BR112021000295A2 - Composição contendo um 7 beta-hidroxicolesterol e um veículo lipídico e seu uso no tratamento de patologias neoplásicas - Google Patents

Abstract

a invenção se refere a uma composição que compreende um derivado de 7ß-hidroxicolesterol e um veículo lipídico, em particular um óleo vegetal, e à sua utilização no tratamento de patologias neoplásicas, como o glioblastoma multiforme. a referida composição pode ser administrada por via oral.

Description

“COMPOSIÇÃO CONTENDO UM 7 BETA-HIDROXICOLESTEROL E UM VEÍCULO LIPÍDICO E SEU USO NO TRATAMENTO DE PATOLOGIAS NEOPLÁSICAS”

[0001] A invenção se refere a uma composição que compreende um derivado 7 beta-hidroxicolesterol e um veículo lipídico, a seu método de preparação e à sua utilização no tratamento de patologias neoplásicas, em particular o glioblastoma multiforme.

[0002] Este veículo lipídico pode conter um óleo ou uma mistura de óleos, vantajosamente um óleo vegetal ou uma mistura de óleos vegetais.

[0003] Em particular, a invenção se refere a uma composição que compreende um derivado 7 beta-hidroxicolesterol e um veículo lipídico, excluindo um veículo lipídico composto por vesículas formadas por uma ou mais camadas lipídicas, como por exemplo vesículas do tipo lipossoma ou micela.

[0004] Vantagantemente, esta composição está em forma líquida e pode ser administrada pela via oral.

[0005] Em particular, o derivado 7 beta-hidroxicolesterol está em solução no referido veículo lipídico.

[0006] Na presente descrição, os termos “7 beta-hidroxicolesterol" ou "7 β- hidroxicolesterol" são utilizados de forma intercambiável.

[0007] O glioblastoma multiforme (GBM), ou astrocitoma de grau IV, é um tumor cerebral caracterizado essencialmente pela transformação de células gliais, que incluem os astrocitos, em células cancerígenas.

[0008] Apesar dos substanciais avanços científicos e terapêuticos em oncologia, como nas áreas de imunoterapia e nanotecnologia, o GBM ainda é um câncer incurável. Na melhor das hipóteses, pesquisadores e médicos ficam satisfeitos quando a sobrevida mediana do paciente pode ser prolongada por no máximo quinze meses.

[0009] Os principais problemas colocados pelo tratamento do GBM são: a) recaída causada por células-tronco. Na verdade, quando as terapias existentes conseguem erradicar total ou parcialmente o tumor, as células-tronco são freqüentemente responsáveis pela recorrência do tumor; (b) as moléculas usadas na quimioterapia não atravessam facilmente a barreira hemato-tumoral (BTB) e, portanto, baixas quantidades do agente anti-GBM chegam ao local do tumor. O uso de mini-bombas (Alzet®), reservatórios (Mamiya®) ou suportes (Gliadel®) implantados no tumor GBM a fim de contornar o problema colocado pelo BTB não melhoram significativamente a eficácia da quimioterapia. O efeito da irradiação do cérebro com ultra-som, para tornar o BTB flexível, sobre a eficácia da quimioterapia está sendo estudado atualmente em animais.

[0010] Na quimioterapia, um dos principais tratamentos é uma terapia combinada, que consiste em administrar Avastin® (inibição da ligação do VEGF a seus receptores) e irinotecan® (inibidor da topoisomerase I). A terapia tripla do tipo PVC (Procarbazina, agente alquilante do DNA; Vincristina, inibição da polimerização de microtubos; CCNU, agente alquilante não específico) é atualmente muito controversa. Temozolomida, um agente alquilante da guanina, combinado com a radioterapia, mostra um aumento na mediana de sobrevida de 2 a 3 meses para pacientes que têm DNA hipermetílico (protocolo Stupp). Os ensaios clínicos utilizando a abordagem Tumor Treating Fields (TTF) como um suplemento ao protocolo Stupp estão em andamento. Estão em andamento os ensaios clínicos (fase III) que testam o ciliengite (inibição de alguns receptores de integrina) e o talampanel (bloqueio dos canais de glutamato do tipo AMPA).

[0011] Além disso, as quimioterapias que mostram eficácia para outros tipos de câncer que não o GBM não melhoram a sobrevida mediana dos pacientes com GBM. Pode ser mencionada, por exemplo, a bleomicina (administrada em linfoma de Hodgkin), o dimaleato afatinibular e a cisplatina (administrada em câncer de pulmão de células não pequenas) e a ciclofosfamida (administrada em câncer de mama).

[0012] O pedido de patente WO2013/168096 descreve uma família de derivados de 7β-hidroxicolesterol mostrando a eficácia antitumoral em células cancerosas humanas in vitro, incluindo GBM, em particular na forma de lipossoma ou na forma de solução de etanol. Em particular, o composto preparado no Exemplo 6 deste pedido (chamado "composto BIM2b" nos exemplos do presente pedido) mostrou atividade in vitro em uma linha de GBM humana, a linha U87-MG (U 87).

[0013] Existe, portanto, a necessidade de uma formulação que permita que o referido derivado de 7β-hidroxicolesterol , ou seja, uma molécula com atividade terapêutica, atravesse o obstáculo da barreira hemato-tumoral (BTB), a fim de alcançar, em particular, um tumor localizado no cérebro, enquanto contém uma quantidade suficiente desta molécula terapêutica.

[0014] Também se busca uma formulação que permita uma administração fácil, de preferência pela via oral, e que não cause efeitos tóxicos durante um tempo de tratamento que pode chegar a várias semanas, ou mesmo vários meses, levando em conta o estado precário de saúde dos pacientes.

[0015] Os compostos esteróides, tais como hormônios esteróides, mineralocorticoides e glicocorticoides carecem da cadeia lateral que faz parte do colesterol e da família do oxisterol. Além disso, em certos compostos esteroidais, há funções cetônicas combinadas com funções alcoólicas e anéis aromáticos, o que não é o caso do colesterol e dos oxisteróis mais comuns. Assim, os compostos esteróides geralmente se dissolvem mais facilmente nos óleos do que o colesterol e os derivados do 7 β-hidroxicolesterol, em particular os compostos da fórmula (I) abaixo, pelas seguintes razões: - o impedimento estéreo dos compostos esteróides é menor do que o do colesterol e dos derivados de 7 β-hidroxicolesterol mencionados acima, - os compostos esteroidais têm mais funções químicas e anéis que tem mais elétrons delocalizados do que o colesterol e que os derivados de 7β-hidroxicolesterol, e - as funções químicas e as estruturas cíclicas com caracteríticas polares encontradas nos compostos esteróides permitem a ligação as funções ácidas, álcoois, ligações duplas e certos anéis (espinasterol, schottenol) presentes em óleo e, portanto, melhor dissolução em óleo do que o colesterol e os derivados de 7 β-hidroxicolesterol da fórmula (I) abaixo.

[0016] Descobriu-se agora que uma formulação que combina um derivado de 7β-hidroxicolesterol e um veículo lipídico, excluindo um veículo lipídico composto de vesículas lipídicas formadas por uma ou mais camadas lipídicas, permitiu que este derivado do esterol cruzasse o BTB, além de obter notável atividade anti-GBM in vivo em animais.

[0017] De preferência, esta formulação combina um derivado de 7 β- hidroxicolesterol e um veículo lipídico, excluindo um veículo lipídico composto de vesículas lipídicas formadas por uma ou mais camadas lipídicas ou composto de pelo menos um fosfolipídeo na forma não-lipossomal.

[0018] Vantajosamente, o referido derivado de 7β-hidroxicolesterol está em solução no veículo lipídico de acordo com a invenção.

[0019] Obter uma combinação dessas propriedades, ou seja, o cruzamento do BTB, a administração do produto ativo em quantidade suficiente, a ausência de toxicidade e a obtenção de um efeito terapêutico in vivo é particularmente difícil de se obter, ainda mais no campo das patologias neoplásicas, onde o cruzamento do BTB sozinho é um grande obstáculo para a eficiência do produto ativo.

[0020] De acordo com a invenção, o referido veículo lipídico é, em particular, um veículo lipídico farmaceuticamente aceitável.

[0021] Em particular, este veículo lipídico compreende ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados e/ou poli-insaturados, ou suas misturas, em particular sob a forma de mono, di- ou triglicerídeos, ou suas misturas.

[0022] Por "vesícula lipídica formada por uma ou mais camadas lipídicas" entende-se uma vesícula lipídica composta ou constituída por uma ou mais camadas lipídicas, como por exemplo, as vesículas do tipo lipossoma ou micela.

[0023] De forma vantajosa, o veículo lipídico de acordo com a invenção compreende pelo menos um lipídeo que não é um fosfolipídeo, sendo o fosfolipídeo na forma lipossomal ou não-lipossomal.

[0024] Vantajosamente, também foi constatado que esta formulação é estável a um pH de cerca de 1,5 (pH da digestão gástrica em humanos) e a um pH de cerca de 8,5 a 10 (pH da digestão ao nível da zona Vater em humanos), o que é 30 particularmente procurado para permitir que o composto ativo chegue ao local de ação, no contexto da administração pela via oral.

