FR3013048A1 - Derive de sterol, son procede de preparation, composition pharmaceutique le contenant et son utilisation pour le traitement du glioblastome multiforme - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un nouveau dérivé de stérol, son procédé de préparation, la composition pharmaceutique le contenant et son utilisation pour le traitement de maladies impliquant des cellules cancéreuses. L'invention vise, en particulier, le traitement du glioblastome multiforme.

Description

L'invention concerne des dérivés de stérol, leur procédé de préparation, les compositions pharmaceutiques les contenant et leur utilisation pour le traitement de maladies impliquant des cellules cancéreuses, et en particulier pour le traitement du glioblastome multiforme. Le glioblastome multiforme (GBM), cornu également sous le nom 10 d'astrocytome de grade 4, est une tumeur cérébrale caractérisée par la transformation des cellules astrocytaires en cellules cancéreuses. La transformation cellulaire correspond au passage d'une cellule eucaryote normale vers une cellule immortalisée et/ou une cellule eucaryote cancéreuse. Dans la suite de la description, on utilisera indifféremment les termes 15 « cellule transformée » ou « cellule cancéreuse ». Malgré les avancées scientifiques et thérapeutiques substantielles dans le domaine de la cancérologie, le GBM reste un cancer incurable. Au mieux, chercheurs et médecins sont satisfaits lorsque la médiane de vie des patients peut être prolongée de quelques mois, jusqu'au maximum quinze mois. 20 Un des problèmes posés par le traitement du GBM est la rechute causée par les cellules souches. En effet, même lorsque les thérapies existantes parviennent à éradiquer tout ou une partie de la tumeur, les cellules souches sont à j'origine d'un nouveau départ tumoral (1, 2). Les thérapies actuelles consistent toujours en une résection de la tumeur, 25 si sa localisation le permet, suivie d'une radiothérapie et/ou d'une chimiothérapie selon le cas. En chimiothérapie, un des traitements « leader » est une bithérapie qui consiste à administrer de l'avastin (inhibition de l'association du VEGF à ses récepteurs) et de l'irinotecan (inhibiteur de la topoisomérase I). La trithérapie de type PCV, qui est une combinaison de Procarbazine (agent alkylant de l'ADN), de 30 lomustine (CCNU ; agent alkylant non spécifique) et de vincristine (inhibition de la polymérisation des microtubules) est à l'heure actuelle très controversée. Le temozolomide, agent alkylant de la guanine, en association avec une radiothérapie montre une augmentation de la médiane de survie en particulier pour les patients qui ont un ADN hyperméthylé. Des essais cliniques (phase III) qui testent le cilengitide (inhibition de quelques récepteurs à l'intégrine) et le talampanel (blocage des canaux au glutamate de type AMPA) sont en cours.

Les recherches et essais cliniques en immunothérapie sont de deux types : - l'immunothérapie adaptative, clans laquelle: des cellules activées in vitro sont injectées chez le patient tels des lymphocytes tueurs activés (LAK ; ess cliniques phase 1) ou des lymphocytes cytotoxiques (CTL ; essais cliniques de phase I) injectés en mode intracrânien. A l'heure actuelle, les observations montrent une survie de 20 mois de façon très marginale. - l'immunothérapie active, qui consiste en l'utilisation de vaccins (phase I) et de cellules dendritiques (phase II). Celle-ci ne montre pas d'amélioration significative de la survie des patients. Ces essais ont été arrêtés.

Les thérapies géniques qui consistent en l'utilisation d'adénovirus, de rétrovirus ou de virus de la rougeole comme vecteur de molécules à potentiel anticancéreux montrent une amélioration de la survie de 6 à 11 mois seulement. La thérapie cellulaire qui propose d'utiliser des cellules souches neuronales comme transporteurs de médicaments dans les GBM est encore au stade de la démonstration en recherche fondamentale. Sur le plan de la recherche fondamentale diverses familles de molécules sont étudiées pour évaluer leur potentiel anticancéreux d'un point de vu thérapeutique. Dans le cadre de l'invention, l'attention a été portée sur la famille des oxystérols dont les propriétés anticancéreuses « in vitro » sont déjà décrites et résumées en 1989 par Leland, L et col (3). Les propriétés cytostatiques des oxystérols sont en général bien documentées (3, 4). Certains oxystérols interfèrent avec l'homéostasie du cholestérol (5) et d'autres causent un transport de cholestérol vers le réticulum endoplasmique (6) rendant ainsi indisponible le cholestérol nécessaire à la prolifération cellulaire et provoquant en plus un dérégulation du métabolisme cellulaire (7). Les propriétés cytotoxiques des oxystérols ont également été décrites (3). Concernant les mécanismes d'action de ces composés, les oxystérols, comme le 25-hydroxycholestérol, qui perturbent l'homéostasie de cholestérol, sont aussi toxiques sur les cellules cancéreuses (8). Cependant, l'effet anticancéreux d'autres oxystérols, tels que le 73-hydroxycholestérol, le 7-cétocholestérol et le 22- cétocholestréol repose sur des mécanismes qui ne sont pas élucidés à l'heure actuelle (9, 10, 11). Parmi les oxystérols, le 73-hydroxycholestérol (7bOHCH) montre «in vitro » une activité cytotoxique remarquable sur des lignées GBM de rat (C6)(7). Pour ces cellules (C6) des auteurs démontrent « in vitro » et « in vivo » que c'est un métabolite du 7bOHCH qui est impliqué dans l'effet anti-cancéreux; le métabolite est du 7bOHCH estérifié en C3-OH par les acides gras intracellulaires (12, 13). On a maintenant trouvé que certains dérivés de 78-hydroxycholestérol, non estérifiés en C3-OH, présentent une activité anti-cancéreuse remarquable « in vitro », notamment sur une lignée cellulaire dérivée d'un GBM humain (Lignée U 251).

