KR102413809B1 - 인간화 항-tf-항원 항체 - Google Patents

Abstract

톰젠-프리덴 라이히(TF) 인간 종양 항원에 특이적으로 결합하는 인간화 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이의 단편이 제공된다. 3개의 뚜렷한 가변 중쇄 및 3개의 가변 경쇄가 제공되고, 총 25개의 뚜렷한 중쇄 및 경쇄 조합을 제조하기 위해 혼합될 수 있다. 암 치료 및 진단 이미징을 위해 모노 클로날 항체(mAb) 및 이의 단편을 이용하는 방법은, 모노 클로날 항체(mAb) 및 이의 단편을 제조하기 위한 방법과 같이 제공된다. 또한, 모노 클로날 항체(mAb) 및 이의 단편을 발현하는 생체 외 세포 배양액, 및 키트가 제공된다.

Description

인간화 항-TF-항원 항체{HUMANIZED ANTI-TF-ANTIGEN ANTIBODIES}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2014년 4월 18일에 출원한 미국 가출원 제61/981,240의 우선권을 주장하는 것이고, 이 내용 전체는 여기에 참조로 인용된다.

본 발명은 일반적으로 톰젠-프리덴 라이히(Thomsen-Friedenreich, TF) 인간 종양 항원을 인식하는 인간화 항체, 및 모노클로날 항체를 이용하는 방법에 관한 것이다.

발암 과정 동안, 세포 표면 상의 탄수화물 구조의 생합성의 변화를 일으키고, 단백질에 또는 지질에 결합되는 다양한 다른 탄수화물이 종양-관련 항원으로 인식되어 왔다. 톰젠-프리덴 라이히(TF) 디사카라이드(disaccharide) (Galβ1-3GalNAcα)는 일반적으로 세린 또는 트레오닌 잔기에 O-결합되는 것이 발견되었다. TF-Ag (T 항원이라고도 알려진)는 췌장, 결장 및 유방에서 발견되는 것을 포함하는 일부 인간 암종(carcinomas)과 관련되어 있고, 이에 기초하여 팬-카시노마 마커(pan-carcinoma marker)로도 불린다. TF-Ag는 더 큰 글리칸 체인(chain)으로의 확장에 의해 정상적인 성인 조직의 면역 시스템으로부터 은폐된다. 암에서, 세포의 글리코실화 조직(cellular glycosylation machinery)은 TF 항원의 노출 및 이들 체인의 끊어짐이 생기는 것을 방해할 수 있다. TF-Ag를 타겟으로 할 수 있는 새로운 모노클로날 항체 및 이들의 항체 단편이 요망되고, 이는 본 발명에 의해 제공된다.

본 발명은 다양한 실시형태에서 TF+ 암의 치료를 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 실시형태에서, 본 발명은 TF-Ag에 특이적으로 결합하는, 부분적으로 인간화된(partially humanized) 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이의 단편을 포함한다. 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이의 단편은 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain)를 포함하고, 상기 중쇄는 이하로 이루지는 군으로부터 선택되는 시퀀스를 포함한다:

EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGFISPNTDYTEYNQKFRDRVT

MTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:7) (H1);

EVQLLESGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGFISPNTDYTEYNQKFRDRVT

LTADKSSSTAYMELSSLTSEDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:8) (H2); 및

EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVKQAPGQGLEWIGFISPNTDYTEYNQKFRDKAT

MTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:9) (H3),

및 이들의 조합.

상기 경쇄는 이하로 이루지는 군으로부터 선택되는 시퀀스를 포함한다:

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSG TKLEIK (SEQ ID NO:10) (L1);

DIVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSG TKLEIK (SEQ ID NO:11) (L2); 및

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSG TKLEIK (SEQ ID NO:12) (L3);

및 이들의 조합.

추가 버젼 H2, H3, L2 및 L3가 제조 및 시험 되었다. 이들은 이하를 포함한다:

중쇄 가변 부위(Heavy variable region) H2a:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGFISPNTDYTEYNQKFRDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTVTVS (SEQ ID NO:13)

중쇄 가변 부위 H3a:

EGQLLESGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTTYWMHWVKKRPGQGLEWIGFISPNTDYTEYNQKFRDKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSDDSAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:14)

경쇄 가변 부위(Light variable region) L2a:

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKVDIK (SEQ ID NO:15)

경쇄 가변 부위 L3a:

ELVMTQTPLSLPVNLGDQASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:16).

본 발명에 포함되는 중쇄 및 가변 쇄의 조합은 다음과 같다: H1-L1; H1-L2; H1-L2a; H1-L3; H1-L3a; H2-L1; H2-L2; H2-L2a; H2-L3; H2-L3a; H3-L1; H3-L2; H3-L2a; H3-L3; H3-L3a; H2a-L1; H2a-L2; H2a-L2a; H2a-L3; H2a-L3a; H3a-L1; H3a-L2; H3a-L2a; H3a-L3; 및 H3a-L3a.

일 실시형태에서, 상기 모노 클로날 항체(mAb)는 인간 IgG 불변 영역(constant region)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이들의 TF-Ag 결합 단편은 화학요법 치료제(chemotherapeutic drugs), 독소 및 방사성 동위원소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제제와 콘쥬게이트된다(conjugated).

다른 양태에서, 본 발명은 개체의 암 예방 및/또는 치료를 위한 방법을 포함하고, 상기 암은 TF-Ag를 발현하는 암 세포를 포함한다. 상기 방법은 상기 기재된 바와 같이, 개체의 하나 이상의 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이의 단편이 투여되는 것을 포함하고, 개체의 상기 암 세포의 성장, 또는 생존, 또는 전이, 또는 이들의 조합은 투여 후에 억제된다.

다른 양태에서, 부분적으로 인간화된 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이의 단편을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

다른 양태에서, 본 발명은 생체 외 세포 배양액(in vitro cell culture)을 제공하고, 세포 배양액 중 세포는 부분적으로 인간화된 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이의 단편을 발현한다.

다른 양태에서, 본 발명은 모노 클로날 항체(mAb) 및 이들의 TF-Ag 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 시퀀스, 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 이러한 발현 벡터를 포함하는 생체 외 세포 배양액을 제공한다. 일 실시형태에서, 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이들의 TF-Ag 결합 단편은 하나 이상의 발현 벡터에 의해 인코딩된다.

일 실시형태에서, 모노 클로날 항체(mAb) 및 이들의 TF-Ag 결합 단편을 제조하는 방법이 제공되고, 일반적으로 생체 외 세포 배양액에서 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이들의 TF-Ag 결합 단편, 또는 이들의 조합을 발현하는 단계, 및 세포 배양액으로부터 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이들의 TF-Ag 결합 단편, 또는 이들의 조합을 분리하는 단계를 포함한다.

또한, 모노 클로날 항체(mAb) 및 이들의 TF-Ag 결합 단편을 포함하는 키트가 제공된다.

도 1은 본 발명에 포함되는 JAA-F11 중쇄 가변 및 3개의 VH 변이체(H1, H2, 및 H3) 부위의 아미노산 시퀀스 얼라인먼트(amino acid sequence alignments)를 제공한다. 볼드체는 JAA-F11과 고안된 인간화 H 쇄 사이에 동일한 아미노산을 나타낸다; 볼드체 및 쉐이딩된 아미노산은 고안된 인간화 쇄와 마우스 JAA-F11 사이의 차이를 나타낸다. 볼드체 및 이탤릭채로 나타내는 위치 72에서의 알라닌은 입체 충동을 억제하는 것이 유지되는 마우스 잔기이다. CDRs(complementarity determining regions)는 이탤릭체로 쓰인다. 넘버링은 카밧 시스템(Kabat system)에 따른다. mJAAF11 시퀀스는 SEQ ID NO:17이다. H1 시퀀스는 SEQ ID NO:7이고; H2 시퀀스는 SEQ ID NO:8이고; H3 시퀀스는 SEQ ID NO:9이다.
도 2는 mJAA-F11 경쇄 가변(JAA-F11VH) 및 3개의 VL 변이체(L1, L2, 및 L3) 부위의 아미노산 시퀀스 얼라인먼트를 제공한다. 볼드체는 마우스 아미노산 또는 마우스 시퀀스와 동일한 아미노산을 나타내고, 볼드체 및 쉐이딩된 아미노산은 고안된 인간화 JAA-F11 변이체 및 마우스 JAA-F11 사이의 차이를 나타낸다. 볼드체 및 이탤릭채로 나타내는 위치 51에서의 류신은 입체 충동을 억제하는 것이 유지되는 마우스 잔기이다. mJAAF11 시퀀스는 SEQ ID NO:17이다. L1 시퀀스는 SEQ ID NO:10이고; L2 시퀀스는 SEQ ID NO:11이고; L3 시퀀스는 SEQ ID NO:12이다.
도 3. TF-Ag-BSA에 각각의 hJAA-F11 및 키메라 항체(chimeric antibody)의 결합을 평가하기 위해 ELISA에 의한 mJAA-F11 억제를 이용하여 상대적인 친화도(relative affinity)의 결정. 에러 바(Error bars)는 ± 1 표준 오차를 나타낸다.
도 4. 10 유방암 세포주에 hJAA-F11, 키메라 및 마우스 JAA-F11 (50 ㎍/mL)의 결합. 세포주는 3중 네거티브(HCC 70, BT 549, MDA-MB-231, MDA-MB-468, DU 4475), ER/PR-포지티브(HCC 1419, AU 565, MDA-kb2), 및 HER2-포지티브 (CAMA-1, HCC 1428)를 포함한다. 상기 시험된 세포주 전체에 대해서, hJAA-F11, 키메라 또는 마우스 JAA-F11 (50㎍/mL에서)에 결합은 TF-Ag 네거티브 대조군 골수종보다 현저히 높다(p≤0.05) (학생의 T-시험). 각각의 에러바는 ± 1 표준 오차를 나타낸다.
도 5. H3L3를 제외하고, 키메라 항체 및 인간화 JAA-F11 항체는 작지만(~6-11%), 종양 세포 성장의 통계적으로 현저한 억제를 야기한다. 세포 증식의 향상은 보이지 않는다. 현저한 결과는 2 또는 1 ug/ml로 임의의 항체에서 보이지 않는다.
도 6a. TA-Ag 포지티브 인간 유방암 세포주(BT 549)에 대한 마우스, 키메라, 및 4 hJAA-F11 작제물의 ADCC 활성. 결과는 세포의 100% 용해(lysis)과 비교하여 항체 시험된 세포에서의 퍼센트 세포 용해로 나타낸다. H2L2 및 H3L3은 인간 세포주의 모든 경우에 키메라 또는 마우스 항체(p<0.05)보다 통계학적으로 더욱 ADCC 활성을 보인다. 이는, 도너 # 1 및 도너 # 2 (3 이상의 독립 실험)으로부터 PBMCs에 대한 모든 실험의 대표적인 평균이다. 에러바는 ± 1 표준 오차를 나타낸다.
도 6b. PBMCs Donor #1에서 TA-Ag 포지티브 인간 유방암 세포주(BT 549)에 대한 마우스, 키메라, 및 4 hJAA-F11 작제물의 ADCC 활성. 결과는 세포의 100% 용해(lysis)과 비교하여 항체 시험된 세포에서의 퍼센트 세포 용해로 나타낸다. H2L2 및 H3L3은 인간 세포주의 모든 경우에 키메라 또는 마우스 항체(p<0.05)보다 통계학적으로 더욱 ADCC 활성을 보인다. 이는, 적어도 3 독립 실험의 평균이다. 에러바는 ± 1 표준 오차를 나타낸다.
도 6c. Donor #2로부터 PBMCs에 대한 TA-Ag 포지티브 인간 유방암 세포주(BT 549)에 대한 마우스, 키메라, 및 4 hJAA-F11 작제물의 ADCC 활성. 결과는 세포의 100% 용해(lysis)와 비교하여 항체 시험된 세포에서의 퍼센트 세포 용해로 나타낸다. H2L2 및 H3L3은 인간 세포주의 모든 경우에 키메라 또는 마우스 항체(p<0.05)보다 통계학적으로 더욱 ADCC 활성을 보인다. 이는, 적어도 3가지의 독립 실험의 평균이다. 에러바는 ± 1 표준 오차를 나타낸다.
도 6d. 4T1 TA-Ag 포지티브 마우스 유방암 세포주에 대한 마우스, 키메라, 및 3 hJAA-F11 작제물의 ADCC 활성. 결과는 세포의 100% 용해(lysis)와 비교하여 항체 시험된 세포에서의 퍼센트 세포 용해로 나타낸다. H3L3 및 키메라는 마우스 항체(p<0.05)보다 통계학적으로 더욱 ADCC 활성을 보인다. 에러바는 ± 1 표준 오차를 나타낸다. ADCC는 도너 #3으로부터 PBMCS와 오직 한번 수행된다.
도 7. 인간화, 키메라 및 마우스 JAA-F11은 CDC(complement dependent cytotoxicity)를 유도하지 않는다. 인간 HCC 1428 유방암 세포주에 대한 마우스, 키메라, 및 2 hJAA-F11 작제물의 CDC 활성이 시험된다. 결과는 세포의 100% 용해(lysis)과 비교하여 항체 시험된 세포에서의 퍼센트 세포 용해로 나타낸다. 시약 키트에 포함되는 포지티브 대조군: LDH 포지티브 세포는 용해를 보인다. 에러바는 ± 1 표준 오차를 나타낸다.
도 8. 표면 결합을 측정하기 위해 효소 면역법을 이용하는 마우스, 키메라, 및 4 hJAA-F11 항체의 내재화(internalization). 내재화는 37 ℃ 또는 4 ℃에서 항체를 갖는 마우스 4T1 유방암 세포의 배양에 의해 분석된다. 기대되는 바와 같이, 패턴은 도 20에서 H3L3으로 도시되는 ADCC 패턴과 반대이고, ADCC가 유도되고, 내재화되는 H2L2에서 예측되지 않는다. 마우스, H2L2, 키메라 Ab, H2L3, 및 H1L1은 현저히 내재화된다(p<0.05). 에러바는 ± 1 표준 오차를 나타낸다.
도 9. 4T1 종양에 걸린 마우스의 hJAA-F11 항체의 면역 조직화를 나타내는 MicroPET 이미지.
도 10. 4T1 종양에 걸린 마우스의 갑상선에 124요오드가 없는 국부화를 나타내는 MicroPET 이미지.

본 발명은 구체적으로 TF-Ag를 인식하는 뚜렷한 인간화 모노 클로날 항체(mAb) 및 이의 단편, 모노 클로날 항체(mAb)의 제조 방법, 및 예방 및/또는 치료 목적, 및 진단 이미징을 위해 모노 클로날 항체(mAb)를 이용하는 방법을 포함한다. 본 발명에 의해 제공되는 모노 클로날 항체(mAb)의 아미노산 시퀀스는 ATCC 카탈로그 번호 CRL-2381 하에 기증되는 하이브리도마(hybridoma)에 의해 제조되는 모노 클로날 항체(mAb)의 아미노산 시퀀스를 변경하기 위한 새로운 시도를 이용하여 개발되었고, 모노 클로날 항체(mAb)의 프레임워크 부위는 특이성을 유지하고, 면역원성(immunogenicity)을 감소시키는 지시된 방법으로 쥐(murine) 및 인간 면역글로불린 (Ig) 시퀀스를 도입한다. 하이브리도마는 JAA-F11로 알려진 모노 클로날 항체(mAb)를 생성한다. 쥐 프레임워크 부위의 맥락에서 JAA-F11 시퀀스로 도입된 변경은 TF-Ag를 발현하는 암 세포를 포함하는 임의의 다수의 암을 방지하기에 적합한 25개의 뚜렷한 모노 클로날 항체(mAb)를 생성하기 위해 혼합될 수 있는 3개의 뚜렷한 가변 중쇄 및 3개의 뚜렷한 가변 경쇄의 앙상블을 야기한다. 또한, 모노 클로날 항체(mAb)는 개체에 뚜렷한 항암 메커니즘을 바람직하게 유도하는 것을 특히 적합하게 하는 바람직한 특성을 갖는다. 예컨대, 중쇄 및 경쇄의 선택에 기초하여, 본 발명은 향상된 항체-의존 세포 독성, 또는 보체 의존 세포 독성(complement dependent cytotoxicity), 또는 모노 클로날 항체(mAb)의 내재화를 자극하기 위해 제공되는 것을 포함한다.

