RU2803241C2 - КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ 7β-ГИДРОКСИХОЛЕСТЕРИН И ЛИПИДНЫЙ НОСИТЕЛЬ, И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ В ЛЕЧЕНИИ НЕОПЛАСТИЧЕСКИХ ПАТОЛОГИЙ - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к области медицины и раскрывает композицию, содержащую, по меньшей мере, одно производное 7β-гидроксихолестерина и липидный носитель, причем указанный липидный носитель включает растительное масло или смесь растительных масел, за исключением липидного носителя, состоящего из из липидных везикул, сформированных из одного или нескольких липидных слоев, или состоящего из фосфолипидов в нелипосомальной форме, в которой производное 7β-гидроксихолестерина соответствует формуле (I), в которой: A представляет собой группу C(O)R₁, в которой R₁ представляет собой насыщенный гетероцикл, содержащий 5 членов и включающий 2 атома кислорода, замещенный, по меньшей мере, одним линейным или разветвленным C₁-C₆ алкилом; B представляет собой ацильную группу, в которой алкильная группа представляет собой С₁-С₆. Также группа изобретений относится к фармацевтической композиции для лечения мультиформной глиобластомы и к способу получения композиции. Техническим результатом группы изобретений является преодоление препятствия гемато-опухолевого барьера (BTB), для достижения опухоли, расположенной в головном мозге, при использовании композиции, содержащей производные 7β-гидроксихолестерола формулы (I) в липидном носителе, содержащем масло или смесь масел. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 8 пр.

Description

Изобретение относится к композиции, содержащей производное 7-бета-гидроксихолестерина и липидный носитель, к способу ее получения и применению в лечении неопластических патологий, в частности мультиформной глиобластомы.

Указанный липидный носитель может содержать масло или смесь масел, преимущественно растительное масло или смесь растительных масел.

В частности, изобретение относится к композиции, содержащей производное 7-бета-гидроксихолестерина и липидный носитель, за исключением липидного носителя, состоящего из везикул, образованных из одного или нескольких липидных слоев, таких как, например, везикулы липосомного или мицеллярного типа.

Предпочтительно указанная композиция находится в жидкой форме и может вводиться перорально.

В частности, указанное производное 7-бета-гидроксихолестерина находится в растворе в указанном липидном носителе.

В настоящем описании “7-бета-гидроксихолестерин” или “7β-гидроксихолестерин” будут использоваться равным образом.

Мультиформная глиобластома (GBM), или астроцитома IV степени, представляет собой опухоль головного мозга, характеризующуюся в основном трансформацией глиальных клеток, которые включают астроциты, в злокачественные клетки.

Несмотря на значительные научные и терапевтические достижения в онкологии, например, в области иммунотерапии и нанотехнологий, GBM по-прежнему остается неизлечимой злокачественной опухолью. При наиболее благоприятном стечении обстоятельств, исследователи и врачи удовлетворены в случае, когда средняя выживаемость пациентов может быть продлена максимум на пятнадцать месяцев.

Основными проблемами при лечении GBM являются: (а) рецидив, обусловленный стволовыми клетками. Фактически, когда существующие методы лечения позволяют полностью или частично устранить опухоль, стволовые клетки часто несут ответственность за рецидив опухоли; (b) молекулы, используемые в химиотерапии, с трудом пересекают гемато-опухолевый барьер (BTB), и, соответственно, небольшие количества анти-GBM средства достигают участок опухоли. Использование мини-насосов (Alzet®), резервуаров (Mamiya®) или носителей (Gliadel®), имплантированных в опухоль GBM, с целью обойти проблему, создаваемую BTB, существенно не повышают эффективность химиотерапии. В настоящее время влияние облучения головного мозга ультразвуком, с целью сделать BTB податливый, на эффективность химиотерапии изучается на животных.

В химиотерапии одним из ведущих методов лечения является комбинированная терапия, которая состоит из введения Авастина® (ингибирование связывания VEGF с его рецепторами) и иринотекана® (ингибитора топоизомеразы I). В настоящее время тройная терапия типа PVC (Прокарбазин, ДНК-алкилирующий агент; Винкристин, ингибирование полимеризации микротрубочек; Ломустин (CCNU), неспецифический алкилирующий агент) является в значительной степени спорной. Темозоломид, алкилирующий агент гуанина в сочетании с лучевой терапией демонстрирует увеличение средней выживаемости пациентов с гиперметилированной ДНК (протокол Ступпа (Stupp)) на 2-3 месяца. Клинические исследования с использованием подхода к “полям для лечения опухолей” (Tumor Treating Fields (TTF)), в качестве дополнения к протоколу Ступпа, продолжаются. Продолжаются клинические исследования (фаза III) циленгитида (ингибирование некоторых рецепторов интегрина) и талампанела (блокирование глутаматных каналов типа AMPA).

Кроме того, химиотерапия, демонстрирующая эффективность в отношении других видов злокачественной опухоли, за исключением GBM, не повышает медианную выживаемость пациентов с GBM. Можно указать, например, блеомицин (вводимый при лимфоме Ходжкина), дималеат афатиниба и цисплатин (вводимый при немелкоклеточном раке легкого) и циклофосфамид (вводимый при раке молочной железы).

В заявке WO2013/168096 описано семейство производных 7β-гидроксихолестерина, демонстрирующих противоопухолевую эффективность в отношении злокачественных клеток человека in vitro, включая GBM, в частности, в форме липосом или в форме этанолового раствора. В частности, соединение, полученное в примере 6 настоящей заявки (называемое “соединение BIM2b” в примерах настоящей заявки), показало активность in vitro в линии GBM человека, линии U87-MG (U 87).

Таким образом, существует потребность в препарате, позволяющем указанному производному 7β-гидроксихолестерина, то есть молекуле, обладающей терапевтической активностью, преодолевать препятствие - гемато-опухолевый барьер (BTB), с целью достижения, в частности, опухоли, расположенной в головном мозге, при этом содержащем достаточное количество этой терапевтической молекулы.

Также требуется препарат, который обеспечивает легкое введение, предпочтительно пероральным путем, и который не вызывает токсических эффектов в процессе лечения, продолжительность которого может достигать нескольких недель или даже нескольких месяцев, принимая во внимание тяжесть состояния здоровья пациентов.

Стероидные соединения, например стероидные гормоны, минералокортикоиды и глюкокортикоиды, лишены боковой цепи, которая является частью холестерина и оксистеринового семейства. Кроме того, в некоторых стероидных соединениях присутствуют кетоновые функциональные группы в сочетании со функциональными группами спирта и ароматическими кольцами, которые не относятся к холестерину и наиболее распространенным оксистеринам.

Соответственно, стероидные соединения обычно легче растворяются в маслах, чем производные холестерина и 7β-гидроксихолестерина, в частности соединения указанной ниже формулы (I), по следующим причинам:

- стерические затруднения стероидных соединений меньше, чем у холестерина и производных 7β-гидроксихолестерина, указанных выше,

- стероидные соединения имеют больше химических функциональных групп и колец с делокализованными электронами, чем производные холестерина и 7β-гидроксихолестерина, и

- химические функциональные группы и циклические структуры с полярными характеристиками, обнаруженные в стероидных соединениях, обеспечивают связывание с кислотными функциональными группами, спиртами, двойными связями и определенными кольцами (спинастерин, шоттенол), присутствующими в масле, и, следовательно, лучше растворяются в масле, чем холестерин и производные 7β-гидроксихолестерина представленной ниже формулы (I).

В настоящее время было обнаружено, что препарат, объединяющий производное 7β-гидроксихолестерина и липидный носитель, за исключением липидного носителя, состоящего из липидных везикул, сформированных из одного или нескольких липидных слоев, обеспечивает этому производному стерола пересечение BTB, а также получение замечательной анти-GBM активности in vivo у животных.

Предпочтительно указанный препарат объединяет производное 7β-гидроксихолестерина и липидный носитель, за исключением липидного носителя, состоящего из липидных везикул, образованных одним или несколькими липидными слоями, или состоящего, по меньшей мере, из одного фосфолипида в нелипосомальной форме.

Предпочтительно указанное производное 7β-гидроксихолестерина находится в растворе в липидном носителе по изобретению.

Получение сочетания этих свойств, то есть пересечение BTB, введение активного продукта в достаточном количестве, отсутствие токсичности и получение терапевтического эффекта in vivo, особенно труднодостижимо, тем более в области неопластических патологий, причем пересечение BTB само по себе является серьезным препятствием для эффективности активного продукта.

