CN108220263A - 重组蛋白质及其制造方法与应用 - Google Patents

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Abstract

一种重组蛋白质及其制造方法与应用。重组蛋白质包括肽，且此肽包括对序列辨识号：1的序列进行置换后的氨基酸序列，而所指置换包括由下列置换所组成的群组的至少一者：所述序列辨识号：1的第182位的氨基酸被置换为天门冬氨酸(Asp)；所述序列辨识号：1的第268位的氨基酸被置换为天门冬氨酸(Asp)；以及所述序列辨识号：1的第384位的氨基酸被置换为酪氨酸(Tyr)。上述重组蛋白质可适用于检测糖化血红蛋白。上述重组蛋白质可具有较高的热稳定性与基质特异性。

Description

重组蛋白质及其制造方法与应用
技术领域
本发明是关于一种重组蛋白质及其制造方法与应用，特别是关于一种适用于检测糖化血红蛋白的重组蛋白质。
背景技术
对糖尿病患者而言，血糖的治疗或控制效果的评估是以糖化血红蛋白(hemoglobin A1c,HbA1c)作为最佳的检测标的，且以酶法(酵素法，Enzyme method)作为常规的临床检测方法。酶法的检测原理是以果糖基氨基酸氧化酶(fructosyl amino acidoxidase,FAOD)的糖解作用作为基础，其中以FAOD作为主要反应酶，而以果糖基缬氨酸(fructosyl valine,F-V)与果糖基缬氨酰基组氨酸(fructosyl valyl histidine,F-VH)作为反应基质，藉以进行糖化血红蛋白的测定。
因此，在利用酶法所进行的糖化血红蛋白检测中，作为主要反应酶的果糖基氨基酸氧化酶的基质特异性(substrate specificity)成为关键因素。然而，在糖化血红蛋白被蛋白酶水解的过程中，除了产生F-V与F-VH之外，也会相对产生大量的果糖基赖氨酸(fructosyl lysine,F-K)，而目前市场上所提供的FAOD对于F-K仍具有一定的亲和性(affinity)，导致糖化血红蛋白的检测受到干扰。
此外，目前市面上用以检测糖化血红蛋白的检测试剂盒中，其果糖基氨基酸氧化酶的热稳定性并不理想，多在试剂盒中添加大量稳定剂来提高稳定性，然而诊断试剂需要一定的保存时间，因而对稳定性有较高的要求，且所加入的稳定剂常导致试剂粘度提高而影响后续的检测。
因此，目前亟需一种具有高基质特异性及热稳定性的果糖基氨基酸氧化酶，以达到既可精准定量糖化血红蛋白并能长期稳定保存的目的。
发明内容
本发明提供一种重组蛋白质，可具有较高的热稳定性与基质特异性。
本发明另提供一种重组蛋白质的制备方法，以制备上述的重组蛋白质。
本发明另提供一种用于检测糖化血红蛋白的检测试剂盒，具有可精准定量糖化血红蛋白以及长期稳定保存的优点。
本发明提供一种重组蛋白质，其包括肽。此肽包括对序列辨识号：1的序列进行置换(substitution)后的氨基酸序列。前述置换可包括由下列置换所组成的群组中的至少一者：序列辨识号：1的第182位的氨基酸被置换为天门冬氨酸(Asp)、序列辨识号：1的第268位的氨基酸被置换为天门冬氨酸(Asp)、以及序列辨识号：1的第384位的氨基酸被置换为酪氨酸(Tyr)。
在本发明的一实施例中，上述置换可包括由下列置换所组成的群组中的至少一者：序列辨识号：1的第182位的氨基酸由甘氨酸(Gly)置换为天门冬氨酸(Asp)(Gly182Asp)、序列辨识号：1的第268位的氨基酸由天门冬酰胺(Asn)置换为天门冬氨酸(Asp)(Asn268Asp)、以及序列辨识号：1的第384位的氨基酸由组氨酸(His)置换为酪氨酸(Tyr)(His384Tyr)。
在本发明的一实施例中，上述肽的氨基酸序列可包括序列辨识号：2的序列。
在本发明的一实施例中，上述肽的氨基酸序列可包括序列辨识号：3的序列。
在本发明的一实施例中，上述肽的氨基酸序列可包括序列辨识号：4的序列。
在本发明的一实施例中，上述序列辨识号：1的氨基酸序列以及编码此序列辨识号：1的多核苷酸(polynucleotide)可选自于小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)。
本发明另提供一种重组蛋白质的制备方法，包括将质粒(plasmid)中可编码序列辨识号：1的氨基酸序列的核苷酸(nucleotide)序列进行置换。置换包括由下列置换所组成的群组中的至少一者：将编码第182位氨基酸的核苷酸置换为编码天门冬氨酸的核苷酸，将编码第268位氨基酸的核苷酸置换为编码天门冬氨酸的核苷酸，以及将编码第384位氨基酸的核苷酸置换为编码酪氨酸的核苷酸。将进行置换后的质粒转化(transformation)至宿主细胞(host cell)中以得到转化体(transformant)，再利用此转化体表现出上述的重组蛋白质。
在本发明的一实施例中，上述置换包括由下列置换所组成的群组中的至少一者：将编码第182位氨基酸的核苷酸由编码甘氨酸的核苷酸置换为编码天门冬氨酸的核苷酸、将编码第268位氨基酸的核苷酸由编码天门冬酰胺的核苷酸置换为编码天门冬氨酸的核苷酸、将编码第384位氨基酸的核苷酸由编码组氨酸的核苷酸置换为编码酪氨酸的核苷酸。
