BR112019020985A2

BR112019020985A2 - formulação de inibidor de stat3

Info

Publication number: BR112019020985A2
Application number: BR112019020985A
Authority: BR
Inventors: M White Jonathan; W Lovell Michael; H Shoemaker Robert; Gupta Shanker
Original assignee: Glg Pharma Llc; Mriglobal; Us Health
Priority date: 2017-04-05
Filing date: 2018-04-05
Publication date: 2020-05-05
Also published as: ES2888235T3; JP2020513022A; CA3058973A1; PL3606515T4; AU2018248303A1; EP3606515A1; PE20200611A1; US10913709B2; KR20200043930A; US20200109109A1; CN110944631A; CO2019012386A2; MX2019011913A; PL3606515T3; WO2018187551A1; EP3606515B1; CL2019002843A1

Abstract

a presente divulgação refere-se a um sal preparado a partir do inibidor de stat3 conhecido como ácido 2-hidróxi-4-[[2-[[(4-metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico e ácido 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol. o sal é solúvel em água e estável por longos períodos de tempo. são ainda fornecidas composições farmacêuticas compreendendo o sal e métodos de administração do sal para prevenir e tratar o câncer, tal como o câncer de mama.

Description

“FORMULAÇÃO DE INIBIDOR DE STAT3”

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO [001]Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. No. 62/481.960 depositado em 5 de abril de 2017, que é incorporado para referência na sua totalidade para todos os fins.

DECLARAÇÃO RELATIVA À PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADO PELO GOVERNO FEDERAL [002]Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob o projeto número 110775.05.015.04 (A) pelos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Câncer. O governo tem certos direitos nesta invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [003]O composto ácido 2-hidróxi-4-[[2-[[(4metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico (também conhecido como ácido 2-hidróxi4-(2-(tosilóxi)acetamido)benzóico):

ΌΗ é conhecido na técnica coloquialmente como NSC-74859 e S3I-201 e é um potente inibidor do transdutor de sinal e ativador de atividade de ligação ao DNA da transcrição 3 (STAT3) (IC50 de 86 ± 33 μΜ in vitro). Em particular, o ácido 2-hidróxi-4[[2-[[(4-metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico induz apoptose em células tumorais que expressam STAT3 ativado. Como resultado, o ácido 2-hidróxi-4-[[2-[[(4metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico demonstrou ser eficaz no tratamento de vios cânceres. No entanto, o ácido 2-hidróxi-4-[[2-[[(4metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico é pouco solúvel em água e etanol,

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2/34 portanto, a administração prática de ácido 2-hidróxi-4-[[2-[[(4metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico não é facilmente viável.

[004]Assim, permanece uma necessidade não atendida de formulações melhoradas contendo ácido 2-hidróxi-4-[[2-[[(4metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico como agente ativo para fornecer um método de prevenção ou tratamento de câncer com administração e eficácia melhorada.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO [005]A invenção fornece um novo sal de ácido 2-hidróxi-4-[[2-[[(4metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico, que é prontamente solúvel em água, para fornecer composições farmacêuticas estáveis. Em particular, a invenção fornece um composto da fórmula:

que é designado como Composto 1 neste documento.

[006]A invenção fornece ainda uma composição farmacêutica compreendendo o Composto 1 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[007]Também são fornecidos métodos de tratamento de câncer, incluindo prevenção e tratamento de câncer com uma composição farmacêutica compreendendo o Composto 1.

BREVE DESCRIÇÃO DAS VÁRIAS VISTAS DOS DESENHOS [008]A FIG. 1 é uma série de cromatogramas de cromatografia líquida de

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3/34 alta eficiência (HPLC) que ilustram a estabilidade do ácido 2-hidróxi-4-[[2-[[(4metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico na presença de um LiOH (FIG. 1A), NaOH (FIG. 1B), K2CO3 (FIG. 1C) ou 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (FIG. 1 D) em água. Sob as condições usadas para gerar os dados, 0 ácido 2-hidróxi-4-[[2[[(4-metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico elui em 8,6 minutos.

[009]A FIG. 2 é um esquema de reação que ilustra a degradação do ácido 2hidróxi-4-[[2-[[(4-metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico pela perda do grupo tosilato.

[010]A FIG. 3 é um esquema químico que ilustra uma síntese do Composto 1 em uma modalidade da invenção.

[011]A FIG. 4 é um gráfico de barras que mostra a capacidade de uma solução aquosa do Composto 1 de inibir a expressão de Ki67 em uma glândula mamária normal de camungongos fêmeas com vírus tumoral mamário de camundongo (MMTV) / neu em várias doses (500 mg/kg de peso corporal (PC)/dia, 250 mg/kg de PC/dia ou 125 mg/kg de PC/dia) em comparação com um controle (sem administração) após duas semanas de tratamento.

[012]A FIG. 5 é um gráfico de barras que mostra a capacidade de uma solução aquosa do Composto 1 de inibir a expressão de STAT3 em uma glândula mamária normal de camundongos fêmeas MMTV / neu em várias doses (500 mg/kg de PC/dia, 250 mg/kg de PC/dia, 250 mg/kg de PC/dia, ou 125 mg/kg de PC/dia) em comparação com um controle (sem administração) após duas semanas de tratamento.

[013]A FIG. 6 é um gráfico que demonstra os efeitos de várias doses do Composto 1 no ganho de peso corporal (gramas) ao longo do tempo (dias de idade) de camundongos fêmeas MMTV / neu durante um estudo de quimioprevenção. O Composto 1 foi administrado aos camundongos a partir dos 50 dias de idade até 0 final do estudo (tratamento de 4 meses). As doses administradas foram 500 mg/kg

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BW/dia (·), 250 mg/kg BW/dia () e 125 mg/kg BW/dia (A), em relação ao controle de nenhuma droga administrada (♦).

[014]A FIG. 7 é um gráfico que demonstra os efeitos de várias doses do Composto 1 na aparência do câncer mamário induzido por dimetilbenzantraceno (DMBA) de camundongos fêmeas MMTV/neu ao longo do tempo (dias). O Composto 1 foi administrado aos camundongos a partir dos 50 dias de idade até o final do estudo (tratamento de 4 meses). As doses administradas foram 500 mg/kg BW/dia (·), 250 mg/kg BW/dia () e 125 mg/kg BW/dia (A), em relação ao controle de nenhuma droga administrada (♦).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [015]A invenção fornece um composto da fórmula

OH h₃c

Composto 1.

[016]Composto 1 é um sal de ácido 2-hidróxi-4-[[2-[[(4metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico com 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3propanodiol que foi surpreendentemente descoberto como sendo altamente solúvel em água e capaz de fornecer uma formulação clara com estabilidade melhorada.

[017]Patente U.S. 7.960.434 descreve amplamente sais de ácido 2-hidróxi-4[[2-[[(4-metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico. No entanto, a Patente U.S. 7.960.434 não descreve nem sugere a preparação de um sal a partir de 2-amino-2(hidroximetil)-1,3-propanodiol.

[018]Composto 1 pode ser amorfo, cristalino ou semicristalino. Como usado

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5/34 aqui, o termo cristalino refere-se a um material com uma estrutura ordenada e tem um ponto de fusão acentuado e permanece sólido sob temperatura crescente até o ponto de fusão, momento em que um líquido de baixa viscosidade é formado. O termo amorfo refere-se a um material que possui uma estrutura aleatória (por exemplo, sem matriz de repetição), enquanto semicristalino refere-se a um material que possui uma combinação de ambas as partes cristalina e amorfa. Em certas modalidades, o Composto 1 é cristalino.

[019]Para ser altamente eficaz em um método de tratamento, o Composto 1 deve ser usado da forma mais pura possível. Técnicas de purificação são conhecidas na área e incluem, por exemplo, cristalização, extração, filtração, cromatografia, destilação e sublimação. A pureza do Composto 1 pode ser testada medindo, por exemplo, o ponto de fusão. Tipicamente, Composto 1 é pelo menos 85% puro (por exemplo, pelo menos 90% puro, pelo menos 92% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 96% puro, pelo menos 97% puro, pelo menos 97% puro, pelo menos 98% puro ou pelo menos 99% puro). Em certos aspectos da invenção, o Composto 1 é pelo menos 98% puro.

