TW201623609A - 用於培養酵母菌細胞的種菌培養基及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示一種用於培養一能夠藉由消耗葡萄糖以及木糖來產生乙醇的酵母菌細胞的種菌培養基，其主要是由糖蜜、玉米浸液及水所構成，其中以該種菌培養基的總體積為計算基礎，該糖蜜具有一範圍落在1.0至6.0%(v/v)的濃度，該玉米浸液具有一範圍落在4.0至8.0%(v/v)的濃度，且該糖蜜的濃度低於該玉米浸液的濃度。該種菌培養基可被用於製備酵母菌細胞的種菌，而該種菌可被用於製備乙醇。

Description

用於培養酵母菌細胞的種菌培養基及其用途
本發明是有關於一種用於培養一能夠藉由消耗葡萄糖以及木糖來產生乙醇的酵母菌細胞的種菌培養基(seed medium)，特別是有關於一種基本上是由糖蜜(molasses)、玉米浸液(corn steep liquor)以及水所構成的種菌培養基，可被用於培養酵母菌細胞，使該酵母菌細胞於逆境環境下，能可有效利用生質並代謝生成乙醇。
纖維素生質(cellulosic biomass)是一種經由工業與農林業運作而可被大量地生產的可再生能量資源(renewable energy resources)。利用化學方法或生物學方法來將纖維素生質轉換成生質能(biomass energy)[亦即纖維素酒精(cellulosic ethanol)]已被廣泛地研究與探討。相較於化學方法，生物學方法因為對於生態環境較為友善並且能源需求較低而特別受到重視。
在利用纖維素生質來生成乙醇的過程中，需先製備一纖維素水解液(cellulosic hydrolysate)，該纖維素水解液除了含有還原糖(reducing sugars)之外，通常還伴隨有 於製備過程中因半纖維素(hemicellulose)與還原糖的降解所產生的發酵抑制物[例如醋酸、糠醛(furfural)、羥甲糠醛(hydroxymethyl furfural,HMF)以及酚類化合物(phenolic compounds)等]。
先前已有許多研究揭示，藉由對釀酒酵母菌進行基因修飾來提高乙醇產量的技術手段。但是由於纖維素水解液中所含有的發酵抑制物會抑制釀酒酵母菌的生長與發酵，而使得還原糖的利用率無法獲得有效提升，甚至會被降低，進而影響乙醇的產量。例如，在E.Casey et al.(2010),FEMS Yeast Research,10：385-393中，E.Casey等人發現，在含有葡萄糖與木糖(xylose)的YEP發酵培養基中，醋酸的存在會顯著降低乙醇生產速率，且會降低葡萄糖與木糖的消耗率，其中又以對木糖消耗的抑制作用最為顯著。為解決此一問題，E.Casey等人揭示醋酸的抑制作用可藉由在發酵培養的期間持續地添加氨水來減低。惟此舉卻會增加發酵培養基的pH值，進而增加菌體汙染的風險，並且在發酵培養的期間持續地添加鹼液更會進一步提高發酵製程所需的成本。因此，發展出新的發酵技術來減低發酵抑制物(特別是醋酸)所造成的不利影響，進而提高木糖的利用率以及提升乙醇的產量，已成為一個重要的研發課題。
許多食品工業的副產物由於富含許多可供微生物生長所需的營養源(nutrient source)，因而具有可供再利用的價值，已有許多文獻揭示可用來培養微生物並且由之 生產有價值的產物。糖蜜(molasses)是製糖工業的一種副產物，主要含有大量的糖(包括蔗糖、葡萄糖以及果糖等)以及水，可被用來做為培養基的碳源，以及食品或飼料的添加劑。糖蜜可依照來源而被區分為蔗糖蜜(cane molasses)(總糖含量為大約48~54%)、甜菜糖蜜(beet molasses)(總糖含量為大約48~52%)、柑橘糖蜜(citrus molasses)(總糖含量為大約40~48%)以及玉米糖蜜(corn molasses)[又被稱為澱粉糖蜜(starch molasses)，總糖含量為大約50%]等。另外，玉米浸液(corn steep liquor)則是玉米濕磨(corn wet-milling)工業的一種副產物，主要含有大約47%的蛋白質，可被用來做為培養基的氮源。