在本发明的一实施例中，上述对编码氨基酸的核苷酸进行置换的方法包括：以如序列辨识号：6所示引物与如序列辨识号：7所示引物对编码第182位的甘氨酸的核苷酸进行置换、以如序列辨识号：8所示引物与如序列辨识号：9所示引物对编码第268位的天门冬酰胺的核苷酸进行置换、以及以如序列辨识号：10所示引物与如序列辨识号：11所示引物对编码第384位的组氨酸的核苷酸进行置换。
在本发明的一实施例中，上述将编码第182位的甘氨酸的核苷酸进行置换后，可得到包含如序列辨识号：2所示氨基酸序列的重组蛋白质。
在本发明的一实施例中，上述将编码第182位的甘氨酸的核苷酸及编码第268位的天门冬酰胺的核苷酸同时进行置换后，可得到包含如序列辨识号：3所示氨基酸序列的重组蛋白质。
在本发明的一实施例中，上述将编码第182位的甘氨酸的核苷酸、编码第268位的天门冬酰胺的核苷酸、以及编码第384位的组氨酸的核苷酸同时进行置换后，可得到包含如序列辨识号：4所示氨基酸序列的重组蛋白质。
在本发明的一实施例中，上述质粒的制备方法可包括：优化果糖基氨基酸氧化酶基因的密码子，以获得如序列辨识号：5所示的多核苷酸；以及建构如序列辨识号：5所示的多核苷酸建构至载体中，以获得编码序列辨识号：1所示氨基酸序列的质粒。
本发明另提供一种编码如上述重组蛋白质的多核苷酸。
本发明另提供一种用于检测糖化血红蛋白的检测试剂盒，其包括如上述的重组蛋白质。
基于上述，本发明提供一种重组蛋白质及其制备方法，其是将序列辨识号：1所示的氨基酸序列的第182位、第268位及第384位的氨基酸中的至少一个氨基酸进行置换而得的重组蛋白质。此外，相较于野生型的果糖基氨基酸氧化酶，此重组蛋白质具有较高的热稳定性与基质特异性。另外，相较于市面上检测糖化血红蛋白的检测试剂盒，本发明所提供的检测试剂盒由于包含上述的重组蛋白质，而具有可精准定量糖化血红蛋白以及长期稳定保存的优点。
为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，并配合所附图式作详细说明如下。
附图简述
图1为本揭露的一实施例的重组蛋白质的制备流程。
符号说明
S100、S110、S120、S130、S140：步骤
实施方式
图1为本发明一实施例的重组蛋白质的制备方法的流程图。请参照图1，首先，如步骤S100，可对果糖基氨基酸氧化酶的基因进行密码子优化(codon optimization)，以获得如序列辨识号：5所示的多核苷酸。上述果糖基氨基酸氧化酶的基因可选取自细菌、酵母菌或真菌，例如是从小麦颖枯病菌属(Phaeosphaeria nodorum)中选取，但不限于此，尚可选取自曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、镰孢属(Fusarium)、毕赤酵母属(Pichia)、锥毛壳属(Coniochaeta)、正青霉属(Eupencillum)、棒杆菌属(Corynebacterium)等。在一实施例中，上述果糖基氨基酸氧化酶的基因可从小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)中选取。其中，进行密码子优化的方式为对密码子中的核苷酸进行调整，例如将GGT调整为GGC，以使得调整后的密码子适于在新的宿主细胞中被利用且能大量表现出氨基酸，并使得此氨基酸与调整前的密码子所表现出的氨基酸相同。
上述果糖基氨基酸氧化酶又可称为果糖基缬氨酸氧化酶(fructosyl valineoxidase)、果糖基肽氧化酶(fructosyl peptide oxidase,FPOX)、阿马道里酶(amadoriase)或酮氨氧化酶(ketoamine oxidase)等。
接着，如步骤S110，可将序列辨识号：5所示的多核苷酸建构至载体中，以获得编码序列辨识号：1所示氨基酸序列的质粒。
之后，如步骤S120，将质粒中编码序列辨识号：1所示氨基酸序列的核苷酸序列进行置换，上述置换可包括由下列置换所组成的群组中的至少一者：将编码第182位氨基酸的核苷酸置换为编码天门冬氨酸的核苷酸、将编码第268位氨基酸的核苷酸置换为编码天门冬氨酸的核苷酸、以及将编码第384位氨基酸的核苷酸置换为编码酪氨酸的核苷酸。
详细而言，上述置换可包括由下列置换所组成的群组中的至少一者：将编码第182位氨基酸的核苷酸由编码甘氨酸的核苷酸置换为编码天门冬氨酸的核苷酸、将编码第268位氨基酸的核苷酸由编码天门冬酰胺的核苷酸置换为编码天门冬氨酸的核苷酸、以及将编码第384位氨基酸的核苷酸由编码组氨酸的核苷酸置换为编码酪氨酸的核苷酸。
更具体而言，对上述氨基酸进行置换的方法可包括：以如序列辨识号：6所示引物与如序列辨识号：7所示引物对编码第182位的甘氨酸的核苷酸进行置换、以如序列辨识号：8所示引物与如序列辨识号：9所示引物对编码第268位的天门冬酰胺的核苷酸进行置换、以及以如序列辨识号：10所示引物与如序列辨识号：11所示引物对编码第384位的组氨酸的核苷酸进行置换。
接着，如步骤S130，可将上述进行置换后的质粒转化至宿主细胞中，以得到转化体(transformant)。
之后，如步骤S140，可利用转化体表现出重组蛋白质。前述重组蛋白质可包括肽，此肽可包括对序列辨识号：1所示序列进行置换后的氨基酸序列。上述置换可包括由下列置换所组成的群组中的至少一者：序列辨识号：1的第182位氨基酸被置换为天门冬氨酸(Asp)、序列辨识号：1的第268位氨基酸被置换为天门冬氨酸(Asp)、以及序列辨识号：1的第384位氨基酸被置换为酪氨酸(Tyr)。
