM產生抗SARS-CoV-2之保護免疫性。表 8. 來自口咽拭子之的 SARS-CoV-2 複本數 / 拭子之 RT-qPCR
HPXV 病毒株 劑量(PFU) 動物編號 第41 天 ( 複本數 / 拭子) 第47 天 ( 複本數 / 拭子)
TNX-801 2.9 x 106 1M 16977 1M 16975 1F 16994 1F 16986 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 2.59E+06 1.75E+05 2.61E+03 2.22E+04
TNX-801 1.06 x 106 2M 16980 2M 16983 2F 16985 2F 16991 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 2.47E+02 6.69E+03 6.33E+04 5.56E+04 3.75E+03
TNX-1800b-2 2.9 x 106 3M 16982 3M 16976 3F 16988 3F 16995 0.00E+00 1.98E+02 4.29E+02 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
TNX-1800b-2 1.06 x 106 4M 16973 4M 16972 4F 16989 4F 16990 7.59E+03 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
TNX-1800a-1 0.6 x 106 5M 16979 5M 16981 5F 16993 5F 16992 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 4.68E+02 0.00E+00
媒劑對照 不適用 6M 16978 6M 16974 6F16987 6F16984 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 9.26E+03 3.66E+04 0.00E+00 1.53E+06
表 9. 來自氣管灌洗之 SARS-CoV-2 複本數 / 毫升 之 RT-qPCR
HPXV 病毒株 劑量(PFU) 動物編號 第41 天 ( 複本數/ 毫升) 第47 天 ( 複本數/ 毫升)
TNX-801 2.9 x 106 1M 16977 1M 16975 1F 16994 1F 16986 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 2.11E+06 0.00E+00 5.31E+02 3.61E+02
TNX-801 1.06 x 106 2M 16980 2M 16983 2F 16985 2F 16991 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 4.50E+04 0.00E+00 3.95E+05 1.72E+04
TNX-1800b-2 2.9 x 106 3M 16982 3M 16976 3F 16988 3F 16995 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
TNX-1800b-2 1.06 x 106 4M 16973 4M 16972 4F 16989 4F 16990 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 8.42E+02 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00
TNX-1800a-1 0.6 x 106 5M 16979 5M 16981 5F 16993 5F 16992 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 9.34E+03 0.00E+00 6.82E+02
媒劑對照 不適用 6M 16978 6M 16974 6F16987 6F16984 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 1.91E+03 8.13E+03 1.43E+04 1.17E+03
例示性實施例： 1. 一種重組痘病毒，其包含編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸，其中SARS-CoV-2蛋白質係選自由以下組成之群：刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)及核衣殼蛋白(N)或該等蛋白質中之兩者或更多者的組合。 2. 根據實施例1之重組痘病毒，其中痘病毒為正痘病毒。 3. 根據實施例2之重組痘病毒，其中正痘病毒係選自由以下組成之群：駱駝痘病毒(CMLV)、牛痘病毒(CPXV)、鼠痘病毒(ECTV)、馬痘病毒(HPXV)、猴痘病毒(MPXV)、痘瘡病毒(VACV)、天花病毒(VARV)、兔痘病毒(RPXV)、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦森伊修病病毒及田鼠痘病毒。 4. 根據實施例2之重組痘病毒，其中正痘病毒為馬痘病毒。 5. 根據實施例4之重組痘病毒，其中馬痘病毒為病毒株MNR-76。 6. 根據實施例2之重組痘病毒，其中正痘病毒為痘瘡病毒。 7. 根據實施例6之重組痘病毒，其中痘瘡病毒係選自由以下組成之病毒株群：Western Reserve、Western Reserve純系3、Tian Tian、Tian Tian純系TP5、Tian Tian純系TP3、NYCBH、NYCBH純系Acambis 2000 (ACAM 2000)、Wyeth、Copenhagen、Lister、Lister 107、Lister-LO、Lister GL-ONC1、Lister GL-ONC2、Lister GL-ONC3、Lister GL-ONC4、Lister CTC1、Lister IMG2 (Turbo FP635)、IHD-W、LC16m18、Lederle、Tashkent純系TKT3、Tashkent純系TKT4、USSR、Evans、Praha、L-IVP、V-VET1或LIVP 6.1.1、Ikeda、EM-63、Malbran、Duke、3737、CV-1、Connaught Laboratories、Serro 2、CM-01、NYCBH Dryvax純系DPP13、NYCBH Dryvax純系DPP15、NYCBH Dryvax純系DPP20、NYCBH Dryvax純系DPP17、NYCBH Dryvax純系DPP21、VACV-IOC、Mulford 1902、安卡拉絨膜尿囊痘瘡病毒(CVA)、經修飾之安卡拉痘瘡病毒(MVA)及MVA-BN。 