본 발명의 실시형태는 JAA-F11 모노 클로날 항체(mAb)로부터 CDR 시퀀스를 포함한다. 이들은 VH chain: CDR1: SGYTFTTYWMH; (SEQ ID NO:1); CDR2: FISPNTDYTEYNQKFRD; (SEQ ID NO:2); CDR3: RSFIGYNFDFWGQGT; (SEQ ID NO:3); 및 VL chain: CDR1: CRSSQTIVYSNGNTYLEW; (SEQ ID NO:4); CDR2: KVSNRFSGVPD; (SEQ ID NO:5); 및 CDR3: CFQGSHVPFTGSG; (SEQ ID NO:6)이다.

CDR 시퀀스는 변형된 프레임워크 시퀀스의 맥락에서 위치한다. 결과적으로, 모노 클로날 항체(mAb) 및 이들의 TF-Ag 결합 단편은 이하로부터 선택되는 중쇄를 포함한다:

H1 - EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGFISPNTDYTEYNQKFR

DRVTMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:7);

H2 -EVQLLESGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGFISPNTDYTEYNQKFRDR

VTLTADKSSSTAYMELSSLTSEDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:8);

H3 - EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVKQAPGQGLEWIGFISPNTDYTEYNQKFRD

KATMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:9) 및

이들의 조합;

및 이하로부터 선택되는 경쇄를 포함한다:

L1 - DVVMTQSPLSLPVTLGQPASIS CRSSQTIVYSNGNTYLEW FQQRPGQSPRLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY CFQGSHVPFTFGSG TKLEIK (SEQ ID NO:10);

L2 - DIVMTQTPLSLPVTLGQPASIS CRSSQTIVYSNGNTYLEW FQQRPGQSPRLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY CFQGSHVPFTFGSG TKLEIK (SEQ ID NO:11);

L3 - DVVMTQSPLSLPVTLGQPASIS CRSSQTIVYSNGNTYLEW YLQRPGQSPRLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYY CFQGSHVPFTFGSG TKLEIK (SEQ ID NO:12)

및 이들의 조합.

상기 시퀀스 이외에, 하기 중쇄 및 경쇄가 소정의 조합으로 제조 및 시험되었다:

중쇄 가변 부위 H2a:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGFISPNTDYTEYNQKFRD

RVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTVTVS (SEQ ID NO:13)

중쇄 가변 부위 H3a:

EGQLLESGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTTYWMHWVKKRPGQGLEWIGFISPNTDYTEYNQKFRD

KATLTADKSSTTAYMQLSSLTSDDSAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:14)

경쇄 가변 부위 L2a:

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFS

GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKVDIK (SEQ ID NO:15)

경쇄 가변 부위 L3a:

ELVMTQTPLSLPVNLGDQASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFS

GSGSGTDFTLKISRVEADDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:16).

본 발명은 상기 시퀀스를 포함하거나 상기 시퀀스로 이루어지는 아미노산 시퀀스를 포함하는 모노 클로날 항체(mAb) 및 이의 TF-Ag 결합 단편을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 모노 클로날 항체(mAb) 및 이의 TF-Ag 결합 단편을 포함하고, 프레임워크 및 CDR 시퀀스는 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, 및 SEQ ID NO:16로 이루어진다.

따라서, 이하 25 중쇄 및 경쇄 조합은 본 발명에 의해 포함된다: H1-L1; H1-L2; H1-L2a; H1-L3; H1-L3a; H2-L1; H2-L2; H2-L2a; H2-L3; H2-L3a; H3-L1; H3-L2; H3-L2a; H3-L3; H3-L3a; H2a-L1; H2a-L2; H2a-L2a; H2a-L3; H2a-L3a; H3a-L1; H3a-L2; H3a-L2a; H3a-L3; 및 H3a-L3a. 일 실시형태에서, 본 발명은 H1L1, H2L2, H3L3, H2L3, H2a 및 L2a, 및 H3a 및 L3a의 조합을 포함하는 모노 클로날 항체(mAb) 및 이의 TF-Ag 결합 단편을 포함한다. 본 발명에서, 이하 기재되는 H 및 L 쇄의 조합의 결과 이외에, H2a-L2a 및 H3aL3a가 제조 및 시험되고, 이들 2개의 조합 결과는 각각 H2-L2 및 H3-L3으로 보고된 것과 유사하다. H2a-L2a 및 H3a-L3a 조합은 EIA(enzyme immunoassays)에서 가장 높은 반응성에 의해 결정되는, TF-Ag의 더욱 향상된 결합 특성을 갖는 추가적인 서브클론의 선택을 가능하게 하는, 서브클로닝 절차의 결과 제조된다. 물론, 내재화의 최고는 H2L2 및 H2aL2a지만, ADCC의 최고는 H2L2, H2aL2a, H3L3 및 H3aL3a이다.

대표적인 VH 및 VL 시퀀스는 도 1 및 2에 의해 더 기재된다. 특히, 도 1은 본 발명에 포함되는 JAA-F11 중쇄 가변 및 3개의 VH 변이체(H1, H2, 및 H3) 부위의 아미노산 시퀀스 얼라인먼트를 제공한다. 볼드체는 JAA-F11과 고안된 인간화 H 쇄 사이에 동일한 아미노산을 나타내고; 볼드체 및 쉐이딩된 아미노산은 고안된 인간화 체인과 마우스 JAA-F11 사이의 차이를 나타낸다. 볼드체 및 이탤릭채로 나타내는 위치 72에서의 알라닌은 입체 충동을 억제하는 것이 유지되는 마우스 잔기이다. CDRs는 이탤릭체로 쓰인다. 넘버링은 카밧 시스템에 따른다. 여기에 기재되는 모노 클로날 항체(mAb)는 "인간화"라고도 불리고, 이들은 소정의 쥐 잔기를 포함하고, 따라서 부분적으로 인간화된 것을 고려할 수 있다고 인지될 것이다.

도 2는 mJAA-F11 경쇄 가변(JAA-F11VH) 및 3개의 VL 변이체(L1, L2, 및 L3) 부위의 아미노산 시퀀스 얼라인먼트를 도시한다. 볼드체는 마우스 아미노산 또는 마우스 시퀀스와 동일한 아미노산을 나타내고, 볼드체 및 쉐이딩된 아미노산은 고안된 인간화 JAA-F11 변이체 및 마우스 JAA-F11 사이의 차이를 나타낸다. 볼드체 및 이탤릭채로 나타내는 위치 51에서의 류신은 입체 충동을 억제하는 것이 유지되는 마우스 잔기이다. 현재 제공되는 인간화 H 및 L 쇄는 JAA-F11 마우스 항체로부터의 차이점 및 이들 사이의 차이점을 포함하지만, 소정의 쥐 아미노산은 인간화 모노 클로날 항체(mAb)의 특이성을 유지하기 위해 유지된다는 것은 도 1 및 2로부터 명백할 것이다.

또한, 여기에 기재되는 인간화 모노 클로날 항체(mAb)의 단편은 본 발명에 포함된다. 적절한 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, ScFv 및 Fv 단편을 포함한다. 다양한 기술은 항체 단편의 생성을 위해 개발되고, 본 발명의 범위 내에 포함된다. 일 실시형태에서, 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이의 단편은 재조합 발현 벡터에 의해 숙주 세포가 제조된다. 본 발명은 여기에 기재되는 아미노산 시퀀스를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 시퀀스 전체, 이러한 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 발현 벡터, 및 이러한 발현 벡터를 포함하는 생체 외 세포 배양액을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양액은 진핵 세포이다. 일 실시형태에서, 세포 배양액은 포유류 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 CHO 세포이다. 모노 클로날 항체(mAb) 및/또는 이들의 TF-Ag 결합 단편, 및/또는 모노 클로날 항체(mAb) 및/또는 이들의 TF-Ag 결합 단편을 발현하는 세포 배양액을 포함하는 키트가 본 발명에 의해 제공된다. 일반적으로, 키트는 모노 클로날 항체(mAb) 및/또는 이들의 TF-Ag 결합 단편, 또는 이들을 발현하는 세포를 함유하는 하나 이상의 밀봉된 용기를 포함한다. 치료 및/또는 이미징 목적을 위한 모노 클로날 항체(mAb) 및/또는 이들의 TF-Ag 결합 단편을 이용하기 위한 지시가 키트에 포함될 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명은 발현 벡터 또는 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이들의 TF-Ag 결합 단편을 인코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 세포를 배양하고, 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이들의 TF-Ag 결합 단편을 발현시키고, 및 세포 배양액으로부터 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이들의 TF-Ag 결합 단편을 분리시키는 것을 포함하는, 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이들의 TF-Ag 결합 단편의 제조 방법을 포함한다. 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이들의 TF-Ag 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 임의의 적절한 발현 벡터를 이용하여 발현될 수 있고, 이들 중 다수는 공지 기술이고 및/또는 시판되고 있다. 일 실시형태에서, 중쇄 및 경쇄는 플라스미드와 같은 단일 발현 벡터 상에 발현된다. 다른 실시형태에서, 발현된 중쇄 및 경쇄가 종래의 모노 클로날 항체(mAb) 작제물을 형성한 후, 중쇄 및 경쇄는 동일한 세포에서 뚜렷한 플라스미드 상에 발현된다. 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이들의 TF-Ag 결합 단편은 본 발명의 이점이 제공되는 종래의 기술을 이용하여 분리 및/또는 정제될 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 암 세포가 TF-Ag 분자를 발현하는 개체의 암 세포의 성장을 억제하고, 및/또는 개체의 암 세포의 전이를 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 인간화 모노 클로날 항체(mAb) 및/또는 이의 단편의 치료량을 개체에 투여하는 것을 포함하고, 상기 투여는 암 세포를 발현하는 TF-Ag의 성장 및/또는 전이를 억제한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법을 실시하는 것은 종양의 체적을 감소시키고, 및/또는 전이 병소, 또는 2차 종양의 형성을 감소시킨다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 개체에 제공된다. 일 실시형태에서, 이를 필요로 하는 개체은 암을 갖는 것으로 추정되는, 또는 암이 진행되거나 재발될 위험이 있다고 진단된다. 일 실시형태에서, 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이들의 TF-Ag 결합 단편의 치료학적으로 유효한 양이 이용된다. 여기서 사용되는 "치료학적으로 유효한(therapeutically effective)"은, 투여되는 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이들의 TF-Ag 결합 단편의 양이 TF+ 암 세포의 성장, 생존 및/또는 전이를 억제하기에 충분한 양인 것을 의미한다.

다양한 실시형태에서, 인간화 모노 클로날 항체(mAb) 및/또는 이의 단편은 TF-Ag를 발현하는 세포에 결합을 통해 암 세포에 화학요법 치료제의 국부화가 가능하도록 화학요법 치료제와 콘쥬게이팅될 수 있다. 이러한 항체의 생성에 유용한 화학요법 치료제는 효소 활성 독소 및 이의 단편을 포함한다. 적절한 효소 활성 독소는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 외독소 A 쇄(exotoxin A chain) (녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터), 리신 A 쇄(ricin A chain), 아브린 A 쇄(abrin A chain), 모데신 A 쇄(modeccin A chain), 알파 사르신(alpha sarcin), 유동 단백질(Aleurites fordii proteins), 디안틴 단백질(dianthin proteins), 미국 자리공 단백질(Phytolaca americana proteins) (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 여주 억제제(momordica charantia inhibitor), 커신(curcin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피시날리스 억제제(sapaonaria officinalis inhibitor), 젤로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레스트릭톡신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin) 및 트리코세신의 비결합 활성 단편을 포함한다. 화학요법 치료제는 임의의 적절한 화학적 콘쥬게이션 시도에 의해 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이들의 TF-Ag 결합 단편에 공유 부착될 수 있다. 일 실시형태에서, 화학요법 치료제는 모노 클로날 항체(mAb) 또는 이들의 TF-Ag 결합 단편을 갖는 융합 단백질의 부분을 포함할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 개체의 전이 병소, 종양 또는 이들의 조합을 확인하기 위한 방법이 제공되고, 상기 전이 병소 또는 종양은 TF-Ag를 발현하는 세포를 포함한다. 상기 방법은 개체의 인간화 모노 클로날 항체(mAb) 및/또는 이의 단편에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 인간화 모노 클로날 항체(mAb) 및/또는 이의 단편은 전이 병소, 종양, 또는 이들의 조합을 확인하기 위해 검출 가능한 표지와 콘쥬게이팅하고, 검출 가능한 표지를 검출한다. 따라서, 인간화 모노 클로날 항체(mAb) 및/또는 이의 단편은 방사성 동위원소와 같은 검출 가능한 표지와 콘쥬게이팅될 수 있다. 다양한 방사성 동위원소는 JAA-F11 모노 클로날 항체(mAb)와 콘쥬게이팅 하기 위해 이용 가능하여, JAA-F11 모노 클로날 항체(mAb)가 결합하는 세포는 이미지화 또는 선택적으로 파괴될 수 있다. TF-Ag를 발현하는 세포의 선택적 파괴를 위해, JAA-F11 모노 클로날 항체(mAb)는 In111, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소와 같은 고방사성 동위원소와 콘쥬게이팅될 수 있다.

인간화 모노 클로날 항체(mAb) 및/또는 이의 단편이 전이 병소 또는 종양에서 TF-Ag를 발현하는 세포를 확인하기 위해 이용되는 경우, 이들은, 신티그래프 연구를 위한 방사성 동위원소, 예컨대 Tc99m (metastable 테크네튬-99), I123, 또는 I123, I131, I124, F19, C13, N15, O17 또는 가돌리늄(III) 또는 망간(II)과 같은 NMR 이미징(자기공명영상, 또는 "MRI"라고도 알려진)을 위한 스핀 표지를 포함할 수 있다.

표지된 인간화 모노 클로날 항체(mAb) 및/또는 이의 단편은 전이 병소 및/또는 종양을 확인하기 위해 전이 질병을 갖는 것으로 추정되는 또는 진단되는 환자에 주입될 수 있다. 이러한 이미징으로부터의 정보는 환자의 질병 상태의 단계 또는 진단에 이용될 수 있다. 이용되는 표지는 사용할 이미징 시스템과 일치하여 선택될 수 있다. 예컨대, 인듐111, 테크네튬99 또는 요오드131은 SPECT(single photon emission computed tomography) 또는 평면 스캔(planar scans)에 이용될 수 있다. 플루오린19 요오드123 및 요오드124와 같은 양전자 방출 표지(Positron emitting label)는 양전자 방출 단층 촬영술(positron emission tomography)에 이용될 수 있다. 가돌리늄 (III) 또는 망간 (II)과 같은 상자성 이온은 MRI에 이용될 수 있다. 개체의 특정 조직 내의 표지의 국부화는 TF-Ag를 발현하는 세포를 포함하는 전이 병소 또는 종양의 국부화를 허용한다. 배경보다 큰 특정 위치에서 표지의 농도는 전이 세포의 존재의 확인을 허용한다. 바람직한 실시형태에서, 표지된 인간화 모노 클로날 항체(mAb) 및/또는 이의 단편의 투여 후, 적절한 기간을 경과하여, 결합되지 않은 인간화 모노 클로날 항체(mAb) 및/또는 이의 단편은 개체로부터 명백해져, 배경 표지(background label)가 매우 감소된다.

콘쥬게이트된 또는 콘쥬게이트 되지 않은 인간화 모노 클로날 항체(mAb) 및/또는 이의 단편을 포함하는 치료적 제형(Therapeutic formulation)은 감압하여 동결 건조된 제형(lyophilized formulation) 또는 수용액의 형태로, 약제학적으로 허용되는 캐리어, 첨가제 또는 안정화제(Remington 's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합됨으로써 제조될 수 있다. 허용되는 캐리어, 첨가제, 또는 안정화제는 적용되는 양 및 농도에서 수령인에 비독성이고, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산과 같은 버퍼; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride); 헥사메토늄 클로라이드(hexamethonium chloride); 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 벤제토늄 클로라이드(benzethonium chloride); 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 미만 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알기닌, 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 슈크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨과 같은 당; 소듐과 같은 염 형성 카운터 이온; 금속 복합체(예컨대 Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 비이온 계면활성제를 포함한다. 인간화 모노 클로날 항체(mAb) 및/또는 이의 단편은 약제학적 조성물에서 다른 화학요법 치료제와 혼합될 수 있다.

인간화 모노 클로날 항체(mAb) 및/또는 이들의 TF-결합 단편은 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내를 포함하는 임의의 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 투입은 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 림프 내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 인간화 모노 클로날 항체(mAb) 및/또는 이의 단편은, 예컨대 항체의 양을 줄이는 펄스 투입에 의해 적절히 투여될 수 있다. 바람직하게, 주입(dosing)은 투여가 간단하거나 만성인지에 대해 부분적으로 의존하여, 주입, 가장 바람직하게 정맥 내 또는 피하 내 주입에 의해 제공된다. 소정의 실시형태에서, 인간화 모노 클로날 항체(mAb) 및/또는 이의 단편은 암 세포의 성장을 억제하거나 전이를 억제하기 위해 유방, 결장, 전립선, 난소, 방광 또는 다른 TF Ag+ 암을 갖는 것으로 추측되거나 진단되는 개체에 투여된다.