La présente invention a donc pour objet des composés dérivés de stérols, pour leur utilisation dans le traitement de maladies impliquant des cellules cancéreuses, et en particulier pour le traitement du glioblastome multiforme. L'invention concerne des composés de formule (I) (I) dans laquelle B représente un groupement -C(0)R1, dans lequel R1 est un alkyle en C1-C6, linéaire ou ramifié, non substitué ou substitué; ou encore R1 représente OR2, dans lequel R2 est un alkyle en C1-C6, linéaire ou ramifié non substitué ou substitué, pour leur utilisation dans le traitement de maladies impliquant des cellules cancéreuses, et en particulier pour le traitement du glioblastome multiforme.

L'invention concerne également un composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, pour son utilisation comme agent anti-tumoral. Le groupement alkyle désigne un groupement linéaire ou ramifié en C1-C6tel que les groupements méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, sec-butyle, tert-butyle, pentyle, isopentyle, sec-pentyle, tert-pentyle, néo-pentyle, hexyle, isohexyle, sec-hexyle, tert-hexyle. De préférence, B représente un groupement -C(0)R1, dans lequel R1 est un groupe méthyle. Selon un autre aspect avantageux, B représente un groupement -C(0)R1, dans lequel R1 représente OR2, dans lequel R2 est un groupement tert-butyl.

Des composés préférés de formule (I) sont le 743-O-acétylcholestérol et le 7-13-0-tert-butyloxycarbonylcholestérol. Les composés de formule (I) peuvent être obtenus à partir du cholestérol par un procédé comprenant les étapes suivantes : - protection de la fonction hydroxyle en position 3 par un groupement protecteur, tel que, par exemple, un groupement arylalcoxycarbonyl, - introduction d'une fonction cétone en position 7, - réduction de la fonction cétone en fonction hydroxyle, - introduction d'un groupement protecteur sur la fonction hydroxyle en position 7, correspondant au groupement B, tel que par exemple un groupement acyl ou alcoxycarbonyl, - déprotection de la fonction hydroxyle en position 3. L'introduction d'une fonction cétone en position 7 peut être effectuée par des méthodes d'oxydation usuelles. La réduction de la fonction cétone en fonction hydroxyle, sélectivement en position 3, peut être réalisée, par exemple selon la méthode de Luche à l'aide de NaBH4 en présence de chlorure de cérium heptahydraté (El Kihel L et al. J. Org. Chem. 2002 : 4075-4078). L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques ou médicaments comprenant au moins un composé de formule (I) et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. De préférence, le(s) composé(s) de formule (I) constituent le(s) seul(s) principe(s) actif(s) contenu(s) dans la composition pharmaceutique selon l'invention, notamment lorsque ladite composition pharmaceutique est un liposome. Alternativement, le composé de formule (I) peut être utilisé en association avec un autre principe actif, tel que, par exemple un agent anticancéreux, en particulier l'avastin, l'irinotécan, le témozolomide ou les dérivés du taxol. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent prendre toute forme appropriée pour leur administration orale ou parentérale, en particulier par injection, perfusion ou inhalation, connue de l'homme du métier.

En particulier, ladite composition pharmaceutique peut être une forme soluble pharmaceutiquement acceptable, notamment une solution alcoolique d'au moins un composé de formule (I), seul ou en association avec un autre principe actif, ou une solution contenant au moins un composé de formule (I), seul ou en association avec un autre principe actif dans un solvant organique, et au moins un agent tensioactif. Ladite forme soluble peut, en outre, contenir un ou plusieurs autres excipients acceptables sur le plan pharmaceutique, et, le cas échéant, être diluée dans une solution physiologique, telle que NaCI à 0,9% (p/v), La solution alcoolique est, par exemple, une solution éthanolique.