详细而言，上述置换可包括由下列置换所组成的群组中的至少一者：序列辨识号：1的第182位氨基酸由甘氨酸(Gly)置换为天门冬氨酸(Asp)(Gly182Asp)、序列辨识号：1的第268位氨基酸由天门冬酰胺(Asn)置换为天门冬氨酸(Asp)(Asn268Asp)、以及序列辨识号：1的第384位氨基酸由组氨酸(His)置换为酪氨酸(Tyr)(His384Tyr)。
在一实施例中，执行如上述制备方法的步骤S100至S140可获得重组蛋白质，如下进一步说明此重组蛋白质。
在一实施例中，此重组蛋白质包括肽，此肽包括对序列辨识号：1的序列进行置换后的氨基酸序列。前述置换可以是将序列辨识号：1所示氨基酸序列的第182位的甘氨酸、第268位的天门冬酰胺、以及第384位的组氨酸三者的中的至少一者进行置换。在一实施例中，此置换可以是将序列辨识号：1的第182位的甘氨酸置换为天门冬氨酸。在另一实施例中，此置换可以是将序列辨识号：1的第268位的天门冬酰胺置换为天门冬氨酸。在又一实施例中，此置换可以是将序列辨识号：1的第384位的组氨酸置换为酪氨酸。
在一实施例中，上述序列辨识号：1所示的氨基酸序列以及编码此序列辨识号：1所示氨基酸序列的多核苷酸可选自于小麦颖枯病菌。
详细言之，在一实施例中，可将序列辨识号：1所示氨基酸序列的第182位的甘氨酸进行置换以得到包含如序列辨识号：2所示氨基酸序列的重组蛋白质。在另一实施例中，可将序列辨识号：1所示氨基酸序列的第182位的甘氨酸及第268位的天门冬酰胺同时进行置换，以得到包含如序列辨识号：3所示氨基酸序列的重组蛋白质。在又一实施例中，可将序列辨识号：1所示氨基酸序列的第182位的甘氨酸、第268位的天门冬酰胺、以及第384位的组氨酸同时进行置换，以得到包含如序列辨识号：4所示氨基酸序列的重组蛋白质。
在一实施例中，上述重组蛋白质可为果糖基氨基酸氧化酶，具有对F-K、F-V及F-VH的氧化酶活性，因而适用于检测糖化血红蛋白。在另一实施例中，相较于野生型的果糖基氨基酸氧化酶，上述包含如序列辨识号：4所示氨基酸序列的重组蛋白质可对F-K具有较低的基质特异性，但对F-V与F-VH具有较高的基质特异性。
此外，在其他实施例中，更提供了多核苷酸、重组载体、转化体与检测试剂盒。上述多核苷酸可为编码如上述重组蛋白质的多核苷酸，且其中，上述多核苷酸可为包含如序列辨识号：5所示核苷酸序列的多核苷酸。上述重组载体可包括如上述的多核苷酸。上述转化体可藉由将上述重组载体转化至宿主细胞中而得。上述检测试剂盒可适用于检测糖化血红蛋白，且包括上述重组蛋白质。
实验
实验1：合成果糖基氨基酸氧化酶基因
首先，由美国国家生物技术资讯中心(National Center for BiotechnologyInformation,NCBI)的基因组数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中，选取预测可在小麦颖枯病菌中编码为果糖基氨基酸氧化酶的基因，例如是编码FAD依赖型氧化还原酶(FAD-dependent oxidoreductase)的基因，其结果相当于NCBI accession No.XM_001798659.1(NCBI登录号XM_001798659.1)所示的mRNA。
接着，针对上述mRNA所对应的cDNA，于其两端设计复制所需的剪接位点，并将其密码子优化为适合于宿主细胞中表达的密码子，例如是将密码子优化为适合于大肠杆菌中表达，尔后进行全基因合成(whole-genomesynthesis)。
之后，将上述合成基因复制到载体中，例如是pUC57(Genescript)的EcoRV位点，并对复制到载体pUC57中的cDNA部分进行序列分析，获得如序列辨识号：5所示的多核苷酸。也就是说，上述合成基因的cDNA部分为序列辨识号：5所示的多核苷酸。序列辨识号：5所示多核苷酸中的cDNA编码区域是第1号核苷酸到第1314号核苷酸，其中起始密码子相当于第1号核苷酸到第3号核苷酸，而终止密码子TAG相当于第1312号核苷酸到第1314号核苷酸。
实验2：制备包含有果糖基氨基酸氧化酶基因的质粒
利用克隆(cloning)的方法将序列辨识号：5所示的多核苷酸建构至载体中，前述载体例如是pQE-30(Qiagen)，但本发明不以此为限。
具体而言，利用全基因合成时于N端导入的NcoI酶切位点，以及C端终止密码子之后的SacI酶切位点，以T4DNA连接酶将序列辨识号：5所示的多核苷酸复制到载体pQE-30的NcoI-SacI位点，以获得可表达序列辨识号：1所示氨基酸序列的质粒pYC1。
实验3：对果糖基氨基酸氧化酶进行定点突变(Site-directedMutagenesis)
上述定点突变系指对FAOD的其中一个氨基酸残基进行置换，例如是对序列辨识号：1所示氨基酸序列的第182位的甘氨酸(glycine)进行置换，以得到单一突变(singlemutant)的果糖基氨基酸氧化酶。详言之，例如是将第182位的甘氨酸置换为天门冬氨酸(aspartic acid)。而对氨基酸进行置换的方法例如为使用定点突变试剂盒(QuikChangeLightning Site-DirectedMutagenesis Kit)(Agilent)，但本发明不以此为限。
