CN103122338A - 热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示序列，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示序列，它的制备步骤包括：1)以AspergillusterreusGP1的果糖赖氨酸氧化酶基因序列为模板，进行易错PCR扩增，建立果糖赖氨酸氧化酶的突变文库；2)将步骤1)所述的突变文库转入大肠杆菌，对其基因进行克隆、重组转化和表达；3)利用醌法测定酶活性，筛选出热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶；所得果糖赖氨酸氧化酶置于40℃下10分钟，酶活保留95%以上，置于45℃下10分钟，酶活保留80%以上。
Description
技术领域
本发明涉及诊断用酶技术领域，具体讲是一种热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶及其制备方法。
背景技术
糖化白蛋白（GA）是指人血清中葡萄糖与白蛋白N末端发生非酶促糖化反应而形成的产物，其中90%与白蛋白链内的赖氨酸ε-NH2残基发生反应，其反应原理为两者首先形成不稳定的葡基胺（Glycosylamine）或Schiff碱基（Schiff Base），后者再经不可逆的葡糖胺（Amadori）重排反应形成稳定的氨基酮（酮胺）。因白蛋白的半衰期大约是20天，所以糖化白蛋白检测可被用于检测过去2-3周平均血糖水平。
如何能精确地测定出人血清中的糖化白蛋白量成为临床检测糖化白蛋白的关键。目前市场主要采用酶法用于检测人血清中的糖化白蛋白，因为其关键步骤在于果糖赖氨酸氧化酶的催化反应，所以果糖赖氨酸的性质决定了测量方法的精密度。然而目前已有的果糖赖氨酸氧化酶热稳定性差，不能很好的满足工业化需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上现有技术的缺点：提供一种能在较高温度下保持良好稳定性的果糖赖氨酸氧化酶。
本发明的技术解决方案如下：
一种热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶，基于果糖赖氨酸氧化酶的基因序列，通过易错PCR技术，构建果糖赖氨酸氧化酶的突变文库，将突变文库转入大肠杆菌，进行两轮筛选，得到了40℃下热处理10分钟酶活大于95%的热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶。该热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID.No.2所示序列。
一种编码热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶的多核苷酸，其核苷酸序列为SEQ ID.No.1所示序列。
本发明的的突变菌株筛选方法如下：
1) 以Aspergillus terreus GP1的果糖赖氨酸氧化酶基因序列为模板，进行易错PCR扩增，建立果糖赖氨酸氧化酶的突变文库；
2) 将步骤1)所述的突变文库转入大肠杆菌，对其基因进行克隆、重组转化和表达；
3) 利用醌法测定酶活性，筛选出热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶。
Aspergillus terreus GP1含有果糖赖氨酸氧化酶的编码基因,本发明是以该基因序列为模板设计两条引物，上游引物序列为： 5'-CTCGGATCCATGCCAGTCACCAAG-3'，下游引物序列为：5'-CCCCTGCAGCTATAACTTCGAGATG-3'；经易错PCR扩增，所得片段经回收后，用BamHI和PstI酶切并连接于可热诱导裂解的载体pEAS-1a上，转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞，涂布于LB平板上，并于30℃培养12-24小时后，将所获得的含有单克隆的平板用印章法复制到一块新的含有IPTG的LB复制平板上，将该复制平板于30℃培养6个小时，充分诱导果糖赖氨酸氧化酶表达，然后依次在38℃条件下放置2小时，在30℃下放置1小时，以使细胞充分裂解，在45℃下放置30分钟，最后在复制平板上均匀喷洒反应液，并转移至30℃放置30分钟，对于颜色变化明显的单克隆，从复制平板上挑选出来，作为下一步筛选的基础，其中所述反应液的组成为：磷酸钾缓冲液0.1M，pH8.0；TOOS溶液 15mM；4-APP 0.5mM；POD 40U/ml；果糖赖氨酸 15mM。
将初步筛选得到的单克隆，接种于96孔板中进行定量测活。方法如下：细胞在30℃下生长6小时，然后加IPTG诱导6小时，再依次转移至38℃下2小时及30℃下1小时进行热诱导裂解，离心，取上清，将上清置于45℃条件下放置30分钟后加入反应液孵育30分钟，其中所述反应液的组成为：磷酸钾缓冲液0.1M，pH8.0；TOOS溶液 15mM；4-APP 0.5mM；POD 40U/ml；果糖赖氨酸 15mM；检测555nm吸光度，得到一株热稳定性较高的菌株；通过序列分析发现与野生型相比共有五个碱基位点发生突变，分别为123T→C，174C→T，494C→G，698C→G，755A→G，相应地涉及到三个氨基酸的突变，分别为199A→G，233T→S，258N→S，将该基因命名为FAOD-MK18。