A titre de solvant organique, on peut utiliser, par exemple, le diméthylacétamide, et à titre d'agent tensioactif, un dérivé de polyéthylène glycol tel que, par exemple, le Solutol®. Un médicament préféré de l'invention consiste à cet égard en une solution alcoolique, de préférence éthanolique, contenant au moins un composé de formule (I). De préférence, le composé de formule (I) constitue le seul principe actif contenu dans ladite solution alcoolique. Un autre médicament préféré de l'invention consiste en une solution contenant au moins un composé de formule (I), seul ou en association avec un autre principe actif dans un solvant organique, et au moins un agent tensioactif. De préférence, le composé de formule (I) constitue le seul principe actif contenu dans ladite solution.

Lesdites formes solubles peuvent être administrées à un patient par transfusion ou perfusion. En particulier, les composés de formule (I) peuvent être injectés directement dans le cortex cérébral, au site de traitement.

Ladite composition pharmaceutique selon l'invention peut également être adaptée à une administration par voie orale ou sub-linguale. Outre les formes galéniques usuelles, par exemple, comprimés sécables ou non sécables, gélules, poudres, granulés, solutions, émulsions, suspensions buvables, gouttes, sirops, etc., les compositions pharmaceutiques orales selon l'invention peuvent 10 comprendre des complexes de composés de formule (I) avec des sels biliaires, ou encore des associations de composés de formule (I) avec des phospholipides. La composition pharmaceutique selon l'invention peut également consister en une préparation liposomale comprenant au moins un composé de formule (I), seul ou en association avec un autre principe actif. Les liposomes 15 peuvent être fabriqués à l'aide de différentes techniques connues de l'homme du métier. Différents lipides constituant les liposomes peuvent être utilisés [Medical Application of Liposomes (1986) edited by Kunio Yagi, Japan Scientific Societies Press, Tokyo, Karger]. Un médicament préféré de l'invention consiste à cet égard en un 20 liposome chargé en au moins un composé de formule (I). L'invention concerne également le traitement de maladies impliquant des cellules cancéreuses, en particulier le traitement du glioblastome multiforme (GBM), par administration d'une quantité efficace d'au moins un composé de formule (I). De préférence, le composé de formule (I) constitue le seul principe actif contenu dans 25 une forme soluble pharmaceutiquement acceptable, ou dans un liposome. Les exemples suivants illustrent l'invention de manière non limitative. La partie I concerne la synthèse chimique. La partie II concerne l'activité biologique d'un composé de formule (I). 30 Synthèse chimique Préparation du 7-beta-0-acétylcholestérol (com)osé I) Exemple 1 : é ration du 7beta-O-acétylcholestérol (composé I) Le schéma réactionnel est représenté sur la Figure 1. Le composé I correspond au composé 1.4. 1) Préparation du composé 1.1 NaC102/NHPI Dioxane/Eau ont été utilisés : Les réactifs suivants MV^T Nb mol. éq Masse ou Volume Cholestéryl benzoate 490,78 100 mmo 50g Sodium Chlorite 90,44 300 mmol 3éq 28g N-hydroxyphtai mide 163,13 10 mmol 0,1éq g Dioxane/Eau 3/1 500m1 Dans un tricot de 11 surmonté d'un réfrigérant, sont placés dans l'ordre le cholesteryl benzoate, le mélange dioxane/eau, le chlorite de sodium et le N- hydroxyphtalimide. Ce mélange est chauffé à 50°C durant 6h. Le suivi de l'avancement de la réaction est réalisé par CCM sur plaque de silice (TLC silica gel 60 F254, Merck) dans Hexane/Et20 80/20. Lorsque le taux de formation atteint une valeur acceptable, le brut réactionnel est coulé sur une solution à 10% de sulfite de sodium (500m1), puis extrait à l'éther. La phase organique obtenue est lavé par une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium, puis à l'eau et enfin à la saumure Cette phase organique est alors séchée sur sulfate de sodium, filtrées puis évaporées sous pression réduite. Le résidu huileux coloré obtenu est alors purifié par recristallisation dans l'éthanol. Le solide blanc obtenu n'ayant pas une pureté suffisante, il est repurifié par chromatographie sur gel de silice (silice SDS 60A, 35-70pm). On réalise un dépôt solide en reprenant cette huile dans le dichlorométhane. La purification est réalisée dans un éluant allant de 98/2 Hexane/Acétate d'éthyle à 90/10. Le produit est obtenu sous forme d'un solide blanc. Rendement : 23 % Analyses Analyse par RMN 1H dans le CDCI3, BRUKER 400 MHz. HPLC colonne phase normale CHIRALCEL O-DH (colonne ODHOCE-CE026), éluant 9/1 Hexane/iPrOH, 20min, longueur d'onde 190nm. Temps de rétention 6,682 mn, pureté HPLC 99,2%. 1H Fumq (CDCI3, 400,13 MHz) : ô 0,71 (s, 3H, CH3), 0,89 (dd, 6H, 2CH3), 0,94 (d, 3H, CH3), 1,02-2,78 (m, 26H), 1,27 (s, 3H, CH3), 4,99 (m, 1H, CH), 5,76 (d, 1H, CH), 7,44-8,05 (m, 5H, CHAr). 2) Préparation du composé 1.2 Les réactifs suivants ont été utilisés : ^ éq Masse ou Volume MW Nb mol. Cétocholestéryl benzoate 504,76 15,8 mmol 8g NaBH4 37,83 7,9 mmol 0,5 éq + 0,5 éq 0,3 g + 0,3 g CeC13.7H20 372,60 14,2 mmol 0,9 éq 5,3 g THF/MeOH 1 :1 200 ml Dans un ballon de 500m1, on place le cétocholestéryl benzoate, le mélange de solvants THF/MeOH et le chlorure de cérium hydraté. Le brut est alors refroidi à 0°C à l'aide d'un bain de glace, avant d'ajouter lentement le borohydrure de sodium. On observe un dégagement gazeux, le bain de glace est maintenu 11-, puis on agite à température ambiante pour 18h. On effectue le suivi de l'avancement par CCM (TLC silica gel 60 F254, Merck) dans un éluant 80/20 Hexane/AcOEt. Si le taux de formation n'est pas suffisant on ajoute 0,5éq de borohydrure de sodium.