또한, 화학요법 치료제, 면역 억제 인자(immunosuppressive agent) 및/또는 사이토킨과 같은 다른 화합물이 투여될 수 있다. 혼합 투여는 분리된 제형 또는 단일 약제학적 제형을 이용하여 공동-투여(co-administration)를 포함할 수 있고, 각각의 순서로 연속적으로 투여될 수 있고, 이는 바람직하게는 시간 간격이 있지만, 둘(또는 모든) 활성제는 생물학적 활성이 동시에 가해진다.

인간화 모노 클로날 항체(mAb) 및/또는 이의 단편은 TF-Ag를 발현하는 세포의 전이 및/또는 성장을 억제하기에 충분한 양으로 상기 치료 방법에 따라 인간 또는 다른 동물에 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 캐리어 또는 희석제의 형태 및 특징은, 질병의 단계 및 개체의 크기와 같은 다른 공지된 변수 및 투여 경로, 혼합될 활성 성분의 양에 의해 지시되는 것을 당업자는 인지할 것이다.

실시예 1

이하 실시예는 본 발명의 인간화 모노 클로날 항체(mAb)를 제조 및 이용, 모노 클로날 항체(mAb)의 물리적 및 기능적 특성을 기재한다.

인간화 JAA-F11의 고안 및 제조

마우스 JAA-F11 가변 부위의 시퀀스가 확인된 후, TF-Ag에 대한 특이성 및 친화도를 유지하도록 CDRs가 정의된다. 포괄적인 CDRs는 각각 시퀀스 및 구조적 가변성에 기초하여 Kabat 등 [139] 및 Chothia 등 [141]에 따라 정의된다. 2개의 아미노산은, 둘다 6Å 이하로 분리되는 원자의 쌍을 포함하는 경우[138] 단백질 구조에서 서로 접촉하는 것으로 간주된다. 마우스 JAA-F11 [142]에 대한 X-ray 결정학 및 컴퓨터를 사용한 탄수화물 스레딩 연구(computational carbohydrate threading studies)는 결합 부위로부터 5-6Å 내에 아미노산 잔기가 확인된다. 배좌 구조(conformational structure)에 중요한 경쇄의 L23 및 L88 위치에서 이들 아미노산 및 2개의 시스테인 잔기는 JAA-F11 인간화에 이용되는 CDRs의 최종 포괄적인 정의에 포함된다.

인간 프레임워크의 선택

중쇄 및 경쇄 JAAF11 가변 부위에 대한 인간 억셉터 항체 프레임워크를 선택하기 위해, 3개의 다양한 접근이 적용되었다. 중쇄(H1, H2, H3)의 3개의 변이체 및 경쇄(L1, L2, L3)의 3개의 변이체가 고안되었다. 임의의 3개의 중쇄(VH)는 총 9개의 가능한 hJAA-F11 VH/VL 조합 변이체를 생성하기 위해 임의의 3개의 경쇄(VL)와 짝을 이룰 수 있다.

이러한 변이체를 생성하기 위해, BLAST 서치는 인간 면역글로불린 시퀀스에 대한 mJAA-F11 (마우스 항체)의 VH 및 VL 시퀀스와 각각 비교하여 수행된다. 최고 10개의 균일한 인간 VH 및 VL 시퀀스는 시뷰 시퀀스 얼라인먼트 프로그램(Seaview Sequence Alignment program)을 이용하여 mJAA-F11의 대응하는 가변 부위로 얼라이닝된다.

제1 변이체, H1 및 L1에서, 프레임워크 부위의 아미노산 시퀀스는 최고 10개의 균일한 인간 IgG 변이 시퀀스에서 각각의 위치에서 가장 자주 보이는 아미노산에 기초하여 선택되었다. 변이체 H2 및 L2에서, 프레임워크 부위의 아미노산 시퀀스는 이하와 같이 선택된다: 만일 임의의 최고 10개의 인간 시퀀스 중 아미노산이, 아미노산이 선택되는 마우스 면역글로불린에 대응하는 아미노산에 매칭될 때, 남아 있는 위치에서, 인간 시퀀스에서 가장 자주 보이는 아미노산이 선택된다. 세번째 변이체, H3 및 L3에서, 프레임워크 부위의 아미노산 시퀀스는 각각의 CDR의 측에 3 마우스 아미노산을 함유하지만, 시퀀스의 나머지는 최고 10 인간 시퀀스에서 가장 자주 보이는 아미노산으로 이루어진다.

또한, 키메라 JAA-F11은 인간 불변 영역에 부착되는 전체 마우스 JAA-F11 가변 부위로 이루어지도록 구성된다. 키메라는, 옳은 마우스 가변 부위가 복제 및 시퀀스되는 것을 확인하고, 인간화 JAA-F11 항체가 평가될 때, 포지티브 대조군으로 작용하게 한다. 키메라는 인간 불변 영역을 갖지만, 마우스 JAA-F11과 동일한 결합 특성을 유지하는 것이 기대된다.

hJAA-F11의 모델의 평가

원래 제안된 hJAA-F11 작제물는 결합 부위에 배좌(conformational) 효과를 위해 평가된다. 3개의 중쇄 변이체(H1, H2, H3)는, 둘러싸는 아미노산과 심각한 입체 상호 작용을 잠재적으로 야기할 수 있는 위치 72에서의 알기닌의 알라닌에 대한 교체를 갖는다. 경쇄 변이체(L1, L2, L3)의 위치 51에서의 류신은, 둘러싸는 아미노산 측쇄와 입체 충돌을 일으킬 수 있는 알기닌과 교체된다. 알기닌 잔기는 제거되고, 도 1 및 2에 도시되는 바와 같이, 원래의 마우스 JAA-F11 프레임워크 잔기, 알라닌 72 (VH) 및 류신 51 (VL)로 교체된다. 마우스 JAA-F11 중쇄 및 경쇄 변이 아미노산 시퀀스와 hJAA-F11 작제물 사이의 얼라인먼트 비교는 도 1 및 2에 도시되는 바와 같다. 또한, 아미노산 시퀀스에서의 차이는 다른 H 및 L 시퀀스와 비교하여 H2a, H3a, L2a, 및 L3a으로 나타내는 것을 당업자는 인지할 것이다.

hJAA-F11 변이체의 면역원성 예측

인간화 변이체 (그래프트된 CDR)의 T20 스코어를 이용한 예측된 면역원성은 매우 낮은 것으로 예상된다(표 1). T20 스코어는 모노 클로날 항체 가변 부위 시퀀스의 "인간성(humanness)"을 측정하기 위해 이용된다. 이러한 스코어링 시스템은 38,000 이상의 인간 항체 시퀀스의 데이터 베이스를 이용하여 Gao et al [Monoclonal antibody humanness score and its applications. 2013. BMC Biotechnology, 13:55]에 의해 개발되었다. 이 방법에서, 이 데이터 베이스의 단백질 BLAST가 수행되고, 시험 인간화 Ab는 이들 인간 시퀀스와 비교된다. 인간화 항체를 상위 20개의 인간 Ab BLAST 매칭과 비교하고, 이들 시퀀스와의 유사성을 스코어링한다. 가장 높은 가능한 스코어는 100 (가장 인간과 같은)이다.

이 방법의 확인은, Gao 등이 인간에 임상적으로 이용되는 90 이상의 항체에 대해 이 면역원성 스코어법을 시험하는 경우에 나타내고, 80 이상의 FR & CDR 시퀀스의 T20 스코어를 갖는 항체가 면역성이 없지만, 85 이상인 오직 FR 시퀀스의 T20 스코어가 면역성이 없다는 것을 확인했다. 현재 hJAA-F11 변이체의 T20 값을 이용하여, 매우 낮은 면역원성이 환자에게 기대된다. 이는, CDR-그래프트된 항체가 더욱 인간이고, 키메라보더 덜 면역성이 기대되고, H1L1 변이체는 CDR-그래프트된 변이체의 가장 인간이고, hJAA-F11 변이체 전체가 낮은 면역원성을 갖는 것으로 기대되는 것을 보여준다.

[표 1]

인간화 및 키메라 JAA-F11 변이체의 발현 및 생성

hJAA-F11 및 키메라 VH 및 VL 유전자는 완전한 IgG1 및 카파 유전자를 함유하는 플라스미드를 생성하기 위해 각각 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 (6307 pAH) 및 인간 카파 경쇄 불변 영역 (6714 pAN)을 함유하는 2개의 다른 포유류 발현 벡터로 클로닝된다. 6307 pAH 및 6714 pAN 발현 벡터에서 클로닝된 VH 및 VL 부위 각각의 옳은 시퀀스 및 배향은 시퀀싱에 의해 변경된다.

CHO-K1 세포로의 2개의 벡터의 안정한 공동-형질 주입(co-transfection) 후에, hJAA-F11 또는 키메라를 발현하는 안정한 클론은 키메라 또는 hJAA-F11의 발현 및 항생물질(antibiotic) G418을 이용하는 네오마이신 저항에 기초하여 선택된다. hJAA-F11 후보의 스크리닝은 확립된 기술을 이용하는 바와 같이, 항 TF-Ag 항체에 대해 ELISA를 이용하여 수행된다. 각각의 인간화 JAA-F11 H/L 혼합 변이체 및 TF-Ag에 가장 높은 반응성을 보이는 키메라 JAA-F11의 공동-형질 주입으로부터의 클론은 여기에 기재되는 다른 특성화를 위해 선택된다. 인간화 JAA-F11 작제물 및 키메라 JAA-F11는 각각 단백질 A 컬럼 크로마토그래피에 의해 배양 상청액으로부터 정제된다. 키메라 항체, 및 H1L1, H2L2, H3L3 및 H2L3, H2aL3a, 및 H3aL3a이 생성되었다. 본 발명의 이점을 고려해볼 때, 당업자는 본 발명에 포함되는 남아 있는 항체 H 및 L 쇄 조합을 쉽게 생성할 것이다.

글리칸 어레이(glycan array)에 의한 화학적 특이성 분석

최초 스크리닝 후, hJAA-F11 및 키메라 JAA-F11 변이체의 화학적 특이성은 기능적 글리코믹스의 컨소시움에 의한 글리칸 어레이를 이용하여 결정된다. 이들 데이터는 마우스 JAA-F11에서 얻어진 데이터와 비교된다. 글리칸 어레이 분석은 렉틴(lectin) 및 항체의 글리칸 결합 반응성을 결정하기 위한 간접적인 면역 형광법(immunofluorescent method)이다. 상기 글리칸 어레이는 마우스 JAA-F11의 화학적 특이성을 설명하기 위해 이용된다. 이 방법은 610 다른 글리칸을 갖는 항체 후보의 반응성을 분석하기 위해 이용된다. hJAA-F11 H1L1, H2L2, H3L3, 및 키메라 항체는 α2-3 시알화(sialylated) 구조와 결합이 부족하고, Galβ1-3GalNAc-α (TF-Ag) 결합 구조에 결합을 한정하는 것을 포함하는 마우스 항체와 동일한 미세(fine) 특이 결합을 보인다. 글리칸 어레이는 610 글리칸 이외에, 인간화 항체, 키메라, 및 마우스 JAA-F11는 오직 TF-Ag 및 사카라이드 구조를 함유하는 4개의 다른 TF-Ag와 결합하는 것을 보인다. 마우스 JAA-F11, 키메라 및 hJAA-F11 작제물가 시험되는 440 또는 610 사카라이드 외에 결합하는 4개의 추가적인 사카라이드는 JAA-F11를 타겟으로 하는 종양에 생물학적으로 문제가 없어야 한다. 치환되지 않은 Neu5Acα2-6(Galβ1-3GalNAcβ, GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcβ 및 Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcβ는 오직, 암 또는 다른 질병 상태에서, 배설되는 유체에서 발견되었다. Neu5Acβ2-6 Galβ1-3GalNAc는 천연 구조가 아니고, 인간에서가 아니다.

인간화 JAA-F11 작제물의 특이성은, 키메라 및 마우스 항체와 비교할 때 동일하거나 개선된 것을 보인다. 예컨대, H2L3은 임의의 추가적인 TF-Ag와 통계학적으로 (p< 0.05 by ANOVA) 덜 결합하는 것을 보이고, H1L1 및 H2L2는 GalNAc의 C-6 히드록실에 추가되도록 디사카라이드를 허용하지 않고, 이는 다른 항체와 통계학적으로 다르다(p< 0.05).

어레이 상에서 600 이상의 네거티브 사카라이드와의 결합 부족은, 이들 항체 전체에 대해 타겟팅 능력을 나타낸다. 결합되지 않은 밀접하게 관련된 사카라이드의 중요한 예는 Galβ1-3GalNAc-베타 결합 구조이고, 항체가 중앙 신경계 GM1 강글리오시드, NK 세포의 아시알로-GM1, 글리코리피드의 GD1 또는 말초 신경 조직의 아시알로 GM1(이들은 베타-결합됨)가 아니고, 종양 조직과 결합되는 것을 나타낸다. 보통 조직에서 TF-Ag의 잘 알려진 연장(elongation)은 GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAcα-Sp8을 형성하는, Gal 상에 GlcNAcβ1-3를 첨가하는 β1-3N-아세틸글루코사미닐-트랜스페라아제(β1-3N-acetylglucosaminyl-transferase)에 의해, 또는 Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc (sialyl-TF)를 형성하는 2-3 시알릴트랜스페라아제에 의해, Neu5Ac2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAc (디시알릴-TF)를 형성하는 제2 시알릴트랜스페라아제로 수행되고, 이들 전체는 마우스, 키메라 또는 인간화 JAA-F11를 결합하지 않는다. 따라서, 정상 조직 결합은 JAA-F11 또는 hJAA-F11 작제물에서 기대되지 않는다.

상대적인 친화도 분석

TF-Ag에 대한 4개의 hJAA-F11 및 키메라 항체의 상대적인 결합 친화도는 효소 면역분석법에서 인간화 항체와 경쟁하기 위해 마우스 항체의 능력을 비교함으로써 결정된다. 이러한 분석에서, 3 ㎍의 각각의 인간화 Ab는 마우스 항 TF-Ag 항체 (mJAA-F11)의 일련의 희석액과 혼합된다. TF-Ag 코팅판에 인간 항-TF-Ag의 결합은 종 특이 항-인간 IgG를 이용하여 측정된다. 1 ㎍의 hJAA-F11을 50% 억제하기 위해 요구되는 마우스 mJAA-F11의 양을 외삽법으로 추정(extrapolate)하고, 이를 상대적인 친화도의 척도로 사용한다. 억제를 위해 요구되는 마우스 항체의 양이 많을수록, 항체의 상대적인 친화도는 높아진다.

결과를 도 3 및 표 2 및 3에 요약했다. 표 2는 1 ㎍의 이러한 인간화 항체와 경쟁하기 위해 다양한 항체에 의해 요구되는 마우스 JAA-F11의 반 최고 억제 농도(half maximal inhibitory concentration)(IC50)를 보인다. H2L2는 IC50 2.31 ㎍의 마우스 항체를 갖는 항체들 사이에서 TF-Ag에 대한 가장 높은 상대적 친화도를 보인다. 표 7은 서로 ANOVA - Tukey post-hoc 시험에 대해 각각의 항체에 대해 산출된 p-값을 도시한다. H2L2 항체의 이러한 개선된 친화도 차이는, 유의(significance)(p=0.057)에 도달되는 H2L3를 제외하고, hJAA-F11 및 키메라 항체 각각과 비교할 때, 통계학적으로 현저하다는 것을 알 수 있다(p<0.05)(표 3). H2L3은 H1L1, H2L2, H3L3 및 키메라 항체와 현저히 다르지 않다. H1L1, H3L3 및 키메라 항체의 상대적 친화도는 서로 현저히 다르지 않다.

[표 2]

[표 3]

hJAA-F11의 생물학적 활성, 특이성 및 활성의 분석

3hJAA-F11 및 키메라 JAA-F11 항체는 인간 종양 세포주와 결합된다.