Согласно изобретению, указанный липидный носитель представляет собой, в частности, фармацевтически приемлемый липидный носитель.

В частности, указанный липидный носитель включает насыщенные и/или мононенасыщенные и/или полиненасыщенные жирные кислоты или их смеси, в частности, в форме моно-, ди- или триглицеридов, или их смесей.

Под “липидными везикулами, образованными одним или несколькими липидными слоями” подразумевается липидная везикула, содержащая или состоящая из одного или нескольких липидных слоев, например, везикулы липосомного или мицеллярного типа.

Предпочтительно, липидный носитель по изобретению содержит, по меньшей мере, один липид, который не является фосфолипидом, причем указанный фосфолипид находится в липосомальной или нелипосомальной форме.

Предпочтительно, также было обнаружено, что этот препарат стабилен при значении pH, составляющем около 1,5 (pH желудочного пищеварения у человека) и при значении pH около 8,5-10 (pH пищеварения на уровне зоны Фатера у человека), что в частности, необходимо для обеспечения достижения активным соединением места действия, в контексте введения пероральным способом.

Таким образом, изобретение относится, в соответствии с первым аспектом, к композиции, содержащей, по меньшей мере, одно производное 7β-гидроксихолестерина и липидный носитель, за исключением липидного носителя, состоящего из липидных везикул, образованных одним или несколькими липидными слоями, или состоящих из фосфолипидов в нелипосомальной форме, в которой указанное производное 7β-гидроксихолестерина соответствует формуле (I)

(I)

в которой:

- А представляет

группу -C(O)R₁, в которой R₁ представляет собой насыщенный гетероцикл, содержащий от 5 до 14 членов и включающий 1 или 2 гетероатома, незамещенный или замещенный, по меньшей мере, одним линейным или разветвленным C₁-C₆ алкилом или группой, выбранной из OR, NRR', NHR и SR, где R и R', независимо, представляют собой водород, линейный или разветвленный C₁-C₁₂, предпочтительно C₁-C₆, алкил или незамещенный арил;

или группу -(R₂)_n-, в которой R₂ представляет собой аминокислотный остаток, связанный своим C-терминальным концом, и n=от 1 до 3, все R₂ являются идентичными или различными, в которой N-терминальный конец указанной амино кислоты может быть замещен группой -C(O)R₃, в которой R₃ представляет собой моно- или полициклическую C₆-C₁₄ арилалкильную группу; моно- или полициклическую C₅-C₁₄ гетероарилалкильную группу, которая может содержать один или несколько гетероатомов, которые могут быть одинаковыми или разными; моно- или полициклическую C₆-C₁₄ арилалкилокси группу или моно- или полициклическую C₅-C₁₄ гетероарилалкилокси группу, которая может содержать один или несколько гетероатомов, которые могут быть идентичными или различными,

- B представляет собой группу -C(O)R₄, в которой R₄ представляет собой линейный или разветвленный C₁-C₁₂, предпочтительно C₁-C₆, алкил, незамещенный или замещенный группой, выбранной из OR, NRR', NHR и SR, как определено выше; арильную группу, незамещенную или замещенную группой, выбранной из OR, NRR', NHR и SR, как определено выше; или R₄ представляет собой OR₅, в котором R₅ представляет собой линейный или разветвленный C₁-C₁₂, предпочтительно C₁-C₆, алкил.

Алкильная группа обозначает линейную или разветвленную C₁-C₁₂ группу, такую как метильная, этильная, пропильная, изопропильная, бутильная, изобутильная, втор-бутильная, трет-бутильная, пентильная, изопентильная, втор-пентильная, трет-пентильная, неопентильная, гексильная, изогексильная, втор-гексильная, трет-гексильная, гептильная, октильная, нонильная, децильная, ундецильная или додецильная группы, причем предпочтительными являются линейные или разветвленные C₁-C₆ алкильные группы.

Арильная группа обозначает ненасыщенную моноциклическую или полициклическую карбоциклическую C₆-C₁₄ группу, такую как фенильная, нафтильная, инденильная, антраценильная группы и, более конкретно, фенильная группа.

Под “гетероатомом” подразумевается атом кислорода, азота или серы.

Предпочтительными аминокислотными остатками являются, например, метионильные, глицинильные или аланильные звенья.

Получение соединений формулы (I) описано в заявках EP2666382 и WO2013/168096.

Термин “включающий”, в значении настоящего описания, можно понимать как охватывающий значения “содержащий”, “составленный из” или “состоящий из”.

“Состоит из” или “состоящий из”, в значении настоящего описания, исключает наличие других признаков, кроме следующих за указанной формулировкой.

Предпочтительно, указанное производное 7β-гидроксихолестерина находится в растворе в указанном липидном носителе.

Предпочтительно, липидный носитель включает масло или смесь масел, предпочтительно растительное масло или смесь растительных масел.

В соответствии с дополнительным аспектом, изобретение относится к композиции, содержащей, по меньшей мере, одно производное 7β-гидроксихолестерина и липидный носитель, где указанный липидный носитель содержит масло или смесь масел, при этом указанное производное 7β-гидроксихолестерина соответствует формуле (I)

(I)

В которой:

- А представляет собой

группу -C(O)R₁, в которой R₁ представляет собой насыщенный гетероцикл, содержащий от 5 до 14 членов и включающий 1 или 2 гетероатома, незамещенный или замещенный, по меньшей мере, одним линейным или разветвленным C₁-C₆ алкилом или группой, выбранной из OR, NRR', NHR и SR, где R и R', независимо, представляют собой водород, линейный или разветвленный C₁-C₁₂, предпочтительно C₁-C₆, алкил или незамещенный арил;

или -(R₂)_n- группу, в которой R₂ представляет собой аминокислотный остаток, связанный своим C-терминальным концом и n=от 1 до 3, все R₂ являются идентичными или различными, в которой N-терминальный конец указанной амино кислоты может быть замещен группой -C(O)R₃, в которой R₃ представляет собой моно- или полициклическую C₆-C₁₄ арилалкильную группу; моно- или полициклическую C₅-C₁₄ гетероарилалкильную группу, которая может содержать один или несколько гетероатомов, которые могут быть идентичными или различными; моно- или полициклическую C₆-C₁₄ арилалкилокси группу или моно- или полициклическую C₅-C₁₄ гетероарилалкилокси группу, которая может содержать один или несколько гетероатомов, которые могут быть идентичными или различными,

- B представляет собой группу -C(O)R₄, в которой R₄ представляет собой линейный или разветвленный C₁-C₁₂, предпочтительно C₁-C₆, алкил, незамещенный или замещенный группой, выбранной из OR, NRR', NHR и SR, как определено выше; арильную группу, незамещенную или замещенную группой, выбранной из OR, NRR', NHR и SR, как определено выше; или R₄ представляет собой OR₅, в котором R₅ представляет собой линейный или разветвленный C₁-C₁₂ алкил, предпочтительно C₁-C₆ алкил.

В частности, указанный липидный носитель состоит из масла или смеси масел, предпочтительно растительного масла или смеси растительных масел.

В частности, указанное производное 7-бета-гидроксихолестерина находится в растворе в указанном масле или смеси масел, предпочтительно в растительном масле или смеси растительных масел, предпочтительно полностью растворено в указанном масле или смеси масел, предпочтительно в указанном растительном масле или смеси растительных масел. масла.

Под “растительным маслом” подразумевается жирное вещество, экстрагированное из масличного растения, то есть из некоторых частей растения, таких как семена, орехи или фрукты, которые содержат липиды, в частности пищевое масло.

Растительное масло содержит насыщенные, мононенасыщенные и/или полиненасыщенные жирные кислоты растительного происхождения, которые присутствуют в основном в форме ацилглицеринов, также называемых глицеридами (сложные эфиры глицерина и жирных кислот). Указанные ацилглицерины являются основными составляющими масла, в частности, в количестве, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% указанного растительного масла. Указанные ацилглицерины могут быть в форме моно-, ди- или триглицеридов или их смесей.

Предпочтительно, указанные жирные кислоты растительного происхождения содержат от 4 до 24 атомов углерода (C₄ - C₂₄), в частности 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 22 атома углерода. Указанные жирные кислоты могут содержать, например, от одной до трех двойных связей в углеродной цепи.