8. 根據實施例1至7中任一項之重組痘病毒，其中SARS-CoV-2蛋白質為S蛋白質。 9. 根據實施例1至8中任一項之重組痘病毒，其中SARS-CoV-2病毒蛋白質之胺基酸序列相對於野生型蛋白質經修飾。 10.      根據實施例8之重組痘病毒，其中SARS-CoV-2病毒S蛋白質經修飾以感染小鼠。 11.      根據實施例8之重組痘病毒，其中相對於野生型S蛋白質(SEQ ID NO: 47)，SARS-CoV-2病毒S蛋白質之胺基酸序列包含選自以下之一或多種取代：Y459H、D614G、S943P、K986P及V987P。 12.      根據實施例1至11中任一項之重組痘病毒，其中編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸位於痘病毒之對於複製痘病毒非必需的區域中。 13.      根據實施例12之重組痘病毒，其中編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸位於痘病毒之胸苷激酶(TK)基因座中。 14.      根據實施例12之重組痘病毒，其中編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸位於痘病毒之B22R同源基因座中。 15.      根據實施例1至14中任一項之重組痘病毒，其中編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸可操作地連接至啟動子。 16.      根據實施例15之重組痘病毒，其中啟動子為痘病毒特異性啟動子。 17.      根據實施例16之重組痘病毒，其中痘病毒特異性啟動子為痘瘡病毒早期啟動子。 18.      根據實施例16之重組痘病毒，其中痘病毒特異性啟動子為痘瘡病毒晚期啟動子。 19.      根據實施例16之重組痘病毒，其中痘病毒特異性啟動子為痘瘡病毒早期及晚期啟動子之串聯。 20.      根據實施例1至19中任一項之重組痘病毒，其中痘病毒為合成痘病毒。 21.      根據實施例20之重組痘病毒，其中重組痘病毒係選自由以下組成之群：TNX-2200 (synVACVΔA2K105SARS-CoV2-Spike-co )、TNX-2200純系1.1.1.1.1、TNX-2200純系2.1.1.1.1、TNX-1800 (scHPXVΔ200SARS-COV2-Spike-co )、TNX-1800a、TNX-1800a-1、TNX-1800b及TNX-1800b-2。 22.      根據實施例21之重組痘病毒，其中重組痘病毒為TNX-1800b-2。 23.      根據實施例21之重組病毒，其中重組痘病毒為TNX-1800a-1。 24.      根據實施例20之重組痘病毒，其中重組痘病毒包含SEQ ID NO: 63、64或65中之任一者。 25.      一種醫藥組合物，其包含根據實施例1至24中任一項之重組痘病毒及醫藥學上可接受之載劑。 26.      根據實施例25之醫藥組合物，其中重組痘病毒係選自由以下組成之群：TNX-2200 (synVACVΔA2K105SARS-CoV2-Spike-co )、TNX-2200純系1.1.1.1.1、TNX-2200純系2.1.1.1.1、TNX-1800 (scHPXVΔ200SARS-COV2-Spike-co )、TNX-1800a、TNX-1800a-1、TNX-1800b及TNX-1800b-2。 27.      根據實施例25之醫藥組合物，其中重組痘病毒包含SEQ ID No: 63、64或65中之任一者。 28.      根據實施例26之醫藥組合物，其中重組痘病毒為TNX-1800b-2。 29.      根據實施例26之醫藥組合物，其中重組痘病毒為TNX-1800a-1。 30.      一種細胞，其感染根據實施例1至29中任一項之重組痘病毒。 31.      根據實施例30之細胞，其中細胞為哺乳動物細胞。 32.      根據實施例31之細胞，其中哺乳動物細胞為Vero細胞、Vero E6細胞或BSC-40細胞。 33.      一種用於選擇表現SARS-CoV-2病毒蛋白質之細胞的方法，其包含使該細胞感染根據實施例1至24中任一項之重組痘病毒且選擇表現該SARS-CoV-2病毒蛋白質之經感染細胞。 34.      根據實施例33之用於選擇表現SARS-CoV-2病毒蛋白質之細胞的方法，其中重組痘病毒係選自由以下組成之群：TNX-2200 (synVACVΔA2K105SARS-CoV2-Spike-co )、TNX-2200純系1.1.1.1.1、TNX-2200純系2.1.1.1.1、TNX-1800 (scHPXVΔ200SARS-COV2-Spike-co )、TNX-1800a、TNX-1800a-1、TNX-1800b及TNX-1800b-2。 35.      根據實施例33之用於選擇表現SARS-CoV-2病毒蛋白質之細胞的方法，其中重組痘病毒包含SEQ ID No: 63、64或65中之任一者。 36.      根據實施例34之用於選擇表現SARS-CoV-2病毒蛋白質之細胞的方法，其中重組痘病毒為TNX-1800b-2。 37.      根據實施例34之用於選擇表現SARS-CoV-2病毒蛋白質之細胞的方法，其中重組痘病毒為TNX-1800a-1。 38.      一種誘導個體之抗SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，其包含向該個體投與免疫學上有效量之根據實施例1至24中任一項之重組痘病毒或根據實施例25至29中任一項之醫藥組合物。 39.      根據實施例38之誘導個體之抗SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，其中該免疫學上有效量之重組痘病毒係藉由劃痕法進行投與。 40.      