TW202031140A - 一種南瓜子萃取物及其製備方法與用途 - Google Patents

Abstract

本發明之目的在於提供一種南瓜子萃取物，特別是一種從經電漿處理或發芽處理的南瓜子中萃取出的南瓜子萃取物；本案更進一步提供前述南瓜子萃取物的製備方法；及該南瓜子萃取物用於製備抗憂鬱、抗焦慮、鎮靜或輔助睡眠之組合物的用途。

Description

一種南瓜子萃取物及其製備方法與用途

本發明係關於南瓜子萃取物及其製備方法與用途，特別是南瓜子萃取物用於抗焦慮、抗憂鬱、鎮靜或輔助睡眠之用途。

精神疾病(Mental disorders)為一種患者在行為、認知或情緒調控上具有障礙的疾病。隨著社會工業化、資訊化，現代人的生活緊張、壓力增加，患有精神疾病的人數與日俱增，使精神疾病成為現代人必須面對的重要課題。美國精神醫學學會出版的精神疾病診斷與統計手冊第五版(The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders V，DSM-5)將精神疾病分成20類，其中，焦慮症(Anxiety disorders)和憂鬱症(Depressive disorders)為最常見的精神疾病。根據世界衛生組織的統計，患有焦慮症或/和憂鬱症的人數，於1990年到2013年期間上升了近50%，世界上約有10%左右的人口受到其影響。患有焦慮症的患者在心理方面常具有莫名的不舒服、煩躁不安或難以入睡的感受，並對感官知覺、學習及注意力造成影響。憂鬱症的病癥則是喪失興趣及愉悅感、時常感到悲傷或有降低自我價值行為，其亦常具有難以入睡眠、食欲不振，感覺疲倦或注意力不集中等症狀。

焦慮症和憂鬱症的成因可分成生理、心理和社會層面，現在已有多數研究指出，焦慮症和憂鬱症可能與腦內神經傳導物質的失衡有關，例如，憂鬱症可能是包含血清素(Serotonin)在內的腦內單胺類神經傳遞物質(Monoamine neurotransmitter)之缺乏或調控不良所致；又如，當人體缺乏γ-胺基丁酸(γ-Aminobutyric acid receptor，GABA)時，可能會導致焦慮及失眠。另外，有研究指出，憂鬱症可能與腦內的環磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)的表現有關，CREB的活化可具抗憂鬱效果，當細胞內CREB蛋白表達增加時，會增加BDNF mRNA表現，進而影響突觸可塑性、神經再生及神經存活。

隨著精神藥物科學的發展，目前已有許多不同抗焦慮和抗憂鬱藥物可供選擇。1961年，第一種苯二氮平類(Benzodiazepines，BZD)安眠鎮靜藥物問世後，即迅速取代當時被普遍使用的巴比妥類(Barbiturates)藥物，成為抗焦慮之首選藥物。BZD是一種中樞神經抑制劑，其是作用於γ-胺基丁酸受體(γ-Aminobutyric acid receptor，GABA receptor)上，常用於安眠、鎮靜及抗焦慮等。但臨床研究報告指出，長期使用BZD會產生依賴性及出現嗜睡、肌肉鬆弛、注意力不集中、記憶力和判斷力減退等症狀。丁螺環酮(Buspirone)是另一類常用於抗焦慮和抗憂鬱的藥物，丁螺環酮作用於血清素系統(Serotonergic system)，其鎮靜作用較弱、抗焦慮效果緩慢，服藥後常伴隨有頭痛暈眩、噁心、情緒不穩等副作用。單胺氧化酶抑制劑(Monoamine oxidase inhibitor，MAOIs)亦常被用於抗憂鬱，MAOIs是透過抑制單胺氧化酶(Monoamine oxidase，MAO)、減緩單胺類神經傳遞物質的分解來達到抗憂鬱效果，然而，MAOIs不可與富含酪胺(Tyramine)的食物一起 食用，否則會有引發高血壓的風險。

抗焦慮和/或抗憂鬱藥物或許能改善病情、使症狀獲得紓解，然而卻伴隨著許多副作用，且患者在減藥時常具有藥物戒斷症狀。因此，現在急需一種安全、低毒性、低副作用且能抗焦慮和/或抗憂鬱的天然物質。