Указанное растительное масло также может содержать, например, незначительные количества, например меньше, чем 20%, предпочтительно меньше, чем 10% или меньше, чем 5% соединений, не относящихся к ацилглицеринам, таких как, например, фосфолипиды, фитостерины, токоферолы, сфинголипиды, каротиноиды и др.

Указанное растительное масло может быть выбрано, например, из арганового масла, масла авокадо, льняного масла, подсолнечного масла, пальмового масла, масла капустной пальмы, кокосового масла, масла из виноградных косточек, масла черной горчицы, макового масла, масла семян ши, масла сладкого миндаля, соевого масла, арахисового масла, хлопкового масла, кунжутного масла, оливкового масла, кукурузного масла, масла какао, касторового масла, морингового масла (или бегенового масла), рапсового масла, масла аннато, масла зародышей пшеницы, сафлорового масла, масла грецкого ореха, масла фундука, сурепного масла или их смесей.

Предпочтительно использовать растительное масло с низким содержанием витамина Е, в частности аргановое масло.

Растительное масло также может быть получено синтетически путем синтеза, например, путем получения масел, имеющих аналогичный химический состав, например, получения масел, включая глицериды.

Использование масла или смеси масел, в частности растительного масла или смеси растительных масел, в качестве липидного носителя в композиции, позволяет получить композицию, которая может содержать достаточное количество соединения формулы (I) для обеспечение как преодоления гематоэнцефалического барьера (BTB), так и необходимой терапевтической активности.

Указанные масла, в частности растительные масла, предпочтительно используются в фармацевтически приемлемой форме.

Кроме того, препараты по изобретению, содержащие такой липидный носитель, обладают очень хорошей стабильностью при предельных значениях pH, например pH около 1,5 (pH пищеварения у человека) и при pH около 8,5-10 (pH переваривания на уровне зоны Фатера у человека), что позволяет сохранить активность соединения формулы (I). Такие свойства не были продемонстрированы в случае липидных везикул, образованных из одного или нескольких липидных слоев, таких как, например, везикулы липосомного или мицеллярного типа.

Предпочтительными соединениями формулы (I) являются те, в которых:

- A представляет собой группу -C(O)R₁, в которой R₁ представляет собой насыщенный гетероцикл, содержащий от 5 до 14 членов и включающий 1 или 2 гетероатома, незамещенных или замещенных, по меньшей мере, одним линейным или разветвленным C₁-C₆ алкилом;

- B представляет собой группу -C(O)R₄, в которой R₄ представляет собой линейный или разветвленный C₁-C₁₂, предпочтительно C₁-C₆, алкил, или R₄ представляет собой OR₅, в котором R₅ представляет собой линейный или разветвленный C₁-C₁₂, предпочтительно C₁-C₆, алкил.

В соответствии с предпочтительным аспектом, R₁ представляет собой насыщенный гетероцикл, содержащий 5 членов и включающий 2 атома кислорода, замещенный, по меньшей мере, одним линейным или разветвленным C₁-C₆ алкилом, в частности метильной группой. В частности, R₁ представляет собой 2,2-диметил-1,3-диоксолановую группу.

Предпочтительно, R₄ представляет собой линейный или разветвленный C₁-C₆ алкил, в частности метильную группу.

В соответствии с предпочтительным аспектом, B представляет собой ацильную группу, причем алкильная группа представляет собой C₁-C₆, в частности ацетильную или алкоксикарбонильную группу, в которой алкильная группа представляет собой C₁-C₆, в частности трет-бутоксикарбонильную группу.

Другими предпочтительными соединениями формулы (I) являются соединения, в которых:

- A представляет собой группу -(R₂)_n-, в которой R₂ представляет собой аминокислотный остаток и n=2; или

- A представляет собой -(R₂)_n- группу, в которой R₂ представляет собой аминокислотный остаток, n=2, и N-терминальный конец указанной аминокислоты замещен арилалкоксикарбонильной группой, в частности бензилоксикарбонилом; или

- A представляет собой аланильный радикал, связанный с глицинильным радикалом, необязательно замещенный на своем N-терминальном конце арилалкоксикарбонильной группой, в частности бензилоксикарбонилом; или

- A представляет собой метионильный радикал, связанный с глицинильным радикалом, необязательно замещенный на своем N-терминальном конце арилалкоксикарбонильной группой, в частности бензилоксикарбонилом, и

- B имеет значения, указанные выше, в своих общих или предпочтительных определениях.

Предпочтительными соединениями формулы (I) являются следующие:

- 7-((трет-бутоксикарбонил)окси)-10,13-диметил-17-(6-метилгептан-2-ил)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1H-циклопента[a]фенантрен-3-ил 2-(2-(((бензилокси)карбонил)амино)ацетамидо)пропионат, также получивший упрощенное название “3-бензилоксикарбонил- глицинил-аланил-7-β-O-трет-бутилоксикарбонилхолестерин” или соединение BIM1a;

- 7-ацетокси-10,13-диметил-17-(6-метилгептан-2-ил)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1H-циклопента[a]фенантрен-3-ил 2-(2-(((бензилокси)карбонил)амино)ацетамидо)пропионат, также получивший упрощенное название “3-бензилоксикарбонил-глицинил-аланил-7-β-О-ацетил-холестерин” или соединение BIM1b;

- 7-((трет-бутоксикарбонил)окси)-10,13-диметил-17-(6-метилгептан-2-ил)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1H-циклопента[a]фенантрен-3-ил 2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбоксилат, также получивший упрощенное название “3-(S)-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбоксил-7-β-O-трет-бутилоксикарбонилхолестерин” или соединение BIM2a;

- 7-ацетокси-10,13-диметил-17-(6-метилгептан-2-ил)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1H-циклопента[a]фенантрен-3-ил 2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбоксилат, также получивший упрощенное название “3-(S)-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбоксил-7-β-O-ацетилхолестерин” или “холест-5-ен-3,7-диол, 7-ацетат 3-[[(4S)-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-ил]карбоксилат], (3β,7β)” или соединение BIM2b.

Эти соединения формулы (I) описаны, соответственно, в примерах 3, 4, 5 и 6 заявки WO2013/168096.

Соединение формулы (I), особенно предпочтительное для целей изобретения, представляет собой указанное выше “соединение BIM2b”, то есть соединение формулы (I), в которой A представляет собой группу -C(O)R₁, в которой R₁ представляет собой 2,2-диметил-1,3-диоксолановую группу, и B представляет собой ацетильную группу.

Это соединение соответствует формуле

Соединение BIM1a представляет собой соединение формулы (I), в которой A представляет собой 3-бензилоксикарбонил-глицинил-аланильную группу, и B представляет собой трет-бутоксикарбонильную группу.

Соединение BIM1b представляет собой соединение формулы (I), в которой A представляет собой 3-бензилоксикарбонил-глицинилал-анильную группу, и B представляет собой ацетильную группу.

Соединение BIM2a представляет собой соединение формулы (I), в которой A представляет собой группу -C(O)R₁, в которой R₁ представляет собой 2,2-диметил-1,3-диоксолановую группу, и B представляет собой трет-бутоксикарбонильную группу.

В настоящем описании, если не указано иное, включены указанные диапазоны значений.

Содержание соединения формулы (I) в композиции по изобретению предпочтительно составляет от 0,1 до 3,5% (мас./об.) от общего объема композиции, предпочтительно 3%. Предпочтительно указанная композиция содержит соединение формулы (I) в количестве от 1 до 35 мг/мл, предпочтительно 30 мг/мл.

Содержание липидного носителя, в частности растительного масла, в композиции по изобретению предпочтительно составляет от 90 до 99%, в частности от 95 до 99% (об./об.) от общего объема композиции.

Композиции по изобретению могут также содержать, по меньшей мере, один обычное вспомогательное вещество или добавку в случае масляной композиции, например сорастворитель, такой как, например, спирт, или антиоксидант.

Указанный сорастворитель, такой как, например, спирт, может присутствовать в композиции, например, в количестве от 0 до 5%, в частности от 1 до 5% (об./об.) от общего объема композиции.

В качестве спирта предпочтительно используется спирт формулы R-OH, в которой R представляет собой C₂-C₆ углеводородную группу, предпочтительно этанол.

Антиоксидант может быть выбран из соединений, которые обычно используются в данной области, например:

- гидроксилированное вещество, такое как лимонная кислота и ее производные, в частности цитрат натрия, цитрат кальция или цитрат калия; аскорбиновая кислота и ее производные, в частности изоаскорбиновая кислота, аскорбат натрия или аскорбат кальция;

- производное тиола, такое как, например, цистеин, ацетилцистеин, дитиотреитол;

- этиленненасыщенные вещества, такие как сорбиновая кислота и так далее.

