TW201821436A

TW201821436A - 重組蛋白質及其製造方法與應用

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Publication number: TW201821436A
Application number: TW106143449A
Authority: TW
Inventors: 黃怡超; 李懷洛; 蔡郁吟; 林志龍
Original assignee: 財團法人工業技術研究院
Priority date: 2016-12-13
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2018-06-16
Also published as: CN108220263B; CN108220263A; EP3336179A1; US10533160B2; TWI668229B; US20180163184A1; EP3336179B1

Abstract

一種重組蛋白質及其製造方法與應用。重組蛋白質包括一胜肽，且此胜肽包括對序列辨識號：1之序列進行置換後的胺基酸序列，而所指置換包括由下列置換所組成之群組的至少一者：所述序列辨識號：1之第182位的胺基酸被置換為天門冬胺酸（Asp）；所述序列辨識號：1之第268位的胺基酸被置換為天門冬胺酸（Asp）；以及所述序列辨識號：1之第384位的胺基酸被置換為酪胺酸（Tyr）。上述重組蛋白質可適用於檢測糖化血色素。

Description

重組蛋白質及其製造方法與應用

本發明是關於一種重組蛋白質及其製造方法與應用，特別是關於一種適用於檢測糖化血色素的重組蛋白質。

對糖尿病患者而言，血糖的治療或控制效果的評估是以糖化血色素(hemoglobin A1c, HbA1c)作為最佳的檢測標的，且以酶法(酵素法，Enzyme method)作為常規的臨床檢測方法。酶法的檢測原理是以果糖基胺基酸氧化酶(fructosyl amino acid oxidase, FAOD)的糖解作用作為基礎，其中以FAOD作為主要反應酶，而以果糖基纈胺酸(fructosyl valine, F-V)與果糖基纈胺醯基組胺酸(fructosyl valyl histidine, F-VH) 作為反應基質，藉以進行糖化血色素的測定。

因此，在利用酶法所進行的糖化血色素檢測中，作為主要反應酶的果糖基胺基酸氧化酶的基質特異性(substrate specificity)成為關鍵因素。然而，在糖化血色素被蛋白酶水解的過程中，除了產生F-V與F-VH之外，也會相對產生大量的果糖基賴胺酸(fructosyl lysine, F-K)，而目前市場上所提供的FAOD對於F-K仍具有一定的親和性（affinity），導致糖化血色素的檢測受到干擾。

此外，目前市面上用以檢測糖化血色素的檢測試劑盒中，其果糖基胺基酸氧化酶的熱穩定性並不理想，多在試劑盒中添加大量穩定劑來提高穩定性，然診斷試劑需要一定的保存時間，因而對穩定性有較高的要求，且所加入的穩定劑常導致試劑黏度提高而影響後續的檢測。

因此，目前亟需一種具有高基質特異性及熱穩定性的果糖基胺基酸氧化酶，以達到既可精準定量糖化血色素並能長期穩定保存的目的。

本發明提供一種重組蛋白質，可具有較高的熱穩定性與基質特異性。

本發明另提供一種重組蛋白質的製備方法，以製備上述的重組蛋白質。

本發明另提供一種用於檢測糖化血色素的檢測試劑盒，具有可精準定量糖化血色素以及長期穩定保存的優點。

本發明提供一種重組蛋白質，其包括一胜肽。此胜肽包括對序列辨識號：1之序列進行置換(substitution)後的胺基酸序列。前述置換可包括由下列置換所組成之群組中的至少一者：序列辨識號：1之第182位的胺基酸被置換為天門冬胺酸（Asp）、序列辨識號：1之第268位的胺基酸被置換為天門冬胺酸（Asp）、以及序列辨識號：1之第384位的胺基酸被置換為酪胺酸（Tyr）。

在本發明的一實施例中，上述置換可包括由下列置換所組成之群組中的至少一者：序列辨識號：1之第182位的胺基酸由甘胺酸（Gly）置換為天門冬胺酸（Asp）(Gly182Asp)、序列辨識號：1之第268位的胺基酸由天門冬醯胺（Asn）置換為天門冬胺酸（Asp）(Asn268Asp)、以及序列辨識號：1之第384位的胺基酸由組胺酸（His）置換為酪胺酸（Tyr）(His384Tyr)。

在本發明的一實施例中，上述胜肽的胺基酸序列可包括序列辨識號：2之序列。

在本發明的一實施例中，上述胜肽的胺基酸序列可包括序列辨識號：3之序列。

在本發明的一實施例中，上述胜肽的胺基酸序列可包括序列辨識號：4之序列。

在本發明的一實施例中，上述序列辨識號：1之胺基酸序列以及編碼此序列辨識號：1之多核苷酸（polynucleotide）可選自於小麥枯草菌（Phaeosphaeria nodorum ）。

本發明另提供一種重組蛋白質的製備方法，包括將質體（plasmid）中可編碼序列辨識號：1之胺基酸序列的核苷酸（nucleotide）序列進行置換。置換包括由下列置換所組成之群組中的至少一者：將編碼第182位胺基酸的核苷酸置換為編碼天門冬胺酸的核苷酸，將編碼第268位胺基酸的核苷酸置換為編碼天門冬胺酸的核苷酸，以及將編碼第384位胺基酸的核苷酸置換為編碼酪胺酸的核苷酸。將進行置換後的質體轉化（transformation）至宿主細胞（host cell）中以得到轉化體（transformant），再利用此轉化體表現出上述的重組蛋白質。