中醫對焦慮症的治療藥物以養心安神藥為主，如：合歡皮、酸棗仁、柏子仁等，臨床使用經驗與近幾年的藥理研究顯示，中藥具有較低副作用的優點。然因植物生長習性與產區問題，大部分的中藥材，其產量有限。

南瓜為被廣泛種植於世界和食用的蔬菜，取得容易且營養價值高。醫學上認為南瓜味甘，溫和健脾、胃及大腸，並具有驅蟲、抗發炎、抗氧化、降低膽固醇及舒緩高血壓等作用。南瓜的種子(以下簡稱南瓜子)富含鋅、錳、膳食纖維、脂肪酸及維生素等營養素，具有多種保健功效，在中藥界為一種可食用和當藥材的中藥。南瓜子亦含有多種蛋白質及血清素的前驅物色胺酸(Tryptophan)，然其含量有限，若能借助現代科學方法提升南瓜子抗焦慮及抗憂鬱之成分含量，並有效將之萃取出，則對於抗焦慮和/或抗憂鬱的藥物或食療發展有莫大的貢獻。

本發明提供一種南瓜子萃取物的製備方法，其是包含步驟一、對南瓜子進行發芽處理；步驟二、將發芽處理後之南瓜子均質化，得一南瓜子粉末；步驟三、將前述南瓜子粉末與醇類萃取溶劑混合萃取而成；其中，該南瓜子粉末與醇類萃取溶劑的混合比例係1：4~6。

為達前述發明目的，該南瓜子粉末與醇類萃取溶劑的最佳混合比例係1：5。

為達前述發明目的，該醇類萃取溶劑係含有6M HCl的乙醇溶液；該乙醇溶液的體積百分濃度為80%~100%。

為達前述發明目的，該乙醇溶液的最佳體積百分濃度係95%。

為達前述發明目的，該步驟一、對南瓜子進行發芽處理前，可進一步加入電漿處理。

為達前述發明目的，該電漿處理係大氣電漿處理。

為達前述發明目的，該大氣電漿處理條件包含電壓8~12kV、電流30mA、頻率30000Hz和反應時間2~10分鐘。

為達前述發明目的，該大氣電漿處理的最佳反應時間為5分鐘。

本發明另提供一種從南瓜子萃取出的南瓜子萃取物，其特徵在於，該南瓜子經過包含電漿處理或發芽處理。

為達前述發明目的，該南瓜子萃取物的有效成分包含γ-胺基丁酸、色胺酸或血清素；其中，該南瓜子萃取物的每100g乾重中包含1700mg~9500mg的γ-胺基丁酸、960mg~2700mg的色胺酸或30mg~150mg的血清素。

為達前述發明目的，其中，該南瓜子萃取物的每100g乾重中包含4100mg~9400mg的γ-胺基丁酸、1100mg~2400mg的色胺酸或30mg~140mg的血清素。