On ajoute au brut réactionnel 50m1 d'eau et 200m1 de dichlorométhane. Après transfert en ampoule à décanter, on récupère la phase organique. La phase aqueuse est réextraite au DCM. Les phases organiques sont rassemblées, lavées par une solution d'acide chlorhydrique 1N puis une solution saturée en NaCI. La phase organique est alors séchée sur sulfate de sodium, filtrée et évaporée sous pression réduite pour conduire à une huile faiblement colorée qui cristallise spontanément. On réalise un dépôt solide en reprenant le résidu dans du DCM. On purifie ce brut sur colonne de gel de silice (silice SDS 60A, 35-70pm) dans un éluant Hexane/AcOEt 9/1. Le produit est obtenu sous forme d'un solide blanc.

Rem__ 3ri 3nt : 89% Analyse Analyse par RMN 1H dans le CDCI3, BRUKER 400 MHz. HPLC colonne phase normale CHIRALCEL 0-DH (colonne ODHOCE-CE026), éluant 9/1 Hexane/iPrOH, 20mn, longueur d'onde 190nm. Temps de rétention 7,076 mn, pureté HPLC 98,8%. 1H RMN (CDCI3, :00,13 MHz) : 6 0,63 (s, 3H, CH3), 0,79 (dd, 6H, 2CH3), 0,85 (d, 3H, CH3), 0,89-2,43 (m, 27H), 1,04 (s, 3H, CH3), 3,81 (d, 1H, CH), 4,81 (m, 1H, CH), 5,29 (d, 1H, CH), 7,34-7,99 (m, 5H, CHAr). 3) Préparation du composé 1.3 Ac20/Pyridine Te. OH Les réactifs suivants ont été utilisés : Dans un ballon de 100m1, on place le 7-p-hydroxychoiesteryl benzoate, la pyridine, puis l'anhydride acétique. Ce mélange est agité à température ambiante pour 16h. Le suivi de l'avancement est réalisé par CCM (TLC silica gel 60 F254, Merck) dans un éluant 9/1 Hexane/AcOEt. Le brut réactionnel est évaporé sous pression réduite. On effectue deux coévaporations à l'acétate d'éthyle. Le résidu obtenu est repris dans l'acétate d'éthyle. La phase organique ainsi obtenue est lavée à l'acide chlorhydrique 1 N, 20 séchée sur sulfate de sodium puis évaporée sous pression réduite. Le solide blanc obtenu est directement introduit dans l'étape suivante sans purification supplémentaire. MW Nb mol. éq Masse ou Volume 7-p-hydroxycholestéryl 505,76 9,9 mmol benzoate Anhydride acétique Pyridine Rendement : 100% Analyse: Analyse par RMN 1H dans le CDCI3, BRUKER 400 MHz. HPLC colonne phase normale CHIRALCEL O-DH (colonne ODHOCE-CE026), éluant 9/1 Hexane/iPrOH, 20rnn, longueur d'onde 190nm.