具体而言，可编码序列辨识号：1所示氨基酸序列的多核苷酸为序列辨识号：5，因此，在一实施例中，先于序列辨识号：5所示的多核苷酸中，找出可编码序列辨识号：1所示氨基酸序列的第182位的甘氨酸的核苷酸为ggc。同时，合成序列辨识号：6所示引物与序列辨识号：7所示引物，此二引物皆具有核苷酸gac。接着，利用序列辨识号：6所示引物与序列辨识号：7所示引物对质粒pYC1进行聚合酶连锁反应(Polymerase chain reaction,PCR)，以得到重组质粒(recombinant plasmid)。于此重组质粒中，编码第182位甘氨酸的核苷酸ggc已被置换为编码天门冬氨酸的核苷酸gac。
接着，利用OneMach1TM-T1R(Invitrogen)将此重组质粒进行转化，并挑取10个表现出具有氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance)的菌落(colony)，且对转化至10个菌落中的10个重组质粒的核苷酸序列进行定序，以确认是否成功导入重组质粒，进而获得可表现序列辨识号：2所示氨基酸序列的质粒pHL35。
实验4：对果糖基氨基酸氧化酶进行多点突变
上述多点突变系指对FAOD的其中二个氨基酸残基进行置换，例如是对序列辨识号：1所示氨基酸序列的第182位的甘氨酸及第268位的天门冬酰胺(asparagine)进行置换，以得到双重突变(double mutant)的果糖基氨基酸氧化酶。详言之，例如是同时将第182位的甘氨酸置换为天门冬氨酸，且将第268位的天门冬酰胺置换为天门冬氨酸。而对氨基酸进行置换的方法则如同上述，于此不再赘述。
具体而言，先于序列辨识号：5所示的多核苷酸中，找出可编码序列辨识号：1所示氨基酸序列的第268位天门冬酰胺的核苷酸为aac。同时，合成序列辨识号：8所示引物与序列辨识号：9所示引物，此二引物皆具有核苷酸gac。接着，由于质粒pHL35中编码第182位氨基酸的核苷酸已被置换为编码天门冬氨酸的核苷酸gac，于是利用序列辨识号：8所示引物与序列辨识号：9所示引物继续对质粒pHL35进行聚合酶连锁反应，以将质粒pHL35中编码第268位天门冬酰胺的核苷酸aac置换为编码天门冬氨酸的核苷酸gac，进而获得可表现序列辨识号：3所示氨基酸序列的质粒pHL43。
实验5：对果糖基氨基酸氧化酶的进行多点突变
上述多点突变系指对FAOD的其中三个氨基酸残基进行置换，例如是对序列辨识号：1所示氨基酸序列的第182位的甘氨酸、第268位的天门冬酰胺及第384位的组氨酸(histidine)进行置换，以得到三重突变(triple mutant)的果糖基氨基酸氧化酶。详言之，例如同时将第182位的甘氨酸置换为天门冬氨酸、将第268位的天门冬酰胺置换为天门冬氨酸、且将第384位的组氨酸置换为酪氨酸(tyrosine)。而对氨基酸进行置换的方法则如同上述，于此不再赘述。
具体而言，先于序列辨识号：5所示的多核苷酸中，找出可编码序列辨识号：1所示氨基酸序列的第384位组氨酸的核苷酸为cat。同时，合成序列辨识号：10所示引物与序列辨识号：11所示引物，此二引物皆具有核苷酸tat。接着，由于质粒pHL43中编码第182位氨基酸与第268位氨基酸的核苷酸皆已被置换为编码天门冬氨酸的核苷酸gac，于是利用序列辨识号：10所示引物与序列辨识号：11所示引物继续对质粒pHL43进行聚合酶连锁反应，以将质粒pHL43中编码第384位组氨酸的核苷酸cat置换为编码酪氨酸的核苷酸tat，进而获得可表现序列辨识号：4所示氨基酸序列的质粒pHL37。
简言之，质粒pHL35可表现序列辨识号：2所示的氨基酸序列，其第182位氨基酸已被置换为天门冬氨酸。质粒pHL43可表现序列辨识号：3所示的氨基酸序列，其第182位与第268位氨基酸皆已被置换为天门冬氨酸。质粒pHL37可表现序列辨识号：4所示的氨基酸序列，其第182位与第268位氨基酸皆已被置换为天门冬氨酸，且其第384位氨基酸已被置换为酪氨酸。
实验6：果糖基氨基酸氧化酶的大量表达与纯化
首先，将质粒pYC1以及上述进行氨基酸残基置换后的质粒pHL35、pHL43、pHL37分别转化至宿主细胞中，以得到具有胺苄青霉素耐性的转化体。前述宿主细胞可以是大肠杆菌，例如是BL21 StarTM(DE3)(Chemically Competent E.coli)(Invitrogen)，但本发明不以此为限。
接着，制备转化体培养用的培养基。先将500mL的TB(Terrific Broth)培养基分注至容积2L的锥形瓶中，并于121℃进行20分钟高压蒸汽灭菌。待培养基放置冷却后，将经过无菌过滤的氨苄青霉素添加至培养基中，使氨苄青霉素的最终浓度为100μg/mL。
之后，于上述TB培养基中接种2ml预先于37℃培养16小时的BL21 StarTM(DE3)(pYC1)的培养液，此培养液为含有100μg/mL氨苄青霉素的LB(Lysogeny broth)培养基，并于37℃以225rpm转速进行摇晃培养，同时追踪600nm的吸光值(OD600或A600)。当吸光值达到0.6时，将温度调降至20℃并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)，使IPTG的最终浓度达为1mM。
