TW201915011A - 使用陽離子交換層析法分離三輕鏈抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供將三輕鏈(H2L3)抗體(例如抗CD123 H2L3抗體)或其抗原結合片段自包含H2L3抗體或其抗原結合片段及雙輕鏈(H2L2)抗體(例如抗CD123 H2L2)或其抗原結合片段之抗體組合物中分離之方法。

Description

使用陽離子交換層析法分離三輕鏈抗體
本發明之領域大體上係關於將三輕鏈(H2L3)抗體(例如抗CD123 H2L3抗體)或其抗原結合片段自包含H2L3抗體或其抗原結合片段及雙輕鏈(H2L2)抗體(例如抗CD123 H2L2)或其抗原結合片段之抗體組合物中分離之方法。
用反應性半胱胺酸殘基加以工程改造之重組抗體，亦即，「經半胱胺酸工程改造之抗體」可與相關藥物共價結合而產生靶向性治療劑。研究已顯示經穩定轉染以表現此種經半胱胺酸工程改造之抗體的哺乳動物細胞亦分泌稱為三輕鏈(H2L3)抗體之高分子量物質(Gomez等人,Biotechnol Bioeng . 105(4): 748-60 (2010))。H2L3經半胱胺酸修飾之抗體為額外輕鏈與H2L2經半胱胺酸修飾之抗體上經工程改造之半胱胺酸殘基之一之間的二硫鍵形成的產物。細胞培養物中之H2L3經半胱胺酸修飾抗體之水準與細胞株及培養條件有關。儘管可修改細胞培養條件以便將H2L3形成減至最少(例如，藉由在細胞培養期間採用溫度變化)，但影響很大程度上視細胞株而定(Gomez等人,Biotechnol Prof . 26(5): 1438-45 (2010))。
由於與單體物質具有諸多相似性，故而在單株H2L2經半胱胺酸修飾之抗體的下游純化期間分離H2L3抗體成為一個挑戰。在一個特定研究中，在純化經非半胱胺酸工程改造之單株抗體時發現疏水性相互作用層析(HIC)使H2L3水準自約3%降至0.5% (Wollacott等人,mAbs 5(6): 925-935 (2013))。在同一研究中，使用陽離子交換層析以試圖移除H2L3抗體。然而，即使在經修改之條件下，此方法亦不足以將所有測試細胞株中之H2L3百分比均降至低於1%。諸位作者推斷陽離子交換層析中之靜電效應之強度不足以移除H2L3抗體。因而，為了獲得最相符之抗體產物(例如，對於治療抗體及含有此種抗體之免疫結合物)，需要在抗體純化期間更有效地分離H2L3物質。
本發明係關於開發用於分離三輕鏈(H2L3)抗體與雙輕鏈(H2L2)抗體之有效純化策略。該等方法利用陽離子交換樹脂主要基於電荷來分離蛋白質之事實。如本文中所提供，在樹脂之pH值低於相關抗體之pH值(例如3.8至6.5)時，所有抗體物質，包括H2L3及H2L2二者，均結合至陽離子交換樹脂。當使用具有高pH值及/或低鹽濃度之溶析組合物自陽離子交換樹脂溶析抗體時，H2L3物質不僅溶析於H2L2物質之主峰溶析之後的晚期溶析份中，而且溶析於含有所要H2L2物質之早期溶析份中。然而，如本文中所顯示，藉由使用較低pH值及較高鹽濃度對陽離子交換樹脂進行最佳化可使大部分或所有H2L3物質溶析於H2L2物質之主峰溶析之後的晚期溶析份中。使用最佳化POROSTM XS強陽離子交換層析，抗體組合物中之H2L3抗體之量可自11%降至低於1%，且此降低程度可在各種細胞株中再現。
在一些實施例中，將H2L3抗體或其抗原結合片段自包含H2L3抗體或其抗原結合片段及H2L2抗體或其抗原結合片段之抗體組合物中分離之方法包括：(i)將該抗體組合物施加至陽離子交換樹脂，使得H2L3抗體或其抗原結合片段及H2L2抗體或其抗原結合片段結合至該樹脂；(ii)將具有約3.8至約5.0之pH值的溶析組合物施加至該陽離子交換樹脂；及(iii)收集自該樹脂溶析之H2L2組合物。
在一些實施例中，將H2L3抗體或其抗原結合片段自包含H2L3抗體或其抗原結合片段及H2L2抗體或其抗原結合片段之抗體組合物中分離之方法包括：(i)將該抗體組合物施加至陽離子交換樹脂，使得H2L3抗體或其抗原結合片段及H2L2抗體或其抗原結合片段結合至該樹脂；(ii)將具有約300 mM至約600 mM之鹽濃度的溶析組合物施加至該陽離子交換樹脂；及(iii)收集自該樹脂溶析之H2L2組合物。
在一些實施例中，將抗CD123 H2L3抗體或其抗原結合片段自包含抗CD123 H2L3抗體或其抗原結合片段及抗CD123 H2L2抗體或其抗原結合片段之抗CD123抗體組合物中分離之方法包括：(i)將該抗CD123抗體組合物施加至陽離子交換樹脂，使得抗CD123 H2L3抗體或其抗原結合片段及抗CD123 H2L2抗體或其抗原結合片段結合至該樹脂；(ii)將具有約3.8至約5.5之pH值的溶析組合物施加至該陽離子交換樹脂；(iii)及收集自該樹脂溶析之抗CD123 H2L2組合物，其中該等抗CD123 H2L3抗體或其抗原結合片段及該等抗CD123 H2L2抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO: 5-7之可變重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO: 8-10之可變輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
在一些實施例中，將抗CD123 H2L3抗體或其抗原結合片段自包含抗CD123 H2L3抗體或其抗原結合片段及抗CD123 H2L2抗體或其抗原結合片段之抗CD123抗體組合物中分離之方法包括：(i)將該抗CD123抗體組合物施加至陽離子交換樹脂，使得抗CD123 H2L3抗體或其抗原結合片段及抗CD123 H2L2抗體或其抗原結合片段結合至該樹脂；(ii)將具有約300 mM至約600 mM之鹽濃度的溶析組合物施加至該陽離子交換樹脂；(iii)及收集自該樹脂溶析之抗CD123 H2L2組合物，其中該等抗CD123 H2L3抗體或其抗原結合片段及該等抗CD123 H2L2抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO: 5-7之可變重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO: 8-10之可變輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
在一些實施例中，該H2L2組合物中之抗體或其抗原結合片段之不超過2%為H2L3抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該H2L2組合物中之抗體或其抗原結合片段之不超過1%為H2L3抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該H2L2組合物中之抗體或其抗原結合片段之不超過0.5%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，該H2L2組合物中之抗體或其抗原結合片段之至少98%、至少99%或至少99.5%為H2L2抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該H2L2組合物包含施加至陽離子交換樹脂之抗體組合物中之H2L3抗體或其抗原結合片段的不超過25%、不超過20%、不超過15%、不超過10%或不超過5%。
在一些實施例中，該H2L2組合物包含選自管柱體積1至9之一或多個溶析管柱體積。在一些實施例中，該H2L2組合物包含溶析管柱體積1至4。在一些實施例中，該陽離子交換樹脂包含交聯聚(苯乙烯二乙烯苯)。在一些實施例中，該陽離子交換樹脂包含磺丙基( -CH2 CH2 CH2 SO3 -)表面官能基。在一些實施例中，該陽離子交換樹脂之粒徑為約50 μm。在一些實施例中，該陽離子交換樹脂具有雙峰孔徑分佈。在一些實施例中，該雙峰孔徑分佈包含直徑為約500 nM之孔隙及直徑為約22 nM之孔隙。在一些實施例中，該陽離子交換樹脂為POROSTM 強陽離子交換樹脂XS。
在一些實施例中，該溶析組合物包含鹽。在一些實施例中，該溶析組合物中之該鹽為氯鹽。在一些實施例中，該氯鹽為氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂。在一些實施例中，該溶析組合物中之鹽濃度為約100 mM至約600 mM、約300 mM至約500 mM或約350 mM至約450 mM。在一些實施例中，該溶析組合物中之鹽濃度為約300 mM至約500 mM或約350 mM至約450 mM。在一些實施例中，該溶析組合物中之鹽濃度為約400 mM。在一些實施例中，該溶析組合物具有約3.8至約6.5之pH值。在一些實施例中，該溶析組合物具有約3.8至約5.0之pH值。在一些實施例中，該溶析組合物具有約4.2之pH值。
在一些實施例中，該方法包括在將該抗體組合物施加至該陽離子交換樹脂之前將平衡組合物施加至該陽離子交換樹脂。在一些實施例中，該平衡組合物包含乙酸鈉。在一些實施例中，該平衡組合物中之該乙酸鈉之濃度為約10 mM至150 mM。在一些實施例中，該平衡組合物中之該乙酸鈉之濃度為約50 mM。在一些實施例中，該平衡組合物具有約3.8至約6.5之pH值。在一些實施例中，該平衡組合物具有約4.2之pH值。
在一些實施例中，該抗體組合物包含約10至約100 g/L蛋白質。在一些實施例中，該抗體組合物包含約30 g/L至約50 g/L或約35 g/L至約45 g/L蛋白質。在一些實施例中，該抗體組合物包含約40 g/L蛋白質。在一些實施例中，該抗體組合物具有約3.8至約6.5之pH值。在一些實施例中，該抗體組合物具有約4.2之pH值。
在一些實施例中，該抗體組合物中之抗體或其抗原結合片段之約1%至約20%為H2L3抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該抗體組合物中之抗體或其抗原結合片段中約1%至約15%、或約5%至約15%、或約3%至約12%、或約10%至約15%為H2L3抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該H2L2組合物包含施加至陽離子交換樹脂之抗體組合物中之H2L2抗體或其抗原結合片段的至少40%、至少45%、至少50%或至少55%。