[020]O composto base, ácido 2-hidróxi-4-[[2-[[(4metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico, pode ser adquirido comercialmente ou preparado utilizando procedimentos químicos de rotina. Vide, por exemplo, a síntese apresentada no Esquema 1 da Patente U.S. 7.960.434, cuja divulgação é incorporada para referência.

[021]2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol está disponível comercialmente e é conhecido como, por exemplo, TRIZMA™ ou base Tris (SigmaAldrich, St. Louis, MO).

[022]Os métodos aqui descritos compreendem a administração do Composto 1 na forma de uma composição farmacêutica. Em particular, uma composição farmacêutica compreende uma quantidade eficaz de Composto 1 e um

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6/34 veículo farmaceuticamente aceitável. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis descritos aqui, por exemplo, veículos, adjuvantes, transportadores ou diluentes, são bem conhecidos dos especialistas na técnica e estão prontamente disponíveis. Tipicamente, o transportador farmaceuticamente aceitável é um quimicamente inerte ao (s) composto (s) ativo (s) e um que não possui efeitos colaterais ou toxicidade prejudiciais nas condições de uso.

[023]As composições farmacêuticas podem ser administradas como formulações orais, sublinguais, transdérmicas, subcutâneas, tópicas, absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos, intravenosa, intranasal, intraarterial, intramuscular, intratumoral, peritumoral, interperitoneal, intratecal, retal, vaginal ou aerossol. Em alguns aspectos, a composição farmacêutica é administrada por via oral ou intravenosa. De preferência, a composição farmacêutica é uma formulação oral.

[024]De acordo com qualquer uma das modalidades, o Composto 1 pode ser administrado por via oral a um objeto em necessidade do mesmo. As formulações adequadas para administração oral podem consistir em (a) soluções líquidas, tal como uma quantidade eficaz do composto dissolvido em diluentes, como água, solução salina ou suco de laranja e podem incluir um aditivo, como ciclodextrina (por exemplo, α-, β- ou γ-ciclodextrina, hidroxipropil ciclodextrina) ou polietileno glicol (por exemplo, PEG400); (b) cápsulas, sachês, comprimidos, pastilhas e trociscos, cada um contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo, como sólidos ou grânulos; (c) pós; (d) suspensões em um líquido apropriado; e (e) emulsões e géis adequados.

[025]Formulações líquidas podem incluir diluentes, tais como água e álcoois, por exemplo, etanol, álcool benzílico e álcoois de polietileno, com ou sem a adição de um surfactante, agente de suspensão ou agente emulsificante farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o transportador farmaceuticamente aceitável

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7/34 compreende etanol, água ou uma combinação de etanol e água. De preferência, o transportador farmaceuticamente aceitável compreende água. Em certos aspectos, a composição farmacêutica é uma solução clara (por exemplo, uma solução aquosa clara).

[026]Formas de cápsulas podem ser do tipo comum de gelatina dura ou macia contendo, por exemplo, surfactantes, lubrificantes e cargas inertes, como lactose, sacarose, fosfato de cálcio e amido de milho. Formas de comprimido podem incluir um ou mais de lactose, sacarose, manitol, amido de milho, amido de batata, ácido algínico, celulose microcristalina, acácia, gelatina, goma guar, dióxido de silício coloidal, croscarmelose de sódio, talco, estearato de magnésio, estearato de cálcio, estearato de zinco, ácido esteárico e outros excipientes, colorantes, diluentes, agentes tamponantes, agentes desintegrantes, agentes umidificantes, conservantes, agentes aromatizantes e transportadores farmacologicamente compatíveis. Formas de losango podem compreender o ingrediente ativo em um sabor, geralmente sacarose e acácia ou tragacanto, bem como pastilhas que compreendem o ingrediente ativo em uma base inerte, como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia, emulsões, géis e semelhantes que contêm, além do ingrediente ativo, os transportadores que são conhecidos na área.

[027]Formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções aquosas e não aquosas de injeção estéril isotônica, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizadores, agentes espessantes, estabilizadores e conservantes. Composto 1 pode ser administrado em um diluente fisiologicamente aceitável em um transportador farmacêutico, como um líquido estéril ou mistura de líquidos, incluindo água, solução salina, dextrose aquosa e soluções de açúcar relacionadas, um álcool (por exemplo, etanol,

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8/34 isopropanol ou álcool hexadecílico), glicóis (por exemplo, propileno glicol ou polietileno glicol), cetais de glicerol (por exemplo, 2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4metanol), éteres (por exemplo, poli(etilenoglicol) 400), um óleo, um graxo ácido, um éster ou glicerídeo de ácido graxo, ou um glicerídeo de ácido graxo acetilado, com ou sem a adição de um surfactante farmaceuticamente aceitável (por exemplo, sabão ou detergente), agente de suspensão (por exemplo, pectina, carbômeros, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose ou carboximetilcelulose) ou agentes emulsificantes e outros adjuvantes farmacêuticos.

[028]Óleos, que podem ser usados em formulações parentéricas incluem petróleo, animais, vegetais ou óleos sintéticos. Exemplos específicos de óleos incluem amendoim, soja, gergelim, semente de algodão, milho, azeitona, petrolato e mineral. Ácidos graxos adequados para uso em formulações parentéricas incluem ácido oleico, ácido esteárico e ácido isoestárico. Oleato de etila e miristato de isopropila são exemplos de ésteres de ácidos graxos adequados. Sabões adequados para uso em formulações parentéricas incluem sais de metais alcalinos gordurosos, amônio e trietanolamina, e detergentes adequados incluem (a) detergentes catiônicos, tais como, por exemplo, halogenetos de dimetil dialquil amônio e halogenetos de alquil piridínio, (b) detergentes aniônicos, tais como, por exemplo, sulfonatos de alquila, arila e olefina, sulfatos de alquila, olefina, éter e monoglicerídeo, e sulfossuccinatos, (c) detergentes não iônicos, tais como, por exemplo, óxidos de amina graxa, alcanolamidas de ácidos graxos,, e copolímeros de polioxietileno-polipropileno, (d) detergentes anfotéricos, tais como, por exemplo, beta-aminopropionatos de alquila, e sais de amônio quaternário de 2-alquilimidazolina e (3) suas misturas.

[029]As formulações parentéricas conterão tipicamente de cerca de 0,5 a cerca de 25% em peso do Composto 1 em solução. Conservantes e tampões adequados podem ser usados em tais formulações. A fim de minimizar ou eliminar a

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9/34 irritação no local da injeção, essas composições podem conter um ou mais surfactantes não iônicos tendo um equlíbrio hidrofílico-lipofílico (HLB) de cerca de 12 a cerca de 17. A quantidade de surfactante nessas formulações varia de cerca de 5 a cerca de 15% em peso. Os surfactantes adequados incluem ésteres de ácidos graxos de polietileno sorbitano, como mono-oleato de sorbitano e os adutos de peso molecular elevado de óxido de etileno com uma base hidrofóbica, formada pela condensação de óxido de propileno com propileno glicol. As formulações parenterais podem ser apresentadas em recipientes selados para doses unitárias ou multidose, como ampolas e frascos, e podem ser armazenados em uma condição seca por congelamento (liofilizada), exigindo apenas a adição do transportador líquido estéril (por exemplo, água) para injeções, imediatamente antes do uso. Soluções e suspensões extemporâneas de injeção podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis do tipo descrito anteriormente.

[030]0s requisitos para transportadores farmacêuticos eficazes para composições injetáveis são bem conhecidos dos versados na área. Vide Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Co., Filadélfia, Pa., Banker and Chalmers, eds., Páginas 238-250 (1982), e ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4^a ed., Páginas 622-630 (1986).

