CN105671011B - 细菌类漆酶laclK的基因和蛋白及应用 - Google Patents

细菌类漆酶laclK的基因和蛋白及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种细菌类漆酶laclK的蛋白，该蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％的一致性，并且具有漆酶活性。本发明还提供了一种细菌类漆酶laclK的基因，该基因编码如上所述的细菌类漆酶laclK的蛋白。本发明还提供了一种脱色的方法，该方法包括：将待脱色的物料与如上所述的细菌类漆酶laclK的蛋白在酶促反应条件下接触。本发明还提供了如上所述的细菌类漆酶laclK的蛋白在染料的检测分析和印染废水的处理中的应用。本发明的细菌类漆酶laclK具有较好的长期稳定性和耐热性，能够在更广阔的适用范围内得以应用。

Description

细菌类漆酶laclK的基因和蛋白及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种细菌类漆酶laclK的蛋白、编码该蛋白的基因、该蛋白的应用以及一种脱色的方法。
背景技术
染料广泛应用于纺织染色、纸张、化妆品、食品等行业。工业上，全世界每年使用的染料和色素有近10000种，超过7×105吨。在染色过程中，有10-15％的染料随着废水排放。有色工业废水水质成分复杂，毒性大，严重危害到水生生物和人类的健康。所以废水中染料的去除或降解对生态环境和生物健康都具有极其重要的意义。
目前处理染料废水的方法有物理法、化学法及生物法。物理法和化学法存在有很多不足，如高成本，低效率，条件限制，其他废水成分的干扰，形成毒性更大的副产物以及密集的能源需求等。生物法主要是依靠微生物合成的酶，如漆酶，细胞色素P450，木质素降解酶等。生物法具有高效、无二次污染、运行成本低、绿色环保的优势，是处理染料废水的有效手段。其中，以漆酶的应用最为广泛。
漆酶(Laccase)是指苯二酚：氧-氧化还原酶(benzenediol:oxygenoxidoreductases,EC 1.10.3.2)，是催化多种芳香类底物氧化并同时将分子氧还原为水的蓝色多铜离子氧化酶(blue multicopper oxidases,MCO)。漆酶可以借助氧将对苯二酚(氢醌)氧化成对苯醌。田彦六郎(1883)在漆树的树液中发现能使“树漆”氧化硬化的酶，后来贝特兰德(G.E.Bertrand，1894)详细地研究了东南亚产的漆中的酶，命名为漆酶。漆酶广泛分布于植物和真菌中，且不同物种中的漆酶的分子量各不相同，在30-70kDa之间。漆酶独特的催化特性使其在生物检测中有广泛的应用，作为高效的生物检测器而成为底物、辅酶、抑制剂等成分分析的有效工具和手段。漆酶构成的生物检测器主要有两种：漆酶电极和漆酶酶标。
但是，现有的漆酶的长期稳定性和耐热性较差，因此限制了漆酶的适用范围。
发明内容
本发明的目的是提高漆酶的长期稳定性和耐热性，提供一种适用范围更广的漆酶。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种细菌类漆酶laclK的蛋白，其中，该蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％的一致性，并且具有漆酶活性。
另一方面，本发明还提供了一种细菌类漆酶laclK的基因，该基因编码如上所述的细菌类漆酶laclK的蛋白。
再一方面，本发明还提供了一种脱色的方法，其中，该方法包括：将待脱色的物料与如上所述的细菌类漆酶laclK的蛋白在酶促反应条件下接触。
再一方面，本发明还提供了如上所述的细菌类漆酶laclK的蛋白在染料的检测分析和印染废水的处理中的应用。
通过上述技术方案，本发明的细菌类漆酶laclK的蛋白的最适反应温度为65℃，60℃保持6d酶活无损失，80℃半衰期为83h；在pH 2.5、4℃条件下保存7d，剩余酶活超过70％，即具有较好的长期稳定性和耐热性，因此能够在更广阔的适用范围内得以应用。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是SDS-PAGE电泳分析LaclK蛋白的结果。其中，由左至右的泳道分别为蛋白Maker、菌体裂解上清、菌体裂解沉淀、纯化的LaclK。
图2是实施例2中给酶量对乙基紫脱色的影响的结果图。
图3是实施例2中时间对乙基紫脱色的影响的结果图。
图4是实施例2中乙基紫浓度对乙基紫脱色的影响的结果图。
图5是实施例2中pH值对乙基紫脱色的影响的结果图。
图6是实施例2中卤离子对乙基紫脱色的影响的结果图。
图7是实施例2中有机试剂对乙基紫脱色的影响的结果图。
图8是实施例4中LaclK酶活随温度和时间变化的情况的结果图。
