TW202019391A - 含有7β-羥膽固醇及脂質載體之組合物及其用於治療腫瘤性病理學之用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種包含7β-羥膽固醇衍生物及脂質載體(特別是植物油)之組合物，及其治療腫瘤性病理學(諸如多形性神經膠質母細胞瘤)之用途。該組合物可藉由經口途徑投與。

Description

含有7β-羥膽固醇及脂質載體之組合物及其用於治療腫瘤性病理學之用途

本發明係關於包含7β-羥膽固醇衍生物及脂質載體之組合物、其製備方法及其用於治療腫瘤性病理學(特定言之多形性神經膠質母細胞瘤)之用途。

該脂質載體可包含油或油之混合物，有利地係植物油或植物油之混合物。

特別地，本發明係關於一種包含7β-羥膽固醇衍生物及脂質載體之組合物，排除由一或多個脂質層形成之囊泡(諸如脂質體或微胞類型之囊泡)組成之脂質載體。

有利地，該組合物係呈液體形式並可藉由經口途徑投與。

特定言之，該7β-羥膽固醇衍生物係呈含在該脂質載體中之溶液形式。

在本發明描述中，同樣使用「7β-羥膽固醇(7beta-hydroxycholesterol/7β-hydroxycholesterol)」。

多形性神經膠質母細胞瘤(GBM)或IV級星形細胞瘤係一種腦腫瘤，其特徵基本上係將包括星形膠質細胞之神經膠質細胞轉化為癌細胞。

儘管在腫瘤學方面取得實質性的科學及治療進展，諸如在免疫療法及奈米技術領域中，GBM仍係一種無法治癒之癌症。研究人員及醫生充其量只能在中位數患者存活期可延長至多十五個月時感到滿意。

GBM處理帶來的主要問題係：(a)由幹細胞引起之複發。事實上，當現有療法成功根除全部或部分腫瘤時，幹細胞通常係造成腫瘤復發的結果；(b)用於化療法中之分子不易穿過血液腫瘤障壁(BTB)並因此少量的抗GBM劑到達腫瘤部位。為避免BTB帶來的問題，使用植入GBM腫瘤中之微型泵(Alzet®)、儲庫(Mamiya®)或支持物(Gliadel®)不會顯著提高化療法之效力。目前正在動物中研究用超音波照射腦使得BTB靈活於化療法之效力上之影響。

在化療法中，主要治療中之一者係組合療法，其由投與阿伐司汀(Avastin)®(抑制VEGF結合至其受體)及伊立諾替康(irinotecan)®(拓撲異構酶I之抑制劑)組成。PVC類型之三重療法(丙卡巴肼(Procarbazine)、DNA烷基化劑；長春新鹼(Vincristine)、抑制微管聚合；CCNU，非特異性烷基化劑)目前係極具爭議的。替莫唑胺(Temozolomide)(一種鳥嘌呤之烷基化劑)與放療法組合顯示對於患有高甲基化DNA之患者，中位存活期增加2至3個月(Stupp方案)。使用腫瘤治療領域(TTF)方法作為Stupp方案補充之臨床試驗正在進行中。測試西崙吉肽(cilengitide)(抑制一些整合素受體)及他崙帕奈(talampanel)(阻斷AMPA型之麩胺酸通道)之臨床試驗(III期)正在進行中。

此外，對除GBM以外的癌症顯示效力之化療法不會改善患有GBM之患者之中位數存活期。可提及(例如)博來黴素(bleomycin)(針對於霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)投與)、阿法替尼二馬來酸酯及順鉑(針對於非小細胞肺癌投與)及環磷醯胺(針對於乳腺癌投與)。

申請案WO2013/168096描述對體外人癌細胞(包括GBM)顯示抗腫瘤效力之7β-羥膽固醇衍生物家族，特定言之呈脂質體形式或呈乙醇溶液形式。特定言之，本申請案實例6中製備的化合物(在本申請案之實例中稱為「化合物BIM2b」)對人GBM系、U87-MG系(U87)顯示體外活性。 [技術問題]

因此需要一種調配物，其允許該7β-羥膽固醇衍生物(即具有治療活性之分子)穿過血液腫瘤障壁(BTB)之障礙，以便特定言之到達位於腦中之腫瘤，同時含有足夠量之該治療性分子。

亦尋求一種調配物，其允許容易投與，較佳藉由經口途徑，並考慮到患者不穩定的健康狀態，在可達數週或甚至數月之治療時間內不會引起毒性作用。

類固醇化合物(諸如類固醇激素)、礦物類皮質激素及糖皮質激素缺乏形成膽固醇之一部分及氧固醇(oxysterol)家族之一部分之側鏈。此外，在某些類固醇化合物中，存在與醇官能及芳族環組合之酮官能，而膽固醇及最常見的氧固醇則不然。

因此，類固醇化合物通常比膽固醇及7β-羥膽固醇衍生物(特定言之下面的式(I)化合物)更容易溶於油中，原因如下： - 類固醇化合物之空間位阻小於膽固醇及以上所提及的7β-羥膽固醇衍生物之空間位阻， - 類固醇化合物比膽固醇及7β-羥膽固醇衍生物具有更多的具有離域電子之化學官能及環，及 - 在類固醇化合物中發現的具有極性特徵之化學官能及環狀結構允許結合至存在於油中之酸官能、醇、雙鍵及某些環(菠菜固醇(spinasterol)、仙人掌甾醇(schottenol))及因此比膽固醇及以下式(I)之7β-羥膽固醇衍生物更佳地溶解於油中。

現已發現，組合7β-羥膽固醇衍生物及脂質載體(不包括由由一或多個脂質層形成的脂質囊泡組成之脂質載體)之調配物允許該固醇衍生物跨越BTB，以及在動物體內獲得顯著的抗GBM活性。

較佳地，該調配物組合7β-羥膽固醇衍生物及脂質載體，不包括由由一或多個脂質層形成的脂質囊泡組成之脂質載體或由至少一種呈非脂質體形式之磷脂組成之脂質載體。

有利地，該7β-羥膽固醇衍生物係呈含在根據本發明之脂質載體中之溶液形式。

獲得此等性質(即BTB之交叉，足量的活性產品之投與，沒有毒性及在體內獲得治療效果)之組合係特別難以實現的，尤其係在腫瘤性病理領域中，其中單獨穿過BTB係活性產品效率之主要障礙。

根據本發明，該脂質載體係特定言之醫藥上可接受之脂質載體。

特定言之，該脂質載體包含飽和及/或單不飽和及/或多不飽和脂肪酸或其混合物，特別係呈單酸甘油酯、二酸甘油酯或三酸甘油酯或其混合物形式的。

「由一或多個脂質層形成的脂質囊泡」意指包含一或多個脂質層或由一或多個脂質層構成之脂質囊泡，諸如(例如)脂質體或微胞類型之囊泡。

有利地，根據本發明之脂質載體包含至少一種不為磷脂之脂質，該磷脂係呈脂質體或非脂質體形式。

有利地，亦發現該調配物在約1.5之pH(人體胃消化之pH)下及在約8.5至10之pH(在人體乏特氏壺腹區(Vater zone)階段消化之pH)下係穩定的，在藉由經口途徑投與之情況下，此特別尋求使活性化合物到達作用部位。

因此，根據第一態樣，本發明係關於包含至少一種7β-羥膽固醇衍生物及脂質載體之組合物，不包括由由一或多個脂質層形成的脂質囊泡組成之脂質載體或由呈非脂質體形式之磷脂組成之脂質載體，其中該7β-羥膽固醇衍生物對應於式(I)