Указанный антиоксидант может присутствовать в композиции, например, в количестве от 0,005 до 0,020% (мас./об.), в частности, от 0,005 до 0,015% (мас./об.), предпочтительно 0,01%.

Предпочтительный антиоксидант выбран из аскорбиновой кислоты и ее производных.

Предпочтительная композиция по изобретению содержит 3% (мас./об.) производного 7β-гидроксихолестерина формулы (I), в частности, одного из предпочтительных указанных выше соединений формулы (I), и более конкретно соединения BIM2b, 0,01% безводной лимонной кислоты (мас./об.) и 1% этанола (об./об.) в аргановом масле. Указанная композиция также может не содержать этанола.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей описанную выше композицию.

Указанная фармацевтическая композиция может также содержать другой активный ингредиент, растворимый в липидной среде, такой как, например, противовоспалительное средство, в частности кортикоид, или противоэпилептическое средство.

Фармацевтические композиции по изобретению могут предпочтительно находиться в форме, подходящей для перорального введения, в частности в жидкой форме, такой как, например, пероральный раствор, пероральная суспензия, капли и т.д., или в инкапсулированной форме, такой как капсула, в которой заключен указанный жидкая композиция, в частности твердая или мягкая капсула на основе желатина.

Изобретение также относится к способу получения композиции, содержащей производное 7β-гидроксихолестерина и липидный носитель, как описано выше, включающему следующие стадии:

- получение смеси, содержащей производное 7β-гидроксихолестерина формулы (I), описанное выше, липидный носитель и сорастворитель,

- необязательно добавление антиоксиданта, и

- при необходимости, упаривание сорастворителя.

Липидный носитель, антиоксидант и сорастворитель определены выше. Вышеуказанные предпочтительные аспекты также применимы к способу по изобретению.

В частности, указанный липидный носитель состоит из масла или смеси масел, предпочтительно растительного масла или смеси растительных масел, в частности арганового масла.

Указанные масла, в частности растительные масла, предпочтительно используются в фармацевтически приемлемой форме.

Предпочтительными условиями указанного способа являются следующие:

- смесь получают при температуре порядка 22-35°C, предпочтительно 33°C;

- содержание соединения формулы (I) в смеси составляет от 0,1 до 3,5% (мас./об.);

- начальное содержание сорастворителя, предпочтительно этанола, в смеси составляет от 1 до 5%, предпочтительно 2,5% (об./об.);

- содержание антиоксиданта, предпочтительно лимонной кислоты и ее производных, в смеси составляет от 0,005 до 0,020% (масса/об.), в частности, от 0,005 до 0,15%, предпочтительно 0,01% (масса/об.).

Смесь, содержащая производное 7β-гидроксихолестерина формулы (I), липидный носитель и сорастворитель и необязательно антиоксидант, может быть смешана, например, с использованием роторного испарителя при перемешивании до растворения соединения формулы (I).

Смесь можно получить, например, путем смешивания производного 7β-гидроксихолестерина формулы (I) и липидного носителя с последующим добавлением сорастворителя и, необязательно, антиоксиданта.

Содержание сорастворителя и, в частности, спирта (в частности, этанола), полученного после упаривания, соответствует действующим правилам для фармацевтических форм (правила ICH Q3C(R6)).

Изобретение также относится к композиции, содержащей производное 7β-гидроксихолестерина формулы (I) и липидный носитель, определенный выше, для применения в лечении неопластической патологии, в частности, мультиформной глиобластомы.

Изобретение также относится к композиции, содержащей производное 7β-гидроксихолестерина формулы (I) и липидный носитель, определенный выше, для применения в лечении злокачественной гемопатии, в частности злокачественной гемопатии миелоидного типа.

Изобретение также относится к способу лечения неопластической патологии, в частности мультиформной глиобластомы, включающему введение эффективного количества композиции, содержащей производное 7β-гидроксихолестерина формулы (I) и липидный носитель, определенный выше, пациенту, нуждающемуся в указанном лечении.

Изобретение также относится к способу лечения злокачественного заболевания крови, в частности злокачественного заболевания крови миелоидного типа, включающему введение эффективного количества композиции, содержащей производное 7β-гидроксихолестерина формулы (I) и липидный носитель, определенный выше, пациенту, нуждающемуся в указанном лечении.

Изобретение также относится к фармацевтическому препарату, содержащей композицию, содержащую производное 7β-гидроксихолестерина формулы (I) и липидный носитель, определенный выше, для применения в лечении неопластической патологии, в частности, мультиформной глиобластомы, или в лечении злокачественного заболевания крови, в частности злокачественного заболевания крови миелоидного типа.

Укзанные выше Общие и предпочтительные аспекты, в частности для производного 7β-гидроксихолестерина формулы (I) и липидного носителя, также применимы к этим применениям и методам.

Вводимая доза может составлять, например, от 3 до 5 мг/кг в день с продолжительностью, например, от 84 до 105 дней. Однако доза может быть увеличена в зависимости от состояния пациента и стадии заболевания до 30 мг/кг/день, и продолжительность лечения может быть увеличена, например, до 2 месяцев.

Изобретение иллюстрируется примерами 1-2 (получение) и примерами 3-8 (результаты).

Метод солюбилизации BIM2b, подробно описанный в примерах 1 и 2, обеспечивал растворение BIM2b в маслах, в частности в аргановом масле. В предпочтительном аспекте, в диапазоне от 1 до 500 мл масла, условия добавления порошка BIM2b к маслу, смешивания системы BIM2b/масло и соотношение площадь поверхности/объем, при котором осуществлялось смешивание, привели к завершению солюбилизации порошка BIM2b в масле.

На фигуре 1 показана колоночная хроматография на силикагеле липидного экстракта из головного мозга здоровой мыши, обработанной масляным препаратом примера 2.

На фигуре 2 представлена колоночная хроматография на силикагеле липидного экстракта из головного мозга собаки с глиобластомой, обработанной масляным препаратом примера 2.

На фигуре 3 показан контроль стабильности масляного препарата примера 2 посредством ВЭТСХ после испытаний на устойчивость при экстремальных значениях pH.

На фигуре 4 показан полный регресс опухоли у собаки с глиобластомой, получавшей масляный препарат примера 2.

Используются следующие сокращения:

7β-ацетил-CH: 7β-ацетилхолестерин

7β-OHCH: 7β-гидроксихолестерин

APCI: Источник химической ионизации при атмосферном давлении

ТСХ: тонкослойная хроматография

CH: холестерин

CHCl₃: хлороформ

Соединение BIM2b: соединение 7-ацетокси-10,13-диметил-17-(6-метилгептан-2-ил)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1H-циклопента[а]фенантрен-3-ил 2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбоксилат, также называемый холест-5-ен-3,7-диол, 7-ацетат 3-[[(4S)-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-ил]карбоксилат], (3β,7β)

Соединение BIM2b PO: соединение BIM2b в форме масляного препарата примера 2 для перорального введения.

EtOH: этанол

Folch: CHCl₃:MetOH (2:1, об.:об.)

АО: аргановое масло

HCl: соляная кислота

GBM: мультиформная глиобластома

ВЭТСХ: высокоэффективная тонкослойная хроматография.

KCl: хлорид калия

MetOH: метанол

NaOH: гидроксид натрия

p: масса

MW: молекулярная масса

RT: температура окружающей среды

СВЭЖХ-МС: сверхвысокопроизводительная жидкостная хроматография-масс-спектрометрия

Об.: объем

A/ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ МОЛЕКУЛЫ, НОСИТЕЛИ И АНАЛИЗЫ

1) Действующее вещество

Холест-5-ен-3,7-диол, 7-ацетат 3-[[(4S)-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-ил]карбоксилат], (3β,7β) синтезировали с качеством в соответствии с НЛП/НПП, как описано в заявке WO2013/168096 (получен в форме порошка, как описано в примере 6).

Эта молекула, формула которой приведена ниже, в экспериментальной части называется BIM2b.

Молекулярная масса: 572,83

2) Продукты деградации и основные метаболиты активного вещества

а) 7β-Ацетилхолестерин синтезировали способом, описанным в заявке WO2013/168096 (соединение 1.4).

Эта молекула, формула которой приведена ниже, в экспериментальной части обозначается как 7β-ацетил-CH.