图9是实施例5中LaclK对多种染料进行脱色的结果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种细菌类漆酶laclK的蛋白，其中，该蛋白的氨基酸序列与SEQ IDNO:1具有至少90％的一致性，并且具有漆酶活性。
其中，SEQ ID NO:1的序列为MTTTIYTNNEQVLMGISLQDDTRPEKNNMALHVCENPETIIQNREHLAASIGHSLQDFVCANQTHSATYYKVTAADKGRGTLRADDAIPATDALYTFEPNIVLSSFTADCVPVLFYATDSTLIGAIHSGWQGTVKEISLKTFTHLKEHEHVDLTNVRVQIGTALSQEKFEVDEDVYTKFKTLGYANDWMYFKDATQKYHIDNQQTVKKQCELAGIPAENITIENVCTFKSDSGFSYRQHKQAGRHLSFIVRK。
其中，所述漆酶活性是指苯二酚：氧-氧化还原酶(benzenediol:oxygenoxidoreductases,EC 1.10.3.2)的活性。该活性可以按照酶学委员会(EnzymeCommission)规定的标准进行测定。
其中，优选地，该蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少95％的一致性，更优选具有至少99％的一致性；特别优选地，该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列。
本发明还提供了一种细菌类漆酶laclK的基因，其中，该基因编码如上所述的细菌类漆酶laclK的蛋白。
其中，可以按照如上所述的细菌类漆酶laclK的蛋白的氨基酸序列，依据密码子对照表，得到编码如上所述的细菌类漆酶laclK的蛋白的基因的核苷酸序列。
其中，特别优选地，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的序列。
本发明还提供了一种脱色的方法，其中，该方法包括：将待脱色的物料与如上所述的细菌类漆酶laclK的蛋白在酶促反应条件下接触。
其中，所述酶促反应条件可以包括：温度为40-100℃，优选为55-70℃，更优选为60-65℃。
其中，所述酶促反应条件可以包括：时间为1-20天，优选为6-20天，更优选为10-20天。
优选地，所述酶促反应条件还包括：所述酶促反应使用2,2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)作为调节剂。2,2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)的使用浓度可以为0.01-1mM。
其中，由于本发明的细菌类漆酶laclK具有优异的热稳定性，优选地，该方法还包括：将待脱色的物料与如上所述的细菌类漆酶laclK的蛋白混合后加热至90-130℃。其中，加热至90-130℃的操作可以在酶促反应之前或酶促反应进行的过程中进行。加热至90-130℃的时间没有特别的要求，可以为10-150小时。加热至90-130℃后，本发明的细菌类漆酶laclK的蛋白仍然能够保留漆酶活性不丧失。
其中，所述待脱色的物料包括三苯甲烷类染料、偶氮类染料和酚类染料中的至少一种；优选地，所述三苯甲烷类染料包括孔雀石绿、灿烂绿、结晶紫、碱性品红、乙基紫和维多利亚蓝B中的至少一种，所述偶氮类染料包括刚果红和/或甲基红；所述酚类染料包括亚甲基蓝、甲苯胺蓝、藏红T和溴酚蓝中的至少一种。
本发明还提供了如上所述的细菌类漆酶laclK的蛋白在染料的检测分析和印染废水的处理中的应用。
其中，本发明的LaclK脱色乙基紫的pH范围可以在5-9，优选为6-9，更优选为7-9。
实施例1
使用购自中国农业微生物菌种保藏管理中心的华癸库特氏菌(Kurthia huakuiiLAM0618T)作为原始菌，扩大培养并提取其基因组DNA作为扩增模版；该华癸库特氏菌是本发明的发明人发现并已经在学术期刊文献中公开的。
使用引物(CGC GGATCC ATGACAACAACAATTTATACG，SEQ ID NO:5；和，CCG CTCGAGTTACTTTCGCACGATAAAGCT，SEQ ID NO:6)对上述扩增模版进行PCR扩增，并且使用BamHI和XhoI内切酶对扩增产物进行酶切并克隆至表达载体pET28a中，得到pET28a-laclK原核表达质粒，经测序验证，该pET28a-laclK原核表达质粒中包含如SEQ ID NO:3所示的外源基因表达序列，并能正确表达如SEQ ID NO:1所示的蛋白。
将上述pET28a-laclK原核表达质粒导入E.coli BL21(DE3)细胞中，得到E.coliBL21(DE3)/pET28a-laclK原核表达菌株。
LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃、180r/min摇床培养到OD600≈0.6，加入终浓度为0.2mM的IPTG和0.2mM CuSO4·5H2O，16℃、120r/min摇床继续培养16h,诱导LaclK蛋白的表达。