根據實施例38之誘導個體之抗SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，其中該免疫反應包含能夠中和SARS-CoV-2病毒之抗體。 41.      根據實施例38之誘導個體之抗SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，其中免疫學上有效量之重組痘病毒能夠保護個體免受SARS-CoV-2病毒感染。 42.      根據實施例38之誘導個體之抗SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，其中免疫學上有效量之重組痘病毒減輕或預防個體在SARS-CoV-2感染之後的病毒進展。 43.      根據實施例38之誘導個體之抗SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，其中免疫反應為T細胞免疫反應。 44.      一種誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，其包含向該個體投與免疫學上有效量之根據實施例1至24中任一項之重組痘病毒或根據實施例25至29中任一項之醫藥組合物。 45.      根據實施例44之誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，其中該免疫學上有效量之重組痘病毒係藉由劃痕法進行投與。 46.      根據實施例44之誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，其中該免疫反應包含能夠中和SARS-CoV-2病毒及痘病毒之抗體。 47.      根據實施例44之誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，其中免疫學上有效量之重組痘病毒能夠保護個體免受SARS-CoV-2病毒及痘病毒感染。 48.      根據實施例44之誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，其中免疫學上有效量之重組痘病毒減輕或預防個體之SARS-CoV-2病毒感染及/或痘病毒感染之進展。 49.      根據實施例44之誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，其中免疫反應為T細胞免疫反應。 50.      根據實施例44至49中任一項之誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，其中痘病毒為痘瘡病毒、天花、馬痘病毒或猴痘病毒。 51.      一種誘導抗SARS-CoV-2病毒之T細胞免疫性之方法，其包含向該個體投與免疫學上有效量之根據實施例1至24中任一項之重組痘病毒或根據實施例25至29中任一項之醫藥組合物。 52.      根據實施例51之誘導抗SARS-CoV-2病毒之T細胞免疫性的方法，其中該免疫學上有效量之重組痘病毒係藉由劃痕法進行投與。 53.      根據實施例51之誘導抗SARS-CoV-2病毒之T細胞免疫性的方法，其中免疫學上有效量之重組痘病毒能夠保護個體免受SARS-CoV-2病毒感染。 54.      根據實施例51之誘導抗SARS-CoV-2病毒之T細胞免疫性的方法，其中免疫學上有效量之重組痘病毒減輕或預防個體之SARS-CoV-2感染之進展。 55.      一種誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之T細胞免疫性的方法，其包含向該個體投與免疫學上有效量之根據實施例1至24中任一項之重組痘病毒或根據實施例25至29中任一項之醫藥組合物。 56.      根據實施例55之誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之T細胞免疫性的方法，其中該免疫學上有效量之重組痘病毒係藉由劃痕法進行投與。 57.      根據實施例55之誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之T細胞免疫性的方法，其中免疫學上有效量之重組痘病毒能夠保護個體免受SARS-CoV-2病毒及痘病毒感染。 58.      根據實施例55之誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之T細胞免疫性的方法，其中免疫學上有效量之重組痘病毒減輕或預防個體之SARS-CoV-2感染及/或痘病毒感染之進展。 59.      根據實施例55至58中任一項之誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之T細胞免疫性的方法，其中痘病毒為痘瘡病毒、天花、馬痘病毒或猴痘病毒。 60.      一種產生根據實施例1至59中任一項中之重組痘病毒之方法，該方法包含： (a)       使宿主細胞感染痘病毒； (b)       使步驟(a)之經感染細胞轉染有編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸以產生重組痘病毒；及 (c)       選擇重組痘病毒，其中編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸在轉染後位於痘病毒之對於複製痘病毒非必需的區域中。 61.      根據實施例33至60中任一項之方法，其中SARS-CoV-2蛋白質係選自由以下組成之群：S刺突蛋白、M蛋白質及N蛋白質或該等蛋白質中之兩者或更多者的組合。 62.      根據實施例33至61中任一項之方法，其中痘病毒為正痘病毒。 63.      根據實施例62之方法，其中正痘病毒係選自由以下組成之群：駱駝痘病毒(CMLV)、牛痘病毒(CPXV)、鼠痘病毒(ECTV)、馬痘病毒(HPXV)、猴痘病毒(MPXV)、痘瘡病毒(VACV)、天花病毒(VARV)、兔痘病毒(RPXV)、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦森伊修病病毒及田鼠痘病毒。 64.      根據實施例62之方法，其中正痘病毒為馬痘病毒。 65.      根據實施例64之方法，其中馬痘病毒為病毒株MNR-76。 66.      根據實施例62之方法，其中正痘病毒為痘瘡病毒。 67.      