在本發明的一實施例中，上述置換包括由下列置換所組成之群組中的至少一者：將編碼第182位胺基酸的核苷酸由編碼甘胺酸的核苷酸置換為編碼天門冬胺酸的核苷酸、將編碼第268位胺基酸的核苷酸由編碼天門冬醯胺的核苷酸置換為編碼天門冬胺酸的核苷酸、將編碼第384位胺基酸的核苷酸由編碼組胺酸的核苷酸置換為編碼酪胺酸的核苷酸。

在本發明的一實施例中，上述對編碼胺基酸的核苷酸進行置換的方法包括：以如序列辨識號：6所示引子與如序列辨識號：7所示引子對編碼第182位之甘胺酸的核苷酸進行置換、以如序列辨識號：8所示引子與如序列辨識號：9所示引子對編碼第268位之天門冬醯胺的核苷酸進行置換、以及以如序列辨識號：10所示引子與如序列辨識號：11所示引子對編碼第384位之組胺酸的核苷酸進行置換。

在本發明的一實施例中，上述將編碼第182位之甘胺酸的核苷酸進行置換後，可得到包含如序列辨識號：2所示胺基酸序列之重組蛋白質。

在本發明的一實施例中，上述將編碼第182位之甘胺酸的核苷酸及編碼第268位之天門冬醯胺的核苷酸同時進行置換後，可得到包含如序列辨識號：3所示胺基酸序列之重組蛋白質。

在本發明的一實施例中，上述將編碼第182位之甘胺酸的核苷酸、編碼第268位之天門冬醯胺的核苷酸、以及編碼第384位之組胺酸的核苷酸同時進行置換後，可得到包含如序列辨識號：4所示胺基酸序列之重組蛋白質。

在本發明的一實施例中，上述質體的製備方法可包括：優化果糖基胺基酸氧化酶基因的密碼子，以獲得如序列辨識號：5所示之多核苷酸；以及建構如序列辨識號：5所示之多核苷酸建構至載體中，以獲得編碼序列辨識號：1所示胺基酸序列的質體。

在本發明的一實施例中，上述果糖基胺基酸氧化酶的基因可從小麥枯草菌中選取。

本發明另提供一種編碼如上述重組蛋白質的多核苷酸。

本發明另提供一種重組載體，包括如上述多核苷酸。

本發明另提供一種轉化體，其是將如上述的重組載體轉化至宿主細胞中而得。

本發明另提供一種用於檢測糖化血色素的檢測試劑盒，其包括如上述的重組蛋白質。

基於上述，本發明提供一種重組蛋白質及其製備方法，其是將序列辨識號：1所示的胺基酸序列的第182位、第268位及第384位的胺基酸中的至少一個胺基酸進行置換而得的重組蛋白質。此外，相較於野生型的果糖基胺基酸氧化酶，此重組蛋白質具有較高的熱穩定性與基質特異性。另外，相較於市面上檢測糖化血色素的檢測試劑盒，本發明所提供的檢測試劑盒由於包含上述的重組蛋白質，而具有可精準定量糖化血色素以及長期穩定保存的優點。

為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。

圖1為本發明一實施例的重組蛋白質的製備方法的流程圖。請參照圖1，首先，如步驟S100，可對果糖基胺基酸氧化酶的基因進行密碼子優化（codon optimization），以獲得如序列辨識號：5所示之多核苷酸。上述果糖基胺基酸氧化酶的基因可選取自細菌、酵母菌或真菌，例如是從小麥枯草菌屬(Phaeosphaeria nodorum )中選取，但不限於此，尚可選取自曲霉屬(Aspergillus )、青黴屬(Penicillium )、鐮孢屬(Fusarium )、畢赤酵母屬(Pichia )、錐毛殼屬(Coniochaeta )、正青黴屬(Eupencillum )、棒桿菌屬(Corynebacterium )等。在一實施例中，上述果糖基胺基酸氧化酶的基因可從小麥枯草菌（Phaeosphaeria nodorum ）中選取。其中，進行密碼子優化的方式為對密碼子中的核苷酸進行調整，例如將GGT調整為GGC，以使得調整後的密碼子適於在新的宿主細胞中被利用且能大量表現出胺基酸，並使得此胺基酸與調整前的密碼子所表現出的胺基酸相同。

上述果糖基胺基酸氧化酶又可稱為果糖基纈胺酸氧化酶(fructosyl valine oxidase)、果糖基胜肽氧化酶(fructosyl peptide oxidase, FPOX)、阿馬道裡酶(amadoriase)或酮氨氧化酶(ketoamine oxidase)等。

接著，如步驟S110，可將序列辨識號：5所示之多核苷酸建構至載體中，以獲得編碼序列辨識號：1所示胺基酸序列的質體。

之後，如步驟S120，將質體中編碼序列辨識號：1所示胺基酸序列的核苷酸序列進行置換，上述置換可包括由下列置換所組成之群組中的至少一者：將編碼第182位胺基酸的核苷酸置換為編碼天門冬胺酸的核苷酸、將編碼第268位胺基酸的核苷酸置換為編碼天門冬胺酸的核苷酸、以及將編碼第384位胺基酸的核苷酸置換為編碼酪胺酸的核苷酸。

詳細而言，上述置換可包括由下列置換所組成之群組中的至少一者：將編碼第182位胺基酸的核苷酸由編碼甘胺酸的核苷酸置換為編碼天門冬胺酸的核苷酸、將編碼第268位胺基酸的核苷酸由編碼天門冬醯胺的核苷酸置換為編碼天門冬胺酸的核苷酸、以及將編碼第384位胺基酸的核苷酸由編碼組胺酸的核苷酸置換為編碼酪胺酸的核苷酸。

