TW201722455A - Nafld/nash預防及/或治療劑 - Google Patents

Abstract

一種包含梅果汁濃縮物或其處理物的非酒精性脂肪肝疾患（NAFLD），特別是非酒精性脂肪肝炎（NASH）的預防及/或治療劑，因為該預防及/或治療劑是利用植物所包含的成分或其處理物而獲得，所以安全且攝取容易。 將梅果汁的濃縮物或其處理物，對（STZ）誘發NAFLD模型小鼠或STZ誘發NASH模型小鼠口服給藥，確認可減輕肝纖維化。

Description

NAFLD/NASH預防及/或治療劑

本發明是關於一種包含梅果汁的濃縮物或其處理物的非酒精性脂肪肝疾患（NAFLD）預防及/或治療劑，特別是非酒精性脂肪肝炎（NASH）的預防及/或治療劑，或像這樣的預防及/或治療劑的製備方法。

肝臟是具有500種以上的多樣功能的最大臟器，進行著除了將由腸吸收的各種營養素再加工並供給至其他臟器，儲藏剩餘部分之外，膽汁的的產生或分泌，以及解毒或排泄等生命維持所需的許多工作。但是，此臟器因不規律的生活、壓力、病毒、藥物、酒精、營養不良、肝循環系統障礙等各種因素導致容易受損，產生急性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化等疾患。特別是我國成人15％以上（估計150～200萬人）有脂肪肝，在青少年層擴大成為大的社會問題。

脂肪肝主要被認為是關連於以大量攝取酒精為原因的酒精性肝障礙的病態。酒精性脂肪肝是指酒精攝取者因堆積脂肪在肝臟，肝細胞內看到脂肪滴，進一步沈積脂肪（特別是中性脂肪）於肝細胞引起肝障礙的病態。但是，近年來即使是非酒精攝取者也出現類似酒精性肝障礙的研究出現。

做為在非酒精攝取者的脂肪性肝障礙的病態，可列舉非酒精性脂肪肝疾患（Non-alcoholic fatty liver disease：NAFLD）。雖然NAFLD被發現認為是中性脂肪沈積在肝細胞的脂肪肝，但卻是其患者約90％可藉由適當飲食與運動療法改善症狀的單純性脂肪肝。

但是，在上述NAFLD的約10％病例中，已知是表示進行性的病態的非酒精性脂肪肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis：NASH）。關於NASH的病理組織的進行過程並沒有統一見解，累積脂肪的肝細胞因變性或壞死，被認為是在肝組織伴隨炎症或纖維化的脂肪性肝炎，已獲得固定的共識。此外，代謝症候群、肥胖、糖尿病、高脂血症、高血壓、高尿酸血症等，在具有多重風險因素的對象，從脂肪肝到NASH的進行，進一步進行到更嚴重的肝纖維化、肝硬化、肝癌的機率被認為更高。

另一方面，梅果肉已知自古以來做為對恢復疲勞、食物中毒等的家庭藥，含有梅肉萃取物的中和處理物的自噬誘導用食品（參照例如專利文獻1），或含有梅肉萃取物的中和處理物的病毒性肝炎患者的肝功能改善劑（參照例如專利文獻2）等被提出。又，以壓榨梅製作的梅榨汁液經加熱濃縮20倍之物，再以NaOH中和後加熱殺菌的梅肉萃取物，已報告對半乳糖胺鹽酸鹽誘發的急性肝衰竭大鼠有效果（參照例如非專利文獻1）。 〔先前技術文獻 〕 〔專利文獻 〕

〔專利文獻1〕特開2007-143452號公報 〔專利文獻2〕特開2011-201841號公報 〔非專利文獻 〕

〔非專利文獻1〕World Gastroenterol. 2012, Vol.18(31) 4118-4126

〔發明所欲解決的問題 〕 本發明的課題在於提供一種藉由利用植物所包含的成分或其處理物而獲得的安全且攝取容易的，用來預防及/或治療NAFLD，特別是用來預防及/或治療NASH的，NAFLD，特別是NASH的預防及/或治療藥。 〔解決問題的手段 〕

關於安全且容易攝取的植物等天然物所包含的成分，雖然本案發明人已經發現改善NAFLD，特別是改善NASH的成分，但已知對於以病毒感染為主因的病毒性肝炎，或以施用毒物等為原因的急性肝炎有效果的梅果汁濃縮物或其處理物，將其施用於鏈脲佐菌素（STZ）誘發NASLD模型小鼠或STZ誘發NASH模型小鼠，發現可減輕在NAFLD，特別是在NASH的病態之一的肝纖維化，完成了本發明。