다양한 인간 유방암 세포주에 hJAA-F11 및 키메라 JAA-F11 항체의 결합은 전체 세포 ELISA를 이용하여 평가된다. TF-Ag 포지티브 마우스 유방 종양 4T1 세포주는 포지티브 대조군으로 작용하지만, P3-X63-Ag8 골수종 세포주는 TF-Ag 네거티브 대조군으로 작용한다. 분석은 다른 3일에 수행되고, 3-4 세포주는 대조군 세포주와 4곱의 시점에서 분석된다. hJAA-F11 또는 키메라 JAA-F11 (50㎍/mL에서)에 기인한 상대적 결합이 TF-Ag 네거티브 대조군 골수종보다 현저히 높은(p≤0.05) 경우, 세포주는 포지티브로 간주된다. 결과는 도 4에 도시된다.

시험되는 암 세포주는 유방암, 호르몬 리셉터 포지티브 또는 네거티브, Her2-포지티브 또는 네거티브, 및 3중 네거티브의 다양한 서브 그룹으로 이루어진다. 시험되는 에스트로겐 리셉터(ER) 및 프로게스테론 리셉터(PR) 포지티브 세포주는 CAMA-1 및 HCC-1428이다. 2개의 Her2/neu 리셉터 포지티브 세포주, HCC-1419 및 AU-565가 시험된다. 시험되는 3중 네거티브 유방암(TNBC) 세포주는 HCC-70, MDA-MB-231, MDA-MB-468, DU-4475, 및 BT-549이다. 하나의 세포주, MDA-kb2는 안드로겐 리셉터를 발현하지만, 에스트로겐 리셉터 네거티브이다. 이들 유방암 세포주는 마우스 JAA-F11를 이용하여 이미 측정되었고, 전체는 TF-Ag 발현에 포지티브이다. 본 발명에서, 결과는, 이들 세포주에 TF-Ag의 발현을 알리는, 시험되는 전체 10 유방암 세포주에 hJAA-F11 및 키메라 JAA-F11 항체가 결합되는 것을 보인다. 다양한 유방암 서브 그룹 중에서, 현재 TNBC 환자를 치료하기 위한 타겟 요법이 없다. 얻어진 데이터는 리셉터 상태와 상관 없이 유방암 환자의 생존을 증가 및 치료하기 위해 hJAA-F11 항체를 이용하고, 공격적인 TNBC를 타겟으로 하는 TF-Ag의 치료적 역할을 나타낸다. 표 4는 시험되는 각각의 세포주의 TF-Ag의 발현 및 유방암 형태를 요약한다.

[표 4]

인간화 JAA-F11는 생체 외에서의 암 세포의 증식을 억제한다.

일부 항-TF-Ag 항체가 종양 세포 증식을 야기하는 것으로 보이기 때문에, 세포 증식에 대한 다양한 구조의 효과를 결정하는 것은 중요하다. 대사 활성을 측정하는 MTT 분석은 3중 수소화 티미딘 직접 증식 분석(tritiated thymidine direct proliferative assay)을 위한 대용물로 선택된다. 항체 없이 대조군과 비교되는 암 세포 성장에 대한 인간화, 키메라, 및 마우스 JAA-F11 항체의 효과가 공지된 방법에 의해 항체의 4 ug/ml에서 결정된다. 데이터는 도 5에 도시된다. H3L3를 제외하고, 키메라 항체 및 인간화 JAA-F11 항체는 작지만(~6-11%), 통계학적으로 현저한 종양 세포 성장의 억제를 야기한다. 세포 증식의 향상은 보이지 않는다.

인간화 JAA-F11는 ADCC를 유도한다.

ADCC(Antibody-dependent cell mediated cytotoxicity)는 이하 적응(adaptation)을 갖는 표준 기술에 따라 LDH(lactate dehydrogenase) 분해 분석에 기초하여 CytoTox 96 비방사성 세포 독성 분석; Promega, Madison, WI)를 이용하여 인간 유방암 세포주에 대해 수행된다. 신선한 인간 말초 혈관 단핵 세포는, 타겟에 대한 비율이 100:1인 이펙터(effector)에서 인간화 항체 및 4T1 마우스 유방암 세포로 이용하기 위해, EDTA 항-응고된 전체 혈액으로부터 분리된다. LDH의 분해는 세포 독성을 정량화하기 위해 이용된다.

도 6a는 인간 유방암 세포주, BT 549와 비교되는 마우스, 키메라, H1L1 및 H3L3 항체에 의해 이용되는 ADCC의 양을 나타낸다. 실험은 3번 이상 반복된다. 전체 실험에서, H2L2 및 H3L3은 인간 세포주의 키메라 또는 마우스 항체보다 현저히 큰 (p< 0.5) ADCC를 보인다. 20% 이상의 TF-Ag 함유 BT549 및 HCC70 타겟 세포는 이펙터:타겟(E:T) 비율이 100:1인 200 ㎍/mL의 H2L2 및 H3L3 항체에 의해 용해된다. 마찬가지로, 마우스 4T1 세포주에 대한 전체 실험에서, 시험되는 전체 항체가 10% 미만의 ADCC지만, H3L3 항체는 키메라 또는 마우스 항체보다 현저히 큰(p< 0.05) ADCC를 보인다. 이는, 현재 H2L2 및 H3L3 항체가 면역 요법을 위한 최고 선택임을 나타낸다. 반대로, 마우스 JAA-F11은 임의의 시험에서 통계학적으로 현저한 ADCC 능력을 보이지 않는다. 3개의 각각의 PBMCs 도너로부터의 ADCC 결과는 도 6b, 6c, 및 6d에 도시된다.

인간화 JAA-F11은 CDC를 유도하지 않는다.

CDC(complement dependent cytotoxicity)를 조절하기 위한 hJAA-F11 및 키메라 항체의 능력은 타겟 세포와 같이 인간 유방암 세포 HCC-1428 세포를 이용하여 LDH 분해 분석에 의해 결정된다. 시약 키트에 제공되는 LDH 포지티브 대조군은 포지티브 대조군으로 이용되고 용해를 보인다. 마우스 JAA-F11, 키메라, H1L1, H3L3, H2L3 항체는 도 7에 도시되는 바와 같이 용해가 일어나지 않는 보체 의존 세포 독성을 유도하지 않는다.

인간화 JAA-F11은 암 세포로 내재화된다.

4T1 유방암 세포로 인간화 및 키메라 JAA-F11의 내재화는, 4 ℃ 또는 37 ℃에서 세포를 배양한 후 측정 및 비교되는 표면 결합의 효소 면역 분석법, 및 핵 염색을 위한 LAMP-1 (lysosomal associated membrane protein, a lysosomal marker) 및 DAPI 염색을 이용하는 면역 형광 현미경법의 2가지 방법에 의해 결정된다. 효소 면역 분석법에서, 도 8에 도시되는 바와 같이, 마우스, H2L2, 키메라, H2L3, 및 H1L1 항체는 각각 0.001, 0.002, 0.001, 0.002, 및 0.014의 p-값으로 현저히 내재화된다. 그러나, H3L3 항체는 현저한 내재화를 보이지 않고(p=0.16), 이는 키메라 또는 마우스 JAA-F11보다 현저히 큰 (p< 0.5) ADCC를 보이는 H3L3이 기대된다.

면역 형광 실험에서, 효소 면역분석법과 일치하게, 마우스, 키메라, H2L2, H2L3 항체는 내재화 및 LAMP-1과의 공동-국부화(co-localization)를 보이고, H3L3은 내재화하지 않는 멤브레인 염색을 보인다. 이러한 데이터는, 표면 효소 면역 분석법을 이용하여 얻어지는 것을 확인한다. 세포 표면 상에 항체의 존재는 ADCC 기능에 필요하기 때문에, 더 높은 ADCC 활성을 보이는 항체는 더 낮은 내재화를 보인다고 예측할 것이다. 내재화 분석은 hJAA-F11, 키메라 및 mJAA-F11에 수행된다. H3L3은 내재화의 양은 적지만, 상대적으로 높은 ADCC를 갖는다는 이러한 기대와 일치되는 것을 보인다. H1L1, H2L3, 키메라 및 mJAA-F11 전체는 통계학적으로 현저한 내재화를 보이고, ADCC가 잘 수행되지 않는다. H2L2 항체에서, H3L3과 유사하게 높은 ADCC가 유도되지만, 키메라 및 다른 인간화 항체와 비교하여 가장 높은 내재화 퍼센트 활성을 보이는, 예상치 못한 결과가 관측되었다.

면역 형광 내재화 실험은 5㎍/mL의 항체를 이용하여 최초로 수행되고, 0.1㎍/ml의 항체 농도를 이용하여 반복하고, 내재화되는 항체가 이러한 저농도에서 된다. 상기 데이터는 내재화의 높은 퍼센트, 및 이러한 내재화의 빠른 속도에 기인하여, 키메라, H2L2 및 H2L3 작제물이 항체-약물 콘쥬게이트로 이용될 가능성을 갖는다는 것을 나타낸다. 글리칸 특이성, 상대적 친화도 내재화, ADCC, 및 CDC 데이터는 이하 표 5에 요약된다.

[표 5]

MicroPET 이미징

MicroPET 이미징은 각각 124요오드 없이 124요오드-hJAA-F11 H2L2 항체와 주입되는 하나의 마우스에 대해 연속으로 수행된다. 이미징은 24, 48, 72, 96, 168, 및 192 시간에 수행된다. 도 9는 다른 시점에서 124요오드-hJAA-F11 H2L2 항체와 주입되는 마우스의 코러날 뷰(coronal view)를 도시하지만, 도 10은 124요오드 없이 주입되는 대조군 마우스의 코러날 뷰이다. 종양에 의해 방사선 표지된 항체의 흡수는 주입 후 24, 48, 72, 및 96 시간에 관측되었다. 또한, 항체의 흡수는 48시간에 비장에서 관측되었다 (도 9). 오직 124요오드를 받지 못한, 4T1 TF-Ag 포지티브 종양을 갖는 네거티브 대조군 마우스는 연구 동안 갑상선을 제외하고 임의의 기관 또는 종양에 국부화되지 않는다는 것을 보인다 (도 10).

전체 쥐 JAA-F11은 유방암 환자의 수동적인 체액 면역법 및 약물 콘쥬게이트법에 잠재성을 갖는다. 그러나, 인간의 마우스 항체의 이용은 HAMA(human anti-murine antibody) 반응 및 환자의 짧은 반감기의 진행에 제한을 보이기 때문에, 인간화는 마우스 JAA-F11 항체의 면역원성을 감소시키고, 긴 시간 동안 순환을 유지시키는 것이 바람직하다.

결과의 상기 설명으로부터, 본 발명은, 다른 양태 중에서, 마우스 JAA-F11 모노 클로날 항체(mAb)의 인간화에 대한 새로운 시도의 설명, 및 마우스, 키메라 및 인간화 JAA-F11 항체 사이의 비교 및 차이를 제공하는 것이 알 수 있다. mJAA-F11은 CDR 그래프팅에 의해 일부 인간화된다. 당업자에게 인지되는 바와 같이, CDR-그래프팅에 의한 인간화는 전통적으로 단일 인간 항체 억셉터 프레임워크를 이용한다[Jones, et al. Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse. 1986. Nature 321: 522- 525]. 따라서, 인간 프레임워크 시퀀스는 존재하는 인간 생식 세포 계열(germline) 유전자로부터 선택된다. 반대로, 본 발명에서, 3개의 새로운 및 다양한 시도는, 3개의 중쇄 변이체(H1, H2, H3) 및 3개의 경쇄 변이체(L1, L2, L3)를 생성하는 중쇄 및 경쇄 JAAF11 가변 부위를 위한 인간 억셉터 항체 프레임워크를 선택하기 위해 이용된다. 상기 언급된 바와 같이, 임의의 3개의 중쇄(VH)는 총 9개의 가능한 hJAA-F11 VH/VL 혼합 변이체를 생성하기 위해 임의의 3개의 경쇄(VL)와 짝을 이룰 수 있다. 또한, 전체 마우스 가변 부위 및 인간 IgG1 및 카파 불변 영역을 갖는 키메라 JAA-F11이 생성되고, 대조군으로 이용된다.

하나의 문제는 CDRs 및 FR 부위를 정의하는데 이용되는 시도는 인간화 항체의 면역원성을 감소시키는지에 관한 것이다. Gao 등 [Monoclonal antibody humanness score and its applications. 2013. BMC Biotechnology, 13:55]에 의해 개발되고, 환자에 이용되는 90 항체의 분석으로 입증되는 T20 스코어법은 인간화 JAA-F11 변이체의 면역원성을 예측하기 위해 이용된다. 인간화 JAA-F11 변이체의 T20 스코어는 키메라 JAA-F11 (<85)보다 전체가 높고(개선되고)(>85), 본 방법 전체 3개에 의해 중쇄 및 경쇄 가변의 인간화는 키메라 변이체보다 덜 면역성이 있을 hJAA-F11 변이체를 생성하는 것을 나타낸다.

마우스 JAA-F11를 인간화하고, 5개의 항체는 CHO-K1 세포, 키메라 및 4 hJAA-F11 작제물, H1L1, H2L2, H3L3 및 H2L3를 이용하여 생성되었다. 따라서, 본 발명의 이점을 고려해 볼 때, 당업자는 다른 4개의 가능한 VH 및 VL 조합을 이용할 것이다.

CDR-그래프팅에 의한 항체 인간화는, 인간화 항체의 일부 프레임워크 아미노산 잔기의 변화에 의해 네거티브한 영향을 미치는 항원 결합 부위 및 CDRs 형태에 기인할 수 있는 항원 결합의 손실 또는 친화도의 감소를 야기할 수 있다. CDRs는 프레임워크 부위 및 다른 CDRs과 상호 작용하는 잔기로 이루어진다. 연속되는 근처의 아미노산과 CDR 아미노산의 상호 작용 이외에, 항원 결합에 직접 또는 간접적으로 영향을 미칠 수 있는 일부 프레임워크 잔기는 VL/VH 계면(VL/VH interface)에서의 잔기 및 버니어 영역 잔기(Vernier zone residues)를 포함한다. 버니어 영역 잔기는 루프 구조의 형태를 위해 기초를 제공하는 CDRs를 언더 라잉하는 β-시트 프레임워크에서의 잔기(β-sheet framework underlying the CDRs)이다. 경쇄 상의 버니어 잔기는 위치 2, 4, 35, 36, 46, 48, 49, 64, 67, 69, 및 71이지만, 중쇄 상에 이들은 위치 2, 27, 28, 29, 30, 47, 48, 49, 67, 69, 71, 73, 78, 93, 94, 및 103에서 정의된다. VL/VH 계면에서의 잔기는 Chothia 및 공동 작업자[Chothia C, et al. The packing of variable domains. 1989. J. Mol. Biol. 186:651-63]에 의해 확인되었고, 위치 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96, 및 98에서 경쇄, 위치 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100-100K, 및 103에서 중쇄이다.

인간 FR 및 CDRs를 선택하기 위한 본 발명에 이용되는 시도는, 키메라 및 마우스 JAA-F11에 비해 TF-Ag에 대한 인간화 JAA-F11의 친화도를 네거티브하게 변경하지 않는다는 것을 보여준다. CDRs를 정의하는 경우, 결합 부위의 5 Å 내지 6 Å 내의 잔기는 TF-Ag에 대한 친화도 및 특이성이 유지되는 것을 보증하도록 포함된다. 이들 잔기는 중쇄 상에 위치 H31, H32, H33, H35, H50, H52, H53, H54, H95, H96, H97, H98, 및 H100에 있고, 경쇄 상에 위치 L27d, L28, L30, L32, L34, L50, L89, L91, L92, 및 L96에 있다. 그러나, 상대적 친화도 연구로부터, 인간화 항체 전체는 TF-Ag에 친화도를 유지하지만, 항체들 사이에서 친화도의 차이가 관측되었다. 상대적인 친화도 연구는, H2L2 항체가 가장 높은 친화도 항체를 가지고, 그 후 H2L3 항체인 것을 밝혀냈다. H2L2 항체는 1 mg의 H2L2 항체의 억제를 위해 2 mg 이상의 마우스 항체를 요구하는 항체들 사이에서 TF-Ag에 대해 가장 높은 상대적 친화도를 갖는다. 또한, H2L3 항체는 현저하진 않지만 H1L1 및 키메라 항체보다 높은 친화도를 갖지만, TF-Ag에 대한 H1L1, H3L3 및 키메라 항체의 상대적 친화도는 서로 현저히 다르지 않다.

친화도의 이들 개선은 다양한 인간화 변이체 사이에 일부 잔기의 변화의 결과로 볼 수 있다. 변이체 사이의 차이는 표 6 및 6b에서 이하에 나열된다.