(I) 其中： -A表示 -C(O)R₁ 基團，其中R₁ 為包含5至14個成員並包含1或2個雜原子之未經取代或經至少一個直鏈或分支鏈C₁ -C₆ 烷基或選自OR、NRR'、NHR及SR之基團取代之飽和雜環，其中R及R'獨立地表示氫、直鏈或分支鏈C₁ -C₁₂ (較佳係C₁ -C₆ )烷基，或未經取代之芳基； 或-(R₂ )_n -基團，其中R₂ 為由C端結合之胺基酸殘基且n=1至3，R₂ 各自相同或不同，其中該胺基酸之N端可經-C(O)R₃ 基團取代，其中R₃ 為單環或多環C₆ -C₁₄ 芳基烷基；可包含一或多個可相同或不同的雜原子之單環或多環C₅ -C₁₄ 雜芳基烷基；可包含一或多個可相同或不同的雜原子之單環或多環C₆ -C₁₄ 芳基烷基氧基或單環或多環C₅ -C₁₄ 雜芳基烷基氧基， -B表示-C(O)R₄ 基團，其中R₄ 為未經取代或經如上所定義的選自OR、NRR'、NHR及SR之基團取代之直鏈或分支鏈C₁ -C₁₂ (較佳係C₁ -C₆ )烷基；未經取代或經如上所定義的選自OR、NRR'、NHR及SR之基團取代之芳基；或R₄ 表示OR₅ ，其中R₅ 為直鏈或分支鏈C₁ -C₁₂ (較佳係C₁ -C₆ )烷基。

烷基表示直鏈或分支鏈C₁ -C₁₂ 基，諸如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、戊基、異戊基、第二戊基、第三戊基、新戊基、己基、異己基、第二己基、第三己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基或十二烷基，較佳係直鏈或分支鏈C₁ -C₆ 烷基。

芳基表示不飽和、單環或多環、碳環C₆ -C₁₄ 基，諸如苯基、萘基、茚基、蒽基，且更特定言之苯基。

「雜原子」意指氧、氮或硫原子。

有利的胺基酸殘基為(例如)甲硫胺醯基、甘胺醯基或丙胺醯基單元。

式(I)化合物之製備描述於申請案EP2666382及WO2013/168096中。

在本發明描述之含義內，「包括」可理解為涵蓋「包含」、「由……構成」或「由……組成」之含義。

在本發明描述之含義內，「由……構成」或「由……組成」不包括除該措辭者之外的其他特徵之存在。

有利地，該7β-羥膽固醇衍生物係呈含在該脂質載體中之溶液形式。

較佳地，脂質載體包含油或油之混合物，有利地係植物油或植物油之混合物。

根據另一態樣，本發明係關於包含至少一種7β-羥膽固醇衍生物及脂質載體之組合物，該脂質載體包含油或油之混合物，其中該7β-羥膽固醇衍生物對應於式(I)

(I) 其中： -A表示 -C(O)R₁ 基團，其中R₁ 為包含5至14個成員並包含1或2個雜原子之未經取代或經至少一個直鏈或分支鏈C₁ -C₆ 烷基或選自OR、NRR'、NHR及SR之基團取代之飽和雜環，其中R及R'獨立地表示氫、直鏈或分支鏈C₁ -C₁₂ (較佳係C₁ -C₆ )烷基，或未經取代之芳基； 或-(R₂ )_n -基團，其中R₂ 為由C端結合之胺基酸殘基且n=1至3，R₂ 各自相同或不同，其中該胺基酸之N端可經-C(O)R₃ 基團取代，其中R₃ 為單環或多環C₆ -C₁₄ 芳基烷基；可包含一或多個可相同或不同的雜原子之單環或多環C₅ -C₁₄ 雜芳基烷基；可包含一或多個可相同或不同的雜原子之單環或多環C₆ -C₁₄ 芳基烷基氧基或單環或多環C₅ -C₁₄ 雜芳基烷基氧基， -B表示-C(O)R₄ 基團，其中R₄ 為未經取代或經如上所定義的選自OR、NRR'、NHR及SR之基團取代之直鏈或分支鏈C₁ -C₁₂ (較佳係C₁ -C₆ )烷基；未經取代或經如上所定義的選自OR、NRR'、NHR及SR之基團取代之芳基；或R₄ 表示OR₅ ，其中R₅ 為直鏈或分支鏈C₁ -C₁₂ (較佳係C₁ -C₆ )烷基。

特定言之，該脂質載體係由油或油之混合物組成，有利地係植物油或植物油之混合物。

「植物油」意指從油性植物提取之脂肪物質，亦即其之植物特定部分(諸如種子、堅果或果實)包含脂質，特定言之食用油。

植物油包含植物來源之飽和、單不飽和及/或多不飽和脂肪酸，其主要呈醯基甘油化合物(亦稱為甘油酯(甘油及脂肪酸之酯))之形式存在。該醯基甘油化合物為油之主要成分，特定言之，量佔該植物油之組分之至少80%，較佳至少90%、或至少95%。該醯基甘油化合物可係呈單酸甘油酯、二酸甘油酯或三酸甘油酯或其混合物之形式。

較佳地，植物來源之該脂肪酸包含4至24個碳原子(C4至C24)，特定言之10、12、14、16、18、20或22個碳原子。該脂肪酸可在碳鏈中包含(例如)一至三個雙鍵。

該植物油亦可包含(例如)少量，諸如少於20%，較佳少於10%，或少於5%之除醯基甘油之外之化合物，諸如磷脂、植物固醇、生育酚、鞘脂(sphyngolipid)、類胡蘿蔔素(carotenoïds)等。

該植物油可選自(例如)摩洛哥堅果油(argan oil)、鱷梨油(avocado oil)、亞麻籽油、向日葵油、棕櫚油、甘藍椰子油、椰子油、葡萄籽油、黑芥子油、罌粟籽油、牛油樹油、甜杏仁油、大豆油、花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油、可可油、蓖麻油、辣木油(Moringa oil)(或山萮油(Ben oil))、油菜籽油、胭脂樹油(annatto oil)、小麥胚芽油、紅花油、核桃油、榛子油、油菜籽油或其混合物。

較佳使用具有低維生素E含量之植物油，特定言之摩洛哥堅果油。

植物油亦可藉由合成以合成方式產生，例如，藉由製備具有相似化學組成之油，例如製備包括甘油酯之油。

使用油或油之混合物(有利地係植物油或植物油之混合物)作為組合物中之脂質載體使得可獲得可包含足量之式(I)化合物之組合物，以獲得穿過血液腫瘤障壁(BTB)之通道及所需治療活性。

該油(特定言之植物油)較佳以醫藥上可接受之形式使用。

此外，根據本發明之包含此種脂質載體之調配物在極端pH下(諸如在約1.5之pH (人體胃消化之pH)下及在約8.5-10之pH (在人體乏特氏壺腹區階段消化之pH)下)具有極好的穩定性，此使得可保持式(I)化合物之活性。在由一或多個脂質層形成的脂質囊泡(諸如脂質體或微胞類型之囊泡)之情況下，尚未證實此等性質。

較佳之式(I)化合物為彼等化合物，其中： - A表示-C(O)R₁ 基團，其中R₁ 為包含5至14個成員並包含1或2個雜原子之未經取代或經至少一個直鏈或分支鏈C₁ -C₆ 烷基取代之飽和雜環； - B表示-C(O)R₄ 基團，其中R₄ 為直鏈或分支鏈C₁ -C₁₂ (較佳係C₁ -C₆ )烷基或R₄ 表示OR₅ ，其中R₅ 為直鏈或分支鏈C₁ -C₁₂ (較佳係C₁ -C₆ )烷基。