Молекулярная масса: 444

b) 7-гидроксихолестерин был предоставлен фирмой SIGMA (ссылка 700035P).

Эта молекула, формула которой приведена ниже, в экспериментальной части обозначается как 7β-OHCH.

Молекулярная масса: 402,65

c) Холестерин был предоставлен фирмой SIGMA (ссылка C8503).

Эта молекула, формула которой приведена ниже, в экспериментальной части обозначается как СН.

Молекулярная масса: 386,65

d) Выбранным носителем является аргановое масло (Olsana, Франция), который в экспериментальной части обозначается как АО.

B) МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

I) МАТЕРИАЛЫ

I.1) Хроматография

I.1.1) Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ) и адсорбционная хроматография на обычной колонке с силикагелем.

- Многопластинчатые резервуары для хроматографии 20 × 20 см (артикул 552-0359)

- Хроматографические колонки со стеклянной фриттой (полезная длина: 300 мм; внутренний диаметр=11 мм; кнопочный кран из фторопласта 1,5 мм) (Analytic Lab, образец LE-AT1811)

- Порошкообразный силикагель 60 (0,063-0,200 мм) (образец 1.07734.1000)

- Пластина для ВЭТСХ: силикагель 60 F254 с концентрирующей зоной (2,5 см) на алюминиевой фольге (VWR, образец 1055830001).

- Небулайзер и колба Эрленмейера 100 мл (Witeg, образец 2147100, NS 14.5/23)

- Нагревательная плита (Stuart SB162)

- Трубка из боросиликатного стекла

- Сканер (Epson Perfection V370 Photo)

- Микрокапилляры Drummond 10 мкл (Sigma, образец P1924)

I.1.2) Хроматография на адсорбционном картридже или обращенно-фазовая хроматография

- SEP PAK Classic Silica (Waters, образец WAT051900)

- SEP PAK Plus C18 (Waters, образец WAT023635)

I.1.3) Сверхвысокопроизводительная жидкостная хроматография - масс-спектрометрия (СВЭЖХ-МС)

Количественную оценку исследуемых молекул (BIM2b и его метаболитов) проводили с использованием системы Nexera X2 СВЭЖХ (Shimadzu), оснащенной колонкой Kinetex EVO C18 (размер частиц: 1,9 мкм; размеры колонки: 100 × 2,1 мм, Phenomenex). APCI-детекцию выполняли с помощью квадруполя (LCMS 8050, Shimadzu).

I.2) Препарат BIM2b для перорального введения (BIM2b PO)

- Аналитические весы Sartorius Quintix (Sartorius, образец QUINTIX 124-1S)

- Пробирки из боросиликатного стекла 5 мл 12×75 мм (Kimble, образец 73500-1275)

- Пробирки из боросиликатного стекла объемом 25 мл Pyrex 18×180 мм (Dutscher, образец 090482)

- Лабораторный стакан объемом 5 мл

- Реакционная колба объемом 1 л с притертой пробкой (с внутренним гнездом, 29/32NS) (VWR, образец 201-1359)

- Роторный испаритель R-215 Buchi

- Фазово-контрастный инвертированный световой микроскоп Eclipse TS-100F, тринокулярный микроскоп Nikon (Dutscher, артикул: 094501), соединенный с цифровой камерой с C-креплением (NIKON, DCMC510)

I.3) Количественная оценка исследуемых молекул (BIM2b и его метаболитов): гомогенизация головного мозга диких мышей и опухолей, полученных после аутопсии головного мозга собак с GBM.

- Гомогенизатор (Ika eurostar 20 digital)

- Измельчитель ткани Potter-Elvehjem (емкость: 4 мл; длина: 120 мм; внешний диаметр: 11 мм) (VWR, образец 432-0200)

- Сферическая делительная воронка, 250 мл с краном из ПТФЭ (Dutscher, образец 479036)

- Разделительная воронка, 50 мл с клапаном из ПТФЭ (Dutscher, образец 084118)

I.4) Органические растворители и другие расходные материалы

- Силикагель для колоночной хроматографии, силикагель 60 (0,063-0,200 мм) (Merck, образец 1.07734.1000)

- CHCl₃, Степень чистоты для ВЭЖХ (Sigma, образец 528730)

- Чистый EtOH (Sigma, образец SI-32221)

- MetOH Сhromasolv для ВЭЖХ ≥ 99,9% (SIGMA, образец 34860)

- N-гексан для ВЭЖХ (Fisher Scientific, образец 1070361)

- Диэтилоксид, стабилизированный для ВЭЖХ (Analytic Lab, образец FI-10254914)

- Ацетон (Sigma-Aldrich, образец 322201)

- Ортофосфорная кислота 99% (Analytic Lab, образец U1B203102H)

- Ацетат меди 98% (Sigma, образец 326755 /

- Бутилированный гидрокситолуол (BHT; Sigma, W218405, образец W218405)

- Соляная кислота мин. 37% (HCl, Thermofisher, образец M0643H)

- Сода (NaOH/Thermofisher, образец 04815)

- Карбонат аммония (Sigma, образец 207861)

- Хлорид калия (Fisher Scientific, образец W2752)

- Формол или раствор формальдегида (36,5-38% в воде) (Sigma, образец F8775)

- Ацетат аммония (Merck, образец C138315)

II) Методы

II.1) ВЭТСХ-хроматография

Этот аналитический метод использовали для количественной оценки BIM2b, продуктов его деградации и его основных метаболитов в лекарственном средстве (BIM2b PO) и в головном мозге диких мышей или опухолях GBM от собак, которые имели эту патологию. Порог обнаружения BIM2b и продуктов его деградации (7β-ацетил-CH и 7β-OHCH), определенный экспериментально, составляет 0,5 мкг.

Этот метод подтверждали с помощью СВЭЖХ-МС.

- Обработка пластин ВЭТСХ

Камеры для многопластинчатой хроматографии насыщали элюентной системой, смесью CHCl₃:MetOH (1:1; об.:об.), в течение 1 часа. ВЭТСХ пластины размещали в камерах; когда фронт элюента достигал 1,5-2 см от верхнего края планшетов, элюирование прекращали. Затем сушили при комнатной температуре в течение 1 ч. Потом эти пластины активировали при 110°C в течение 15 мин. После остывания их заворачивали в алюминиевую фольгу и хранили, предохраняя от воздействия света и влаги.

- Нанесение образцов на пластины ВЭТСХ и хроматографические условия

Все образцы солюбилизировали в ацетоне и помещали в капилляры Drummond (10 мкл) в концентрирующую зону ВЭТСХ пластин. При использовании стандартных диапазонов BIM2b, 7β-ацетил-CH и 7β-OHCH, их получали из исходных этанольных растворов с концентрацией 0,1 мг/мл для каждой контрольной молекулы.

Хроматографическое разделение проводили в две стадии: стадия предварительного элюирования (3 раза) смесью CHCl₃:MetOH (2:1, об./об.) в качестве элюентной системы для концентрирующей зоны, за которой следует стадия разделения (3 раза) для зоны разделения, осуществляемая смесью гексан:простой эфир (3:7, об./об.) в качестве элюентной системы для идентификации и количественного определения стеринов.

Перед хроматографией, камеры насыщали соответствующими элюентными системами для концентрирования и для разделения.

Между каждым элюированием пластины сушили в струе холодного воздуха из фена для сушки волос.

- Визуализация и количественный анализ оксистеринов

Оксистерины визуализировали методом Макала (1). Реагент Макала состоит из 8% (мас./об.) водного раствора ортофосфорной кислоты и 3% (мас./об.) ацетата меди. После хроматографии, ВЭТСХ пластины сушили, опрыскивали реактивом Макала и нагревали на нагревательной плите до 140°С. Оксистерины приобретали цвет берлинской лазури, а холестерин становился розовато-лиловыми. Цветные пятна сканировали, а затем осуществляли количественный анализ посредством Image J (версия 1,50 г).

Количественный анализ оксистеринов и холестерина методом ВЭТСХ подтверждали с помощью СВЭЖХ - МС.

II.2) СВЭЖХ - МС

Экспериментальные условия для элюирования и детекции:

- Количественный анализ BIM2b и 7β-OHCH

Изократическое элюирование осуществляли с подвижной фазой, состоящей из MetOH, содержащей 5 мМ ацетата аммония.