接着，继续培养20小时。待结束培养后，藉由离心汇集菌体，并加入CelLyticTB 2XCell Lysis Reagent(Sigma)破菌液使菌体破碎，且对前述包含有已破碎菌体的悬浮液进行离心以分离取得上清液。接着，使用cOmpleteTM His-Tag Purification Resin(Roche)对所获得的上清液进行纯化以获得纯化的目标蛋白质，再利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)确认所纯化的目标蛋白质确实是单一的蛋白质。
上述目标蛋白质例如为小麦颖枯病菌属的果糖基肽氧化酶(PnFPOX)，意即果糖基氨基酸氧化酶，且所获得的目标蛋白质即为上述的重组蛋白质，也就是将序列辨识号：1所示氨基酸序列的第182位的甘氨酸、第268位的天门冬酰胺及第384位的组氨酸三者的中的至少一者进行置换的蛋白质，而关于氨基酸的置换方式已于前文中进行说明，于此不再重复叙述。
于上述操作中，含有质粒pYC1的转化体可表现序列辨识号：1所示的氨基酸序列，也就是野生型的果糖基氨基酸氧化酶(简称PnFPOX)。含有质粒pHL35的转化体可表现序列辨识号：2所示的氨基酸序列，也就是果糖基氨基酸氧化酶的第182位氨基酸已被置换为天门冬氨酸的重组蛋白质(简称PnFPOX-SS)。含有质粒pHL43的转化体可表现序列辨识号：3所示的氨基酸序列，也就是果糖基氨基酸氧化酶的第182位氨基酸与第268位氨基酸皆已被置换为天门冬氨酸的重组蛋白质(简称PnFPOX-DS)。而含有质粒pHL37的转化体可表现序列辨识号：4所示的氨基酸序列，也就是果糖基氨基酸氧化酶的第182位氨基酸与第268位氨基酸皆已被置换为天门冬氨酸，且第384位氨基酸已被置换为酪氨酸的重组蛋白质(简称PnFPOX-TS)。
实验7：果糖基氨基酸氧化酶的活性、基质特异性及热稳定性的评估
检测上述重组蛋白质(PnFPOX-SS、PnFPOX-DS、PnFPOX-TS)的氧化酶活性、基质特异性以及热稳定性，并与野生型的果糖基氨基酸氧化酶(PnFPOX)以及其他物种的果糖基氨基酸氧化酶(简称FPOX-CE)(龟甲万公司(Kikkoman Corporation)制造)进行比较。
氧化酶活性评估
对基质的氧化酶活性是利用氧化酶与基质反应后产生过氧化氢，过氧化氢和呈色剂再经由过氧化氢酶催化产生颜色变化，接着只需检测呈色剂在特定波长的吸光度变化，便可计算得知氧化酶活性。
具体说明氧化酶活性的检测方式如下：首先，参考Hirokawa等人于2003年发表在Biochmical and Biophysical Research Communications期刊的文献(卷号311，页数104-111)来配制活性测定溶液，即，pH值8.0的10mM磷酸钾缓冲溶液中含有5mg/L过氧化氢酶(TOYOBO)、100mg/L 4-Aminoantipyrine(Sigma)和0.167g/L TOOS(Sigma)。接着进行测定，首先将145μl活性测定溶液于37℃加热30分钟，接着添加5μl已预先以酶稀释液(含有0.15％BSA的10mM磷酸钾缓冲液(pH值8.0))进行稀释的酶溶液于此活性测定试剂中以进行反应。于37℃反应5分钟后，即测定OD555于单位时间内的吸光度变化(ΔOD实验/min)。同时，以5μl酶稀释液代替酶溶液，进行如同上述的操作并测定吸光度的变化(Δ OD空白/min)以作为空白测试(blank)。
以于1分钟内可使1微摩尔(μmole)的基质氧化的酶量规定为1单位(U)，并根据下述算式，由所得吸光度变化来计算氧化酶的活性。氧化酶的活性值(U/ml)＝{(ΔOD实验/min-ΔOD空白/min)X 150(μl)X稀释倍率}/{4.5X 5(μl)}。于上述算式中，“150μl”表示检测溶液的总液量，“4.5”表示毫摩尔的吸光系数，“5μl”表示氧化酶样本的液量。
接着，测定FPOX-CE、PnFPOX、PnFPOX-SS、PnFPOX-DS、及PnFPOX-TS对不同的基质的氧化酶活性。所检测的基质包括：果糖基赖氨酸(F-K)、果糖基缬氨酸(F-V)、果糖基缬氨酰基组氨酸(F-VH)。不同重组蛋白质的氧化酶活性的检测结果如表1所示。
表1：不同重组蛋白质的氧化酶活性比对(氧化酶活性值(单位U/mg))
FPOX-CE PnFPOX PnFPOX-SS PnFPOX-DS PnFPOX-TS
F-K 0.82 0.12 0.29 0.25 0.05
F-V 12.69 15.14 16.43 16.59 16.03
F-VH 3.18 2.73 4.22 4.02 4.05
依据表1所示结果可知，相较于其他物种的果糖基氨基酸氧化酶(FPOX-CE)，野生型的果糖基氨基酸氧化酶(PnFPOX)对果糖基赖氨酸(F-K)的氧化酶活性较低，而对果糖基缬氨酸(F-V)的氧化酶活性较高。而相较于野生型的果糖基氨基酸氧化酶(PnFPOX)，三重突变的果糖基氨基酸氧化酶(PnFPOX-TS)则对F-K的氧化酶活性较低，然而对果糖基缬氨酸(F-V)与果糖基缬氨酰基组氨酸(F-VH)的氧化酶活性较高。
基质特异性评估