Temps de rétention 4,972 mr, pureté HPLC 99,6%. 1H RMN (CDCI3, 400,13 MHz) : 5 0,63 (s, 3H, CH3), 0,79 (dd, 6H, 2CH3), 0,84 (d, 3H, CH3), 0,91-2,41 (m, 26H), 1,06 (s, 3H, CH3), 1,95 (s, 3H, CH3 acétyle), 4,78 (m, 1H, CH), 4,99 (d, 1H, CH), 5,21 (s, 1H, CH), 7,33-7,98 (m, 5H, CHAr). 4) Préparation du composé 1.4 Les réactifs suivants ont été utilisés: Dans un ballon de 100m1, on place le 743-0-acétylcholestéryl benzoate et la solution 1% de soude dans le méthanol. Ce mélange est agité à température ambiante jusqu'à complète solubilisation. Le suivi de l'avancement est réalisé par chromatographie sur couche mince (CCM) (TLC silica gel 60 F254, Merck) dans un éluant 7/3 Hexane/AcOEt. MW Nb mol Masse ou Volume- 743-0-acétylcholestéryl benzoate 548,81 9,1 mmol 5g 50 ml 1% NaOH dans Méthanol Afin de compléter la réaction, le brut réactionnel peut être chauffé à 40°C, et un contrôle par CCM est alors réalisé toutes les 20 minutes. On ajoute 200 ml d'acétate d'éthyle et 50m1 d'eau, puis on transfère en ampoule à décanter et séparation des phases. La phase aqueuse est ré-extraite à l'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur sulfate de sodium, filtrées puis évaporées sous pression réduite pour conduire à un résidu huileux. Le résidu est repris dans l'acétate d'éthyle afin de préparer le dépôt solide. La purification est réalisée sur colonne de gel de silice (silice SDS 60A, 35- 70pm) dans un éluant Hexane/AcOEt allant de 9/1 à 7/3. Le produit attendu est obtenu sous forme d'une huile incolore qui cristallise spontanément pour conduire à un solide blanc. La colonne est lavée à l'acétate d'éthyle 100% afin de récupérer le 7-t3-hydroxycholestérol formé.

Rendement : 38% Analyse : Analyse par RMN 1H dans le CDCI3, BRUKER 400 MHz. HPLC colonne phase normale CHIRALCEL O-DH (colonne ODHOCE-CE026), éluant 9/1 Hexane/iPrOH, 20mn, longueur d'onde 190nm.

Temps de rétention 6,186 mn, pureté HPLC 91,7%. 1H RMN (CDCI3, 400,13 MHz) : 0,62 (s, 3H, CH3), 0,78 (dd, 6H, 2CH3), 0,85 (d, 3H, CH3), 0,86-2,28 (m, 27H), 1,03 (s, 3H, CH3), 1,96 (s, 3H, CH3 acétyle), 3,47 (m, 1H, CH), 4,94 (td, 1H, CH), 5,13 (t, 1H, CH).

Exemple préparation du 7beta-O-tert-butvloxycarbonylcholestérol (composé 11) Le composé II est préparé à partir du composé 1.2 de l'exemple 1. 1) Préparation du 7-43-0-t-butyloxycarbonyl-choIestérylbenzoate Les réactifs suivants ont été utilisés MW Nb mol. éq Masse ou Volume 743-hydroxycholestéryl benzoate 505,76 1,29 mmol 0,65 g Boc2O 218,25 2,8 mmol 2,2 éq 0,61 g DMAP 122,17 0,13 mmol 0,1 éq 0,016 g Hexane/THF 5 :2 42 ml Dans un ballon monocol de 100m1, on place le 743-hydroxycholesteryl benzoate, le solvant, la 2,6-diméthylaminopyridine puis l'anhydride de tertbutyloxycarbonyle. Ce mélange est agité à température jusqu'à complète 10 solubilisation. Le suivi de l'avancement est réalisé par CCM dans un éluant 8/2 Hexane/AcOEt. On ajoute 50 ml d'AcOEt et 10m1 d'eau. La phase organique ainsi obtenue est séchée sur sulfate de sodium, filtrée puis évaporée sous pression réduite pour conduire à un résidu huileux. 15 Le résidu est repris dans l'AcOEt afin de préparer le dépôt solide. La purification est réalisée sur colonne de gel de silice dans un éluant Hexane/AcOEt 95/5. Analyse : Analyse par RMN 1H dans le CDCI3. t RMN (CDCI3, 400,13 MHz) : ô 0,59 (s, 3H, CH3), 0,77 (dd, 6H, 20 2CH3), 0,84 (d, 3H, CH3), 0,86-1,98 (m, 24H), 1,09 (s, 3H, CH3), 1,41 (s, 9H,5 3CH3, t-Boc), 2,42 (m, 2H, CH2), 4,80 (m, 1H, CH), 4,91 (d, 1H, CH), 5,18 (s, 1H, CH), 7,34-7,97 (m, 5H, CHAr). 2) Préparation du 7-13-0-tert-butyloxycarbonylcholestérol 10 Les réactifs suivants ont été utilisés : MW b mol. 606,89 713-0-t-butyloxycarbonylcholestéryl benzoate 1,64 mmol --- 1% NaOH Me0H Masse ou Volume 1g 50 ml Dans un ballon monocol de 50m1, on place le 7-13-04- butyloxycarbonylcholestéryl benzoate et la solution 1% de soude dans le 15 méthanol. Ce mélange est agité à température ambiante jusqu'à complète solubilisation. Le suivi de l'avancement est réalisé par CCM dans un éluant 7/3 Hexane/AcOEt. Afin de compléter la réaction le brut peut être chauffé à 40°C. On ajoute 100 ml d'AcOEt et 20m1 d'eau. La phase aqueuse est réextraite à l'AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur 20 sulfate de sodium, filtrées puis évaporées sous pression réduite pour conduire à un résidu huileux. Le résidu est repris dans l'AcOEt afin de préparer le dépôt solide. La purification est réalisée sur colonne de gel de silice dans un éluant Hexane/AcOEt allant de 9/1 à 7/3. La colonne est lavée à l'AcOEt 100% afin de récupérer le 25 7-3-hydroxycholestérol formé.