根據一個較佳態樣，R₁ 為包含5個成員並包含2個氧原子之經至少一個直鏈或分支鏈C₁ -C₆ 烷基(特定言之甲基)取代之飽和雜環。特定言之，R₁ 為2,2-二甲基-1,3-二氧戊環基。

較佳地，R₄ 為直鏈或分支鏈C₁ -C₆ 烷基，特定言之甲基。

根據一個較佳態樣，B表示醯基，其中烷基為C₁ -C₆ ，特定言之乙醯基或烷氧基羰基，其中烷基為C₁ -C₆ ，特定言之第三丁氧基羰基。

其他較佳之式(I)化合物為彼等化合物，其中： -A表示-(R₂ )_n -基團，其中R₂ 為胺基酸殘基且n=2；或 -A表示-(R₂ )_n -基團，其中R₂ 為胺基酸殘基，n=2及該胺基酸之N端係經芳基烷氧基羰基(特定言之苄基氧基羰基)取代；或 -A表示結合至甘胺醯基之丙胺醯基，其在其N端視需要經芳基烷氧基羰基(特定言之苄基氧基羰基)取代；或 -A表示結合至甘胺醯基之甲硫胺醯基，其在其N端視需要經芳基烷氧基羰基(特定言之苄基氧基羰基)取代，及 -B係如以上所定義，在其一般或較佳定義中。

較佳之式(I)化合物如下： -2-(2-(((苄基氧基)羰基)胺基)-乙醯胺基)丙酸7-((第三丁氧基羰基)氧基)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊[a]菲-3-基酯，亦給出簡化的名稱「3-苄基氧基羰基-甘胺醯基-丙胺醯基-7-β-O-第三丁基氧基羰基-膽固醇」或化合物BIM1a； -2-(2-(((苄基氧基)羰基)胺基)-乙醯胺基)丙酸7-乙醯氧基-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊[a]菲-3-基酯，亦給出簡化的名稱「3-苄基氧基羰基-甘胺醯基-丙胺醯基-7-β-O-乙醯基-膽固醇」或化合物BIM1b； -2,2-二甲基-1,3-二氧戊環-4-羧酸7-((第三丁氧基羰基)氧基)-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊[a]菲-3-基酯，亦給出簡化的名稱「3-(S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊環-4-羧基-7-β-O-第三丁基氧基羰基-膽固醇」或化合物BIM2a； -2,2-二甲基-1,3-二氧戊環-4-羧酸7-乙醯氧基-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊[a]菲-3-基酯，亦給出簡化的名稱「3-(S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊環-4-羧基-7-β-O-乙醯基-膽固醇」或「膽甾-5-烯-3,7-二醇，7-乙酸酯3-[[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊環-4-基]羧酸酯]，(3β，7β)」或化合物BIM2b。

此等式(I)化合物分別描述於申請案WO2013/168096之實例3、4、5及6中。

尤佳用於本發明目的之式(I)化合物為以上提及的「化合物BIM2b」，亦即式(I)化合物，其中A為-C(O)R₁ 基團，其中R₁ 為2,2-二甲基-1,3-二氧戊環基及B為乙醯基。

該化合物對應於式

化合物BIM1a為式(I)化合物，其中A為3-苄基氧基羰基-甘胺醯基-丙胺醯基及B為第三丁氧基羰基。

化合物BIM1b為式(I)化合物，其中A為3-苄基氧基羰基-甘胺醯基-丙胺醯基及B為乙醯基。

化合物BIM2a為式(Ⅰ)化合物，其中A為-C(O)R₁ 基團，其中R₁ 為2,2-二甲基-1,3-二氧戊環基及B為第三丁氧基羰基。

在本發明描述中且除非另有說明，否則包含所指示的值之範圍。

根據本發明之組合物中式(I)化合物之含量較佳為組合物總體積之0.1至3.5%(w/v)，較佳係3%。較佳地，該組合物包含式(I)化合物，其比率為1至35 mg/ml，較佳係30 mg/ml。

根據本發明之組合物中脂質載體(特定言之植物油)之含量較佳為組合物總體積之90至99%，特定言之95至99%(v/v)。

在油性組合物之情況下，根據本發明之組合物亦可包含至少一種常用賦形劑或添加劑(例如共溶劑，諸如(例如)醇)或抗氧化劑。

該共溶劑(諸如(例如)醇)可(例如)以組合物總體積之0至5%，特定言之1至5%(v/v)之比率存在於組合物中。

對於醇，較佳使用式R-OH之醇，其中R表示C₂ -C₆ 烴基，較佳係乙醇。

抗氧化劑可選自該領域中常用的化合物，例如： -羥基化物質，諸如檸檬酸及其衍生物，特別是檸檬酸鈉、檸檬酸鈣或檸檬酸鉀；抗壞血酸及其衍生物，特別是異抗壞血酸、抗壞血酸鈉或抗壞血酸鈣； -硫醇衍生物，諸如半胱胺酸、乙醯基半胱胺酸、二硫蘇糖醇； -烯系不飽和物質，諸如山梨酸等。

該抗氧化劑可以例如0.005至0.020%(w/v)，特別是0.005至0.015%(w/v)，較佳0.01%之比率存在於組合物中。

較佳之抗氧化劑係選自抗壞血酸及其衍生物。

根據本發明之較佳組合物包含3%(w/v)之式(I)之7β-羥膽固醇衍生物(特別是以上提及的較佳式(I)化合物中之一者，且更特別係化合物BIM2b)、0.01%無水檸檬酸(w/v)及1%乙醇(v/v)於摩洛哥堅果油中。該組合物亦可不含乙醇。

本發明亦關於包含如上所述的組合物之醫藥組合物。

該醫藥組合物亦可含有可溶於脂質介質中之另一種活性成分，諸如抗炎劑(特別是皮質激素)，或抗癲癇劑。

根據本發明之醫藥組合物可較佳呈適於經口途徑投與之形式，特別是呈液體形式，諸如經口溶液、經口懸浮液、滴劑等，或呈囊封形式，諸如囊封該液體調配物之膠囊，特別是基於明膠之硬或軟膠囊。

本發明亦關於一種用於製備包含如上所述的7β-羥膽固醇衍生物及脂質載體之組合物之方法，該方法包括以下步驟： - 製備含有如上所述的式(I)之7β-羥膽固醇衍生物、脂質載體及共溶劑之混合物， - 視需要添加抗氧化劑，及 - 若適用，蒸發共溶劑。

脂質載體、抗氧化劑及共溶劑係如以上所定義。以上提及的較佳態樣亦適用於根據本發明之方法。

特定言之，該脂質載體由油或油之混合物(有利地，植物油或植物油的混合物，特定言之摩洛哥堅果油)組成。

該油(特定言之植物油)較佳以醫藥上可接受之形式使用。

該方法之較佳條件如下： - 混合物之製備溫度為約22至35℃，較佳33℃； - 混合物中式(Ⅰ)化合物之含量為0.1至3.5%(w/v)； - 混合物中共溶劑(較佳乙醇)之初始含量為約1至5%，較佳2.5%(v/v)； - 混合物中抗氧化劑(較佳檸檬酸及其衍生物)之含量為0.005至0.020%(w/v)，特定言之0.005至0.15%，較佳0.01%(w/v)。