根據實施例66之方法，其中痘瘡病毒係選自由以下組成之病毒株群：Western Reserve、Western Reserve純系3、Tian Tian、Tian Tian純系TP5、Tian Tian純系TP3、NYCBH、NYCBH純系Acambis 2000、Wyeth、Copenhagen、Lister、Lister 107、Lister-LO、Lister GL-ONC1、Lister GL-ONC2、Lister GL-ONC3、Lister GL-ONC4、Lister CTC1、Lister IMG2 (Turbo FP635)、IHD-W、LC16m18、Lederle、Tashkent純系TKT3、Tashkent純系TKT4、USSR、Evans、Praha、L-IVP、V-VET1或LIVP 6.1.1、Ikeda、EM-63、Malbran、Duke、3737、CV-1、Connaught Laboratories、Serro 2、CM-01、NYCBH Dryvax純系DPP13、NYCBH Dryvax純系DPP15、NYCBH Dryvax純系DPP20、NYCBH Dryvax純系DPP17、NYCBH Dryvax純系DPP21、VACV-IOC、安卡拉絨膜尿囊痘瘡病毒(CVA)、經修飾之安卡拉痘瘡病毒(MVA)及MVA-BN。 68.      根據實施例33至67中任一項之方法，其中編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸位於痘病毒之對於複製痘病毒非必需的區域中。 69.      根據實施例68之方法，其中編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸位於痘病毒之胸苷激酶(TK)基因座中。 70.      根據實施例68之方法，其中編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸位於痘病毒之B22R同源基因座中。 71.      根據實施例33至70中任一項之方法，其中編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸可操作地連接至啟動子。 72.      根據實施例71之方法，其中啟動子為痘病毒特異性啟動子。 73.      根據實施例72之方法，其中痘病毒特異性啟動子為痘瘡病毒早期啟動子。 74.      根據實施例72之方法，其中痘病毒特異性啟動子為痘瘡病毒晚期啟動子。 75.      根據實施例72之方法，其中痘病毒特異性啟動子為痘瘡病毒早期及晚期啟動子之串聯。 76.      根據實施例33至75中任一項之方法，其中痘病毒為合成痘病毒。 77.      一種減輕或預防有需要或處於風險下之個體之SARS-CoV-2病毒感染之進展的方法，其包含向該個體投與免疫學上有效量之根據實施例1至24中任一項之重組痘病毒或根據實施例25至29中任一項之醫藥組合物。 78.      一種減輕或預防有需要或處於風險下之個體之SARS-CoV-2病毒及痘病毒感染之進展的方法，其包含向該個體投與免疫學上有效量之根據實施例1至24中任一項之重組痘病毒或根據實施例25至29中任一項之醫藥組合物。 79.      一種減輕或預防SARS-CoV-2病毒及痘病毒之進展的方法，其中痘病毒為痘瘡病毒、天花、馬痘病毒或猴痘病毒。 80.      一種抗SARS-CoV-2病毒之疫苗，其包含根據實施例1至23之重組病毒或根據實施例25至29之醫藥組合物。 81.      一種抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之二價疫苗，其包含根據實施例1至24之重組病毒或根據實施例25至29之醫藥組合物。 82.      一種抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之二價疫苗，其中痘病毒為痘瘡病毒、天花、馬痘病毒或猴痘病毒。
出於說明本發明之目的，在圖式中展示本發明之各種實施例。然而，應理解，本發明不限於圖式中所展示之精確配置及工具。
圖 1 .線性dsDNA合成HPXV (GenBank寄存編號KY349117)及合成VACV (synVACV) (GenBank寄存編號MN974381)基因體之示意圖。以橙色描繪胸苷激酶(TK)基因座。HPXV中之TK基因座位於基因體位置：92077-92610處，其中基因ID為HPXV095 (SEQ ID NO: 1)。VACV中之TK基因座位於基因體位置：83823-84344處，其中基因ID為synVACV_105 (SEQ ID NO: 2)。
圖 2. 位於HPXV094側接區與HPXV096側接區之間的HPXV之大致4 kb之TK基因座(HPXV095)之示意圖。
圖 3 .合成HPXV與合成VACV ACAM2000之TK基因座的序列比對，其中展示核苷酸相似度為大約99%。圖3係指按出現之次序分別為SEQ ID NO: 34-36。
圖 4. 線性dsDNA HPXV之示意圖，其展示編碼SARS-CoV-2表現卡匣之PCR片段之產生。表現卡匣經引入HPXV基因體之TK基因座中且包含可操作地連接至SARS-CoV-2刺突S基因上游插入之痘瘡病毒早期及晚期啟動子的SARS-CoV2刺突S基因。
圖 5. HPXV及VACV、ACAM 2000救援病毒及藉由與左重組側接臂及右重組側接臂重組插入編碼SARS-CoV-2刺突S蛋白質之合成表現卡匣的示意圖。
圖 6. 產生重組HPXV之方法的示意圖，該方法包含：(1)使BSC-40細胞在HPXV095基因座中感染有表現yfpgpt卡匣之HPXV；(2)感染後24小時，使經感染細胞轉染有合成表現卡匣；(3)感染/轉染後48小時，在冷凍/解凍的重複循環輪次下採集細胞裂解物，釋放HPXV及表現SARS-CoV-2刺突S蛋白質(rHPXV-SARS S)之重組HPXV之後代病毒；及(4)選擇包含rHPXV-SARS S之細胞。
圖 7 .包含SARS-CoV-2 S蛋白質之重組HPXV的選擇及純化之示意圖，其包含(1)感染/轉染之先前步驟；(2)採集細胞且細胞裂解以釋放對照HPXV及rHPXV-SARS S後代；(3)將後代病毒盤滴定於BSC-40細胞上；及(4)藉由螢光顯微鏡尋找非螢光溶菌斑。SARS-CoV-2 S已替換yfpgpt卡匣之病毒後代為非螢光的。