一种热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶的制备方法，它包括以下步骤：
1) 菌体的获得：培养含有重组质粒的大肠杆菌BL21（DE3）菌种，加入IPTG诱导2-8小时，离心收集菌体，收集的菌体用缓冲液重新悬浮，超声破碎，离心收集上清；
2) 硫酸铵沉淀：使用硫酸铵溶液对步骤1)所得上清液进行分级沉淀，将最后收集得到的沉淀溶于buffer A中，得到粗提液；
3) 亲和层析：用buffer A平衡镍柱，再将步骤2)得到的粗提液上镍柱吸附，吸附结束后，用咪唑溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液；
4) 透析：将步骤3)中的洗脱液装至透析袋中，置于4℃透析液中，并磁力搅拌透析12-24小时，即得到热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶。
所述buffer A的组成为：磷酸钾缓冲液10-100 mM，pH 8.0， NaCl 100-1000mM。
所述咪唑溶液的组成为：磷酸钾缓冲液10-100 mM，pH 8.0， NaCl 100-1000mM，咪唑 20mM-1000mM。
所述透析液的组成为：磷酸钾缓冲液10-100 mM，pH 8.0，NaCl 100-1000mM。
所述重组质粒通过将基因FAOD-MK18连接至pET-22b载体上获得。
本发明的有益效果是：对酶学性质进行研究发现，通过该突变菌株获得的氧化酶的酶活及底物亲和力较野生型菌株并未发生大的变化，而其热稳定性较野生型有很大的提高，将其置于40 ℃下10分钟，酶活保留95%以上，置于45℃下10分钟，酶活保留80%以上。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。
实施例一
以Aspergillus terreus GP1的果糖赖氨酸氧化酶的编码基因为模板，进行易错PCR扩增。
1、引物序列：
上游引物序列为：5'-CTCGGATCCATGCCAGTCACCAAG- 3'，
下游引物序列为：5'-CCCCTGCAGCTATAACTTCGAGATG-3'。
2、易错PCR反应体系及反应条件：
PCR反应体系：
100μL体系中含有：
| 名称 | 体积（μL） |
| dNTP Mixture（各2.5mM） | 8 |
| dTTP(100mM) | 0.8 |
| dCTP(100mM) | 0.8 |
| 10*PCR Buffer | 10 |
| 上游引物（5mM） | 20 |
| 下游引物（5mM） | 20 |
| MnCl2（5mM） | 10 |
| Mg2+（25mM） | 14 |
| Taq 酶（5U/μL） | 1 |
| 模板（10ng/μL） | 5 |
| 水 | 12 |
PCR反应条件为：
95℃ 5min；94℃ 30sec；55℃ 30sec；72℃ 2min；30个循环；72℃ 10min；4℃ 保存。
3、取3μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在1.3kb附件有目的产物条带。剩余97ul产物经纯化后，用BamHI和PstI进行双酶切，并与pEAS-1a连接，转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞，涂布于LB平板上，并置于30℃培养24小时，获得突变体库。
实施例二
突变体菌株的初步筛选
1、将含有突变体库的LB平板上的单克隆用印章法复制到一块新的含有IPTG的LB复制平板上，将复制平板于30℃培养6个小时，充分诱导果糖赖氨酸氧化酶表达。
2、将复制平板置于38℃条件下放置2小时，再转移至30℃放置1小时，以使细胞充分裂解，接着将复制平板置于45℃放置30分钟。
3、随后在复制平板上均匀喷洒反应液，并转移至30℃下放置30分钟，其中所述反应液的组成为：磷酸钾缓冲液0.1M，pH8.0；TOOS溶液 15mM；4-APP 0.5mM；POD 40U/ml；果糖赖氨酸 15mM；对于颜色变化明显的单克隆，从其复制平板上挑选出来，共计56个，作为下一步筛选的基础。
实施例三
突变体菌株的复筛
1、将初步筛选得到的56个单克隆，接种于96孔板中于30℃下生长6小时，然后加IPTG诱导6小时，再依次转移至38℃下2小时及30℃下1小时进行热诱导裂解，离心，取上清，并置于45℃条件下放置30分钟后加入反应液，其中所述反应液的组成为：磷酸钾缓冲液0.1M，pH8.0；TOOS溶液 15mM；4-APP 0.5mM；POD 40U/ml；果糖赖氨酸 15mM。
2、检测555nm吸光度。
实施例四
突变株的序列测定
通过上述初筛和复筛，成功筛选到一株热稳定性较高的突变菌株，提取质粒，通过测序后确定其序列如SEQ ID.No.1所示。
其中共有5个核苷酸位点发生突变，分别为： 123T→C，174C→T，494C→G，698C→G，755A→G。