包含式(I)之7β-羥膽固醇衍生物、脂質載體及共溶劑及視需要之抗氧化劑之混合物可(例如)在攪拌下使用旋轉蒸發器混合直至式(I)化合物溶解。

該混合物可例如藉由將式(I)之7β-羥膽固醇衍生物及脂質載體混合，然後添加共溶劑及視需要之抗氧化劑來實現。

蒸發後獲得的共溶劑(且特定言之醇(特定言之乙醇))之含量與醫藥形式之現行規定(ICH Q3C(R6)法規)相容。

本發明亦關於包含式(I)之7β-羥膽固醇衍生物及如以上所定義的脂質載體之組合物，其用於治療腫瘤性病理學，特定言之多形性神經膠質母細胞瘤。

本發明亦關於包含式(I)之7β-羥膽固醇衍生物及如以上所定義的脂質載體之組合物，其用於治療惡性血液病，特定言之骨髓類型之惡性血液病。

本發明亦關於治療腫瘤性病理學，特定言之多形性神經膠質母細胞瘤之方法，該方法包括對需要該治療的患者投與有效量之包含式(I)之7β-羥膽固醇衍生物及如以上所定義的脂質載體之組合物。

本發明亦關於治療惡性血液病，特定言之骨髓類型之惡性血液病之方法，該方法包括對需要該治療的患者投與有效量之包含式(I)之7β-羥膽固醇衍生物及如以上所定義的脂質載體之組合物。

本發明亦關於一種醫藥組合物，其包含包括式(I)之7β-羥膽固醇衍生物及如以上所定義的脂質載體之組合物，其用於治療腫瘤性病理學，特定言之多形性神經膠質母細胞瘤，或用於治療惡性血液病，特定言之骨髓類型之惡性血液病。

以上提及的一般及較佳態樣(特定言之對於式(I)之7β-羥膽固醇衍生物及脂質載體)亦適用於此等用途。

投與的劑量可係(例如) 3至5 mg/kg/天，持續時間之範圍為(例如) 84至105天。然而，劑量可根據患者病情及疾病階段增加至30 mg/kg/天及治療持續時間可增加(例如)至2個月。

藉由實例1-2(製備)及實例3至8(結果)說明本發明。

如實例1及2中詳細描述的BIM2b之溶解方法允許BIM2b溶解在油(特定言之摩洛哥堅果油)中。在一個有利的態樣中，在1至500 ml油之範圍內，將BIM2b粉末添加至油、混合BIM2b/油系統及進行混合之表面積/體積比之條件導致完成BIM2b粉末在油中溶解。

使用以下縮寫： 7β-乙醯基-CH：7β-乙醯基-膽固醇 7β-OHCH：7β-羥膽固醇 APCI：大氣壓化學電離源 TLC：薄層層析 CH：膽固醇 CHCl₃ ：氯仿 化合物BIM2b：化合物2,2-二甲基-1,3-二氧戊環-4-羧酸7-乙醯氧基-10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-1H-環戊烷并[a]菲-3-基酯，亦稱為膽甾-5-烯-3,7-二醇，7-乙酸酯 3-[[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊環-4-基]羧酸酯]，(3β,7β) 化合物BIM2b PO：實例2之油性調配物形式之化合物BIM2b，適於藉由經口途徑投與 EtOH：乙醇 Folch：CHCl₃ :MetOH(2:1，v:v) AO：摩洛哥堅果油 HCl：鹽酸 GBM：多形性神經膠質母細胞瘤 HPTLC：高效薄層層析 KCl：氯化鉀 MetOH：甲醇 NaOH：氫氧化鈉 p：重量 MW：分子量 RT：環境溫度 UPLC MS：超高效液相層析-質譜 v：體積A/ 所使用的分子及載體及分析 1)活性物質

如申請案WO2013/168096中所述合成在GLP/GMP等級之膽甾-5-烯-3,7-二醇，7-乙酸酯 3-[[(4S)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊環-4-基]羧酸酯]，(3β,7β)(以如實例6中所述的粉末形式獲得)。

該分子(其式如下)在整個實驗部分稱為BIM2b。

分子量：572.83 2)活性物質之降解產物及主要代謝產物 a) 如申請案WO2013/168096中所述合成7β-乙醯基-膽固醇(化合物1.4)。

該分子(其式如下)在整個實驗部分稱為7β-乙醯基-CH。

分子量：444 b)     7β-羥膽固醇由SIGMA(參考號700035P)提供。

該分子(其式如下)在整個實驗部分稱為7β-OHCH。

分子量：402.65 c) 膽固醇由SIGMA(參考號C8503)提供。

該分子(其式如下)在整個實驗部分稱為CH。

分子量：386.65 d) 所選擇的載體為摩洛哥堅果油(Olsana，France)，在實驗部分稱為AO。B) 材料及方法 I) 材料 I.1) 層析 I.1.1)高效薄層層析 (HPTLC) 及習知矽膠管柱上之吸附層析 - 用於層析之多板槽20 x 20 cm(參考號552-0359) - 帶玻璃料之層析柱(有用長度：300 mm；內徑=11 mm；鑰匙式PTFE活塞1.5 mm)(Analytic Lab，參考號LE-AT1811) - 粉狀矽膠60 (0.063-0.200 mm)(參考號1.07734.1000) - HPTLC板：在鋁箔(VWR，參考號1055830001)上具有濃縮區(2.5 cm)之矽膠60 F254。 - 霧化器及Erlenmeyer燒瓶100 ml (Witeg，參考號2147100，NS 14.5/23) - 熱板(Stuart SB162) - 硼矽酸鹽玻璃管 - 掃描儀(Epson Perfection V370 Photo) - 微毛細管Drummond 10 µl (Sigma，參考號P1924) I.1.2)吸附盒或反相層析 - SEP PAK經典矽膠(Waters，參考號WAT051900) - SEP PAK Plus C18 (Waters，參考號WAT023635) I.1.3)超高效液相層析 - 質譜 (UPLC – MS)

所研究的分子(BIM2b及其代謝產物)之定量係使用配備Kinetex EVO C18管柱之Nexera X2 UPLC系統(Shimadzu)進行精心製作(粒徑：1.9 µm；管柱尺寸：100 x 2.1 mm，Phenomenex)。用四極桿(LCMS 8050，Shimadzu)進行APCI偵測。I.2) 適於藉由經口途徑投與之 BIM2b 之調配物 (BIM2b PO) - Sartorius Quintix精密天平(Sartorius，參考號QUINTIX 124-1S) - 5 ml硼矽酸鹽玻璃管12 x 75 mm (Kimble，參考號73500-1275) - 25 ml硼矽酸鹽玻璃管Pyrex 18 x 180 mm (Dutscher，參考號090482) - 5 ml燒杯 - 帶有磨砂玻璃活塞之1公升反應燒瓶(female，29/32NS) (VWR，參考號201-1359) - R-215 Buchi旋轉蒸發器 - 耦合至C接口數位相機(NIKON，DCMC510)之相位倒置光學顯微鏡Eclipse TS-100F trinocular Nikon (Dutscher，參考號：094501)I.3) 研究中之分子 (BIM2b 及其代謝產物 ) 之定量 ： 野生型小鼠之腦的均質化及 患有 GBM 之狗之腦之屍檢後獲得的腫瘤之均質化 - 均質機(Ika eurostar 20數位) - Potter-Elvehjem組織研磨機(容量：4 ml；長度：120 mm；外徑：11 mm)(VWR，參考號432-0200) - 球形分液漏斗，250 ml，帶有PTFE活塞(Dutscher，參考479036) - 分液漏斗，50 ml，帶有PTFE活塞(Dutscher，參考084118)I.4) 有機溶劑及其他消耗品 - 用於管柱層析之矽膠，矽膠60(0.063-0.200 mm) (Merck，參考案1.07734.1000) - CHCl₃ ，HPLC級(Sigma，參考號528730) - EtOH絕對值(Sigma，參考號SI-32221) - 用於HPLC之MetOH chromasolv≥99.9%(SIGMA，參考號34860) - 用於HPLC之正己烷(Fisher Scientific，參考號1070361) -乙醚，經穩定用於HPLC (Analytic Lab，參考號FI-10254914) - 丙酮(Sigma-Aldrich，參考號322201) - 正磷酸99%(Analytic Lab，參考號U1B203102H) - 乙酸銅98%(Sigma，參考號326755/ - 丁基化羥基甲苯(BHT；Sigma，W218405，參考號W218405) - 鹽酸最低37%(HCl，Thermofisher，參考號M0643H) - 蘇打(Soda)(NaOH/Thermofisher，參考號04815) - 碳酸銨(Sigma，參考號207861) - 氯化鉀(Fisher Scientific，參考號W2752) - Formol或甲醛溶液(36.5-38%含在水中)(Sigma，參考號F8775) - 乙酸銨(Merck，參考號C138315)II) 方法 II.1)  HPTLC 層析