Analyse : Analyse par RMN 1H dans le CDCI3. 111 RN (CDCI3, 400,13 0,60 (s, 3H, CH3), 0,78 (dd, 6H, 2CH3), 0,84 (d, 3H, CH3), 0,91-2,29 (m, 27H), 0,97 (s, 3H, CH3), 1,41 (s, 9H, 3CH3, t-Boc), 3,47 (m, 1H, CHB), 4,77 (td, 1H, CHc), 5,17 (t, 1H, CHA). ctivi*e lklue A/ Protocoles Les protocoles suivants ont été utilisés pour toutes les expérimentations : 1) Cultures cellulaires On a utilisé des plaques de culture de 96 puits (NUNC, USA) à fond plat en plastique traité culture cellulaire (Sigma-Aldrich, réf 114754) ; 3000 cellules sont ensemencées par puits dans 200 pl de milieu de culture. Le milieu de culture est composé de MEM (Gibco, USA) contenant, du pyruvate 1 mM), de la glutamine (2 mM), 10% (v/v) de sérum de veau foetal (Gibco), de la Ciprofloxacine (5 ug /ml ; Bayer) et de la Fongizone (2,5 ug/ml ; Gibco). Au moment du traitement, 100 pl de milieu de culture pure, 100 pI de milieu de culture contenant de l'éthanol ou 100 pI de milieu de culture contenant le principe actif sont ajoutés par puits ; le volume final du milieu de culture, après traitement, est donc de 300 pl pour tous les puits. Les cultures sont incubées dans un incubateur Sanyo (Japon, modèle, MCO-19AIC-UV) à 37°C et dans une atmosphère à 5% de CO2 et saturée en humidité. Les cellules sont observées au microscope inversé (Nikon ellipse TS100, Japon) et les photos prises à l'aide d'une caméra (DIGITAL camera avec c-mount ;référence DCM510, USB 2.0 ; LABOVER, France). La hotte de culture est une hotte PSM (thermo SCIENTIFIC, modèle HERA SAFE KS12, France).

Les passages sont effectués par dissociation à la trypsine (Type 3 de pancréas de bovin, Sigma, France). La dissociation des cellules se fait à température ambiante, pendant 30 minutes, avec une solution de Tyrode KCI 0,04 % (p/v) contenant 0,05% (p/v) de trypsine. Après dissociation, les cellules sont suspendues dans le milieu de culture, comptées à l'aide d'une cellule de THOMA et diluées dans le même milieu pour obtenir 3000 cellules par puits. a) Lignées cellulaires On a utilisé la lignée GBM humaine U-251. La lignée U-251 et son milieu de culture (Eagle's Minimum Essential Medium ou EMEM) proviennent de ECACC (UK, ref 09G002). Les cellules sont mises et maintenues en culture selon les recommandations de l'ECACC. Cette lignée est couramment utilisée «in vitro» et «in vivo» pour tester le potentiel anti GBM. b) Traitement des cultures Le principe actif est dissous dans de l'éthanol absolu (AnalaR, NORMAPUR, VWR, France ; solution mère) et 10 pI des solutions-mères sont dilués dans 990 pl de milieu de culture (milieu de de traitement) ; 100 pI de milieu de traitement sont ensuite ajoutés dans les puits de culture (200 pI de milieu de culture). Le traitement se fait après 24 heures de mise en culture et les concentrations utilisées sont de 66 et de 33 pM (volume final du milieu de culture par puits BI-GBM : 300 pI). 2) Mesure de l'activité anti-GBM de 7bOAcOH. Les méthodes de mesure suivantes sont utilisées : a) Dos ecu9 des protéines. Le milieu de culture est retiré de chaque puits et 50 pI de tampon de Laemmli (0,1 ml de Tris, 0,8 ml de glycérol, 1,6 mL de SDS 10%, 8 ml q.s.p. eau ultra pure) sont ajoutés par puits.