对应的氨基酸序列为SEQ ID.No.2，其中共有3个氨基酸位点发生突变，分别为：99A→G，233T→S，258N→S，并将其该基因命名为FAOD-MK18。
实施例五
克隆至pET-22b表达载体上
以FAOD-MK18的编码基因为模板，进行易错PCR扩增。
1、引物序列
上游引物序列为：5'-CTCCATATGCCAGTCACCAAG- 3'，
下游引物序列为：5'-CCCCTCGAGCTATAACTTCGAGATG-3'。
2、PCR反应体系及条件
反应体系为50μL：
| 名称 | 体积（μL） |
| dNTP Mixture（各2.5mM） | 4 |
| 10*PCR Buffer | 5 |
| 上游引物（5mM） | 10 |
| 下游引物（5mM） | 10 |
| Taq 酶（5U/μL） | 0.5 |
| 模板（1ng/μL） | 2.5 |
| 水 | 18 |
反应条件为：
95℃ 5min；94℃ 30sec；55℃ 30sec；72℃ 2min；30个循环；72℃ 10min；4℃ 保存。
3、取3μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在1.3kb附近有目的产物条带；剩余47μL产物经纯化后，再经NdeI和XhoI双酶切后，与经相同酶切的pET-22b连接，转化大肠杆菌JM109细胞。
4、经PCR鉴定正确及测序确认后，抽质粒，并转换大肠杆菌BL21（DE3），获得含有目的基因的表达菌株。
实施例六
制备方法
1) 菌体的获得：培养含有FAOD-MK18的大肠杆菌BL21（DE3），加入IPTG诱导4小时，离心收集菌体，收集的菌体用缓冲液重新悬浮，超声破碎，离心收集上清；
2) 硫酸铵沉淀：使用硫酸铵溶液对步骤1)所得上清液进行分级沉淀，将最后收集得到的沉淀溶于buffer A中，得到粗提液；
3) 亲和层析：用buffer A平衡镍柱，再将步骤2)得到的粗提液上镍柱吸附，吸附结束后，用咪唑溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液；
4) 透析：将步骤3)中的洗脱液装至透析袋中，置于4℃透析液中，并磁力搅拌透析过夜。
所述步骤2)中buffer A组成为：50 mM，pH 8.0 磷酸钾缓冲液；500mM NaCl；
所述步骤3)中咪唑溶液组成为：50 mM，pH 8.0磷酸钾缓冲液；500mM NaCl；20mM~1000mM咪唑；
所述步骤4)中透析液组成为：50 mM，pH 8.0 磷酸钾缓冲液，500mM NaCl。
实施例七
稳定性测定
1) 经纯化后的FAOD-MK18酶和野生型FAOD，分别置于25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃条件下孵育10分钟。
2) 将步骤1)中的酶各取100μL，加入反应液2900μL，于30℃反应5分钟。
3) 检测555nm处吸光度。
所述反应液为：磷酸钾缓冲液，0.1M，pH8.0；TOOS溶液，15mM；4-APP，0.5mM；POD，40U/ml；果糖赖氨酸，15mM。
FAOD-MK18的热稳定性较野生型有较大提高。将其置于40 ℃下10分钟，酶活保留95%以上，置于45℃下10分钟，酶活保留80%以上。
SEQUENCE LISTING
<110> 宁波美康生物科技股份有限公司
<120> 热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶及其制备方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1314
<212> DNA
<213> Aspergillus terreus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1314)
<400> 1
atg cca gtc acc aag tct tcg tcg ata ttg atc atc ggg gcg ggc acc 48
Met Pro Val Thr Lys Ser Ser Ser Ile Leu Ile Ile Gly Ala Gly Thr
1 5 10 15
tgg ggt tgc tca act gcc ctg cat ctt gcc cgc aga gga tac acc aat 96
Trp Gly Cys Ser Thr Ala Leu His Leu Ala Arg Arg Gly Tyr Thr Asn
20 25 30
gtc act gtc ctt gac ccg tac ccg gtc cca tca gcc att tcg gcc ggc 144
Val Thr Val Leu Asp Pro Tyr Pro Val Pro Ser Ala Ile Ser Ala Gly
35 40 45
aac gac gtc aac aag atc atc tcg tcc ggt cag tac agc agc aag aag 192
Asn Asp Val Asn Lys Ile Ile Ser Ser Gly Gln Tyr Ser Ser Lys Lys
50 55 60