根据上述氧化酶活性的测定结果，并利用以下算式所计算的活性比值来代表FPOX-CE、PnFPOX、PnFPOX-SS、PnFPOX-DS、PnFPOX-TS对不同基质的基质特异性。其中，(F-K/F-V)＝(以F-K作为基质时的氧化酶活性值)/(以F-V作为基质时的氧化酶活性值)，而由此算式所计算的活性比值越小，则表示此蛋白质对F-V的基质特异性较高。(F-K/F-VH)＝(以F-K作为基质时的氧化酶活性值)/(以F-VH作为基质时的氧化酶活性值)，而由此算式所计算的活性比值越小，则表示此蛋白质对F-VH的基质特异性较高。不同重组蛋白质的基质特异性的分析结果如表2所示。
表2：不同重组蛋白质的基质特异性比对
依据表2所示结果可知，相较于其他物种的果糖基氨基酸氧化酶(FPOX-CE)，野生型的果糖基氨基酸氧化酶(PnFPOX)的F-K/F-V与F-K/F-VH的活性比值较小，显示PnFPOX对F-V与F-VH的基质特异性较高。而，三重突变的果糖基氨基酸氧化酶(PnFPOX-TS)的F-K/F-V与F-K/F-VH的活性比值皆远小于其他物种的果糖基氨基酸氧化酶(FPOX-CE)，显示PnFPOX-TS对F-V与F-VH的基质特异性远高于FPOX-CE，且相差约20倍以上。
换言之，以基质特异性而言，其他物种的果糖基氨基酸氧化酶(FPOX-CE)虽具有较为广泛的基质活性，然而其基质特异性较差，相对于此，野生型的果糖基氨基酸氧化酶(PnFPOX)、单一突变的果糖基氨基酸氧化酶(PnFPOX-SS)、双重突变的果糖基氨基酸氧化酶(PnFPOX-DS)以及三重突变的果糖基氨基酸氧化酶(PnFPOX-TS)对于基质特异性的改善都有良好的效果，并以PnFPOX-TS的改善效果最佳。
热稳定性评估
将其他物种的果糖基氨基酸氧化酶(FPOX-CE)、野生型的果糖基氨基酸氧化酶(PnFPOX)、以及上述重组蛋白质(PnFPOX-SS、PnFPOX-DS、PnFPOX-TS)分别溶于100mM磷酸钾缓冲液(pH值8.0)中，使其浓度达到0.05mg/ml，并于25～60℃进行10分钟加热处理后，测定其氧化酶活性。同时，根据以下算式来计算热稳定性(％)：热稳定性＝(热处理后的氧化酶活性值)/(未进行热处理的氧化酶活性)x100％。
表3：不同重组蛋白质的热稳定性比对
FPOX-CE PnFPOX PnFPOX-SS PnFPOX-DS PnFPOX-TS
25℃ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％
30℃ 99％ 99％ 100％ 101％ 102％
37℃ 97％ 99％ 100％ 100％ 103％
40℃ 97％ 99％ 99％ 100％ 102％
45℃ 87％ 100％ 99％ 102％ 104％
50℃ 30％ 86％ 96％ 101％ 102％
55℃ 5％ 6％ 11％ 67％ 33％
60℃ 0％ 0％ 0％ 0％ 0％
依据表3所示结果可知，相较于其他物种的果糖基氨基酸氧化酶(FPOX-CE)与野生型的果糖基氨基酸氧化酶(PnFPOX)，进行定点突变或多点突变的果糖基氨基酸氧化酶，无论是单一、双重、或者是三重突变的果糖基氨基酸氧化酶(PnFPOX-SS、PnFPOX-DS、PnFPOX-TS)，于50℃热处理后皆仍具有至少95％的氧化酶活性。而当热处理的温度提高至55℃时，FPOX-CE和PnFPOX的氧化酶活性均已降至低于10％，此时PnFPOX-DS和PnFPOX-TS的氧化酶活性仍分别有67％和33％。换言之，相较于其他物种及野生型的果糖基氨基酸氧化酶(FPOX-CE与PnFPOX)，进行定点突变或多点突变后的果糖基氨基酸氧化酶(PnFPOX-SS、PnFPOX-DS、PnFPOX-TS)可具有较高的热稳定性。
综上所述，本发明提供一种重组蛋白质及其制备方法，其是将序列辨识号：1所示氨基酸序列的第182位、第268位及第384位的氨基酸中的至少一个氨基酸进行置换而得的重组蛋白质。此外，相较于野生型的果糖基氨基酸氧化酶，此重组蛋白质具有较高的热稳定性与基质特异性。并且，相较于市面上检测糖化血红蛋白的检测试剂盒，本发明所提供的检测试剂盒中含有上述的重组蛋白质，具有可精准定量糖化血红蛋白且能长期稳定保存的优点。
虽然本发明已以实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与润饰，故本发明的保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。
序列表
<110> 财团法人工业技术研究院
<120> 重组蛋白质及其制造方法与应用
<130> 66204-CN-PA
<150> US 62/433,733
<151> 2016-12-13
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 437
<212> PRT
<213> 小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)
<400> 1
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<213> 小麦颖枯病菌
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<211> 1314