本發明亦提供一種如前所述之南瓜子萃取物用於製備預防或改善腦內神經傳導物質失衡相關疾病之組合物的用途。

為達前述發明目的，該腦內神經傳導物質失衡相關疾病係焦慮症。

為達前述發明目的，該腦內神經傳導物質失衡相關疾病係憂鬱症。

為達前述發明目的，該南瓜子萃取物的有效劑量包含依體重口服給予小鼠每公斤體重0.1g~1.0g的南瓜子萃取物。

為達前述發明目的，該組合物可增加腦內單胺濃度、單胺代謝產物濃度或CREB表現量。

為達前述發明目的，該單胺係NE、DA或5-HT。

為達前述發明目的，該單胺代謝產物係MHPG、DOPAC或5-HIAA。

為達前述發明目的，該組合物可抑制腦內單胺氧化酶A活性。

為達前述發明目的，該組合物包含醫藥組合物、食品組合物或其組成。

本發明更進一步提供一種如前所述之南瓜子萃取物用於製備具鎮靜功效之組合物的用途。

為達前述發明目的，該組合物具改善失眠或輔助睡眠之功效。

本發明使用在世界各地皆容易取得的南瓜子作為取得抗憂 鬱、抗焦慮物及具鎮靜等功效之天然成分的材料，然而南瓜子本身能提供及萃取出的有效成分含量有限，為了達到發明目的，發明人不辭辛勞地測試出可大幅提升南瓜子萃取物有效成分的方法，並輔以動物實驗證實，使用本發明所提供之方法所萃取出的南瓜子萃取物，具有抗憂鬱、抗焦慮、鎮靜或輔助睡眠等諸多功效；此外，本發明更完善提供了該南瓜子萃取物抗憂鬱的作用機轉。相較於其他中草藥，本發明具有材料容易取得之優勢，適合工業大量生產；另，相較於傳統西藥，本發明具有使用天然物質、副作用較小之優勢。

上述多項優勢和功效，實屬充分符合新穎性及進步性之法定專利要件，爰依法提出申請，懇請 貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明。

第1圖係南瓜子萃取物之製備流程圖。

第2圖係南瓜子萃取物的抗焦慮功效實驗結果。

第3圖係南瓜子萃取物對小鼠自發運動量之影響。

第4圖係南瓜子萃取物對於輔助戊巴比妥(Pentobarbital)誘發睡眠之睡眠時間的影響。

第5圖係南瓜子萃取物對於強迫游泳試驗之小鼠不動時間(Immobility time)的影響。

第6圖係南瓜子萃取物對於尾部懸吊試驗之小鼠不動時間(Immobility time)的影響。

第7圖係電漿南瓜子萃取物對於強迫游泳實驗後小鼠腦內CREB表現量的影響。

本說明書中所述之所有技術性及科學用語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常知識者可共同瞭解的意義。

本說明書用語「醇類」包含，但不限於甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇。

本說明書用語「鹼性溶液」包含，但不限於氫氧化鉀(KOH)、氫氧化鈉(NaOH)、氫氧化鈣(Ca(OH)₂)。

本說明書用語「南瓜子萃取物」，除非另有所定義，否則係指經發芽處理之發芽南瓜子萃取物及經電漿處理和發芽處理之電漿發芽南瓜子萃取物的總稱。

本說明書用語「預防」、「改善」，包含以治療或預防之方式緩和、減輕、或改善至少一項疾病症狀或生理狀況、預防新增之症狀、抑制疾病或生理狀況、阻止或減緩疾病發展、造成疾病或生理狀況之復原、減緩因疾病造成的生理狀況、停止疾病症狀或生理狀況。

本發明所使用之組合物，其劑型包含，但不限於溶液(Solution)、乳劑(Emulsion)、懸浮液(Suspension)、粉末(Powder)、錠劑(Tablet)、丸劑(Pill)、口含錠(Lozenge)、片劑(Troche)、口嚼膠(Chewing gum)、膠囊(Capsule)以及其他類似或適用本發明之劑形。

本發明所述之組合物，可進一步添加一可食性材料，以製備為一種食品產品或保健產品。其中該可食性材料包含，但不限於：水 (Water)、流體乳品(Fluid milk products)、牛奶(Milk)、濃縮牛奶(Concentrated milk)、優酪乳(Yogurt)、酸乳(Sour milk)、冷凍優格(Frozen yogurt)、乳桿菌發酵飲料(Lactic acid bacteria-fermented beverages)、奶粉(Milk powder)、冰淇淋(Ice cream)、乳酪(Cream cheeses)、乾酪(Dry cheeses)、豆奶(Soybean milk)、發酵豆奶(Fermented soybean milk)、蔬果汁(Vegetable-fruit juices)、果汁(Juices)、運動飲料(Sports drinks)、甜點(Confectionery)、果凍(Jellys)、糖果(Candies)、嬰兒食品(Infant formulas)、健康食品(Health foods)、動物飼料(Animal feeds)、中草藥材(Chinese herbals)、膳食補充品(Dietary supplements)。