[0025] A invenção se refere, portanto, de acordo com um primeiro aspecto, a uma composição que compreende pelo menos um derivado de 7β-hidroxicolesterol e a um veículo lipídico, excluindo um veículo lipídico constituído por vesículas lipídicas formadas por uma ou mais camadas lipídicas ou que consistem em fosfolípidos na forma não-lipossomal, no qual o referido derivado de 7β-hidroxicolesterol corresponde à fórmula (I)

(I) na qual: - A representa um grupo -C(O)R1 no qual R1 é um heterociclo saturado composto de 5 a 14 membros e incluindo 1 ou 2 heteroátomos, não substituídos ou substituídos por pelo menos um grupo alquila C1-C6 linear ou ramificado ou um grupo selecionado de OR, NRR', NHR e SR, onde R e R', independentemente, representam hidrogênio, um alquila C1-C12 linear ou ramificado, de preferência alquila C1-C6 ou um grupo arila não substituído; ou um grupo -(R2)n- no qual R2 é um resíduo de aminoácido ligado por sua extremidade C-terminal e n= 1 a 3, sendo cada um dos R2 idêntico ou diferente, no qual a extremidade N-terminal do referido aminoácido pode ser substituída por um grupo -C(O)R3 no qual R3 é um grupo monocíclico ou policíclico C6-C14 arilalquila; um grupo mono ou policíclico C5-C14 heteroarilalquila que pode compreender um ou mais heteroátomos, que podem ser idênticos ou diferentes; um grupo mono ou policíclico C6-C14 ariloxi ou um grupo monocíclico ou policíclico C5- C14 heteroarilalquilosxi que pode compreender um ou mais heteroátomos, que podem ser idênticos ou diferentes, - B representa um grupo -C(O)R4, no qual R4 é um alquila C1-C12 linear ou ramificado, de preferência alquila C1-C6, não-substituído ou substituído por um grupo selecionado de OR, NRR', NHR e SR, como definido acima; um grupo arila, não-substituído ou substituído por um grupo selecionado de OR, NRR', NHR e SR, como definido acima; ou R4 representa OR5, no qual R5 é um alquila C1-C12 linear ou ramificado, de preferência alquila C1-C6.

[0026] O grupo alquila denota um grupo C1-C12 linear ou ramificado como os grupos metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, sec-butila, tert-butila, pentila, isopentila, sec-pentila, tert-pentila, neo-pentila, hexila, isohexila, sec-hexila, tert- hexila, heptila, octila, nonila, decila, undecila ou grupos dodecila, sendo preferidos os grupos alquila C1-C6 lineares ou ramificados.

[0027] O grupo arila denota um grupo insaturado, monocíclico ou policíclico, carbocíclico, C6-C14, tais como os grupos fenila, naftila, indenila, antracenila e mais particularmente o grupo fenila.

[0028] Por "heteroátomo" entende-se um átomo de oxigênio, nitrogênio ou enxofre.

[0029] Os resíduos vantajosos de aminoácidos são, por exemplo, unidades de metionila, glicinila ou alanila.

[0030] A preparação dos compostos da fórmula (I) é descrita nos documentos EP2666382 e WO2013/168096.

[0031] O termo "compreendendo" pode ser compreendido, no sentido da presente descrição, como englobando os significados "contendo", "constituído por" ou "consistindo em".

[0032] O termo "constituído por" ou "consistindo em", no sentido da presente descrição, exclui a presença de outras características além daquelas que seguem a referida redação.

[0033] De forma vantajosa, o referido derivado de 7β-hidroxicolesterol está em solução no referido veículo lipídico.

[0034] De preferência, o veículo lipídico compreende um óleo ou uma mistura de óleos, vantajosamente um óleo vegetal ou uma mistura de óleos vegetais.

[0035] De acordo com um outro aspecto, a invenção diz respeito a uma composição que compreende pelo menos um derivado de 7β-hidroxicolesterol e um veículo lipídico, no qual o referido veículo lipídico compreende um óleo ou uma mistura de óleos, no qual o derivado de 7β-hidroxicolesterol corresponde à fórmula (I)

(I) na qual: - A representa um grupo -C(O)R1 no qual R1 é um heterociclo saturado composto de 5 a 14 membros e incluindo 1 ou 2 heteroátomos, não substituídos ou substituídos por pelo menos um grupo alquila C1-C6 linear ou ramificado ou um grupo selecionado de OR, NRR', NHR e SR, onde R e R', independentemente, representam hidrogênio, um alquila C1-C12 linear ou ramificado, de preferência alquila C1-C6 ou um grupo arila não substituído; ou um grupo -(R2)n- no qual R2 é um resíduo de aminoácido ligado por sua extremidade C-terminal e n= 1 a 3, sendo cada um dos R2 idêntico ou diferente, no qual a extremidade N-terminal do referido aminoácido pode ser substituída por um grupo -C(O)R3 no qual R3 é um grupo monocíclico ou policíclico C6-C14 arilalquila; um grupo mono ou policíclico C5-C14 heteroarilalquila que pode compreender um ou mais heteroátomos, que podem ser idênticos ou diferentes; um grupo mono ou policíclico C6-C14 ariloxi ou um grupo monocíclico ou policíclico C5- C14 heteroarilalquilosxi que pode compreender um ou mais heteroátomos, que podem ser idênticos ou diferentes, - B representa um grupo -C(O)R4, no qual R4 é um alquila C1-C12 linear ou ramificado, de preferência alquila C1-C6, não-substituído ou substituído por um grupo selecionado de OR, NRR', NHR e SR, como definido acima; um grupo arila, não-substituído ou substituído por um grupo selecionado de OR, NRR', NHR e SR, como definido acima; ou R4 representa OR5, no qual R5 é um alquila C1-C12 linear ou ramificado, de preferência alquila C1-C6.

[0036] Em particular, este veículo lipídico é constituído por um óleo ou uma mistura de óleos, vantajosamente de um óleo vegetal ou uma mistura de óleos vegetais.

[0037] Em particular, o derivado 7 beta-hidroxicolesterol está em solução no referido óleo ou mistura de óleos, de preferência um óleo vegetal ou uma mistura de óleos vegetais, vantajosamente totalmente dissolvido no referido óleo ou mistura de óleos, de preferência no referido óleo vegetal ou mistura de óleos vegetais.

[0038] Por "óleo vegetal" entende-se uma substância gordurosa extraída de uma planta oleaginosa, ou seja, uma planta cujas sementes, nozes ou frutos contêm lipídios, em particular um óleo comestível.

[0039] O óleo vegetal compreende ácidos graxos saturados, monoinsaturados e/ou poli-insaturados de origem vegetal, que estão principalmente presentes na forma de acilgliceróis, também chamados glicerídeos (ésteres de glicerol e ácidos graxos). Estes acilgliceróis são os principais constituintes do óleo, em particular, em uma quantidade de pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, ou pelo menos 95% do óleo vegetal em questão. Tais acilgliceróis podem ser na forma de mono, di ou triglicerídeos, ou suas misturas.

[0040] De preferência, estes ácidos graxos de origem vegetal compreendem 20 de 4 a 24 átomos de carbono (C4 a C24), em particular 10, 12, 14, 16, 18, 20 ou 22 átomos de carbono. Estes ácidos graxos podem compreender, por exemplo, de uma a três ligações duplas na cadeia do carbono.

[0041] Este óleo vegetal também pode incluir, por exemplo, quantidades menores, como menos de 20%, de preferência menos de 10%, ou menos de 5% de outros compostos que não os acilgliceróis, como, por exemplo, fosfolipídios, fitoesteróis, tocoferóis, esfigolipídios, carotenóides, etc.

[0042] Este óleo vegetal pode ser selecionado, por exemplo, de óleo de argan,

óleo de abacate, óleo de linhaça, óleo de girassol, óleo de palma, óleo de palma de repolho, óleo de coco, óleo de grainha de uva, óleo de mostarda preta, óleo 30 de semente de papoula, óleo de manteiga de karité, óleo de amêndoas doces, óleo de soja, óleo de amendoim, óleo de algodão, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho, óleo de cacau, óleo de mamona, óleo de moringa (ou óleo de Ben), óleo de colza, óleo de anato, óleo de gérmen de trigo, óleo de cártamo, óleo de nozes, óleo de avelã, óleo de nabo silvestre ou suas misturas.

[0043] Um óleo vegetal com baixo teor de vitamina E, em particular o óleo de argan, será preferencialmente utilizado.

[0044] O óleo vegetal também pode ser produzido sinteticamente, por exemplo, preparando óleos com composição química semelhante, por exemplo, preparando óleos incluindo glicerídeos.

[0045] O uso de um óleo ou mistura de óleos, vantajosamente um óleo vegetal ou mistura de óleos vegetais, como o veículo lipídico na composição, permite obter uma composição que pode conter uma quantidade suficiente de composto de fórmula (I) para obter tanto a passagem pela barreira hemato-tumoral (BTB) quanto a atividade terapêutica necessária.

[0046] Estes óleos, em particular os óleos vegetais, são utilizados preferencialmente de forma farmaceuticamente aceitável.

[0047] Além disso, as formulações de acordo com a invenção que compreende tal veículo lipídico têm muito boa estabilidade a extremos de pH como um pH de cerca de 1,5 (pH da digestão gástrica em humanos) e a um pH de cerca de 8,5 a 10 (pH da digestão ao nível da zona do Vater em humanos), o que torna possível preservar a atividade do composto da fórmula (I). Tais propriedades não foram demonstradas no caso de vesículas lipídicas formadas de uma ou mais camadas lipídicas, como por exemplo, as vesículas do tipo lipossoma ou micela.