在一些實施例中，該抗體組合物包含經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該等經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段在EU/OU編號位置442處包含經工程改造之半胱胺酸殘基。在一些實施例中，該抗體組合物包含抗體。在一些實施例中，該抗體組合物包含抗體之抗原結合片段。在一些實施例中，該抗體組合物包含Fab、Fab'、F(ab')2 、Fd、單鏈Fv或scFv、二硫鍵連接之Fv、V-NAR結構域、IgNar、內抗體、IgGΔCH2、微型抗體、F(ab')3 、四功能抗體、三功能抗體、雙功能抗體、單結構域抗體、DVD-Ig、Fcab、mAb2 、(scFv)2 或scFv-Fc。在一些實施例中，該抗體組合物包含由CHO細胞株產生之抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，該方法更包括使該H2L2組合物中之H2L2抗體或其抗原結合片段與細胞毒素結合以形成免疫結合物組合物。在一些實施例中，該免疫結合物組合物係根據本文中所描述之方法產生。在一些實施例中，該免疫結合物包含不超過2% H2L3抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該免疫結合物包含不超過1% H2L3抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該免疫結合物包含不超過0.5% H2L3抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，H2L2組合物組合物係根據本文中所描述之方法產生。如申請專利範圍第46項之H2L2組合物，其包含不超過2% H2L3抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該H2L2組合物包含不超過1% H2L3抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該H2L2組合物包含不超過0.5% H2L3抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，(i)該陽離子交換樹脂包含交聯聚(苯乙烯二乙烯苯)、磺丙基(-CH2 CH2 CH2 SO3 -)表面官能基、約50 μm之粒徑以及包括直徑為約500 nM之孔隙及直徑為約22 nM之孔隙的雙峰孔徑分佈；(ii)該溶析組合物包含約300至600 mM氯鹽及約3.8至約5.0之pH值；(iii)該抗體組合物包含約10至約100 g/L蛋白質且該抗體組合物中之抗體或其抗原結合片段之約10%至約15%為H2L3抗體或其抗原結合片段；(iv)該H2L2組合物包含選自管柱體積1至9之一或多個溶析管柱體積；且(v)該H2L2組合物中之抗體或其抗原結合片段之不超過2%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，(i)該陽離子交換樹脂包含交聯聚(苯乙烯二乙烯苯)、磺丙基(-CH2 CH2 CH2 SO3 -)表面官能基、約50 μm之粒徑以及包括直徑為約500 nM之孔隙及直徑為約22 nM之孔隙的雙峰孔徑分佈；(ii)該溶析組合物包含約400 mM NaCl及約4.2之pH值；(iii)該抗體組合物包含約30至約50 g/L蛋白質且該抗體組合物中之抗體或其抗原結合片段之約10%至約15%為H2L3抗體或其抗原結合片段；(iv)該H2L2組合物包含溶析管柱體積1至4；且(v)該H2L2組合物中之抗體或其抗原結合片段之不超過1%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，組合物包含抗CD123抗體或其抗原結合片段，其中該等抗CD123抗體或其抗原結合片段之少於1%為H2L3抗體或其抗原結合片段，且其中該等抗CD123抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO: 5-7之可變重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO: 8-10之可變輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。在一些實施例中，該抗CD123抗體包含SEQ ID NO:1之可變重鏈序列。在一些實施例中，該抗CD123抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:2之可變輕鏈序列。在一些實施例中，該抗CD123抗體或其抗原結合片段經半胱胺酸工程改造。在一些實施例中，該抗CD123抗體包含SEQ ID NO:3之重鏈序列。在一些實施例中，該抗CD123抗體包含SEQ ID NO:4之輕鏈序列。在一些實施例中，該等抗CD123抗體或其抗原結合片段之少於0.5%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，組合物包含抗CD123免疫結合物，其中該等免疫結合物包含與DGN549-C連接之抗CD123抗體或其抗原結合片段，其中該等抗CD123抗體或其抗原結合片段之少於1%為H2L3抗體或其抗原結合片段，且其中該等抗CD123抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO: 5-7之可變重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO: 8-10之可變輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。在一些實施例中，該抗CD123抗體包含SEQ ID NO:1之可變重鏈序列。在一些實施例中，該抗CD123抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:2之可變輕鏈序列。在一些實施例中，該抗CD123抗體或其抗原結合片段經半胱胺酸工程改造。在一些實施例中，該抗CD123抗體包含SEQ ID NO:3之重鏈序列。在一些實施例中，該抗CD123抗體包含SEQ ID NO:4之輕鏈序列。在一些實施例中，該免疫結合物具有以下結構：
在一些實施例中，該等抗CD123抗體或其抗原結合片段之少於0.5%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
對相關申請案之交叉引用
本申請案主張2018年9月22日申請之美國臨時申請案第62/562,188號之優先權權益，該案係以引用之方式併入本文中。 對以電子方式提交之序列表之引用
以電子方式提交之序列表(名稱： 2921_097PC01_ST25；大小：15,737位元組；及創建日期：2018年9月20日)之內容係以引用之方式整體併入本文中。
本發明提供將H2L3抗體(例如抗CD123 H2L3抗體)或其抗原結合片段自包含H2L3抗體或其抗原結合片段及H2L2抗體(例如抗CD123抗體)或其抗原結合片段之抗體組合物中分離之方法。I. 定義
為了促進理解本發明，以下定義許多術語及片語。
「陽離子交換樹脂」係指固相，該固相帶負電且具有游離陽離子以便與通過該固相上方或通過該固相之水溶液中的陽離子交換。與適於形成陽離子交換樹脂之固相連接的任何帶負電配位體均可使用，例如甲酸、磺酸以及其他。市售陽離子交換樹脂包括但不限於例如具有以下基團之彼等陽離子交換樹脂：基於磺酸之基團；基於磺乙基之基團；基於磺丙基之基團；基於磺丁基之基團；基於磺氧乙基之基團、基於羧甲基之基團；基於磺酸及羧酸之基團；基於羧酸之基團；基於磺酸之基團；及基於正磷酸之基團。如本文中所提供，可基於陽離子交換樹脂中之帶負電基團與蛋白質(例如，抗體或其抗原結合片段)上之帶正電基團之間的相互作用來分離蛋白質(例如，抗體或其抗原結合片段)。
術語「溶析」及其語法變化形式係指藉由使用適當條件，例如改變樹脂(例如，層析材料)周圍緩衝液之離子強度或pH值、藉由改變分子之疏水性或藉由改變配位體(例如電荷)之化學性質，使得相關蛋白質不能夠結合樹脂且因此自樹脂(例如，層析管柱)中溶析而自樹脂(例如，層析材料)中移除分子，例如相關多肽。術語「溶析液」係指當溶析施加至管柱上時離開樹脂(例如，管柱)之含有相關多肽之流出液。在溶析相關多肽之後，可視需要對樹脂(例如管柱)進行再生、消毒及儲存。
術語「抗體」意謂免疫球蛋白分子，其可經由該免疫球蛋白分子之可變區內的至少一個抗原識別位點識別且特異性結合標靶，諸如蛋白質、多肽、肽、碳水化合物、聚核苷酸、脂質或上述之組合。如本文中所使用，術語「抗體」涵蓋完整多株抗體、完整單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、包含抗體之融合蛋白質及任何其他經修飾之免疫球蛋白分子，只要該等抗體展現所要生物活性即可。抗體基於其重鏈恆定域(分別稱為α、δ、ε、γ及μ)之一致性可屬於五個主要免疫球蛋白類別中之任一個：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，或其亞類(同型) (例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。不同類別之免疫球蛋白具有不同且熟知之次單元結構及三維構形。抗體可為裸抗體或與諸如毒素、放射性同位素等其他分子結合。
術語「抗體片段」係指完整抗體中具有足以結合至陽離子交換樹脂之正電荷的部分。「抗原結合片段」係指完整抗體中結合抗原且具有足以結合至陽離子交換樹脂之帶正電的部分。抗原結合片段可含有完整抗體之抗原決定可變區。抗體片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、線性抗體及單鏈抗體。
術語「三輕鏈」或「H2L3」抗體或抗原結合片段係指含有兩個重鏈或其片段及三個輕鏈或其片段之抗體或其抗原結合片段。
術語「雙輕鏈」或「H2L2」抗體或抗原結合片段係指含有兩個重鏈或其片段及兩個輕鏈或其片段之抗體或其抗原結合片段。
術語「抗體組合物」係指包含抗體或其抗原結合片段之組合物。抗體組合物可包含細胞培養中(例如由CHO細胞)產生、使用蛋白A管柱加以純化且視情況使用陰離子交換管柱進一步純化之抗體及其他組分。除抗體或其抗原結合片段以外，抗體組合物可含有例如Tris乙酸。抗體組合物亦可含有聚集物。
「H2L2」組合物係指自陽離子交換樹脂溶析之相較於施加至陽離子交換樹脂之抗體組合物而言含有更大比例之H2L2物質的組合物。
「H2L3」組合物係指自陽離子交換樹脂溶析之相較於施加至陽離子交換樹脂之抗體組合物而言含有更大比例之H2L3物質的組合物。
術語「經半胱胺酸工程改造之」抗體或其抗原結合片段包括具有至少一個正常情況下不存在於抗體或其抗原結合片段輕鏈或重鏈之指定殘基處的半胱胺酸(「Cys」)的抗體或其抗原結合片段。此種Cys亦可稱為「經工程改造之Cys」，其可使用任何習知分子生物學或重組技術(例如，藉由在靶殘基處用Cys之編碼序列置換非Cys殘基之編碼序列)進行工程改造。舉例而言，若原始殘基為具有編碼序列5'-UCU-3'之Ser，則編碼序列可突變(例如，藉由定點突變誘發)至編碼Cys之5'-UGU-3'。在某些實施例中，經Cys工程改造之抗體或其抗原結合片段在重鏈中具有經工程改造之Cys。在某些實施例中，經工程改造之Cys處於重鏈CH3結構域中或附近。在某些實施例中，經工程改造之Cys處於重鏈之殘基442處(EU/OU編號；EU指數，Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, NIH出版物第91-3242號, 1991，其全部內容係以引用之方式併入本文中)。在某些實施例中，Fc區在如藉由EU指數編號之位置239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422及442中之一或多個處包含半胱胺酸。在某些實施例中，以下殘基中之任何一或多個均可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205 (Kabat編號)；重鏈之A118 (EU編號)；及重鏈Fc區之S400 (EU編號)。在某些實施例中，例如scFv之可變輕鏈結構域在Kabat位置100處具有半胱胺酸。在某些實施例中，例如scFv之可變重鏈結構域在Kabat位置44處具有半胱胺酸。可如例如美國專利第7,521,541號、美國專利第7,855,275號、美國公開申請案第20110033378號及WO 2011/005481中所描述來產生經半胱胺酸工程改造之抗體。
「單株」抗體或其抗原結合片段係指涉及單一抗原決定子或抗原決定基之高度特異性識別及結合的均質抗體或抗原結合片段群體。此與典型地包括針對不同抗原決定子之不同抗體的多株抗體相反。術語「單株」抗體或其抗原結合片段涵蓋完整及全長單株抗體以及抗體片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(scFv)突變體、包含抗體部分之融合蛋白質及包含抗原識別位點之任何其他經修飾免疫球蛋白分子。此外，「單株」抗體或其抗原結合片段係指以許多方式製造之此種抗體及其抗原結合片段，包括但不限於藉由雜交瘤、噬菌體選擇、重組表現及轉殖基因動物。