由於糖蜜以及玉米浸液所含有的成分可被酵母菌吸收代謝，進而可用於支持其生長以及發酵活性，目前已有許多文獻揭示，使用含有糖蜜和/或玉米浸液的培養基來進行酵母菌的培養，可提升酵母菌細胞數的增長，進而提升發酵產物的產量。例如，在Samuel Amartey and Thomas W.Jeffries(1994),Biotechnology letters.,16：211-214中，Samuel A.等人揭示將樹幹畢赤酵母菌(Pichia stipitis)CBS 6054培養於僅含有30g/L的玉米浸液的培養基中而得到一接種源，接著將該接種源接種至相同的培養基中來進行發酵反應。結果發現，與含有複雜成分的培養基相較之下，使用僅含有30g/L的玉米浸液的培養基來進行發酵反應可些微地提高樹幹畢赤酵母菌CBS 6054的生長速率，而少量地提高木糖利用率以及酒精產量。
在Kim Y.H.et al.(2007),J.Ind.Eng.Chem.,13：153-158中，Kim Y.H.等人為了生產大量的β-聚葡萄糖(β-glucan)(它是細胞壁組成中最主要的多醣)，將釀酒酵母菌JUL3培養於由葡糖糖、酵母萃取物以及蛋白腖所構成的種菌培養基(seed medium)中而得到一接種源，接著將該接種源接種至含有不同濃度的糖蜜與玉米浸液之培養基中來進行培養。而實驗結果僅揭示使用含有6.4%(v/v)的糖蜜以及17%(v/v)的玉米浸液的培養基可增加釀酒酵母菌JUL3於培養物中的細胞質量。
在VU V.H.and Kim K.(2009),J.Microbiol.Biotechnol.,19：1603-1611中，VU V.H.等人為了提高釀酒酵母菌KV-25的培養之細胞密度，將釀酒酵母菌KV-25培養於YPD培養基中而得到一接種源，接著將該接種源接種至含有不同濃度的糖蜜與玉米浸液之培養基中來進行培養，結果發現：糖蜜與玉米浸液的最適化濃度分別為10.25%(v/v)以及16.87%(v/v)，並且使用被接種以該接種源之含有該最適化濃度的糖蜜與玉米浸液之培養基來進行批次培養可獲得36.5g/L的細胞質量。
然而，這些先前研究需在培養的過程中使用大量的糖蜜和/或玉米浸液而提高所需的成本，不敷產業上的實際應用，且僅揭示使用糖蜜和/或玉米浸液作為酵母菌的營養源進行培養可提高細胞質量，並未揭示對酵母菌於纖維素水解液中之影響，更未揭示可改善酵母菌於含有醋酸的纖維素水解液中的木糖利用量，進而提升乙醇產率。
發明概要
於是，在第一個方面，本發明提供一種用於培養一能夠藉由消耗葡萄糖以及木糖來產生乙醇的酵母菌細胞的種菌培養基，其主要是由糖蜜、玉米浸液及水所構成，其中以該種菌培養基的總體積為計算基礎，該糖蜜具有一範圍落在1.0至6.0%(v/v)的濃度，該玉米浸液具有一範圍落在4.0至8.0%(v/v)的濃度，且該糖蜜的濃度低於該玉米浸液的濃度。
在第二個方面，本發明提供一種用於製備酵母菌細胞的種菌(seed culture)的方法，其包括：將一酵母菌細胞，特別是能夠藉由消耗葡萄糖以及木糖來產生乙醇的酵母菌細胞，培養於一如上所述的種菌培養基中，俾以在該種菌培養基中製備該酵母菌細胞的種菌，供之後發酵接種用。
在第三個方面，本發明提供一種以生質製備乙醇的方法，其包括：將一能夠藉由消耗葡萄糖以及木糖來產生乙醇的酵母菌細胞培養於一如上所述的種菌培養基中，俾以在該種菌培養基中製備該酵母菌細胞的種菌；以及接種該種菌於該生質中進行發酵；其中，該生質包含葡萄糖、木糖，及醋酸。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後， 將變得明顯。
本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中：圖1顯示在含有醋酸的發酵培養基中進行發酵反應的情況下，不同處理條件所得釀酒酵母菌種菌對發酵製程的乙醇產量影響的比較圖；以及圖2顯示在含有醋酸的發酵培養基中進行發酵反應的情況下，不同處理條件所得釀酒酵母菌種菌對發酵製程的乙醇產量影響的比較圖。
發明的詳細說明