- Количественный анализ 7β-ацетил-CH:

Элюирование осуществляли с линейным бинарным градиентом. Элюент A представлял собой 0,1% (об.:об.) муравьиную кислоту, а элюент B представлял собой MetOH, содержащий 0,1% муравьиной кислоты. Элюирование начинали смесью (об.:об.) 20% A и 80% B и заканчивали 100% элюента B; продолжительность градиента составляла 3 мин.

Объем инъекций составлял 10 мкл, и детекцию выполняли методом APCI в положительном режиме.

II.3) Экстракция и очистка BIM2b и продуктов его деградации

Помимо количественного анализа BIM2b, 7β-ацетил-CH и 7β-OHCH во время испытаний на стабильность BIM2b в составе BIM2b (BIM2b PO), когда образцы BIM2b PO наносили непосредственно на ВЭТСХ пластины, экстракция и очистка оксистеринов необходимы для количественной оценки этих молекул в BIM2b PO, подвергнутых воздействию экстремальных значений pH, в головном мозге диких мышей, получавших перорально через зонд BIM2 PO, или в опухолях GBM, полученных в результате аутопсии собаки с GBM, которые возникли спонтанно (субъект-собака с GBM), получавшей перорально BIM2b и выжившей в течение 8 месяцев (средняя выживаемость собаки с GBM составляет 2-3 месяца, несмотря на химиотерапевтическое лечение).

Оксистерины экстрагируются методом, рекомендованным Folch et al. (2). Экстракция осуществляется в разделительной воронке. Вкратце, экстракцию проводят смесью CHCl₃:MetOH (2:1, об.:об.; Folch); для этого метода отношение объема Folch к объему водного образца составляет 19. Промывка и диспергирование фазы посредством 0,2 объема органической фазы водного раствора, содержащего 0,74% KCl.

В случае экстракции оксистеринов из головного мозга здоровых мышей, получавших перорально BIM2b PO, или из опухоли GBM собаки, также получавшей перорально BIM2b PO, органическую фазу, промытую 0,74% KCl, промывают еще раз 0,4 объема смеси CHCl₃:MetOH:H₂O (3:48:47; об:об:об; верхняя фаза по методу Фолча). Затем высушенный остаток солюбилизируют в подходящем растворителе для экспериментального метода, который следует за стадией экстракции.

II.4) Образцы, требующие экстракции перед разделением, и количественный анализ оксистеринов.

- Исследование на устойчивость BIM2b PO при экстремальном кислом значении pH с последующей инкубацией при щелочном значении pH

Для этих исследований сначала BIM2b PO инкубировали в кислотном растворе при pH 1,5, а затем в основном растворе при pH 8,5. Эти 2 значения соответствуют физиологическим значениям pH пищеварения желудка и пищеварения на уровне ампулы Фатера у человека.

Водный раствор кислоты готовили из 1М и 0,1М исходных растворов HCl. Основной раствор представлял собой водный раствор карбоната аммония при 25 мМ.

Перед началом проведения эксперимента, первый лабораторный стакан, содержащий 4 мл кислотного раствора (pH 1,5), нагревали до 37°C; затем на поверхность раствора осторожно наносили 2 мл BIM2b PO. Реакционную смесь перемешивали посредством магнитной мешалки в течение 10 часов. Перемешивание прекращали и реакционную смесь оставляли на 2 часа для соответствующего преобразования маслянистой верхней фазы. В течение 2 ч, когда реакционную смесь оставляли отстаиваться, во втором лабораторном стакане готовили основной раствор (pH 8,5) и нагревали до 37°C. Образец объемом 1 мл отбирали из липидной фазы кислотного раствора и осторожно наносили на водную поверхность основного раствора. Перемешивание начинали в течение 10 ч инкубации. После прекращения перемешивания, всю смесь (BIM2b PO и основной раствор) подвергали экстракции по методу Фолча без повторной промывки органической фазы верхней фазой по методу Фолча.

- Экстракция и количественный анализ оксистеринов и их метаболитов из головного мозга здоровых мышей, получавших BIM2b PO (перорально)

Головной мозг мышей, высушенный и хранящийся в криопробирках при температуре 180°C в жидком азоте, оставляли для снижения температуры до температуры окружающей среды. Каждый головной мозг взвешивали и помещали в Potter; добавляли 4 мл 0,74% охлажденного KCl, и остальную часть процедуры проводили на льду. Каждый головной мозг измельчали 6 раз при 1000 об/мин, каждый цикл включал измельчения в течение 5 минут и паузу в течение 5 минут. Оксистерины экстрагировали в соответствии с процедурой Фолча, описанной выше (II.3.). Затем липидный остаток подвергали адсорбционной хроматографии на колонке с силикагелем.

Силикагель (8 г) готовили в 40 мл смеси гексан:эфир (диэтилоксид (3:7, об./об.)) и затем выливали в соответствующие колонки. Высота слоя силикагеля составляла 18 см, а его объем составлял 15 мл.

Подходящее количество экстракта головного мозга мыши растворяли в 1 мл первой элюентной системы и наносили на слой силикагеля. Элюирование происходило за 4 стадии для концентрирования фракций, содержащих оксистерины, и удаления, насколько это возможно, липидов, загрязняющих головной мозг мыши, в частности холестерин.

Элюирование происходит следующим образом:

1-е элюирование: гексан:простой эфир (3:7, об:об)

2-е элюирование: ацетон:EtOH (95:5, об:об).

3-е элюирование: ацетон:EtOH (93:7, об:об).

4-е элюирование: EtOH

Процедура элюирования описана на фигуре 1.

Группы фракций упаривали досуха, растворяли в ацетоне и соответствующие объемы подвергали ВЭТСХ хроматографии.

- Экстракция и количественный анализ BIM2b и его метаболитов из опухоли GBM у собаки, получавшей BIM2b PO (перорально)

Опухоль GBM получали путем аутопсии собаки с глиобластомой, получавшей перорально BIM2b PO и прожившей с хорошим качеством жизни в течение 8 месяцев. Аутопсию проводили через 21 день после прекращения лечения BIM2b PO. Опухоль фиксировали в формалине в основном для гистопатологического анализа, а оставшийся фрагмент анализировали для количественного анализа BIM2b.

На фрагментах головного мозга собак без GBM и на части фрагмента опухоли все проверки выполняли с целью продемонстрировать, что фиксация формалином не изменяет качество оксистеринов или выход при их экстракции методом Фолча.

Фрагменты головного мозга собак, хранящиеся по отдельности в криопробирках при температуре+4°C в ванне с формалином, сушили на бумаге Sopalin перед тем, как их взвесить и поместить в Potter. Также как и при экстракции мозга мышей, каждый фрагмент экстрагировали после добавления 4 мл охлажденного 0,74% KCl. Процедуры гомогенизации и экстракции аналогичны описанным для головного мозга мышей в части “Методы”.

Получали таким образом сухой липидный экстракт фрагмента опухоли собаки с GBM, который хроматографировали последовательно на картридже SEP PAK Classic Silica; затем на SEP PAK Plus C18 (с элюентом A=5 мМ ацетат аммония/вода высшей степени очистки и B=5 мМ ацетат аммония/MetOH). Процесс хроматографии на колонках SEP PAK показан на фиг.2.

С. Примеры получения и результаты

Пример 1: Испытания на липидных носителях

Испытываемые масла: аргановое масло, масло авокадо, оливковое масло, арахисовое масло и масло виноградных косточек. Испытания проводили в масштабе пробирки.

К 1 мл отобранного масла добавляли несколько раз различные количества BIM2b, от 1 до 35 мг, для достижения определенного количества. Контрольную пробирку осторожно перемешивали между каждым добавлением BIM2b.

Пробирки помещали в инкубатор при температуре 37°C на 24 часа. В течение первых 5 часов инкубации, пробирки доставали из инкубатора каждый час, чтобы их осторожно перемешивать, и снова помещали в инкубатор на ночь. На следующий день визуально проверяли внешний вид смеси масла и BIM2b для определения степени растворения порошка в масле. Когда невооруженный глазом определяли, что BIM2b полностью растворился в масле, проводили исследование посредством микроскопа для проверки наличия или отсутствия BIM2b в форме порошка или кристаллов.

Результаты показывают, что BIM2b полностью растворяется в масле авокадо, оливковом масле, арахисовом масле и масле виноградных косточек при концентрации 3 мг BIM2b/мл масла.

В аргановом масле (АО) BIM2b растворяется до концентрации 30 мг (52 мкмоль) BIM2b/мл AO.