[0048] Os compostos preferidos da fórmula (I) são aqueles em que: - A representa um grupo -C(O)R1 no qual R1 é um heterociclo saturado composto de 5 a 14 membros e incluindo 1 ou 2 heteroátomos, não substituídos ou substituídos por pelo menos um grupo alquila C1-C6 linear ou ramificado; - B representa um grupo -C(O)R4, no qual R4 é um alquila C1-C12 linear ou ramificado, de preferência C1-C6 ou R4 representa OR5, no qual R5 é um alquila C1-C12 linear ou ramificado, de preferência alquila C1-C6.

[0049] De acordo com um aspecto preferido, R1 é um heterociclo saturado composto por 5 membros e incluindo 2 átomos de oxigênio, substituído por pelo menos um alquila C1-C6 linear ou ramificado, em particular um grupo metila. Em particular, R1 é um grupo 2,2-dimetil-1,3-dioxolano.

[0050] De preferência, o R4 é um alquila C1-C6 linear ou ramificado, em particular um grupo metila.

[0051] De acordo com um aspecto preferido, B representa um grupo acila no qual o grupo alquila é C1-C6, em particular acetila ou um grupo alcoxicarbonila no qual o grupo alquila é C1-C6, em particular um grupo terc-butoxicarbonila.

[0052] Outros compostos preferidos da fórmula (I) são aqueles em que: - A representa um grupo -(R2)n- no qual R2 é um resíduo de aminoácido e n = 2; ou - A representa um grupo -(R2)n- no qual R2 é um resíduo de aminoácido, n = 2 e a extremidade N-terminal do referido aminoácido é substituída por um grupo arilalcoxicarbonila, em particular benziloxicarbonila; ou - A representa um radical alanílico ligado a um radical glicinílico, opcionalmente substituído em sua extremidade N-terminal por um grupo arilalcoxicarbonila, em particular benziloxicarbonila; ou - A representa um radical metionila ligado a um radical glicinílico, opcionalmente substituído em sua extremidade N-terminal por um grupo arilalcoxicarbonila, em particular benziloxicarbonila, e - B é como definido acima, em suas definições gerais ou preferidas. Os compostos preferidos da fórmula (I) são os seguintes: - 7-((tert-butoxicarbonil)oxi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptano-2-il)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecaidro-1H- ciclopenta[a]fenantreno- 3-il 2-(2-((benziloxi)carbonil)amino)-

acetamido)propionato, que também recebeu o nome simplificado "3- benziloxicarbonil-glicinil-alanil-7-β-O-tert-butiloxicarbonil- colesterol" ou composto BIM1a; - 7-acetoxi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)- 2,3,4,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H- ciclopenta [a] fenantren-3-il 2-(2- (((benziloxi)carbonil)amino)- acetamido)propionato, que também recebeu o nome simplificado "3- benziloxicarbonil-glicinil-alanil-7-β-O- acetil-colesterol" ou composto BIM1b; - 7-((tert-butoxicarbonil)oxi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2- il)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahydro-1H- ciclopenta[a] fenantren-3-il 2,2-dimetil-1,3-dioxolana-4-carboxilato, também com o nome simplificado "3-(S)-2,2-dimetil-1,3-dioxolana-4-carboxil-7- β-O- tert-butiloxicarbonil-cholesterol" ou composto BIM2a; - 7-acetoxi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptano-2-il)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17-tetradecaidro -1H-ciclopenta [a]fenanter-3-il 2,2-dimetil- 1,3-dioxolano-4-carboxilato, que também recebeu o nome simplificado "3- (S)-2",2-dimetil-1,3-dioxolana-4-carboxil-7-β-O-acetilcolesterol", ou "colest-5-eno-3,7-diol, 7-acetato 3-[[(4S)-2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4- il]carboxil], (3β,7β)" ou composto BIM2b.

[0053] Estes compostos de fórmula (I) são descritos, respectivamente, nos Exemplos 3, 4, 5 e 6 do pedido WO2013/168096.

[0054] Um composto de fórmula (I) particularmente preferido para os fins da invenção é o "composto BIM2b" mencionado acima, ou seja, um composto de fórmula (I) no qual A é um grupo -C(O)R1 no qual R1 é um grupo 2,2-dimetil-1,3-dioxolano e B é um grupo acetil.

[0055] Este composto corresponde à fórmula

[0056] O composto BIM1a é um composto de fórmula (I) no qual A é um grupo 3- benziloxicarbonil-glicinil-alanila e B é um grupo terc-butoxicarbonila.

[0057] O composto BIM1b é um composto de fórmula (I) no qual A é um grupo 3- benziloxicarbonil-glicinil-alanila e B é um grupo acetil-alanila.

[0058] O composto BIM2a é um composto de fórmula (I) no qual A é um grupo 25 -C(O)R1 no qual R1 é um grupo 2,2-dimetil-1,3-dioxolano e B é um grupo terc- butoxicarbonila.

[0059] Na presente descrição, e salvo disposição em contrário, os intervalos de valores indicados são inclusivos.

[0060] O conteúdo do composto da fórmula (I) na composição de acordo com a invenção é de preferência de 0,1 a 3,5% (p/v) do volume total da composição, de preferência 3%. De preferência, esta composição compreende o composto da fórmula (I) a uma taxa de 1 a 35 mg/ml, de preferência 30 mg/ml.

[0061] O conteúdo de veículo lipídico, em particular de óleo vegetal, na composição de acordo com a invenção é de preferência de 90 a 99%, em particular de 95 a 99% (v/v) do volume total da composição.

[0062] As composições de acordo com a invenção também podem conter pelo menos um excipiente ou aditivo usual no caso de uma composição oleosa, por exemplo um co-solvente, como por exemplo um álcool ou um antioxidante.

[0063] Este co-solvente, como por exemplo um álcool, pode estar presente na composição, por exemplo, a uma taxa de 0 a 5%, em particular 1 a 5% (v/v) do volume total da composição.

[0064] Como álcool, será utilizado, de preferência, um álcool de fórmula R-OH, no qual R representa um grupo de hidrocarbonetos C2-C6, de preferência etanol.

[0065] O antioxidante pode ser selecionado a partir dos compostos que são usuais neste campo, por exemplo: - uma substância hidroxilada como o ácido cítrico e seus derivados, em particular citrato de sódio, citrato de cálcio ou citrato de potássio; ácido ascórbico e seus derivados, em particular ácido isoascórbico, ascorbato de sódio ou ascorbato de cálcio; - um derivado do tiol, como por exemplo cisteína, acetilcisteína, ditiotreitol; - uma substância etilenicamente insaturada, como o ácido sórbico, etc.

[0066] Este antioxidante pode estar presente na composição, por exemplo, a uma taxa de 0,005 a 0,020% (p/v), em particular de 0,005 a 0,015% (p/v), de preferência 0,01%.

[0067] Um antioxidante preferido é selecionado a partir do ácido ascórbico e seus derivados.

[0068] Uma composição preferencial de acordo com a invenção compreende 3% (p/v) de derivado de 7β-hidroxicolesterol da fórmula (I), em particular de um dos compostos preferidos da fórmula (I) mencionada acima, e mais particularmente do composto BIM2b, 0,01% de ácido cítrico anidro (p/v) e 1% de etanol (v/v), no óleo de argan. Esta composição também pode ser isenta de etanol.

[0069] A invenção também se refere a uma composição farmacêutica que compreende uma composição como a descrita acima.

[0070] Esta composição farmacêutica também pode conter outro princípio ativo solúvel em um meio lipídico, como por exemplo um agente anti-inflamatório, em particular um corticóide, ou um agente antiepiléptico.

[0071] As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem preferencialmente estar em uma forma adequada para administração por via oral, em particular na forma líquida, como por exemplo, solução oral, suspensão oral, gotas, etc., ou na forma encapsulada, como uma cápsula encapsulando a referida formulação líquida, em particular uma cápsula dura ou mole à base de gelatina.

[0072] A invenção também se refere a um método de preparação de uma composição que compreende um derivado de 7β-hidroxicolesterol e um veículo lipídico, como descrito acima, compreendendo as seguintes etapas - preparação de uma mistura contendo o derivado 7 β-hidroxicolesterol da fórmula (I) como descrito acima, um veículo lipídico e um co-solvente, - opcionalmente adição de um antioxidante, e - se aplicável, evaporação do co-solvente.

[0073] O veículo lipídico, o antioxidante e o co-solvente são os definidos acima.

[0074] Os aspectos preferidos mencionados acima também se aplicam ao método de acordo com a invenção.

[0075] Em particular, este veículo lipídico consiste em um óleo ou uma mistura de óleos, vantajosamente um óleo vegetal ou uma mistura de óleos vegetais, em particular óleo de argan.

[0076] Estes óleos, em particular os óleos vegetais, são utilizados preferencialmente de forma farmaceuticamente aceitável.

[0077] As condições preferenciais de tal método são as seguintes: - a mistura é preparada a uma temperatura da ordem de 22 a 35°C, de preferência 33°C; - o conteúdo do composto da fórmula (I) na mistura é de 0,1 a 3,5% (p/v); - o conteúdo inicial de co-solvente, de preferência etanol, na mistura é da ordem de 1 a 5%, de preferência 2,5% (v/v); - o conteúdo de antioxidante, de preferência ácido cítrico e seus derivados, na mistura é de 0,005 a 0,020% (p/v), em particular de 0,005 a 0,15%, de preferência 0,01% (p/v).