術語「人類化」抗體或其抗原結合片段係指非人類(例如鼠類)抗體或抗原結合片段之形式，其為含有最小非人類(例如鼠類)序列之特定免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白或其片段。典型地，人類化抗體或其抗原結合片段為人類免疫球蛋白，其中互補決定區(CDR)之殘基經非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠)之CDR中具有所要特異性、親和力及容量之殘基置換(「CDR移植」) (Jones等人, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等人, Nature 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等人, Science 239:1534-1536 (1988))。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基經來自非人類物種之具有所要特異性、親和力及容量之抗體或片段中的相應殘基置換。人類化抗體或其抗原結合片段可藉由取代Fv構架區中及/或經置換之非人類殘基內之其他殘基來進行進一步修飾，以改進並優化抗體或其抗原結合片段特異性、親和力及/或容量。一般而言，人類化抗體或其抗原結合片段將包括實質上所有至少一個且典型地兩或三個含有所有或實質上所有對應於非人類免疫球蛋白之CDR區的可變域，而所有或實質上所有FR區為人類免疫球蛋白一致序列之FR區。人類化抗體或其抗原結合片段亦可包含免疫球蛋白恆定區或域(Fc)，典型地人類免疫球蛋白恆定區或域之至少一部分。用於產生人類化抗體之方法的實例描述於以下文獻中：美國專利5,225,539；Roguska等人, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973 (1994)；及Roguska等人, Protein Eng. 9(10):895-904 (1996)。在一些實施例中，「人類化」抗體為表面重整抗體。
抗體之「可變區」係指單獨或組合之抗體輕鏈可變區或抗體重鏈可變區。重鏈及輕鏈之可變區各自由以三個互補性決定區(CDR，亦稱為高變區)連接之四個構架區(FR)組成。FR維持各鏈中之CDR與另一鏈之CDR緊密鄰近一起，有助於形成抗體之抗原結合位點。存在至少兩種對於測定CDR之技術：(1)基於物種間序列變異性之方法(亦即，Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest , (第5版, 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)；「Kabat」)及(2)基於抗原-抗體複合物之結晶學研究的方法(Al-lazikani等人,J. Molec. Biol. 273:927-948 (1997))。另外，此項技術中有時使用此兩種方法之組合來測定CDR。
當提及可變域(約輕鏈中之殘基1至107及重鏈中之殘基1至113)中之殘基時一般使用Kabat編號系統(例如Kabat等人,Sequences of Immunological Interest. (第5版, 1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) (「Kabat」))。
如Kabat中之胺基酸位置編號係指用於Kabat等人(Sequences of Immunological Interest. (第5版, 1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.)，「Kabat」)中之抗體編集之重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有對應於可變域FR或CDR之縮短或插入的更少或額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變域可包括處於H2中殘基52之後的單一胺基酸插入(殘基52a，根據Kabat)及處於重鏈FR殘基82之後的多個插入殘基(例如,殘基82a、82b及82c等，根據Kabat)。對於指定抗體，殘基之Kabat編號可藉由在抗體序列之同源性區域上與「標準」Kabat編號序列進行比對來確定。而Chothia係指結構環之位置(Chothia及Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917, (1987))。當使用Kabat編號轉化進行編號時，Chothia CDR-H1環之末端視環長度而在H32與H34之間變化(此係因為Kabat編號方案將插入物置於H35A及H35B處；若35A或35B均不存在，則環末端在32處；若僅存在35A，則環末端在33處；若35A或35B均存在，則環末端在34處)。AbM高變區表示Kabat CDR與Chothia結構環之間的摺衷，且由Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體使用。
術語「人類」抗體或其抗原結合片段意謂由人類產生之抗體或其抗原結合片段或者使用此項技術中已知的任何技術製造的具有對應於由人類產生之抗體或其抗原結合片段的胺基酸序列的抗體或其抗原結合片段。人類抗體或其抗原結合片段之此定義包括完整或全長抗體及其片段。
術語「嵌合」抗體或其抗原結合片段係指胺基酸序列來源於兩個或更多個物種之抗體或其抗原結合片段。典型地，輕鏈及重鏈兩者之可變區對應於來源於一個哺乳動物物種(例如，小鼠、大鼠、兔等)且具有所要特異性、親和力及容量之抗體或其抗原結合片段的可變區，而恆定區與來源於另一物種(通常為人類)之抗體或其抗原結合片段中的序列同源，以避免在該物種中引發免疫反應。
術語「抗原決定基」或「抗原決定子」在本文中可互換用於指抗原中能夠由特定抗體識別且特異性結合之部分。當抗原為多肽時，抗原決定基可由連續胺基酸及藉由蛋白質之三級摺疊而毗鄰之非連續胺基酸形成。由連續胺基酸形成之抗原決定基典型地在蛋白質變性後得以保留，而由三級摺疊形成之抗原決定基典型地在蛋白質變性後喪失。在獨特空間構形下，抗原決定基典型地包括至少3個且更通常至少5或8至10個胺基酸。
「結合親和力」一般係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的總非共價相互作用總和的強度。除非另外指示，否則如本文中所使用，「結合親和力」係指體現結合對之成員(例如抗體及抗原)之間的1:1相互作用的內在結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(Kd)表示。親和力可藉由此項技術中已知的常用方法，包括本文中所描述之方法來量測。低親和力抗體一般緩慢結合抗原且傾向於容易解離，而高親和力抗體一般更快結合抗原且傾向於保持結合較久。量測結合親和力之多種方法在此項技術中為已知的，出於本發明之目的可使用其中之任一種。以下描述特定說明性實施例。
「或更佳」當在本文中用於指結合親和力時係指分子與其結合搭配物之間的更強結合。「或更佳」當在本文中用於指更強結合時由較小數值Kd值表示。舉例而言，對抗原具有「0.6 nM或更佳」親和力之抗體係指抗體對抗原之親和力＜0.6 nM，亦即，0.59 nM、0.58 nM、0.57 nM等，或小於0.6 nM之任何值。
「特異性結合」一般意謂抗體經由其抗原結合域來結合抗原決定基且該結合需要抗原結合域與抗原決定基之間存在一定互補性。根據此定義，與抗體將結合隨機無關抗原決定基相比，據稱當其經由其抗原結合域結合抗原決定基時，抗體更容易「特異性結合該抗原決定基」。術語「特異性」在本文中用於考核某一抗體結合某一抗原決定基之相對親和力。舉例而言，可認為抗體「A」與抗體「B」相比對指定抗原決定基具有較高特異性，或可稱抗體「A」以比其對相關抗原決定基「D」所具有的特異性高的特異性結合抗原決定基「C」。
「優先結合」意謂抗體特異性結合抗原決定基比其結合相關相似同源或類似抗原決定基更容易。因此，與相關抗原決定基相比，「優先結合」指定抗原決定基之抗體將更可能結合該抗原決定基，縱使此種抗體可與該相關抗原決定基交叉反應。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換用於指任何長度之胺基酸聚合物。該聚合物可為線性或分枝的，其可包含經修飾之胺基酸，且其可間雜非胺基酸。該術語亦涵蓋已天然地或藉由插入加以修飾之胺基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他處理或修飾，諸如與標記組分結合。該定義內亦包括例如含有一或多種胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及此項技術中已知的其他修飾的多肽。應理解，由於本發明之多肽係基於抗體，故在某些實施例中，該等多肽可呈單鏈或締合鏈形式存在。
如本文中所使用之術語「免疫結合物」或「結合物」係指連接至細胞結合劑(亦即，抗CD123抗體或其片段)之化合物或其衍生物且由以下通式定義：C-A，其中C=細胞毒素(例如，類美登素、苯并二氮呯化合物，包括吡咯并苯并二氮呯(PBD)及四環苯并二氮呯，諸如吲哚啉并苯并二氮呯)，且A=抗體或其抗原結合片段，例如抗CD123抗體或抗體片段。免疫結合物可視情況含有連接基，且由以下通式定義：C-L-A，其中C=細胞毒素，L=連接基，且A=抗體或其抗原結合片段，例如抗CD123抗體或抗體片段。免疫結合物亦可由以下反序通式定義：C-A或A-L-C。免疫結合物亦可含有每個抗體或其抗原結合片段(A)多個細胞毒素(C)或者每個抗體或其抗原結合片段(A)多個細胞毒素(C)及連接基(L)。
「連接基」為能夠以穩定共價方式將化合物(通常為藥物，諸如類美登素、苯并二氮呯化合物，包括吡咯并苯并二氮呯(PBD)及四環苯并二氮呯，諸如吲哚啉并苯并二氮呯)連接至細胞結合劑(諸如抗CD123抗體或其片段)之任何化學部分。連接基可在化合物或抗體保持活性之條件下對例如二硫鍵裂解敏感或實質上具有抗性。適合之連接基在此項技術中為熟知的且包括例如二硫基及硫醚基。
片語「醫藥學上可接受」指示物質或組合物必須在化學上及/或在毒理學上與構成調配物之其他成分及/或用其治療之哺乳動物相容。
術語「醫藥調配物」係指呈允許活性成分之生物活性有效且不含對將投與該調配物之個體具有不可接受之毒性的額外組分的形式的製劑。該調配物可為無菌的。
除非另外指示，否則如本文中可互換使用之術語「(人類) IL-3Rα」、「介白素-3受體α」或「CD123」係指任何天然(人類) IL-3Rα或CD123。CD123蛋白為異源二聚細胞因子受體(IL-3受體，或IL-3R)之介白素3特異性次單元。該等術語涵蓋「全長」未處理CD123多肽以及由在細胞內進行處理而產生之CD123多肽之任何形式。該術語亦涵蓋CD123之天然存在之變異體，例如由剪接變異體及等位基因變異體編碼之彼等變異體。本文中所描述之CD123多肽可自多種來源，諸如自諸多人類組織類型或自另一來源分離，或者藉由重組或合成方法來製備。在特定指示時，「CD123」可用於指編碼CD123多肽之核酸。人類CD123序列為已知的，且包括例如與NCBI參考號NP_002174及NM_002183 (人類CD123變異體1之蛋白質及核酸序列)以及NP_001254642及NM_001267713 (人類CD123變異體2之蛋白質及核酸序列)相關之彼等序列。如本文中所使用，術語「人類CD123」係指包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之序列的CD123。
術語「抗CD123抗體」或「結合CD123之抗體」係指能夠以充分親和力結合CD123之抗體，因此該抗體適用作診斷及/或治療劑用於靶向CD123 (例如huMov19 (M9346A)抗體)。抗CD123抗體與無關非CD123蛋白之結合程度可小於該抗體與 CD123之結合之約10%，如例如藉由放射性免疫分析法(RIA)所量測。