也就是說，本發明如以下所述。 （1）一種非酒精性脂肪肝疾患（NAFLD）的預防及/或治療劑，包含梅果汁的濃縮物或其處理物。 （2）如上述（1）所述的預防及/或治療劑，其中濃縮物的處理物是濃縮物的中和處理物。 （3）如上述（1）或（2）所述的預防及/或治療劑，其中濃縮物是加熱濃縮物。 （4）如上述（1）～（3）中任一所述的預防及/或治療劑是用於口服給藥。 （5）如上述（1）～（4）中任一所述的預防及/或治療劑是做為補充料來使用。 （6）如上述（1）～（5）中任一所述的預防及/或治療劑是減輕肝組織的纖維化。 （7）如上述（1）～（6）中任一所述的預防及/或治療劑，其中非酒精性脂肪肝疾患（NAFLD）是非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。 （8）一種非酒精性脂肪肝疾患（NAFLD）的預防及/或治療劑的製備方法，其特徵在於包含以下步驟：（a）從青梅製備梅榨汁液：以及（b）將以步驟（a）所製備的梅榨汁液濃縮來製備梅果汁濃縮物。 （9）如上述（8）所述的製備方法，其中在步驟（b）的濃縮是加熱濃縮。 （10）如上述（8）或（9）所述的製備方法，更包含以下步驟：（c）將以步驟（b）所製備的梅果汁濃縮物或梅果汁加熱濃縮物中和，來製備梅果汁濃縮中和物或梅果汁加熱濃縮中和物。 （11）如上述（8）～（10）中任一所述的製備方法，其中非酒精性脂肪肝疾患（NAFLD）是非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。 （12）一種食品，包含梅果汁的濃縮物或其處理物。 （13）如上述（12）所述的食品，其中濃縮物的處理物是濃縮物的中和處理物。 （14）如上述（12）或（13）所述的食品，其中濃縮物是加熱濃縮物。 （15）如上述（12）～（14）中任一所述的食品，其中食品是病人用食品、特定保健用食品或表示機能性食品。 （16）一種食品添加劑，包含梅果汁的濃縮物或其處理物。 （17）如上述（16）所述的食品添加劑，其中濃縮物的處理物是濃縮物的中和物。 （18）如上述（16）或（17）所述的食品添加劑，其中濃縮物是加熱濃縮物。 （19）如上述（16）～（18）中任一所述的食品添加劑，使用於病人用食品、特定保健用食品或表示機能性食品。 （20）一種用來在非酒精性脂肪肝疾患（NAFLD）的預防及/或治療使用的梅果汁濃縮物或其處理物。 （21）上述（20）所述的梅果汁濃縮物或其處理物，其中濃縮物的處理物是濃縮物的中和處理物。 （22）上述（20）或（21）所述的梅果汁濃縮物或其處理物，其中濃縮物是加熱濃縮物。 （23）上述（20）～（22）中任一所述的梅果汁濃縮物或其處理物是用於口服給藥。 （24）上述（20）～（23）中任一所述的梅果汁濃縮物或其處理物是做為補充料來使用。 （25）上述（20）～（24）中任一所述的梅果汁濃縮物或其處理物是減輕肝組織的纖維化。 （26）上述（20）～（25）中任一所述的梅果汁濃縮物或其處理物，其中非酒精性脂肪肝疾患（NAFLD）是非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。 （27）一種預防及/或治療非酒精性脂肪肝疾患（NAFLD）的方法，包含：將有效量的梅果汁的濃縮物或其處理物給予對象。 （28）上述（27）所述的方法，其中濃縮物的處理物是濃縮物的中和處理物。 （29）上述（27）或（28）所述的方法，其中濃縮物是加熱濃縮物。 （30）上述（27）～（29）中任一所述的方法是用於口服給藥。 （31）上述（27）～（30）中任一所述的方法是做為補充料來使用。 （32）上述（27）～（31）中任一所述的方法是減輕肝組織的纖維化。 （33）上述（27）～（32）中任一所述的方法，其中非酒精性脂肪肝疾患（NAFLD）是非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。 （34）一種用來製造有效量的梅果汁的濃縮物或其處理物的，非酒精性脂肪肝疾患（NAFLD）的預防及/或治療劑的方法， （35）上述（34）所述的方法，其中濃縮物的處理物是濃縮物的中和處理物。 （36）上述（34）或（35）所述的方法，其中濃縮物是加熱濃縮物。 （37）上述（34）～（36）中任一所述的方法是用於口服給藥。 （38）上述（34）～（37）中任一所述的方法是做為補充料來使用。 （39）上述（34）～（38）中任一所述的方法是減輕肝組織的纖維化。 （40）上述（34）～（39）中任一所述的方法，其中非酒精性脂肪肝疾患（NAFLD）是非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。 〔發明效果 〕

根據本發明，藉由減輕NAFLD，特別是NASH患者的肝組織的纖維化，可治療NAFLD，特別是NASH，藉由降低非酒精攝取者的NAFLD，特別是NASH的發病率，可預防NAFLD，特別是NASH。

做為本發明的NAFLD，特別是NASH的預防及/或治療劑，若為包含濃縮物或其處理物的預防劑及/或治療劑，則沒有特別限定，但較佳為用於口服給藥。做為上述濃縮物，可較佳例示為加熱濃縮物，做為這些濃縮物的處理物，可列舉這些濃縮物的稀釋及/或中和物（以下將濃縮物的中和處理物稱為「梅果汁濃縮中和物」）。本發明的NAFLD或NASH預防及/或治療劑，可以以醫藥或補充料的形態來使用。做為本發明的其他態樣，可列舉用來使用在NAFLD，特別是NASH的預防及/或治療的梅果汁的濃縮物或其處理物、在NAFLD或NASH的預防及/或治療劑的製造的梅果汁的濃縮物或其處理物的使用、或將梅果汁的濃縮物或其處理物口服提供給對象的NAFLD，特別是NASH的預防及/或治療方法。