更具體而言，對上述胺基酸進行置換的方法可包括：以如序列辨識號：6所示引子與如序列辨識號：7所示引子對編碼第182位之甘胺酸的核苷酸進行置換、以如序列辨識號：8所示引子與如序列辨識號：9所示引子對編碼第268位之天門冬醯胺的核苷酸進行置換、以及以如序列辨識號：10所示引子與如序列辨識號：11所示引子對編碼第384位之組胺酸的核苷酸進行置換。

接著，如步驟S130，可將上述進行置換後的質體轉化至宿主細胞中，以得到轉化體（transformant）。

之後，如步驟S140，可利用轉化體表現出重組蛋白質。前述重組蛋白質可包括一胜肽，此胜肽可包括對序列辨識號：1所示序列進行置換後的胺基酸序列。上述置換可包括由下列置換所組成之群組中的至少一者：序列辨識號：1之第182位胺基酸被置換為天門冬胺酸（Asp）、序列辨識號：1之第268位胺基酸被置換為天門冬胺酸（Asp）、以及序列辨識號：1之第384位胺基酸被置換為酪胺酸（Tyr）。

詳細而言，上述置換可包括由下列置換所組成之群組中的至少一者：序列辨識號：1之第182位胺基酸由甘胺酸（Gly）置換為天門冬胺酸（Asp）(Gly182Asp)、序列辨識號：1之第268位胺基酸由天門冬醯胺（Asn）置換為天門冬胺酸（Asp）(Asn268Asp)、以及序列辨識號：1之第384位胺基酸由組胺酸（His）置換為酪胺酸（Tyr）(His384Tyr)。

在一實施例中，執行如上述製備方法之步驟S100至S140可獲得一重組蛋白質，如下進一步說明此重組蛋白質。

在一實施例中，此重組蛋白質包括一胜肽，此胜肽包括對序列辨識號：1之序列進行置換後的胺基酸序列。前述置換可以是將序列辨識號：1所示胺基酸序列之第182位的甘胺酸、第268位的天門冬醯胺、以及第384位的組胺酸三者之中的至少一者進行置換。在一實施例中，此置換可以是將序列辨識號：1之第182位的甘胺酸置換為天門冬胺酸。在另一實施例中，此置換可以是將序列辨識號：1之第268位的天門冬醯胺置換為天門冬胺酸。在又一實施例中，此置換可以是將序列辨識號：1之第384位的組胺酸置換為酪胺酸。

在一實施例中，上述序列辨識號：1所示的胺基酸序列以及編碼此序列辨識號：1所示胺基酸序列之多核苷酸可選自於小麥枯草菌。

詳細言之，在一實施例中，可將序列辨識號：1所示胺基酸序列之第182位的甘胺酸進行置換以得到包含如序列辨識號：2所示胺基酸序列的重組蛋白質。在另一實施例中，可將序列辨識號：1所示胺基酸序列之第182位的甘胺酸及第268位的天門冬醯胺同時進行置換，以得到包含如序列辨識號：3所示胺基酸序列的重組蛋白質。在又一實施例中，可將序列辨識號：1所示胺基酸序列之第182位的甘胺酸、第268位的天門冬醯胺、以及第384位的組胺酸同時進行置換，以得到包含如序列辨識號：4所示胺基酸序列的重組蛋白質。

在一實施例中，上述重組蛋白質可為果糖基胺基酸氧化酶，具有對F-K、F-V及F-VH的氧化酶活性，因而適用於檢測糖化血色素。在另一實施例中，相較於野生型的果糖基胺基酸氧化酶，上述包含如序列辨識號：4所示胺基酸序列的重組蛋白質可對F-K具有較低的基質特異性，但對F-V與F-VH具有較高的基質特異性。

此外，在其他實施例中，更提供了多核苷酸、重組載體、轉化體與檢測試劑盒。上述多核苷酸可為編碼如上述重組蛋白質的多核苷酸，且其中，上述多核苷酸可為包含如序列辨識號：5所示核苷酸序列之多核苷酸。上述重組載體可包括如上述之多核苷酸。上述轉化體可藉由將上述重組載體轉化至宿主細胞中而得。上述檢測試劑盒可適用於檢測糖化血色素，且包括上述重組蛋白質。

實驗

實驗 1 ： 合成果糖基胺基酸氧化酶基因

首先，由美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的基因組數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中，選取預測可在小麥枯草菌中編碼為果糖基胺基酸氧化酶的基因，例如是編碼FAD依賴型氧化還原酶(FAD-dependent oxidoreductase)的基因，其結果相當於NCBI accession No. XM_001798659.1 (NCBI登錄號XM_001798659.1)所示的mRNA。

接著，針對上述mRNA所對應的cDNA，於其兩端設計複製所需的剪接位點，並將其密碼子優化為適合於宿主細胞中表現的密碼子，例如是將密碼子優化為適合於大腸桿菌中表現，爾後進行全基因合成（whole-genome synthesis）。

之後，將上述合成基因複製到載體中，例如是pUC57(Genescript)的EcoRV位點，並對複製到載體pUC57中的cDNA部分進行序列分析，獲得如序列辨識號：5所示的多核苷酸。也就是說，上述合成基因的cDNA部分為序列辨識號：5所示的多核苷酸。序列辨識號：5所示多核苷酸中的cDNA編碼區域是第1號核苷酸到第1314號核苷酸，其中起始密碼子相當於第1號核苷酸到第3號核苷酸，而終止密碼子TAG相當於第1312號核苷酸到第1314號核苷酸。