[031]Composições aplicadas topicamente são geralmente na forma de líquidos (por exemplo, enxaguatório bucal), cremes, pastas, loções e géis. Administração tópica inclui a aplicação na mucosa oral, que inclui a cavidade oral, epitélio oral, palato, mucosa gengival e nasal. O veículo pode ser um líquido, sólido ou semissólido. Nas modalidades, a composição é uma solução aquosa, tal como um enxaguatório bucal. Alternativamente, a composição pode ser um veículo de dispersão, emulsão, gel, loção ou creme para os vários componentes. Em uma modalidade, o veículo primário é a água ou um solvente biocompatível que é substancialmente neutro ou que foi tornado substancialmente neutro. O veículo

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10/34 líquido pode incluir outros materiais, tais como um anti-irritante, tampões, álcoois, glicerina e óleos minerais com vários emulsificantes ou agentes dispersantes como conhecido na área, para obter o pH, consistência e viscosidade desejados. É possível que a composição possa ser produzida como um sólido, tal como um pó ou grânulos. Os sólidos podem ser aplicados diretamente ou dissolvidos em água ou em um solvente biocompatível antes do uso para formar uma solução que é substancialmente neutra (por exemplo, cerca de pH 7) ou que foi tornada substancialmente neutra e que pode ser aplicada no local de destino. Nas modalidades da invenção, o veículo para aplicação tópica na pele pode incluir água, soluções tamponadas, vários álcoois, glicóis como glicerina, materiais lipídicos como ácidos graxos, óleos minerais, fosfoglicerídeos, colágeno, gelatina e materiais à base de silicone.

[032]Em uma modalidade, a solubilidade do Composto 1 na composição farmacêutica (por exemplo, solução aquosa), incluindo o transportador e quaisquer outros excipientes presentes, é de pelo menos 5 mg/mL, pelo menos 10 mg/mL, pelo menos 20 mg/mL, pelo menos 30 mg/mL, pelo menos 40 mg/mL ou pelo menos 50 mg/mL. Em particular, a solubilidade será de cerca de 40 mg/mL, cerca de 45 mg/mL, cerca de 50 mg/mL, cerca de 55 mg/mL, cerca de 60 mg/mL ou cerca de 65 mg/mL.

[033]Uma composição farmacêutica compreendendo o Composto 1, tal como uma solução aquosa compreendendo o Composto 1, é tipicamente estável (por exemplo, à temperatura ambiente e/ou a uma temperatura inferior à temperatura ambiente) por pelo menos 1 hora (por exemplo, pelo menos 2 horas, pelo menos 3 horas, pelo menos 4 horas, pelo menos 5 horas, pelo menos 6 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 18 horas, pelo menos 24 horas, pelo menos 36 horas, pelo menos 2 dias, pelo menos 2,5 dias, pelo menos 3 dias, pelo menos 3,5 dias, pelo menos 4 dias, pelo menos 4,5 dias, pelo menos 5 dias, pelo menos 5,5

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11/34 dias, pelo menos 6 dias, pelo menos 6,5 dias ou pelo menos 7 dias (1 semana)).

[034]Para ajudar a aumentar a estabilidade a longo prazo, a composição farmacêutica pode, se desejado, ser armazenada a uma temperatura inferior à temperatura ambiente, incluindo armazenar a composição a 20 ^QC ou menos, 15 ^QC ou menos, 12 ^QC ou menos, 10 ^QC ou menos, 8 ^QC ou menos, 5 ^QC ou menos, 2 ^QC ou menos ou 0 ^QC ou menos. O limite inferior da temperatura pode ser, por exemplo, -40 ^QC ou mais, -30 ^QC ou mais, -20 ^QC ou mais, -10 ^QC ou mais, ou 0 ^QC ou mais. Quaisquer dois dos endpoints anteriores podem ser usados para definir um intervalo próximo, ou podem ser usados individualmente para definir um intervalo final. Em certos aspectos da invenção, a composição farmacêutica é uma solução clara que compreende água como transportador. De preferência, tal composição é armazenada a uma temperatura inferior à temperatura ambiente (por exemplo, -30 ^QC a 0 ^QC, cerca de 0 ^QC ou cerca de -20 ^QC).

[035]A composição farmacêutica pode ter qualquer pH adequado para uma formulação e/ou tratamento desejado. Tipicamente, a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 7, tal como um pH de cerca de 6-8 (por exemplo, entre 6,0 a 8,0, entre 6,5 a 7,5, entre 6,6 a 7,4 e entre 6,7 a 7,3).

[036]A dose administrada ao objeto (por exemplo, um mamífero, como um humano) de acordo com a presente invenção deve ser suficiente para afetar a resposta desejada. Um especialista na área reconhecerá que a dosagem dependerá de uma variedade de fatores, incluindo idade, condição ou estado da doença, predisposição para a doença, defeito genético ou defeitos, e peso corporal do objeto. O tamanho da dose também será determinado pela via, tempo e frequência da administração, bem como a existência, natureza e extensão de quaisquer efeitos colaterais adversos que possam acompanhar a administração do Composto 1 e o efeito desejado. Será apreciado por um especialista na área que várias condições ou estados de doença podem requerer tratamento prolongado envolver múltiplas

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12/34 administrações.

[037]Os métodos inventivos compreendem a administração de uma quantidade eficaz de Composto 1. Uma quantidade eficaz significa uma quantidade suficiente para mostrar um benefício significativo em um objeto, por exemplo, promovendo pelo menos um aspecto da citotoxicidade das células tumorais (por exemplo, inibição do crescimento, diminuição da proliferação celular, inibição de sobrevivência de uma célula cancerosa, indução de apoptose, redução de proliferação, redução de tamanho e/ou massa de um tumor (por exemplo, tumor sólido)) ou tratamento, cura, prevenção, retardo do início, redução do risco, interrupção ou melhoria de outras condições médicas relevantes associadas a um câncer em particular. O benefício significativo observado no objeto pode ser em qualquer grau adequado (10% ou mais, 20% ou mais, 30% ou mais, 40% ou mais, 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80 % ou mais, 90% ou mais ou 95% ou mais). Em alguns aspectos, um ou mais sintomas do câncer são prevenidos, reduzidos, retardados, interrompidos e/ou eliminados após a administração do Composto 1, desse modo, efetivamente prevenindo e/ou tratando o câncer em pelo menos algum grau. Em uma modalidade particular, o crescimento de células cancerígenas é prevenido, o aparecimento de células cancerígenas é retardado, o número de células cancerígenas é reduzido e/ou as células cancerígenas são encolhidas e/ou mortas após a administração do Composto 1 a um objeto.

[038]As quantidades efetivas podem variar dependendo do efeito biológico desejado no objeto e condição a ser tratada. A este respeito, qualquer dose adequada do Composto 1 pode ser administrada ao objeto (por exemplo, humano), de acordo com o tipo de câncer a ser tratado. Várias considerações gerais levadas em consideração na determinação da “quantidade efetiva” são conhecidas dos especialistas na técnica e são descritas, por exemplo, em Gilman et al., Eds., Goodman e Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8^â ed.,

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Pergamon Press, 1990; e Remington's Pharmaceutical Sciences, 17^â Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, cada um dos quais é aqui incorporado por referência. A dose do Composto 1 desejavelmente varia de cerca de 0,1 mg por quilograma (kg) do peso corporal do mamífero (mg/kg) (por exemplo, de cerca de 0,5 mg/kg, de cerca de 0,75 mg/kg, de cerca de, cerca de 1 mg/kg, de cerca de 2 mg/kg, de cerca de 3 mg/kg, de cerca de 5 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg, de cerca de 20 mg/kg, de cerca de 20 mg/kg, de cerca de 30 mg/kg, de cerca de 40 mg/kg, de cerca de 50 mg/kg, de cerca de 60 mg/kg, de cerca de 75 mg/kg, de cerca de 90 mg/kg, de cerca de 100 mg/kg, de cerca de 100 mg/kg, de cerca de 125 mg/kg, de cerca de 150 mg/kg, de cerca de 175 mg/kg, de cerca de 200 mg/kg, de cerca de 225 mg/kg, de cerca de 250 mg/kg, de cerca de 275 mg/kg, de cerca de 275 mg/kg, de cerca de 300 mg/kg, de cerca de 325 mg/kg, de cerca de 350 mg/kg, de cerca de 375 mg/kg, de cerca de 400 mg/kg) a cerca de 800 mg/kg (por exemplo, a cerca de 425 mg/kg, a cerca de 450 mg/kg, a cerca de 475 mg/kg, a cerca de 500 mg/kg, a cerca de 525 mg/kg, a cerca de 550 mg/kg, a cerca de 575 mg/kg, a cerca de 600 mg/kg, a cerca de 600 mg/kg, a cerca de 625 mg/kg, a cerca de 625 mg/kg, a cerca de 650 mg/kg, a cerca de 675 mg/kg, a cerca de 700 mg/kg, a cerca de 725 mg/kg, a cerca de 750 mg/kg ou a cerca de 775 mg/kg). Quaisquer dois dos endpoints anteriores podem ser usados para definir um intervalo próximo ou podem ser usados individualmente para definir um intervalo final. Por exemplo, a dose do Composto 1 desejavelmente varia de cerca de 100 mg/kg/dia a cerca de 600 mg/kg/dia, de cerca de 125 mg/kg/dia a cerca de 500 mg/kg/dia, de cerca de 200 mg/kg/dia a cerca de 550 mg/kg/dia, de cerca de 250 mg/kg/dia a cerca de 500 mg/kg/dia, cerca de 250 mg/kg/dia ou cerca de 500 mg/kg/dia.