gac gag gtc gaa gtc aat gag att atc gcc gaa cag gcc ttc aat ggc 240
Asp Glu Val Glu Val Asn Glu Ile Ile Ala Glu Gln Ala Phe Asn Gly
65 70 75 80
tgg aaa aat gac ccc atc ttc aag ccg tac tac cac gac acc ggc gtc 288
Trp Lys Asn Asp Pro Ile Phe Lys Pro Tyr Tyr His Asp Thr Gly Val
85 90 95
gtg atg tcc gcc acc aca cag gaa gga ttg gag cgt ctg ggg gtc cgc 336
Val Met Ser Ala Thr Thr Gln Glu Gly Leu Glu Arg Leu Gly Val Arg
100 105 110
gtg cga cct gaa gat gaa ccc gat gta gcc gaa ttg act cgg ccg gag 384
Val Arg Pro Glu Asp Glu Pro Asp Val Ala Glu Leu Thr Arg Pro Glu
115 120 125
cag ttc cgc cag ctg gcc ccc ggc gtc ttg aag ggt aac ttc ccc ggt 432
Gln Phe Arg Gln Leu Ala Pro Gly Val Leu Lys Gly Asn Phe Pro Gly
130 135 140
tgg agg ggg tac cac att cgc tca aac gcg ggc tgg gcg cat gcg cgc 480
Trp Arg Gly Tyr His Ile Arg Ser Asn Ala Gly Trp Ala His Ala Arg
145 150 155 160
aac gcc ctg gtc ggc gcg gcg cgg gag gca cag cgc ctg ggt gtg cgc 528
Asn Ala Leu Val Gly Ala Ala Arg Glu Ala Gln Arg Leu Gly Val Arg
165 170 175
ttc gtc gcg gga tcg ccg cag ggc aga gtc atc acg ttg att ttt gag 576
Phe Val Ala Gly Ser Pro Gln Gly Arg Val Ile Thr Leu Ile Phe Glu
180 185 190
aac aac gat gtg aag ggt gcc gtc acg gcg gac ggc aag atc tgg cgg 624
Asn Asn Asp Val Lys Gly Ala Val Thr Ala Asp Gly Lys Ile Trp Arg
195 200 205
gcc gag cag act atc ctc tgc gct ggt gcg gcc gcc ggc cag ttt ctg 672
Ala Glu Gln Thr Ile Leu Cys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gln Phe Leu
210 215 220
gat ttc aag gac caa ctg cgt ccc agt gcg tgg act ctg gtc cac atc 720
Asp Phe Lys Asp Gln Leu Arg Pro Ser Ala Trp Thr Leu Val His Ile
225 230 235 240
cag ttg aag ccg gaa gag cgt gcc cag tat aaa agc atg ccg gtg gtc 768
Gln Leu Lys Pro Glu Glu Arg Ala Gln Tyr Lys Ser Met Pro Val Val
245 250 255
ttc aac atc gag aag ggg ttc ttc ttc gag ccg gat gag gag cgt ggt 816
Phe Asn Ile Glu Lys Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asp Glu Glu Arg Gly
260 265 270
gaa atc aag atc tgc gac gaa cac ccc ggg tac acg aat atg acc acg 864
Glu Ile Lys Ile Cys Asp Glu His Pro Gly Tyr Thr Asn Met Thr Thr
275 280 285
ggg gcc gac ggc cgc gtg agg agc att ccc ttc gag aag acg cag gtt 912
Gly Ala Asp Gly Arg Val Arg Ser Ile Pro Phe Glu Lys Thr Gln Val
290 295 300
cct cga gaa gcg gag atg cgc gtc cgc aag ctt ctg tct gaa acg atg 960