Dans des puits contrôles, 10 pl d'une solution de gamme d'albumine de sérum de boeuf (BSA cristallisée, Sigma) sont ajoutés ; la gamme allant de 0 jusqu'à 20 pg par puits. Les puits sont ensuite complétés par 40 pl de tampon de Laemmli. Enfin, 200 pl de la solution du réactif BCA sont ajoutés (Pierce, USA ; BCA Protein Assay Kit ; ThemoScientific, France). Les plaques de culture sont incubées pendant 30 min dans une étuve à 37 °C. La densité optique pour chaque puits est lue et quanUiée par un lecteur de plaques (BioRad, USA, iMark Microplate reader 12222) à 570 nm. 10 b) Viabilité cellulaire (test MTT) Ce test permet de déterminer l'état énergétique, particulièrement celui de la mitochondrie. La solution-stock de sel de tétrazolium MTT (bromure de 344,5- diméthylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyl tetrazolium, Sigma -Aldrich, USA, réf M5655) est faite de 10mg de MTT/ml de tampon PBS (Phosphate Buffered Saline, SIGMA, ref D 15 1408). Cette solution est directement ajoutée au milieu de culture de chaque puits ; la concentration finale de MTT est de 25 pg/ml. La plaque est alors placée à l'étuve à 37°C pendant 1 heure minimum. Après l'appar:tion des grains bleus de formazan, des photos ont été prises pour compter les cellules présentant une forte densité de grains de formazan. 20 Ensuite, les milieux sont éliminés et 100 pl de diméthylsulfoxide (DMSO, SDS CARLO ERBA, Italie) sont ajoutés pour dissoudre les dépôts de formazan. La densité optique se lit et se quantifie par l'utilisation du acteur de plaques (BioRad, iMark Microplate reader) à 570 nm. Des photos sont aussi prises avant la dissolution des grains de formazan 25 dans le DMSO et la viabilité est parfois aussi testée par la méthode d'exclusion du trypan bleu. Les prises de vue sont réalisées à l'aide d'un microscope à épifluorescence (Axiovert A.1, Zeiss, Allemagne). 30 B/ Activité anti-GBM « nvitro » sur les cellules U-251 1) Expression de résultats 18 3013048 Les résultats sont exprimés selon les paramètres suivants - Quantification des protéines résiduelles après le traitement par le composé 1 de l'exemple 1 en solution éthanolique (dénommé ci-après 7bOAcOH Etoh) -Quantification de la viabilité cellulaire résiduelle après le traitement par 7bOAcOH Etoh. 2) Résultats 10 a) Observation morphologique. La figure 2 montre que, après huit jours en culture des cellules traitées avec l'éthanol uniquement (grossissement x 10; culture traitée au MTT) ; aucune altération cellulaire n'est observée. En revanche, sur les figures 3 et 4 on observe que des cultures traitées avec 33 ou 66 pM de 7b0AcCH Etoh présentent une 15 éradication totale des cellules après 8 jours de traitemert (figure 3 et figure 4 grossissement x10 ; cultures traitées au MTT). Les grains de formazan restants proviennent probablement des réductases résiduelles adsorbées à la surface du substratum solide de culture. 20 b) Dosages des protéines et du MTT. Les figures 5 et 6 montrent le dosage des protéines et du MTT après 8 jours de traitement par 33 ou 66 pM de 7bOAcCH Etoh. Les résultats sont comparés à ceux des cultures contrôles traitées par de l'éthanol uniquement. Les résultats sont la moyenne de deux expériences faites en'quadruplât. 25 Dans la figure 5, les résultats sort exprimés en pg de protéine résiduelle. Dans la figure 6, les résultats représentent la viabilité cellulaire résiduelle, exprimée en densité optique. Les résultats montrent que, au bout de 8 jours de traitement, la teneur en protéines résiduelles est de 7% par rapport aux cultures contrôles traitées à l'éthanol 30 uniquement (figure 5). Du fait qu'aucune cellule intègre n'est observée (figures 3 et 4), les protéines résiduelles proviennent probablement des déchets cellulaires adsorbés au substratum solide de culture.

Le pourcentage de viabilité cellulaire résiduelle n'est que de 25% par rapport aux cultures contrôles traitées à l'éthanol uniquement (figure 6). Ces observations démontrent clairement que le composé 1 de l'exemple 1 a une très forte activité anti-GBM humain envers les lignées U-251.

20 Bibliographie 301304 8 Kondo, T., Setoguchi, T. & Taga, T. Proc Nati Acad Sci U S A 101, 781-786, (2004).

5 2 Zhou, Y. et al. J Biot Chem 286, 32843-32853, (2011).