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 可编码序列辨识号:1所示胺基酸序列的多核苷酸
<220>
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<222> (6)..(6)
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<220>
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<222> (1302)..(1302)
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<220>
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<222> (1305)..(1305)
<223> n=a或g或c或t
<400> 5
atggcnccnw snmgngcnaa yacnwsngtn athgtngtng gnggnggngg nacnathggn 60
wsnwsnacng cnytncayyt ngtnmgnwsn ggntayacnc cnwsnaaygt nacngtnytn 120
gaygcntayc cnathccnws nwsncarwsn gcnggnaayg ayytnaayaa rathatgggn 180
gtnwsnytnm gnaayccngt ngayytncar ytngcnytng argcnmgnca ratgtggaay 240
gargaygary tnttyaaraa rttyttycay aayacnggnm gnytngaytg ygcncayggn 300
garaargaya thgcngayyt naarwsnggn taycargcny tngtngaygc nggnytngay 360
gcnacnaayg artggytnga ywsngargay garathytna armgnatgcc nytnytnwsn 420
mgngaycara thaarggntg gaargcnath ttywsnaarg ayggnggntg gytngcngcn 480
gcnaargcna thaaygcngt nggngartay ytnmgngayc arggngtnmg nttyggntty 540
tayggngcng gnwsnttyaa rgcnccnytn ytngcngarg gngtntgyat hggngtngar 600
acngtngayg gnacnmgnta ytaygcngay aargtngtny tngcngcngg ngcntggwsn 660
ccnacnytng tngarytnca ygarcartgy gtnwsnaarg cntgggtnta yggncayath 720
carytnacnc cngargargc ngcnmgntay aaraaywsnc cngtngtnta yaayggngay 780
gtnggnttyt tyttygarcc naaygarcay ggngtnatha argtntgyga ygarttyccn 840
ggnttyacnm gnttyaarat gcaycarccn ttyggngcna argcnccnaa rmgnathwsn 900
gtnccnmgnw sncaygcnaa rcayccnacn gayacnathc cngaygcnws ngaygtnwsn 960
athmgnmgng cnathgcnac nttyatgccn carttyaara ayaaraarat gttyaaycar 1020
gcnatgtgyt ggtgyacnga yacngcngay gcngcnytny tnathtgyga rcayccngar 1080
tggaaraayt tygtnytngc nacnggngay wsnggncayw snttyaaryt nytnccnaay 1140
athggnaarc aygtngtnga rytnytngar ggnacnytng cngaygayyt ngcncaygcn 1200
tggmgntggm gnccnggnws nggngaygcn ytnaarwsnm gnmgnwsngc nccngcnaar 1260
gayytngcng ayatgccngg ntggaaycay gayaarccnm gngcnaayyt ntag 1314
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物，用于对序列辨识号：1中编码第182位的甘氨酸的核苷酸进行置换
<400> 6
gtgtacgttt cggtttctat gacgcgggct ctttc 35
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物，用于对序列辨识号：1中编码第182位的甘氨酸的核苷酸进行置换
<400> 7
gaaagagccc gcgtcataga aaccgaaacg tacac 35