本發明所述之組合物，可進一步包括藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑。

適當之給藥途徑包含，但不限於口服、靜脈、直腸、氣霧、腸胃道、眼、肺、黏膜穿透、皮膚穿透、陰道、耳、鼻、局部給藥。

此外，腸胃道給藥之示例包括但不限於肌肉內、皮下、靜脈內、髓內注射，以及髓鞘內、心室內、腹腔內、淋巴內、鼻內注射。

本發明實施例中所使用之ICR雄性小鼠係購自樂斯科生物科技股份有限公司(BioLASCO Taiwan Co.,Ltd.)，體重22~24公克，每組實驗動物10隻。飼養於12小時亮12小時暗的燈光控制系統，飼養溫度控制於23±1℃，水與飲食供應不予限制。實驗動物管理與照顧依中華民國實驗動物學會出版之實驗動物飼養與管理指南規定。

本發明實施例中所使用之口服劑量，除非另外有所定義，否則係以每公斤動物體重所給的藥物/萃取物重量表示，具體的口服劑量係 依據每隻動物的個別體重回乘。南瓜子萃取物於本發明實施例中所使用的三種口服劑量分別為：0.1g/kg(低劑量)、0.5g/kg(中劑量)、1.0g/kg(高劑量)。

本發明實施例中所使用之腹腔注射(Intraperitoneal,IP)給藥劑量，除非另外有所定義，否則係以每公斤動物體重所給的藥物/萃取物重量表示，具體的給藥劑量係依據每隻動物的個別體重回乘。

本發明實施例中作為抗焦慮或鎮定功效實驗的正對照組係給予二氮平(Diazepam，DZP)的小鼠；DZP係一種常見用於治療焦慮症和失眠的藥物。

本發明實施例中作為抗憂鬱功效實驗的正對照組係給予伊米帕明(imipramine，IMIP)的小鼠；IMIP係一種常見用於治療憂鬱症的藥物。

本發明實施例中所得之數據，均以One-way ANOVA分析其變異數，再以Scheffe’s test檢定其間差異之顯著性，凡p值小於0.05以下時，則認為有統計意義。

本發明之實施例僅為例示，由於個體治療療程之變異極大，而大量的建議值之偏離並非異常。劑量可依據變異而改變，而不限於使用之化合物之活性、治療疾病或生理狀態、給藥方式、個體需求、疾病嚴重性、及醫師判斷。

本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。

實施例1 南瓜子萃取物之製備。

(1)發芽處理；包含將帶殼南瓜子用水洗淨後，使用70%~75%酒精對南瓜子進行殺菌，接著將殺菌完的南瓜子進行加熱泡水處 理，然後將加熱泡水處理完之南瓜子舖於溼紗布上方，於室溫下放置兩天待其發芽；其中，該加熱泡水處理包含將南瓜子置於40℃~65℃水中加熱20分鐘~40分鐘，接著泡水2小時~6小時，以於55℃水中加熱30分鐘，接著泡水4小時為最佳。(2)去殼均質化：將南瓜子秤重、去除外殼後，使用均質機粉碎，得一南瓜子粉末。(3)醇類萃取：將前述南瓜子粉末與一醇類萃取溶劑以1：4~6比例混合後，先進行較低溫加熱處理，接著進行較高溫加熱處理，得一南瓜子粗萃物；其中，該醇類萃取溶劑包含但不限於含有6M HCl的乙醇溶液，該含有6M HCl的乙醇溶液的乙醇體積百分濃度為80%~100%，以95%最佳，該含有6M HCl的乙醇溶液的6M HCl與乙醇的比例為1：8~10，以1：9為最佳；其中，該南瓜子粉末與醇類萃取溶劑的最佳混合比例為1：5；其中，該較低溫加熱處理係於45℃~65℃加熱10~30分鐘，以於55℃加熱20分鐘為最佳；其中，該較高溫加熱處理係於90℃~100℃加熱20~40分鐘，以於100℃加熱30分鐘為最佳。(4)濃縮凍乾：將前述南瓜子粗萃物靜置冷卻後，以濾紙過濾取得上清萃取液，使用鹼性溶液將上清萃取液調成中性pH值，接著使用真空濃縮機去除酒精，得一濃縮萃取液；使用真空冷凍乾燥機將濃縮萃取液凍乾成粉末。