[표 6a]

[표 6b]

상기 언급한 바와 같이, 항원 결합에 영향을 미치는 프레임워크 잔기는 버니어 영역 및 VL/VH 계면 잔기를 포함한다. 인간화 작제물과 비교하면, 본 발명의 모노클로날 항체(mAb)는 결합 부위 형태에 중요할 수 있는 VL/VH 계면 잔기 및 버니어 영역의 대부분을 유지하지만, 일부 변화는 면역성 인간화 변이체를 덜 생성하게 한다. 버니어 영역 또는 VL/VH 계면에서 변화되고, CDRs에 대해 4 아미노산(연속하여) 내에 아미노산까지 변화되는 아미노산은 별표로 나타낸다. 3개의 작제물 사이에 다른 중쇄 시퀀스 상에 위치 48, 67, 69, 및 73에 4개의 버니어 영역이 있다. H2는 H1 및 H3 구조 사이에 다른 8개의 위치 5, 11, 69, 73, 75, 82b, 83, 및 85에 마우스 잔기를 유지한다. 이들 8개의 잔기 중, 2개는 위치 69 및 73의 버니어 영역 잔기이다. 동시에, H2 및 H1은 H3 상의 마우스 잔기로 유지되는 2개의 버니어 영역 위치, 즉 잔기 48 및 67에 치환기를 갖는다. H1L1 및 H3L3 사이에 친화도의 차이가 없기 때문에, 48 및 67에서의 버니어 영역 위치는, H3에서 유지되지만, H1에서 변화되는 친화도 차이에 기여하지 않을 것을 시사한다. 그러나, H2는 H1 및 H3과는 달리 위치 69 및 73에서 마우스 버니어 영역 잔기를 유지하고, 이는, 2개의 버니어 영역 위치에서의 변화는 친화도의 차이에 기여할 수 있다는 것을 시사한다. CDR2가 기저를 이루는 이들 2개의 버니어 영역 잔기는 H1 및 H3과 비교하여 향상된 H2 결합을 가질 수 있다. 인간화 작제물 사이의 아미노산 차이 중, 위치 69 및 108은 결합 부위가 가장 가깝다. H2에서의 위치 69의 아미노산(마우스 항체에서와 같이)은 류신이지만, 다른 인간화 작제물 모두는 메티오닌을 갖는다. H2 및 마우스 항체 사이의 차이 중, 아미노산 38, 48, 66, 67, 및 109에서의 변화는 CDRs와 가장 가깝고, 친화도에 영향을 줄 수 있다.

H2L2는 H2L3보다 친화도가 높기 때문에, L2와 L3의 비교는 이러한 차이점에 대한 이유를 더 기술하는 것을 도울 수 있다. VL/VH 잔기에 변화는 없고, 경쇄 상의 버니어 영역 잔기의 대부분은 버니어 위치 2 및 36을 제외하고, 3개의 인간화 작제물 사이에 유지된다. L3과는 달리, 그러나 마우스 항체와 같이, 높은 친화도 L2는 버니어 위치 36에서 티로신 대신에 페닐알라닌을 갖는다. 위치 36 및 37에서 아미노산은, 결합 부위의 5 Å 내이고, GalNAc의 감소 말단에서 알파 결합 요건의 유지에 중요한 것이 발견되는 위치 24-35에서 아미노산의 일부이기 때문에, 유리한 방법으로 형태에 영향을 줄 수 있다.

다수의 보통의 조직은 중추 신경계, NK 세포 상에, 말초 신경 조직에서 일반적으로 발견되는 Galβ1-3GalNAc-베타 결합 구조와 같은 TF-Ag와 매우 유사한 구조이지만, 동일하지 않으므로, 미세 특이성의 유지는 이러한 인간화의 주요 특성이다. hJAA-F11 H1L1, H2L2, H3L3, 및 키메라 항체는, 글리칸 어레이에 기초한 α2-3 시알릴레이트 구조와 결합이 부족하고, Galβ1-3GalNAc-α (TF-Ag) 결합 구조와 결합이 제한되는 것을 포함하는 마우스 항체와 비교하여, 항원 결합의 동일한 또는 개선된 미세 특이성을 유지한다. 인간화 JAA-F11 작제물의 특이성은 600 이상의 다양한 사카라이드에 대해 시험하는 경우, 동일한 또는 개선되는 것을 보인다. 마우스 JAA-F11 및 인간화 작제물 전체는 단지 5 사카라이드, TF-Ag, 및 GlcNAc (2에서 NeuAc, 및 3번째에서 GlcNAc)와 1-6 결합되는 하나의 추가적인 당을 갖는 또는 GalNAc에 1-6 결합되는 2개의 추가 당 GalGlcNAc를 갖는 3 트리사카라이드와 반응한다. 예컨대, H2L3은 JAA-F11에 결합하는 4개의 다른 사카라이드 전체에 덜 결합을 보이지만, H1L1 및 H2L2는 키메라 및 마우스 항체와 비교할 때, JAA-F11와 결합하는 테트라사카라이드와 결합하지 않는다. JAA-F11에 결합하는 이들 4개의 다른 사카라이드는 보통의 조직에서 발현되는 것으로 알려져 있지만, 타겟 구조의 증가된 특이성은 항상 바람직하다. 이는, 인간 요법에서 이들 항체 전체에 비슷한 타겟팅 능력을 설명한다. H2L3는 다른 작제물과 비교하여 4개의 사카라이드 중 3개에 덜 결합함으로써 보이는 것과 같이 결합 특이성이 증가하지만, H2 및 H3 사이의 차이는 이들 차이를 야기할 수 있다. 친화도 부분에서 이미 논의된 변이체 사이의 차이는, 이들 개선된 특이성에 이유가 있을 수 있다. H2L3은 NeuAcalpha2-6(TF-Ag) 및 GlcNAcbeta2-6(TF-Ag)에 결합이 감소된다는 점에서 H2L2와 다르다.

이론에 의해 제한되지 않고, H1L1 및 H2L2가 테트라사카라이드에 전혀 결합되지 않는 이유는, H3L3 및 마우스 항체와 비교하여 이들 항체 사이에 공유된 차이를 갖도록 할 수 있는 것으로 판단된다. H1 및 H2는 버니어 영역 위치이고, CDR의 4 아미노산 내에 연속적인, 위치 48에 메티오닌을 갖는다. 이 메티오닌은 마우스 및 H3 항체의 이소류신 대신이다.

본 발명에서, 전체 세포 EIA는 3중-네거티브 유방암 세포주를 결합하기 위해 hJAA-F11 및 키메라 JAA-F11 항체의 능력을 강조하게 된다. 얻어진 데이터는 유방암 전체, 그러나 현재 이들 형태의 암에 대한 타겟팅된 요법이 없기 때문에, 특히 공격적인 TNBC(triple-negative breast cancer)를 타겟팅 시에 TF-Ag의 잠재적 치료 역할을 제시한다.

TF-Ag를 결합하는 일부 렉틴(lectin) 및 항체는 TF-Ag 발현 종양 세포의 증식을 증가시킨다. 이는 보통, 렉틴 또는 항체가 감소 말단 (증식을 야기하는)에서 알파 및 베타 아노머(anomer) 또는 오직 알파 아노머 (억제적)를 결합하는지와 연결되는 것으로 판단된다. 마우스 JAA-F11이 오직 알파 아노머와 결합하고, 종양 세포의 증식을 야기하지 않지만, 인간화 작제물이 종양 세포에 이러한 영향을 갖는지를 결정하는 것이 중요하다. 인간화 JAA-F11 및 키메라 항체는 생체 외 암 세포의 증식을 야기하지 않지만, 마우스 JAA-F11의 효과가 적은(~6 - 11%) 것과 유사하지만, 마우스 4T1 및 인간 암세포 성장의 현저한 억제가 관측된다.

ADCC가 항체가 암 세포를 제거하는 주요 메카니즘 중 하나이고, 암 요법에 이용되는 것이 항체에 중요하기 때문에, ADCC를 유도하기 위한 인간화 JAA-F11 변이체의 능력이 조사된다. ADCC 활성은 인간화 작제물의 전체가 아닌 일부에서 보이고, 3개의 개체의 PBMCs에 보인다. H2L2 및 H3L3 항체는 마우스 4T1 및 인간 유방암 세포주의 키메라 또는 마우스 항체보다 더욱 현저한 ADCC를 유도하고, 이는, 현재 H2L2 및 H3L3 항체가 직접 수동적인 면역요법을 위한 바람직한 선택일 수 있음을 나타낸다. 마우스 JAA-F11는 임의의 시험에서 통계학적으로 현저한 ADCC 능력을 보이지 않는다. 항체가 킬링 종양 세포에 이용되는 다른 이펙터 기능은 CDC이다. 인간화, 키메라 및 마우스 JAA-F11 항체 중 어느 것도 CDC를 유도하지 않지만, 이러한 CDC 활성의 부족은 이들을 면역요법으로 이용하지 못하게 하고, 헤르셉틴(Herceptin)은 CDC의 오직 명목상의 양을 유도하는 것이 발견되고, 이는 그 작용 모드 중 하나가 아니다. Rituxan을 이용하는 데이터는, 보체 결합이 NK 세포 결합을 억제하고, 효능을 감소시키는 것을 보여준다.

항체는 세포로 항체-약물 콘쥬게이트의 형태로 약물 또는 독성을 이동시키기 위해 잠재적으로 이용될 수 있다. 따라서, 암 세포 상에 TF-Ag에 결합 후, 내재화 시키기 위해 인간화 JAA-F11 변이체의 능력을 평가한다. 마우스 JAA-F11은 1시간 내에 내재화 하기 위해 이전에 보여준다. 효소 면역 분석법을 이용하여, 마우스, H2L2, 키메라, H2L3, 및 H1L1 항체는 마우스 4T1 유방암 세포로 현저히 내재화되는 것을 보이지만, H3L3 항체는 현저한 내재화를 보이지 않는다. 생세포 형광 현미경법은, 효소 면역 분석법으로부터 얻어지는 결과를 확인한다. 더 높은 ADCC 활성을 보이는 항체는 더 낮은 내재화를 보이고, 내재화 분석으로부터의 결과가 이러한 기대와 일치하는, 즉 많이 내재화되지 않지만 마우스 또는 키메라 항체보다 H3L3 항체가 더욱 ADCC를 보이는 것을 기대한다. 그러나, H2L2는, ADCC 분석에서 잘 수행되지만, 잘 내재화된다. 어떻게 이들 둘이 동일한 항체에서 일어날 수 있는지의 메카니즘은 아직 이해되지 않지만, 하나의 가능성은, CHO 세포에서의 다양한 생성 속도가 다양한 푸코실화(fucosylation) 속도를 야기할 수 있고, 만약 H2L2가 덜 푸코실화되면, 비록 내재화되지만 세포 표면 상에 있는 시간 동안 우수한 ADCC를 수행할 것이라는 것이다. 이러한 결과는, 키메라, H2L2 및 H2L3 작제물이 항체-약물 콘쥬게이트로 이용될 가능성을 갖는 것을 보여준다.

마우스 124I-JAA-F11 항체는 마우스의 TF-Ag 유방암에 국부화 하는 것이 보여진다. 표지된 JAA-F11 항체는 인간 3중 네거티브 유방암에 적어도 20일 및 24일 동안 4T1 종양에 결합이 유지되고, 이는, JAA-F11이 TF-Ag 포함 종양을 치료하고, 전이를 찾기 위해 이용될 수 있는 것을 암시한다. iodine-124 표지된 인간화 항체가 마우스에서 인간 유방암에 국부화될 것인지를 시험하기 위해, 가장 높은 친화도를 갖는 인간화 항체, H2L2 변이체(내재화하고, ADCC를 수행하는)가 이용된다. 이미징은 우선적인 종양 흡수, 및 차가운 토끼 면역 글로불린을 이용하는 나중 실험에서 블럭킹되는 지라(spleen) 및 갑상선에서 흡수를 보인다. MicroPET 이미징은, 방사선 표지된 인간화 항체가 24시간 내에 종양에 의해 흡수되고, 96시간까지 나타낼 수 있는 것을 보여준다. 환자의 이러한 방사선 국부화(radiolocalization)는 전이를 발견하기 위해 이용될 수 있고, 직접 수동적인 면역요법 또는 항체-약물 콘쥬게이트 요법 전에 특정 환자에게 임의의 오프 타겟 결합(off target binding)이 존재하는지 결정하기 위해 이용된다.

TF-Ag는 유방암을 포함하는 몇 가지 인간 암종의 80% 이상으로 존재한다. 이는 종양 부착 및 전이에 기능적 역할을 가져, 타겟 TF-Ag에 항체의 능력은 전이를 억제하고, 암 세포를 죽이기 위해 항체-약물 콘쥬게이트로서 면역요법으로 이용 가능성을 제시한다. TF-Ag에 특정 고특이성을 갖는 JAA-F11 항체는 유방암 및 다른 암을 치료하기 위한 수동적인 항 TF-Ag 대응으로 우수한 잠재력을 유지된다. 우리의 인간화 접근에서, 이러한 특정 특이성을 유지하고, 인간화 JAA-F11 변이체와 함께 향상될 것이다.

실시예 2

이 실시예는 여기에 기재되는 결과를 얻기 위해 이용되는 방법 및 재료의 설명을 제공한다.

JAA-F11 CDRs는 이전에 예측되었다. 중쇄 및 경쇄 가변 부위의 아미노산 시퀀스를 확인하기 위해, 마우스 JAA-F11 항체의 클로닝 및 시퀀싱이 수행되었다.

인간에 치료적 이점을 갖기 위해, 항체는 타겟 항원에 특이성을 유지하고, 동시에 항-마우스 면역 반응을 생성하지 않아야 한다. TF-Agα에 대한 특이성 및 친화도를 유지하기 위해 마우스 JAA-F11의 CDRs을 유지하도록 CDR 그래프팅 시도가 선택된다. CDRs는 Chothia 및 Kabat 방법, 및 x선 결정 구조 및 컴퓨터 탄수화물 스레딩을 이용하여 선택된다.

중쇄 및 경쇄 JAAF-11 가변 부위 각각의 인간 억셉터 항체 프레임워크를 선택하기 위해, 단백질 BLAST® (BLASTP) 서치는 마우스 JAA-F11에 가장 상응하는 인간 항체를 확인하기 위해 전체 필요한 인간(호모 사피엔스) 젠뱅크 데이터 베이스에 대해 blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins에서 수행된다. 비-호모 사피엔스 단백질 시퀀스, 인간화 항체 및 파지 디스플레이 시퀀스 전체는 BLASTP 결과로부터 제거된다. JAA-F11의 중쇄 및 경쇄 가변 시퀀스 각각에 얻어지는 최상 10 가장 상응하는 시퀀스는 인간화 JAA-F11 (hJAA-F11)에 대해 잠재적인 인간 억셉터 항체 프레임워크로 선택된다. 시뷰 시퀀스 얼라인먼트 프로그램은 마우스 JAA-F11 가변 중쇄 또는 경쇄 영역 시퀀스를 갖는 10 잠재적인 인간 억셉터 가변 중쇄 또는 경쇄 프레임워크 시퀀스를 얼라이닝하기 위해 이용된다.

3개의 중쇄(H1, H2, 및 H3) 및 3개의 경쇄 (L1, L2, 및 L3) 가변 부위는 10 가장 유사한 인간 면역 글로불린 시퀀스의 단백질 BLAST 선택으로부터 구성된다. 그 후, 마우스 JAA-F11로부터의 최종 CDRs는 3개의 다양한 방법 중 하나에 의해 인간 프레임워크 영역 상에 그래프팅되고, 3개의 다른 중쇄 및 3개의 다른 경쇄를 생성한다. 첫번째 방법에서, (a) 중쇄 H1 및 경쇄 L1 FR 시퀀스는 최고 10 선택된 인간 FR 시퀀스 중에서 각 부위에 가장 자주 발생하는 인간 아미노산을 함유하도록 고안된다. 두번째 방법에서, (b) 중쇄 H2 및 경쇄 L2는, 아미노산이 마우스 JAA-F11에 보이도록 매칭되는 임의의 최고 10 인간 FR에 존재하지 않으면, 각 부위에서 최고 10 선택된 인간 FR 시퀀스 사이에 가장 자주 발생하는 인간 아미노산을 함유하도록 고안된 후, 아미노산은 마우스 JAA-F11에서와 같이 유지된다. 세번째 방법에서, (c) 중쇄 H3 또는 경쇄 L3에서, 마우스 JAA-F11의 CDR1, CDR2 및 CD3의 전후의 3개의 FR 잔기는 유지되고, 나머지 잔기는 변이체 H1 또는 L1과 같은 인간 시퀀스에서 가장 자주 보이는 아미노산이다. 이들 고안된 중쇄 가변 중 임의의 하나는 H1/L1, H1/L2, H1L3, H2L1, H2L3 등과 같이, 유사하게 고안된 경쇄 가변과 짝을 이룰 수 있다.