實驗 2 ：製備 包含有 果糖基胺基酸氧化酶基因的質體

利用選殖(cloning)的方法將序列辨識號：5所示的多核苷酸建構至載體中，前述載體例如是pQE-30 (Qiagen)，但本發明不以此為限。

具體而言，利用全基因合成時於N端導入之NcoI酶切位點，以及C端終止密碼子之後的SacI酶切位點，以T4 DNA 連接酶將序列辨識號：5所示的多核苷酸複製到載體pQE-30的NcoI-SacI位點，以獲得可表現序列辨識號：1所示胺基酸序列的質體pYC1。

實驗 3 ：對 果糖基胺基酸氧化酶進行定點突變（ Site-directed Mutagenesis ）

上述定點突變係指對FAOD之其中一個胺基酸殘基進行置換，例如是對序列辨識號：1所示胺基酸序列之第182位的甘胺酸(glycine)進行置換，以得到單一突變(single mutant)的果糖基胺基酸氧化酶。詳言之，例如是將第182位的甘胺酸置換為天門冬胺酸(aspartic acid)。而對胺基酸進行置換的方法例如為使用定點突變試劑盒(QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit) (Agilent)，但本發明不以此為限。

具體而言，可編碼序列辨識號：1所示胺基酸序列之多核苷酸為序列辨識號：5，因此，在一實施例中，先於序列辨識號：5所示之多核苷酸中，找出可編碼序列辨識號：1所示胺基酸序列之第182位的甘胺酸的核苷酸為ggc。同時，合成序列辨識號：6所示引子與序列辨識號：7所示引子，此二引子皆具有核苷酸gac。接著，利用序列辨識號：6所示引子與序列辨識號：7所示引子對質體pYC1進行聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction, PCR)，以得到重組質體(recombinant plasmid)。於此重組質體中，編碼第182位甘胺酸的核苷酸ggc已被置換為編碼天門冬胺酸的核苷酸gac。

接著，利用One Shot® Mach1™-T1R(Invitrogen)將此重組質體進行轉化，並挑取10個表現出具有氨芐青黴素抗性(ampicillin resistance)的菌落(colony)，且對轉化至10個菌落中的10個重組質體的核苷酸序列進行定序，以確認是否成功導入重組質體，進而獲得可表現序列辨識號：2所示胺基酸序列的質體pHL35。

實驗 4 ：對 果糖基胺基酸氧化酶進行多點突變

上述多點突變係指對FAOD之其中二個胺基酸殘基進行置換，例如是對序列辨識號：1所示胺基酸序列之第182位的甘胺酸及第268位的天門冬醯胺(asparagine)進行置換，以得到雙重突變(double mutant)的果糖基胺基酸氧化酶。詳言之，例如是同時將第182位的甘胺酸置換為天門冬胺酸，且將第268位的天門冬醯胺置換為天門冬胺酸。而對胺基酸進行置換的方法則如同上述，於此不再贅述。

具體而言，先於序列辨識號：5所示之多核苷酸中，找出可編碼序列辨識號：1所示胺基酸序列之第268位天門冬醯胺的核苷酸為aac。同時，合成序列辨識號：8所示引子與序列辨識號：9所示引子，此二引子皆具有核苷酸gac。接著，由於質體pHL35中編碼第182位胺基酸的核苷酸已被置換為編碼天門冬胺酸的核苷酸gac，於是利用序列辨識號：8所示引子與序列辨識號：9所示引子繼續對質體pHL35進行聚合酶連鎖反應，以將質體pHL35中編碼第268位天門冬醯胺的核苷酸aac置換為編碼天門冬胺酸的核苷酸gac，進而獲得可表現序列辨識號：3所示胺基酸序列的質體pHL43。

實驗 5 ：對 果糖基胺基酸氧化酶的進行多點突變

上述多點突變係指對FAOD之其中三個胺基酸殘基進行置換，例如是對序列辨識號：1所示胺基酸序列之第182位的甘胺酸、第268位的天門冬醯胺及第384位的組胺酸(histidine)進行置換，以得到三重突變(triple mutant)的果糖基胺基酸氧化酶。詳言之，例如同時將第182位的甘胺酸置換為天門冬胺酸、將第268位的天門冬醯胺置換為天門冬胺酸、且將第384位的組胺酸置換為酪胺酸(tyrosine)。而對胺基酸進行置換的方法則如同上述，於此不再贅述。

具體而言，先於序列辨識號：5所示之多核苷酸中，找出可編碼序列辨識號：1所示胺基酸序列之第384位組胺酸的核苷酸為cat。同時，合成序列辨識號：10所示引子與序列辨識號：11所示引子，此二引子皆具有核苷酸tat。接著，由於質體pHL43中編碼第182位胺基酸與第268位胺基酸的核苷酸皆已被置換為編碼天門冬胺酸的核苷酸gac，於是利用序列辨識號：10所示引子與序列辨識號：11所示引子繼續對質體pHL43進行聚合酶連鎖反應，以將質體pHL43中編碼第384位組胺酸的核苷酸cat置換為編碼酪胺酸的核苷酸tat，進而獲得可表現序列辨識號：4所示胺基酸序列的質體pHL37。

簡言之，質體pHL35可表現序列辨識號：2所示的胺基酸序列，其第182位胺基酸已被置換為天門冬胺酸。質體pHL43可表現序列辨識號：3所示的胺基酸序列，其第182位與第268位胺基酸皆已被置換為天門冬胺酸。質體pHL37可表現序列辨識號：4所示的胺基酸序列，其第182位與第268位胺基酸皆已被置換為天門冬胺酸，且其第384位胺基酸已被置換為酪胺酸。