做為本發明的NAFLD，特別是NASH的預防及/或治療劑的製備方法，若具備以下步驟：（a）從青梅製備梅榨汁液：以及（b）將以步驟（a）所製備的梅榨汁液（加熱）濃縮來製備梅果汁濃縮物，則沒有特別限制，但較佳為具備：（c）將以步驟（b）所製備的梅果汁濃縮物或梅果汁加熱濃縮物中和，來製備梅果汁濃縮中和物或梅果汁加熱濃縮中和物。

做為在本發明的NASH，在不認為有C型肝炎病毒（HCV）或B型肝炎病毒（HBV）等病毒感染，且明顯沒有飲酒史的的非酒精攝取者的肝臟組織中，可舉出伴隨著脂肪變性和炎症性細胞浸潤的肝組織的炎症病態及進行纖維化的病態。肝組織的纖維化是指對應開始表現出脂肪變性或炎症性變化跡象的肝細胞壞死或損傷所導致的實質細胞的脫落或組織的功能降低而發生的，包含活性化星狀細胞或肌成纖維細胞的纖維母細胞的累積或纖維母細胞做出的膠原蛋白等的細胞間基質累積等導致的脫落組織的置換，但肝組織的纖維化雖然對物理形態的維持有貢獻，卻並非恢復肝組織者。過度的膠原蛋白等纖維性蛋白質的沈積，或隨著纖維母細胞的浸潤繁殖的組織硬化不只在局部，還廣泛地存在於肝臟組織，病態進一步進展，進展為更嚴重的肝纖維化與肝硬化。做為本發明的NAFLD，在非酒精攝取者的肝臟組織中，可舉出被認為是中性脂肪沈積於肝細胞的病態，除了上述NASH以外，雖然不滿足單純性脂肪肝、明確的炎症性細胞的聚集或明確的纖維化等NASH的定義，但包含看到局部的肝實質的脂肪變性壞死，或是小葉中心或肝門管區的間質擴張等的往NASH的轉移過程的病態。又，在血液檢查中，伴隨著血中的ALT值或AST值的輕度升高（通常的約2～4倍）的狀況多，特別是表現ALT顯著上升的狀況多。

做為本發明的NAFLD，特別是NASH的預防及/或治療劑的作用，可舉出減輕NASH患者的肝纖維化，做為確認有無肝纖維化或肝組織的炎症的方法，可舉出在藉由染色肝臟組織切片所製作的肝臟組織像中確認的方法。做為染色肝臟組織切的方法可舉出苯胺藍染色、三色染色、鍍銀染色法、阿贊-馬洛里染色法（Azan-Mallory stain）、 蘇木精-伊紅染色、天狼星紅染色、蘇木精染色/天狼星紅染色法等。其中，以如蘇木精的金屬錯鹽染料將核與細胞質染色後，親水性高分子的天狼星紅藉由結合陽離子性的金屬錯鹽染料，可強調纖維或其關連組織來染色，可較佳舉出蘇木精染色/天狼星紅染色法。

做為本發明的藉由NAFLD，特別是NASH的預防及/或治療劑的給予來減輕肝纖維化的情況，可舉出用顯微鏡等以目視來評價上述肝臟組織像，在給予後纖維化區域減少或消滅的情況，或藉由使用圖像分析程式提取染色陽性部位來分析上述肝臟組織像，在給予後染色陽性部位減少或消滅的情況。此外，在本發明的NASH的病態改善，是具有減輕肝纖維化來達成者，也有伴隨著血漿白蛋白值或血漿總蛋白值的增加的情況。又，上述肝纖維化減輕的情況，在方便上也可包含開始形成的肝纖維減輕導致肝臟組織恢復，或抑制肝纖維化開始。

做為本發明的NAFLD，特別是NASH預防及/或治療劑所給予的對象（人），可例示被診斷為NAFLD或NASH，需要治療NAFLD或NASH者；以及代謝症候群、肥胖、糖尿病、高脂血症、高血壓、高尿酸血症等NAFLD或NASH發病的可能性高者等；雖然沒有被診斷為NAFLD或NASH，但需要預防/希望預防NAFLD或NASH者。

做為本發明的NAFLD，特別是NASH預防及/或治療劑的給予態樣，可對應給予對象的健康狀態、症狀的輕重、年齡、體重、醫師的判斷等適當設定，但較佳為口服給藥。做為對人的口服給藥量是以梅果汁濃縮中和物的稀釋液（實施例3的1.7倍稀釋物）換算，可例示為30〜600毫克/公斤/日，較佳為40〜370毫克/公斤/日，更佳為80〜300毫克/公斤/日。

在本發明的NAFLD，特別是NASH預防及/或治療劑的製劑化，可對應需要施加其他任意成分。做為任意成分可舉出例如結晶性纖維素、明膠、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、滑石、植物性及動物性脂肪、油脂、膠、聚亞烷基二醇等的，藥學上容許的一般載體、黏合劑、穩定劑、溶劑、分散介質、增量劑、賦形劑、稀釋劑、pH緩衝劑、崩解劑、增溶劑、助溶劑等各種製劑用配合成分。