如前述所述，其中，該南瓜子在進行發芽處理前，可進一步加入電漿處理；該電漿處理包含將南瓜子舖平於大氣電漿設備的鐵盤中，以電壓8~12kV、電流30mA、頻率30000Hz條件反應2~10分鐘，以5分鐘為最佳；大氣電漿反應期間會產生電子、正負電荷離子、氣體分子與活性自由基；其中該氣體分子包含臭氧。

實施例2 南瓜子萃取物之成分分析。

使用未經發芽處理和/或電漿處理，並依實施例1所述(2)~(4)步驟所萃取出的一般南瓜子萃取物作為成分對照組。取實施例1中所述之南瓜子萃取物或前述一般南瓜子萃取物，將其回溶於蒸餾水中，並使用孔徑0.45μM之過濾器過濾，得一萃取物回溶液。γ-胺基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)及色胺酸(Tryptophan)含量分析係使用Pereira等人於2008年所發表之方法，將其適度修改後進行；具體實施方式係，將0.25M GABA溶於水中，配製成GABA標準品稀釋液，或將0.05M色胺酸溶於2.5% KH₂PO₄中，配製成色胺酸標準品稀釋液；取100μL前述萃取物回溶液或100μL標準品稀釋液加入100μL硼酸鉀溶液，接著加入25μL的鄰苯二甲醛(O-phthaladehyde，OPA)衍生劑，衍生35分鐘後注射至高效能液相層析儀(High performance liquid chromatography，HPLC)中進行分析。血清素(Serotonin)含量分析之具體實施方式係，取100μL前述萃取物回溶液或100μL標準品稀釋液加入100μL硼酸鉀溶液後，注射至HPLC中進行分析。

分析結果如表1所示：經發芽處理的南瓜子萃取物(簡稱發芽南瓜子萃取物)，其γ-胺基丁酸、色胺酸含量較未經發芽和/或電漿處理的南瓜子萃取物(簡稱一般南瓜子萃取物)分別高出約2.9倍及1.5倍；同時經電漿處理和發芽處理的南瓜子萃取物(簡稱電漿發芽南瓜子萃取物)，其γ-胺基丁酸、色胺酸、血清素含量較一般南瓜子萃取物分別高出約6倍、2.4倍及3.4倍。由上述結果可知，對南瓜子進行發芽處理或/和電漿處理可有效的提升其可萃取出的γ-胺基丁酸、色胺酸或血清素含量。

表1

實施例3 南瓜子萃取物之抗焦慮功效實驗。

採用對舉臂型十字迷宮實驗作為抗焦慮功效之評估。對舉臂型十字迷宮係由兩個30cm×5cm的開放臂、兩個30cm×5cm×15cm的封閉臂、在中間用以連接各臂的5cm×5cm開放正方形及距離地面50cm高的腳架所組成。

實驗流程：以口服形式分別餵食實驗組小鼠發芽南瓜子萃取物或電漿發芽南瓜子萃取物，劑量如前所述；正對照組則是以口服形式給予小鼠1.5mg/kg的二氮平。餵食60分鐘後，將小鼠放入對舉臂型十字迷宮正方形中間，一次一隻，測定5分鐘，並於每隻小鼠測定完後將對舉臂型十字迷宮擦拭乾淨。

抗焦慮能力評估方式：以小鼠停留於開放臂及封閉臂之時間和次數作為評估標準。停留於開放臂之時間越長、進入次數越多，抗焦慮能力越好；反之，停留封閉臂之時間越長、進入次數越多，抗焦慮能力越差。

抗焦慮功效實驗結果顯示於第2圖：餵食小鼠低、中或高劑量的發芽南瓜子萃取物，小鼠進入開放臂之次數與停留時間皆有所提升，進入封閉臂之次數及時間皆有所減少；而餵食小鼠中或高劑量之電漿發芽南瓜子萃取物亦有相同的結果。結果顯示發芽南瓜子萃取物和電漿發芽南 瓜子萃取物對抗焦慮皆有正面影響功效。