纖維素生質含有大量的纖維素、半纖維素及木質素等成分，這些成分會互相纏繞包覆而形成複雜且堅韌的網狀結構，這會使得在利用纖維素生質來生產乙醇的過程中受到限制。因此，該纖維素生質通常會先經過一適當的前處理(pretreatment)後，再以酵素進行分解處理將之水解成還原糖(諸如葡萄糖與木糖等)。然而，纖維素生質在經過上述前處理後，會伴隨產生發酵抑制物(例如，醋酸、糠醛以及羥甲糠醛等)，進而影響酵母菌發酵產製乙醇的能力。
為了減低作為發酵抑制物的醋酸所造成的不利影響，以提高木糖的利用率以及乙醇的產量，申請人經戮 力研究結果發現，以含有糖蜜與玉米浸液的種菌培養基進行種菌培養所得之一可共發酵葡萄糖與木糖的酵母菌的接種用種菌，可有效地提升其對醋酸之抗性，亦即經本發明技術處理所製備的該種菌，可於存在有醋酸的發酵條件下，有效改善其木糖利用量，進而提升乙醇產率。
於是，依據本發明所提出之一種用於培養一能夠藉由消耗葡萄糖以及木糖來產生乙醇的酵母菌細胞的種菌培養基，其主要是由糖蜜、玉米浸液及水所構成，其中以該種菌培養基的總體積為計算基礎，該糖蜜具有一範圍落在1.0至6.0%(v/v)的濃度，該玉米浸液具有一範圍落在4.0至8.0%(v/v)的濃度，且該糖蜜的濃度低於該玉米浸液的濃度。
如本文中所用的，術語“糖蜜”意指在精製來自於一植物的糖的過程中在移去糖膏(massecuite)中的蔗糖結晶(sucrose crystal)後所得到之殘餘的糖漿(syrup)，並且是本技術領域中所熟習之物。適用於本發明中的糖蜜種類沒有特別限制，可包括各種商業上可購得的產品。較佳地，該糖蜜是選自於下列所構成之群組：蔗糖蜜、甜菜糖蜜、柑橘糖蜜、玉米糖蜜，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該糖蜜是蔗糖蜜。
依據本發明，以該種菌培養基的總體積為計算基礎，該糖蜜具有一範圍落在3.0至4.0%(v/v)的濃度。在本發明的一個較佳具體例中，以該種菌培養基的總體積為計算基礎，該糖蜜具有一為3.0%(v/v)的濃度。
如本文中所用的，術語“玉米浸液”意指在玉米濕磨製程中藉由稀酸浸泡玉米所得到的浸漬液之濃縮液，並且是本技術領域中熟習之物。適用於本發明的玉米浸液種類沒有特別限制，可包括各種商業上可購得的產品。
依據本發明，以該種菌培養基的總體積為計算基礎，該玉米浸液具有一範圍落在5.0至7.0%(v/v)的濃度。在本發明的一個較佳具體例中，以該種菌培養基的總體積為計算基礎，該玉米浸液具有一為6.0%(v/v)的濃度。
如本文中所用的，術語“水”包括，但不限於：去離子水、逆滲透水、蒸餾水以及二次水(ddH2O)。在本發明的一個較佳具體例中，該水是去離子水。
本發明亦提供一種用於製備酵母菌細胞的種菌的方法，其包括：將一能夠藉由消耗葡萄糖以及木糖來產生乙醇的酵母菌細胞培養於一如上所述的種菌培養基中，俾以在該種菌培養基中製備該酵母菌細胞的種菌。
如此處所用的，術語“酵母菌細胞”意欲涵蓋所有能夠藉由消耗葡萄糖以及木糖來產生乙醇的酵母菌菌株，適用於本發明的酵母菌細胞包括，但不限於，源自於下列的細胞：酵母菌屬物種(Saccharomyces spp.)、畢赤酵母菌屬物種(Pichia spp.)以及假絲酵母菌屬物種(Candida spp.)。
依據本發明，該酵母菌細胞是重組型釀酒酵母菌(recombinant Saccharomyces cerevisiae)。較佳地，該重組型釀酒酵母菌的基因組DNA中，包括一編碼木糖還原酶 (xylose reductase,XR)的基因、一編碼木酮糖激酶(xylulose kinase,XK)的基因，以及一編碼木糖醇脫氫酶(xylitol dehydrogenase,XDH)的基因。更佳地，在該重組型釀酒酵母菌的基因組DNA中的fps1基因[其編碼甘油通道蛋白(glycerin passage protein)]以及gpd2基因[其編碼甘油-3-磷酸脫氫酶-2(glycerol 3-phosphate dehydrogenase-2,GPD2)]被刪除、破壞，或失效。
如本文中所用的，術語“刪除(delete)”意指藉由刪除一基因之全部或部分的編碼區域。