做為本發明的NAFLD，特別是NASH預防及/或治療劑的製備方法的步驟（a），可舉出從青梅製備梅榨汁液，可舉出例如對於青梅1，較佳為製備0.2～0.6的比例的梅榨汁液的步驟。具體來說，可例示藉由將粗破碎的青梅果肉或解凍的青梅果肉，以各種榨汁機或離心分離機榨汁，將梅榨汁回收，來製備梅榨汁液的步驟。做為獲得上述粗破碎的青梅果肉的方法，可舉出以攪拌機等破碎青梅的方法。青梅是立即使用採取後的青梅為較佳，或是採取後在製備梅榨汁液前立即冷凍保存為較佳。

做為本發明的NAFLD，特別是NASH預防及/或治療劑的製備方法的步驟（b），可舉出將以步驟（a）所製備的梅榨汁液濃縮來製備梅果汁濃縮物，較佳為加熱濃縮來製備梅果汁加熱濃縮物的步驟，可舉出例如對於青梅1，較佳為製備0.07～0.2，更佳為0.075～0.15，再更佳為的0.08～0.12的比例的梅果汁（加熱）濃縮物的製備步驟。具體來說，可舉出藉由將上述梅榨汁液減壓濃縮或是加熱沸騰並維持在100℃以上進行加熱處理，製備Brix值70～80％的梅果汁（加熱）濃縮物的步驟。

做為本發明的NAFLD，特別是NASH預防及/或治療劑的製備方法的步驟（c），雖然可舉出將以步驟（b）所製備的梅果汁（加熱）濃縮物中和，來製備梅果汁（加熱）濃縮中和物，但在中和前較佳為稀釋梅果汁（加熱）濃縮物。例如，可藉由添加對於上述梅果汁（加熱）濃縮物較佳為0.5～6.0，更佳為0.75～4.3，再更佳為1.0～2.0的比例的水或適當的溶劑，來製備梅果汁（加熱）濃縮物的稀釋溶液。

接下來，上述梅果汁（加熱）濃縮物的稀釋溶液被中和。具體來說，可藉由添加鹼性溶液至上述梅果汁（加熱）濃縮物的稀釋溶液，調整上述梅果汁（加熱）濃縮物的稀釋溶液的pH值成較佳為pH值5.0～8.0，更佳為pH值5.4～7.2，再更佳為pH值6.5～7.0，來製備梅果汁（加熱）濃縮中和物的溶液。做為上述鹼性溶液可例示NaOH水溶液、KOH水溶液。

從梅果汁（加熱）濃縮中和物溶液，也可以進一步以過濾器或離心分離除去非分散性的固形物或非流動性的固形物等不溶物。又，從梅果汁（加熱）濃縮中和物溶液，也可以在使用網孔除去不溶物後稀釋成製品。

在本發明的梅果汁（加熱）濃縮中和物，通常以特定倍率稀釋上述梅果汁（加熱）濃縮物。做為像這樣的特定倍率，可例示1.5～20倍，較佳為2～10倍，更佳為3～5倍。 本發明的梅果汁的濃縮物或其處理物，除了做為非酒精性脂肪肝疾患（NAFLD）的預防及/或治療劑來使用之外，也可以利用在食品領域。舉出例如，含有本發明的梅果汁的濃縮物或其處理物的各種食品（例如包含所謂健康食品的一般食品、特定特別用途食品、保健功能食品、食品素材、飲料）、食品添加劑等。特別用途食品包含病人用食品、特定保健用食品、孕產婦、哺乳婦用奶粉、嬰兒用製備奶粉、吞嚥困難者用食品。保健功能食品包含特定保健用食品、營養功能食品及表示功能性食品。本發明的梅果汁的濃縮物或其處理物，可特別適合用於病人用食品、特定保健用食品、表示功能性食品等的製造。本發明的梅果汁的濃縮物或其處理物可不添加其他物質，維持原本形態（糊狀）下做為食品來攝取。又，也可以配合需要以慣用手段來粉末化或顆粒化本發明的梅果汁的濃縮物或其處理物。再者，在添加米粉、油脂、澱粉、乳糖、麥芽糖、植物油粉、可可脂粉、硬脂酸等適當助劑於本發明的梅果汁的濃縮物或其處理物後，用慣用的手段，也可以成形成適合實用的形態例如糊、飲料、軟膠囊、無縫膠囊、硬膠囊、顆粒、丸劑等來供食用，又，也可以添加至各種食品例如主食麵包、甜麵包等麵包；果醬；軟餅乾；甜餅乾；仙貝等甜點；蛋糕；膠；速食麵、速食味噌湯、速食湯等速食食品；冰淇淋製品；優格、牛奶、飲料劑、清涼飲料（茶、咖啡、紅茶、果汁等）等來使用。在此情況下，本發明的梅果汁的濃縮物或其處理物的配合量是根據該食用組成物的種類或狀態等來適當設定。

以下，雖然根據實施例來更具體地說明本發明，但本發明的技術範圍並不受限於這些例示。實施例 1

［梅果汁濃縮物中和物的溶液製備］  採取後的青梅20公斤立即以攪拌機粉碎，將粗粉碎的果肉以利用離心力的榨汁機榨汁，回收榨汁來獲得梅榨汁液8公斤。使此梅榨汁液加熱沸騰約90小時來濃縮，在藉由維持100℃以上24小時進行加熱處理，獲得梅果汁加熱濃縮物0.4公斤（Brix75％）。