[039]A atividade constitutiva de STAT3 é um marcador para muitos tipos de câncer e outras doenças, como nefropatia diabética, resistência à insulina do músculo esquelético em diabetes tipo 2, endometriose, depressão, asma, colite,

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14/34 fibrose renal, doença inflamatória intestinal, lúpus eritematoso sistêmico (LES), doença de Alzheimer, doença de Huntington e autismo. Vide, por exemplo, Gkouveris et al., Journal of Cancer Therapy, 2015; 6: 709-726, WO 2012/159107 e WO 2010/062681. No que diz respeito às células cancerígenas, acredita-se que STAT3 aberrante promova a invasão e metástase de células tumorais. Vide, por exemplo, Yue et al., Expert Opinion Investig Drugs, 2009; 18 (1): 45-56. Assim, em alguns aspectos da invenção, o Composto 1 inibe e/ou reduz a atividade de STAT3 em uma célula, tal como uma célula cancerígena.

[040]A inibição de STAT3 foi descrita na técnica como um tratamento viável do câncer, tipicamente através da prevenção da fosforilação / ativação de STAT3, inibição da ligação ao DNA, ou inibição de formação de dímero STAT3. Foi demonstrado que a supressão da atividade de STAT3 induz apoptose em células cancerígenas. Vide, por exemplo, Gkouveris et al., Journal of Cancer Therapy, 2015; 6: 709-726. Assim, Composto 1 pode ser administrado a um objeto em necessidade do mesmo como parte de um método de tratamento para câncer. Em particular, a invenção fornece um método para prevenir o câncer (por exemplo, câncer de mama) em um objeto que compreende administrar ao objeto uma quantidade eficaz de Composto 1. Nesse método, normalmente há um retardo no aparecimento de câncer ou células cancerígenas não se formam, particularmente em um objeto em risco de um câncer em particular. Além disso, é fornecido um método de tratamento de câncer (por exemplo, câncer de mama) em um objeto que compreende administrar ao objeto uma quantidade eficaz de Composto 1. Nesse método, as células cancerígenas são mortas, encolhidas, inibidas e/ou reduzidas em número.

[041 ]O tipo de câncer a ser tratado ou prevenido não é particularmente limitado, mas em certos aspectos, o câncer é caracterizado por ter atividade de STAT3 aumentada e/ou expressão de Ki67 aumentada em relação ao tecido normal do mesmo tipo. Vide, por exemplo, Garcia et al., Cell Growth Differ, 1997; 8 (12):

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1267-1276; Watson et al., BrJ. Cancer, 1995; 71 (4): 840-844; Huang et al., Gynecol Oncol, 2000; 79 (1): 67-73; Dhir et al., Prostate, 2002; 51 (4): 241-246; Mora et al., Cancer Res, 2002; 62 (22): 6659-6666; Corvinus et al., Neoplasia, 2005; 7 (6): 545555; Guo et al., Am J Transl Res, 2009; 1 (3): 283-290; Schaefer et al., Oncogene, 2002; 21 (13): 2058-2065; e Wei et al., Oncogene, 2003; 22 (3): 319-329. Por exemplo, STAT3 é constitutivamente ativo em mais de 40% de todos os cânceres de mama, particularmente nos cânceres de mama triplo-negativos, que não têm a expressão do receptor de estrogênio (ER), receptor de progesterone (PR), e receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2/Neu) (Banerjee et al., Int J Cancer, 2016; 138 (11): 2570-2578). Demonstrou-se também que STAT3 ativado induz a biossíntese de estrogênio e a subsequente proliferação de células epiteliais da mama ER-positivas (Ishii et al., Cancer Res, 2008; 68 (3): 852-860), e acredita-se que desempenhe um papel importante na manutenção de células de câncer de mama semelhantes a células-tronco promotoras de recorrência de tumor e na conversão de uma população de células-tronco não cancerosas em célulastronco semelhantes a células-tronco de câncer de mama (Marotta et al., J Clin Invest, 2011; 121 (7): 2723-2735). Assim, o presente inibidor de STAT3 oferece uma vantagem única sobre os agentes preventivos de câncer de mama aprovados pela FDA, tamoxifeno e raloxifeno, pois o inibidor de STAT3 pode potencialmente impedir vários subtipos de câncer de mama. Além disso, devido o Composto 1 como inibidor de STAT3 possuir um mecanismo de ação distinto dos moduladores seletivos de receptores de estrogênio (SERMs) tamoxifeno e raloxifeno, tais inibidores também podem ser particularmente úteis contra cânceres de mama ER-positivos que desenvolveram resistência a essas drogas.

[042]Exemplos de cânceres tratáveis com os métodos inventivos incluem cânceres de cabeça e pescoço, olhos, pele, boca, garganta, esôfago, peito, osso, pulmão, cólon, sigmóide, reto, estômago, próstata, mama, ovários, rim, fígado,

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16/34 pâncreas, cérebro, intestino, coração ou suprarrenais. Mais particularmente, os cânceres incluem tumor sólido, sarcoma, carcinoma, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogênico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendotelio sarcoma, carcinoma, tumores do estômago, mesotelioma câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, carcinoma de glândula sudorípara, carcinoma de glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, carcinoma de células renais, carcinoma de células renais carcinoma, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, câncer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmão, carcinoma de pulmão de pequenas células, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, sarcinoma de Kaposi neuroma acústico, oligo dendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, urn tumor transmitido pelo sangue, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica aguda de células B, leucemia linfoblástica aguda de células T, leucemia mieloblástica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia aguda promielocítica, leucemia monoblástica aguda, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia acutenonimifocítica, leucemia indiferenciada aguda, leucemia mielocítica crônica, leucemia linfocítica crônica, leucemia de células ciliadas ou mieloma múltiplo. Vide, por exemplo, Harrison’s Principles of Internal Medicine, Eugene Braunwald et al., eds., pp. 491 762 (15^a ed. 2001 ).Em alguns aspectos, o câncer é um tumor sólido.

[043]De acordo com uma modalidade, o câncer a ser tratado e/ou prevenido é selecionado a partir de leucemia, mieloma múltiplo, câncer pancreático, câncer renal, câncer cerebral, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer colorretal, cancer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário e

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17/34 câncer de próstata. Em outra modalidade, o câncer é câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer colorretal, câncer renal, câncer cerebral ou câncer de pâncreas. Em ainda outra modalidade, o câncer é o câncer de pâncreas, câncer de fígado ou câncer de mama. De preferência, o câncer a ser tratado e/ou prevenido é o câncer de mama.