如本文中所用的，術語“破壞(disrupt)”意指在一基因中進行核苷酸的刪除、插入(insertion)或突變(mutation)，而使得該基因無法表現產生一活性酵素(active enzyme)，或使該基因表現產生一具有被嚴重降低活性(severely reduced activity)的酵素。
如本文中所用的，術語“使失效(disable)”意指一基因或其所編碼的蛋白質被去活化(inactive)，進而失去原有的活性或功能。
在本發明的一個較佳具體例中，該酵母菌細胞係藉由將一株以寄存編號BCRC 920077被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)的釀酒酵母菌[亦以寄存編號DSM 25508被寄存於德國微生物菌種寄存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ)]之基因組DNA中的fps1基因與gpd2基因進行刪除或破壞而製得。
在本發明的另一個較佳具體例中，該酵母菌細胞是樹幹畢赤酵母菌(Pichia stipitis)。
依據本發明，該培養步驟是在一好氧條件(aerobic condition)下被進行。
本發明亦提供一種以生質製備乙醇的方法，其包括：將一能夠藉由消耗葡萄糖以及木糖來產生乙醇的酵母菌細胞培養於一如上所述的種菌培養基中，俾以在該種菌培養基中製備該酵母菌細胞的種菌；以及接種該種菌於該生質中進行發酵；其中，該生質包含葡萄糖、木糖，及醋酸。
依據本發明，該酵母菌細胞及其培養步驟是如上面所描述者。
依據本發明，該生質是一包含有葡萄糖、木糖，及醋酸的混合糖液。
依據本發明，該生質是一包含有葡萄糖、木糖，及醋酸的纖維素水解液。
依據本發明，該纖維素水解液是藉由對一纖維素生質依序地進行一前處理及一水解處理而被製得。
如本文中所用的，術語“纖維素水解液”與“木質纖維素水解液”和“生質水解液(biomass hydrolysate)”係可被交替地使用，並且意指由生質之糖化(saccharification)所產生的產物。
依據本發明，在該生質中的醋酸具有一範圍落 在4至10g/L的濃度。較佳地，在該生質中的醋酸具有一範圍落在5至8.5g/L的濃度。更佳地，在該生質中的醋酸具有一範圍落在6至8g/L的濃度。
依據本發明，該發酵步驟是在實質上沒有糖蜜以及玉米浸液的條件下被進行。
如本文中所用的，術語“實質上沒有(substantially free of)”意指一被具體指明的成分缺少有意義的數量。較佳地，該發酵步驟是在完全沒有該成分的條件下被進行，或者該成分的數量對於該發酵步驟不具有可測量的影響(measurable effect)。
依據本發明，該發酵步驟是在一範圍落在5.0至6.5的pH值的條件下被進行。較佳地，該發酵步驟是在一範圍落在5.0至5.5的pH值的條件下被進行。
依據本發明，該發酵步驟是在一厭氧條件(anaerobic condition)下被進行。
較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
實施例 一般實驗材料：
1.製備△fps1△gpd2雙突變的釀酒酵母菌(△fps1△gpd2 double mutant of Saccharomyces cerevisiae)：在下面實驗中所使用的釀酒酵母菌菌株是△ fps1△gpd2雙突變的釀酒酵母菌，其大體上是依據Zhang A et al.(2007)(同上述)以及Hubmann G.et al.(2011)(同上述)當中所述的方法而被製備。簡言之，首先，依據Zhang A et al.(2007)(同上述)當中所述的方法，將一可共發酵五碳糖與六碳糖的釀酒酵母菌BCRC 920077(得自於申請人先前專利案TW I450963，亦以寄存編號DSM 25508被寄存於DSMZ)的fps1基因剔除，繼而將所得到的△fps1突變菌株進一步依據Hubmann G.et al.(2011)(同上述)當中所揭示的方法來進行gpd2基因的剔除，藉此而得到△fps1△gpd2雙突變的釀酒酵母菌菌株(下面簡稱“經雙突變的釀酒酵母菌”)。