圖 8 .早期、晚期及重疊早期/晚期痘瘡病毒啟動子。展示核心、間隔子及起始子(init)。圖A 展示早期啟動子核苷酸序列(SEQ ID NO: 3)；使用4-鹼基碼指示最佳表現所需之特異性核苷酸；藉由N指示非關鍵核苷酸；嘌呤必須存在於init區內。圖B 展示晚期啟動子核苷酸序列(SEQ ID NO: 4)；T-run及TAAAT init序列提供較高表現。圖C 展示合成早期/晚期啟動子核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)；早期及晚期啟動子之元件分別指示於該序列之上方及下方。
圖 9 .重疊早期/晚期痘瘡病毒啟動子之變化的核苷酸序列，其包含晚期啟動子之不同間隔子3'。圖A 展示38個核苷酸間隔子(SEQ ID NO: 40；SEQ ID NO: 37中列舉之啟動子及間隔子之全長序列)；圖B 展示99個核苷酸間隔子(SEQ ID NO: 41；SEQ ID NO: 38中列舉之啟動子及間隔子之全長序列)且圖C 展示160個核苷酸間隔子(SEQ ID NO: 42；SEQ ID NO: 39中列舉之啟動子及間隔子之全長序列)。
圖 10. 產生包含編碼SARS-CoV-2 S蛋白質之核酸之重組scHPXV或synVACV的方法之示意圖，該方法包含：(1)使BSC-40細胞感染救援HPXV或VACV病毒及(2)使經感染BSC-40細胞在TK基因座中轉染有PCR產生片段，其中PCR產生片段包含經工程改造之SARS-CoV-2 S基因表現卡匣。SARS-CoV-2 S基因含有一或多種修飾(至少存在Y459H)。所得經修飾S蛋白經調適以感染小鼠。亦經由寫碼沈默突變誘發自SARS-CoV-2 S基因移除痘瘡早期轉錄終止信號ETTS (T5 NT (SEQ ID NO: 14))以在感染之早期階段產生全長轉錄本。
圖 11. 感染synVACVΔA2K105yfp-gpt 或synVACVΔA2K105SARSCoV2-SPIKE-co::nm (TNX-2200)純系1.1.1.1.1或2.1.1.1.1之BSC-40細胞的SARS-CoV-2刺突蛋白表現之西方墨點。「模擬物」表示不含病毒之陰性對照組。「Mr」為以千道爾頓(kiloDalton) (kDa)為單位之分子量標記物集合。右側上之標記鑑別各種蛋白質：「S多聚體」：刺突多聚體蛋白質；「FL S-G」：全長經糖基化刺突蛋白；「FL S」：全長刺突蛋白；「VACV I3」：單股DNA結合I3蛋白質(內部對照)；「SPIKE-co::nm」：經密碼子最佳化且不含標記物之刺突蛋白，指示不存在YFP-GPT表現。
圖 12. 感染合成TNX-801、TNX-1800a-1或TNX-1800b-2之BSC-40細胞的刺突蛋白表現之西方墨點。「模擬物」表示不含病毒之陰性對照組。「kDa」為千道爾頓(分子量)。右側之標記鑑別各種蛋白質：「S多聚體」：刺突多聚體蛋白質；「FL S-G」：全長經糖基化刺突蛋白；「FL S」：全長刺突蛋白；「VACV I3」：單股DNA結合I3蛋白質(內部對照)。
圖 13. 經疫苗接種2.9 × 106 個PFU TNX-801之非洲綠猴(AGM)之第7天皮膚反應(「種痘(take)」)之示意圖。圖 A 展示雌性AGM (動物編號：1F 16986)；圖 B 展示雌性AGM (動物編號：1F 16994)；圖 C 展示雄性AGM (動物編號：1M 16975)；及圖 D 展示雄性AGM (動物編號：1M 16977)。
圖 14. 經疫苗接種1.06 ×106 個PFU TNX-801之非洲綠猴(AGM)之第7天皮膚反應(「種痘」)之示意圖。圖 A 展示雌性AGM (動物編號：2F 16985)；圖 B 展示雌性AGM (動物編號：1F 16991)；圖 C 展示雄性AGM (動物編號：2M 16980)；及圖 D 展示雄性AGM (動物編號：1M 16983)。
圖 15. 經疫苗接種2.9 × 106 個PFU TNX-1800b-2之非洲綠猴(AGM)之第7天皮膚反應(「種痘」)之示意圖。圖 A 展示雌性AGM (動物編號：3F 16988)；圖 B 展示雌性AGM (動物編號：3F 16995)；圖 C 展示雄性AGM (動物編號：3M 16976)；及圖 D 展示雄性AGM (動物編號：3M 16982)。
圖 16. 經疫苗接種1.06 ×106 個PFU TNX-1800b-2之非洲綠猴(AGM)之第7天皮膚反應(「種痘」)之示意圖。圖 A 展示雌性AGM (動物編號：4F 16989)；圖 B 展示雌性AGM (動物編號：4F 16990)；圖 C 展示雄性AGM (動物編號：4M 16972)；及圖 D 展示雄性AGM (動物編號：4M 16973)。
圖 17. 經疫苗接種0.6 ×106 個PFU TNX-1800a-1之非洲綠猴(AGM)之第7天皮膚反應(「種痘」)之示意圖。圖 A 展示雌性AGM (動物編號：5F 16992)；圖 B 展示雌性AGM (動物編號：5F 16993)；圖 C 展示雄性AGM (動物編號：5M 16979)；及圖 D 展示雄性AGM (動物編號：5M 16981)。
圖 18. 展示感染TNX-801、TNX-1800b-2、TNX-1200或TNX-2200之後48小時，BSC-40細胞、HeLa細胞及HEK 293細胞中之細胞病變效應的染色盤。
圖 19A 、 19B 、 19C 及 19D. 隨時間推移，BSC-40細胞、HeLa細胞及HEK 293細胞中之病毒生長曲線。圖 19A 展示感染TNX-1200之細胞；圖 19B 展示感染TNX-2200之細胞；圖 19C 展示感染TNX-801之細胞；及圖 19D 展示感染TNX-1800b-2之細胞。
圖 20A 及 20B. 隨時間推移，感染合成馬痘病毒(HPXV)之BSC-40細胞中之病毒生長曲線。圖 20A 展示感染TNX-801、scHPXVΔ095yfp-gpt 、TNX-1800a-1、scHPXVΔ200yfp-gpt 或TNX-1800b-2之細胞中所測得的病毒效價(PFU/mL)；圖 20B 展示經感染細胞中相對於輸入之倍數變化。
圖 21A 及 21B. 隨時間推移，感染合成痘瘡病毒(VACV)之BSC-40細胞之病毒生長曲線。圖 21A 展示感染TNX-1200、TNX-2200或synVACVΔA2K105yfp-gpt 之細胞中所測得的病毒效價(PFU/mL)；圖 21B 展示經感染細胞中相對於輸入之倍數變化。