該分析方法用於定量藥物(BIM2b PO)中之BIM2b、其降解產物及其主要代謝產物(BIM2b PO)、及野生型小鼠之腦或來自具有該病理的狗之GBM腫瘤。以實驗方式確定的BIM2b及其降解產物(7β-乙醯基-CH及7β-OHCH)之偵測臨限值為0.5 μg。

該方法藉由UPLC–MS來驗證。

- HPTLC 板之處理 多板層析槽用溶析劑系統CHCl₃ :MetOH混合物(1:1；v:v)飽和1 h。將HPTLC板置於槽中；當溶析劑前端到達距板的頂部邊緣1.5-2 cm時停止溶析。然後將其等在環境溫度下乾燥1 h。接下來，將此等板在110℃下活化15 min。一旦其等已冷卻，立刻將其等用鋁箔包裹並遠離光及水分儲存。

- 基於 HPTLC 板及層析條件沉積樣本 將所有樣本溶解於丙酮中並用Drummond毛細管(10 μl)沉積在HPTLC板之濃縮區上。當使用BIM2b、7β-乙醯基-CH及7β-OHCH之標準範圍時，其等藉由每種參考分子之0.1 mg/ml的乙醇儲備溶液製備。

層析分離分兩個步驟進行：預溶析步驟(3次)，用CHCl₃ :MetOH混合物(2:1，v/v)作為濃縮區之溶析系統，接著係分離步驟(3次)，用己烷:乙醚混合物(3:7，v/v)作為溶析系統進行分離，以鑑定及定量固醇。

在層析之前，將槽用各自的溶析系統飽和以進行濃縮及分離。

使用來自吹風機之冷空氣流在每次溶析之間乾燥板。

- 氧固醇之可視化及定量 根據Macala方法(1)可視化氧固醇。Macala試劑由8%(w/v)正磷酸及3%(w/v)乙酸銅之水溶液組成。層析後，將HPTLC板乾燥，用Macala試劑噴霧並在熱板上加熱至140℃。氧固醇變成普魯士藍(Prussian blue)及膽固醇變成紫紅色。掃描有色斑點及然後藉由Image J(版本1.50 g)定量。

藉由HPTLC方法定量氧固醇及膽固醇藉由UPLC–MS驗證。

II.2)        UPLC – MS 溶析及偵測之實驗條件 ： - BIM2b及7β-OHCH之定量 等濃度溶析係用由包含5 mM乙酸銨之MetOH組成之流動相進行。 - 7β-乙醯基-CH之定量：

用線性二元梯度進行溶析。溶析劑A為0.1% (v:v)之甲酸及溶析劑B為包含0.1%甲酸之MetOH。用20% A及80% B之混合物(v:v)開始溶析並以100%之溶析劑B結束；梯度之持續時間為3 min。

注射體積為10 μl及藉由APCI以正模式進行偵測。

II.3)        BIM2b 及其降解產物之提取及純化 在對調配的BIM2b (BIM2b PO)中BIM2b之穩定性測試期間，其中將BIM2b PO之樣本直接施加於HPTLC板上，除了定量BIM2b、7β-乙醯基-CH及7β-OHCH之外，氧固醇(oxysterols)之提取及純化為用於定量此等分子在暴露於極端pH條件之BIM2b PO中，在藉由經口途徑管飼BIM2 PO之野生型小鼠的腦中，或在獲自患有自發GBM的狗(GBM狗個體)經口途徑用BIM2b治療並存活8個月(儘管進行化療法治療，患有GBM的狗之平均存活期為2-3個月)之屍檢的GBM腫瘤中所需。

藉由Folch等人(2)推薦的方法提取氧固醇。提取係在分離漏斗中進行。簡言之，用CHCl₃ :MetOH混合物(2:1，v:v；Folch)進行提取；對於該方法，Folch體積與水性樣本體積之比率為19。用0.2體積之含0.74% KCl之水溶液之有機相沖洗並破碎該相。

對於從經口途徑用BIM2b PO治療之健康小鼠的腦或從亦藉由經口途徑用BIM2b PO治療之狗的GBM腫瘤提取氧固醇之情況，用0.4體積的CHCl₃ :MetOH:H₂ O混合物(3:48:47；v:v:v；Folch之上層相)再次沖洗經0.74% KCl沖洗的有機相。然後將經乾燥之殘餘物溶解於適宜溶劑中，用於提取步驟之後的實驗方法。

II.4) 在分離及定量氧固醇之前需要提取之樣本 - 測試 BIM2b PO 對極端酸性 pH 之抗性 ， 接著在鹼性 pH 培育 對於此等測試，首先將BIM2b PO於pH 1.5酸浴中及然後於pH 8.5鹼浴中培育。此2個值分別對應於人體胃消化之生理pH及在乏特氏壺腹(Vater ampulla)階段消化之生理pH。

從1M及0.1M HCl儲備溶液製備酸水浴。鹼性浴為25 mM之碳酸銨水溶液。

在開始實驗之前，將包含4 ml酸浴(pH 1.5)之第一燒杯加熱至37℃；然後將2 ml BIM2b PO溫和地沉積在該浴之表面上。用磁性棒攪拌反應混合物10 h。關閉攪拌，並將反應混合物靜置2 h，以適當重整油性上層相。在反應混合物靜置2 h期間，在第二燒杯中製備鹼性浴(pH 8.5)並加熱至37℃。從酸浴之脂質相取出1-ml樣本並溫和地沉積在鹼性浴之水性表面上。開始攪拌，以進行10 h之培養。在停止攪拌後，將整個混合物(BIM2b PO及鹼性浴)進行Folch提取，而無需再洗滌具有Folch上層相之有機相。

- 來自經 BIM2b PO 治療 ( 經口途徑 ) 之健康小鼠的腦之氧固醇及其代謝產物之提取及定量 使經乾燥並在180℃下在液氮中在冷凍管中個別地儲存之小鼠腦恢復至環境溫度。稱重每個腦並放入Potter中；添加4 ml 0.74%冷KCl並在冰床上進行其餘程序。每個腦以1000 rev/min研磨6次，每個循環包括5分鐘的研磨及5分鐘的靜置。根據上述Folch程序(II.3.)提取氧固醇。然後將脂質殘餘物在矽膠管柱上進行吸附層析。