實驗 6 ：果糖基胺基酸氧化酶的大量表達與純化

首先，將質體pYC1以及上述進行胺基酸殘基置換後的質體pHL35、pHL43、pHL37分別轉化至宿主細胞中，以得到具有胺芐青黴素耐性的轉化體。前述宿主細胞可以是大腸桿菌，例如是BL21 Star™(DE3) (Chemically CompetentE. coli ) (Invitrogen)，但本發明不以此為限。

接著，製備轉化體培養用的培養基。先將500 mL的TB (Terrific Broth)培養基分注至容積2 L之錐形瓶中，並於121°C進行20分鐘高壓蒸汽滅菌。待培養基放置冷卻後，將經過無菌過濾之氨芐青黴素添加至培養基中，使氨芐青黴素之最終濃度為100 μg/mL。

之後，於上述TB培養基中接種2 ml預先於37°C培養16小時的BL21 Star™(DE3) (pYC1)的培養液，此培養液為含有100 μg/mL氨苄青黴素的LB (Lysogeny broth)培養基，並於37°C以225 rpm轉速進行搖晃培養，同時追蹤600 nm的吸光値(OD600或A600)。當吸光値達到0.6時，將溫度調降至20°C並加入異丙基-b-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)，使IPTG之最終濃度達為1 mM。

接著，繼續培養20小時。待結束培養後，藉由離心匯集菌體，並加入CelLytic™ B 2X Cell Lysis Reagent (Sigma)破菌液使菌體破碎，且對前述包含有已破碎菌體之懸浮液進行離心以分離取得上清液。接著，使用cOmplete^TM His-Tag Purification Resin (Roche)對所獲得的上清液進行純化以獲得純化的目標蛋白質，再利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)確認所純化之目標蛋白質確實是單一的蛋白質。

上述目標蛋白質例如為小麥枯草菌屬之果糖基胜肽氧化酶(PnFPOX)，意即果糖基胺基酸氧化酶，且所獲得的目標蛋白質即為上述的重組蛋白質，也就是將序列辨識號：1所示胺基酸序列之第182位的甘胺酸、第268位的天門冬醯胺及第384位的組胺酸三者之中的至少一者進行置換的蛋白質，而關於胺基酸的置換方式已於前文中進行說明，於此不再重複敘述。

於上述操作中，含有質體pYC1的轉化體可表現序列辨識號：1所示的胺基酸序列，也就是野生型的果糖基胺基酸氧化酶(簡稱PnFPOX)。含有質體pHL35的轉化體可表現序列辨識號：2所示的胺基酸序列，也就是果糖基胺基酸氧化酶之第182位胺基酸已被置換為天門冬胺酸的重組蛋白質(簡稱PnFPOX-SS)。含有質體pHL43的轉化體可表現序列辨識號：3所示的胺基酸序列，也就是果糖基胺基酸氧化酶之第182位胺基酸與第268位胺基酸皆已被置換為天門冬胺酸的重組蛋白質(簡稱PnFPOX-DS)。而含有質體pHL37的轉化體可表現序列辨識號：4所示的胺基酸序列，也就是果糖基胺基酸氧化酶之第182位胺基酸與第268位胺基酸皆已被置換為天門冬胺酸，且第384位胺基酸已被置換為酪胺酸的重組蛋白質(簡稱PnFPOX-TS)。

實驗 7 ：果糖基胺基酸 氧化酶之 活性、基質特異性及熱穩定性的評估

檢測上述重組蛋白質(PnFPOX-SS、PnFPOX-DS、PnFPOX-TS)的氧化酶活性、基質特異性以及熱穩定性，並與野生型的果糖基胺基酸氧化酶(PnFPOX)以及其他物種的果糖基胺基酸氧化酶(簡稱FPOX-CE)(龜甲萬公司(Kikkoman Corporation)製造)進行比較。

氧化酶活性評估

對基質的氧化酶活性是利用氧化酶與基質反應後產生過氧化氫，過氧化氫和呈色劑再經由過氧化氫酶催化產生顏色變化，接著只需檢測呈色劑在特定波長的吸光度變化，便可計算得知氧化酶活性。

具體說明氧化酶活性之檢測方式如下：首先，參考Hirokawa等人於2003年發表在Biochmical and Biophysical Research Communications期刊之文獻（卷號311，頁數104-111）來配製活性測定溶液，即，pH值8.0的10 mM磷酸鉀緩衝溶液中含有5 mg/L過氧化氫酶(TOYOBO)、100 mg/L 4-Aminoantipyrine (Sigma)和0.167g/L TOOS (Sigma)。接著進行測定，首先將145 μl活性測定溶液於37°C加熱30分鐘，接著添加5 μl已預先以酶稀釋液(含有0.15% BSA的10 mM磷酸鉀緩衝液(pH值8.0))進行稀釋的酶溶液於此活性測定試劑中以進行反應。於37°C反應5分鐘後，即測定OD555於單位時間內的吸光度變化(ΔOD實驗/min)。同時，以5 μl酶稀釋液代替酶溶液，進行如同上述的操作並測定吸光度的變化(Δ OD空白/min)以作為空白測試(blank)。

以於1分鐘內可使1微摩爾(μmole)的基質氧化的酶量規定為1單位(U)，並根據下述算式，由所得吸光度變化來計算氧化酶的活性。氧化酶之活性值(U/ml) = { (ΔOD實驗/min -ΔOD空白/min)X 150 (μl) X 稀釋倍率} / {4.5 X 5 (μl) }。於上述算式中，“150 μl”表示檢測溶液的總液量，“4.5”表示毫摩爾的吸光係數，“5 μl”表示氧化酶樣本的液量。