術語「IMGN632」係指圖8中所示之免疫結合物組合物。免疫結合物組合物包含含有每個呈磺化型式之huCD123-6Gv4.7 (「G4723A」)抗體平均1.5至2.1個DGN549-C細胞毒性劑的免疫結合物(圖8A)。免疫結合物組合物亦可包含未磺化免疫結合物(圖8B中所示之單亞胺結構)。
除非上下文另外清楚指示，否則如本發明及申請專利範圍中所使用，單數形式「一(個)」、「一(種)」及「該」包括複數形式。
應理解，在本文中以措辭「包含」描述實施例之情況下，亦提供以「由…組成」及/或「基本上由…組成」加以描述之在其他方面類似之實施例。
如本文中在諸如「A及/或B」之片語中所使用之術語「及/或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」及「B」。同樣，如本文中在諸如「A、B及/或C」之片語中所使用之術語「及/或」意欲涵蓋以下實施例中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。II. 陽離子交換樹脂
根據本文中所提供之方法，陽離子交換樹脂可用於將三輕鏈(H2L3)抗體及其抗原結合片段自包含H2L3及雙輕鏈(H2L2)抗體及其抗原結合片段之組合物中分離。
適用於本文中所提供之方法中的一種例示性陽離子交換樹脂為最佳化POROSTM 強陽離子交換樹脂XS (Thermos Fisher，前Life Technologies Corporation，Carlsbad，CA；10,000 mL=目錄號440334；5,000 mL=目錄號4404335；1,000 mL=目錄號4404336；250 mL=目錄號4404337；10 mL=目錄號82071，及50 mL=目錄號82072)。
陽離子交換樹脂可包含例如交聯聚(苯乙烯二乙烯苯)。陽離子交換樹脂可具有磺丙基( -CH2CH2CH2SO3-)表面官能基。陽離子交換樹脂可包含交聯聚(苯乙烯二乙烯苯)且具有磺丙基( -CH2CH2CH2SO3-)表面官能基。
在一些實施例中，陽離子交換樹脂不是Fractogel SE HiCap (EMD Millipore)管柱。在一些實施例中，該陽離子交換樹脂不基於甲基丙烯酸酯。
陽離子交換樹脂可具有約50 μm之粒徑。陽離子交換樹脂可具有雙峰孔徑分佈，例如具有直徑為約500 nM之孔隙及直徑為約22 nM之孔隙。陽離子交換樹脂可具有約50 μm之粒徑以及具有直徑為約500 nM之孔隙及直徑為約22 nM之孔隙的雙峰孔隙分佈。
陽離子交換樹脂可包含交聯聚(苯乙烯二乙烯苯)，具有磺丙基(-CH2CH2CH2SO3-)表面官能基，具有約50 μm之粒徑，且具有存在直徑為約500 nM之孔隙及直徑為約22 nM之孔隙的雙峰孔隙分佈。
陽離子交換樹脂可具有特定大小。舉例而言，陽離子交換樹脂可為約10至約15,000 ml。陽離子交換樹脂可為約20至約25 mL。陽離子交換樹脂可為約100至約150 mL。陽離子交換樹脂可為約10,000至約15,000 mL。陽離子交換樹脂可為約13,800 mL。陽離子交換樹脂可為32 L或更大。
陽離子交換樹脂可為管柱。III. 抗體及其抗原結合片段
抗體及其抗原結合片段(例如治療上適用之抗體及其抗原結合片段)一般含有兩個重鏈或其片段及兩個輕鏈或其片段。然而，亦觀測到含有兩個重鏈或其片段及三個輕鏈或其片段之三輕鏈(H2L3)物質。此種H2L3物質可能以較高比率存在於經半胱胺酸工程改造之抗體及其抗原結合片段中，例如在H2L3物質為額外輕鏈與抗體或其抗原結合片段上經工程改造之半胱胺酸之一之間形成二硫鍵之結果時。因此，如本文中所使用之抗體組合物可包含經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段。類似地，H2L2或H2L3抗體或其抗原結合片段可為經半胱胺酸工程改造之H2L2或H2L3抗體或其抗原結合片段。經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段可例如在EU/OU編號位置442處包含經工程改造之半胱胺酸殘基。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段為人類化抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，人類化抗體或片段為表面重整抗體或其抗原結合片段。在其他實施例中，抗體或其抗原結合片段為完全人類抗體或其抗原結合片段。
舉例而言，抗CD123抗體或其抗原結合片段可用於本發明方法中。抗CD123抗體或其抗原結合片段可含有如以下表1至表3中所示之huCD123-6Gv4.7抗體之序列。舉例而言，用於本文中提供之方法中的抗CD123抗體或其抗原結合片段可包含分別為SEQ ID NO: 5、6及7之可變重鏈CDR-1、CDR-2及CDR-3序列以及分別為SEQ ID NO: 8、9及10之可變輕鏈CDR-1、CDR-2及CDR-3序列。用於本文中所提供之方法中的抗CD123抗體或其抗原結合片段可包含含有SEQ ID NO:1中所示之序列的可變重鏈結構域。用於本文中所提供之方法中的抗CD123抗體或其抗原結合片段可包含含有SEQ ID NO:2中所示之序列的可變輕鏈結構域。用於本文中所提供之方法中的抗CD123抗體或其抗原結合片段可包含含有SEQ ID NO:1中所示之序列的可變重鏈結構域及含有SEQ ID NO:2中所示之序列的可變輕鏈結構域。用於本文中所提供之方法中的抗CD123抗體或其抗原結合片段可包含含有SEQ ID NO:3中所示之序列的重鏈。用於本文中所提供之方法中的抗CD123抗體或其抗原結合片段可包含含有SEQ ID NO:4中所示之序列的輕鏈。用於本文中所提供之方法中的抗CD123抗體或其抗原結合片段可包含含有SEQ ID NO:3中所示之序列的重鏈及含有SEQ ID NO:4中所示之序列的輕鏈。
在一個實例中，用於本文中所提供之方法中的抗CD123抗體或其抗原結合片段可包含含有表1中所示之序列的可變重鏈結構域及可變輕鏈結構域。在另一實例中，用於本文中所提供之方法中的抗CD123抗體或其抗原結合片段可包含含有表2中所示之序列的重鏈及輕鏈。在另一實例中，用於本文中所提供之方法中的抗CD123抗體或其抗原結合片段可包含含有表3中所示之序列的可變重鏈及輕鏈互補決定區。 表1. huCD123-6Gv4.7重鏈可變區及輕鏈可變區 表2. huCD123-6Gv4.7-C442全長重鏈及輕鏈 表3. huCD123-6Gv4.7-C442可變重鏈及輕鏈互補決定區
抗CD123抗體或其抗原結合片段可結合至人類CD123之胺基酸205至346內之抗原決定基。
用於本發明方法之抗體或其抗原結合片段(例如，經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段、抗CD123抗體或其抗原結合片段，或者經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段)可重組產生。舉例而言，用於本發明方法之抗體或其抗原結合片段(例如，經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段、抗CD123抗體或其抗原結合片段，或者經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段)可在哺乳動物細胞株，例如CHO細胞中產生。IV. 抗體組合物
根據本文中所提供之方法，可將包含三輕鏈(H2L3)抗體及其抗原結合片段以及雙輕鏈(H2L2)抗體及其抗原結合片段之抗體組合物施加至陽離子交換管柱，以分離H2L3及H2L2物質。
用於本文中所提供之方法中的抗體組合物可為其中抗體或其抗原結合片段之約1%至約20%為H2L3抗體或其抗原結合片段之組合物。用於本文中所提供之方法中的抗體組合物可為抗體組合物中之抗體或其抗原結合片段之約1%至約15%或約5%至約15%或約3%至約12%或約10%至約15%為H2L3抗體或其抗原結合片段之組合物。
用於本文中所提供之方法中的抗體組合物可包含特定蛋白質濃度，以便將特定裝載密度施加至陽離子交換樹脂。蛋白質濃度(裝載密度)可為例如約10 g/L至約100 g/L。蛋白質濃度(裝載密度)可為約30 g/L至約50 g/L。蛋白質濃度(裝載密度)可為約30 g/L至約45 g/L。蛋白質濃度(裝載密度)可為約30 g/L至約40 g/L。蛋白質濃度(裝載密度)可為約40 g/L。
除H2L2及H2L3物質以外，抗體組合物亦可能含有聚集物。舉例而言，抗體組合物可含有約1%至約10%聚集物。抗體組合物可含有約1%至約5%聚集物。抗體組合物可含有約2%至約5%聚集物。
抗體組合物可具有特定pH值，例如約3.8至約6.5。抗體組合物可具有約3.8至約5.5之pH值。抗體組合物可具有約3.8至約5.0之pH值。抗體組合物可具有約3.8至約4.7之pH值。抗體組合物可具有約3.8至約4.4之pH值。抗體組合物可具有約3.8至約4.2之pH值。抗體組合物可具有約4.0至約5.0之pH值。抗體組合物可具有約4.0至約4.7之pH值。抗體組合物可具有約4.0至約4.4之pH值。抗體組合物可具有約4.0至約4.2之pH值。抗體組合物可具有約4.2之pH值。
抗體組合物之pH值可例如與平衡組合物(結合組合物)之pH值相同，如以下更詳細描述，該平衡組合物可在抗體組合物施加至陽離子交換樹脂之前施加至陽離子交換樹脂。抗體組合物之pH值可例如與溶析組合物之pH值相同，如以下更詳細描述，該溶析組合物可在抗體組合物之後施加至陽離子交換樹脂以溶析H2L2組合物。抗體組合物之pH值可與平衡組合物(結合組合物)及溶析組合物之pH值相同。
在一些實施例中，抗體組合物之pH值不為6.0。在一些實施例中，抗體組合物之pH值低於6.0。
抗體組合物可包含經蛋白A純化之抗體或其抗原結合片段。抗體組合物可包含已進行蛋白A純化且在陰離子交換管柱中進行純化之抗體或其抗原結合片段。因此，抗體組合物可含有諸如緩衝液(例如Tris乙酸)及/或抗體聚集物之組分，以及可溶性H2L2及H2L3抗體或其抗原結合片段。V. 用於產生 H2L2 及 H2L3 組合物之溶析溶液及溶析方法
根據本文中所提供之方法，可將三輕鏈(H2L3)抗體及其抗原結合片段以及雙輕鏈(H2L2)抗體及其抗原結合片段分別自陽離子交換管柱中溶析。
特定言之，可將溶析組合物施加至陽離子交換樹脂(例如管柱)以優先溶析H2L2物質，且隨後可自樹脂收集H2L2組合物。本文中提供用於此種方法中之溶析組合物。
用於本文中所提供之方法中的溶析組合物可包含鹽。該鹽可為氯鹽，例如氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂。在一種情況下，該鹽為氯化鈉。溶析組合物中之鹽(例如氯化鈉)濃度可為例如約100 mM至約600 mM。溶析組合物中之鹽(例如氯化鈉)濃度可為約200 mM至約600 mM。溶析組合物中之鹽(例如氯化鈉)濃度可為約300 mM至約600 mM。溶析組合物中之鹽(例如氯化鈉)濃度可為約400 mM至約600 mM。溶析組合物中之鹽(例如氯化鈉)濃度可為約200 mM至約500 mM。溶析組合物中之鹽(例如氯化鈉)濃度可為約300 mM至約500 mM。溶析組合物中之鹽(例如氯化鈉)濃度可為約400 mM至約500 mM。溶析組合物中之鹽(例如氯化鈉)濃度可為約380 mM至約420 mM。溶析組合物中之鹽(例如氯化鈉)濃度可為約400 mM。
在一些實施例中，溶析組合物之鹽濃度不為100 mM。在一些實施例中，溶析組合物之鹽濃度高於100 mM。
用於本文中所提供之方法中的溶析組合物可具有特定pH值。該pH值可為例如約3.8至約6.5。溶析組合物可具有約3.8至約5.5之pH值。溶析組合物可具有約3.8至約5.0之pH值。溶析組合物可具有約3.8至約4.7之pH值。溶析組合物可具有約3.8至約4.4之pH值。溶析組合物可具有約3.8至約4.2之pH值。溶析組合物可具有約4.0至約5.0之pH值。溶析組合物可具有約4.0至約4.7之pH值。溶析組合物可具有約4.0至約4.4之pH值。溶析組合物可具有約4.0至約4.2之pH值。溶析組合物可具有約4.2之pH值。