[044]O objeto a ser tratado precisa de tratamento e tem câncer, corre risco para câncer e/ou é suspeito de ter câncer. Um objeto pode estar em risco para câncer com base em uma variedade de fatores, incluindo idade, predisposição genética (por exemplo, histórico familiar de câncer e/ou resultado de um teste de rastreamento genético), exposição à radiação, exposição à fumaça, inalação de particulados, consumo de mutagênicos e/ou dieta. Um objeto com pelo menos um parente de primeiro grau (isto é, pai, irmão e/ou filho) diagnosticado com um câncer em particular pode sugerir que o objeto tenha um risco maior que a média para esse câncer. Dois parentes de primeiro grau diagnosticados com um câncer em particular aumentam ainda mais o risco. Os objetos podem ser rastreados e/ou diagnosticados para vários tipos de câncer, incluindo autoexame, exame clínico, mamografia, exame de Papanicolau, ultrassom, tomossíntese digital da mama, biópsia, ressonância magnética (MRI), raio-x, colonoscopia, teste sanguíneo, teste de urina, exame retal e tomografia computadorizada de baixa dose (LDCT). Em um exemplo particular e, um objeto encontrado com uma mutação no gene tipo 1 de câncer de mama (BRCA1) e/ou no gene HER2 e/ou uma alta expressão de um ou mais biomarcadores de câncer conhecidos (por exemplo, Ki67, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, antígeno específico de próstata (PSA), CA-125) normalmente seria reconhecido como um objeto com risco de câncer (por exemplo, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de ovário) ou com suspeita de câncer. Em um exemplo particular, um objeto pode ser rastreado quanto à taxa de crescimento celular (por exemplo, a proporção de células cancerígenas dentro de um tumor que está

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18/34 crescendo e se dividindo para formar novas células cancerígenas). Os níveis de Ki67 podem ser medidos e, quanto maior a porcentagem de Ki67, mais rapidamente as células cancerígenas crescerão. Outros possíveis marcadores tumorais que podem ser testados em uma amostra de sangue, tecido, urina ou medula sanguínea de um objeto incluem, por exemplo, AFP, rearranjos de genes ALK, rearranjo de genes de imunoglobulina de células B, B2M (beta 2-microglobulina), BCR -ABL, CA 15-3, Ca-19-9, calcitonina, CEA (antígeno carcino-embrionário), cromogranina A (CgA), DCP (des-gama-carbóxi, protrombina), mutação EGFR, fibrina, fibrinogênio, gastrina, hCG (gonadotrofina coriônica humana), mutação JAK2, mutação KRAS, LD (lactato desidrogenase), imunoglobulinas monoclonais, SMRP (peptídeos solúveis relacionados à mesotelina), rearranjo gênico do receptor de células T, tireoglobulina, assinatura de 21 genes e assinatura de 70 genes.

[045]As diretrizes de triagem para avaliar o risco de um objeto para certos tipos de câncer variam de acordo com o câncer. Por exemplo, a triagem do câncer de mama é recomendada para (i) objetos considerados com risco médio acima de 45 anos e (ii) testando pelo menos anualmente, principalmente aos 30 anos, para objetos considerados com risco acima da média (por exemplo, pelo menos um dos pais, irmão ou criança com câncer de mama, com teste positivo para mutação nos genes BRCA1, BRCA2, HER2 e/ou CHEK2 e/ou histórico de radiação torácica entre 10 e 30 anos). O rastreamento do câncer colorretal é recomendado para objetos com risco médio acima de 50 anos, mas o teste pode ser mais precoce para objetos avaliados com maior risco se um parente de primeiro grau tiver tido pólipos colorretais ou câncer, um objeto tiver uma doença inflamatória intestinal (por exemplo, doença de Crohn ou oolite ulcerosa) e/ou se um objeto tiver uma síndrome genética, como polipose adenomatosa familiar (FAP) ou câncer colorretal hereditário não polipose (síndrome de Lynch). Os objetos podem estar em risco de câncer de pulmão se o objeto tiver um histórico de tabagismo intenso, atualmente fuma ou

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19/34 parou de fumar nos últimos 15 anos e tiver entre 55 e 80 anos. Objetos do sexo masculino podem estar em risco de câncer de próstata se o objeto for afroamericano, tiver um parente de primeiro grau diagnosticado com câncer de próstata antes dos 60 anos e/ou um parente de primeiro grau que morreu de câncer de próstata antes dos 75 anos.

[046]Em certas modalidades dos métodos aqui descritos, o Composto 1 pode ser coadministrado com um ou mais (por exemplo, 2, 3 ou mais) agentes anticâncer adicionais (por exemplo, um agente quimioterapêutico) e/ou terapia de radiação. Os termos coadministrado ou coadministração se referem à administração simultânea ou sequencial. Um composto pode ser administrado antes, simultaneamente com ou após a administração de outro composto.

[047]Exemplos de agentes anticâncer incluem compostos de platina (por exemplo, cisplatina, carboplatina, oxaliplatina), agentes alquilantes (por exemplo, ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucil, mostarda nitrogenada, tiotepa, melfalano, bussulfano, procarbazina, estreptozocina, temozolomida, dacarbazina, bendamustina), antibióticos antitumorais (por exemplo, daunorrubicina, doxorrubicina, idarubicina, epirrubicina, mitoxantrona, bleomicina, mitomicina C, plicamicina, dactinomicina), taxanos (por exemplo, paclitaxel e docetaxel), antimetabolitos, fluorimetabina, floxuridina, capecitabina e metotrexato), análogos de nucleosídeos (por exemplo, fludarabina, clofarabina, cladribina, pentostatina, nelarabina), inibidores da topoisomerase (por exemplo, topotecano e irinotecano), agentes hipometilantes (por exemplo, azacitidina e decitabina), inibidores de proteossoma (por exmeplo, bortezomib), epipodofilotoxinas (por exemplo, etoposídeo e teniposídeo), inibidores da síntese de DNA (por exemplo, hidroxiureia), alcalóides da vinca (por exemplo, vicristina, vindesina, vinorelbina e vinblastina), inibidores da tirosina quinase (por exemplo, imatinib, dasatinib, nilotinib, sorafenib, sunitinib), anticorpos monoclonais (por exemplo, rituximab, cetuximab,

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20/34 panetumumab, tositumomab, trastuzumab, alemtuzumab, benztazumab, alemtuzumab) por exemplo, carmustina, fotemustina e lomustina), enzimas (por exemplo, L-asparaginase), agentes biológicos (por exemplo, interferons e interleucinas), hexametilmelamina, mitotano, inibidores de angiogênese (por exemplo, talidomida, lenalidomida), esteróides (por exemplo, prednisona, dexametasona e prednisolona), agentes hormonais (por exemplo, tamoxifeno, raloxifeno, leuprolida, bicaluatmida, granisetron, flutamida), inibidores de aromatase (por exemplo, letrozol e anastrozol), trióxido de arsênico, tretinoína, inibidores não seletivos da ciclo-oxigenase (por exemplo, agentes anti-inflamatórios não esteróides, salicilatos, aspirina, piroxicam, ibuprofeno, indometacina, naprosina, diclofenaco, tolmetina, tolprina, cetoprofeno, oxabetona, cetoprofeno, oxabenzona), inibidores de ciclo-oxigenase-2 (COX-2) seletivos, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades preferidas, uma composição farmacêutica compreende um transportador farmaceuticamente aceitável, o Composto 1, e tamoxifen, raloxifeno, ou ambos tamoxifen e raloxifeno.

[048]Para os fins da presente invenção, o termo objeto é tipicamente direcionado a um mamífero. Os mamíferos incluem, entre outros, a ordem Rodentia, tal como camundongos, e a ordem Logomorpha, tal como coelhos. Em alguns aspectos, os mamíferos são da ordem Carnivora, incluindo felinos (gatos) e caninos (cães), Artiodactyla, incluindo bovinos (vacas) e suínos (porcos) ou da ordem Perssodactyla, incluindo equídeos (cavalos). Em alguns aspectos, os mamíferos são da ordem dos primatas, ceboides ou simióides (macacos) ou da ordem dos antropóides (humanos e macacos). Nas modalidades da invenção, o objeto a ser tratado é um humano. O objeto pode ser macho ou fêmea e, em alguns aspectos da invenção, o objeto é fêmea.

[049]Os exemplos a seguir ilustram ainda mais a invenção, mas, é claro, não devem ser interpretados como limitantes de seu escopo.

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EXEMPLO 1 [050]Este exemplo demonstra a estabilidade do ácido 2-hidróxi-4-[[2-[[(4metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico na presença de várias bases.

[051]Estudos de cromatografia líquida por espectrometria de massa (LC-MS) foram realizados, nos quais 1,1 equivalente molar de uma variedade de bases, incluindo LiOH, NaOH, K2CO3, NaHCOa e 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (TRIZMA™, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi pesado, dissolvido em água e adicionado a ácido 2-hidróxi-4-[[2-[[(4-metilfenil)sulfonil]óxi]acetil] amino]benzóico. As misturas resultantes foram examinadas quanto à solubilidade e estabilidade, com os resultados analisados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção por UV e espectroscopia de massa.