實施例4 南瓜子萃取物之鎮靜功效實驗。

使用對自發運動量之影響和輔助誘發睡眠功效評估南瓜子萃取物之鎮靜功效。

(1)對自發運動量之影響：

使用活動量監測裝置(TruScan TV photobeam sensor E63-12)，偵測小鼠在裝置中運動及休息的時間和距離，以運動時間、靜止時間和水平移動距離作為評估指標。小鼠運動時間及水平移動距離越短、靜止時間越長，越鎮靜。

實驗流程：以口服形式分別餵食實驗組小鼠發芽南瓜子萃取物或電漿發芽南瓜子萃取物，劑量如前所述；正對照組則是以口服形式給予小鼠1.5mg/kg的二氮平。餵食55分鐘後，先將小鼠放入實驗裝置內適應5分鐘，再開始觀察並連續記錄60分鐘。

對小鼠自發運動量之影響結果顯示於第3圖：結果顯示高劑量的發芽南瓜子萃取物和高劑量的電漿發芽南瓜子萃取物對於自發運動量實驗之休息時間有延長作用。

(2)輔助誘發睡眠功效：

實驗流程：以口服形式分別餵食實驗組小鼠發芽南瓜子萃取物或電漿發芽南瓜子萃取物，劑量如前所述；正對照組則是以口服形式給予小鼠5mg/kg的二氮平。餵食60分鐘後，以腹腔注射形式給予小鼠45mg/kg的戊巴比妥(Pentobarbital)誘發睡眠，接著觀察起效時間(Onset)及睡眠時間(Sleeping time)；其中，該起效時間係指小鼠腹腔注射完戊巴比妥至翻 正反射(Righting reflex)消失的時間；其中，該睡眠時間係指小鼠翻正反射消失至翻正反射再現的時間。

誘發睡眠實驗結果顯示於第4圖：結果顯示高劑量的發芽南瓜子萃取物和高劑量的電漿發芽南瓜子萃取物對於睡眠時間有延長作用。

由上述對小鼠自發運動量之影響和誘發睡眠實驗結果可知，高劑量的發芽南瓜子萃取物和高劑量的電漿發芽南瓜子萃取物皆具鎮靜功效。

實施例5 南瓜子萃取物之抗憂鬱功效實驗。

使用強迫游泳試驗和尾部懸吊試驗評估南瓜子萃取物之抗憂鬱功效。

(1)強迫游泳試驗(Forced Swimming Test，FST)：

強迫游泳試驗係使用Porsolt於1978年所提出之方法：將小鼠個別放置於水深15公分、水溫維持在23-25℃的透明玻璃圓柱容器裡(高度：25公分，口徑：10公分)，老鼠會在水中掙扎試圖逃脫，努力無效後會放棄掙扎而在水面上呈現靜止不動的行為絕望(Behavioural despair)狀態。

實驗流程：以口服形式分別餵食小鼠低劑量、中劑量或高劑量的發芽南瓜子萃取物或電漿發芽南瓜子萃取物。每日口服給藥一次，口服給予小鼠兩週後，最後一次給藥60分鐘後進行實驗。以接受伊米帕明(10mg/kg,i.p.)腹腔注射30分鐘後的小鼠作為正對照組。實驗時間為6分鐘，前2分鐘為適應期，記錄後4分鐘小鼠不動時間(Immobility time)。小鼠不動時間越短，其抗憂鬱能力越好。

強迫游泳試驗結果顯示於第5圖：中、高劑量的發芽南瓜子 萃取物及低、中、高劑量的電漿發芽南瓜子萃取物，對於不動時間有縮短作用。由強迫游泳試驗可知，發芽南瓜子萃取物及電漿發芽南瓜子萃取物皆具抗憂鬱的效果。

(2)尾部懸吊試驗(Tail Suspension Test；TST)：

懸尾試驗採用Steru於1985所提出之方法：將小鼠尾部一公分黏貼膠帶，貼至離地面50公分高的壓克力箱，當小鼠被懸吊於半空中，為了克服不正常體位而掙扎，但努力無效後，小鼠會顯得無助而不再扭動，顯示絕望現象，此現象與強迫游泳試驗中的靜止不動很相似。