在一些實施例中，溶析組合物之pH值不為6.0。在一些實施例中，溶析組合物之pH值低於6.0。
用於本文中所提供之方法中的溶析組合物可具有鹽濃度與pH值之特定組合。舉例而言，鹽(例如，氯化鈉)濃度可為約300 mM至約600 mM，且pH值可為約3.8至約5.5。鹽(例如，氯化鈉)濃度可為約300 mM至約500 mM，且pH值可為約3.8至約5.0。鹽(例如，氯化鈉)濃度可為約380 mM至約420 mM，且pH值可為約4.0至約4.4。鹽(例如氯化鈉)濃度可為約400 mM，且pH值可為約4.2。
在一些實施例中，溶析組合物在pH 6.0下不存在100 mM氯化鈉。
如本文中所顯示，將本文中所提供之溶析組合物(例如，具有低pH值及高鹽濃度)施加至本文中所提供之含有本文中所提供之含H2L2及H2L3抗體或其抗原結合片段之抗體組合物的陽離子交換樹脂可在存在極少至不存在H2L3污染之情況下溶析H2L2組合物。此係因為本文中所提供之方法可使H2L3物質始終在晚期溶析(在H2L2溶析峰之後)，而不是在早期(連同H2L2溶析峰一起)以及晚期(在H2L2溶析峰之後)溶析。
因而，本文中所提供之H2L2組合物可包含一或多個溶析管柱體積。舉例而言，H2L2組合物可包含選自管柱體積1至9之單一溶析管柱體積。H2L2組合物可包含選自管柱體積1至9之兩個溶析管柱體積(例如，管柱體積1及2或管柱體積3及4)。H2L2組合物包含選自管柱體積1至9之三、四、五、六、七、八或九個溶析管柱體積。H2L2組合物亦可包含溶析管柱體積1至9 (亦即，前九個管柱體積之總匯)。本文中所提供之H2L2組合物可包含溶析管柱體積1至8 (亦即，前四個管柱體積之總匯)。本文中所提供之H2L2組合物可包含溶析管柱體積1至7 (亦即，前四個管柱體積之總匯)。本文中所提供之H2L2組合物可包含溶析管柱體積1至6 (亦即，前四個管柱體積之總匯)。本文中所提供之H2L2組合物可包含溶析管柱體積1至5 (亦即，前四個管柱體積之總匯)。本文中所提供之H2L2組合物可包含溶析管柱體積1至4 (亦即，前四個管柱體積之總匯)。本文中所提供之H2L2組合物可包含溶析管柱體積1至3 (亦即，前四個管柱體積之總匯)。
使用本文中所提供之方法，可有效地分離抗體組合物中之H2L3物質與H2L2物質。舉例而言，本文中所使用之方法可產生包含施加至陽離子交換樹脂之抗體組合物中所存在之H2L3物質之不超過25%、不超過20%、不超過15%、不超過10%或不超過5%的H2L2組合物。另一方面，本文中所使用之方法可產生包含施加至陽離子交換樹脂之抗體組合物中所存在之H2L3物質之至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的H2L3組合物。
藉由使用本文中所提供之方法，可獲得其中抗體或抗原結合片段之不超過2%、不超過1%或不超過0.5%為H2L3物質的H2L2組合物。藉由使用本文中所提供之方法，可獲得H2L2組合物中之抗體或其抗原結合片段之至少98%、至少99%或至少99.5%為H2L2抗體或其抗原結合片段的H2L2組合物。
藉由使用本文中所提供之方法，亦可獲得與施加至陽離子交換樹脂之抗體組合物相比含有較少聚集物之H2L2組合物。舉例而言，使用本文中所提供之方法，可獲得包含不超過1%聚集物或不超過0.5%聚集物之H2L2組合物。使用本文中所提供之方法，可獲得包含約0.3%聚集物、約0.2%聚集物或約0.1%聚集物之H2L2組合物。
有利地，本文中所提供之方法亦提供高產率。舉例而言，使用本文中所提供之方法，可獲得含有施加至陽離子交換樹脂之抗體組合物中之H2L2抗體或其抗原結合片段之至少40%、至少45%、至少50%或至少55%的H2L2組合物。
為了使陽離子交換樹脂平衡且促進H2L2及H2L3抗體與樹脂結合，可在將抗體組合物施加至樹脂之前將平衡組合物(或結合組合物)施加至樹脂。平衡組合物(結合組合物)可用於維持樹脂之pH值及/或傳導性。可用於此目的之適合緩衝液在此項技術中為熟知的，且包括pH值與用於分離H2L3物質與H2L2物質之層析步驟中所使用之所選樹脂相容的任何緩衝液。平衡組合物(結合組合物)可含有例如乙酸鈉，其濃度之高足以維持pH值，但不會過高而不能阻止抗體組合物中之抗體及其抗原結合片段與陽離子交換樹脂結合。
平衡組合物(結合組合物)可包含例如10 mM至150 mM乙酸鈉。平衡組合物(結合組合物)可包含例如25 mM至150 mM乙酸鈉。平衡組合物(結合組合物)可包含50 mM乙酸鈉。
在一些實施例中，平衡組合物(結合組合物)不含20 mM乙酸鈉。在一些實施例中，平衡組合物(結合組合物)含有超過20 mM乙酸鈉。
平衡組合物(結合組合物)亦可具有特定pH值，例如約3.8至約6.5。平衡組合物(結合組合物)可具有約3.8至約5.5之pH值。平衡組合物(結合組合物)可具有約3.8至約5.0之pH值。平衡組合物(結合組合物)可具有約3.8至約4.7之pH值。平衡組合物(結合組合物)可具有約3.8至約4.4之pH值。平衡組合物(結合組合物)可具有約3.8至約4.2之pH值。平衡組合物(結合組合物)可具有約4.0至約5.0之pH值。平衡組合物(結合組合物)可具有約4.0至約4.7之pH值。平衡組合物(結合組合物)可具有約4.0至約4.4之pH值。平衡組合物(結合組合物)可具有約4.0至約4.2之pH值。平衡組合物(結合組合物)可具有約4.2之pH值。
在一些實施例中，平衡組合物(結合組合物)之pH值不為6.0。在一些實施例中，平衡組合物(結合組合物)之pH值低於6.0。
如本文中所顯示，將H2L3抗體或其抗原結合片段自包含H2L3抗體或其抗原結合片段及H2L2抗體或其抗原結合片段之抗體組合物中分離之方法可包括：(i)將該抗體組合物施加至陽離子交換樹脂，使得H2L3抗體或其抗原結合片段及H2L2抗體或其抗原結合片段結合至樹脂；(ii)將溶析組合物施加至陽離子交換樹脂；及(iii)收集自樹脂溶析之H2L2組合物。該方法可視情況包括在將抗體組合物施加至陽離子交換樹脂之前將平衡組合物(結合組合物)施加至陽離子交換樹脂。如本文中所顯示，陽離子交換樹脂之選擇以及溶析組合物之pH值及鹽濃度可有利地致使所有H2L3物質在H2L2峰溶析之後溶析，且允許收集存在極少(例如少於1%)至不存在H2L3物質之H2L2組合物。VI. H2L2 組合物之用途
根據本文中所提供之方法，可將三輕鏈(H2L3)抗體及其抗原結合片段與雙輕鏈(H2L2)抗體及其抗原結合片段分離以產生H2L2組合物。此種H2L2組合物適用於例如治療目的。舉例而言，H2L2組合物可用於調配包含高純H2L2抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物，例如包含不超過例如1%或0.5% H2L3物質之組合物。
根據本文中所提供之方法產生的H2L2組合物亦可用於產生免疫結合物。有利地，由本文中所提供之H2L2組合物產生之免疫結合物將存在極少至不存在H2L3物質。此種免疫結合物可藉由使用連接基團以便將藥物或前藥連接至抗體或其抗原結合片段來製備。適合之連接基團在此項技術中為熟知的，且包括例如二硫基、硫醚基、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團及酯酶不穩定基團。個別免疫結合物可含有例如每個抗體或其抗原結合片段1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個藥物或前藥。包含此種免疫結合物之組合物可具有每個抗體或其抗原結合片段平均約1至約10、約1至約5、約1至約3或約1.5至約2.1個藥物或前藥。
根據本文中所提供之方法產生之免疫結合物組合物可包含不超過2%、不超過1%或不超過0.5%之H2L3物質。根據本文中所提供之方法產生之免疫結合物組合物可包含至少98%、至少99%或至少99.5%之H2L2物質。
舉例而言，包含H2L2抗CD123抗體或其抗原結合片段(例如huCD123-6Gv4.7；G4723A)之H2L2組合物可與細胞毒性劑結合而形成免疫結合物。細胞毒性劑可為例如吲哚啉并苯并二氮呯殺癌劑，諸如DGN549-C。產生此種免疫結合物之方法提供於例如WO 2017/004025及WO 2017/004026中；該兩案之內容係以引用之方式整體併入本文中。
在一些實施例中，包含H2L2抗CD123抗體或其抗原結合片段(例如，huCD123-6Gv4.7；G4723A)之H2L2組合物可與DGN549-C結合。所得免疫結合物組合物可含有每個抗體(huCD123-6Gv4.7；G4723A)平均約1.5至約2.1個細胞毒素(DGN549-C)。免疫結合物組合物可調配於硫酸氫鈉中以形成如圖8A (及8B)中所示之IMGN632。 實例
應理解，本文中所描述之實例及實施例僅出於說明目的，且根據其進行之各種修改或變化將建議給熟習此項技術者並且將包括在本申請案之精神及權限內。實例 1 ： H2L3 水準之評定
先前已報導，經穩定轉染以表現經半胱胺酸工程改造之抗體的哺乳動物細胞亦分泌稱為三輕鏈(H2L3)抗體之高分子量物質(Gomez等人, Biotechnol Bioeng. 2010 Mar 1;105(4):748-60)。此等抗體含有與抗體上經工程改造之半胱胺酸締合的額外(第三)輕鏈。由於與單體物質具有諸多相似性，故而在經半胱胺酸工程改造之單株抗體(CysmAb)的下游純化期間分離此種新高分子量(HMW)物質成為一個挑戰。為了開發穩定且有效之純化策略來移除H2L3物質，評估例示性抗體中之H2L3含量且評定多種用於移除H2L3之方法。
所研究之例示性單株抗體為經半胱胺酸工程改造之huCD123-6Gv4.7 (G4723A)抗體(參見WO 2017/004025及WO 2017/004026，兩案之內容係以引用之方式整體併入本文中；亦參見以上表1至表3)。在CHO細胞中表現該抗體，隨後使用蛋白A層析法自澄清細胞培養物上清液中對其進行純化。在蛋白A層析之後，使用尺寸排阻超高效液相層析法(SEC-UPLC)來評定抗體之純度(包括單體、聚集物、H2L3及低分子量物質之百分比)。SEC-UPLC分析顯示H2L3物質(圖1)。SEC-UPLC層析圖顯示CysmAb組成物質之各峰的滯留時間：單體(17.686分鐘)、聚集物(15.336分鐘)、H2L3 (16.638分鐘)及低分子量物質(19.008分鐘及22.445分鐘) (圖1)。
對使用同一抗體之八個不同生物反應器生產批次(A、B、C、D、E、F、G及H)之實驗進行分析。H2L3之量受細胞株及培養條件二者影響且自2%至11%變化(圖2)。實例 2 ：陶瓷氫氧磷灰石層析對 H2L3 分離無效
使用陶瓷氫氧磷灰石(CHT)層析未有效地達成H2L3物質之移除。(圖3。)在此等實驗中，用含有20 mM磷酸鉀之緩衝液在pH 6.7下使CHT管柱平衡。將含4.7% H2L3物質之CysmAb裝載至CHT™ 樹脂(BioRad Laboratories，Hercules，CA)上，且藉由使用100 mM、95 mM、90 mM或85 mM磷酸鉀緩衝液在pH 6.7下進行階段溶析來加以溶析。收集1CV溶析份中在50 mAU以上之溶析峰。對各溶析份之抗體階段產率及H2L3%進行分析，且用於計算及與6個管柱體積(CV)虛擬池之階段產率及H2L3%進行比較。認為高分子量物質(亦即，聚集物及H2L3)將由於其尺寸較大而更強地結合於CHT樹脂上，並且將溶析於晚期溶析份中。此外，認為用較低磷酸鹽濃度進行溶析將獲得虛擬池之較寬溶析峰及較低階段產率，同時改良分離。然而，圖3顯示在測試磷酸鹽範圍內H2L3物質之移除未得以改良並且仍高達2.5%。改變鹽濃度之額外實驗亦未能有效地分離H2L3物質，且幾無改變CHT管柱中之pH值的餘地。因而，CHT層析法不能夠有效地分離H2L3。實例 3 ：最佳化陽離子交換層析法有效地分離 H2L3