Pro Arg Glu Ala Glu Met Arg Val Arg Lys Leu Leu Ser Glu Thr Met
305 310 315 320
cct cag ctt gcg gac cgg ccg ttc agt ttc gca agg atc tgc tgg tgt 1008
Pro Gln Leu Ala Asp Arg Pro Phe Ser Phe Ala Arg Ile Cys Trp Cys
325 330 335
gcg gat acc ccc aat cgc gag ttt atc att gac cgt cat ccc gaa tac 1056
Ala Asp Thr Pro Asn Arg Glu Phe Ile Ile Asp Arg His Pro Glu Tyr
340 345 350
ccg tcg ctt gtt ctt ggg tgt ggt gct tca gga cga ggc ttc aaa tat 1104
Pro Ser Leu Val Leu Gly Cys Gly Ala Ser Gly Arg Gly Phe Lys Tyr
355 360 365
ctt ccc tcg atc gga agc atc atc gca gac gcc atg gag gac aaa acc 1152
Leu Pro Ser Ile Gly Ser Ile Ile Ala Asp Ala Met Glu Asp Lys Thr
370 375 380
ccg gca aaa atc cac aag ctg atc cgc tgg agc ccg gaa atc gcg atc 1200
Pro Ala Lys Ile His Lys Leu Ile Arg Trp Ser Pro Glu Ile Ala Ile
385 390 395 400
aac cgt aac tgg ggg gac aga tta ggt cga ttt gga ggg ccc aac cgg 1248
Asn Arg Asn Trp Gly Asp Arg Leu Gly Arg Phe Gly Gly Pro Asn Arg
405 410 415
gtc atg gat ttc aat gaa gtg aag gag tgg act aat gtc acc caa agg 1296
Val Met Asp Phe Asn Glu Val Lys Glu Trp Thr Asn Val Thr Gln Arg
420 425 430
gac atc tcg aag tta tag 1314
Asp Ile Ser Lys Leu
435
<210> 2
<211> 437
<212> PRT
<213> Aspergillus terreus
<400> 2
Met Pro Val Thr Lys Ser Ser Ser Ile Leu Ile Ile Gly Ala Gly Thr
1 5 10 15
Trp Gly Cys Ser Thr Ala Leu His Leu Ala Arg Arg Gly Tyr Thr Asn
20 25 30
Val Thr Val Leu Asp Pro Tyr Pro Val Pro Ser Ala Ile Ser Ala Gly
35 40 45
Asn Asp Val Asn Lys Ile Ile Ser Ser Gly Gln Tyr Ser Ser Lys Lys
50 55 60
Asp Glu Val Glu Val Asn Glu Ile Ile Ala Glu Gln Ala Phe Asn Gly
65 70 75 80
Trp Lys Asn Asp Pro Ile Phe Lys Pro Tyr Tyr His Asp Thr Gly Val
85 90 95
Val Met Ser Ala Thr Thr Gln Glu Gly Leu Glu Arg Leu Gly Val Arg
100 105 110
Val Arg Pro Glu Asp Glu Pro Asp Val Ala Glu Leu Thr Arg Pro Glu
115 120 125
Gln Phe Arg Gln Leu Ala Pro Gly Val Leu Lys Gly Asn Phe Pro Gly
130 135 140
Trp Arg Gly Tyr His Ile Arg Ser Asn Ala Gly Trp Ala His Ala Arg
145 150 155 160
Asn Ala Leu Val Gly Ala Ala Arg Glu Ala Gln Arg Leu Gly Val Arg
165 170 175
Phe Val Ala Gly Ser Pro Gln Gly Arg Val Ile Thr Leu Ile Phe Glu
180 185 190
Asn Asn Asp Val Lys Gly Ala Val Thr Ala Asp Gly Lys Ile Trp Arg
195 200 205
Ala Glu Gln Thr Ile Leu Cys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gln Phe Leu