또한, 키메라 JAA-F11은, 전체 마우스 JAA-F11 가변 부위가 인간 IgG1 불변 영역에 부착되도록 구성된다. 이는, 인간 변이체를 평가하기 위한 포지티브 대조군으로 이용될 인간 불변 영역을 갖지만, 마우스 항체의 원래의 특이성 및 친화도를 가져야 하는 기준선을 제공하는 것이다.

모델 hJAA-F11의 평가

다양한 hJAA-F11 작제물는 배좌 효과가 평가된다. 간단히, 다양한 hJAA-F11 작제물의 제안된 중쇄 및 경쇄 가변 시퀀스는 JAA-F11 시퀀스와 얼라이닝된다. 둘러싸는 아미노산과 심각한 입체 상호 작용을 잠재적으로 야기할 수 있는 각각의 인간화 변이체의 프레임워크에서 임의의 아미노산 잔기는 제거되고, 원래의 마우스 JAA-F11 프레임워크 잔기로 대체된다.

T20 스코어를 이용하는 hJAA-F11 변이체의 면역원성 예측

인간화 또는 완전한 인간 항체는 인간 이용에 안전하고, 비면역성인 것으로 간주되지만, 전체 인간 및 인간화 항체의 면역원성은 환자에게 보고되었다. 선택된 시퀀스가 낮은 면역원성인지를 결정하기 위해, 면역원성 분석이 T20 스코어법에 의해 수행된다. Gao 등에 의해 개발된 T20 스코어 아날라이저는 38,000 이상의 인간 항체 시퀀스의 데이터 베이스를 이용하여 모노클로날 항체 가변 부위 시퀀스의 "사람성(humanness)"을 산출한다.

이 방법에서, 단백질 BLAST 서치가 수행되고, 시험 인간화 Ab는 우선 모든 이들 인간 시퀀스와 비교된다. 그 후, 인간화 항체는 최고 20 인간 Ab BLAST 매칭과 비교되고, 이들 시퀀스에 유사성이 스코어된다. 인간화 항체의 T20 스코어는 최고 20 매칭된 인간 시퀀스의 퍼센트 확인의 평균으로부터 얻어진다. 가장 높은 가능한 스코어는 100(가장 인간과 유사한)이다. 환자에게 면역원성에 대한 이러한 방법의 관계의 개념의 증거로서, Gao 등은 T20 스코어를 갖는 임상 개발(마우스, 키메라(마우스로부터), 인간화 (n=22), 및 전체 인간 항체 시퀀스)의 다양한 단계에서 또는 임상적 용도로 승인된 90 이상의 항체의 환자의 생체 내 면역원성 결과와 비교되고, 80 이상의 FR & CDR 시퀀스의 T20 스코어를 갖는 Abs는 면역성이 있고, 오직 FR 시퀀스에 대해 T20 스코어를 이용하여, 85 이상의 Abs는 면역성이 없는 것이 발견되었다. 인간화 JAA-F11 변이체의 T20 스코어는 abanalyzer.lakepharma.com/에서 T20 컷오프 인간 데이터베이스를 이용하여 산출된다.

코돈 최적화 및 유전자 합성. 인간화 JAA-F11 VH 및 VL 변이체 아미노산 시퀀스의 고안 후, 대응하는 뉴클레오티드 시퀀스는 중국 햄스터(Cricetulus griseus)(CHO) 세포 단백질 생성에 최적화된 코돈 이용을 위해 수동으로 선택되었고, 합성되고, 일반적으로 클로닝 벡터로 이용되는 pUC57 플라스미드에 삽입된다.

포유류 발현 벡터의 hJAA-F11 및 키메라 JAA-F11 변이 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 유전자의 서브 클로닝 및 시퀀싱. hJAA-F11 VH 유전자는 인간 거대세포바이러스(cytomegalovirus) (CMV) 프로모터 및 암피실린 (Amp) 및 히드티디놀 탈수소효소 (hisD) 카셋의 대조군 하에 인간 IgG1 중쇄 리더/불변 영역을 함유하는 발현 벡터 (pAH6307)로 서브-클로닝 및 삽입된다. VL 유전자는 인간 CMV 프로모터 및 네오마이신 포소포트랜스페라아제 (neoR) 카셋의 대조군 하에서 인간 카파 경쇄 리더/불변 영역을 함유하는 발현 벡터 (pAN 6714)에 삽입된다. 마찬가지로, 키메라 JAA-F11 VH 및 VL은 발현되고, 이후 분석에서 포지티브 대조군으로 이용된다.

인간화 및 키메라 JAA-F11 변이체의 제조 및 발현

CHO-K1 세포로의 공동 형질 주입(Co-transfection)

부착(Adherent) 중국 햄스터 난소 (CHO-K1; ATCC #CCL-61, Manassas, VA) 세포는, 50-80% 컨플루언시(confluency)로 수확되고, 습윤한 공기에서 5% 이산화탄소 (CO2) 및 37 ℃에서 10% 소 태아 혈청(FCS;Hyclone)으로 완충된 Ham's F12 배지 (Corning Cellgro, Manassas, VA)에서 형질 주입 전에, 18시간 동안 배양된다. 포유류 6307 pAH (VH) 및 6714 pAN (VL) 발현 벡터는 전기 천공법에 의해 CHO-K1 세포로 공동 형질 주입된다 (Gene Pulser System (Bio-Rad, Hercules, CA). 간단히, 각각의 플라스미드 (VH 및 VL)는 PvuI 제한 효소 (Promega, Madison, WI)를 이용하여 선형화되고(linearize), 5 ㎍의 각각의 플라스미드는 0.4 cm의 전기 천공법 큐벳 (Bio-Rad, Hercules, CA)에서 총 체적 500 ㎕ 중 차가운 Ham's F12 배지 (Corning Cellgro, Manassas, VA)에 5 × 106 CHO-K1 세포가 첨가된다. 혼합물을 함유하는 큐벳은 960 μF 및 250 mV에서 전기 천공된다. 그 후, 형질 주입 혼합물은 1 x 105 cells/mL의 농도로 미리-데펴진 선택되지 않은 배지 (10% FCS로 완충된Ham's F12)로 희석된다. 그 후, 웰 당 1 x 10⁴ 세포의 밀도로, 200 마이크로리터가 96-웰 조직 배양판 (BD Bioscience, San Jose, California)으로 플레이팅된다. 형질 주입된 세포는 조직 배양 인큐베이터 중 37 ℃ 및 5% CO₂ 에서 배양된다. 72시간 동안, 96-웰 조직 배양판으로부터 비선택적인 배지가 제거되고, 700㎍/ml G418 (Gibco, Life Techologies, Grand Island, NY), 5mM의 히스티디놀 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) 및 10mM의 HEPES 버퍼 (Corning Cellgro, Manassas, VA)를 함유하는 200㎕의 Ham's F12 (plus 10% FCS) 선택 배지로 교체되고, 콜로니는 3주까지 동안 성장된다. 플라스미드 6307 pAH 및 6714 pAN로 형질 주입되는 CHO-K1 세포는 성장을 계속하지만, 형질 주입되지 않은 CHO-K1 세포는 성장하지 않을 것이다. 다음 14-21일 동안 매 2-4일, 선택 배지는 죽은 세포의 잔해를 제거하기 위해 교체되고, 내성 세포의 콜로니는 선택 배지에서 성장된다.

효소 결합된 면역 분석법(ELISA)에 의한 배양 상청액의 분석

선택 후 14-21일 사이에, 96-웰 플레이트로부터의 CHO-K1 배양 상청액이 수집되고, 효소 결합 면역 분석법(ELISA)에 의해 항체에 대해 분석되었다. 간단히, 100 ㎕의 배양 상청액이 코팅 버퍼 (pH 9.6에서 0.1 M Na2CO3)에서 1.25 ㎍/mL의 TF-Ag-BSA 콘쥬게이트로 코팅되는 Immulon 1 B-배지 결합 96-웰 미량 정량판 (Thermo Scientific, Milford, MA)에 첨가되고, TBS-brij (pH 7.2)로 5번 세정했다. 또한, 포지티브 대조군으로 작용하기 위해, 살균 PBS 중 정제된 마우스 JAA-F11 (1 mg/mL)의 1:500 희석액이 각각의 플레이트 상의 2-3 웰이 첨가되었다. 37 ℃에서 2시간 배양 후, 플레이트는 5번 세정되고, 1% BSA-PBST 버퍼 (1:10,000) 중 100 ㎕의 항-인간 IgG-알칼리성 포스파타제 콘쥬게이트 2차 항체 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)를 형질 주입된 세포의 각 웰에 첨가하지만, 1% BSA-PBST 버퍼 중 항-마우스 IgG-알칼리성 포스파타제 콘쥬게이트 2차 항체 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)의 1:1000 희석액은 마우스 JAA-F11 대조군 웰에 이용된다. 실온에서 1시간 배양 후, 플레이트를 5번 세정한 후, 100㎕의 포스파타제 기질(p-니트로페닐 포스페이트(pNPP))(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)를 각각의 웰에 첨가했다. 플레이트는 TF-Ag에 대한 IgG 항체의 존재를 스크리닝 하기 위해 실온에서 1시간 배양 후 플레이트 리더를 이용하여 405nm에서 리딩한다. 블랭크에서, HAM's F12 (plus10% FCS) 배지는 1차 항체 배양 후, 2차 항체 배양 및 기질 배양 동안 이용된다.

안정한 클론의 생성 및 제조

선택이 시작된 후 14-21일에 항-TF-Ag 항체를 최초 스크리닝 후, 최고 흡수율 리딩을 갖는 10-12 클론을 선택하여, 증식을 위해 24-웰 조직 배양판으로 전달된다. 그 후, 이들 클론으로부터 배양 상청액은 ELISA에 의해 분석된다. 최고 흡수율 리딩을 제공하는 4 클론을 T25 조직 배양 플라스크로 전달하고, 클론이 TF-Ag에 여전히 항체 활성을 생성하는 것을 보증하도록, ELISA에 의해 항-TF-Ag 항체를 증식 및 스크리닝한다. 그 후, 이들 4 클론은 T75 조직 배양 플라스크로 전달되고, 항-TF-Ag 항체를 증식 및 재스크리닝하고, 저장되는 세포는 액체 질소로 냉동 저장된다. 그 후, 최고 항-TF-Ag 결과의 클론은, 세포주가 안정한 것을 보증하도록 증식되고 2-3번 계대(passaged)된다.

상기 얻어진 최고의 클론으로부터 각각의 hJAA-F11 중쇄 및 경쇄 조합의 안정한 각각의 세포 클론은 희석을 제한함으로써 서브 클로닝을 통해 생성된다. 간단히, 세포는 T75 조직 배양 플라스크에 컨플루언스(confluence)까지 성장되고, 수확 및 카운터되고, 선택 배지 중 96-웰 플레이트의 각각의 웰에서 0.3 세포/웰 희석액에 씨딩된다(seeded). 플레이트를 현미경 하에서 조심스럽게 7-10일 후에 관찰하고, 세포의 싱글 포커스를 보이는 웰을 마킹하고, 충분한 성장 밀도가 보일 때가지 모니터링한다. 이들 마킹된 웰로부터의 상청액을 ELISA에 의해 항-TF-Ag 항체를 시험했다. 최고 흡수율 리딩을 제공하는 4 클론을 부모 클론을 얻기 위해 상기 기재된 것과 같이 증식시킨다. 최고 흡수율을 제공하는 서브-클론을 증식시키고, T200 NuncTM 세포 배양 3중 플라스크 (Thermo Fisher Scientific, Inc.) 중에서 상청액의 생성을 위해 이용된다.

각각의 인간화 변이체 JAA-F11의 3중 플라스크 배양 플라스크의 생성을 위해, 배양 상청액의 1리터가 수확되기 전에 세포를 3주 동안 배양시킨다. 키메라 JAA-F11를 생성하는 클론을 인간화 JAA-F11 변이체와 동일한 방법을 진행하였다.

인간화 및 키메라 JAA-F11 변이체의 정제

인간화 및 키메라 JAA-F11 변이체 상청액을 단백질 A-세파로오스® 4B, Fast Flow affinity column (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)를 이용하여 정제했다. 단백질 A 컬럼을 제조하기 위해, 버퍼 A 중 수지의 1:1 현탁액 (0.02 M NaH2PO4, 0.15 M NaCl, pH 8.0까지)을 컬럼에 부었다. 컬럼을 고정한 후, 버퍼 A의 20 컬럼 체적 (CV)으로 세정했다. 죽은 세포 또는 잔해를 제거하기 위해, CHO-K1 세포 배양 상청액의 1리터를 30분 동안 3500 rpm에서 원심분리한 후, 여과했다. 여과된 상청액을 단백질 A 컬럼 상에 로딩하고, 1 mL/min의 유속으로 중력에 의해 드립시켰다. 그 후, 컬럼을 버퍼 A의 10 CV로 세정했다. 항체를 버퍼 B의 3 CV를 이용하여 단백질 A 컬럼으로부터 용리했다(0.2 M Na2HPO4, 0.1 M Citric Acid, pH 3.9). 항체에 대한 낮은 pH의 효과를 최소화 하기 위해 용리액을 0.1M NaOH로 조심스럽게 중성화했다. 단백질 A 컬럼을 20-30 CV의 버퍼 A로 재-평형화 하고, 2-8 ℃에서 저장했다. 각각의 컬럼을 동일한 항체에 대해 5번까지 이용했다. 정제된 항체를 서로; 1X PBS (Phosphate Buffered Saline) 또는 이후 분석에 요구되는 페놀 레드를 가지는 또는 가지지 않는 RPMI 배지에 대해 4 ℃에서 밤새 투석했다. 투석 후, 항체를 0.22 ㎛ 필터 (Corning)로 여과하고, 이하 설명되는 바와 같이 바이오-라드(Bio-Rad) 단백질 분석에 의해 단백질 농도를 결정했다. 항체를 4 ℃에서 저장하고, ELISA를 이용하여 TF-Ag의 결합을 체크했다.

바이오-라드 단백질 분석

항체 농도를 브래드포드 염료-결합법에 기초한 바이오-라드 단백질 분석을 이용하여 결정했다. 간단히, 염료 시약을 1:4 비율로 증류수로 희석하고, Whatman 여과지 #1을 이용하여 여과했다. 공지된 단백질 표준(1.44 mg/mL gamma globulin, Bio-Rad, Hercules, CA)의 일련의 희석액 및 인간화 항체 샘플을 1X PBS 버퍼를 이용하여 제조했다. 10 ㎕의 각각의 표준 및 샘플 용액을 미량 정량판의 웰로 3중으로 위치시켰다. 그 후, 희석된 염료 시약의 200 마이크로리터를 다채널 피펫을 이용하여 전체 웰로 첨가하고, 버블을 생성하지 않고 위아래로 피펫팅함으로써 혼합했다. 플레이트를 적어도 5분 내지 1시간 동안 실온에서 배양했다. 그 후, 흡수율을 플레이트 리더 상에서 595 nm에서 리딩했다(Bio-Tek Instruments).

화학적 특이성의 결정

다양한 hJAA-F11 작제물 및 키메라 JAA-F11의 화학적 특이성은 인쇄된 글리칸 분석을 이용하여 결정된다. 이는, 마우스 JAA-F11에서 이미 얻어진 데이터와 비교된다. 글리칸 어레이는 간접적인 면역 형광법이고, Functional Glycomics 웹사이트의 컨소시엄에 기재되어 있다. 각각의 작제물은 610 다양한 글리칸과 반응성이 분석된다. 간단히, 인쇄된 어레이는 항체와 연속하여 배양되고, 세정되고, FITC로 표지된 2차 항체와 배양된다. 세정 후, 이미지는 퍼킨 엘머 Microscanarray XL4000로 리딩되고, tiff 파일 이미지는 저장되고, Imagene V.6 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 이미지 분석이 수행된다. 각각의 결합 글리칸의 상대적인 결합이 표현되고, 원래의 글리칸 TF-Ag의 결합으로 정상화된다. ANOVA를 이용하여 상대적인 결합 능력의 비교 및 통계적 분석이 수행되었다.