將梅果汁加熱濃縮物以大約等重量的水稀釋來做為梅果汁加熱濃縮物溶液，將8N NaOH水溶液加入此梅果汁加熱濃縮物溶液，中和至pH6.8，以純水稀釋來獲得梅果汁濃縮中和物（37 w/v％溶液）。像這樣的梅果汁濃縮中和物溶液以3000rpm離心分離，使不溶物沈澱。再者，用殺菌過濾器（0.2μm孔徑，莎多利斯（Sartorius）公司製造）來殺菌，除去不溶物來獲得梅果汁濃縮中和物溶液。實施例 2

[STZ誘發NASH模型小鼠的製作]  將鏈脲黴素（STZ）給予C57BL/6J小鼠，製作STZ誘導NASH模型小鼠。概述表示如下。

關於懷孕第17天的C57BL/6J小鼠（日本查爾斯河公司製造）30隻，在自由攝取γ-射線照射固體飼料（CRF-1，東方酵母工業公司製造），及自由飲用蒸餾水的環境下進行個別飼養，使其生產。子代小鼠是以4：1的比例，分成給予STZ的小鼠與不給予STZ的小鼠（標準小鼠）。

給予STZ的各小鼠，將出生日做為0日，在出生後第二天，用胰島素注射器（Maijekuta，日本泰爾茂（TERUMO）公司製造）將STZ（Sigma公司製造）的10毫克/毫升（0.1M檸檬酸緩衝劑pH4.5）溶液20μL在背部皮下給藥。STZ給藥後，直到達到4週齡為止以母乳營養飼養。達到4週齡，在STZ給藥後經過四週的當日，進行雌雄判斷，選擇雄性個體。同日對雄性個體禁食6小時後，使用簡單的血糖值測量裝置（Gurtest Neo sensor（グルテストＮｅｏセンサー），三和化學研究所製造），從尾靜脈採血，來測量血糖值。

禁食開始後6小時斷奶，這之後餵食高脂肪食物（HFD32，日本CLEA公司製造），做為STZ誘發NASH模型小鼠群來持續飼養。未進行STZ給藥的標準小鼠，餵食CRF-1來代替高脂肪食物。實施例 3

[梅果汁濃縮中和物的給予] （小鼠分群）  關於上述STZ誘發NASH模型小鼠群，在達到8週齡的當日，以頸靜脈採血法採取0.05毫升的血液。採取到的血液立即回收至含肝素的離心管中，以3000rpm離心分離10分鐘，得到血漿後，用「DRI-CHEM」（富士軟片公司）測量定ALT值。根據ALT值、體重及血糖值，用統計分析系統EXSUS7.7（CAC EXICARE公司製造），在以下檢討，以分層隨機分配進行分組成給予梅果汁濃縮中和物的小鼠群與控制組小鼠群。從分群日開始每經過一週，及屍體剖檢日測量體重。

（給予態樣）  達到8週齡的第二天，在實施例1製備的除去不溶物的梅果汁加熱濃縮中和物（溶液），進行以蒸餾水進行的1.7倍稀釋液（「梅果汁濃縮中和稀釋液」）的給予實驗。對給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠群與控制組小鼠群自由餵食HFD32，對標準小鼠群自由餵食CRF=1，在自由飲用蒸餾水的條件下進行飼養。然後從給藥開始日連續28天分別從上午9點到下午111點間使用一次，與從午後5點到午後7點間使用一次口胃管，對給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠群給予10毫升/公斤（體重）的梅果汁濃縮中和稀釋液，對控制組小鼠群給予10毫升/公斤（體重）的蒸餾水。

在梅果汁濃縮中和稀釋液給予實驗開始28天後的屍體剖檢日，12週齡的STZ誘發NASH模型小鼠進行2小時禁食，在戊巴比妥麻醉下從腹部大靜脈進行採血。獲得的血液立刻收集在有肝素的離心管中，以3000rpm離心分離10分鐘後得到血漿。確認以放血進行安樂死後，採取肝臟並將一部份浸漬於福馬林緩衝液。

（天狼星紅染色圖像）  對上述福馬林浸漬肝臟，製作石蠟切片。實施蘇木精染色及用天狼星紅染色試劑盒（日本Cosmo Bio公司）實施天狼星紅染色。施加天狼星紅染色的切片標本，以ALL-IN-ONE螢光顯微鏡（BZ-9000，Keyence公司製造）在10倍率物鏡下取得圖像，製作連接圖像。其結果表示在第1圖（a）〜（c）。

（結果）  從第1圖（a）可知，在不給予STZ的標準小鼠的肝臟，只確認成為天狼星紅陽性的膠原纖維在血管基底膜，不認為有疾患反應性的肝纖維化，但是從第1圖（b）可知，在不給予梅果汁濃縮中和稀釋液、給予STZ的控制組小鼠的肝臟，看到炎症細胞浸潤與天狼星紅陽性的膠原蛋白在肝細胞周圍擴張的影像，認為有肝纖維化（特別是箭頭部位）。另一方面，從第1圖（c）可知，在給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠的肝臟，沒有看到炎症細胞浸潤與纖維化。因此，梅果汁濃縮中和稀釋液口服給藥確認有使STZ誘發NASH模型小鼠的肝臟的炎症細胞浸潤與纖維化消滅的效果。