在40 ml己烷:醚混合物(乙醚(3:7，v/v))中製備矽膠(8 g)及然後倒入適宜管柱中。矽膠床之高度為18 cm及其體積為15 ml。

將適宜量之小鼠腦提取物溶解於1 ml第一溶析劑系統中並沉積在矽膠床上。溶析分4個步驟進行，以濃縮包含氧固醇之部分，並儘可能去除污染小鼠腦之脂質，特定言之膽固醇。

溶析進行如下： 第一次溶析：己烷:醚(3:7，v:v) 第二次溶析：丙酮:EtOH(95:5，v:v) 第三次溶析：丙酮:EtOH(93:7，v:v) 第四次溶析：乙醇

溶析程序描述於圖1中。

將部分組蒸發至乾燥，溶解在丙酮中並將適宜體積進行HPTLC層析。

- 從經 BIM2b PO 治療 ( 經口途徑 ) 之狗的 GBM 腫瘤提取及定量 BIM2b 及其代謝產物 GBM腫瘤係藉由對患有神經膠質母細胞瘤之狗進行屍檢而獲得的，其藉由經口途徑用BIM2b PO治療並以良好的生活品質存活8個月。在停止用BIM2b PO治療後21天進行屍檢。將腫瘤固定在甲醛中主要用於組織病理學分析並分析剩餘片段以定量BIM2b。

對於不患有GBM之狗的腦之片段及對於腫瘤片段之一部分，進行所有檢查以證實用甲醛固定不會改變氧固醇之品質或其藉由Folch技術之提取物之產率。

在sopalin紙上乾燥在冷凍管中在+4℃下單獨儲存在甲醛浴中之狗腦之片段，然後將該等片段稱重並放入Potter中。正如提取小鼠腦一樣，在添加4 ml冷0.74% KCl後提取每個片段。均質化及提取之程序與方法部分中對小鼠腦之描述相同。

由此獲得狗GBM腫瘤片段之干燥脂質提取物並在SEP PAK經典矽膠濾筒上；然後在SEP PAK Plus C18 (利用溶析劑A = 5 mM乙酸銨/超純水及B = 5 mM乙酸銨/MetOH)上依次層析。SEP PAK管柱之層析過程顯示於圖2中。

C. 製備實例及結果 實例 1 ：脂質載體之測試

所測試的油為摩洛哥堅果油、鱷梨油、橄欖油、花生油及葡萄籽油。該等測試係在試管規模下進行。

將不同量的BIM2b (1至35 mg)添加至1 ml所選擇的油中數次，以達到測定的量。在每次添加BIM2b之間溫和地攪拌試管。

在37℃下將管置於培養箱中24 h。在培養的前5個小時期間，每小時將管從培養箱中取出以便溫和地攪拌其等，並放回培養箱過夜。第二天，肉眼檢查油及BIM2b之混合物的外觀，以確定粉末在油中之溶解度。當裸眼看到BIM2b已完全溶解在油中時，用顯微鏡進行檢查以檢查呈粉末或結晶形式之BIM2b之存在或不存在。

該等結果顯示BIM2b完全溶解於鱷梨油、橄欖油、花生油及葡萄籽油中，濃度為3 mg BIM2b/ml油。

在摩洛哥堅果油(AO)中，BIM2b溶解至30 mg (52 µmol) BIM2b/ml AO之濃度。實例 2 ：BIM2b PO之製備

將285 ml摩洛哥堅果油(Olsana，France)放入用作生產容器的1L燒瓶中。燒瓶之位置係傾斜的並圍繞其自身軸手動轉動，以便以面積/體積比率：1.6 cm^-1 (計算結果：460 cm² /285 cm³ )將油均勻地分佈在燒瓶壁上。保持該位置，在整個壁上併入9 g BIM2b粉末，以覆蓋燒瓶之整個表面。接下來，添加包含30 mg檸檬酸之3 mL乙醇(來自10 mg檸檬酸/ml乙醇之儲備溶液)；及然後添加12 ml乙醇(亦即5%乙醇)。在30℃水浴中將燒瓶置於15 rpm速度之Buchi^® R-215角度旋轉蒸發器上2 h。為使乙醇蒸發，然後將其在30℃水浴中蒸發過夜，活塞打開。

因此，獲得300 ml組合物，其包含含在摩洛哥堅果油中之BIM2b，濃度為30 mg/ml。

由此獲得的BIM2b PO調配物(其將用於以下所給出的實例中)包含含在摩洛哥堅果油中之3% (w/v) BIM2b、0.01%(w/v)無水檸檬酸及1% EtOH(v/v)(蒸發後)。

在該批次生產後，BIM2b PO中BIM2b及其降解產物之定量顯示濃度為30 mg BIM2b/ml BIM2b PO，沒有任何降解產物。

藉由該方法生產的BIM2b PO批次之穩定性研究顯示，在實驗條件下，儲存6個月後存在1%降解產物(w/v)，及在同一批次儲存12個月後小於或等於2%(w/v)。實例 3 ：測試BIM2b PO對酸pH之耐受性，接著在鹼性pH下培養

測試程序描述於以上部分II)方法中。

在連續酸(pH 1.5)及鹼性(pH 8.5)浴中培養BIM2b PO後，將乾燥的脂質提取物溶解在丙酮中。由於缺乏空間(理論為15、30、40及60 μg之4個軌道)，沒有沉積標準範圍。

呈現於圖3中之HPTLC之分析結果顯示無論沉積量如何，偵測到單一條帶(BIM2b之單一條帶)，滯留因子(Rf)為0.5至0.64。以實驗方式確定的降解產物7β-乙醯基-CH及7β-OHCH(不可見)之Rf值分別為0.37及0.24。此等結果顯示BIM2b PO耐受極端pH條件而不會降解。 實例4：BIM2b PO在健康小鼠中之毒性之研究

7天中有5天每天兩次以每隻動物1.5 mg (50 µl BIM2 PO)之速率對野生型小鼠經口投與(藉由管)來自實例2之組合物，最大治療持續時間為21天。同時，對照組野生型小鼠未接受任何治療。

在治療組中，18天後處死2隻小鼠及21天後處死3隻小鼠。在對照組中，21天後處死3隻小鼠。

將內臟器官(胃、消化道、肝、腎、肺、心臟)之樣本浸入4%甲醛中72 h並在4℃下儲存，及然後包埋在石蠟中。在稀釋之前及之後對樣本進行宏觀分析。

根據符合命名法(3)之4級評估系統，對經蘇木精-伊紅-藏紅花染色之切片進行經甲醛固定之內臟器官之組織學檢查及毒理學定量。

檢查所有切片之細胞改變、變性、壞死、炎症、纖維化等之可能的征兆。

結論如下(每個器官)： - 胃：任何經治療小鼠均沒有病變 - 小腸：最小淋巴漿細胞性發炎被解釋為形成背景噪音之一部分。無明顯病變。 - 大腸：任何小鼠均沒有病變。 - 肝臟：與對照小鼠相比，在經治療小鼠中觀測到細胞質儲存減少及肝細胞肥大減輕之趨勢。該種變化仍然非常分散及不能肯定地歸因於治療。 - 腎臟：在任何小鼠中均未偵測到明顯的病變。 - 肺：其中一隻經治療小鼠之最小組織細胞增生及輕微肺泡發炎，可能由經口強制給食引起的。 - 心臟：任何小鼠中均未偵測到病變。

總言之，結果顯示分子BIM2b不會帶有任何毒性。在指定的劑量學上投與BIM2b，每天兩次，每週5次，在周末沒有治療，不會產生不良的臨床效應。同樣地，所研究的生物學參數未證實肝或腎毒性。未觀測到可能在投與類固醇時預期的糖尿病及高膽固醇血症。實例 5 ：BIM2b PO在健康狗中之耐受性之研究