圖 22. 線性dsDNA HPXV之示意圖，其展示編碼SARS-CoV-2表現卡匣之PCR片段之產生。表現卡匣經引入HPXV基因體之TK基因座中且包含編碼SARS-CoV2刺突S基因蛋白質的DNA，該SARS-CoV2刺突S基因蛋白質可操作地連接至SARS-CoV-2刺突S DNA上游插入的痘瘡病毒早期及晚期啟動子。表現卡匣進一步包含1 kb HPXV左側接臂(例如，HPXV092、HPXV093及HPXV094)及1 kb HPXV右側接臂(例如，HPXV096)。
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Claims (82)

  1. 一種重組痘病毒，其包含編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸，其中該SARS-CoV-2蛋白質係選自由以下組成之群：刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)及核衣殼蛋白(N)，或該等蛋白質中之兩者或更多者的組合。
  2. 如請求項1之重組痘病毒，其中該痘病毒為正痘病毒。
  3. 如請求項2之重組痘病毒，其中該正痘病毒係選自由以下組成之群：駱駝痘病毒(CMLV)、牛痘病毒(cowpox virus；CPXV)、鼠痘病毒(ECTV)、馬痘病毒(HPXV)、猴痘病毒(MPXV)、痘瘡病毒(vaccinia virus；VACV)、天花病毒(VARV)、兔痘病毒(RPXV)、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒(Taterapox virus)、瓦森伊修病病毒(Uasin Gishu disease virus)及田鼠痘病毒。
  4. 如請求項2之重組痘病毒，其中該正痘病毒為馬痘病毒。
  5. 如請求項4之重組痘病毒，其中該馬痘病毒為病毒株MNR-76。
  6. 如請求項2之重組痘病毒，其中該正痘病毒為痘瘡病毒。
  7. 如請求項6之重組痘病毒，其中該痘瘡病毒係選自由以下組成之病毒株群：Western Reserve、Western Reserve純系3、Tian Tian、Tian Tian純系TP5、Tian Tian純系TP3、NYCBH、NYCBH純系Acambis 2000 (ACAM 2000)、Wyeth、Copenhagen、Lister、Lister 107、Lister-LO、Lister GL-ONC1、Lister GL-ONC2、Lister GL-ONC3、Lister GL-ONC4、Lister CTC1、Lister IMG2 (Turbo FP635)、IHD-W、LC16m18、Lederle、Tashkent純系TKT3、Tashkent純系TKT4、USSR、Evans、Praha、L-IVP、V-VET1或LIVP 6.1.1、Ikeda、EM-63、Malbran、Duke、3737、CV-1、Connaught Laboratories、Serro 2、CM-01、NYCBH Dryvax純系DPP13、NYCBH Dryvax純系DPP15、NYCBH Dryvax純系DPP20、NYCBH Dryvax純系DPP17、NYCBH Dryvax純系DPP21、VACV-IOC、Mulford 1902、安卡拉絨膜尿囊痘瘡病毒(Chorioallantoid Vaccinia virus Ankara，CVA)、經修飾之安卡拉痘瘡病毒(Modified vaccinia Ankara；MVA)及MVA-BN。
  8. 如請求項1至7中任一項之重組痘病毒，其中該SARS-CoV-2蛋白質為S蛋白質。
  9. 如請求項1至8中任一項之重組痘病毒，其中該SARS-CoV-2病毒蛋白質之胺基酸序列係相對於野生型蛋白質經修飾。
  10. 如請求項8之重組痘病毒，其中該SARS-CoV-2病毒S蛋白質經修飾以感染小鼠。
  11. 如請求項8之重組痘病毒，其中相對於野生型S蛋白質(SEQ ID NO: 47)，該SARS-CoV-2病毒S蛋白質之胺基酸序列包含選自以下之一或多種取代：Y459H、D614G、S943P、K986P及V987P。
  12. 如請求項1至11中任一項之重組痘病毒，其中該編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸位於該痘病毒之對於複製該痘病毒非必需的區域中。
  13. 如請求項12之重組痘病毒，其中該編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸位於該痘病毒之胸苷激酶(TK)基因座中。
  14. 如請求項12之重組痘病毒，其中該編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸位於該痘病毒之B22R同源基因座中。
  15. 如請求項1至14中任一項之重組痘病毒，其中該編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸可操作地連接至啟動子。
  16. 如請求項15之重組痘病毒，其中該啟動子為痘病毒特異性啟動子。
  17. 如請求項16之重組痘病毒，其中該痘病毒特異性啟動子為痘瘡病毒早期啟動子。
  18. 如請求項16之重組痘病毒，其中該痘病毒特異性啟動子為痘瘡病毒晚期啟動子。
  19. 如請求項16之重組痘病毒，其中該痘病毒特異性啟動子為痘瘡病毒早期及晚期啟動子之串聯。
  20. 如請求項1至19中任一項之重組痘病毒，其中該痘病毒為合成痘病毒。
  21. 如請求項20之重組痘病毒，其中該重組痘病毒係選自由以下組成之群：TNX-2200 (synVACVΔA2K105SARS-CoV2-Spike-co )、TNX-2200純系1.1.1.1.1、TNX-2200純系2.1.1.1.1、TNX-1800 (scHPXVΔ200SARS-COV2-Spike-co )、TNX-1800a、TNX-1800a-1、TNX-1800b及TNX-1800b-2。
  22. 如請求項21之重組痘病毒，其中該重組痘病毒為TNX-1800b-2。
  23. 如請求項21之重組痘病毒，其中該重組痘病毒為TNX-1800a-1。
  24. 如請求項20之重組痘病毒，其中該重組痘病毒包含SEQ ID NO: 63、64或65中之任一者。
  25. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至24中任一項之重組痘病毒及醫藥學上可接受之載劑。