（天狼星紅染色陽性部位定量） 關於上述連接圖像，使用BZ-II圖像分析應用程式來提取天狼星紅陽性部位面積，標準小鼠（n=7）做為1的情況下的，算出控制組小鼠（n=18）與給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠（n=18）的個別比率，表示在第2圖。顯著差異檢定（學生t檢定）是以p＜0.05來判斷具有顯著差異。

（結果） 從第2圖可知，當標準小鼠（n=7）做為1的情況下，控制組小鼠的天狼星紅陽性部位的值為1.55，給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠的天狼星紅陽性部位的值是1.26，顯著減少（圖中的＊是在給予STZ的控制組小鼠群與給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠群的比較中，以上述顯著差異檢定，表示P值在0.05以下）。梅果汁濃縮中和稀釋液的口服給藥，確認有預防及/或治療NASH模型小鼠的肝臟的炎症細胞浸潤與纖維化的效果。

（血漿白蛋白值）  在失償性肝硬化患者的血清白蛋白濃度與累積存活率在相關關係，已知血清白蛋白濃度高者預後良好，所以對三種小鼠測量血漿中的白蛋白濃度。結果表示在第3圖。

（結果） 從第3圖可知，標準小鼠的血漿白蛋白濃度為1.91克/分升，控制組小鼠的血漿白蛋白濃度為1.77克/分升。另一方面，由於給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠的血漿白蛋白濃度為1.96克/分升，梅果汁濃縮中和稀釋液的口服給藥，確認達成血漿白蛋白值的增加，有達成生存率的上升的可能性（圖中的＊是在給予STZ的控制組小鼠群與給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠群的比較中，以學生t檢定進行顯著差異檢定，表示P值在0.05以下）。

（血漿總蛋白值）  因為已知因肝障礙進展使肝功能降低，在肝臟的蛋白質合成能力降低（Hepatology 1984 May-Jun;4(3):430-5），所以對三種小鼠測量血漿總蛋白質。結果表示在第4圖。

（結果） 從第4圖可知，標準小鼠的血漿總蛋白值是4.34克/分升，控制組小鼠的血漿總蛋白值是3.83克/分升。另一方面，因為給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠的天狼星紅血漿白蛋白值為4.10克/分升，所以梅果汁濃縮中和稀釋液的口服給藥，確認達成血漿總蛋白值的增加，有達成肝臟的蛋白質合成能力上升的可能性（圖中的＊是在給予STZ的控制組小鼠群與給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠群的比較中，以學生t檢定進行顯著差異檢定，表示P值在0.05以下）。

（肝功能指標） 關於三種小鼠，血漿中的天門冬胺酸胺基轉移酶（AST）濃度與丙胺酸胺基轉移酶（ALT）濃度是以富士DRI-CHEM生化學分析裝置來測量。合併實驗使用的小鼠體重，結果表示在第5圖（a）至第5圖（c）。

（結果） 從第5圖（a）可知，關於體重，控制組小鼠、給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠，一起相較於標準小鼠為減少。關於ALT值及AST值，控制組小鼠及給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠，相較於標準小鼠表示高值（圖中的n.s.是在給予STZ的控制組小鼠群與給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠群的比較中，以學生t檢定進行顯著差異檢定，表示P值比0.05大）。

[結論] 在8～12週齡的STZ誘發NASH模型小鼠中，當口服給予梅果汁濃縮中和稀釋液的情況下，AST、ALT值雖然沒有差異，但確認纖維化顯著減輕，認為有在梅果汁濃縮中和稀釋液的NASH的纖維化減輕效果。又，已確認即使到達12週齡也可以抑制肝纖維化的進行。又，已確認血中白蛋白值、總蛋白值是因給予梅果汁濃縮中和稀釋液而顯著上升，表示肝功能的改善。實施例 4

[STZ誘發NAFLD模型小鼠的製作] 在對達到5週齡的STZ誘發NAFLD模型小鼠，從達到5週齡的第二天，給予梅果汁濃縮中和稀釋液。

在梅果汁濃縮中和稀釋液給予實驗開始21天後的屍體剖檢日，8週齡的STZ誘發NASH模型小鼠進行2小時禁食，在戊巴比妥麻醉下從腹部大靜脈進行採血。獲得的血液立刻收集在有肝素的離心管中，以3000rpm離心分離10分鐘後得到血漿。確認以放血進行安樂死後，採取肝臟並將一部份浸漬於福馬林緩衝液。

（天狼星紅染色圖像） 對上述福馬林浸漬肝臟，製作石蠟切片。實施蘇木精染色及用天狼星紅染色試劑盒實施天狼星紅染色。施加天狼星紅染色的切片標本，以ALL-IN-ONE螢光顯微鏡在10倍率物鏡下取得圖像，製作連接圖像。其結果表示在第6圖（a）至第6圖（c）。