接著，測定FPOX-CE、PnFPOX、PnFPOX-SS、PnFPOX-DS、及PnFPOX-TS對不同的基質的氧化酶活性。所檢測的基質包括：果糖基賴胺酸(F-K)、果糖基纈胺酸(F-V)、果糖基纈胺醯基組胺酸(F-VH)。不同重組蛋白質之氧化酶活性的檢測結果如表1所示。

表1：不同重組蛋白質之氧化酶活性比對(氧化酶活性值(單位U/mg))

依據表1所示結果可知，相較於其他物種的果糖基胺基酸氧化酶(FPOX-CE)，野生型的果糖基胺基酸氧化酶(PnFPOX)對果糖基賴胺酸(F-K)的氧化酶活性較低，而對果糖基纈胺酸(F-V)的氧化酶活性較高。而相較於野生型的果糖基胺基酸氧化酶(PnFPOX)，三重突變的果糖基胺基酸氧化酶(PnFPOX-TS)則對F-K的氧化酶活性較低，然對果糖基纈胺酸(F-V)與果糖基纈胺醯基組胺酸(F-VH)的氧化酶活性較高。

基質特異性評估

根據上述氧化酶活性的測定結果，並利用以下算式所計算的活性比值來代表FPOX-CE、PnFPOX、PnFPOX-SS、PnFPOX-DS、PnFPOX-TS對不同基質的基質特異性。其中，(F-K/F-V) = (以F-K作為基質時的氧化酶活性值) / (以F-V作為基質時的氧化酶活性值)，而由此算式所計算的活性比值越小，則表示此蛋白質對F-V的基質特異性較高。(F-K/F-VH) = (以F-K作為基質時的氧化酶活性值) / (以F-VH作為基質時的氧化酶活性值)，而由此算式所計算的活性比值越小，則表示此蛋白質對F-VH的基質特異性較高。不同重組蛋白質之基質特異性的分析結果如表2所示。

表2：不同重組蛋白質之基質特異性比對

依據表2所示結果可知，相較於其他物種的果糖基胺基酸氧化酶(FPOX-CE)，野生型的果糖基胺基酸氧化酶(PnFPOX)的F-K/F-V與F-K/F-VH的活性比值較小，顯示PnFPOX對F-V與F-VH的基質特異性較高。而，三重突變的果糖基胺基酸氧化酶(PnFPOX-TS)的F-K/F-V與F-K/F-VH的活性比值皆遠小於其他物種的果糖基胺基酸氧化酶(FPOX-CE)，顯示PnFPOX-TS對F-V與F-VH的基質特異性遠高於FPOX-CE，且相差約20倍以上。

換言之，以基質特異性而言，其他物種的果糖基胺基酸氧化酶(FPOX-CE)雖具有較為廣泛的基質活性，然其基質特異性較差，相對於此，野生型的果糖基胺基酸氧化酶(PnFPOX)、單一突變的果糖基胺基酸氧化酶(PnFPOX-SS)、雙重突變的果糖基胺基酸氧化酶(PnFPOX-DS)以及三重突變的果糖基胺基酸氧化酶(PnFPOX-TS)對於基質特異性的改善都有良好的效果，並以PnFPOX-TS的改善效果最佳。

熱穩定性評估

將其他物種的果糖基胺基酸氧化酶(FPOX-CE)、野生型的果糖基胺基酸氧化酶(PnFPOX)、以及上述重組蛋白質(PnFPOX-SS、PnFPOX-DS、PnFPOX-TS)分別溶於100 mM磷酸鉀緩衝液(pH值8.0)中，使其濃度達到0.05 mg/ml，並於25~60 °C進行10分鐘加熱處理後，測定其氧化酶活性。同時，根據以下算式來計算熱穩定性(%)：熱穩定性=(熱處理後的氧化酶活性值) / (未進行熱處理的氧化酶活性) x 100%。

表3：不同重組蛋白質之熱穩定性比對

依據表3所示結果可知，相較於其他物種的果糖基胺基酸氧化酶(FPOX-CE)與野生型的果糖基胺基酸氧化酶(PnFPOX)，進行定點突變或多點突變的果糖基胺基酸氧化酶，無論是單一、雙重、或者是三重突變的果糖基胺基酸氧化酶(PnFPOX-SS、PnFPOX-DS、PnFPOX-TS)，於50℃熱處理後皆仍具有至少95%的氧化酶活性。而當熱處理的溫度提高至55℃時，FPOX-CE和PnFPOX的氧化酶活性均已降至低於10%，此時PnFPOX-DS和PnFPOX-TS的氧化酶活性仍分別有67%和33%。換言之，相較於其他物種及野生型的果糖基胺基酸氧化酶(FPOX-CE 與PnFPOX)，進行定點突變或多點突變後的果糖基胺基酸氧化酶(PnFPOX-SS、PnFPOX-DS、PnFPOX-TS)可具有較高的熱穩定性。

綜上所述，本發明提供一種重組蛋白質及其製備方法，其是將序列辨識號：1所示胺基酸序列的第182位、第268位及第384位的胺基酸中的至少一個胺基酸進行置換而得的重組蛋白質。此外，相較於野生型的果糖基胺基酸氧化酶，此重組蛋白質具有較高的熱穩定性與基質特異性。並且，相較於市面上檢測糖化血色素的檢測試劑盒，本發明所提供的檢測試劑盒中含有上述的重組蛋白質，具有可精準定量糖化血色素且能長期穩定保存的優點。

雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

S100、S110、S120、S130、S140‧‧‧步驟

第1圖為本揭露之一實施例的重組蛋白質的製備流程。

＜110＞財團法人工業技術研究院＜120＞重組蛋白質及其製造方法與應用＜130＞ 66204-TW-PA ＜150＞ US 62/433,733 ＜151＞ 2016-12-13 ＜160＞ 11 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 437 ＜212＞ PRT ＜213＞Phaeosphaeria nodorum ＜400＞ 1 Met Ala Pro Ser Arg Ala Asn Thr Ser Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Thr Pro Ser Asn Val Thr Val Leu Asp Ala Tyr Pro Ile Pro Ser Ser 35 40 45 Gln Ser Ala Gly Asn Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Val Ser Leu Arg 50 55 60 Asn Pro Val Asp Leu Gln Leu Ala Leu Glu Ala Arg Gln Met Trp Asn 65 70 75 80 Glu Asp Glu Leu Phe Lys Lys Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Leu Asp 85 90 95 Cys Ala His Gly Glu Lys Asp Ile Ala Asp Leu Lys Ser Gly Tyr Gln 100 105 110 Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu Asp Ala Thr Asn Glu Trp Leu Asp Ser 115 120 125 Glu Asp Glu Ile Leu Lys Arg Met Pro Leu Leu Ser Arg Asp Gln Ile 130 135 140 Lys Gly Trp Lys Ala Ile Phe Ser Lys Asp Gly Gly Trp Leu Ala Ala 145 150 155 160 Ala Lys Ala Ile Asn Ala Val Gly Glu Tyr Leu Arg Asp Gln Gly 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(1146)..(1146) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1155)..(1155) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1158)..(1158) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1164)..(1164) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1167)..(1167) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1173)..(1173) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1176)..(1176) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1179)..(1179) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1182)..(1182) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1191)..(1191) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1194)..(1194) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1200)..(1200) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1206)..(1206) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1212)..(1212) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1215)..(1215) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1218)..(1218) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1221)..(1221) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1224)..(1224) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1230)..(1230) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1233)..(1233) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1239)..(1239) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1242)..(1242) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1245)..(1245) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1248)..(1248) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1251)..(1251) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1254)..(1254) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1257)..(1257) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1266)..(1266) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1269)..(1269) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1278)..(1278) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1281)..(1281) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1299)..(1299) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1302)..(1302) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜220＞＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1305)..(1305) ＜223＞ n=a或g或c或t ＜400＞ 5 atggcnccnw snmgngcnaa yacnwsngtn athgtngtng gnggnggngg nacnathggn 60 wsnwsnacng cnytncayyt ngtnmgnwsn ggntayacnc cnwsnaaygt nacngtnytn 120 gaygcntayc cnathccnws nwsncarwsn gcnggnaayg ayytnaayaa rathatgggn 180 gtnwsnytnm gnaayccngt ngayytncar ytngcnytng argcnmgnca ratgtggaay 240 gargaygary tnttyaaraa rttyttycay aayacnggnm gnytngaytg ygcncayggn 300 garaargaya thgcngayyt naarwsnggn taycargcny tngtngaygc nggnytngay 360 gcnacnaayg artggytnga ywsngargay garathytna armgnatgcc nytnytnwsn 420 mgngaycara thaarggntg gaargcnath ttywsnaarg ayggnggntg gytngcngcn 480 gcnaargcna thaaygcngt nggngartay ytnmgngayc arggngtnmg nttyggntty 540 tayggngcng gnwsnttyaa rgcnccnytn ytngcngarg gngtntgyat hggngtngar 600 acngtngayg gnacnmgnta ytaygcngay aargtngtny tngcngcngg ngcntggwsn 660 ccnacnytng tngarytnca ygarcartgy gtnwsnaarg cntgggtnta yggncayath 720 carytnacnc cngargargc ngcnmgntay aaraaywsnc cngtngtnta yaayggngay 780 gtnggnttyt tyttygarcc naaygarcay ggngtnatha argtntgyga ygarttyccn 840 ggnttyacnm gnttyaarat gcaycarccn ttyggngcna argcnccnaa rmgnathwsn 900 gtnccnmgnw sncaygcnaa rcayccnacn gayacnathc cngaygcnws ngaygtnwsn 960 athmgnmgng cnathgcnac nttyatgccn carttyaara ayaaraarat gttyaaycar 1020 gcnatgtgyt ggtgyacnga yacngcngay gcngcnytny tnathtgyga rcayccngar 1080 tggaaraayt tygtnytngc nacnggngay wsnggncayw snttyaaryt nytnccnaay 1140 athggnaarc aygtngtnga rytnytngar ggnacnytng cngaygayyt ngcncaygcn 1200 tggmgntggm gnccnggnws nggngaygcn ytnaarwsnm gnmgnwsngc nccngcnaar 1260 gayytngcng ayatgccngg ntggaaycay gayaarccnm gngcnaayyt ntag 1314 ＜210＞ 6 ＜211＞ 35 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子，用於對序列辨識號：1中編碼第182位之甘胺酸的核苷酸進行置換＜400＞6 gtgtacgttt cggtttctat gacgcgggct ctttc 35 ＜210＞ 7 ＜211＞ 35 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子，用於對序列辨識號：1中編碼第182位之甘胺酸的核苷酸進行置換＜400＞7 gaaagagccc gcgtcataga aaccgaaacg tacac 35 ＜210＞ 8 ＜211＞ 29 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子，用於對序列辨識號：1中編碼第268位之天門冬醯胺的核苷酸進行置換＜400＞8 ttttcttcga gccggacgag cacggcgtg 29 ＜210＞ 9 ＜211＞ 29 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子，用於對序列辨識號：1中編碼第268位之天門冬醯胺的核苷酸進行置換＜400＞9 cacgccgtgc tcgtccggct cgaagaaaa 29 ＜210＞ 10 ＜211＞ 37 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子，用於對序列辨識號：1中編碼第384位之組胺酸的核苷酸進行置換＜400＞10 ctgccaaata ttggcaagta tgttgttgaa ctgctgg 37 ＜210＞11 ＜211＞ 37 ＜212＞ DNA ＜213＞人工序列＜220＞＜223＞引子，用於對序列辨識號：1中編碼第384位之組胺酸的核苷酸進行置換＜400＞11 ccagcagttc aacaacatac ttgccaatat ttggcag 37