非变性条件下6×His标签重组LaclK蛋白的纯化参考QIAexpress Ni-NTA FastStart Handbook手册操作。利用Ni-NTA柱亲和纯化蛋白，洗脱液经50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液反复超滤，脱盐和除去咪唑。纯化的蛋白融于50mM Tris-HCl(pH 8.0)，4℃保存备用。SDS-PAGE电泳分析LaclK蛋白，结果如图1所示，表明目的蛋白LaclK已获得纯化。
以2,6-二甲氧基苯酚为底物测定酶活力，测定前3min在60℃、pH 7.0的反应体系内468nm处吸光值线性变化情况。酶活力单位(U)定义为每分钟氧化1μmol 2,6-二甲氧基苯酚所需的酶量。以2,6-二甲氧基苯酚为底物，LaclK比酶活为0.43U/mg。
实施例2
本实施例对实施例1得到的LaclK进行表征。
制备1mL的脱色体系，其包括50mM Na2HPO4-KH2PO4(pH 7.0)缓冲液、不同终浓度的乙基紫、LaclK、卤离子和有机试剂以及一定浓度的NO3 -、SO4 2-和腐殖酸。各体系在60℃避光反应1个小时，在最大吸收波长596nm处检测吸收值。
脱色率(％)＝[(A0-At)/A0]×100
A0、At分别为对照组和实验组反应t小时后在596nm处的吸光值。对照组不添加酶液以等量的缓冲液代替，每组三个重复实验。
以10μM乙基紫为底物，测定给酶量25-300U/L时的脱色率变化。以20μM乙基紫为底物，给酶量200U/L，测定不同脱色时间(20-180min)脱色率的变化。选择不同浓度(10-100μM)的乙基紫为底物，在给酶量200U/L的条件下，测定其脱色情况。以20μM乙基紫为底物，给酶量200U/L，在不同pH(3.0-10.0)条件下测定脱色率。pH缓冲体系分别为50mM柠檬酸-柃檬酸钠缓冲液(pH 3.0～5.0)，50mM Na2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH6.0-7.0)，50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-9.0)，50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0-10.0)。以20μM乙基紫为底物，给酶量200U/L，测定不同浓度(10-1000mM)的卤离子(F-、Cl-、Br-、I-)对脱色的影响。以20μM乙基紫为底物，给酶量200U/L，考察不同浓度(5％-30％，v/v)的有机试剂(甲醇、乙醇和二甲基亚砜)对脱色的影响。以20μM乙基紫为底物，给酶量200U/L，测定NO3 -(20mg L-1)和SO4 2-(300mg L-1)对脱色的影响。
图2为给酶量对乙基紫脱色的影响；在给酶量为100U/L的条件下，LaclK对10μM乙基紫脱色率为79.9％；当给酶量达到200U/L，脱色率增至91.2％；而继续增加给酶量，脱色率不再升高。
图3为时间对乙基紫脱色的影响；反应20min，200U/L LaclK对20μM乙基紫脱色率为45.6％；在1h后脱色率超过了80％；随着时间的延长，脱色率基本保持稳定，为83％左右。
图4为乙基紫浓度对脱色的影响；随着乙基紫浓度的增加，脱色率降低。乙基紫浓度低于50μM时，脱色率高于57％；当浓度达到100μM时，脱色率仅为5％。
图5为pH值对脱色的影响；LaclK脱色乙基紫的最适pH在7.0左右，在pH 5～9内，保持着较高的脱色率，超过了51％，表明LaclK具有广泛的pH作用范围，在中性偏碱条件下也能脱色乙基紫，这是其它真菌漆酶所不具有的。
图6为卤离子对脱色的影响。纺织工业排放的废水中通常含有大量的卤离子，良好的耐卤特性是酶的工业应用所需要的。卤离子对漆酶的抑制作用表现在Cl-和Br-作为电子供体的竞争性抑制剂，而F-作为非竞争性抑制剂。此外，卤离子还能结合漆酶活性中心的铜离子(type 2和type 3)发挥抑制作用。可能由于LaclK不存在典型的type 2和type 3铜离子，所以卤离子对其抑制作用不是很明显。即使存在1M NaCl、NaF和NaBr时，乙基紫的脱色率还分别达到53.4％、44.3％和58.0％。
图7为有机试剂对脱色的影响。有机试剂作为良好的溶剂，酶在有机试剂中的反应可以拓宽酶的应用领域。当脱色体系中存在5％的甲醇、乙醇和二甲基亚砜时，脱色率由83.6％(不加有机试剂)分别变为79.9％、68.9％和73.9％；当甲醇、乙醇和二甲基亚砜浓度增大到20％时，其脱色率分别还有36.1％、10.0％和53.4％。
表1表示NO3 -和SO4 2-对乙基紫脱色的影响。NO3 -和SO4 2-经常出现在纺织工业排放的废水中。表1的结果表明20mg L-1的NO3 -和300mg L-1的SO4 2-对脱色率影响甚微。