[0078] A mistura contendo o derivado de 7β-hidroxicolesterol da fórmula (I), um veículo lipídico e um co-solvente e opcionalmente um antioxidante pode ser misturado, por exemplo, usando um evaporador rotativo com agitação até que haja dissolução do composto da fórmula (I).

[0079] A mistura pode ser feita, por exemplo, misturando o derivado de 7β- hidroxicolesterol da fórmula (I) e um veículo lipídico, depois adicionando um co- solvente e, opcionalmente, um antioxidante.

[0080] O conteúdo de co-solvente, e em particular de álcool (em particular etanol) obtido após a evaporação é compatível com os regulamentos atuais para formas farmacêuticas (ICH Q3C(R6) Regulations).

[0081] A invenção também se refere a uma composição composta por um derivado do 7β-hidroxicolesterol da fómrula (I) e um veículo lipídico, como definido acima, para uso no tratamento de uma patologia neoplásica, em particular o glioblastoma multiforme.

[0082] A invenção também se refere a uma composição composta por um derivado de 7β-hidroxicolesterol da fórmula (I) e um veículo lipídico, como definido acima, para uso no tratamento de uma hemopatia maligna, em particular uma hemopatia maligna do tipo mielóide.

[0083] A invenção também se refere a um método de tratamento de uma patologia neoplásica, em particular o glioblastoma multiforme, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma composição composta por um derivado de 7β- hidroxicolesterol da fórmula (I) e um veículo lipídico, como definido acima, a um paciente que necessita de tal tratamento.

[0084] A invenção também se refere a um método de tratamento de uma hemopatia maligna, em particular uma hemopatia maligna do tipo mielóide, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma composição composta por um derivado de 7β-hidroxicolesterol de fórmula (I) e um veículo lipídico, como definido acima, a um paciente que necessita de tal tratamento.

[0085] A invenção também se refere a uma composição farmacêutica que compreende uma composição composta por um derivado de 7β-hidroxicolesterol da fórmula (I) e um veículo lipídico, como definido acima, para uso no tratamento de uma patologia neoplásica, em particular de glioblastoma multiforme, ou no tratamento de uma hemopatia maligna, em particular de uma hemopatia maligna do tipo mielóide.

[0086] Os aspectos gerais e preferenciais mencionados acima, em particular para o derivado de 7 β-hidroxicolesterol da fórmula (I) e o veículo lipídico, também se aplicam a estes usos e métodos.

[0087] A dose administrada pode ser, por exemplo, de 3 a 5 mg/kg por dia com uma duração variando, por exemplo, de 84 a 105 dias. Entretanto, a dose pode ser aumentada dependendo da condição do paciente e do estágio da doença até 30 mg/kg/dia e a duração do tratamento pode ser aumentada, por exemplo, para 2 meses.

[0088] A invenção é ilustrada pelos Exemplos 1-2 (preparação) e Exemplos 3 a 8 (resultados).

[0089] O método de solubilização do BIM2b, como descrito em detalhes nos Exemplos 1 e 2, permitiu a dissolução do BIM2b nos óleos, particularmente no óleo de argan. Em um aspecto vantajoso, sobre uma faixa de 1 a 500 ml de óleo, as condições de adição do pó BIM2b ao óleo, de mistura do sistema BIM2b/óleo e a relação área de superfície/volume na qual a mistura foi realizada levaram à solubilização completa do pó BIM2b no óleo.

[0090] A figura 1 mostra a cromatografia em coluna de sílica de um extrato lipídico de um cérebro de camundongo saudável tratado com a formulação oleosa do Exemplo

2.

[0091] A figura 2 mostra a cromatografia em coluna de sílica de um extrato lipídico do cérebro de um cão com glioblastoma tratado com a formulação oleosa do Exemplo

2.

[0092] A figura 3 mostra o monitoramento da estabilidade, por HPTLC, da formulação oleosa do Exemplo 2 após os testes de resistência a extremos de pH.

[0093] A Figura 4 mostra a regressão total do tumor em um sujeito canino com glioblastoma tratado com a formulação oleosa do Exemplo 2. As seguintes abreviações são utilizadas:

[0094] 7β-acetil-CH: 7β-acetil-colesterol

[0095] 7β-OHCH: 7 β-hidroxicolesterol

[0096] APCI: Fonte de Ionização Química por Pressão Atmosférica TLC: cromatografia em camada fina

[0097] CH: colesterol

[0098] CHCl3: clorofórmio

[0099] Composto BIM2b: compound 7-acetoxi-10,13-dimetil-17-(6- metilheptan-2-

il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahydro-1H- ciclopenta[a] fenantren-3- il 2,2-dimetil-1,3-dioxolana-4-carboxilato, também chamado de colo-5-eno-3,7-diol, 7- acetato 3-[[(4S)-2,2-dimetil-1,3-dioxolana-4- il]carboxilato], (3β,7β)

[0100] Composto BIM2b PO: composto BIM2b na forma de formulação oleosa do Exemplo 2 para administração pela via oral

[0101] EtOH: etanol

[0102] Folch: CHCl3:MetOH (2:1, v:v)

[0103] AO: óleo de argan

[0104] HCl: ácido clorídrico

[0105] GBM: glioblastoma multiforme

[0106] HPTLC: Cromatografia de camada fina de alto desempenho

[0107] KCl: cloreto de potássio MetOH: metanol

[0108] NaOH: hidróxido de sódio

[0109] p: peso

[0110] MW: peso molecular

[0111] RT: temperatura ambiente

[0112] UPLC MS: cromatografia líquida de ultra alto desempenho -

[0113] espectrometria de massa

[0114] v: volume A/ MOLÉCULAS E VEÍCULOS UTILIZADOS E ANÁLISES 1) Substância ativa

[0115] Colest-5-eno-3,7-diol, 7-acetato 3-[[(4S)-2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4- il]carboxilato], (3β,7β) foi sintetizado no grau GLP/GMP como descrito no documento WO2013/168096 (obtido na forma de pó como descrito no Exemplo 6).

[0116] Esta molécula, cuja fórmula é dada abaixo, é chamada de BIM2b em toda a seção experimental.

Peso molecular: 572,83 2) Produtos de degradação e principais metabólitos da substância ativa a) 7 β-Acetil-colesterol foi sintetizado como descrito no documento WO2013/168096 (composto 1,4).

[0117] Esta molécula, cuja fórmula é dada abaixo, é chamada 7 β-acetil-CH em toda a seção experimental.

Peso molecular: 444 b) 7 β-hidroxicolesterol foi fornecido pela SIGMA (referência 700035P).

[0118] Esta molécula, cuja fórmula é dada abaixo, é chamada 7β-OHCH em toda a seção experimental.

Peso molecular: 402,65 c) O colesterol foi fornecido pela SIGMA (referência C8503).

[0119] Esta molécula, cuja fórmula é dada abaixo, é chamada de CH em toda a seção experimental.

Peso molecular: 386,65 d) O veículo selecionado é o óleo de argan (Olsana, França), chamado AO em toda a seção experimental. B) MATERIAIS E MÉTODOS I) MATERIAIS I.1) Cromatografia I.1.1) Cromatografia de camada fina de alto desempenho (HPTLC) e cromatografia de adsorção em uma coluna de sílica convencional - Tanques multiplacas para cromatografia 20 x 20 cm (referência 552-0359) - Colunas cromatográficas com fritas de vidro (comprimento útil: 300 mm; diâmetro interno = 11 mm; torneira de PTFE 1,5 mm operada por chave) (Laboratório Analítico, referência LE-AT1811) - Gel de sílica em pó 60 (0,063-0,200 mm) (referência 1.07734.1000) - Placa HPTLC: gel de sílica 60 F254 com zona de concentração (2,5 cm) sobre folha de alumínio (VWR, referência 1055830001). - Nebulizador e Erlenmeyer de 100 ml (Witeg, referência 2147100, NS

14.5/23) - Placa quente (Stuart SB162) - Tubo de vidro borossilicatado - Scanner (Foto Epson Perfection V370) - Microcapilares Drummond 10μl (Sigma, referência P1924) I.1.2) Cromatografia em cartucho de adsorção ou em fase reversa

- Sílica clássica SEP PAK (Waters, referência WAT051900) - SEP PAK Plus C18 (Águas, referência WAT023635) I.1.3) Cromatografia líquida de ultra alto desempenho - Espectrometria de massa (UPLC - MS)

[0120] A quantificação das moléculas em investigação (BIM2b e seus metabólitos) foi elaborada utilizando um sistema Nexera X2 UPLC (Shimadzu) equipado com 30 uma coluna Kinetex EVO C18 (tamanho da partícula: 1,9 μm; dimensões da coluna: 100 x 2,1 mm, Fenomenex). A detecção APCI é realizada com um quadripolo (LCMS 8050, Shimadzu). I.2) FormulaçãodeBIM2bparaadministraçãopelaviaoral(BIM2b PO) - Balança de precisão Sartorius Quintix (Sartorius, referência QUINTIX 124- 1S) - Tubos de vidro borossilicato de 5 ml 12 x 75 mm (Kimble, referência 73500-1275) - Tubos de 25 ml de vidro borossilicato Pyrex 18 x 180 mm (Dutscher, referência 090482) - Béquer de 5 ml - Frasco de reação de 1 litro com tampa de vidro moída (fêmea, 29/32NS) (VWR, referência 201-1359) - Evaporador rotativo Buchi R-215 - Microscópio de luz invertida com contraste de fase Eclipse TS-100F trinocular Nikon (Dutscher, referência: 094501) acoplado a uma câmera digital de montagem em C (NIKON, DCMC510) I.3) Quantificação das moléculas sob investigação (BIM2b e seus metabólitos): homogeneização de cérebros de camundongos selvagens e de tumores obtidos após necropsia de cérebros de cães com GBM - Homogeneizador (Ika eurostar 20 digital) - Moedor de tecido Potter-Elvehjem (capacidade: 4 ml; comprimento: 120 mm; diâmetro externo: 11 mm) (VWR, referência 432-0200) - Funil separador esférico, 250 ml com torneira PTFE (Dutscher, referência