2.在下面實施例中，用於配製種菌培養基的蔗糖蜜以及玉米浸液分別是購自於豐年豐和企業股份有限公司(Fonen And FonHer Enterprise Co.,LTD)以及台灣糖業股份有限公司(Taiwan Sugar Corporation)，其中蔗糖蜜含有435g/L的蔗糖、36.5g/L的葡萄糖以及86g/L的果糖，而玉米浸液含有60.88%(w/w)的水、17.67%(w/w)的粗蛋白質、6.49%(w/w)的粗灰分以及177.94ppm的二氧化硫。
3.下列實驗材料是購自於景明化工股份有限公司(Echo Chemical Co.,LTD)：葡萄糖以及木糖。
4.下列實驗材料是購自於SHOWA：尿素。
5.下列實驗材料是購自於Scharlau：醋酸。
6.在下面實施例中所使用的YPD培養基具有一如下面表1所示的配方。
7.在下面實施例中，用於發酵培養經雙突變的釀酒酵母菌的發酵培養基具有一如下面表2所示的配方。
8.在下面實施例中，用於發酵培養樹幹畢赤酵母菌BCRC 21775的發酵培養基具有一如下面表3所示的配方。
一般實驗方法：
1.高效能液相層析(high performance liquid chromatography,HPLC)分析：在下面的實施例中，被用來進行HPLC分析的待測樣品中所含有的成分及其濃度(g/L)是參考美國國家再生能源實驗室(National Renewable Energy Laboratory,NREL)所頒布的有關標準生物質分析之實驗室分析程序(laboratory analytical procedures,LAPs)，並藉由使用一配備有一個折射率偵測器(refractive index detector,RI detector)的高效能液相層析儀(DIONEX Ultimate 3000)來進行測定，其中所使用的管柱以及操作條件如下：分析管柱為Aminex HPX-87H管柱(BioRad)：流動相：5mM硫酸(配於水中)；流速被控制為0.6mL/分鐘；樣品注射體積為20μL；管柱烘箱(column oven)溫度控制在65℃；RI溫度控制在45℃。
此外，為供比對，使用不同濃度之葡萄糖(1.25-24g/L)、木糖(1.25-24g/L)、醋酸(0.25-6g/L)以及乙醇(0.938-20g/L)來分別作為校正標準品(control standard)並進行相同的分析。
實施例1. 在存在有醋酸的發酵條件下，由含有不同濃度的玉米浸液與3%的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之經雙突變的釀酒酵母菌的種菌對於發酵製程的乙醇產率的影響
於本實施例中，依據上面“一般實驗材料”的第1項「製備△fps1△gpd2雙突變的釀酒酵母菌」所得到的經雙突變的釀酒酵母菌被拿來作為試驗菌株。
實驗方法：
首先，將該經雙突變的釀酒酵母菌菌株分成6組，其中包括5個實驗組(亦即實驗組1至5)以及1個對照組。接著，將實驗組1至5的菌株分別接種至具有如下面表4中所示的配方之種菌培養基(10mL)中，以及將對照組的菌株接種至如上面表1中所示的YPD培養基(10mL)中。
之後，將各組菌株置於一恆溫振盪培養箱(30℃、200rpm)內進行培養歷時16小時。接著，將所形成的培養物於15,700g下進行離心歷時1分鐘，然後收集細胞沉澱物並使用如上面表2中所示的發酵培養基來充份懸浮菌體，由此所得到的細胞懸浮液被拿來作為經雙突變的釀酒酵母菌的種菌。
之後，將各組種菌分別以2×106細胞/mL的接種 量接種於一含有100mL的如上面表2中所示的發酵培養基的錐形瓶中，然後於一厭氧條件下以及一恆溫培養箱(30℃、200rpm)中進行發酵反應歷時72小時。在發酵反應開始之後的第6小時以及第24小時，對各組添加6N的NaOH以使其pH值被維持在5.5。
之後，將所得到的各組發酵培養物於12,000rpm下予以離心歷時1分鐘，而所得到之發酵產物(fermentation product)是依據上面“一般實驗方法”的第1項「高效能液相層析分析」當中所述的方法來進行乙醇的含量分析。