7天中有5天每天兩次(在用餐後的早晨及空腹的晚上)以15 mg (0.5 ml)之速率對平均體重為11 kg之3隻比格(beagle)狗經口投與來自實例2之組合物，治療時間為21天。

所投與劑量之計算基於投與規定的值3 mg/kg/天。

在工作日從D0至D21每天進行動物之完整臨床檢查：稱重，測取直腸溫度，一般病情，食慾。在周末(未投與之休息時間)，動物僅進行簡單的觀測以檢查其一般病情及行為是否正常。

在治療開始及結束時(在D0及D21)採集用於全血細胞計數(FBC)及生化分析之血液樣本。所有狗均接受全部治療。檢查狗時沒有觀測到副作用。

研究結果如下： 由於使用類固醇可能導致體重增加，因此每天治療時對狗進行稱重。與預期的相反，觀測到所有狗的體重減輕約4.5%。

未偵測到膽固醇及三酸甘油酯濃度之增加。相反，測得此等分子數量之減少：膽固醇平均為-2.3%，三酸甘油酯平均為-30%。

使用類固醇亦可能係糖尿病發展之根源。在D21沒有觀測到糖血症之增加。相反，觀測到平均葡萄糖降低12.9%。

基於所進行的腎平衡(尿素及肌酸酐)，在3隻狗中未觀測到腎毒性。

治療後3隻狗的肝平衡(白蛋白、蛋白質、 天冬胺酸胺基轉移酶(AST)及丙胺酸胺基轉移酶(ALT)(AST/ALT比率) 、鹼性磷酸酶、總膽紅素)係正常的。此外，未觀測到血液學及生化參數之顯著變化。

總言之，以BIM2b PO組合物形式投與的化合物BIM2b不會導致任何毒性。持續21天每天兩次每週5天以30 mg/ml化合物BIM2b之劑量投與該組合物不會引起不良的臨床效應。同樣地，所研究的參數未證實肝或腎毒性。實例 6 ：藉由經口途徑投與患有自發性神經膠質瘤之狗(稱為「GBM狗個體」)之BIM2b PO之抗GBM效力之研究

該研究之目的係欲評估呈根據本發明之組合物投與之化合物BIM2b在治療犬神經膠質瘤中之效力。

該研究中包括藉由圖像診斷之患有自發性神經膠質瘤之9隻狗。以3 mg/kg化合物BIM2b (1 ml實例2組合物)/5 kg部分之日劑量經口治療狗。

該研究包括5個週期之21天(105天)的治療，接著係2個週期之3個月的觀測。藉由MRI評估病情及腫瘤體積。

在第D0天(第1次投與)，臨床檢查GBM狗個體並收集血樣用於生化參數之分析。在D15，記錄心電圖並採集血樣。從D21開始，根據腫瘤反應及/或毒性，評估劑量，升高(原始劑量之+25%)或降低(原始劑量之約-25%)。

在D42、D63、D84及D105進行心電圖、血樣及MRI，然後在停止治療後3個月及6個月進行。

腫瘤反應係藉由MRI基於RECIST標準(實體腫瘤中之反應評估標準)評估。此等標準將腫瘤反應定義如下： - 進展係腫瘤最大軸之尺寸相對於之前的MRI增加超過20%； - 消退定義為腫瘤最大軸之尺寸相對於之前的MRI減小超過30%； - 穩定性定義為腫瘤大小之變化在減少小於30%與增加小於20%之間。

結果 該研究持續22個月。所包括的9隻狗中的3隻未進行分析，因為其等沒有達到D42 (特定言之由於包含在疾病過晚期而導致的死亡)。在剩餘的6隻狗中，2隻狗(N 及G)分別在D165 (5.5個月)及D126 (4.2個月)死亡。來自GBM狗個體N 之腫瘤用於定量BIM2b及其代謝產物(實例8)。

對於剩餘的4隻GBM狗個體，發現藉由經口途徑之治療具有良好的耐受性。所有4隻狗均注意到臨床征兆之改善：2隻保持穩定並在其他兩個病例中觀測到極明顯的消退，其中一隻(D )的病灶幾乎消失。圖4顯示在D42，狗D 之腫瘤消失。實例 7 ：經BIM2b PO口服治療之小鼠的腦中BIM2b之分析

經BIM2b PO口服治療健康小鼠及腦之起源描述於實例4中。

如方法部分中所述，藉由HPTLC分離、偵測及定量腦中之化合物BIM2b及其代謝產物。

結果顯示於下表1中： 表1

結果顯示化合物BIM2b存在於藉由經口途徑經根據本發明之組合物中BIM2b PO治療之小鼠的腦中。此證實化合物BIM2b跨越經處理健康小鼠之血液-腦障壁(BBB)。在D22，小鼠腦中BIM2b之含量之顯著下降(91.5%)與在D20停止治療之間觀測到明顯的相關性。代謝產物僅以少量被發現。

在腫瘤性病理學而非BBB之情況下，參考BTB(血液-腫瘤障壁)。BTB因腫瘤之存在及其生理學而受到弱化。研究顯示分子比BBB更容易跨越BTB。

跨越BBB可因此被視為跨越BTB之預測。

在腦中發現的BIM2b相對於小鼠攝取的總量之百分比在D18為0.013%。實例 8 ：藉由經口途徑經BIM2b PO治療之GBM狗個體之腫瘤中BIM2b之分析。

GBM腫瘤來自實例6中之狗N。

如部分II)方法中所述，藉由HPTLC分離、偵測及定量腫瘤中之化合物BIM2b及其代謝產物。

結果顯示在所分析的212.7 mg腫瘤片段中存在3.7 μg BIM2b。在整個腫瘤中發現的BIM2b相對於狗攝取的BIM2b之總量之重量百分比為0.39%；亦即比在健康小鼠之腦中發現的重量百分比高30倍(實例7)。

在停止治療後21天進行腫瘤之屍檢並仍然在腫瘤中發現BIM2b之事實顯示包含在BIM2b PO之化合物BIM2b跨越BTB並優先在GBM腫瘤中發現。參考文獻 1. Macala, LJ、Yu RK及Ando, S. J. Lip.Res.(1983)，24: 1243-1250。 2. Folch, J、Lees, M及Sloane-Stanley，GH. J. Biol.Chem.(1957)，226: 497-509。 3. Mann PC、Vahle J.、Keenan, CM、Baker JF、Bradley, AE、Goodman, DG、Harada, T、Herbert, R、Kaufmann, W、Kellner, R、Nolte, T、Rittinghausen, S及Tanaka, T. Toxicologic Pathology (2012)，40 (4 Suppl)。

圖1顯示來自經實例2之油性調配物處理之健康小鼠腦之脂質提取物之矽膠管柱層析。

圖2顯示來自經實例2之油性調配物處理之患有神經膠質母細胞瘤之狗的腦之脂質提取物之矽膠管柱層析。

圖3顯示在對極端pH之抗性測試之後，藉由HPTLC監測實例2之油性調配物之穩定性。

圖4顯示經實例2之油性調配物治療之患有神經膠質母細胞瘤的狗個體中腫瘤之完全消退。

Claims (24)

1. 一種組合物，其包含至少一種7β-羥膽固醇衍生物及脂質載體，其中該脂質載體包含油或油之混合物，其中該7β-羥膽固醇衍生物對應於式(I)

   