[052]Para todas as bases examinadas, 0 ácido 2-hidróxi-4-[[2-[[(4metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico exibiu boa solubilidade aquosa; no entanto, nem todo sal era estável (FIGS 1A-1D). Como visto nos dados do espectro de massa, 0 degradante primário foi a perda do grupo tosilato (FIG. 2). A degradação foi muito mais pronunciada em bases mais fortes, como 0 hidróxido de sódio. Foi determinado que 0 TRIZMA™, uma base mais fraca e mais prejudicada, proporcionava excelente solubilidade (cerca de 60 mg/mL de solubilidade em água com pH 7), e 0 produto permaneceu estável durante a análise inicial (até ~ 8 horas em água à temperatura ambiente)

EXEMPLO 2 [053]Este exemplo demonstra uma síntese do Composto 1 em uma modalidade da invenção.

[054]Ácido 2-hidróxi-4-[[2-[[(4-metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico (1,52 g, GLG-Pharma, Jupiter, FL, lote AL650-78-4) foi dissolvido em 11 mL de isopropanol e 18 mLde tetra-hidrofurano (THF). Em um recipiente separado, 506 mg de 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (TRIZMA™, Sigma-Aldrich, St. Louis,

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MO, lote SLBK9274V) foram dissolvidos em 1,0 mL de água destilada. As duas misturas foram combinadas, misturadas por 30 minutos, filtradas através de um filtro de membrana de náilon de 0,2 μιτι e depois destiladas a vácuo sob calor. A destilação continuou até que aproximadamente metade do volume permanecesse, por exemplo, cerca de 15 mL. Isopropanol (15 mL) foi adicionado e a destilação continuou até a metade do volume permanecer, após o que foram adicionados 15 mL de acetato de etila e a destilação da mistura ternária continuou. Após a remoção de metade do destilado, a adição de acetato de etila foi repetida mais duas vezes, com a destilação final reduzindo o volume para ~ 5 mL para dar um óleo claro. Em seguida, foram adicionados 5 mL de isopropanol para dar uma solução clara; 25 mL de acetato de etila foram em seguida adicionados por adição gota a gota resultando na precipitação de um sólido branco. O produto sólido foi recolhido por filtração e o bolo do filtro foi lavado com 10 mL de acetato de etila. O produto isolado foi seco sob vácuo para fornecer 1,4 g (rendimento de 69%) de um material higroscópico.

[055]A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi realizada usando um Cromatógrafo Líquido LC-2010CHT (Shimadzu, Columbia, MD) equipado com um detector interno de ultravioleta (UV). A detecção foi a 261 nm. A espectrometria de massa foi conduzida com um espectrômetro de massa quadrupolo triplo API-4000 ™ (Sciex, Framingham, MA) acoplado ao Shimadzu-LC. Os resultados foram adquiridos e processados com o software ANALYST ™, versão 1.5.1 (Sciex, Framingham, MA). A separação por HPLC foi realizada usando uma coluna XSELECT ™ HSS T3 C18, 75 χ 3,0 mm, 3,5 μιτι (Waters Corporation, Milford, MA), com uma temperatura de coluna a 40 ^QC. A fase móvel consistiu em (A) ácido fórmico a 0,1% em água (classe LC-MS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e (B) ácido fórmico a 0,1% em acetonitrila (classe LC-MS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). O programa de eluição por HPLC consistiu na seguinte rampa de gradiente - 30% B por 5 minutos, rampa linear para 90% B durante 20 minutos, mantida em 90% B por

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23/34 minutos. Isto foi realizado a 0,5 ml/min ao longo de 30 minutos no total, com um período de reequilíbrio de 5 minutos de 30% B antes da próxima injeção. As amostras foram injetadas a uma concentração de 0,5 mg/mL com um volume de injeção de 5 μΙ_. A linearidade foi estabelecida através de uma curva de calibração padrão nas concentrações de 0,5, 0,25, 0,1 e 0,05 mg/mL; r² = 0,9997. Os parâmetros do espectrômetro de massa foram mostrados na Tabela 1.

Tabela 1

Tipo de varredura	Q1 MS
Polaridade	Positivo
Fonte de íon	ESl-Turbo Spray
Início/Parada (Da)	100.0/600.0, Tempo = 0.50 s
CUR	40.0
GS1	40.0
GS2	40.0
IS	2500.00
TEM	500.0
lhe	ON
DP	20
EP	10

[056]Como alternativa, HPLC foi realizada usando um cromatógrafo líquido Agilent 1100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) equipado com um detector ultravioleta interno (UV). A detecção foi a 261 nm. Os resultados foram adquiridos e processados com o sistema de dados Agilent ChemStation (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). A separação por HPLC foi realizada usando uma coluna XBridge C18, 150 x 4,6 mm, 3,5 μιτι (Waters Corporation, Milford, MA), com uma temperatura de coluna à temperatura ambiente. A fase móvel consistiu em (A) ácido fórmico a

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0,1% em água (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e (B) ácido fórmico a 0,1% em acetonitrila (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). O programa de eluição por HPLC consistiu na seguinte rampa de gradiente - 20% B por 5 min, rampa linear para 90% B durante 20 min, mantida em 90% B por 5 min. Isto foi realizado a 0,75 ml/min ao longo de 30 minutos no total, com um período de reequilíbrio de 5 minutos de 20% B antes da próxima injeção. As amostras foram injetadas a uma concentração de 0,5 mg/mL com um volume de injeção de 5 pL.

EXEMPLO 3 [057]Este exemplo demonstra uma síntese do Composto 1 em uma modalidade da invenção.

[058]Uma solução de ácido 2-hidróxi-4-[[2-[[(4metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico (10 mmol) foi dissolvida em THF/EtOH (1:1) (250 mL), e a solução resultante foi resfriada a 0 ^QC em banho de gelo. Depois que a solução foi resfriada, foi adicionado o 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (TRIZMA ™, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (10 mmol) (10 mmol) e a mistura foi agitada por 90 minutos a 0 ^QC. Após a conclusão, o solvente foi removido com cuidado para manter a mistura à temperatura ambiente ou abaixo dela. O resíduo resultante foi triturado com pentanos e colocado sob alto vácuo a 0 ^QC por 2 horas e depois foi preenchido com árgon. O sólido branco resultante (rendimento quantitativo) foi armazenado no congelador (20 ^QC) até estar pronto para uso.

EXEMPLO 4 [059]Este exemplo demonstra um estudo farmacocinético (PK) de uma formulação compreendendo o Composto 1 em uma modalidade da invenção.

[060]O Composto 1 (750 mg) foi dissolvido em 10 mL de água estéril (75 mg/mL). A solução resultante foi filtrada através de um filtro de seringa de 0,2 pm para fornecer uma solução transparente e incolor. Esta solução foi então analisada quanto à concentração real por HPLC contra um padrão. Uma vez determinada a

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25/34 concentração, a solução foi diluída adequadamente para obter uma solução de 50 mg/mL. A formulação foi adequada para uso imediato ou para armazenamento posterior a -20 ^QC.

[061]Para fins comparativos, uma suspensão de ácido 2-hidróxi-4-[[2-[[(4metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico em carboximetilcelulose (CMC) foi preparada como se segue. Uma solução a 0,5% de CMC foi preparada usando água filtrada. Uma suspensão de 50 mg/mL foi preparada tomando 500 mg de ácido 2hidróxi-4-[[2-[[(4-metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico em 10 mL da solução de CMC a 0,5%. O pH foi ajustado para 6,0-6,5. A solução é adequada para uso imediato ou posterior, armazenando em temperatura ambiente por até 24 horas.

[062]Setenta camundongos FVB-N fêmeas, de 8 a 9 semanas de idade e 20 a 30 g, dos Laboratórios Charles River (Wilmington, MA) foram adquiridos. Quarenta e oito foram dosados por gavagem oral (PO) com um dos três níveis de dose do Composto 1 ou do ácido 2-hidróxi-4-[[2-[[(4metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico misturado com carboximetilcelulose (CMC), oito foram doseados por via intravenosa (IV) com um nível de dose do Composto 1, e um foi dosado por IV com placebo (vide Tabela 2). Dois camundongos (um no grupo A e um no grupo D) foram mal administrados, de modo que outros dois camundongos foram usados nos extras para substituí-los.