使用POROSTM XS強陽離子交換層析法來測試H2L3物質之移除。用含50 mM乙酸鈉之緩衝液在pH 5.5下使POROSTM 強陽離子交換樹脂XS (Life Technologies Corporation，Carlsbad，CA)平衡。將含3%聚集物及4% H2L3物質之CysmAb組合物裝載至POROSTM XS管柱上且藉由使用0-200 mM NaCl梯度溶析20 CV來加以溶析。收集0.5 CV溶析份中在50 mAU以上之溶析峰。分析各溶析份之抗體階段產率、聚集物%及H2L3%，且針對溶析份編號進行繪圖。圖4顯示聚集物物質溶析於晚期溶析份(F8-F10)中且有效地與溶析抗體之主峰分離。H2L3物質亦溶析於除溶析抗體之主峰以外的不同溶析份中。H2L3物質之顯著部分溶析於晚期溶析份中且有效地與H2L2抗體之主峰分離(圖4)。然而，H2L3物質之一部分與抗體峰之早期溶析份共同溶析(圖4)。據信早期溶析之H2L3物質由以麩胱甘肽封端之H2L3抗體中之游離半胱胺酸產生。麩胱甘肽封端之物質具有較強酸性(較低PI)且因此溶析於較早溶析份中。晚期溶析之H2L3物質據信由以半胱胺酸封端之H2L3抗體中之游離半胱胺酸產生。半胱胺酸封端之物質具有較弱酸性(較高PI)且因此溶析於較晚溶析份中。
鑒於此等結果，設計對POROSTM XS管柱結合及溶析條件進行進一步最佳化以使早期溶析之H2L3物質溶析於較晚溶析份中，以便更有效地將其與H2L2物質之主峰分離。發現降低Poros XS層析之結合及溶析pH值顯著改良H2L3物質之移除(圖5)。
使用POROSTM XS層析在pH 5.0、4.7及4.4下進行NaCl梯度溶析(在pH 5.0下，150-300 mM NaCl，20 CV；在pH 4.7及4.4下，0-500 mM NaCl，25 CV)。POROSTM XS樹脂裝載材料(抗體組合物)具有約8.4%之H2L3物質。收集0.5 CV溶析份中在100 mAU以上之溶析峰。分析各溶析份之抗體階段產率及H2L3%。將具有不同收集體積之虛擬池之H2L3%相對於各虛擬池之產率進行繪圖。抗體峰之較早溶析份中共同溶析之H2L3物質隨pH值降低而減少。圖5顯示降低POROSTM XS管柱之結合及溶析pH值顯著改良H2L3物質之移除，故在較低pH值下進行溶析產生具有較低H2L3物質之產物。在pH 4.4下，H2L3有效地與抗體分離且僅溶析於較晚溶析份中。在較低pH值下進行溶析產生具有較低H2L3物質之產物(H2L2組合物)。
溶析峰之鹽濃度及收集體積亦顯示影響H2L3移除(圖6)。在此等實驗中，將具有約4.1% H2L3物質之起始材料(抗體組合物)裝載至用50 mM乙酸鈉在pH 4.2下平衡之POROSTM XS管柱上。用含380 mM至420 mM NaCl之50 mM乙酸鈉緩衝液在pH 4.2下溶析結合之抗體。收集1 CV溶析份中在100 mAU以上之溶析峰。對在不同NaCl濃度及不同收集體積下溶析之虛擬池之H2L3%進行比較。圖6顯示NaCl濃度愈低且收集體積愈小，則溶析庫中所達成之H2L3%愈低。在測試NaCl濃度範圍內，虛擬池之H2L3%均自4.1%降至＜1%。
使用JMP®預測分析工具來分析圖6中之實驗結果。構建數學模型來預測不同鹽濃度及收集體積下之產率、聚集物%、H2L3%及總高分子量(HMW)%。圖7顯示鹽濃度顯著影響所有反應，而收集體積僅顯著影響階段產率。基於產物品質要求及實務考量來設定各應答之合意度。最終製程條件考量鹽濃度與收集體積之具有最高總體合意度之組合。
藉由對包括pH值、鹽濃度、裝載密度及收集體積在內之結合及溶析條件進行最佳化，最終產物中之H2L3水準始終降至＜1% (表4；在與以上所描述相同之POROS條件下使用pH 4.2、400 mM NaCl、收集4CV (亦即，管柱體積1至4)進行實驗)。 表4. 包括pH值、鹽濃度、裝載密度及收集體 積在內之結合及溶析條件之最佳化。
基於以上描述之實驗，確定pH值、鹽、裝載密度及收集體積之理想範圍如下：pH值為約3.8至6.5、鹽濃度為約100 mM至600 mM、裝載密度為約10-100 g/L，且收集體積為約1至9個CV。 * * *
應瞭解，[實施方式]部分而非[發明內容]及[發明摘要]部分意欲用於解釋申請專利範圍。[發明內容]及[發明摘要]部分闡述如諸位發明人所設想之本發明之一或多個但並非所有例示性實施例，且因而不意欲以任何方式限制本發明及所附申請專利範圍。
上文已在說明規定功能及其關係之實現方式的功能構建塊的幫助下描述本發明。為了便於描述，本文中已任意地定義此等功能構建塊之邊界。可定義替代邊界，只要適當地執行規定功能及其關係即可。
以上特定實施例之描述將全面揭示本發明之一般特性，以便其他人可在不背離本發明之一般概念的情況下藉由應用熟習此項技術者能力範圍內之知識在不過度實驗之情況下容易地對此種特定實施例進行修改及/或改以供用於多種應用。因此，基於本文中所呈現之教授內容及指導，此種改適及修改意欲在所揭示之實施例的等效方案的含義及範圍內。應理解，本文中之片語或術語係出於描述而非限制之目的，因此將由熟習此項技術者根據該等教授內容及指導加以解釋本說明書之術語或片語。
本發明之寬度及範疇不應受以上描述之例示性實施例中之任一者限制，而是應僅根據以下申請專利範圍及其等效物來定義。
圖1顯示經半胱胺酸工程改造之單株抗體(CysmAb)組合物在蛋白A純化後之粒徑排阻超高效液相層析(SEC-UPLC)層析圖。所指示之諸峰表示CysmAb單體、聚集物、三輕鏈抗體(H2L3)及低分子量(LMW)物質。層析圖之y軸為吸光度強度(以AU或吸光度單位為單位)之量度。x軸以時間(分鐘)為單位，且用於確定各峰之滯留時間。
圖2顯示不同的生物反應器生產批次(A、B、C、D、E、F、G及H)中之聚集物(深灰色柱條)及H2L3抗體(淡灰色柱條)之百分比。批次A及批次B中之聚集物及H2L3抗體係於細胞株A中產生。批次C及批次D中之聚集物及H2L3抗體係於細胞株B中產生。批次E、批次F、批次G及批次H中之聚集物及H2L3抗體係於細胞株C中產生。
圖3顯示在不同的鹽濃度(100 mM、95 mM、90 mM或85 mM磷酸鉀緩衝液)下進行陶瓷氫氧磷灰石(CHT)純化之後溶析液中之H2L3抗體百分比。裝載物H2L3% (深灰色柱條)，溶析液H2L3% (淡灰色柱條)。
圖4顯示經半胱胺酸工程改造之mAb物質之溶析概況與聚集物及H2L3物質之溶析概況的重疊圖。量測溶析份1至溶析份10 (F1-F10) (x軸)中每一者之溶析份產率% (黑色線)、聚集物% (淡灰色柱條)及H2L3% (深灰色柱條)。
圖5顯示在不同的溶析pH值下溶析池中之H2L3百分比。較高pH值(實線、黑色圓)、中等pH值(虛線、空心圓)、較低pH值(虛線、黑色圓)、起始H2L3 (黑色直線)。
圖6顯示在不同的NaCl濃度(420 mM、410 mM、400 mM、390 mM及380 mM)及收集體積(CV1-3、CV1-4、CV1-5及小於/等於7CV)下溶析液中之H2L3百分比。起始H2L3 (黑色直線)。
圖7顯示基於CysmAb純化之統計合意度分析的用於POROSTM XS陽離子交換層析之最終溶析條件。
圖8A顯示IMGN632之化學結構。IMGN632為包含處於亞硫酸氫鈉中之含有與細胞毒性有效負載DGN549-C連接之抗CD123 G4723抗體之免疫結合物的組合物。該組合物中之大部分免疫結合物呈圖8A中所示之磺化型式。
圖8B顯示亦可存在於IMGN632組合物中的含有與細胞毒性有效負載DGN549-C連接之抗CD123 G4723抗體的免疫結合物的未磺化形式(單亞胺結構)。

Claims (130)

  1. 一種將H2L3抗體或其抗原結合片段自包含H2L3抗體或其抗原結合片段及H2L2抗體或其抗原結合片段之抗體組合物中分離之方法，該方法包括： 　　(i) 將該抗體組合物施加至陽離子交換樹脂，使得H2L3抗體或其抗原結合片段及H2L2抗體或其抗原結合片段結合至該樹脂； 　　(ii) 將具有約3.8至約5.0之pH值的溶析組合物施加至該陽離子交換樹脂；及 　　(iii) 收集自該樹脂溶析之H2L2組合物。
  2. 一種將H2L3抗體或其抗原結合片段自包含H2L3抗體或其抗原結合片段及H2L2抗體或其抗原結合片段之抗體組合物中分離之方法，該方法包括： 　　(i) 將該抗體組合物施加至陽離子交換樹脂，使得H2L3抗體或其抗原結合片段及H2L2抗體或其抗原結合片段結合至該樹脂； 　　(ii) 將具有約300 mM至約600 mM之鹽濃度的溶析組合物施加至該陽離子交換樹脂；及 　　(iii) 收集自該樹脂溶析之H2L2組合物。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該H2L2組合物中之該等抗體或其抗原結合片段之不超過2%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
  4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該H2L2組合物中之該等抗體或其抗原結合片段之不超過1%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
  5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該H2L2組合物中之該等抗體或其抗原結合片段之不超過0.5%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之方法，其中該H2L2組合物中之該等抗體或其抗原結合片段之至少98%、至少99%或至少99.5%為H2L2抗體或其抗原結合片段。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之方法，其中該H2L2組合物包含施加至該陽離子交換樹脂之該抗體組合物中之該等H2L3抗體或其抗原結合片段的不超過25%、不超過20%、不超過15%、不超過10%或不超過5%。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中該H2L2組合物包含選自管柱體積1至9之一或多個溶析管柱體積。
  9. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中該H2L2組合物包含溶析管柱體積1至4。
  10. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之方法，其中該陽離子交換樹脂包含交聯聚(苯乙烯二乙烯苯)。
  11. 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之方法，其中該陽離子交換樹脂包含磺丙基(-CH2 CH2 CH2 SO3 -)表面官能基。
  12. 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之方法，其中該陽離子交換樹脂之粒徑為約50 μm。
  13. 如申請專利範圍第1項至第12項中任一項之方法，其中該陽離子交換樹脂具有雙峰孔徑分佈。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該雙峰孔徑分佈包括直徑為約500 nM之孔隙及直徑為約22 nM之孔隙。
  15. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之方法，其中該陽離子交換樹脂為POROSTM 強陽離子交換樹脂XS。
  16. 如申請專利範圍第1項或第3項至第15項中任一項之方法，其中該溶析組合物包含鹽。
  17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該溶析組合物中之該鹽為氯鹽。
  18. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該氯鹽為氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂。