Claims

一種重組蛋白質，包括：胜肽，其中所述胜肽包括對序列辨識號：1之序列進行置換後的胺基酸序列，而所述置換包括由下列置換所組成之群組中的至少一者：所述序列辨識號：1之第182位的胺基酸被置換為天門冬胺酸（Asp）；所述序列辨識號：1之第268位的胺基酸被置換為天門冬胺酸（Asp）；以及所述序列辨識號：1之第384位的胺基酸被置換為酪胺酸（Tyr）。
如申請專利範圍第1項所述的重組蛋白質，其中所述置換包括由下列置換所組成之群組中的至少一者：所述序列辨識號：1之第182位胺基酸由甘胺酸（Gly）置換為天門冬胺酸（Asp）(Gly182Asp)；所述序列辨識號：1之第268位胺基酸由天門冬醯胺（Asn）置換為天門冬胺酸（Asp）(Asn268Asp)；以及所述序列辨識號：1之第384位胺基酸由組胺酸（His）置換為酪胺酸（Tyr）(His384Tyr)。
如申請專利範圍第1項所述的重組蛋白質，其中所述胜肽的胺基酸序列包括序列辨識號：2之序列。
如申請專利範圍第1項所述的重組蛋白質，其中所述胜肽的胺基酸序列包括序列辨識號：3之序列。
如申請專利範圍第1項所述的重組蛋白質，其中所述胜肽的胺基酸序列包括序列辨識號：4之序列。
如申請專利範圍第1項所述的重組蛋白質，其中所述序列辨識號：1之胺基酸序列以及編碼所述序列辨識號：1之多核苷酸選自於小麥枯草菌。
一種重組蛋白質的製備方法，包括：將質體中編碼序列辨識號：1之胺基酸序列的核苷酸序列進行置換，其中，所述置換包括由下列置換所組成之群組中的至少一者：將編碼第182位胺基酸的核苷酸置換為編碼天門冬胺酸的核苷酸；將編碼第268位胺基酸的核苷酸置換為編碼天門冬胺酸的核苷酸；以及將編碼第384位胺基酸的核苷酸置換為編碼酪胺酸的核苷酸；將進行置換後的所述質體轉化至宿主細胞中以得到轉化體；以及利用所述轉化體表現出所述重組蛋白質。
如申請專利範圍第7項所述的重組蛋白質的製備方法，其中所述置換包括由下列置換所組成之群組中的至少一者：將編碼所述第182位胺基酸的核苷酸由編碼甘胺酸的核苷酸置換為編碼天門冬胺酸的核苷酸；將編碼所述第268位胺基酸的核苷酸由編碼天門冬醯胺的核苷酸置換為編碼天門冬胺酸的核苷酸；以及將編碼所述第384位胺基酸的核苷酸由編碼組胺酸的核苷酸置換為編碼酪胺酸的核苷酸。
如申請專利範圍第8項所述的重組蛋白質的製備方法，其中對編碼所述胺基酸的核苷酸進行置換的方法包括：以如序列辨識號：6所示引子與如序列辨識號：7所示引子對編碼所述第182位之甘胺酸的核苷酸進行置換；以如序列辨識號：8所示引子與如序列辨識號：9所示引子對編碼所述第268位之天門冬醯胺的核苷酸進行置換；以及以如序列辨識號：10所示引子與如序列辨識號：11所示引子對編碼所述第384位之組胺酸的核苷酸進行置換。
如申請專利範圍第8項所述的重組蛋白質的製備方法，其中將編碼所述第182位之甘胺酸的核苷酸進行置換以得到包含如序列辨識號：2所示胺基酸序列之所述重組蛋白質。
如申請專利範圍第8項所述的重組蛋白質的製備方法，其中將編碼所述第182位之甘胺酸的核苷酸及編碼所述第268位之天門冬醯胺的核苷酸同時進行置換以得到包含如序列辨識號：3所示胺基酸序列之所述重組蛋白質。
如申請專利範圍第8項所述的重組蛋白質的製備方法，其中將編碼所述第182位之甘胺酸的核苷酸、編碼所述第268位之天門冬醯胺的核苷酸、以及編碼所述第384位之組胺酸的核苷酸同時進行置換以得到包含如序列辨識號：4所示胺基酸序列之所述重組蛋白質。
如申請專利範圍第7項所述的重組蛋白質的製備方法，其中所述質體的製備方法包括：優化果糖基胺基酸氧化酶基因的密碼子，以獲得如序列辨識號：5所示之多核苷酸；以及建構如所述序列辨識號：5所示之多核苷酸至載體中，以獲得編碼所述序列辨識號：1所示胺基酸序列的所述質體。
如申請專利範圍第13項所述的重組蛋白質的製備方法，其中所述果糖基胺基酸氧化酶的基因是從小麥枯草菌中選取。
一種編碼如申請專利範圍第1項所述的重組蛋白質的多核苷酸。
一種重組載體，包括如申請專利範圍第15項所述的多核苷酸。
一種轉化體，其是將如申請專利範圍第16項所述的重組載體轉化至宿主細胞中而得。
一種用於檢測糖化血色素的檢測試劑盒，包括如申請專利範圍第1項所述的重組蛋白質。