  26. 如請求項25之醫藥組合物，其中該重組痘病毒係選自由以下組成之群：TNX-2200 (synVACVΔA2K105SARS-CoV2-Spike-co )、TNX-2200純系1.1.1.1.1、TNX-2200純系2.1.1.1.1、TNX-1800 (scHPXVΔ200SARS-COV2-Spike-co )、TNX-1800a、TNX-1800a-1、TNX-1800b及TNX-1800b-2。
  27. 如請求項25之醫藥組合物，其中該重組痘病毒包含SEQ ID No: 63、64或65中之任一者。
  28. 如請求項26之醫藥組合物，其中該重組痘病毒為TNX-1800b-2。
  29. 如請求項26之醫藥組合物，其中該重組痘病毒為TNX-1800a-1。
  30. 一種細胞，其經如請求項1至29中任一項之重組痘病毒感染。
  31. 如請求項30之細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。
  32. 如請求項31之細胞，其中該哺乳動物細胞為Vero細胞、Vero E6細胞或BSC-40細胞。
  33. 一種用於選擇表現SARS-CoV-2病毒蛋白質之細胞的方法，其包含使該細胞感染如請求項1至24中任一項之重組痘病毒且選擇表現該SARS-CoV-2病毒蛋白質之經感染細胞。
  34. 如請求項33之用於選擇表現SARS-CoV-2病毒蛋白質之細胞的方法，其中該重組痘病毒係選自由以下組成之群：TNX-2200 (synVACVΔA2K105SARS-CoV2-Spike-co )、TNX-2200純系1.1.1.1.1、TNX-2200純系2.1.1.1.1、TNX-1800 (scHPXVΔ200SARS-COV2-Spike-co )、TNX-1800a、TNX-1800a-1、TNX-1800b及TNX-1800b-2。
  35. 如請求項33之用於選擇表現SARS-CoV-2病毒蛋白質之細胞的方法，其中該重組痘病毒包含SEQ ID No: 63、64或65中之任一者。
  36. 如請求項34之用於選擇表現SARS-CoV-2病毒蛋白質之細胞的方法，其中該重組痘病毒為TNX-1800b-2。
  37. 如請求項34之用於選擇表現SARS-CoV-2病毒蛋白質之細胞的方法，其中該重組痘病毒為TNX-1800a-1。
  38. 一種誘導個體之抗SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，其包含向該個體投與免疫學上有效量之如請求項1至24中任一項之重組痘病毒或如請求項25至29中任一項之醫藥組合物。
  39. 如請求項38之誘導個體之抗SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，其中該免疫學上有效量之該重組痘病毒係藉由劃痕法進行投與。
  40. 如請求項38之誘導個體之抗SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，其中該免疫反應包含能夠中和該SARS-CoV-2病毒之抗體。
  41. 如請求項38之誘導個體之抗SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，其中該免疫學上有效量之重組痘病毒能夠保護該個體免受SARS-CoV-2病毒感染。
  42. 如請求項38之誘導個體之抗SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，其中該免疫學上有效量之重組痘病毒減輕或預防該個體在SARS-CoV-2感染之後的該病毒之進展。
  43. 如請求項38之誘導個體之抗SARS-CoV-2病毒之免疫反應的方法，其中該免疫反應為T細胞免疫反應。
  44. 一種誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，其包含向該個體投與免疫學上有效量之如請求項1至24中任一項之重組痘病毒或如請求項25至29中任一項之醫藥組合物。
  45. 如請求項44之誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，其中該免疫學上有效量之該重組痘病毒係藉由劃痕法進行投與。
  46. 如請求項44之誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，其中該免疫反應包含能夠中和該SARS-CoV-2病毒及該痘病毒之抗體。
  47. 如請求項44之誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，其中該免疫學上有效量之重組痘病毒能夠保護該個體免受該SARS-CoV-2病毒及該痘病毒感染。
  48. 如請求項44之誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，其中該免疫學上有效量之重組痘病毒減輕或預防該個體之該SARS-CoV-2病毒感染及/或該痘病毒感染之進展。
  49. 如請求項44之誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，其中該免疫反應為T細胞免疫反應。
  50. 如請求項44至49中任一項之誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之免疫反應的方法，其中該痘病毒為痘瘡病毒、天花、馬痘病毒或猴痘病毒。
  51. 一種誘導抗SARS-CoV-2病毒之T細胞免疫性的方法，其包含向該個體投與免疫學上有效量之如請求項1至24中任一項之重組痘病毒或如請求項25至29中任一項之醫藥組合物。
  52. 如請求項51之誘導抗SARS-CoV-2病毒之T細胞免疫性的方法，其中該免疫學上有效量之該重組痘病毒係藉由劃痕法進行投與。
  53. 如請求項51之誘導抗SARS-CoV-2病毒之T細胞免疫性的方法，其中該免疫學上有效量之重組痘病毒能夠保護該個體免受SARS-CoV-2病毒感染。
  54. 如請求項51之誘導抗SARS-CoV-2病毒之T細胞免疫性的方法，其中該免疫學上有效量之重組痘病毒減輕或預防該個體之該SARS-CoV-2感染之進展。
  55. 一種誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之T細胞免疫性的方法，其包含向該個體投與免疫學上有效量之如請求項1至24中任一項之重組痘病毒或如請求項25至29中任一項之醫藥組合物。