479036) - Funil de separação, 50 ml com torneira PTFE (Dutscher, referência 084118) I.4) Solventes orgânicos e outros materiais de consumo - Sílica para cromatografia em coluna, sílica gel 60 (0,063-0,200 mm) (Merck, referência 1.07734.1000) - CHCl3, grau HPLC (Sigma, referência 528730) - EtOH absoluto (Sigma, referência SI-32221) - MetOH cromasolv para HPLC ≥ 99,9% (SIGMA, referência 34860) - N-Hexano para HPLC (Fisher Scientific, referência 1070361) - Óxido de dietila, estabilizado para HPLC (Laboratório Analítico, referência FI- 10254914) - Acetona (Sigma-Aldrich, referência 322201) - Ácido ortofosfórico 99% (Laboratório Analítico, referência U1B203102H) - Acetato de cobre 98% (Sigma, referência 326755/ - Hidroxitolueno butilado (BHT; Sigma, W218405, referência W218405) - Ácido clorídrico mín. 37% (HCl, Thermofisher, referência M0643H) - Soda (NaOH/Thermofisher, referência 04815) - Carbonato de amônio (Sigma, referência 207861) - Cloreto de potássio (Fisher Scientific, referência W2752) - Formol ou solução de formaldeído (36,5-38% em água) (Sigma, referência F8775) - Acetato de amônio (Merck, referência C138315) II) Métodos II. 1) Cromatografia HPTLC

[0121] Esta abordagem analítica foi utilizada para quantificar o BIM2b, seus produtos de degradação e seus principais metabólitos no medicamento (BIM2b PO) e cérebros de camundongos do tipo selvagem ou tumores de GBM de cães que tinham esta patologia. O limite de detecção do BIM2b e de seus produtos de degradação (7 β-acetil-CH e 7 β-OHCH), determinado experimentalmente, é de 0,5 μg.

[0122] Este método foi validado por UPLC - MS. - Tratamento das placas HPTLC

[0123] Os tanques de cromatografia de múltiplas placas são saturados com o sistema eluente, a mistura CHCl3:MetOH (1:1; v:v), durante 1 h. As placas HPTLC são colocadas nos tanques; a eluição é interrompida quando a frente eluente atinge 1,5-2 cm da borda superior das placas. Em seguida, são secas à temperatura ambiente durante 1 h. Em seguida, estas placas são ativadas a 110°C durante 15 min. Uma vez resfriadas, elas são envoltas em folha de alumínio e são armazenadas longe da luz e da umidade. - Depósito das amostras nas placas HPTLC, e condições cromatográficas

[0124] Todas as amostras são solubilizadas em acetona e são depositadas com 10 capilares Drummond (10 μl) na zona de concentração das placas HPTLC. Quando são utilizadas as faixas padrão de BIM2b, 7 β-acetil-CH e 7 β-OHCH, elas são preparadas a partir de soluções de estoque de etanol de 0,1 mg/ml para cada molécula de referência.

[0125] A separação cromatográfica é realizada em duas etapas: uma etapa de pré-eluição (3 vezes) com a mistura CHCl3:MetOH (2:1, v/v) como sistema eluente para a zona de concentração, seguida por uma etapa de separação (3 vezes) para a zona de separação realizada com a mistura hexano:eter (3:7, v/v) como sistema eluente, a fim de identificar e quantificar os esteróis.

[0126] Antes da cromatografia, os tanques são saturados com os respectivos sistemas eluentes para concentração e separação.

[0127] As placas são secas entre cada eluição usando uma corrente de ar frio de um secador de cabelo. - Visualização e quantificação dos oxisteróis

[0128] Os oxisteróis são visualizados de acordo com o método Macala (1). O reagente Macala consiste em uma solução aquosa a 8% (p/v) de ácido ortofosfórico e 3% (p/v) de acetato de cobre. Após cromatografia, as placas de HPTLC são secas, aspergidas com o reagente Macala e aquecidas em uma placa quente a 140°C. Os oxisteróis tornam-se azuis prussianos e o colesterol se torna malva. As manchas coloridas são digitalizadas e depois quantificadas pelo Image J (versão 1,50 g).

[0129] A quantificação dos oxisteróis e do colesterol pelo método HPTLC foi validada por UPLC - MS. II.2) UPLC – MS

[0130] Condições experimentais para eluição e detecção: - Quantificação de BIM2b e 7β-OHCH

[0131] A eluição isocrática é realizada com uma fase móvel que consiste de MetOH contendo 5 mM de acetato de amônio. - Quantificação de 7β-acetil-CH:

[0132] A eluição é realizada com um gradiente binário linear. O eluente A era 0,1% (v:v) de ácido fórmico e o eluente B era MetOH contendo 0,1% de ácido fórmico. A eluição começa com uma mistura (v:v) de 20% A e 80% B e termina com 100% do eluente B; a duração do gradiente é de 3 min.

[0133] O volume das injeções é de 10μl e a detecção é realizada pela APCI em modo positivo. II.3) Extração e purificação de BIM2b e seus produtos de degradação

[0134] Com exceção da quantificação de BIM2b, 7β-acetil-CH e 7β-OHCH durante os testes de estabilidade em BIM2b na formulação BIM2b (BIM2b PO), onde as amostras de BIM2b PO são aplicadas diretamente nas placas HPTLC, a extração e purificação dos oxisteróis é necessária para quantificar estas moléculas em BIM2b PO expostas a condições de pH extremo, em cérebros de camundongos do tipo selvagem alimentados por via oral com BIM2 PO ou em tumores de GBM obtidos da necropsia de um cão com GBM que ocorreram espontaneamente (sujeito de GBM), tratados por via oral com BIM2b e que sobreviveram por 8 meses (a sobrevivência média de um cão com GBM é de 2- 3 meses apesar dos tratamentos de quimioterapia).

[0135] Os oxisteróis são extraídos pelo método recomendado por Folch et al. (2). A extração é feita em um funil separador. Em resumo, a extração é realizada com uma mistura CHCl3:MetOH (2:1, v:v; Folch); para este método, a relação entre o volume de Folch e o volume da amostra aquosa é de 19. Lavar e quebrar a fase com 0,2 volume da fase orgânica da solução aquosa contendo KCl a 0,74%.

[0136] Para o caso da extração dos oxisteróis do cérebro de camundongos saudáveis tratados por via oral com BIM2b PO ou de um tumor GBM de um cão também tratado por via oral com BIM2b PO, a fase orgânica enxaguada com 0,74% KCl é enxaguada novamente com 0,4 volume de mistura CHCl3:MetOH:H2O (3:48:47; v:v:v; fase superior de Folch). O resíduo seco é então solubilizado em um solvente adequado para o método experimental que segue a etapa de extração. II.4) Amostras que requerem extração antes da separação e quantificação dos oxisteróis - Teste de resistência do BIM2b PO a um pH ácido extremo seguido de incubação em pH básico

[0137] Para estes testes, o BIM2b PO é incubado primeiramente em um banho ácido a pH 1,5 e depois em um banho básico a pH 8,5. Estes 2 valores correspondem respectivamente aos pHs fisiológicos da digestão gástrica e da digestão ao nível da ampola Vater em humanos.

[0138] O banho aquoso ácido é preparado a partir de soluções de estoque 1M e 0,1M de HCl. O banho básico é uma solução aquosa de carbonato de amônio a 25 mM.

[0139] Um primeiro béquer contendo 4 ml de banho ácido (pH 1,5) é aquecido a 37°C antes de iniciar o experimento; 2 ml de BIM2b PO são então gentilmente depositados na superfície do banho. A mistura de reação é agitada com uma barra magnética por 10 h. A agitação é desligada, e a mistura de reação é deixada em repouso por 2 h para uma reforma adequada da fase oleosa superior. Durante as 2 h com a mistura de reação deixada em repouso, o banho básico (pH 8,5) é preparado em um segundo béquer e aquecido a 37°C. Uma amostra de 1 ml é retirada da fase lipídica do banho ácido e é depositada suavemente sobre a superfície aquosa do banho básico. A agitação é iniciada, durante 10 h de incubação. Após a interrupção da agitação, toda a mistura (BIM2b PO e o banho básico) é submetida à extração de Folch, sem necessidade de lavar novamente a fase orgânica com a fase superior de Folch. - Extração e quantificação dos oxisteróis e seus metabolitos a partir de cérebros de camundongos saudáveis tratados com BIM2b PO (via oral)

[0140] O cérebro do mouse seca e armazenado invididualmente em criotubos a 180°C em nitrogênio líquido são deixados para retornar à temperatura ambiente. Cada cérebro é pesado e colocado no Potter; 4 ml de 0,74% de KCl frio são adicionados e o restante do procedimento ocorre em uma cama de gelo.