  19. 如申請專利範圍第16項至第18項中任一項之方法，其中該溶析組合物中之鹽濃度為約100 mM至約600 mM、約300 mM至約500 mM或約350 mM至約450 mM。
  20. 如申請專利範圍第2項至第15項中任一項之方法，其中該溶析組合物中之鹽濃度為約300 mM至約500 mM或約350 mM至約450 mM。
  21. 如申請專利範圍第19項或第20項之方法，其中該溶析組合物中之鹽濃度為約400 mM。
  22. 如申請專利範圍第2項至第21項中任一項之方法，其中該溶析組合物具有約3.8至約6.5之pH值。
  23. 如申請專利範圍第1項至第22項中任一項之方法，其中該溶析組合物具有約3.8至約5.0之pH值。
  24. 如申請專利範圍第22項或第23項之方法，其中該溶析組合物具有約4.2之pH值。
  25. 如申請專利範圍第1項至第24項中任一項之方法，其中該方法包括在將該抗體組合物施加至該陽離子交換樹脂之前將平衡組合物施加至該陽離子交換樹脂。
  26. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該平衡組合物包含乙酸鈉。
  27. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該平衡組合物中之該乙酸鈉之濃度為約10 mM至150 mM。
  28. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該平衡組合物中之該乙酸鈉之濃度為約50 mM。
  29. 如申請專利範圍第25項至第28項中任一項之方法，其中該平衡組合物具有約3.8至約6.5之pH值。
  30. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該平衡組合物具有約4.2之pH值。
  31. 如申請專利範圍第1項至第30項中任一項之方法，其中該抗體組合物包含約10至約100 g/L蛋白質。
  32. 如申請專利範圍第31項之方法，其中該抗體組合物包含約30 g/L至約50 g/L或約35 g/L至約45 g/L蛋白質。
  33. 如申請專利範圍第32項之方法，其中該抗體組合物包含約40 g/L蛋白質。
  34. 如申請專利範圍第1項至第33項中任一項之方法，其中該抗體組合物具有約3.8至約6.5之pH值。
  35. 如申請專利範圍第34項之方法，其中該抗體組合物具有約4.2之pH值。
  36. 如申請專利範圍第1項至第35項中任一項之方法，其中該抗體組合物中之該等抗體或其抗原結合片段之約1%至約20%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
  37. 如申請專利範圍第36項之方法，其中該抗體組合物中之該等抗體或其抗原結合片段之約1%至約15%、或約5%至約15%、或約3%至約12%、或約10%至約15%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
  38. 如申請專利範圍第1項至第37項中任一項之方法，其中該H2L2組合物包含施加至該陽離子交換樹脂之該抗體組合物中之該等H2L2抗體或其抗原結合片段的至少40%、至少45%、至少50%或至少55%。
  39. 如申請專利範圍第1項至第38項中任一項之方法，其中該抗體組合物包含經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段。
  40. 如申請專利範圍第39項之方法，其中該等經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段在EU/OU編號位置442處包含工程改造之半胱胺酸殘基。
  41. 如申請專利範圍第1項至第40項中任一項之方法，其中該抗體組合物包含抗體。
  42. 如申請專利範圍第1項至第40項中任一項之方法，其中該抗體組合物包含抗體之抗原結合片段。
  43. 如申請專利範圍第1項至第40項之方法，其中該抗體組合物包含Fab、Fab'、F(ab')2 、Fd、單鏈Fv或scFv、二硫鍵連接之Fv、V-NAR結構域、IgNar、內抗體、IgGΔCH2、微型抗體、F(ab')3 、四功能抗體、三功能抗體、雙功能抗體、單結構域抗體、DVD-Ig、Fcab、mAb2 、(scFv)2 或scFv-Fc。
  44. 如申請專利範圍第1項至第43項中任一項之方法，其中該抗體組合物包含由CHO細胞株產生之抗體或其抗原結合片段。
  45. 如申請專利範圍第1項至第44項中任一項之方法，其更包括使該H2L2組合物中之該等H2L2抗體或其抗原結合片段與細胞毒素結合以形成免疫結合物組合物。
  46. 一種H2L2組合物，其係根據如申請專利範圍第1項至第45項中任一項之方法產生。
  47. 如申請專利範圍第46項之H2L2組合物，其包含不超過2% H2L3抗體或其抗原結合片段。
  48. 如申請專利範圍第47項之H2L2組合物，其包含不超過1% H2L3抗體或其抗原結合片段。
  49. 如申請專利範圍第48項之H2L2組合物，其包含不超過0.5% H2L3抗體或其抗原結合片段。
  50. 一種免疫結合物組合物，其係根據如申請專利範圍第45項之方法產生。
  51. 如申請專利範圍第50項之免疫結合物組合物，其包含不超過2% H2L3抗體或其抗原結合片段。
  52. 如申請專利範圍第51項之免疫結合物組合物，其包含不超過1% H2L3抗體或其抗原結合片段。
  53. 如申請專利範圍第52項之免疫結合物組合物，其包含不超過0.5% H2L3抗體或其抗原結合片段。
  54. 如申請專利範圍第1項之方法，其中 　　(i) 該陽離子交換樹脂包含交聯聚(苯乙烯二乙烯苯)、磺丙基(-CH2 CH2 CH2 SO3 -)表面官能基、約50 μm之粒徑以及包括直徑為約500 nM之孔隙及直徑為約22 nM之孔隙的雙峰孔徑分佈； 　　(ii) 該溶析組合物包含約300至600 mM氯鹽及約3.8至約5.0之pH值； 　　(iii) 該抗體組合物包含約10至約100 g/L蛋白質且該抗體組合物中之該等抗體或其抗原結合片段之約10%至約15%為H2L3抗體或其抗原結合片段； 　　(iv) 該H2L2組合物包含選自管柱體積1至9之一或多個溶析管柱體積；且 　　(v) 該H2L2組合物中之該等抗體或其抗原結合片段之不超過2%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
  55. 如申請專利範圍第1項之方法，其中 　　(i) 該陽離子交換樹脂包含交聯聚(苯乙烯二乙烯苯)、磺丙基(-CH2 CH2 CH2 SO3 -)表面官能基、約50 μm之粒徑以及包括直徑為約500 nM之孔隙及直徑為約22 nM之孔隙的雙峰孔徑分佈； 　　(ii) 該溶析組合物包含約400 mM NaCl及約4.2之pH值； 　　(iii) 該抗體組合物包含約30至約50 g/L蛋白質且該抗體組合物中之該等抗體或其抗原結合片段之約10%至約15%為H2L3抗體或其抗原結合片段； 　　(iv) 該H2L2組合物包含溶析管柱體積1至4；且 　　(v) 該H2L2組合物中之該等抗體或其抗原結合片段之不超過1%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
  56. 一種將抗CD123 H2L3抗體或其抗原結合片段自包含抗CD123 H2L3抗體或其抗原結合片段及抗CD123 H2L2抗體或其抗原結合片段之抗CD123抗體組合物中分離之方法，該方法包括： 　　(i) 將該抗CD123抗體組合物施加至陽離子交換樹脂，使得抗CD123 H2L3抗體或其抗原結合片段及抗CD123 H2L2抗體或其抗原結合片段結合至該樹脂； 　　(ii) 將具有約3.8至約5.5之pH值的溶析組合物施加至該陽離子交換樹脂； 　　(iii) 及收集自該樹脂溶析之抗CD123 H2L2組合物， 　　其中該等抗CD123 H2L3抗體或其抗原結合片段及該等抗CD123 H2L2抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO: 5-7之可變重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO: 8-10之可變輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
  57. 一種將抗CD123 H2L3抗體或其抗原結合片段自包含抗CD123 H2L3抗體或其抗原結合片段及抗CD123 H2L2抗體或其抗原結合片段之抗CD123抗體組合物中分離之方法，該方法包括： 　　(i) 將該抗CD123抗體組合物施加至陽離子交換樹脂，使得抗CD123 H2L3抗體或其抗原結合片段及抗CD123 H2L2抗體或其抗原結合片段結合至該樹脂； 　　(ii) 將具有約300 mM至約600 mM之鹽濃度的溶析組合物施加至該陽離子交換樹脂； 　　(iii) 及收集自該樹脂溶析之抗CD123 H2L2組合物， 　　其中該等抗CD123 H2L3抗體或其抗原結合片段及該等抗CD123 H2L2抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO: 5-7之可變重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO: 8-10之可變輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
  58. 如申請專利範圍第56項或第57項之方法，其中該抗CD123抗體包含SEQ ID NO:1之可變重鏈序列。
  59. 如申請專利範圍第56項至第58項中任一項之方法，其中該抗CD123抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:2之可變輕鏈序列。
  60. 如申請專利範圍第56項至第59項中任一項之方法，其中該抗CD123抗體或其抗原結合片段經半胱胺酸工程改造。
  61. 如申請專利範圍第56項至第60項中任一項之方法，其中該抗CD123抗體包含SEQ ID NO:3之重鏈序列。
  62. 如申請專利範圍第56項至第61項中任一項之方法，其中該抗CD123抗體包含SEQ ID NO:4之輕鏈序列。
  63. 如申請專利範圍第56項至第62項中任一項之方法，其中該H2L2組合物中之該等抗體或其抗原結合片段之不超過2%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
  64. 如申請專利範圍第63項之方法，其中該H2L2組合物中之該等抗體或其抗原結合片段之不超過1%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
  65. 如申請專利範圍第64項之方法，其中該H2L2組合物中之該等抗體或其抗原結合片段之不超過0.5%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
  66. 如申請專利範圍第56項至第65項中任一項之方法，其中該H2L2組合物中之該等抗體或其抗原結合片段之至少98%、至少99%或至少99.5%為H2L2抗體或其抗原結合片段。
  67. 如申請專利範圍第56項至第66項中任一項之方法，其中該H2L2組合物包含施加至該陽離子交換樹脂之該抗體組合物中之該等H2L3抗體或其抗原結合片段的不超過25%、不超過20%、不超過15%、不超過10%或不超過5%。
  68. 如申請專利範圍第56項至第67項中任一項之方法，其中該H2L2組合物包含選自管柱體積1至9之一或多個溶析管柱體積。
  69. 如申請專利範圍第56項至第68項中任一項之方法，其中該H2L2組合物包含溶析管柱體積1至4。