Пример 2: Получение BIM2b PO

В колбу объемом 1 л, используемую в качестве производственной емкости, помещали 285 мл арганового масла (Olsana, France). Положение колбы соответствовало наклонному, и ее вручную поворачивали вокруг собственной оси для равномерного распределения масла по стенке колбы в соотношении площадь/объем: 1,6 см^-1 (вычисленный результат: 460 см²/285 см³). Сохраняя это положение, 9 г порошка BIM2b наносили на всю стенку, чтобы покрыть всю поверхность колбы. Затем добавляли 3 мл этанола, содержащего 30 мг лимонной кислоты (из исходного раствора при соотношении 10 мг лимонной кислоты/мл этанола); а затем 12 мл этанола (т.е. 5% этанола). Колбу под наклоном помещали на ротационный испаритель Buchi® R-215 с водяной баней при температуре 30°C и скорости вращения 15 об/мин на 2 часа. Затем, для упаривания этанола, оставляли упариваться на водяной бане при температуре 30°C в течение ночи без пробки.

Таким образом, получали 300 мл композиции, содержащей BIM2b в аргановом масле в концентрации 30 мг/мл.

Полученная таким образом композиция BIM2b PO, которая будет использоваться в приведенных ниже примерах, содержит 3% (масса/об.) BIM2b, 0,01% (масса/об.) безводной лимонной кислоты и 1% EtOH (об./об.) (после упаривания) в аргановом масле.

Количественный анализ BIM2b в BIM2b PO и продуктов его деградации, сразу после производства этой партии, показывает концентрацию 30 мг BIM2b/мл BIM2b PO без каких-либо продуктов деградации.

Исследование стабильности партий BIM2b PO, полученных этим методом, показывает в экспериментальных условиях присутствие 1% продуктов деградации (масса/об.) после хранения в течение 6 месяцев, и меньше, чем или равное 2% (масса/об.) после хранения той же партии в течение 12 месяцев.

Пример 3: Исследование устойчивости BIM2b PO при кислотном значении pH с последующей инкубацией при щелочном значении pH

Процедура исследования описана выше в части II) “Методы”.

После инкубации BIM2b PO последовательно в кислотном (pH 1,5) и основном (pH 8,5) растворах, сухой липидный экстракт растворяли в ацетоне. Вследствие нехватки места (4 дорожки при теоретических 15, 30, 40 и 60 мкг), стандартный диапазон не наносили.

Аналитические результаты ВЭТСХ, представленные на фиг. 3, показывают обнаружение простой полосы, полосы BIM2b, независимо от нанесенного количества, с коэффициентом удерживания (Rf) от 0,5 до 0,64. Значения Rf продуктов деградации 7β-ацетил-CH и 7β-OHCH (не видимы), определенные экспериментально, составляют 0,37 и 0,24 соответственно. Эти результаты показывают, что BIM2b PO устойчив в условиях экстремальных значений pH без деградации.

Пример 4: Исследование токсичности BIM2b PO на здоровых мышах

Композицию примера 2 вводили перорально (через зонд) дикие мыши в количестве 1,5 мг (50 мкл BIM2 PO) на одно животное, дважды в день, 5 дней из 7 с максимальной продолжительностью лечения 21 день. Параллельно контрольная группа диких мышей не получала лечение.

В группе лечения, 2-х мышей умерщвляли через 18 дней, и 3-х мышей умерщвляли через 21 день. В контрольной группе, 3-х мышей умерщвляли через 21 день.

Образцы внутренних органов (желудка, пищеварительного тракта, печени, почек, легких, сердца) погружали в 4% формальдегид на 72 часа и хранили при температуре 4°C, а затем заливали парафином. Образцы подвергались макроскопическому анализу до и после разбавления.

Гистологическое исследование внутренних органов, фиксированных формальдегидом, и токсикологические количественные анализы осуществляли на срезах, окрашенных гематоксилин-эозин-шафраном по 4-уровневой системе оценки, соответствующей номенклатуре (3).

Все срезы исследовали на предмет возможных признаков клеточного изменения, дегенерации, некроза, воспаления, фиброза и так далее.

Выводы являются следующими (по каждому органу):

- Желудок: ни у одной из обработанных мышей нет повреждений

- Тонкая кишка: минимальное воспаление лимфоплазмоцистической природы, которое интерпретируется как составляющая фонового шума. Отсутствуют значительные поражения.

- Толстая кишка: ни у одной из мышей нет повреждений.

- Печень: у обработанных мышей по сравнению с контрольными мышами наблюдалась тенденция к снижению цитоплазматического накопления и гепатоцеллюлярной гипертрофии. Это изменение оставалось очень рассеянным, и его нельзя с уверенностью отнести к лечению.

- Почки: не обнаружено значительных повреждений ни у одной из мышей.

- Легкие: минимальный гистиоцитоз и небольшое альвеолярное воспаление у одной из обработанных мышей, возможно, вызванное пероральным принудительным кормлением.

- Сердце: не обнаружено поражение ни у одной из мышей.

В итоге, результаты показывают, что молекула BIM2b не обладает какой-либо токсичностью. Введение BIM2b в указанной дозировке два раза в день, 5 раз в неделю, при отсутствии лечения в выходные дни, не вызывало нежелательных клинических эффектов. Аналогичным образом, исследованные биологические параметры не показали гепатотоксичность или нефротоксичность. Диабет и гиперхолестеринемия, которые можно было ожидать при приеме стероидов, не наблюдались.

Пример 5: Исследование переносимости BIM2b PO у здоровых собак

Композицию примера 2 вводили перорально 3 собакам породы бигль со средней массой 11 кг в количестве 15 мг (0,5 мл) дважды в день (утром после дневной еды и вечером во время голодания), 5 дней из 7 при продолжительности лечения 21 день.

Расчет вводимой дозы был основан на значении, указанном для введения, 3 мг/кг в день.

Полное клиническое обследование животных проводили ежедневно в рабочие дни со дня D0 по день D21: взвешивание, измерение ректальной температуры, общего состояния, аппетита. В выходные дни (период отдыха без введения) животные подвергались только простому наблюдению, чтобы убедиться, что их общее состояние и поведение были нормальными.

Образцы крови для клинического анализа крови (FBC) и биохимических анализов брали в начале и в конце лечения (в день D0 и D21). Все собаки получали лечение полностью. При обследовании собак побочных эффектов не наблюдали.

Результаты исследования являются следующими:

Поскольку использование стероидов может вызвать увеличение мссы, собак взвешивали каждый день лечения. Вопреки ожиданиям, потеря массы у всех собак составила около 4,5%.

Не обнаруживали повышение уровня холестерина и триглицеридов. И наоборот, было определено уменьшение количества этих молекул: в среднем -2,3% для холестерина, в среднем -30% для триглицеридов.

Использование стероидов также может быть источником развития диабета. На 21 день не наблюдали повышение гликемии. И наоборот, наблюдали снижение уровня глюкозы в среднем на 12,9%.

На основании определения баланса веществ в почках (мочевина и креатинин) у 3 собак не наблюдали нефротоксичность.

Баланс веществ в печени (альбумин, белки, аспартатаминотрансфераза (AST) и аланинаминотрансфераза (ALT) (соотношение AST/ALT), щелочная фосфатаза, общий билирубин) у 3 собак был нормальным после лечения. Более того, не наблюдали значительного изменения гематологических и биохимических показателей.

В заключение необходимо отметить, соединение BIM2b, вводимое в виде композиции BIM2b PO, не приводит к какой-либо токсичности. Введение этой композиции в дозе 30 мг/мл соединения BIM2b два раза в день, 5 дней в неделю в течение 21 дня не вызвало нежелательных клинических эффектов. Аналогично, исследованные параметры не продемонстрировали гепатотоксичность или нефротоксичность.

Пример 6: Изучение анти-GBM эффективности BIM2b PO, вводимой перорально собакам со спонтанными глиомами (так называемые “субъекты-собаки с мультиформной глиобластомой (GBM)”)

Целью этого исследования было оценить эффективность соединения BIM2b, вводимого в композиции по изобретению, при лечении глиом у собак.

В исследование были включены 9 собак со спонтанными глиомами, диагностированными посредством изображений. Собак обрабатывали перорально с суточной дозой 3 мг/кг соединения BIM2b (1 мл композиции примера 2) на часть 5 кг.

Исследование включает 5 циклов обработки по 21 день (105 дней), за которыми следуют 2 цикла по 3 месяца наблюдения. Состояние и объем опухоли оценивали посредством МРТ.