[0141] Cada cérebro é moído 6 vezes a 1000 rev/min, cada ciclo compreendendo 5 minutos de moagem e 5 minutos de descanso. Os oxisteróis são extraídos de acordo com o procedimento Folch descrito acima (II. 3.). O resíduo lipídico é então submetido à cromatografia de adsorção em uma coluna de sílica.

[0142] A sílica (8 g) é preparada em 40 ml da mistura de hexano:éter (óxido dietílico (3:7, v/v) e depois despejada nas colunas apropriadas. A altura do leito de sílica é de 18 cm e seu volume é de 15 ml.

[0143] Uma quantidade adequada de extrato de cérebro de camundongo é dissolvida em 1 ml do primeiro sistema eluente e depositada no leito de sílica. A eluição ocorre em 4 etapas a fim de concentrar as frações que contêm os oxisteróis e remover o máximo possível os lipídios que contaminam o cérebro do camundongo, em particular o colesterol.

[0144] As eluições procedem da seguinte forma: 1a eluição: hexano:éter (3:7, v:v) 2a eluição: acetona:EtOH (95:5, v:v) 3a eluição: acetona:EtOH (93:7, v:v) 4a eluição: EtOH

[0145] O procedimento de eluição é descrito na Figura 1.

[0146] Os grupos de frações são evaporados até a secura, dissolvidos em acetona e os volumes apropriados são submetidos à cromatografia HPTLC. - Extração e quantificação de BIM2b e seus metabólitos de um tumor de GBM em um cão tratado com BIM2b PO (via oral)

[0147] O tumor GBM foi obtido por necropsia de um cão com glioblastoma, que foi tratado pela via oral com BIM2b PO e que viveu com uma boa qualidade de vida durante 8 meses. A necropsia foi realizada 21 dias após a interrupção do tratamento com BIM2b PO. O tumor foi fixado em formol principalmente para análise histopatológica e um fragmento restante foi analisado para quantificação de BIM2b.

[0148] Em fragmentos de cérebro de cães sem GBM e em uma parte do fragmento tumoral, todas as verificações foram realizadas para demonstrar que a fixação com formol não alterou a qualidade dos oxisteróis ou o rendimento na extração dos mesmos pela técnica Folch.

[0149] Os fragmentos de cérebro de cão, armazenados individualmente em criotubos a +4°C em um banho de formol, são secos em papel sopalina antes de serem pesados e colocados no oleiro. Assim como na extração do cérebro do camundongo, cada fragmento foi extraído após a adição de 4 ml de 0,74% de KCl frio. Os procedimentos para homogeneização e extração são os mesmos descritos para os cérebros de camundongos na seção Métodos.

[0150] O extrato lipídico seco do fragmento de tumor GBM de cachorro foi assim obtido e foi cromatografado sequencialmente em um cartucho Sílica Clássica SEP PAK; depois em SEP PAK Plus C18 (com eluente A = 5 mM de acetato de

[0151] 20 amônio/água pura e B = 5 mM de acetato de amônio/MetOH). O processo de cromatografia nas colunas SEP PAK é mostrado na Figura 2. C) Exemplos de preparação e resultados Exemplo 1: Testes em veículos lipídicos

[0152] Os óleos testados são óleo de argan, óleo de abacate, azeite de oliva, óleo de amendoim e óleo de grainha de uva. Os testes foram realizados em escala de tubo de ensaio.

[0153] Várias quantidades de BIM2b, variando de 1 a 35 mg, foram adicionadas a 1 ml do óleo selecionado, várias vezes, para atingir a quantidade determinada.

[0154] O tubo de ensaio é mexido suavemente entre cada adição de BIM2b.

[0155] Os tubos são colocados em uma incubadora a 37°C durante 24 h. Durante as primeiras 5 horas de incubação, os tubos são retirados da incubadora a cada hora para que sejam agitados suavemente, e são recolocados na incubadora durante a noite. No dia seguinte, o aspecto da mistura do óleo e BIM2b foi verificado visualmente para determinar o grau de dissolução do pó no óleo. Quando o BIM2b parece a olho nu ter se dissolvido completamente no óleo, o exame com o microscópio é realizado para verificar a presença ou ausência do BIM2b na forma de pó ou cristais.

[0156] Os resultados mostram que o BIM2b se dissolve completamente em óleo de abacate, azeite de oliva, óleo de amendoim e óleo de semente de uva a uma concentração de 3 mg de BIM2b/ml de óleo.

[0157] No óleo de argan (AO), o BIM2b é dissolvido até uma concentração de 30 mg (52μmol) de BIM2b/ml de AO. Exemplo 2: Preparação do BIM2b PO

[0158] 285 ml de óleo de argan (Olsana, França) foram colocados em um frasco de 1L, utilizado como recipiente de produção. A posição do frasco é inclinada e é girada manualmente em torno de seu próprio eixo a fim de distribuir o óleo uniformemente na parede do frasco em uma relação área/volume: 1,6 cm-1 (resultado calculado: 460 cm2/285 cm3). Mantendo esta posição, 9 g de pó BIM2b é incorporado sobre toda a parede, de modo a cobrir toda a superfície do frasco. Em seguida, são adicionados 3 mL de etanol contendo 30 mg de ácido cítrico (de uma solução de reserva a 10 mg de ácido cítrico/ml de etanol); e depois 12 ml de etanol (ou seja, 5% de etanol). O frasco é colocado em um evaporador rotativo angular Buchi® R-215 em banho-maria a 30°C a uma velocidade de 15 rpm durante 2 h. Para evaporar o etanol, ele é então deixado para evaporar em banho-maria a 30°C durante a noite com a rolha aberta. Assim, 300 ml de composição são obtidos contendo BIM2b em óleo de argan a uma concentração de 30 mg/ml.

[0159] A formulação BIM2b PO assim obtida, que será utilizada nos exemplos dados abaixo, contém 3% (p/v) de BIM2b, 0,01% (p/v) de ácido cítrico anidro e 30 1% de EtOH (v/v) (após evaporação) em óleo de argan.

[0160] A quantificação de BIM2b em BIM2b PO e de seus produtos de degradação logo após a produção deste lote mostra uma concentração de 30 mg de BIM2b/ml de BIM2b PO sem nenhum produto de degradação.

[0161] Um estudo de estabilidade dos lotes BIM2b PO produzidos por este método mostra, sob condições experimentais, a presença de 1% de produtos de degradação (p/v) após armazenamento por 6 meses, e menos ou igual a 2% (p/v) após armazenamento do mesmo lote por 12 meses. Exemplo 3: Teste de resistência de BIM2b PO a um pH ácido seguido de incubação em pH básico

[0162] O procedimento de teste é descrito acima na Seção II) Métodos.

[0163] Após incubação de BIM2b PO nos sucessivos banhos ácidos (pH 1,5) e básicos (pH 8,5), o extrato lipídico seco foi dissolvido em acetona. Devido à falta de espaço (4 faixas a 15, 30, 40 e 60 μg teóricos), uma faixa padrão não foi depositada.

[0164] Os resultados analíticos do HPTLC apresentados na Figura 3 mostram a detecção de uma única faixa, a do BIM2b, independentemente da quantidade depositada, com um fator de retenção (Rf) de 0,5 a 0,64. Os valores Rf dos produtos de degradação 7β-acetil-CH e 7β-OHCH (não visível) determinados experimentalmente são 0,37 e 0,24, respectivamente. Estes resultados mostram que o BIM2b PO resiste a condições de pH extremo sem ser degradado. Exemplo 4: Investigação da toxicidade do BIM2b PO em camundongos saudáveis

[0165] A composição do Exemplo 2 foi administrada oralmente (por tubo) a camundongos do tipo selvagem a uma taxa de 1,5 mg (50 μl de BIM2 PO) por animal, duas vezes ao dia, 5 dias em 7 com uma duração máxima de tratamento de 21 dias. Em paralelo, um grupo de controle de camundongos do tipo selvagem não recebeu nenhum tratamento.

[0166] No grupo tratado, 2 camundongos foram sacrificados após 18 dias e 3 camundongos foram sacrificados após 21 dias. No grupo de controle, 3 camundongos foram sacrificados após 21 dias.

[0167] As amostras de órgãos internos (estômago, canal alimentar, fígado, rim, pulmão, coração) foram imersas em formaldeído a 4% durante 72 h e armazenadas a 4°C, e depois embebidas em parafina. As amostras foram submetidas a análise macroscópica antes e depois do desbaste.

[0168] O exame histológico dos órgãos internos fixados com formaldeído e quantificações toxicológicas foram realizados em seções coradas com hematoxilina- eosina de acordo com um sistema de avaliação em 4 níveis de acordo com a nomenclatura (3).

[0169] Todas as seções foram examinadas quanto a possíveis sinais de alteração celular, degeneração, necrose, inflamação, fibrose, etc.

[0170] As conclusões são as seguintes (para cada órgão): - Estômago: não há lesão em nenhum camundongo tratado - Intestino delgado: inflamação mínima de natureza linfoplasmacística interpretada como fazendo parte do ruído de fundo. Nenhuma lesão significativa. - Intestino grosso: não há lesão em nenhum dos camundongos. - Fígado: uma tendência à redução do armazenamento citoplasmático e hipertrofia hepatocelular foram observados nos camundongos tratados em comparação com os camundongos de controle. Esta mudança permaneceu muito difusa e não pode ser atribuída com certeza ao tratamento. - Rim: nenhuma lesão significativa detectada em nenhum dos camundongos. - Pulmão: histiocitose mínima e leve inflamação alveolar em um dos camundongos tratados, possivelmente causada pela alimentação forçada por via oral. - Coração: nenhuma lesão detectada em nenhum dos camundongos.