상대적인 친화도의 결정

TF-Ag에 hJAA-F11의 상대적인 친화도 결합은 마우스 JAA-F11 항체 및 키메라 JAA-F11 항체와 경쟁적 저해 ELISA를 이용하여 분석되었다. 간단히, 3 ㎍/mL hJAA-F11 또는 키메라 JAA-F11을 1.25 ug/mL TF-Ag 코팅된 96-웰 플레이트 (Thermo Scientific, Milford, MA)에서 마우스 JAA-F11 (10, 8, 6, 4, 2 ug/mL)의 다양한 농도의 존재 하에 배양했다. 결합된 항체는 항-인간 IgG 2차 항체 및 기질과 배양함으로써 검출되고, 흡수율 리딩은 이들 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 얻어진다. 3 ㎍/mL의 인간화 또는 키메라 항체의 결합이 50%로 억제되도록 요구되는 마우스 항체의 양이 결정 및 비교된다. 억제를 위해 요구되는 마우스 항체의 양이 높을수록, 항체의 상대적인 친화도가 높아진다. 각각의 인간화 항체 및 키메라 항체의 상대적인 친화도는 ANOVA를 이용하여 비교된다.

hJAA-F11의 생물학적 효능의 분석

인간 유방암 세포주에의 결합 평가

다양한 인간 유방암 세포주에 hJAA-F11의 결합은 전체 세포 ELISA를 이용하여 분석된다. TF-Ag를 함유하는 마우스 포유류 종양 4T1 세포주는 포지티브 대조군으로 작용하지만, JAA F11 하이브리도마를 생성하기 위한 융합 파트너인 P3-X63-Ag8 골수종 (ATCC 넘버: CRL-1580) 세포주는 TF-항원 네거티브 대조군으로 작용한다. 포지티브 결합은 학생의 T 시험을 이용하여 골수종 세포주와 항체의 반응성에 대한 각각의 세포주를 갖는 각각의 항체의 반응성을 비교함으로써 결정된다. 데이터를 표준화 하기 위해, 각각의 세포주에의 결합은 시험 세포주에 리딩되는 흡수율을 골수종 세포에 리딩되는 흡수율로 나눔으로써 표현된다.

세포 제조

4T1 유방암 및 골수종 세포주는 비효소적 Cellstripper (Mediatech, Inc. VA, USA)를 이용하여 수확된다. 세포, 배지의 응집(clumping)을 억제하기 위해, 버퍼 및 시약을 이용 전에 미리-데펴지게 한다. 접착 세포에 대해, 배지를 배양 용기로부터 제거하고, 칼슘 및 마그네슘 없이 1X DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)로 세포를 린싱한다(Mediatech Inc., Cellgro). 5 밀리리터의 세포 해리 용액을 각각의 플라스크에 첨가한 후 10분 동안 37 ℃에서 배양했다. 세포를 몰아내기 위해서, 플라스크를 탭핑한다. 비접착 골수종 세포에 대해서, 플라스크를 잘 탭핑하고, 배양 상청액을 10분 동안 1000 x G에서 원심 분리한다. 세포 펠렛을 세포 해리 용액에서 재현탁하고, 10분 동안 37 ℃에서 배양했다. 배양 후, 20 mL의 1X DPBS를 세포에 첨가하고, 응집을 제거하기 위해 반복적으로 피펫팅했다. 그 후, 세포 현탁액을 10분 동안 1000 x G로 원심 분리했다. 상청액을 디켄팅하고, 펠렛을 5mL DPBS에서 재현택했다. 세포를 트리판 블루 염료 및 혈구계산판(hemocytometer)을 이용하여 카운팅했다. 1×106 생세포/ml를 얻기 위해 세포를 희석했다. 세포 현탁액 (2×105 세포)의 200 마이크로리터를 5ml의 폴리스티렌 튜브 4개조(quadruplet)에 위치시켰다. 4% 포름알데히드의 200 마이크로리터를 각각의 튜브에 첨가하고, 10분 동안 1500 x G에서 원심분리 되기 전에, 실온에서 20분 동안 배양했다. 상청액을 원 스로우(one throw)로 조심스럽게 디켄팅하고, 세포를 DPBS로 세정한 후 원심분리 및 디켄팅한다. PBS-트윈 1% BSA (w/v)의 200 마이크로리터를 각각의 튜브에 첨가하고, 2주까지 4 ℃ 이상에서 밤새 저장했다.

세포의 효소 면역 분석법

50 ㎍/mL의 마우스 JAA-F11, hJAA-F11 또는 키메라 JAA-F11 항체의 200 마이크로리터를 4개조에서 시험되는 다양한 세포주를 함유하는 튜브에 첨가하고, 2시간 동안 37 ℃에서 배양했다. 200 ㎕의 1X PBS-0.1% 트윈 20-1% BSA로 처리된 튜브의 1세트는 시험되는 각각의 세포주에 네거티브 대조군으로 작용한다. 튜브는 3 mL의 세정 버퍼 (1X PBS 트윈, 아지드 아님)로 3번 세정된 후, 1500 x G에서 10분 동안 원심분리된다. 상청액은 각각의 세정 사이에 조심스럽게 디켄팅된다. PBS-트윈-1% BSA 중 항-마우스 IgG (γ-쇄-특이적) 호스래디시 퍼옥시다제 2차 항체 (1:1000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 또는 항-인간 IgG (γ-쇄-특이적) 호스래디시 퍼옥시다제 2차 항체 (1:2000, Sigma Aldrich, St. Louis, MO)의 200 밀리리터가 각각의 튜브에 첨가된 후, 실온(RT)에서 1시간 동안 배양되었다. 배양 후, 튜브는 디켄팅되고, 3번 세정되고, 세정 사이에 1500 x G로 원심 분리되었다. 그 후, O-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드 기질 (OPD; Sigma, St. Louis, MO) 용액의 200 마이크로리터가 각각의 튜브에 첨가되고, 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 배양 후, 반응은 100 ㎕의 정지액 (1N H2SO4)에 의해 정지되고, 1500 x G에서 10분 동안 원심 분리되었다. 다음으로, 200 ㎕의 상청액은 각각의 튜브로부터 제거되고, 마이크로리터 플레이트에서 각각의 웰로 전달되었다. 마이크로플레이트 리더(Microplate Autoreader, Model EL311, Bio-Tek Instruments, Inc.)를 이용하여 490nm에서 흡수율은 리딩되고, 미반응된 OPD 기질이 블랭크로 이용되었다. 다양한 세포주에 대해서, 각각의 개별적인 평균 블랭크(오직 PBS-트윈-1%BSA를 갖는 튜브)는 최종 광학 리딩을 얻기 위해 각각의 평균 OD로부터 공제되었다. 각각의 실험은 3번 반복되었다.

생체 외 암 세포 증식에 대한 hJAA-F11의 효과

암 세포 성장에 대한 인간화 및 키메라 JAA-F11 항체의 효과를 측정하기 위해, 생체 외 3-[4,5-디메틸리아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리윰 브로마이드 (티아졸릴 블루, MTT) 증식 분석이 수행되었다. 4T1 마우스 유방암 세포 및 인간 유방암 세포가 다양한 양의 JAA-F11, 인간화 및 키메라 JAA-F11 (4, 2, 및 1 ㎍/mL)의 존재 하에 96-웰 플레이트 중 10 복제물에 1 x 104 cells/well로 씨딩되었다. 이러한 세포 밀도에서 플레이팅 되는 경우, 세포는 72시간에 이들 성장 곡선의 선형 부분이다. 항체 없이 배양 배지에서 성장된 세포는 보통의 성장 대조군으로 작용한다. 배양 배지 단독이 블랭크로 이용된다. 37 ℃에서 세포 성장의 68시간 후, 10 ㎕의 테트라졸리윰염 MTT (5mg/ml)가 각각의 웰에 첨가되고, 플레이트는 다른 4시간 동안 인큐베이터로 돌아가게 된다. 배양의 마지막에, 각각의 웰에서 얻어지는 포르마잔(formazan) 생성물은 120 ㎕의 디메틸 설폭시드 (DMSO, Fisher Scientific)를 첨가함으로서 가용화되고, 그 후, 각각의 웰의 흡수율은 570 nm에서 측정된다(MicroplateAutoreader, Model EL311, Bio-Tek Instruments, Inc.).

항체-의존 세포의 독성 분석

hJAA-F11 항체의 이펙터 기능을 측정하기 위해, ADCC(antibody-dependent cellular cytotoxicity) 및 CDC(complement-dependent cytotoxicity) 분석이 수행되었다.

ADCC는 이펙터 세포로서 인간 PBMC(peripheral blood mononuclear cells)를 이용하고, 이펙터:타겟(E:T) 비율이 100:1인 타겟 세포로서 인간 유방암 세포주를 이용하여 LDH(lactate dehydrogenase) 분해 분석(CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity assay; Promega, Madison, WI)에 의해 결정되었다.

PBMCs는 Ficoll-Paque를 이용하여 밀도 구배 원심법(density gradient centrifugation)에 의해 전체 혈액으로부터 제조되었다. 퍼플-탑 EDTA 베큐테이너(vacutainer)에 수집되는 전체 혈액은 동 체적의 미리-데펴진 살균 DPBS와 혼합된다. 그 후, 희석된 혈액의 20 밀리리터는 50 mL의 코니컬 튜브에서 15 mL의 피콜-빠끄 플러스(Ficoll-Paque Plus) (GE Healthcare)에 부드럽게 레이어드된다. 샘플은 멈춤 없이 실온에서 30-40분 동안 1300 rpm에서 원심 분리된다. 다음으로, PBMC 층은 수집되고, 살균 PBS는 총 체적 40mL의 PBMCs에 첨가된다. 그 후, 임의의 오염 피콜 및 혈소판/플라스마 단백질을 제거하기 위해, 혼합물은 18 ℃ 내지 22 ℃에서 10분 동안 1000 rpm에서 원심분리 되었다. 상청액을 버리고, 세포를 새로운 살균 PBS에 재현탁하고, 원심 분리 단계를 반복했다. 세포를 RPMI 1640 배양 배지 (10% FCS)에 재현탁하고, 혈구계산판 및 트리판 블루를 이용하여 카운팅했다.

타겟 세포 (1 x 104; 30㎕) 및 PBMCs (1 x 106; 30㎕)를 96-웰 U-바톰 플레이트에 첨가하고, 조직 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 17시간 동안 hJAA-F11 또는 키메라 항체 (200 ㎍/mL; 30㎕)와 배양했다. 17시간 배양 완료 전 45분, 10 ㎕의 용해 용액 (x10)을 타겟 세포 최대 LDH 분해 대조군(타겟 세포 및 배지) 및 체적 조정 대조군 (단독 배지)을 함유하는 웰에 첨가했다. 배양의 마지막에, 플레이트를 1000 rpm에서 4분 동안 원심 분리했다. 그 후, 50 마이크로리터 약수(aliquot)를 전체 웰에서 새로운 플랫-바톰 96-웰 플레이트로 전달했다. 다음으로, 50 ㎕의 환원의 기질 믹스(reconstituted substrate mix)를 이들 웰 각각에 첨가했다. 플레이트를 호일로 커버하고, 실온에서 30분 동안 배양했다. 반응이 각각의 웰에 50 ㎕의 정지액의 첨가로 정지되고, 흡수율은 마이크로플레이트 리더 (MicroplateAutoreader, Model EL311, Bio-Tek Instruments, Inc.)를 이용하여 490 nm에서 기록된다. 세포 독성은 이하 식을 이용하여 산출된다:

세포 독성(%)=100 × [(E - SE)] / [(M - SE)],

각각의 조건에 대한 기질의 흡수율이 측정된다. 조건은 다음과 같다; E는 실험 웰이고, SE는 항체 대조군 없는 자발적인 해리이고(타겟 세포는 이펙터 세포 및 PBS와 배양됨), M은 10X 용해 용액으로 용리된 타겟 세포에 의해 측정되는 최대 해리이다.

CDC (Complement dependent cytotoxicity) 분석

CDC는 타겟 세포 집단으로 HCC 1428 유방암 세포(ATCC® CRL-2327, Manassas, VA)를 이용하는 LDH(lactate dehydrogenase) 분해 분석(CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity assay; Promega, Madison, WI)에 의해 측정된다. 시약 키트와 제공되는 소 심장 LDH를 함유하는 LDH 포지티브 샘플은 포지티브 대조군으로 이용된다. 세포 독성의 배경 수준에 대한 토끼, 새끼 토끼 및 기니피그 보체를 비교한 후, 감압 하에 동결 건조된 기니피그 혈청(CL3112, Cedarlane Laboratories, Burlington, NC)이 보체의 공급원으로 이용되고, 제조자의 지시에 따라 재구성되었다. 분석에 이용된 최적 세포 농도는 웰 당 1 x 104 cells/50 ㎕이다. 사용되는 항체는 페놀 레드 프리-RPMI 배지에 대해서 투석되었다. 실험 웰에서, 50 ㎕의 HCC 1428 세포 현탁액, 20 ㎕의 보체 희석액 (1:20로 최종 희석액), 및 30 ㎕의 항체 (100 ㎍/ml의 최종 농도)가 라운드-바톰 96-웰 배양판의 4개조 세트의 각 웰에서 혼합되었다. LDH의 자발적인 분해 및 보체 공급원으로 사용되는 혈청에 의해 조절되는 임의의 세포 독성에 대한 대조군에 항체 없이 타겟 세포 및 보체를 함유하는 대조군 웰이 포함된다. 플레이트는 4분 동안 1000 rpm에서 원심분리 된 후, 5% 이산화탄소와 37 ℃에서 2시간 동안 배양된다. 2시간 배양 완료 전 45분, 10 ㎕의 용해 용액 (x10)을 타겟 세포 최대 LDH 분해 대조군 및 체적 조절 대조군을 함유하는 웰에 첨가했다.

배양 마지막에, 플레이트를 1000 rpm으로 4시간 동안 원심 분리했다. 그 후, 50 마이크로리터 약수를 전체 웰에서 새로운 플랫-바톰 96-웰 플레이트로 전달했다. 다음으로, 50 ㎕의 환원의 기질 믹스(reconstituted substrate mix)를 이들 웰 각각에 첨가했다. 플레이트를 호일로 커버하고, 실온에서 30분 동안 배양했다. 반응이 각각의 웰에 50 ㎕의 정지액의 첨가로 정지되고, 흡수율은 마이크로플레이트 리더 (MicroplateAutoreader, Model EL311, Bio-Tek Instruments, Inc.)를 이용하여 490 nm에서 기록된다. 세포 독성은 이하 식을 이용하여 산출된다:

세포 독성(%)=100 × [(E - SE)] / [(M - SE)],

각각의 조건에 대한 기질의 흡수율이 측정된다. 조건은 다음과 같다; E는 실험 웰이고, SE는 항체 없이 보체를 갖는 자발적인 해리이고(타겟 세포는 보체 및 배지와 배양됨), M은 10X 용해 용액으로 용리된 타겟 세포의 것이다.

세포 내재화 분석

인간화 및 키메라 JAA-F11의 4T1 유방암 세포로의 내재화는 2가지 방법, 4 ℃ 또는 37 ℃의 2가지 배양 온도에서 측정되는 표면 결합을 이용하는 효소 면역 분석법, 및 면역 형광 현미경법에 의해 분석된다.