乙醇產率是藉由將所測得的乙醇含量以及發酵前發酵培養基中所含有的葡萄糖含量以及木糖含量代入下列公式(I)而被計算出：A=[B/(C×0.51+D×0.48)]×100 (I)
其中：A=乙醇產率(%)
B=所測得的乙醇含量(g/L)
C=發酵前發酵培養基中所含有的葡萄糖含量(g/L)
D=發酵前發酵培養基中所含有的木糖含量(g/L)
結果：
本實驗所測得的結果被顯示於圖1中。從圖1可見，與對照組相較之下，各實驗組的發酵產物所測得的乙醇產率皆有顯著的提高，同時會隨著玉米浸液之濃度的增加而更趨於明顯。這個實驗結果顯示，在存在有醋酸的 發酵條件下，由含有不同濃度的玉米浸液與3%(v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之經雙突變的釀酒酵母菌的種菌，皆能夠有效地提升發酵製程的乙醇產率。
實施例2. 在存在有醋酸的發酵條件下，由含有不同濃度的蔗糖蜜與6%的玉米浸液之種菌培養基所製得之經雙突變的釀酒酵母菌的種菌對於發酵製程的乙醇產率的影響
於本實施例中，使用相同於實施例1所具者的試驗菌株。
實驗方法：
首先，將該經雙突變的釀酒酵母菌菌株分成7組，其中包括6個實驗組(亦即實驗組1至6)以及1個對照組。接著，將實驗組1至6的菌株分別接種至具有如下面表5中所示的配方之種菌培養基(10mL)中，以及將對照組的菌株接種至如上面表1中所示的YPD培養基(10mL)中。
之後，將各組菌株置於一恆溫振盪培養箱(30℃、200rpm)內進行培養歷時16小時。接著，將所形成的培養物於15,700g下進行離心歷時1分鐘，然後收集細胞沉澱物並使用如上面表2中所示的發酵培養基來充份懸浮菌體，由此所得到的細胞懸浮液被拿來作為經雙突變的釀酒酵母菌的種菌。
之後，將各組種菌分別以2×106細胞/mL的接種量接種於一含有100mL的如上面表2中所示的發酵培養基的錐形瓶中，然後於一厭氧條件下以及一恆溫培養箱(30℃、200rpm)中進行發酵反應歷時72小時。在發酵反應開始之後的第6小時以及第24小時，對各組添加6N的NaOH以使其pH值被維持在5.5。
之後，將所得到的各組發酵培養物於12,000rpm下予以離心歷時1分鐘，而所得到之發酵產物是依據上面“一般實驗方法”的第1項「高效能液相層析分析」當中所述的方法來進行乙醇的含量分析，並且依據上面實施例1當中所述的計算方式來計算出各組的乙醇產率。
結果：
本實驗所測得的結果被顯示於圖2中。從圖2可見，與對照組相較之下，各實驗組的發酵產物所測得的乙醇產率皆有提高的情形，其中又以實驗組3的發酵產物所測得的乙醇產率最高。這個實驗結果顯示，在存在有醋酸的發酵條件下，由含有不同濃度的蔗糖蜜與6%(v/v)的玉米浸液之種菌培養基所製得之經雙突變的釀酒酵母菌的種菌皆能夠有效地提升發酵製程的乙醇產率，其中以含有3%(v/v)蔗糖蜜以及6%(v/v)玉米浸液的種菌培養基之效果最佳。
實施例3. 不同的pH值的發酵條件下的影響
於本實施例中，使用相同於實施例1所具者的試驗菌株，並使用含有醋酸且pH值為5.0、5.5或6.0的發酵培養基來模擬含有醋酸的生質(例如，纖維素水解液)，而探討在此發酵培養基中進行發酵反應的情況下，由含有3%(v/v)的蔗糖蜜與6%(v/v)的玉米浸液之種菌培養基所製得之該經雙突變的釀酒酵母菌的種菌對於發酵製程的葡糖糖與木糖的利用量以及乙醇產率的影響。
實驗方法：
首先，將該經雙突變的釀酒酵母菌菌株分成6組，其中包括3個實驗組(亦即實驗組1至3)以及3個對照組(亦即對照組1至3)。接著，將實驗組1至3的菌株分別接種至含有3%(v/v)蔗糖蜜以及6%(v/v)玉米浸液的種菌培養基(10mL)中，以及將對照組1至3的菌株分別接種至如上面表1中所示的YPD培養基(10mL)中。
之後，將各組菌株置於一恆溫振盪培養箱(30℃、200rpm)內進行培養歷時16小時。接著，將所形成的培養物於15,700g下進行離心歷時1分鐘，然後收集細胞沉澱物並使用如上面表2中所示的發酵培養基來充份懸浮菌體，由此所得到的細胞懸浮液被拿來作為經雙突變的釀酒酵母菌的種菌。