[0171] Em resumo, os resultados mostram que a molécula BIM2b não causa qualquer toxicidade. A administração de BIM2b na posologia indicada, duas vezes ao dia, 5 vezes por semana, com ausência de tratamento no fim de semana, não deu origem a efeitos clínicos indesejáveis. Da mesma forma, os parâmetros biológicos investigados não demonstraram toxicidade hepática ou renal. Diabetes e hipercolesterolemia, que poderiam ser esperados com a administração de um esteroide, não foram observados. Exemplo 5: Estudo de tolerância de BIM2b PO em cães saudáveis

[0172] A composição do Exemplo 2 foi administrada oralmente a 3 cães beagle com peso médio de 11 kg, a uma taxa de 15 mg (0,5 ml), duas vezes ao dia (de manhã após a refeição do dia e à noite durante o jejum), 5 dias em 7 com uma duração de tratamento de 21 dias.

[0173] O cálculo da dose administrada foi baseado no valor especificado para a administração, de 3 mg/kg por dia.

[0174] Um exame clínico completo dos animais foi realizado diariamente nos dias úteis de D0 a D21: pesagem, tomada da temperatura retal, estado geral, apetite. No fim de semana (período de descanso sem administração), os animais só foram submetidos a simples observação para verificar se seu estado geral e comportamento eram normais.

[0175] Amostras de sangue para o hemograma completo (FBC) e ensaios bioquímicos foram colhidas no início e no final do tratamento (em D0 e D21). Todos os cães receberam o tratamento completo. Nenhum efeito colateral foi observado quando os cães foram examinados.

[0176] Os resultados do estudo são os seguintes:

[0177] Como o uso de esteróides pode causar um ganho de peso, os cães eram pesados todos os dias do tratamento. Ao contrário do esperado, foi observada uma perda de peso para todos os cães de cerca de 4,5%.

[0178] Não foi detectado aumento no nível de colesterol e triglicerídeos. Pelo contrário, foi medida uma diminuição na quantidade dessas moléculas: -2,3% em média para o colesterol, -30% em média para os triglicerídeos.

[0179] O uso de esteróides também pode ser a fonte de desenvolvimento do diabetes. Nenhum aumento na glicemia foi observado na D21. Pelo contrário, foi observada uma diminuição na glicose de 12,9% em média.

[0180] Com base no equilíbrio renal realizado (uréia e creatinina), não foi observada toxicidade renal nos 3 cães.

[0181] O equilíbrio hepático (albumina, proteínas, aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) (relação AST/ALT), fosfatase alcalina, bilirrubina total) dos 3 cães estava normal após o tratamento. Além disso, nenhuma mudança significativa nos parâmetros hematológicos e bioquímicos foi observada.

[0182] Em resumo, o composto BIM2b administrado sob a forma de composição BIM2b PO não leva a nenhuma toxicidade. A administração desta composição na posologia de 30 mg/ml de composto BIM2b, duas vezes ao dia, 5 dias por semana, durante 21 dias, não causou efeitos clínicos indesejáveis. Da mesma forma, os parâmetros estudados não demonstraram toxicidade hepática ou renal. Exemplo 6: Estudo da eficácia anti-GBM do BIM2b PO administrado pela via oral a cães com gliomas espontâneos (chamados "pacientes caninos GBM")

[0183] O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia do composto BIM2b administrado em uma composição de acordo com a invenção no tratamento dos gliomas caninos.

[0184] 9 cães com gliomas espontâneos diagnosticados por imagens foram 15 incluídos no estudo. Os cães foram tratados oralmente com uma dose diária de 3 mg/kg de composto BIM2b (1 ml de composição do Exemplo 2) por parcela de 5 kg.

[0185] O estudo compreende 5 ciclos de tratamento de 21 dias (105 dias) seguidos de 2 ciclos de 3 meses de observação. A condição e o volume do tumor são avaliados por ressonância magnética.

[0186] No dia D0 (1a administração), paciente canino GBM é examinado clinicamente e uma amostra de sangue é coletada para análise dos parâmetros bioquímicos. No dia D15, um eletrocardiograma é registrado e uma amostra de sangue é colhida. A partir de D21, a dose é revisada, seja aumentada (+ 25% da dose original) ou diminuída (-25% da dose original), dependendo da resposta do tumor e/ou toxicidade.

[0187] Eletrocardiogramas, amostras de sangue e ressonância magnética são realizados em D42, D63, D84 e D105, depois de 3 meses e 6 meses após a interrupção do tratamento.

[0188] A resposta ao tumor é avaliada por RM com base nos critérios RECIST (Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos). Estes critérios definem a resposta tumoral da seguinte forma: - A progressão é um aumento no tamanho do maior eixo do tumor de mais de 20% em relação à ressonância magnética anterior; - A regressão é definida por uma diminuição no tamanho do maior eixo do tumor de mais de 30% em relação à ressonância magnética anterior;

- A estabilidade é definida por uma mudança no tamanho do tumor entre uma diminuição de menos de 30% e um aumento de menos de 20%. Resultados

[0189] Este estudo durou 22 meses. 3 dos 9 cães incluídos não foram analisados, pois não alcançaram a D42 (mortes devidas, em particular, à inclusão em um estágio muito avançado da doença). Entre os 6 cães restantes, 2 cães (N e G) morreram em D165 (5,5 meses) e D126 (4,2 meses), respectivamente. O tumor do paciente canino N GBM foi utilizado para quantificar o BIM2b e seus metabólitos (Exemplo 8).

[0190] Para os demais cães de 4 GBM, descobriu-se que o tratamento pela via oral é bem tolerado. Uma melhora dos sinais clínicos é observada para todos os 4 cães: 2 permaneceram estáveis e uma regressão muito clara foi observada nos outros dois casos quase com o desaparecimento da lesão para um deles (D). A figura 4 mostra o desaparecimento do tumor para o cão D em D42. Exemplo 7: Análise de BIM2b no cérebro de camundongos tratados por os com BIM2b

PO

[0191] O tratamento dos camundongos saudáveis per os com BIM2b PO e a proveniência dos cérebros são descritos no Exemplo 4.

[0192] O composto BIM2b e seus metabólitos no cérebro foram separados, detectados e quantificados por HPTLC, conforme descrito na seção Métodos.

[0193] Os resultados são apresentados na Tabela 1 abaixo: Tabela 1 Dia Peso do cérebro (mg) Composto BIM2b (μg/g de cérebro) D2 415 12,5 D4 490 7,1 D18 471 11,7 D22 466 1,0

[0194] Os resultados mostram que o composto BIM2b é encontrado no cérebro de camundongos tratados pela via oral com BIM2b PO em uma composição de acordo com a invenção. Isto demonstra que o composto BIM2b cruza a barreira hematoencefálica (BBB) dos camundongos saudáveis tratados. Em D22, uma correlação evidente é observada entre a queda pronunciada (91,5%) no conteúdo de

BIM2b no cérebro do camundongo e a interrupção do tratamento em D20. Os metabólitos são encontrados apenas como traços.

[0195] No caso de uma patologia neoplásica, em vez de BBB, é feita referência ao BTB (barreira hemato-tumoral). O BTB é enfraquecido pela presença do tumor e por sua fisiologia. As pesquisas mostram que as moléculas atravessam o BTB mais facilmente do que o BBB.

[0196] A travessia do BBB pode, portanto, ser considerada como uma previsão de travessia do BTB.

[0197] A porcentagem de BIM2b encontrada no cérebro, em relação à quantidade total que os camundongos ingeriram, é de 0,013% em D18.

[0198] Exemplo 8: Análise de BIM2b em um tumor de um paciente canino GBM tratado pela via oral com BIM2b PO.

[0199] O tumor GBM é do cão N no Exemplo 6.

[0200] O composto BIM2b e seus metabólitos no tumor são separados, detectados e quantificados por HPTLC, conforme descrito na Seção II) Métodos. Os resultados mostram a presença de 3,7 μg de BIM2b nos 212,7 mg de 25 fragmento de tumor analisado. A porcentagem por peso de BIM2b encontrada em todo o tumor em relação à quantidade total de BIM2b que o cão ingeriu é de 0,39%; ou seja, 30 vezes mais que a porcentagem por peso encontrada no cérebro de camundongos saudáveis (Exemplo 7).

[0201] O fato de que a necropsia do tumor foi realizada 21 dias após a interrupção do tratamento e que o BIM2b ainda é encontrado no tumor mostra que o composto BIM2b contido no BIM2b PO atravessa o BTB e é encontrado preferencialmente no tumor GBM.

[0202] Referências

1. Macala,LJ,YuRKeAndo,S., J. Lip. Res. (1983), 24: 1243-1250.

2. Folch,J,Lees,MeSloane-Stanley,GH., J. Biol. Chem. (1957), 226: 497-509.

3. MannPC,VahleJ.,Keenan,CM,BakerJF,Bradley,AE,Goodman, DG, Harada, T, Herbert, R, Kaufmann, W, Kellner, R, Nolte, T, Rittinghausen, S, e Tanaka, T., Toxicologic Pathology (2012), 40 (4 Suplemento).