表1
介质 脱色率(％)
CK 83.6±1.1
NO<sub>3</sub><sup>-</sup>(20mg L<sup>-1</sup>) 82.5±1.7
SO<sub>4</sub><sup>2-</sup>(300mg L<sup>-1</sup>) 81.0±0.4
实施例3
本实施例对实施例1得到的LaclK进行表征。
使用ABTS(2,2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))、2,6-DMP(2,6-二甲氧基苯酚，溶于无水乙醇)和L-多巴胺作为底物，检测对不同底物的最适pH值、Km(mM)、Kcat(s-1)和Kcat/Km(mM-1s-1)，结果如表2所示。
表2
底物 最适pH K<sub>m</sub>(mM) K<sub>cat</sub>(s<sup>-1</sup>) K<sub>cat</sub>/K<sub>m</sub>(mM<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>)
ABTS 2.5 0.17 0.073 0.43
2,6-DMP 7.0 0.15 0.350 2.33
L-多巴胺 6.0 0.11 1.090 9.91
实施例4
本实施例对实施例1得到的LaclK进行表征。
使用ABTS(2,2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))为底物，在20-100℃的温度范围内测定酶活随温度变化的情况，以确定最适温度。然后在60℃、80℃和90℃下测定酶活随时间变化的情况，并且使用OriginPro 8.6软件计算半衰期。结果分别如图8中的a-d所示。可以看出，LaclK最适反应温度为65℃，60℃保持6d酶活无损失，80℃半衰期83h，90℃半衰期为18小时。目前已报到最耐热的细菌漆酶是来自Thermus thermophilus HB27的Tth-laccase，Tth-laccase在80℃半衰期仅为14h。
实施例5
本实施例对实施例1得到的LaclK进行表征。
使用实施例1得到的LaclK，在添加或不添加1mM的调节剂(2,2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)或乙酰丁香酮)的情况下，对多种染料进行脱色。染料包括：三苯甲烷类染料(孔雀石绿、灿烂绿、结晶紫、碱性品红、乙基紫和维多利亚蓝B)、偶氮类染料(刚果红和/或甲基红)、酚类染料(亚甲基蓝、甲苯胺蓝、藏红T和溴酚蓝)。结果如图9的a-d所示，其中，图9c表示刚果红的脱色结果，图9d表示灿烂绿的脱色结果。从图9的结果可以看出实施例1得到的LaclK对多种染料均能达到显著地脱色效果。
实施例6
在SEQ ID NO:1所示的蛋白中发生点突变得到的SEQ ID NO:2所示的蛋白(由SEQID NO:4所示的核酸编码)，作为laclK，其酶活力与SEQ ID NO:1所示的蛋白基本相同。其中，SEQ ID NO:1的第241位为Q谷氨酰胺，SEQ ID NO:2的第241位为R精氨酸。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (3)

1.一种脱色的方法，其特征在于，该方法包括：将待脱色的物料与细菌类漆酶laclK在酶促反应条件下接触；
该漆酶的氨基酸序列为SEQ ID NO : 1所示的序列；该漆酶最适反应温度为65℃，在60℃保持6d酶活性无损失，在80℃时的半衰期为83h；
所述酶促反应条件包括：所述酶促反应使用2,2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)作为调节剂；
所述待脱色的物料包括三苯甲烷类染料、偶氮类染料和酚类染料中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酶促反应条件包括：温度为60-65℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述三苯甲烷类染料包括孔雀石绿、灿烂绿、结晶紫、碱性品红、乙基紫和维多利亚蓝B中的至少一种，所述偶氮类染料包括刚果红和/或甲基红；所述酚类染料包括亚甲基蓝、甲苯胺蓝、藏红T和溴酚蓝中的至少一种。
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CN103820355A (zh) * 2013-11-28 2014-05-28 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 一种华癸库特氏菌及微生物菌剂和它们的应用

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