  70. 如申請專利範圍第56項至第69項中任一項之方法，其中該陽離子交換樹脂包含交聯聚(苯乙烯二乙烯苯)。
  71. 如申請專利範圍第56項至第70項中任一項之方法，其中該陽離子交換樹脂包含磺丙基(-CH2 CH2 CH2 SO3 -)表面官能基。
  72. 如申請專利範圍第57項至第72項中任一項之方法，其中該陽離子交換樹脂之粒徑為約50 μm。
  73. 如申請專利範圍第56項至第72項中任一項之方法，其中該陽離子交換樹脂具有雙峰孔徑分佈。
  74. 如申請專利範圍第73項之方法，其中該雙峰孔徑分佈包含直徑為約500 nM之孔隙及直徑為約22 nM之孔隙。
  75. 如申請專利範圍第56項至第74項中任一項之方法，其中該陽離子交換樹脂為POROSTM 強陽離子交換樹脂XS。
  76. 如申請專利範圍第56項或第58項至第75項中任一項之方法，其中該溶析組合物包含鹽。
  77. 如申請專利範圍第76項之方法，其中該溶析組合物中之該鹽為氯鹽。
  78. 如申請專利範圍第77項之方法，其中該氯鹽為氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂。
  79. 如申請專利範圍第76項至第78項中任一項之方法，其中該溶析組合物中之鹽濃度為約100 mM至約600 mM、約300 mM至約500 mM或約350 mM至約450 mM。
  80. 如申請專利範圍第57項至第78項中任一項之方法，其中該溶析組合物中之鹽濃度為約300 mM至約500 mM或約350 mM至約450 mM。
  81. 如申請專利範圍第79項或第80項之方法，其中該溶析組合物中之鹽濃度為約400 mM。
  82. 如申請專利範圍第57項至第81項中任一項之方法，其中該溶析組合物具有約3.8至約6.5之pH值。
  83. 如申請專利範圍第56項至第82項中任一項之方法，其中該溶析組合物具有約3.8至約5.0之pH值。
  84. 如申請專利範圍第82項或第83項之方法，其中該溶析組合物具有約4.2之pH值。
  85. 如申請專利範圍第56項至第84項中任一項之方法，其中該方法包括在將該抗體組合物施加至該陽離子交換樹脂之前將平衡組合物施加至該陽離子交換樹脂。
  86. 如申請專利範圍第85項之方法，其中該平衡組合物包含乙酸鈉。
  87. 如申請專利範圍第86項之方法，其中該平衡組合物中之該乙酸鈉之濃度為約10 mM至150 mM。
  88. 如申請專利範圍第86項之方法，其中該平衡組合物中之該乙酸鈉之濃度為約50 mM。
  89. 如申請專利範圍第85項至第88項中任一項之方法，其中該平衡組合物具有約3.8至約6.5之pH值。
  90. 如申請專利範圍第89項之方法，其中該平衡組合物具有約4.2之pH值。
  91. 如申請專利範圍第56項至第90項中任一項之方法，其中該抗體組合物包含約10至約100 g/L蛋白質。
  92. 如申請專利範圍第91項之方法，其中該抗體組合物包含約30 g/L至約50 g/L或約35 g/L至約45 g/L蛋白質。
  93. 如申請專利範圍第92項之方法，其中該抗體組合物包含約40 g/L蛋白質。
  94. 如申請專利範圍第56項至第93項中任一項之方法，其中該抗體組合物具有約3.8至約6.5之pH值。
  95. 如申請專利範圍第94項之方法，其中該抗體組合物具有約4.2之pH值。
  96. 如申請專利範圍第56項至第95項中任一項之方法，其中該抗體組合物中之該等抗體或其抗原結合片段之約1%至約20%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
  97. 如申請專利範圍第96項之方法，其中該抗體組合物中之該等抗體或其抗原結合片段中約1%至約15%、或約5%至約15%、或約3%至約12%、或約10%至約15%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
  98. 如申請專利範圍第56項至第97項中任一項之方法，其中該H2L2組合物包含施加至該陽離子交換樹脂之該抗體組合物中之該等H2L2抗體或其抗原結合片段的至少40%、至少45%、至少50%或至少55%。
  99. 如申請專利範圍第56項至第97項中任一項之方法，其中該抗體組合物包含經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段。
  100. 如申請專利範圍第99項之方法，其中該等經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段在EU/OU編號位置442處包含經工程改造之半胱胺酸殘基。
  101. 如申請專利範圍第56項至第100項中任一項之方法，其中該抗體組合物包含抗體。
  102. 如申請專利範圍第56項至第100項中任一項之方法，其中該抗體組合物包含抗體之抗原結合片段。
  103. 如申請專利範圍第56項至第100項之方法，其中該抗體組合物包含Fab、Fab'、F(ab')2 、Fd、單鏈Fv或scFv、二硫鍵連接之Fv、V-NAR結構域、IgNar、內抗體、IgGΔCH2、微型抗體、F(ab')3 、四功能抗體、三功能抗體、雙功能抗體、單結構域抗體、DVD-Ig、Fcab、mAb2 、(scFv)2 或scFv-Fc。
  104. 如申請專利範圍第56項至第103項中任一項之方法，其中該抗體組合物包含由CHO細胞株產生之抗體或其抗原結合片段。
  105. 如申請專利範圍第56項至第104項中任一項之方法，其更包括使該H2L2組合物中之該等H2L2抗體或其抗原結合片段與細胞毒素結合以形成免疫結合物組合物。
  106. 一種H2L2組合物，其係根據如申請專利範圍第56項至第105項中任一項之方法產生。
  107. 如申請專利範圍第106項之H2L2組合物，其包含不超過2% H2L3抗體或其抗原結合片段。
  108. 如申請專利範圍第107項之H2L2組合物，其包含不超過1% H2L3抗體或其抗原結合片段。
  109. 如申請專利範圍第108項之H2L2組合物，其包含不超過0.5% H2L3抗體或其抗原結合片段。
  110. 一種免疫結合物組合物，其係根據如申請專利範圍第105項之方法產生。
  111. 如申請專利範圍第110項之免疫結合物組合物，其包含不超過2% H2L3抗體或其抗原結合片段。
  112. 如申請專利範圍第111項之免疫結合物組合物，其包含不超過1% H2L3抗體或其抗原結合片段。
  113. 如申請專利範圍第112項之免疫結合物組合物，其包含不超過0.5% H2L3抗體或其抗原結合片段。
  114. 如申請專利範圍第56項之方法，其中 　　(i) 該陽離子交換樹脂包含交聯聚(苯乙烯二乙烯苯)、磺丙基(-CH2 CH2 CH2 SO3 -)表面官能基、約50 μm之粒徑以及包括直徑為約500 nM之孔隙及直徑為約22 nM之孔隙的雙峰孔徑分佈； 　　(ii) 該溶析組合物包含約300至600 mM氯鹽及約3.8至約5.0之pH值； 　　(iii) 該抗體組合物包含約10至約100 g/L蛋白質且該抗體組合物中之該等抗體或其抗原結合片段之約10%至約15%為H2L3抗體或其抗原結合片段； 　　(iv) 該H2L2組合物包含選自管柱體積1至9之一或多個溶析管柱體積；且 　　(v) 該H2L2組合物中之該等抗體或其抗原結合片段之不超過2%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
  115. 如申請專利範圍第57項之方法，其中 　　(i) 該陽離子交換樹脂包含交聯聚(苯乙烯二乙烯苯)、磺丙基(-CH2 CH2 CH2 SO3 -)表面官能基、約50 μm之粒徑以及包括直徑為約500 nM之孔隙及直徑為約22 nM之孔隙的雙峰孔徑分佈； 　　(ii) 該溶析組合物包含約400 mM NaCl及約4.2之pH值； 　　(iii) 該抗體組合物包含約30至約50 g/L蛋白質且該抗體組合物中之該等抗體或其抗原結合片段之約10%至約15%為H2L3抗體或其抗原結合片段； 　　(iv) 該H2L2組合物包含溶析管柱體積1至4；且 　　(v) 該H2L2組合物中之該等抗體或其抗原結合片段之不超過1%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
  116. 一種包含抗CD123抗體或其抗原結合片段之組合物，其中該等抗CD123抗體或其抗原結合片段之少於1%為H2L3抗體或其抗原結合片段，且其中該等抗CD123抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO: 5-7之可變重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO: 8-10之可變輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
  117. 如申請專利範圍第116項之組合物，其中該抗CD123抗體包含SEQ ID NO:1之可變重鏈序列。
  118. 如申請專利範圍第116項或第117項之組合物，其中該抗CD123抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:2之可變輕鏈序列。
  119. 如申請專利範圍第116項至第118項中任一項之組合物，其中該抗CD123抗體或其抗原結合片段經半胱胺酸工程改造。
  120. 如申請專利範圍第116項至第119項中任一項之組合物，其中該抗CD123抗體包含SEQ ID NO:3之重鏈序列。
  121. 如申請專利範圍第116項至第120項中任一項之組合物，其中該抗CD123抗體包含SEQ ID NO:4之輕鏈序列。
  122. 如申請專利範圍第116項至第121項中任一項之組合物，其中該等抗CD123抗體或其抗原結合片段之少於0.5%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
  123. 一種包含抗CD123免疫結合物之組合物，其中該等免疫結合物包含與DGN549-C連接之抗CD123抗體或其抗原結合片段，其中該等抗CD123抗體或其抗原結合片段之少於1%為H2L3抗體或其抗原結合片段，且其中該等抗CD123抗體或其抗原結合片段包含分別為SEQ ID NO: 5-7之可變重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及分別為SEQ ID NO: 8-10之可變輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
  124. 如申請專利範圍第123項之組合物，其中該抗CD123抗體包含SEQ ID NO:1之可變重鏈序列。
  125. 如申請專利範圍第123項或第124項之組合物，其中該抗CD123抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:2之可變輕鏈序列。
  126. 如申請專利範圍第123項至第125項中任一項之組合物，其中該抗CD123抗體或其抗原結合片段經半胱胺酸工程改造。
  127. 如申請專利範圍第123項至第126項中任一項之組合物，其中該抗CD123抗體包含SEQ ID NO:3之重鏈序列。
  128. 如申請專利範圍第123項至第127項中任一項之組合物，其中該抗CD123抗體包含SEQ ID NO:4之輕鏈序列。
  129. 如申請專利範圍第1項至第128項中任一項之組合物，其中該免疫結合物具有以下結構：。
  130. 如申請專利範圍第1項至第129項中任一項之組合物，其中該等抗CD123抗體或其抗原結合片段之少於0.5%為H2L3抗體或其抗原結合片段。
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