之後，將各組種菌分別以2×106細胞/mL的接種量接種於一含有100mL的如上面表2中所示的發酵培養基的錐形瓶中，然後於一厭氧條件下以及一恆溫培養箱(30℃、200rpm)中進行發酵反應歷時72小時。在發酵反應開始之後的第6小時以及第24小時，對各組添加6N的NaOH以使實驗組1與對照組1的pH值被維持在5.0，實驗組2與對照組2的pH值被維持在5.5，以及實驗組3與對照組3的pH值被維持在6.0。
接著，將所得到的各組發酵培養物於12,000rpm下予以離心歷時1分鐘，而所得到之發酵產物是依據上面“一般實驗方法”的「高效能液相層析分析」當中所述的方法來進行乙醇、木糖以及葡萄糖的含量分析，並且依據上面 實施例1當中所述的計算方式來計算出各組的乙醇產率。
結果：
本實驗所測得的結果被顯示於下面表6中。
從表6可見，無論將由不同的種菌培養基所製得之種菌接種於pH值被維持在5.0、5.5或6.0的發酵培養基中來進行發酵培養的情況下，各組發酵產物所測得之剩餘的葡萄糖含量皆為0g/L。另外，就乙醇產率以及木糖含量而言，各個實驗組的發酵產物所測得的乙醇產率皆高於對應的對照組所具者，而各個實驗組的發酵產物所測得之剩餘的木糖含量皆低於對應的對照組所具者。特別地，實驗組1的發酵產物所測得的乙醇產率是近似於對照組2所具者，而實驗組2的發酵產物所測得的乙醇產率是近似於對照組3所具者。這個實驗結果顯示，在存在有醋酸的發酵條件下，無論pH值被維持在5.0、5.5或6.0，由含有3%(v/v)的蔗糖蜜與6%(v/v)的玉米浸液之種菌培養基所製得 之經雙突變的釀酒酵母菌的種菌皆能夠有效地提升發酵製程的木糖利用量，進而提升乙醇產率。因此，當在發酵反應中pH值隨著時間而降低時，可節省被用來調整pH值的NaOH使用量。
實施例4. 在存在有醋酸的發酵條件下，由含有3%的蔗糖蜜與6%的玉米浸液之種菌培養基所製得之樹幹畢赤酵母菌(Pichia stipitis)BCRC 21775的種菌對於發酵製程的乙醇產率的影響
於本實施例中，樹幹畢赤酵母菌BCRC 21775(購自於台灣的食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心)被拿來作為試驗菌株，並使用含有醋酸且pH值為6.0或6.5的發酵培養基來模擬含有醋酸的生質(例如，纖維素水解液)。
實驗方法：
首先，將樹幹畢赤酵母菌BCRC 21775分成4組，其中包括2個實驗組(亦即實驗組1與2)以及2個對照組(亦即對照組1與2)。接著，將實驗組1與2的菌株分別接種至含有3%(v/v)蔗糖蜜以及6%(v/v)玉米浸液的種菌培養基(10mL)中，以及將對照組1與2的菌株分別接種至如上面表1中所示的YPD培養基(10mL)中。
之後，將各組菌株置於一恆溫振盪培養箱(30℃、200rpm)內進行培養歷時16小時。接著，將所形成的培養物於15,700g下進行離心歷時1分鐘，然後收集細胞沉澱物並使用如上面表3中所示的發酵培養基來充份懸浮菌 體，由此所得到的細胞懸浮液被拿來作為樹幹畢赤酵母菌BCRC 21775的種菌。
之後，將各組種菌分別以2×106細胞/mL的接種量接種於一含有100mL的如上面表3中所示的發酵培養基的錐形瓶中，然後於一厭氧條件下以及一恆溫培養箱(30℃、200rpm)中進行發酵反應歷時72小時。在發酵反應開始之後的第6小時以及第24小時，對各組添加6N的NaOH以使實驗組1與對照組1的pH值被維持在6.0，以及實驗組2與對照組2的pH值被維持在6.5。
接著，將所得到的各組發酵培養物於12,000rpm下予以離心歷時1分鐘，而所得到之發酵產物是依據上面“一般實驗方法”的「高效能液相層析分析」當中所述的方法來進行乙醇的含量分析。
乙醇產率是藉由將所測得的乙醇含量以及發酵前發酵培養基中所含有的木糖含量代入下列公式(II)而被計算出：E=[F/(G×0.48)]×100 (II)
其中：E=乙醇產率(%)
F=所測得的乙醇含量(g/L)
G=發酵前發酵培養基中所含有的木糖含量(g/L)
結果：