В день D0 (1-е введение) субъекта-собаку с GBM обследовали клинически и собирали образец крови для анализа биохимических параметров. В день D15 регистрировали электрокардиограмму и забирали образец крови. Начиная со дня 21, дозу пересматривали: либо повышали (+25% от исходной дозы), либо понижали (-25% от исходной дозы) в зависимости от реакции опухоли и/или токсичности.

Электрокардиограммы, образцы крови и МРТ выполняли в день D42, D63, D84 и D105, затем через 3 и 6 месяцев после прекращения лечения/обработки.

Ответ опухоли оценивали посредством МРТ на основе критериев RECIST (критерии оценки ответа солидных опухолей). Эти критерии определяют опухолевый ответ следующим образом:

- прогрессирование - увеличение размера опухоли по наибольшей оси больше, чем на 20% по сравнению с предыдущими данными МРТ;

- регресс определяется уменьшением размера опухоли по наибольшей оси больше, чем на 30% по сравнению с предыдущими данными МРТ;

- стабильность определяется изменением размера опухоли в диапазоне значений между уменьшением размера меньше, чем на 30% и увеличением меньше, чем на 20%.

Результаты

Длительность этого исследования составляла 22 месяца. Исследованию не подвергали 3-х из 9-ти включенных в исследование собак, поскольку они не достигли дня D42 (смертность, в частности, вследствие включения на слишком поздней стадии заболевания). В числе оставшихся 6 собак, 2 собаки (N и G) умерли в день D165 (5,5 месяца) и D126 (4,2 месяца) соответственно. Опухоль субъекта-собаки с GBM N использовали для количественного определения BIM2b и его метаболитов (пример 8).

Было обнаружено, что у оставшихся 4 субъектов-собак с GBM пероральное лечение переносилось хорошо. Улучшение клинических признаков отмечалось у всех 4 собак: 2 остались стабильными, а в двух других случаях наблюдалась очень четкая регрессия почти с исчезновением поражения у одной из этих собак (D). На фиг.4 показано исчезновение опухоли у собаки D в день D42.

Пример 7: Анализ BIM2b в головном мозге мышей, получавших перорально BIM2b PO

Лечение здоровых мышей перорально BIM2b PO и условия получения головного мозга описаны в примере 4.

Соединение BIM2b и его метаболиты в головном мозге были разделены, обнаружены и количественно определены с помощью ВЭТСХ, как описано в части “Методы”.

Результаты представлены в таблице 1 ниже:

Таблица 1

День	Масса головного мозга (мг)	Соединение BIM2b (мкг/г головного мозга)
D2	415	12,5
D4	490	7,1
D18	471	11,7
D22	466	1,0

Результаты показывают, что соединение BIM2b обнаруживается в головном мозге мышей, получавшей перорально BIM2b PO в композиции по изобретению. Это демонстрирует, что соединение BIM2b проникает через гематоэнцефалический барьер (BBB) обработанных здоровых мышей. В день 22 наблюдается явная корреляция между выраженным снижением (91,5%) содержания BIM2b в головном мозге мыши и прекращением лечения в день 20. Метаболиты обнаруживаются только в следовых количествах.

В случае неопластической патологии, обращается внимание на BTB (гемато-опухолевый барьер) а не на BBB. BTB ослаблен наличием опухоли и ее физиологией. Исследования показывают, что молекулы проникают через BTB легче, чем через BBB.

Таким образом, пересечение BBB может рассматриваться как прогнозирование пересечения BTB.

Выраженное в процентах количество BIM2b, обнаруженного в головном мозге, по отношению к общему количеству, которое принимали мыши, составляет 0,013% в день 18.

Пример 8: Анализ BIM2b в опухоли у собаки с GBM, получавшей перорально BIM2b PO.

Опухоль GBM получена от собаки N в примере 6.

Соединение BIM2b и его метаболиты в опухоли разделяли, обнаруживали и количественно определяли посредством ВЭТСХ, как описано в части II) Методы.

Результаты показывают присутствие 3,7 мкг BIM2b в 212,7 мг исследованного фрагмента опухоли. Массовый процент BIM2b, обнаруженного во всей опухоли, по отношению к общему количеству BIM2b, которое приняла собака, составляет 0,39%; то есть в 30 раз больше, чем процентное содержание по массе, обнаруженное в мозге здоровых мышей (пример 7).

Тот факт, что аутопсию опухоли проводили через 21 день после прекращения лечения и что BIM2b все еще обнаруживается в опухоли, показывает, что соединение BIM2b, содержащееся в BIM2b PO, пересекает BTB и обнаруживается преимущественно в опухоли GBM.

Ссылочный материал

1. Macala, LJ, Yu RK and Ando, S.

J. Lip. Res. (1983), 24: 1243-1250.

2. Folch, J, Lees, M and Sloane-Stanley, GH.

J. Biol. Chem. (1957), 226: 497-509.

3. Mann PC, Vahle J., Keenan, CM, Baker JF, Bradley, AE, Goodman, DG, Harada, T, Herbert, R, Kaufmann, W, Kellner, R, Nolte, T, Rittinghausen, S, and Tanaka, T. Toxicologic Pathology (2012), 40 (4 Suppl).

Claims (23)

1. Композиция, содержащая, по меньшей мере, одно производное 7β-гидроксихолестерина и липидный носитель, причем указанный липидный носитель включает растительное масло или смесь растительных масел, за исключением липидного носителя, состоящего из липидных везикул, сформированных из одного или нескольких липидных слоев, или состоящего из фосфолипидов в нелипосомальной форме, в которой производное 7β-гидроксихолестерина соответствует формуле (I)

(I)

В которой:

- A представляет собой группу -C(O)R₁, в которой R₁ представляет собой насыщенный гетероцикл, содержащий 5 членов и включающий 2 атома кислорода, замещенный, по меньшей мере, одним линейным или разветвленным C₁-C₆ алкилом;

- B представляет собой ацильную группу, в которой алкильная группа представляет собой С₁-С₆.

2. Композиция по п.1, в которой указанный носитель содержит, по меньшей мере, один липид, отличный от фосфолипида.

3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что она находится в форме, подходящей для перорального введения.

4. Композиция по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что соединение формулы (I) находится в растворе в указанном липидном носителе.

5. Композиция по любому из пп.1-4, в которой указанный липидный носитель включает растительное масло, выбранное из арганового масла, масла авокадо, льняного масла, подсолнечного масла, пальмового масла, масла капустной пальмы, кокосового масла, масла из виноградных косточек, масла черной горчицы, макового масла, масла семян ши, масла сладкого миндаля, соевого масла, арахисового масла, хлопкового масла, кунжутного масла, оливкового масла, кукурузного масла, масла какао, касторового масла, морингового масла (или бегенового масла), рапсового масла, масла аннато, масла зародышей пшеницы, сафлорового масла, масла грецкого ореха, масла фундука, сурепного масла или их смесей.

6. Композиция по любому из пп.1-5, в которой указанный липидный носитель представляет собой аргановое масло.

7. Композиция по любому из пп.1-6, в которой производное 7β-гидроксихолестерина представляет собой соединение формулы (I), в которой A представляет собой группу -C(O)R₁, где R₁ представляет собой 2,2-диметил-1,3-диоксолановую группу, и B представляет собой ацетильную группу формулы

.

8. Композиция по любому из пп.1-7, в которой содержание соединения формулы (I) составляет от 0,1 до 3,5% (мас./об.) от общего объема композиции.

9. Композиция по любому из пп.1-8, отличающаяся тем, что содержание соединения формулы (I) составляет от 1 до 35 мг/мл.

10. Композиция по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что содержание липидного носителя составляет от 90 до 99% (об./об.) от общего объема композиции.

11. Фармацевтическая композиция для лечения мультиформной глиобластомы, содержащая композицию по любому из пп.1-10.

12. Фармацевтическая композиция по п.11, отличающаяся тем, что она находится в форме, подходящей для перорального введения.

13. Способ получения композиции по любому из пп.1-10, включающий следующие стадии:

- получение смеси, содержащей производное 7β-гидроксихолестерина формулы (I), как определено в любом из пп.1-10, липидный носитель и сорастворитель,

- необязательное добавление антиоксиданта, и

- при необходимости, упаривание сорастворителя.

14. Способ по п.13, в котором липидный носитель такой, как определено в любом из пп.1 или 5.

15. Композиция по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что содержание соединения формулы (I) составляет 30 мг/мл.

Images