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Tabela 2

Estudo PTKS	Grupo de Dose	#Animais / dose	Animais Totais
IV - 50 mg/kg	A	8	8
IV Placebo - 0 mg/kg	B	1	1
Composto 1
PO 500 mg/kg	C	8	8
PO 250 mg/kg	D	8	8
PO 125 mg/kg	E	8	8
Formulação CMC
PO 500 mg/kg	F	8	8
PO 250 mg/kg	G	8	8
PO 125 mg/kg	H	8	8
Total	57

^a Pontos no tempo: 5, 10, 15, 30, 60, 90, 180 e 1440 min.

[063]Um esquema de dosagem foi estabelecido como segue, no entanto, a quantidade de dosagem real foi baseada no peso medido do camundongo antes do estudo. As soluções foram preparadas diretamente antes da dosagem; quaisquer materiais não utilizados foram armazenados congelados.

• Para dose de 125 mg/kg - 0,06 mL fornecerá 125 mg/kg para um camundongo de 25 g

- 125 mg/kg * 0,025 kg camundongo = 3,125 mg; 3,125 mg -? 50 mg/mL = 0,06 mL • Para dose de 250 mg/kg - 0,125 mL fornecerá 250 mg/kg para um camundongo de 25 g

- 250 mg/kg * 0,025 kg camundongo = 6,25 mg; 6,25 mg -? 50 mg/mL = 0,125 mL

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27/34 • Para dose de 500 mg/kg - 0,25 mL fornecerá 500 mg/kg para urn camundongo de 25 g

- 500 mg/kg * 0,025 kg camundongo = 12,5 mg; 12,5 mg -? 50 mg/mL = 0,250 mL [064]Os camundongos foram pesados dentro de 72 horas após ο recebimento e novamente no Dia do Estudo -1. Os camundongos foram observados uma vez por dia antes do dia 0, e pelo menos duas vezes por dia, começando no dia 0, durante 24 horas após a dose, quanto à morbidade e moribundidade. Nenhum dos camundongos do grupo A-H demonstrou sinais de toxicidade pós-dose; não houve mortalidade devido à administração oral ou IV do Composto 1 ou à formulação CMC aos camundongos em qualquer uma das doses administradas.

[065]Amostras de sangue foram obtidas de camundongos individuais em oito (8) momentos após a administração da dose: 5, 10, 15, 30, 60, 90, 180 e 1440 minutos após a dose usando um grupo de camundongo / ponto de tempo / dose como mostrado acima na Tabela 2. Os animais foram exsanguinados e as amostras de sangue coletadas foram resfriadas por pelo menos 3 minutos, mas não por mais de 30 minutos, antes da centrifugação para obter plasma para análise. Cada animal foi anestesiado via CO2; a exsanguinação foi seguida por pneumotórax para confirmar a morte. Todas as amostras de plasma foram analisadas por UHPLC-UVMS para determinar a concentração do Composto 1, utilizando um método analítico de fase reversa. Análise não compartimental (NCA) de dados de farmacocinética para 0 cálculo dos parâmetros farmacocinéticos, que incluíam meia-vida terminal, AUC, biodisponibilidade (F), Cmax e Tmax foi utilizada. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

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28/34 àbela 3

Via	Parâmetro³, unidade	Composto 1	Formulação CMC
IV	Dose, mg/kg	50
Cmax, pg/ml	3.6
Tmax, min	—
ti/2, min	16
AUCo-~, pg/ml-min	59
AUC %Extrap, %	1.4
CL, mL/min/kg	849
V_ss, L/kg	20
MRT, min	16
PO	Dose, mg/kg	500	250	125	500	250	125
Cmax, pg/ml	740	90	68	85	172	29
Tmax, min	15	15	5	15	10	10
ti/2, min	62	84	65	113	63	260
AUCo-~, pg/ml-min	14	7.0	8.0	11	9.3	1.9
AUC %Extrap, %	11	23	14	34	16	ND
F, %	2.4	2.4	5.4	1.9	3.1	1.3
CL, mL/min/kg	850	848	847	850	847	ND*
MRT, min	78	127	99	169	99	ND

^a Abreviações: Cmax, concentração plasmática máxima; t-1/2, meia-vida de eliminação terminal; Tmax, tempo para atingir Cmax; AUCo-~, área sob a curva de concentração-tempo no plasma do tempo zero ao tempo infinito; CL, espaço; V_ss, volume de distribuição em estado estacionário; F, biodisponibilidade oral; MRT, tempo médio de permanência; ND, não determinado.

* NCA não conseguiu prever AUC, CL e MRT. AUCo-3h é relatado aqui.

[066]Para a análise de estabilidade do plasma, a preparação da amostra consistiu em tomar 0,1 mL de plasma, que foi pipetado volumetricamente em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com tampa de pressão contendo 0,9 mL de acetonitrila. O tubo foi submetido a vórtice por ~ 1 minuto e depois centrifugado a ~

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10.000 rpm por ~ 5 minutos. O sobrenadante foi transferido para um frasco de HPLC para análise.

[067]Uma curva de calibração foi preparada injetando 0,1 mL de plasma em branco em um tubo de microcentrífuga com tampa de pressão com o padrão Composto 1; gerando um interval de padrões de 5 ng/mL a 1.000 ng/mL. A resposta da área do pico foi linear no intervalo, com um limite de detecção (LOD) de 5 ng/mL (sinal para ruído de 3:1) e um limite de quantificação (LOQ) de 20 ng/mL.

[068]A separação cromatográfica foi realizada utilizando uma cromatografia líquida de ultra desempenho Waters ACQUITY ™ (UPLC) equipada com detecção UV e MS (Waters XEVO ™ G2-XS Quadrupolo no Tempo de Voo (Q-TOF)) (Waters Corporation, Milford, MA). Uma coluna ACQUITY ™ UPLC BEH C18 de 1,7 pm foi usada à temperatura ambiente, com o amostrador automático ajustado a 10 ^QC. A fase móvel consistiu em ácido fórmico a 0,1% em água (fase móvel A) e ácido fórmico a 0,1% em acetonitrila (fase móvel B), que foi eluída a 0,5 ml/min por 7 min. Um gradiente foi utilizado começando em 90% A: 10% B por 1 min e depois aumentando linearmente para 10% A: 90% B ao longo de 4 min, com uma retenção de 1 min às 10:90 (A:B) por 1 min e finalmente 1 min de período de reequilíbrio a 90:10 (A: B). Volumes de injeção foram de 5 pL; A detecção UV foi registrada a 261 nm. Dados espectrais de massa foram coletados no modo de ionização por eletropulverização negativa em uma faixa de 100-800 amu, com a extração de íons do produto realizada após a aquisição dos dados em m/z 364. A fonte foi ajustada em 2 kV (capilar) com um deslocamento de cone de amostra de 45 e um desvio de fonte de 80. A temperatura da fonte foi ajustada em 150 ^QC e o gás de dessolvatação e as temperaturas em 800 L/h e 500 ^QC, respectivamente. O fluxo de gás do núcleo foi ajustado para 20 L/h. O instrumento foi controlado e os dados coletados no software MASSLYNX ™, versão 4.1 (Waters Corporation, Milford, MA).

[069]A fim de avaliar a estabilidade do plasma para o Composto 1, o material

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30/34 foi recolhido no plasma de camundongo e analisado ao longo do tempo. Inicialmente, as amostras foram avaliadas diariamente, mas era evidente que a estabilidade era curta, uma vez que nenhum ácido 2-hidróxi-4-[[2-[[(4metilfenil)sulfonil]óxi]acetil]amino]benzóico foi observado após 1 dia. Uma análise hora a hora foi então conduzida, mostrando uma diminuição acentuada nas condições ambientais (vide Tabela 4). Finalmente, foi realizado um estudo de estabilidade do plasma a -20 ^QC, o qual mostrou estabilidade aumentada, embora o aumento na estabilidade fosse apenas modesto (vide Tabela 5). Deve-se notar que a medição do tempo para ambiente é listada em horas (Tabela 4) em comparação com o tempo para -20 ^QC, que foi medido em dias (Tabela 5).