내재화의 효소 면역 분석법

마우스 4T1 유방암 세포주는 JAA-F11, hJAA-F11 또는 키메라 JAA-F11의 내재화가 시험된다. 5십만 (5 x 105) 세포는 6-웰 플레이트의 6 웰 전체에 씨딩되고, 컨플루언스로 성장된다. 각각의 시험되는 항체에 대해서, 2개의 플레이트가 준비된다. 배지는 각각의 플레이트로부터 제거되고, 1 mL의 항체 (200 ㎍/mL)는 각각의 플레이트의 3웰에 첨가되고, 1 mL의 PBS 희석액이 남아 있는 3웰에 첨가된다. 플레이트의 한 세트를 37 ℃에서 배양해 내재화시키고, 다른 플레이트는 4 ℃에서 배양된다. 1시간 배양 후, 배지는 제거되고, 웰은 1 mL의 페놀 레드 프리 RPMI 배지로 4번 세정된다. 다음으로, 1 mL의 2% 파라포름알데히드가 각각의 웰에 첨가되고, 플레이트는 세포를 고정하기 위해 20분 동안 실온에서 배양된다. 그 후, 플레이트는 페놀 레드 프리 RPMI 배지로 4번 세정된다. 다음으로, 1% BSA/PBS 중 1 mL의 항-마우스 또는 항-인간 IgG (γ-쇄-특이적) 알칼리성 포스파타제 2차 항체 (1:5000, Sigma, St. Louis, MO)가 첨가되고, 플레이트는 1시간 동안 37 ℃에서 배양된다. 그 후, 플레이트는 페놀 레드 프리 RPMI 배지로 4번 세정되고, 1 mL의 p-니트로페닐 포스페이트 기질(pNPP)이 첨가되고, 암실에서 1시간 동안 배양되었다. 1시간 배양 후, 각각의 웰로부터 200 ㎕가 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 전달되고, 흡수율은 마이크로플레이트 리더(MicroplateAutoreader, Model EL311, Bio-Tek Instruments, Inc.)를 이용하여 405 nm에서 기록되었다. 반응되지 않은 기질은 블랭크로 이용되었다. 3중 웰은 평균화되고, 오직 블랭크의 배지의 평균 광학 밀도는 항체를 함유하는 웰로부터 공제된다. 퍼센트 내재화는 이하 식을 이용하여 산출된다:

% 내재화=100* [1-(37 ℃ 샘플- 37 ℃ 블랭크) / (4 ℃ 샘플-4 ℃ 블랭크)]

면역 형광 현미경법

이 방법에서, 4T1 유방암 세포는 10% FCS RPMI 1640 배지 중 3 x 105 세포의 밀도로 2개의 6-웰 조직 배양판에서 커버 슬립 상에 씨딩되고, 24시간 동안 5% CO2 및 37 ℃에서 배양된다. 배지가 플레이트로부터 제거되고, 혈청-프리 RPMI 1640 배지에 희석된 1.5 mL의 시험 항체 (5 ㎍/mL)가 각각의 웰에 첨가되었다. 항체의 표면 결합을 시키기 위해, 두 플레이트를 20분 동안 4 ℃에서 위치시켰다. 20분 배양 후, 커버 슬립을 플레이트 중 하나를 새로운 6-웰 플레이트로 전달했다. 항체 희석액은 2차 플레이트로부터 제거되고, 미리-데펴진 혈청 프리 RPMI 1640 배지가 첨가되고, 플레이트는 조직 배양 인큐베이터에서 1시간 동안 37 ℃에서 배양되었다. 1차 플레이트로부터 커버 슬립은 얼음-차가운 5%BSA/PBS로 두번 세정하고, 1X PBS로 한번 린싱한 후, 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드 용액(Affymetrix)으로 고정했다. 37 ℃에서 1시간 배양 후, 2차 플레이트로부터 커버 슬립은 새로운 6-웰 플레이트로 전달, 세정, 린싱 및 고정되었다.

1X PBS로 세번 세정한 후, 양 플레이트 중 세포는 실온에서 10분 동안 PBS 중 0.1% 트리톤(Triton) X-100, 0.1% 소듐 디옥시콜레이트가 투과되게 하였다. 다음으로, 세포를 1X PBS로 3번 린싱한 후, 실온에서 30분 동안 5% BSA/PBS에서 배양했다. 그 후, 커버 슬립은 실온에서 1시간 동안 1 ㎍/mL의 5% BSA/PBS의 희석액에서 토끼 항-리소좀 멤브레인 단백질 1(LAMP1; Abcam, 24170) 항체와 배양되었다. 그 후, 커버 슬립은 1X PBS로 3번 린싱되고, 1:500의 5% BSA/PBS 희석액에서, 항-마우스 IgG-Alexa 647 및 항-토끼 IgG Alexa 488 (마우스 JAA-F11 커버 슬립) 및 항-인간 IgG-Alexa 647 및 항-토끼 IgG Alexa 488 (키메라 및 hJAA-F11) 2차 항체 (Molecular Probes, Invitrogen)와 배양되었다. 항-토끼 IgG Alexa 488 2차 항체는 항-LAMP 1 항체를 검출하기 위해 이용되었다. 커버 슬립은 암실, 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 배양 후, 세포는 암실에서 1X PBS로 3번 린싱되었다. 커버 슬립을 현미경 슬라이드 상의 DAPI 배지와 슬로페이드 골드 시약 (Slowfade Gold reagent)과 아래로 마주하는 세포에 위치시키고, 매니큐어로 밀봉했다. 세포를 AxioImager 형광 현미경 (Zeiss)으로 분석했다. 이미지를 캡쳐하고, AxioVision Release 4.8.2 소프트웨어를 이용하여 분석했다.

TF-Ag를 갖는 유방암을 검출하도록 인간화 JAA-F11의 효능을 시험하기 위한 생체 내 연구

상기 생체 외 생물학적 연구로부터 얻어지는 H2L2 인간화 JAA-F11 항체를 이용하여, iodine-124 표지된 인간화 항체가 마우스의 TF-Ag 유방암의 위치를 알아낼 수 있는지를 시험하기 위해, 마우스에 대해 면역 조직화 연구가 수행되었다.

hJAA-F11 (H2L2) 항체의 [124]요오드 표시(Iodine labeling)

인간화 JAA-F11 항체의 [124]요오드 표시는 볼튼 헌터법(Bolton Hunter method)을 이용하여 수행되었다. 요오드화 전에, 인간화 항체는 우선 볼튼 헌터 시약 (Sulfo-SHPP)(Thermo Scientific, Rockford IL, USA)을 이용하여 변형된다. 간단히, 1.9 mg의 hJAA-F11 항체가 변형 버퍼에 용해되었다(200 mM borate buffer, pH 9.0). 5 mg의 수용성 볼튼 헌터 시약은 사용 직전에 1 mL의 변형 버퍼에 용해되었다. 그 후, 100 ㎕의 수용성 볼튼 헌터 시약 용액은 항체 샘플에 첨가되고, 주기적인 혼합과 함께 3시간 동안 얼음 상에서 배양되었다. 비반응되는 수용성 볼튼 헌터 시약은 PBS(PBS: 0.1 M 소듐 포스페이트, 150 mM 소듐 클로라이드)에 대해 투석됨으로써 제거되었다. 이 중간 단계에서, 인간화 항체는 항체의 리신 중 일부와 부착되는 링커를 함유하고, 이는 2주 동안 안정하다.

그 후, 변형된 hJAA-F11 항체는 키조니트 간접 표시법(Chizzonite indirect labeling method) [158]을 이용하여 표지된다. 간단히, 피어스(Pierce) 예비-코팅된 요오드화 튜브(Thermo Fisher, Rockford, IL, USA)는 1 mL의 높은 트리스 요오드화 버퍼(0.125 M Tris-HCl, pH 6.8, 0.15 M NaCl)로 예비-웨팅(prewet)된다. 버퍼는 디켄팅된 후, 100 ㎕의 높은 트리스 요오드화 버퍼가 튜브의 바닥에 직접적으로 첨가된 후, 0.02 M NaOH 용액(IBA Molecular, Richmond, VA) 중 280 ㎕의 (4.59 밀리쿼리) 소듐 124I 요오드가 첨가된다. 방사성 동위원소 칼리브레이터 CRC 12 (Capintec)를 이용하여 최초 카운트가 행해진다. pH가 7, 중성인 것을 보증하기 위해, 혼합물의 pH가 측정된다. 실온에서 6분 활성화 후, 활성화된 요오드가 이전에 변형된 huJAA-F11 용액에 첨가되었다. 9분 배양 기간 후, 50 ㎕의 포집 버퍼(Scavenging Buffer) (10 mg tyrosine/mL in Tris Iodination Buffer; 25 mM Tris, pH 7.5, 0.4 M NaCl) 및 혼합물은 5분 동안 배양되었다. 포집 버퍼의 목적은, 버퍼 중에 티로신과 반응하는 프리 요오드를 제거하는 것이다.

그 후, 1 mL의 트리스/NaCl/EDTA 버퍼 (25 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 0.4 M NaCl, 5 mM EDTA, 0.05% 소듐 아지드)를 반응 혼합물에 첨가한다. 그 후, 샘플을 트리스/NaCl/EDTA 버퍼와 예비-평형을 맞춘 10 mL의 탈염 컬럼에 첨가한다. 샘플 튜브를 0.5 mL 트리스/NaCl/EDTA 버퍼로 세정하고, 세정한 것을 컬럼에 첨가했다. 샘플을 트리스/NaCl/EDTA 버퍼를 이용하여 각각 500 ㎕의 15 분획으로 용출시키고, 방사성을 시험했다. 방사성 표지 효능을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 가장 높은 활성을 갖는 분획에 대해 측정했다. 방사성 표지된 항체는 표시의 2시간 내에 동물로 주입된다. 표지된 인간화 JAA-F11가 그 TF-Ag 활성을 유지하는지를 보증하기 위해, 방사성 면역 분석도 수행되었다.

동물 및 종양 모델

이 연구에서 동물은 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committees) 규율에 따라 하우징 및 이용된다. 전체 프로토콜은 버팔로 대학의 IACUC에 의해 승인되었다. 4T1 마우스 유방암 세포는 하나의 오른쪽 유두 피하에 0.1 mL D-PBS 중 5 x 104 세포를 주입함으로써 7-8주령 암컷 Balb/C 마우스에 이식되었다. 마우스를 2 그룹으로 나누고, 꼬리 정맥에 의해 종양 이식 후 10-14일 [124I]-hJAA-F11 (n=13) 및 프리 124124 (n=7) 주입된 후, 생물 분류 연구 및 Micro-PET 이미징이 수행되었다. 각각의 2 그룹으로부터 하나의 마우스는 이미징된 후 연구되었다. 전체 마우스는 갑상선-차단 체제로 전체 연구를 통해, 표지된 항체가 주입된 후 0.2g/L의 포타슘 요오드 수(potassium iodide water)가 수용된다.

생물 분류 연구

마우스는 방사성 표지된 항체의 주입 후 72, 96, 168, 및 192 시간에 복강 내 0.1 mL 소듐 판토바르비탈(Sodium Pentobarbital) (Fatal Plus)을 주입함으로써 희생된다. 각 시점에, 표지된 항체가 전달된 3마리의 마우스 및 프리 요오드를 갖는 2마리의 마우스는 희생된다. 혈액, 근육, 지라, 폐, 신장, 심장, 간, 소장, 대장, 위, 뇌, 피부, 종양 조직, 뼈, 꼬리, 식도, 갑상선 및 난소가 수확되고, 미리 칭량된 5 ml의 폴리프로필렌 튜브에 넣는다. 이들 튜브는 각각의 조직/기관의 실제 중량을 얻기 위해 재칭량된다. 전체 뷰트가 캡핑되고, 방사성은 감마 카운터를 이용하여 측정된다. 각각의 조직에 대한 방사성 흡수는 첨부 2에서와 같은 하기 식에 따라 조직의 그램에 대한 주입량의 퍼센트(%ID/g)로 산출된다:

Micro-PET 이미징

2개의 그룹으로부터 각각의 하나의 마우스에서 표지된 항체의 국부화는 공지된 기술을 이용하여 주입한 후 24, 48, 72, 96, 168, 및 192 시간에 MicroPET 카메라, Focus 120® (Siemens Concorde Microsystems)을 이용하여 MicroPET 이미징을 통해 결정된다. 간단히, 스캐닝 전에, 마우스는 O2/이소플루레인(isoflurane) (1%-3% 이소플루레인)으로 마취된 후, MicroPET 스캐너의 겐트리(gantry)에서 프론(prone) 위치에서 이미징된다. 방출 스캔 윈도우는 350 내지 750 keV 사이에서 세팅된다. 스캔은 각 마우스에 대해 30분 동안 수행된다.

방사성 면역 분석법

방사성 표지된 항체의 면역성을 결정하기 위해, RIA(radioimmunoassay)가 수행된다. 미량정량판이 코팅 버퍼에서 100 ㎕의 1.25 ㎍/mL TF-Ag-BSA 콘쥬게이트로 코팅되었다. 버퍼를 웰로부터 제거하고, 1%BSA/PBS-트윈으로 세정했다. 1%BSA/PBS-트윈 중 방사성 표지된 hJAA-F11의 연속 희석액의 100 마이크로리터가 웰이 첨가되고, 1시간 동안 실온에서 결합시켰다. 배양 후, 결합되지 않은 항체는 다채널 피펫을 이용하여 수동으로 3번 1%BSA/PBS-트윈을 갖는 웰을 세정함으로써 제거된다. 결합되지 않은 hJAA-F11은 실온에서 30분 동안 200 ㎕의 1M 아세트산/0.15M NaCl 버퍼 (pH 2.4)로 배양함으로써 플레이트로부터 제거된다. 배양 후, 각각의 웰로부터 100 ㎕의 용액을 분리된 폴리프로필렌 시험관에 첨가하고, 방사성을 감마 카운터를 이용하여 측정했다.

본 발명은 특정 실시형태를 통해 설명하지만, 관례적인 변형은 당업자에게 명백할 것이고, 이러한 변형은 본 발명의 범위 내인 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> THE RESEARCH FOUNDATION OF STATE UNIVERSITY OF NEW YORK Kate, Rittenhouse-Olson <120> HUMANIZED ANTI-TF-ANTIGEN ANTIBODIES <130> 011520.01155 <150> 61/981,240 <151> 2014-04-18 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> mouse <400> 1 Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met His 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> mouse <400> 2 Phe Ile Ser Pro Asn Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Arg 1 5 10 15 Asp <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> mouse <400> 3 Arg Ser Phe Ile Gly Tyr Asn Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 1 5 10 15 <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> mouse <400> 4 Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu 1 5 10 15 Glu Trp <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> mouse <400> 5 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> mouse <400> 6 Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> humanized antibody chain <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Phe Ile Ser Pro Asn Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Phe Ile Gly Tyr Asn Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 118 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> humanized antibody chain <400> 8 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Phe Ile Ser Pro Asn Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Phe Ile Gly Tyr Asn Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 118 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> humanized antibody chain <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Phe Ile Ser Pro Asn Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Phe Ile Gly Tyr Asn Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> humanized antibody chain <400> 10 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 11 <211> 112 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> humanized antibody chain <400> 11 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 12 <211> 112 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> humanized antibody chain <400> 12 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 13 <211> 117 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> humanized antibody chain <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Phe Ile Ser Pro Asn Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Phe Ile Gly Tyr Asn Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser 115 <210> 14 <211> 118 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> humanized antibody chain <400> 14 Glu Gly Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Lys Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Phe Ile Ser Pro Asn Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Phe Ile Gly Tyr Asn Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 112 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> humanized antibody chain <400> 15 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 110 <210> 16 <211> 112 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> humanized antibody chain <400> 16 Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Asn Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 17 <211> 112 <212> PRT <213> mouse <400> 17 Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Asn Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Claims (8)

1. 중쇄 및 경쇄를 포함하고, TF-Ag에 특이적으로 결합하는, 부분적으로 인간화된(partially humanized) 모노클로날 항체(mAb) 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
   상기 중쇄 또는 이의 항원 결합 단편은 이하로 이루어지는 시퀀스: EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVKQAPGQGLEWIGFISPNTDYTEYNQKFRDKATMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:9) (H3)
   를 포함하고, 상기 경쇄 또는 이의 항원 결합 단편은 이하로 이루어지는 시퀀스: DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:12) (L3)
   를 포함하는 것이거나,
   또는
   상기 중쇄 또는 이의 항원 결합 단편은 이하로 이루어지는 시퀀스:
   QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGFISPNTDYTEYNQKFRDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTVTVS (SEQ ID NO:13) (H2a)를 포함하고, 상기 경쇄 또는 이의 항원 결합 단편은 이하로 이루어지는 시퀀스:
   DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKVDIK (SEQ ID NO:15) (L2a)
   를 포함하는 것인, 부분적으로 인간화된 모노클로날 항체(mAb) 또는 이의 항원 결합 단편.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 모노클로날 항체(mAb)는 인간 IgG 불변 영역(constant region)을 포함하는 것인, 부분적으로 인간화된 모노 클로날 항체(mAb).
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 모노클로날 항체(mAb) 또는 이의 항원 결합 단편은 화학요법 치료제(chemotherapeutic drug), 독소(toxin) 및 방사성 동위원소(radioactive isotope)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제제와 콘쥬게이트되는 것인, 부분적으로 인간화된 모노클로날 항체(mAb) 또는 이의 항원 결합 단편.
   
4. 개체의 암 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물로서,
   상기 암은 TF-Ag를 발현하는 암 세포를 포함하고, 상기 조성물은 하나 이상의 제1항의 모노클로날 항체(mAb) 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 개체에서 상기 암 세포의 성장, 또는 생존, 또는 전이, 또는 이들의 조합은 상기 약제학적 조성물의 투여 후에 억제되는, 약제학적 조성물.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 모노클로날 항체(mAb)는 인간 IgG 불변 영역을 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
   
6. 제4항에 있어서,
   상기 모노클로날 항체(mAb) 또는 이의 항원 결합 단편은 화학요법 치료제, 독소 및 방사성 동위원소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제제와 콘쥬게이트되는 것인, 약제학적 조성물.
   
7. 제1항에 기재된 부분적으로 인간화된 모노클로날 항체(mAb) 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 개체의 암 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물.
   
8. 세포 배양액 중 세포가 제1항에 기재된 부분적으로 인간화된 모노클로날 항체(mAb) 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하는, 생체 외 세포 배양액(in vitro cell culture).

Images