   (I) 其中： -A表示 -C(O)R₁ 基團，其中R₁ 為飽和雜環，其包含5至14個成員並包括1或2個雜原子，未經取代或經至少一個直鏈或分支鏈C₁ -C₆ 烷基或選自OR、NRR'、NHR及SR之基團取代，其中R及R'獨立地表示氫、直鏈或分支鏈C₁ -C₁₂ (較佳係C₁ -C₆ )烷基，或未經取代之芳基； 或-(R₂ )_n -基團，其中R₂ 為由C端結合之胺基酸殘基且n=1至3，R₂ 各自相同或不同，其中該胺基酸之N端可經-C(O)R₃ 基團取代，其中R₃ 為單環或多環C₆ -C₁₄ 芳基烷基；可包含一或多個可相同或不同雜原子之單環或多環C₅ -C₁₄ 雜芳基烷基；可包含一或多個可相同或不同雜原子之單環或多環C₆ -C₁₄ 芳基烷基氧基或單環或多環C₅ -C₁₄ 雜芳基烷基氧基， -B表示-C(O)R₄ 基團，其中R₄ 為未經取代或經選自如上定義的OR、NRR'、NHR及SR之基團取代之直鏈或分支鏈C₁ -C₁₂ (較佳係C₁ -C₆ )烷基；未經取代或經選自如上定義的OR、NRR'、NHR及SR之基團取代之芳基；或R₄ 表示OR₅ ，其中R₅ 為直鏈或分支鏈C₁ -C₁₂ (較佳係C₁ -C₆ )烷基。
2. 一種組合物，其包含至少一種7β-羥膽固醇衍生物及脂質載體，排除由一或多個脂質層形成的脂質囊泡組成之脂質載體或由磷脂組成呈非脂質體形式之脂質載體，其中該7β-羥膽固醇衍生物對應於式(I)

   

   (I) 其中： -A表示 -C(O)R₁ 基團，其中R₁ 為飽和雜環，其包含5至14個成員並包括1或2個雜原子，未經取代或經至少一個直鏈或分支鏈C₁ -C₆ 烷基或選自OR、NRR'、NHR及SR之基團取代，其中R及R'獨立地表示氫、直鏈或分支鏈C₁ -C₁₂ (較佳係C₁ -C₆ )烷基，或未經取代之芳基； 或-(R₂ )_n -基團，其中R₂ 為由C端結合之胺基酸殘基且n=1至3，R₂ 各自相同或不同，其中該胺基酸之N端可經-C(O)R₃ 基團取代，其中R₃ 為單環或多環C₆ -C₁₄ 芳基烷基；可包含一或多個可相同或不同雜原子之單環或多環C₅ -C₁₄ 雜芳基烷基；可包含一或多個可相同或不同雜原子之單環或多環C₆ -C₁₄ 芳基烷基氧基或單環或多環C₅ -C₁₄ 雜芳基烷基氧基， -B表示-C(O)R₄ 基團，其中R₄ 為未經取代或經選自如上定義的OR、NRR'、NHR及SR之基團取代之直鏈或分支鏈C₁ -C₁₂ (較佳係C₁ -C₆ )烷基；未經取代或經選自如上定義的OR、NRR'、NHR及SR之基團取代之芳基；或R₄ 表示OR₅ ，其中R₅ 為直鏈或分支鏈C₁ -C₁₂ (較佳係C₁ -C₆ )烷基。
3. 如請求項2之組合物，其中該載體包含除磷脂之外的至少一種脂質。
4. 如請求項2之組合物，其中該脂質載體包含油或油之混合物。
5. 如請求項1至4中任一項之組合物，其係呈適於經口途徑投與之形式。
6. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中該式(I)化合物係呈溶液在該脂質載體中。
7. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中該脂質載體包含植物油或植物油之混合物。
8. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中該脂質載體包含選自以下之植物油：摩洛哥堅果油(argan oil)、鱷梨油(avocado oil)、亞麻籽油、向日葵油、棕櫚油、甘藍椰子油(cabbage palm oil)、椰子油、葡萄籽油、黑芥子油、罌粟籽油、牛油樹油(shea butter oil)、甜杏仁油、大豆油(soya oil)、花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油、可可油、蓖麻油、辣木油(Moringa oil)(或山萮油(Ben oil))、油菜籽油、胭脂樹油(annatto oil)、小麥胚芽油、紅花油、核桃油、榛子油、油菜籽油(turnip rape oil)，或其混合物。
9. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中該脂質載體為摩洛哥堅果油。
10. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中，在式(I)中，A表示-C(O)R₁ 基團，其中R₁ 為飽和雜環，其包含5個成員並包括2個氧原子，經至少一個直鏈或分支鏈C₁ -C₆ 烷基取代。
11. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中，在式(I)中，B表示-C(O)R₄ 基團，其中R₄ 為直鏈或分支鏈C₁ -C₆ 烷基，或R₄ 表示OR₅ ，其中R₅ 為直鏈或分支鏈C₁ -C₁₂ (較佳係C₁ -C₆ )烷基。
12. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中，在式(I)中，B表示烷基為C₁ -C₆ 之醯基，或烷基為C₁ -C₆ 之烷氧基羰基。
13. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中，在式(I)中，A表示： -(R₂ )_n -基團，其中R₂ 為胺基酸殘基且n=2；或 -(R₂ )_n -基團，其中R₂ 為胺基酸殘基，n=2，及該胺基酸之N端係經芳基烷氧基羰基(特別是苄基氧基羰基)取代；或 結合至甘胺醯基之丙胺醯基，在其N端視需要經芳基烷氧基羰基(特別是苄基氧基羰基)取代；或 結合至甘胺醯基之甲硫胺醯基，在其N端視需要經芳基烷氧基羰基(特別是苄基氧基羰基)取代，及 B係如請求項1至3、5或6中任一項中所定義。
14. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中該7β-羥膽固醇衍生物係選自式(I)化合物，其中： -A為3-苄基氧基羰基-甘胺醯基-丙胺醯基，及B為第三丁氧基羰基，或 -A為3-苄基氧基羰基-甘胺醯基-丙胺醯基，及B為乙醯基，或 -A為-C(O)R₁ 基團，其中R₁ 為2,2-二甲基-1,3-二氧戊環基，及B為第三丁氧基羰基。
15. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中該7β-羥膽固醇衍生物為式(I)之化合物，其中A為-C(O)R₁ 基團，其中R₁ 為2,2-二甲基-1,3-二氧戊環基，及B為乙醯基，如下式

    

    。
16. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中式(I)化合物之含量為該組合物總體積之0.1至3.5% (w/v)。
17. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中式(I)化合物之含量為1至35 mg/ml，較佳30 mg/ml。
18. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中脂質載體之含量為組合物總體積之90至99% (v/v)。
19. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至18中任一項之組合物。
20. 如請求項19之醫藥組合物，其係呈適於經口途徑投與之形式。
21. 一種用於製備如請求項1至16中任一項之組合物之方法，該方法包括以下步驟： -製備含有如請求項1、2或10至15中任一項中所定義的式(I)之7β-羥膽固醇衍生物、脂質載體及共溶劑之混合物， -視需要添加抗氧化劑及 -若適用，蒸發共溶劑。
22. 如請求項21之方法，其中該脂質載體係如請求項3、4或7至9中任一項中所定義。
23. 一種如請求項1至20中任一項之組合物用於製造藥物之用途，其中該藥物係用於治療腫瘤性病理學或惡性血液病。
24. 如請求項23之用途，其中該腫瘤性病理學為多形性神經膠質母細胞瘤。

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