實驗流程：以口服形式分別餵食小鼠低劑量、中劑量或高劑量的發芽南瓜子萃取物或電漿發芽南瓜子萃取物。每日口服給藥一次，口服給予小鼠兩週後，最後一次給藥60分鐘後進行實驗。以接受伊米帕明(10mg/kg,i.p.)腹腔注射30分鐘後的小鼠作為正對照組。實驗時間為6分鐘，前2分鐘為適應期，記錄後4分鐘小鼠不動時間(Immobility time)。小鼠不動時間越短，其抗憂鬱能力越好。

懸尾試驗結果顯示於第6圖：中、高劑量的發芽南瓜子萃取物和低、中、高劑量的電漿發芽南瓜子萃取物對於尾部懸吊試驗之小鼠不動時間有縮短作用；因此，發芽南瓜子萃取物和電漿發芽南瓜子萃取物皆具抗憂鬱效果。

實施例6 電漿發芽南瓜子萃取物對腦內單胺(NE、DA或5-HT)及單胺代謝物(MHPG、DOPAC或5-HIAA)濃度的影響。

腦組織前處理：取前述實施例5(1)強迫游泳試驗完之小鼠。將小鼠斷頭取腦，將腦分成皮質(Cortex)部位、海馬體(Hippocampus)部位、 紋狀體(Striatum)部位及下視丘(Hypothalamus)部位樣品；各樣品分別加入均質溶液(配方：取8.8mg的抗壞血酸(Ascorbic acid)與122mg的EDTA溶於1000ml的0.1M過氯酸(Perchloric acid)中)，使用超音波均質；樣品均質完後，離心30分鐘，取上清液，該上清液即為待分析樣品。

標準品溶液：於實驗當天配製標準品溶液，具體配製方式係分別秤取5mg的NE、MHPG、5-HT、5-HIAA、DA及DOPAC，置於6個不同棕色瓶中，分別加12.5mL純水，混合均勻後分別取25μL，再分別加入1.25mL純水稀釋，稀釋完之溶液即為各單胺(NE、DA或5-HT)及單胺代謝物(MHPG、DOPAC或5-HIAA)的標準品溶液。

濃度測試：使用HPLC分離待分析樣品的單胺及單胺代謝物，並以電化學測定儀(Electrochemical detector)測定含量。

結果顯示於表2：中劑量的電漿南瓜萃取物可以提升皮質部位的DA、5-HT及5-HIAA；海馬體部位的NE及MHPG；下視丘部位的5-HT之濃度表現。高劑量的電漿南瓜萃取物則是可以提升皮質部位的DA、5-HT、DOPAC及5-HIAA；海馬體部位的NE、5-HT、MHPG及5-HIAA；紋狀體部位的5-HT及5-HIAA；下視丘部位的5-HT及5-HIAA之濃度表現。

所有數值均以平均值±平均值標準誤差(mean±SEM)表示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；與對照組(control)相比較。

實施例7 電漿發芽南瓜子萃取物對腦內單胺氧化酶(Monoamine oxidase，MAO)的影響。

腦組織前處理：如前述實施例5(1)強迫游泳試驗完之小鼠。將小鼠斷頭取腦，加入500μL的PBS(50mM，pH7.4)均質；均質後，離心30分鐘(4℃，12000rpm)，分開上清液與沉澱物(Pellet)；取上清液待用。

單胺氧化酶活性分析：取20μL PBS(50mM,pH=7.4)分 別置入微孔盤中，再先後加入20μL樣品稀釋溶液(4μL前述腦組織前處理上清液加入196μL PBS)、20μL amplex red(0.1mM)、20μL benylamine(MAO-B)(或20μL血清素(MAO-A))，爾後加入20μL HRP(5U/mL)，於室溫放置60分鐘反應後，以Ex 560/Em 590測其螢光值並計算出單胺氧化酶的活性。計算公式：(MAO值-Blank值)/蛋白質之值/樣品的總平均值，再乘以100%。