Claims (24)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um derivado 7 β -hidroxicolesterol e um veículo lipídico, em que dito veículo lipídico compreende um óleo ou uma mistura de óleos, no qual o derivado 7 β - hidroxicolesterol corresponde à fórmula (I) (I) na qual: - A representa um grupo -C(O)R1 no qual R1 é um heterociclo saturado compreendendo 5 a 14 membros e incluindo 1 ou 2 heteroátomos, não substituídos ou substituídos com pelo menos um grupo alquila C1-C6 linear ou ramificado ou um grupo selecionado de OR, NRR', NHR e SR, onde R e R', independentemente, representam hidrogênio, uma alquila C1-C12 linear ou ramificada, de preferência C1-C6 ou uma arila não substituída; ou um grupo -(R2)n- no qual R2 é um resíduo de aminoácido ligado por sua extremidade C-terminal e n= 1 a 3, cada dos R2 sendo idêntico ou diferente, no qual a extremidade N-terminal do dito aminoácido pode ser substituída por um grupo - C(O)R3 no qual R3 é um grupo mono- ou policíclico C6-C14 arilalquila; um grupo mono ou policíclico C5-C14 heteroarilalquila que pode compreender um ou mais heteroátomos, que podem ser idênticos ou diferentes; um grupo mono ou policíclico C6-C14 arilalquilóxi ou um grupo mono ou policíclico C5-C14 heteroarilalquiloxi que pode compreender um ou mais heteroátomos, que podem ser idênticos ou diferentes, - B representa um grupo -C(O)R4, no qual R4 é uma alquila C1-C12 linear ou ramificada, de preferência C1-C6, não-substituída ou substituída com um grupo selecionado de OR, NRR', NHR e SR, como definido acima; um grupo arila, não- substituído ou substituído por um grupo selecionado de OR, NRR', NHR e SR, como definido acima; ou R4 representa OR5, no qual R5 é uma alquila C1-C12 linear ou ramificada, de preferência C1-C6.

2. Composição caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um derivado 7 β -hidroxicolesterol e um veículo lipídico, excluindo um veículo lipídico composto por vesículas lipídicas formadas a partir de uma ou mais camadas lipídicas ou composto por fosfolípidos na forma não-lipossomal, no qual o derivado 7β – hidroxicolesterol corresponde à fórmula (I) (I) na qual: - A representa um grupo -C(O)R1 no qual R1 é um heterociclo saturado compreemdemdp 5 a 14 membros e incluindo 1 ou 2 heteroátomos, não substituídos ou substituídos com pelo menos um grupo alquila C1-C6 linear ou ramificado ou um grupo selecionado de OR, NRR', NHR e SR, onde R e R', independentemente, representam hidrogênio, uma alquila C1-C12 linear ou ramificada, de preferência C1-C6 ou um grupo arila não substituído; ou um grupo -(R2)n- no qual R2 é um resíduo de aminoácido ligado por sua extremidade C-terminal e n= 1 a 3, sendo cada um dos R2 sendo idêntico ou diferente, no qual a extremidade N-terminal do referido aminoácido pode ser substituída por um grupo -C(O)R3 no qual R3 é um grupo monocíclico ou policíclico C6-C14 arilalquila; um grupo mono ou policíclico C5-C14 heteroarilalquila que pode compreender um ou mais heteroátomos, que podem ser idênticos ou diferentes; um grupo mono ou policíclico C6-C14 arilalquilóxi ou um grupo mono ou policíclico C5-C14 heteroarilalquilóxi que pode compreender um ou mais heteroátomos, que podem ser idênticos ou diferentes,

- B representa um grupo -C(O)R4, no qual R4 é uma alquila C1-C12 linear ou ramificada, de preferência C1-C6, não-substituído ou substituído por um grupo selecionado de OR, NRR', NHR e SR, como definido acima; um grupo arila, não- substituído ou substituído por um grupo selecionado de OR, NRR', NHR e SR, como definido acima; ou R4 representa OR5, no qual R5 é uma alquila C1-C12 linear ou ramificada, de preferência C1-C6. 3 Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o dito veículo compreende pelo menos um lipídeo que não seja um fosfolipídeo.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que o dito veículo lipídico compreende um óleo ou uma mistura de óleos.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de estar em uma forma adequada para a administração pela via oral.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o composto da fórmula (I) está em solução no dito veículo lipídico.

7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o dito veículo lipídico compreende um óleo vegetal ou uma mistura de óleos vegetais.

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o dito veículo lipídico compreende um óleo vegetal selecionado de óleo de argan, óleo de abacate, óleo de linhaça, óleo de girassol, óleo de palma, óleo de palma de repolho, óleo de coco, óleo de grainha de uva, óleo de mostarda preta, óleo de semente de papoula, óleo de manteiga de carité, óleo de amêndoas doces, óleo de soja, óleo de amendoim, óleo de algodão, óleo de gergelim, azeite de oliva, óleo de milho, óleo de cacau, óleo de mamona, óleo de moringa (ou óleo de Ben), óleo de colza, óleo de anato, óleo de gérmen de trigo, óleo de cártamo, óleo de nozes, óleo de avelã, óleo de nabo silvestre ou suas misturas.

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que este veículo lipídico é óleo de argan.

10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que, na fórmula (I), A representa um grupo -C(O)R1 no qual R1 é um heterociclo saturado compreendendo 5 membros e incluindo 2 átomos de oxigênio, substituído por pelo menos uma alquila C1-C6 linear ou ramificada.

11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que, na fórmula (I), B representa um grupo -C(O)R4 no qual R4 é uma alquila C1-C6 linear ou ramificada, ou R4 representa OR5, no qual R5 é uma alquila C1-C12 linear ou ramificado, de preferência C1-C6.

12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que, na fórmula (I), B representa um grupo acila no qual o grupo alquila é C1-C6 ou um grupo alcoxicarbonila no qual o grupo alquila é C1-C6.

13. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que, na fórmula (I), A representa: - um grupo -(R2)n- no qual R2 é um resíduo de aminoácido e n = 2; ou - um grupo -(R2)n- no qual R2 é um resíduo de aminoácido, n = 2 e a extremidade N-terminal do referido aminoácido é substituída por um grupo arilalcoxicarbonila, em particular benziloxicarbonila; ou - um radical alanílico ligado a um radical glicinílico, opcionalmente substituído em sua extremidade N-terminal por um grupo arilalcoxicarbonila, em particular benziloxicarbonila; ou - um radical metionila ligado a um radical glicinílico, opcionalmente substituído em sua extremidade N-terminal por um grupo arilalcoxicarbonila, em particular benziloxicarbonila, e - B é como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, 5 ou 6.

14. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que o derivado 7 β-hidroxicolesterol é selecionado a partir dos compostos da fórmula (I) na qual: - A é um grupo 3-benziloxicarbonil-glicinil-alanila e B é um grupo tert-

butoxicarbonila, ou - A é um grupo 3-benziloxicarbonil-glicinil-alanil e B é um grupo acetil, ou - A é um grupo -C(O)R1 no qual R1 é um grupo 2,2-dimetil-1,3-dioxolano e B é um grupo tert-butoxicarbonil.

15. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou 14, caracterizada pelo fato de que o derivado 7β-hidroxicolesterol é um composto de fórmula (I) no qual A é um grupo -C(O)R1 no qual R1 é um grupo 2,2-dimetil-1,3- dioxolano e B é um grupo acetila, de fórmula .

16. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que o conteúdo do composto da fórmula (I) é de 0,1 a 3,5% (p/v) do volume total da composição.

17. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que o conteúdo do composto da fórmula (I) é de 1 a 35 mg/ml, de preferência 30 mg/ml.

18. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que o conteúdo do veículo lipídico é de 90 a 99% (v/v) do volume total da composição.

19. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma composição definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.

20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que está em uma forma adequada para administração pela via oral.

21. Método para preparar uma composição definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: - preparar uma mistura contendo o derivado de 7 β-hidroxicolesterol da fórmula (I) definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 10 a 15, um veículo lipídico e um co-solvente, - opcionalmente adicionar um antioxidante e - se aplicável, evaporar o co-solvente.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o veículo lipídico é definido em qualquer uma das reivindicações 3, 4 ou 7 a 9.

23. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de uma patologia neoplásica ou de uma hemopatia maligna.

24. Composição para uso de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a patologia neoplásica é glioblastoma multiforme.

Extrato seco ressolubilizado

Petição 870210002470, de 08/01/2021, pág. 48/52 em 1 ml de sistema eluente hexano: éter 3:7

Sistema Hexano: éter Acetona: Acetona: eluente 3:7 EtOH 95:5 EtOH 93:7

Grupo de frações 1/4

Composto(s) Lipídeos 0 compostos detectado(s)

Extrato evaporado até Extrato evaporado até secura e ressolubilizado secura e ressolubilizado com 0,5 ml de ChCl3 com 0,5 ml de 15% Eluente A + 85% Eluente B

Petição 870210002470, de 08/01/2021, pág. 49/52 Sílica clássica SEP PAK SEP PAK mais C18

Eluente Sistema 15% Eluente A + 85% 100% Eluente B Eluente Eluente B Fração Fração

Composto Lipídeos Restante de lipídeos + 2/4 detectado Composto Restante de lipídeos Traços de lipídeos Traços de BIM2b, 7b - detectado + BIM2b e seus BIM2b e acetil-CH e 7b- metabólitos seus OH-CH metabólitos

A ser combinado, evaporado até secura e ressolubilizado em acetona para análise de HPTLC

Fator de retenção (Rf)

Volume depositado (μl) Quantidade teórica depositada (μg)

(inclusão)