（結果）  從第6圖（a）可知，在不給予梅果汁濃縮中和稀釋液、給予STZ的控制組NAFLD模型小鼠的肝臟，認為有血管周圍累積炎症細胞，脂肪沈積於肝細胞以及天狼星紅陽性的膠原纖維化部分的擴張，確認NASH進行。另一方面，從第6圖（b）可知，在給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠肝臟，幾乎沒有炎症細胞浸潤、或肝細胞的脂肪沈積、血管周圍的纖維化擴張。因此，梅果汁濃縮中和稀釋液的口服給藥，確認有抑制STZ誘發NAFLD模型小鼠的肝臟的炎症細胞浸潤與纖維化的效果、改善或治療NAFLD、預防NASH的效果。

（天狼星紅染色陽性部位定量） 關於上述連接圖像，使用BZ-II圖像分析應用程式來提取天狼星紅陽性部位面積，控制組小鼠（n=19）做為1的情況下的，算出給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠（n=19）的比率，表示在第7圖。顯著差異檢定（學生t檢定）是以p＜0.05來判斷具有顯著差異。

（結果） 從第7圖可知，當控制組小鼠（n=19）做為1的情況下，給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠（n=19）的天狼星紅陽性部位的值為0.63，顯著減少（圖中的＊是控制組小鼠群與給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠進行上述顯著差異檢定，表示判斷為有顯著差異）。

（肝功能指標） 關於標準小鼠（n=7）、控制組小鼠（n=19）、給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠（n=19）的三種小鼠，血漿中的AST濃度與ALT濃度是使用日立公司7180型自動分析裝置的JSCC標準化對應法來測量。結果表示在第8圖（a）及第8圖（b）。

（結果） 從第8圖（a）及第8圖（b）可知，關於AST值與ALT值，給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠，相較於控制組小鼠表示顯著低值（圖中的＊是在控制組小鼠群與給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠群的比較中，以學生t檢定進行顯著差異檢定，表示P值在0.05以下）。

（蘇木精-伊紅染色） 關於控制組小鼠與給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠，用上述石蠟切片來進行蘇木精-伊紅染色。選擇接近兩群的AST及ALT的平均值的個體切片，將病理像以ALL-IN-ONE螢光顯微鏡（BZ-9000，Keyence公司製造）在4倍率物鏡下觀察的結果表示在第9圖（a）及第9圖（b）。

從第9圖（a）及第9圖（b）可知，在（a）的控制組小鼠中，認為有許多微小的脂肪滴沈積。在（b）的給予梅果汁濃縮中和稀釋液的小鼠中，不認為有脂肪滴。

（結論） 在5～8週齡的STZ誘發NAFLD模型小鼠，在口服給予梅果汁濃縮中和稀釋液的情況下，確認AST、ALT值顯著減少，脂肪沈積也顯著減少，有抑制纖維化顯示的效果。因此，確認預防在NAFLD模型小鼠的肝臟的炎症細胞浸潤，即使達到8週齡，也可以抑制NASH的進行。

[總結] 本發明的梅果汁濃縮物或其處理物，以可預防及/或治療NAFLD或NASH這點，在醫療領域是有用的。實施例 5

[給予未中和處理的梅果汁的加熱濃縮物溶液] （材料與方法）  動物是使用8週齡的威斯達系列雄性大鼠。將實施例1的梅果汁的加熱濃縮物以大約等重量的水稀釋做為梅果汁加熱濃縮物溶液，再以水稀釋，來獲得未中和的梅果汁的加熱濃縮物溶液（37w/v％溶液）。將此未中和的梅果汁的加熱濃縮物溶液稀釋至與實施例3的實驗相同濃度的梅果汁加熱濃縮物的給予液（未中和的梅果汁的加熱濃縮物溶液的稀釋液），以6克/公斤的用量對動物口服給藥8天，與給予同量的蒸餾水的情況（控制群）比較。給藥第7天的實驗物質給予結束後，將用量750毫克/2.5毫升/公斤的用量的D（＋）－半乳糖胺鹽酸鹽給藥至腹腔內，誘發急性肝障礙。給予此半乳糖胺48小時後，在戊巴比妥麻醉下，從腹部大動脈放血，採取肝臟進行福馬林固定，供蘇木精-伊紅染色。此外，進行確認在給予半乳糖胺的大鼠的肝臟小葉內出現的細胞，在以抗肌動蛋白抗體進行的免疫染色（日冷（Nichirei）公司Histofine染色試劑盒）表示陽性的活性化星狀細胞。 （結果） 在肝臟組織給予蒸餾水的群，對於在肝小葉內看到小型的纖維產生細胞的累積像（第10圖（a）），在給予梅果汁濃縮物的給藥液的群，這些的纖維產生細胞的累積被顯著減輕（第10圖（b））。控制群的肝小葉內累積的小型纖維產生細胞是肌動蛋白抗原為陽性的活性化星狀細胞，在肝組織的纖維化責任細胞。從此結果，得知在給予梅果汁濃縮物的給藥液的群，伴隨著由給予半乳糖胺引起的肝障礙的肝纖維化責任細胞（即活性化星狀細胞）的出現被抑制。第10圖（c）表示在以抗肌動蛋白抗體進行的的免疫染色表示陽性的活性化星狀細胞（→所示細胞）。產業利用性