  56. 如請求項55之誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之T細胞免疫性的方法，其中該免疫學上有效量之該重組痘病毒係藉由劃痕法進行投與。
  57. 如請求項55之誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之T細胞免疫性的方法，其中該免疫學上有效量之重組痘病毒能夠保護該個體免受該SARS-CoV-2病毒及該痘病毒感染。
  58. 如請求項55之誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之T細胞免疫性的方法，其中該免疫學上有效量之重組痘病毒減輕或預防該個體之該SARS-CoV-2感染及/或痘病毒感染之進展。
  59. 如請求項55至58中任一項之誘導抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之T細胞免疫性的方法，其中該痘病毒為痘瘡病毒、天花、馬痘病毒或猴痘病毒。
  60. 一種產生如請求項1至59中任一項中之重組痘病毒之方法，該方法包含： (a)    使宿主細胞感染痘病毒； (b)    使步驟(a)之經感染細胞轉染有編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸以產生重組痘病毒；及 (c)    選擇重組痘病毒，其中該編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸在轉染後位於該痘病毒之對於複製該痘病毒非必需的區域中。
  61. 如請求項33至60中任一項之方法，其中該SARS-CoV-2蛋白質係選自由以下組成之群：S刺突蛋白、M蛋白質及N蛋白質或該等蛋白質中之兩者或更多者的組合。
  62. 如請求項33至61中任一項之方法，其中該痘病毒為正痘病毒。
  63. 如請求項62之方法，其中該正痘病毒係選自由以下組成之群：駱駝痘病毒(CMLV)、牛痘病毒(CPXV)、鼠痘病毒(ECTV)、馬痘病毒(HPXV)、猴痘病毒(MPXV)、痘瘡病毒(VACV)、天花病毒(VARV)、兔痘病毒(RPXV)、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦森伊修病病毒及田鼠痘病毒。
  64. 如請求項62之方法，其中該正痘病毒為馬痘病毒。
  65. 如請求項64之方法，其中該馬痘病毒為病毒株MNR-76。
  66. 如請求項62之方法，其中該正痘病毒為痘瘡病毒。
  67. 如請求項66之方法，其中該痘瘡病毒係選自由以下組成之病毒株群：Western Reserve、Western Reserve純系3、Tian Tian、Tian Tian純系TP5、Tian Tian純系TP3、NYCBH、NYCBH純系Acambis 2000、Wyeth、Copenhagen、Lister、Lister 107、Lister-LO、Lister GL-ONC1、Lister GL-ONC2、Lister GL-ONC3、Lister GL-ONC4、Lister CTC1、Lister IMG2 (Turbo FP635)、IHD-W、LC16m18、Lederle、Tashkent純系TKT3、Tashkent純系TKT4、USSR、Evans、Praha、L-IVP、V-VET1或LIVP 6.1.1、Ikeda、EM-63、Malbran、Duke、3737、CV-1、Connaught Laboratories、Serro 2、CM-01、NYCBH Dryvax純系DPP13、NYCBH Dryvax純系DPP15、NYCBH Dryvax純系DPP20、NYCBH Dryvax純系DPP17、NYCBH Dryvax純系DPP21、VACV-IOC、安卡拉絨膜尿囊痘瘡病毒(CVA)、經修飾之安卡拉痘瘡病毒(MVA)及MVA-BN。
  68. 如請求項33至67中任一項之方法，其中該編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸位於該痘病毒之對於複製該痘病毒非必需的區域中。
  69. 如請求項68之方法，其中該編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸位於該痘病毒之胸苷激酶(TK)基因座中。
  70. 如請求項68之方法，其中該編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸位於該痘病毒之B22R同源基因座中。
  71. 如請求項33至70中任一項之方法，其中該編碼SARS-CoV-2病毒蛋白質之核酸可操作地連接至啟動子。
  72. 如請求項71之方法，其中該啟動子為痘病毒特異性啟動子。
  73. 如請求項72之方法，其中該痘病毒特異性啟動子為痘瘡病毒早期啟動子。
  74. 如請求項72之方法，其中該痘病毒特異性啟動子為痘瘡病毒晚期啟動子。
  75. 如請求項72之方法，其中該痘病毒特異性啟動子為痘瘡病毒早期及晚期啟動子之串聯。
  76. 如請求項33至75中任一項之方法，其中該痘病毒為合成痘病毒。
  77. 一種減輕或預防有需要或處於風險下之個體之SARS-CoV-2病毒感染之進展的方法，其包含向該個體投與免疫學上有效量之如請求項1至24中任一項之重組痘病毒或如請求項25至29中任一項之醫藥組合物。
  78. 一種減輕或預防有需要或處於風險下之個體之SARS-CoV-2病毒及痘病毒感染之進展的方法，其包含向該個體投與免疫學上有效量之如請求項1至24中任一項之重組痘病毒或如請求項25至29中任一項之醫藥組合物。
  79. 一種減輕或預防SARS-CoV-2病毒及痘病毒之進展的方法，其中該痘病毒為痘瘡病毒、天花、馬痘病毒或猴痘病毒。
  80. 一種抗SARS-CoV-2病毒之疫苗，其包含如請求項1至23中任一項之重組病毒或如請求項25至29中任一項之醫藥組合物。
  81. 一種抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之二價疫苗，其包含如請求項1至24中任一項之重組病毒或如請求項25至29中任一項之醫藥組合物。
  82. 一種抗SARS-CoV-2病毒及痘病毒之二價疫苗，其中該痘病毒為痘瘡病毒、天花、馬痘病毒或猴痘病毒。
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