本實驗所測得的結果被顯示於下面表7中。
從表7可見，各個實驗組的發酵產物所測得的乙醇產率皆高於對應的對照組所具者。特別地，實驗組1的發酵產物所測得的乙醇產率高於對照組2所具者。這個實驗結果顯示，在存在有醋酸的發酵條件下，無論pH值被維持在6.0或6.5，由含有3%(v/v)的蔗糖蜜與6%(v/v)的玉米浸液之種菌培養基所製得之樹幹畢赤酵母菌BCRC 21775的種菌皆能夠有效地提升發酵製程的乙醇產率。因此，當在發酵反應中pH值隨著時間而降低時，可節省被用來調整pH值的NaOH使用量。
綜合以上的實驗結果，可得證：在存在有醋酸的發酵條件下，由含有糖蜜與玉米浸液的種菌培養基所製得之一可共發酵葡萄糖與木糖的酵母菌的種菌能夠有效地提升發酵製程的木糖利用量，進而提升乙醇產率。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修 改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

Claims (19)

  1. 一種用於培養一能夠藉由消耗葡萄糖以及木糖來產生乙醇的酵母菌細胞的種菌培養基，其主要是由糖蜜、玉米浸液及水所構成，其中以該種菌培養基的總體積為計算基礎，該糖蜜具有一範圍落在1.0至6.0%(v/v)的濃度，該玉米浸液具有一範圍落在4.0至8.0%(v/v)的濃度，且該糖蜜的濃度低於該玉米浸液的濃度。
  2. 如請求項1的種菌培養基，其中以該種菌培養基的總體積為計算基礎，該糖蜜具有一範圍落在3.0至4.0%(v/v)的濃度。
  3. 如請求項1的種菌培養基，其中以該種菌培養基的總體積為計算基礎，該玉米浸液具有一範圍落在5.0至7.0%(v/v)的濃度。
  4. 如請求項1的種菌培養基，其中該糖蜜是選自於下列所構成之群組：蔗糖蜜、甜菜糖蜜、柑橘糖蜜、玉米糖蜜，以及它們的組合。
  5. 一種用於製備酵母菌細胞的種菌的方法，其包括：將一能夠藉由消耗葡萄糖以及木糖來產生乙醇的酵母菌細胞培養於一如請求項1至4中任一項所述的種菌培養基中，俾以在該種菌培養基中製備該酵母菌細胞的種菌。
  6. 如請求項5的方法，其中該酵母菌細胞是選自於由下列所構成的群組：重組型釀酒酵母菌以及樹幹畢赤酵母菌。
  7. 如請求項6的方法，其中該重組型釀酒酵母菌的基因組 DNA包括一編碼木糖還原酶的基因、一編碼木酮糖激酶的基因及一編碼木糖醇脫氫酶的基因。
  8. 如請求項6的方法，其中在該重組型釀酒酵母菌的基因組DNA中的fps1基因及gpd2基因被刪除、破壞，或失效。
  9. 如請求項5的方法，其中該培養步驟是在一好氧條件下被進行。
  10. 一種以生質製備乙醇的方法，其包括：將一能夠藉由消耗葡萄糖以及木糖來產生乙醇的酵母菌細胞培養於一如請求項1至4中任一項所述的種菌培養基中，俾以在該種菌培養基中製備該酵母菌細胞的種菌；以及接種該酵母菌細胞的種菌於該生質中進行發酵；其中，該生質包含葡萄糖、木糖及醋酸。
  11. 如請求項10的方法，其中該酵母菌細胞是選自於由下列所構成的群組：重組型釀酒酵母菌及樹幹畢赤酵母菌。
  12. 如請求項11的方法，其中該重組型釀酒酵母菌的基因組DNA包括一編碼木糖還原酶的基因、一編碼木酮糖激酶的基因及一編碼木糖醇脫氫酶的基因。
  13. 如請求項11的方法，其中在該重組型釀酒酵母菌的基因組DNA中的fps1基因及gpd2基因被刪除、破壞，或失效。
  14. 如請求項10的方法，其中該培養步驟是在一好氧條件 下被進行。
  15. 如請求項10的方法，其中該發酵步驟是在實質上沒有糖蜜以及玉米浸液的條件下被進行。
  16. 如請求項10的方法，其中該發酵步驟是在一範圍落在5.0至6.5的pH值的條件下被進行。
  17. 如請求項10的方法，其中該發酵步驟是在一厭氧條件下被進行。
  18. 如請求項10的方法，其中在該生質中的醋酸濃度為4至10g/L。
  19. 如請求項10的方法，其中該生質是一纖維素水解液。
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