本發明的梅果汁濃縮物或其處理物，以可預防及/或治療NAFLD或NASH這點，在醫療領域是極有用的。

ALT：丙胺酸胺基轉移酶 AST：天門冬胺酸胺基轉移酶 NAFLD：非酒精性脂肪肝疾患 STZ：鏈脲佐菌素

第1圖表示以蘇木精染色/天狼星紅染色的肝臟組織的圖。（a）正常小鼠的肝臟，（b）STZ誘發NASH模型小鼠（控制組小鼠）（c）給予梅果汁濃縮中和稀釋液的STZ誘發NASH模型小鼠的肝臟。 第2圖是將12週齡的標準小鼠、12週齡的STZ誘發NASH模型小鼠、給予梅果汁濃縮中和稀釋液的實驗開始28天後的12週齡的STZ誘發NASH模型小鼠的，天狼星紅染色陽性部位定量化的圖。 第3圖表示標準小鼠、STZ誘發NASH模型小鼠、給予梅果汁濃縮中和稀釋液的STA誘發NASH模型小鼠的，血漿白蛋白值的圖。 第4圖表示標準小鼠、STZ誘發NASH模型小鼠、給予梅果汁濃縮中和稀釋液的STA誘發NASH模型小鼠的，血漿總蛋白質值的圖。 第5圖表示標準小鼠、STZ誘發NASH模型小鼠、給予梅果汁濃縮中和稀釋液的STZ誘發NASH模型小鼠的，（a）體重、（b）ALT值、（c）AST值的圖。 第6圖表示以蘇木精染色/天狼星紅染色的肝臟組織的圖。（a）STZ誘發NAFLD模型小鼠的肝臟（控制組小鼠），（b）給予梅果汁濃縮中和稀釋液的STZ誘發NASH模型小鼠的肝臟。 第7圖是將8週齡的STZ誘發NAFLD模型小鼠、給予梅果汁濃縮中和稀釋液的實驗開始21天後的8週齡的STZ誘發NAFLD模型小鼠的，天狼星紅染色陽性部位定量化的圖。 第8圖表示STZ誘發NAFLD模型小鼠、給予梅果汁濃縮中和稀釋液的STZ誘發NAFLD模型小鼠的（a）AST值、（b）ALT值的圖。 第9圖表示以蘇木精-伊紅染色的肝臟組織的圖。（a）是控制STZ誘發NAFLD模型小鼠的肝臟，（b）是給予梅果汁濃縮中和稀釋液的STZ誘發NAFLD模型小鼠的肝臟。 第10圖的（a）是給予進行蘇木精-伊紅染色的蒸餾水的控制組小鼠的肝臟組織的顯微鏡相片（攝影倍率：400倍），（b）是給予不進行中和處理的梅果汁加熱濃縮物溶液的稀釋液的小鼠的肝臟組織的顯微鏡照片（攝影倍率：400倍），以及（c）是以抗肌動蛋白抗體進行免疫染色的控制組小鼠的肝臟組織的顯微鏡照片（攝影倍率：1000倍）。

NAFLD‧‧‧非酒精性脂肪肝疾患

STZ‧‧‧鏈脲佐菌素

Claims (19)

1. 一種非酒精性脂肪肝疾患（NAFLD）的預防及/或治療劑，包含梅果汁的濃縮物或其處理物。
2. 如申請專利範圍第1項所述的預防及/或治療劑，其中濃縮物的處理物是濃縮物的中和處理物。
3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述的預防及/或治療劑，其中濃縮物是加熱濃縮物。
4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的預防及/或治療劑是用於口服給藥。
5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的預防及/或治療劑是做為補充料來使用。
6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的預防及/或治療劑是減輕肝組織的纖維化。
7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述的預防及/或治療劑，其中非酒精性脂肪肝疾患（NAFLD）是非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。
8. 一種非酒精性脂肪肝疾患（NAFLD）的預防及/或治療劑的製備方法，其特徵在於包含以下步驟： （a）從青梅製備梅榨汁液：以及 （b）將以步驟（a）所製備的梅榨汁液濃縮來製備梅果汁濃縮物。
9. 如申請專利範圍第8項所述的製備方法，其中在步驟（b）的濃縮是加熱濃縮。
10. 如申請專利範圍第8項或第9項所述的製備方法，更包含以下步驟： （c）將以步驟（b）所製備的梅果汁濃縮物或梅果汁加熱濃縮物中和，來製備梅果汁濃縮中和物或梅果汁加熱濃縮中和物。
11. 如申請專利範圍第8項至第10項中任一項所述的製備方法，其中非酒精性脂肪肝疾患（NAFLD）是非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。
12. 一種食品，包含梅果汁的濃縮物或其處理物。
13. 如申請專利範圍第12項所述的食品，其中濃縮物的處理物是濃縮物的中和處理物。
14. 如申請專利範圍第12項或第13項所述的食品，其中濃縮物是加熱濃縮物。
15. 如申請專利範圍第12項至第14項中任一項所述的食品，其中食品是病人用食品、特定保健用食品或表示機能性食品。
16. 一種食品添加劑，包含梅果汁的濃縮物或其處理物。
17. 如申請專利範圍第16項所述的食品添加劑，其中濃縮物的處理物是濃縮物的中和物。
18. 如申請專利範圍第16項或第17項所述的食品添加劑，其中濃縮物是加熱濃縮物。
19. 如申請專利範圍第16項至第18項中任一項所述的食品添加劑，使用於病人用食品、特定保健用食品或表示機能性食品。