210 215 220
Asp Phe Lys Asp Gln Leu Arg Pro Ser Ala Trp Thr Leu Val His Ile
225 230 235 240
Gln Leu Lys Pro Glu Glu Arg Ala Gln Tyr Lys Ser Met Pro Val Val
245 250 255
Phe Asn Ile Glu Lys Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asp Glu Glu Arg Gly
260 265 270
Glu Ile Lys Ile Cys Asp Glu His Pro Gly Tyr Thr Asn Met Thr Thr
275 280 285
Gly Ala Asp Gly Arg Val Arg Ser Ile Pro Phe Glu Lys Thr Gln Val
290 295 300
Pro Arg Glu Ala Glu Met Arg Val Arg Lys Leu Leu Ser Glu Thr Met
305 310 315 320
Pro Gln Leu Ala Asp Arg Pro Phe Ser Phe Ala Arg Ile Cys Trp Cys
325 330 335
Ala Asp Thr Pro Asn Arg Glu Phe Ile Ile Asp Arg His Pro Glu Tyr
340 345 350
Pro Ser Leu Val Leu Gly Cys Gly Ala Ser Gly Arg Gly Phe Lys Tyr
355 360 365
Leu Pro Ser Ile Gly Ser Ile Ile Ala Asp Ala Met Glu Asp Lys Thr
370 375 380
Pro Ala Lys Ile His Lys Leu Ile Arg Trp Ser Pro Glu Ile Ala Ile
385 390 395 400
Asn Arg Asn Trp Gly Asp Arg Leu Gly Arg Phe Gly Gly Pro Asn Arg
405 410 415
Val Met Asp Phe Asn Glu Val Lys Glu Trp Thr Asn Val Thr Gln Arg
420 425 430
Asp Ile Ser Lys Leu
435
Claims (7)
1. 一种热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶，其特征在于： 其氨基酸序列为SEQ ID.No.2所示序列。
2. 一种编码权利要求1所述的热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶的多核苷酸，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID.No.1所示序列。
3. 一种热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：
1) 菌体的获得：培养含有重组质粒的大肠杆菌菌种，加入IPTG诱导2-8小时，离心收集菌体，收集的菌体用缓冲液重新悬浮，超声破碎，离心收集上清；
2) 硫酸铵沉淀：使用硫酸铵溶液对步骤1)所得上清液进行分级沉淀，将最后收集得到的沉淀溶于buffer A中，得到粗提液；
3) 亲和层析：用buffer A平衡镍柱，再将步骤2)得到的粗提液上镍柱吸附，吸附结束后，用咪唑溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液；
4) 透析：将步骤3)中的洗脱液装至透析袋中，置于4℃透析液中，并磁力搅拌透析12-24小时，即得到热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶。
4. 根据权利要求3所述的一种热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶的制备方法，其特征在于：所述buffer A的组成为：磷酸钾缓冲液10-100 mM，pH 8.0， NaCl 100-1000mM。
5. 根据权利要求3所述的一种热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶的制备方法，其特征在于：所述咪唑溶液的组成为：磷酸钾缓冲液10-100 mM，pH 8.0， NaCl 100-1000mM，咪唑 20mM-1000mM。
6. 根据权利要求3所述的一种热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶的制备方法，其特征在于：所述透析液的组成为：磷酸钾缓冲液10-100 mM，pH 8.0，NaCl 100-1000mM。
7. 根据权利要求3所述的一种热稳定性高的果糖赖氨酸氧化酶的制备方法，其特征在于：所述重组质粒通过将基因FAOD-MK18连接至pET-22b载体上获得。
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