3 Leland,L., Smith, B; and Johnson H. Free Radical Biology and Medicine 7, 285-332, (1989) de Weille, J., Fabre, C. & Bakalara N. Biochem Pharrnacol, 86(1)154-60 (2013) Saucier, S. E., Kandutsch, A. A., Gayen, A. K., Swahn D. K. & Spencer, T. A. J Biol Chem 264, 6863-6869, (1989) DeBose-Boyd, R. A. Cell Res 18, 609-621, (2008) 7 Clarion, L. et al. Biochem Pharmacol 83, 37-46, (2012) 8 Philippot, J. R., Cooper, A. G. & Wallach D. F. Proc Natl Acad Sci U S A 74, 956-960, (1977) 9 Kupferberg, A et al. Mol Cell Biochem 101, 11-22, (1994) 10 Chuu, C. P. & Lin, H. P. Anticancer Res 30, 3643-3648, (2010) 11 de Weille, J., Fabre C., Gaven, C. & Bakalara N. Biochem Pharrnacol 86, 161-167, (2013) 12 Kupferberg, A et al. Biochim Biophys Acta 1013, 223-231 (1989) 13 Werthie, M et al. Cancer Research 54, 998-1003 (1994)

Claims (16)

1. REVENDICATIONS1. Composé de formule (I) HO (I) dans laquelle B représente un groupement -C(0)R1, dans lequel R1 est un alkyle en C1-C6, linéaire ou ramifié, non substitué ou substitué; ou encore R1 représente OR2, 10 dans lequel R2 est un alkyle en C1-C6, linéaire ou ramifié, non substitué ou substitué, pour son utilisation dans le traitement de maladies impliquant des cellules cancéreuses
2. 2. Composé de formule (I) pour son utilisation selon la revendication 1, pour le 15 traitement du glioblastome multiforme.
3. 3. Composé de formule (I) pour son utilisation selon la revendication 1, en tant qu'agent anti-tumoral.
4. 4. Composé de formule (I) pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que, dans la formule (I), B représente un groupement -C(0)R1, dans lequel R1 est un groupe méthyle.
5. 5. Composé de formule (I) pour son utilisation selon quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que, dans la formule (I), B représente un groupement -C(0)R1, dans lequel R1 représente OR2, et R2 est un groupe tertbutyle.
6. 6. Composé de formule (I) pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, qui est choisi parmi le
7. 7-8-0-acétylcrolestérol et le 7-13-0-tertbutyloxycarbonylcholestérol. 7. Procédé de préparation d'un composé de formule (I) (I) dans laquelle B représente un groupement -C(0)R1, dans lequel R1 est un alkyle en 10 C1-C6, linéaire ou ramifié, non substitué ou substitué; ou encore R1 représente OR2, et R2 est un alkyle en C1-C6, linéaire ou ramifié, non substitué ou substitué, comprenant les étapes suivantes : - protection de la fonction hydroxyle en position 3 par un groupement protecteur' - introduction d'une fonction cétone en position 7, 15 - réduction de la fonction cétone en fonction hydroxyle, - introduction d'un groupement protecteur sur la fonction hydroxyle en position 7, correspondant au groupement B, - déprotection de la fonction hydroxyle en position 3. 20
8. 8. Composition pharmaceutique comprenant au moins un composé de formule (I)HO (I) dans laquelle B reperi..e un groupc,,ment -C(0)R1, dans leq.'. ' est un alkyle en C1-C6, linéaire ou ramifié, non substitué ou substitué; ou encore R1 représente OR2, et R2 est un alkyle en Cl-C6, linéaire ou ramifié, non substitué ou substitué, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
9. 9. Composition pharmaceutique selon la revendication 8, comprenant un composé de formule (I) dans laquelle B représente un groupement -C(0)R1, dans lequel R1 est un groupe méthyle.
10. 10. Composition pharmaceutique selon la revendication 8, comprenant un composé de formule (I) dans laquelle B représente un groupement -C(0)R1, dans lequel R1 représente OR2, et R2 est un groupe tert-butyle.
11. 11. Composition pharmaceutique selon la revendication 8, comprenant un composé de formule (I) choisi parmi le 743-0-acétylcholestérol et le 7-F3-O-tertbutyloxycarbonylcholestérol.
12. 12. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 8 à 11 qui est une forme soluble pharmaceutiquement acceptable.
13. 13. Composition pharmaceutique selon la revendication 12, qui est une solution alcoolique d'au moins un composé de formule (I), ou une solution contenant au 25 moins un composé de formule(I) dans un solvant organique et au moins un agent tensioactif.
14. 14. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, qui est une préparation liposomale comprenant au moins un composé de formule (I).
15. 15. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, qui est adaptée à une administration par voie orale ou sub-linguale.
16. 16. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, dans laquelle ledit composé de formule (I) est le seul principe actif ou est présent en association avec un autre principe actif.