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物，用于对序列辨识号：1中编码第268位的天门冬酰胺的核苷酸进行置换
<400> 8
ttttcttcga gccggacgag cacggcgtg 29
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物，用于对序列辨识号：1中编码第268位的天门冬酰胺的核苷酸进行置换
<400> 9
cacgccgtgc tcgtccggct cgaagaaaa 29
<210> 10
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物，用于对序列辨识号：1中编码第384位的组氨酸的核苷酸进行置换
<400> 10
ctgccaaata ttggcaagta tgttgttgaa ctgctgg 37
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物，用于对序列辨识号：1中编码第384位的组氨酸的核苷酸进行置换
<400> 11
ccagcagttc aacaacatac ttgccaatat ttggcag 37

Claims (15)

1.一种重组蛋白质，其特征在于，包括：
肽，其中所述肽包括对序列辨识号：1的序列进行置换后的氨基酸序列，而所述置换包括由下列置换所组成的群组中的至少一者：
所述序列辨识号：1的第182位的氨基酸被置换为天门冬氨酸；
所述序列辨识号：1的第268位的氨基酸被置换为天门冬氨酸；以及
所述序列辨识号：1的第384位的氨基酸被置换为酪氨酸。
2.根据权利要求1所述的重组蛋白质，其特征在于，所述置换包括由下列置换所组成的群组中的至少一者：
所述序列辨识号：1的第182位氨基酸由甘氨酸置换为天门冬氨酸；
所述序列辨识号：1的第268位氨基酸由天门冬酰胺置换为天门冬氨酸；以及
所述序列辨识号：1的第384位氨基酸由组氨酸置换为酪氨酸。
3.根据权利要求1所述的重组蛋白质，其特征在于，所述肽的氨基酸序列包括序列辨识号：2的序列。
4.根据权利要求1所述的重组蛋白质，其特征在于，所述肽的氨基酸序列包括序列辨识号：3的序列。
5.根据权利要求1所述的重组蛋白质，其特征在于，所述肽的氨基酸序列包括序列辨识号：4的序列。
6.根据权利要求1所述的重组蛋白质，其特征在于，所述序列辨识号：1的氨基酸序列以及编码所述序列辨识号：1的多核苷酸选自于小麦颖枯病菌。
7.一种重组蛋白质的制备方法，其特征在于，包括：
将质粒中编码序列辨识号：1的氨基酸序列的核苷酸序列进行置换，其中，所述置换包括由下列置换所组成的群组中的至少一者：
将编码第182位氨基酸的核苷酸置换为编码天门冬氨酸的核苷酸；
将编码第268位氨基酸的核苷酸置换为编码天门冬氨酸的核苷酸；以及
将编码第384位氨基酸的核苷酸置换为编码酪氨酸的核苷酸；
将进行置换后的所述质粒转化至宿主细胞中以得到转化体；以及
利用所述转化体表现出所述重组蛋白质。
8.根据权利要求7所述的重组蛋白质的制备方法，其特征在于，所述置换包括由下列置换所组成的群组中的至少一者：
将编码所述第182位氨基酸的核苷酸由编码甘氨酸的核苷酸置换为编码天门冬氨酸的核苷酸；
将编码所述第268位氨基酸的核苷酸由编码天门冬酰胺的核苷酸置换为编码天门冬氨酸的核苷酸；以及
将编码所述第384位氨基酸的核苷酸由编码组氨酸的核苷酸置换为编码酪氨酸的核苷酸。
9.根据权利要求8所述的重组蛋白质的制备方法，其特征在于，对编码所述氨基酸的核苷酸进行置换的方法包括：
以如序列辨识号：6所示引物与如序列辨识号：7所示引物对编码所述第182位的甘氨酸的核苷酸进行置换；
以如序列辨识号：8所示引物与如序列辨识号：9所示引物对编码所述第268位的天门冬酰胺的核苷酸进行置换；以及
以如序列辨识号：10所示引物与如序列辨识号：11所示引物对编码所述第384位的组氨酸的核苷酸进行置换。
10.根据权利要求8所述的重组蛋白质的制备方法，其特征在于，将编码所述第182位的甘氨酸的核苷酸进行置换以得到包含如序列辨识号：2所示氨基酸序列的所述重组蛋白质。
11.根据权利要求8所述的重组蛋白质的制备方法，其特征在于，将编码所述第182位的甘氨酸的核苷酸及编码所述第268位的天门冬酰胺的核苷酸同时进行置换以得到包含如序列辨识号：3所示氨基酸序列的所述重组蛋白质。
12.根据权利要求8所述的重组蛋白质的制备方法，其特征在于，将编码所述第182位的甘氨酸的核苷酸、编码所述第268位的天门冬酰胺的核苷酸、以及编码所述第384位的组氨酸的核苷酸同时进行置换以得到包含如序列辨识号：4所示氨基酸序列的所述重组蛋白质。
13.根据权利要求7所述的重组蛋白质的制备方法，其特征在于，所述质粒的制备方法包括：
优化果糖基氨基酸氧化酶基因的密码子，以获得如序列辨识号：5所示的多核苷酸；以及
建构如所述序列辨识号：5所示的多核苷酸至载体中，以获得编码所述序列辨识号：1所示氨基酸序列的所述质粒。
14.一种编码根据权利要求1所述的重组蛋白质的多核苷酸。
15.一种用于检测糖化血红蛋白的检测试剂盒，其特征在于，包括根据权利要求1所述的重组蛋白质。
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