結果顯示於表3：中劑量及高劑量的電漿南瓜子萃取物可抑制腦內MAO-A的活性。

所有數值均以平均值±平均值標準誤差(mean±SEM)表示。*p<0.05，***p<0.001；與對照組(control)相比較。

實施例8 電漿發芽南瓜子萃取物對腦內CREB表現影響。

腦組織前處理：取前述實施例5(1)強迫游泳試驗完之小鼠，將小鼠斷頭取腦，加入500μL的PBS(50mM，pH7.4)均質；均質後，離心30分鐘(4℃，12000rpm)，分開上清液與沉澱物(Pellet)；取上清液待用。

CREB表現量測定：使用Bio-Rad分析套組，測出蛋白質濃度，之後利用西方點墨法觀察腦內CREB表現。

結果顯示於第7圖：中劑量和高劑量的電漿南瓜子萃取物可增加腦內CREB蛋白之表現量。

上列詳細說明係針對本發明之可實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。

Claims (22)

1. 一種南瓜子萃取物的製備方法，其是包含步驟一、對南瓜子進行發芽處理；步驟二、將發芽處理後之南瓜子均質化，得一南瓜子粉末；步驟三、將前述南瓜子粉末與醇類萃取溶劑混合萃取而成；其中，該南瓜子粉末與醇類萃取溶劑的混合比例係1：4~6。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該南瓜子粉末與醇類萃取溶劑的最佳混合比例係1：5。
3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該醇類萃取溶劑係含有6M HCl的乙醇溶液；該乙醇溶液的體積百分濃度為80%~100%。
4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中，該乙醇溶液的最佳體積百分濃度係95%。
5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該步驟一、對南瓜子進行發芽處理前，可進一步加入電漿處理。
6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中，該電漿處理係大氣電漿處理。
7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中，該大氣電漿處理條件包含電壓8~12kV、電流30mA、頻率30000Hz和反應時間2~10分鐘。
8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中，該大氣電漿處理的最佳反應時間為5分鐘。
9. 一種從南瓜子萃取出的南瓜子萃取物，其特徵在於，該南瓜子經過包含電漿處理或發芽處理。
10. 如申請專利範圍第9項所述之南瓜子萃取物，其中，該南瓜子萃取物的有效成分包含γ-胺基丁酸、色胺酸或血清素；其中，該南瓜子萃取物的每100g乾重中包含1700mg~9500mg的γ-胺基丁酸、960mg~2700mg的色胺酸或30mg~150mg的血清素。
11. 如申請專利範圍第10項所述之南瓜子萃取物，其中，該南瓜子萃取物的每100g乾重中包含4100mg~9400mg的γ-胺基丁酸、1100mg~2400mg的色胺酸或30mg~140mg的血清素。
12. 一種如申請專利範圍第9-11項所述之南瓜子萃取物用於製備預防或改善腦內神經傳導物質失衡相關疾病之組合物的用途。
13. 如申請專利範圍第12項所述之用途，其中，該腦內神經傳導物質失衡相關疾病係焦慮症。
14. 如申請專利範圍第12項所述之用途，其中，該腦內神經傳導物質失衡相關疾病係憂鬱症。
15. 如申請專利範圍第12項所述之用途，其中，該南瓜子萃取物的有效劑量包含依體重口服給予小鼠每公斤體重0.1g~1.0g的南瓜子萃取物。
16. 如申請專利範圍第12項所述之用途，其中，該組合物可增加腦內單胺濃度、單胺代謝產物濃度或CREB表現量。
17. 如申請專利範圍第16項所述之組合物，其中，該單胺係NE、DA或5-HT。
18. 如申請專利範圍第16項所述之組合物，其中，該單胺代謝產物係MHPG、DOPAC或5-HIAA。
19. 如申請專利範圍第12項所述之組合物，其中，該組合物可抑制腦內單胺氧化酶A活性。
20. 如申請專利範圍第12項所述之用途，其中，該組合物包含醫藥組合物、食品組合物或其組成。
21. 一種如申請專利範圍第9-11項所述之南瓜子萃取物用於製備具鎮靜功效之組合物的用途。
22. 如申請專利範圍第21項所述之用途，其中，該組合物具改善失眠或輔助睡眠之功效。

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