Tabela 4

Tempo (horas)	% Recuperação*
0	88.6
1	61.2
2	52.6
3	28.7
5	21.3
6	15.8

Recuperado com base em comparação com um padrão recém-preparado

Tabela 5

Tempo (dias)	% Recuperação*
0	94.5
1	76.6
2	65.7
3	58.0
6	46.6

Recuperado com base em comparação com um padrão recém-preparado [070]A estabilidade em um extrato de acetonitrila (preparação pós-amostra) foi boa com pouca / nenhuma degradação ao longo de 6 dias (vide Tabela 6). Portanto, era desejável extrair as amostras para uma forma mais estável (acetonitrila) o mais rápido possível para minimizar a variação dos dados. Em

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31/34 particular, uma vez que a centrifugação foi realizada nas amostras de sangue para fornecer as amostras de plasma para análise, a extração em acetonitrila foi realizada o mais rápido possível (por exemplo, < 1 hora).

Tabela 6

Tempo (Dias)	% Recuperação*
0	89
2	89
3	90
6	90

Recuperado com base em comparação com um padrão recém-preparado

EXEMPLO 5 [071 ]Este exemplo demonstra que o Composto 1 inibe a expressão de Ki67 no tecido normal da glândula mamária.

[072]Células do epitélio do duto mamário foram contatadas com uma dose equivalente a 500 mg/kg, 250 mg/kg ou 125 mg/mg de peso corporal (PC) / dia do Composto 1. Células que não foram contatadas com qualquer composto serviram como controle. A expressão do Ki67 foi avaliada por análise imuno-histoquímica do epitélio de duto normal. As seções coradas foram digitalizadas e quantificadas usando o software de análise de imagens automatizado.

[073]Os resultados são mostrados na FIG. 4. Após duas semanas de tratamento, observou-se que uma dose de 500 mg/kg de peso corporal (PC) / dia de Composto 1 inibiu Ki67 em 83%, enquanto uma dose de 250 mg/kg de PC/dia de Composto 1 inibiu o Ki67 em 85%. Como o Ki67 é considerado um biomarcador para o desenvolvimento de câncer de mama e outros cânceres, a capacidade de inibir o Ki67, particularmente em tecidos saudáveis, representa um caminho viável para a prevenção de cânceres, tal como o câncer de mama.

EXEMPLO 6 [074]Este exemplo demonstra que o Composto 1 inibe a expressão de STAT3 no tecido normal da glândula mamária.

[075]Células do epitélio do duto mamário foram contatadas com uma dose

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32/34 equivalente a 500 mg/kg, 250 mg/kg ou 125 mg/mg de peso corporal (PC) / dia do Composto 1. Células que não foram contatadas com qualquer composto serviram como controle. A expressão de STAT3 foi avaliada por análise imuno-histoquímica do epitélio de duto normal. As seções coradas foram digitalizadas e quantificadas usando o software de análise de imagens automatizado.

[076]Os resultados são mostrados na FIG. 5. Após duas semanas de tratamento, observou-se que uma dose de 500 mg/kg de PC/dia de Composto 1 inibiu STAT3 em 75%, uma dose de 250 mg/kg de PC/dia de Composto 1 inibiu STAT3 em 44%, e uma dose de 125 mg/kg de PC/dia de Composto 1 inibiu STAT3 em 8,8%. Uma vez que a atividade de STAT3 aumentada é considerada um biomarcador para o desenvolvimento de câncer de mama e outros cânceres, a capacidade de inibir STAT3, particularmente em tecidos saudáveis, representa um caminho viável para a prevenção de cânceres, tal como o câncer de mama.

EXEMPLO 7 [077]Este exemplo demonstra que o Composto 1 pode retardar o aparecimento do câncer de mama em um estudo in vivo.

[078]Camundongos fêmeas MMTV/neu com cinquenta dias de idade foram administrados com Composto 1 por gavagem 5 vezes / semana em doses de 500, 250 e 100 mg/kg de PC/dia. O grupo de controle negativo recebeu apenas veículo (água purificada). A fim de acelerar a formação do tumor, os camundongos também receberam 7,12-dimetilbenz [a] antraceno (DMBA) por gavagem 1 vez / semana por 4 semanas a partir dos 57 dias de idade. O estudo foi finalizado 4 meses após a exposição ao DMBA. Durante o período de tratamento, os pesos corporais dos camundongos e a aparência de tumores mamários palpáveis foram monitorados semanalmente e duas vezes por semana, respectivamente. Nenhuma perda de peso ou toxicidade foi observada em qualquer um dos grupos ao longo do curso da experiência (FIG. 6).

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33/34 [079]O tratamento com o Composto 1 resultou em uma diminuição dependente da dose na incidência, multiplicidade e pesos de tumores mamários em comparação com o controle somente do veículo (FIG. 7). Em todas as doses testadas, o Composto 1 foi capaz de retardar o aparecimento do câncer de mama induzido por DMBA em camundongas fêmeas. Uma dose de 500 mg/kg de PC/dia mostrou o maior efeito na prevenção do câncer de mama.

[080]Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patentes e patentes, citadas neste documento são aqui incorporadas por referência na mesma extensão como se cada referência fosse individual e especificamente indicada para ser incorporada por referência e foi apresentada em sua totalidade neste documento.

[081 ]O uso dos termos a/o e uma/um e pelo menos um e referentes semelhantes no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações a seguir) devem ser interpretados para abranger tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contradito pelo contexto. O uso do termo pelo menos um seguido de uma lista de um ou mais itens (por exemplo, pelo menos um de A e B) deve ser interpretado como um item selecionado entre os itens listados (A ou B) ou qualquer combinação de dois ou mais dos itens listados (A e B), a menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contradito pelo contexto. Os termos compreendendo, tendo, incluindo e contendo devem ser interpretados como termos em aberto (ou seja, significando incluindo, mas não se limitando a), a menos que indicado de outra forma. A recitação de intervalos de valores neste documento visa apenas a servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado dentro do intervalo, a menos que indicado de outra forma aqui, e cada valor separado é incorporado à especificação como se fosse aqui recitado individualmente. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a

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34/34 menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contradito pelo contexto. O uso de todo e qualquer exemplo ou linguagem exemplar (por exemplo, tal como) aqui fornecido, visa meramente a iluminar melhor a invenção e não representa uma limitação no escopo da invenção, a menos que seja reivindicado de outra forma. Nenhuma linguagem na especificação deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

[082]As modalidades preferidas desta invenção são descritas aqui, incluindo o melhor modo conhecido pelos inventores para realizar a invenção. Variações dessas modalidades preferidas podem se tornar aparentes para os versados na técnica após a leitura da descrição anterior. Os inventores esperam que versados na técnica especializados empregem tais variações conforme apropriado, e os inventores pretendem que a invenção seja praticada de outra forma que não especificamente aqui descrita. Por conseguinte, esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes do objeto recitado nas reivindicações anexas, conforme permitido pela lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos acima descritos em todas as variações possíveis é abrangida pela invenção, a menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contradito pelo contexto.

Claims

REIVINDICAÇÃO

1. Composto, CARACTERIZADO pelo fato de que tem a fórmula
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é cristalino.
3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é pelo menos 85% puro.
4. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o composto de acordo como definido em qualquer uma das reivindicações 1-3 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que o transportador farmaceuticamente aceitável compreende água.
6. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição está a uma temperatura inferior a 0 ^QC.
7. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-6, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição tem um pH de cerca de 7.
8. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-7, CARACTERIZADA pelo fato de que é uma solução clara.
9. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-8, CARACTERIZADA pelo fato de que é uma formulação oral.

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10. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-9, CARACTERIZADA pelo fato de que é para uso na prevenção de câncer.
11. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-9, CARACTERIZADA pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer.
12. Composição farmacêutica para uso, de acordo com a reivindicação 10 ou reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que o câncer aumentou a atividade de STAT3 e/ou aumentou a expressão de Ki67 em relação ao tecido normal do mesmo tipo.
13. Composição farmacêutica para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, CARACTERIZADA pelo fato de que o câncer é selecionado a partir de leucemia, mieloma múltiplo, câncer de pâncreas, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário e câncer de próstata.
14. Composição farmacêutica para uso, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que o câncer é câncer de pâncreas, câncer de fígado ou câncer de mama.
15. Composição farmacêutica para uso de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que o câncer é câncer de mama.