TW201544593A - 用以製備蝦紅素之重組多核苷酸序列及其用途 - Google Patents

Abstract

本揭示內容是關於用以製備蝦紅素之重組多核苷酸序列、載體、宿主細胞及方法。利用本揭示內容之重組多核苷酸序列可縮短代謝路途以提升蝦紅素前趨物的合成，藉此製備具有特定立體異構物形式和／或酯化形式的最終產物（例如蝦紅素）。

Description

用以製備蝦紅素之重組多核苷酸序列及其用途

本揭示內容是關於生物合成蝦紅素（astaxanthin）。更具體來說，本揭示內容是關於以生物方法合成蝦紅素或其前驅物或衍生物。

類胡蘿蔔素（carotenoids）是一種捕光色素（light harvesting pigments），可用以保護光合系統，避免過量光照所引起的光氧化傷害。在人體中，類胡蘿蔔素是可作為抗氧化劑的維生素A前驅物，已知可刺激免疫系統，保護個體抵抗諸如癌症等各式疾病。自然界存在著多種類胡蘿蔔素，包含蝦紅素、茄紅素（lycopene）、β-胡蘿蔔素（β-carotene）、海膽酮（echinenone）、斑螯黃質（又名角黃素，canthaxanthin）和玉米黃質（zeaxanthin）。相較於其他種類的類胡蘿蔔素而言，蝦紅素具有更顯著的抗氧化功效；因此，蝦紅素更具經濟價值。可廣泛應用於水產養殖、醫療保健產品、化妝品和食品工業等不同領域。

蝦紅素（又名蝦青素，3,3'-二羥基-ß-胡蘿蔔素-4,4'-二酮，3,3'-dihydroxy-ß-carotene-4,4'-dione，第1圖）是一種類胡蘿蔔色素，賦予某些鳥類、甲殼類動物和鮭魚獨特的顯色。蝦紅素的抗氧化力是維生素E的500倍以上，且是其他類胡蘿蔔素的10倍以上。已知氧化壓力會導致風溼性關節炎、帕金森氏症、阿茲海默症、癌症和中風。許多研究指出，蝦紅素具有促進保健功效，不僅可用於預防且可治療各式疾病，例如癌症、慢性發炎疾病、代謝症候群、糖尿病、糖尿病腎病變、心血管疾病、胃腸道疾病、肝臟疾病、神經退化性疾病、眼部疾病、皮膚疾病、運動性疲勞、雄性不孕症和氯化汞引發的急性腎衰竭，增強免疫力並減少罹患動脈粥狀硬化的風險。

在各式類胡蘿蔔素產品中，蝦紅素是價格最高的產品。巿售蝦紅素多由化學方法合成（亦即，石化合成法），其商業用途主要是作為養殖鮭魚和鱒魚用的飼料添加劑。化學合成和天然合成的蝦紅素，雖具有大致相同的化學式，然二者的分子特性卻截然不同；該不同之處賦予了天然蝦紅素較佳的安全性及抗氧化功效。此外，化學合成的蝦紅素在醫藥巿場上接受度很低，原因如下：

第一，幾何異構物的形式會影響合成蝦紅素的吸收。化學合成的蝦紅素具有Z形式的構型（順式異構型，cis-isomeric），該結構的蝦紅素無法被動物體吸收，因此，美國食品藥物管理局（U.S. Food and Drug Administration, FDA）已禁止其販售使用（表1）。相較之下，98%的天然蝦紅素係為E形式的構型（反式異構型，trans-isomer）（表1）。

第二，蝦紅素具有三種構型異構體，其構型是利用分子結構中的二個氫氧基來區分，包含二種鏡像異構物（enantiomer，即3R, 3’R及3S, 3’S）和一種內消旋型異構物（mesoform，即3R, 3’S，第1圖），各異構物皆具有位於C-3和C-3’的二個掌性中心。相較於3R, 3’R立體異構物，3S, 3’S立體異構物的抗氧化功效更為顯著；3R, 3’S內消旋型異構物則不具有任何抗氧化功效。化學合成蝦紅素通常是一種同時包含3S, 3’S、3R, 3’S及3R, 3’R的混合物（比例約為1:2:1）；相較之下，源自藻類之天然蝦紅素則主要為3S, 3’S形式的立體異構物（表1）。

第三，游離形式（或稱自由形式，free form）的合成蝦紅素非常容易進行氧化反應。天然蝦紅素常與蛋白質接合，或與一或二種脂肪酸產生酯化反應而形成一單酯體（monoester）或雙酯體（diester）；酯化蝦紅素相較於游離形式更易被人體吸收。此外，源自藻類（例如雨生紅球藻，Haematococcus pluvialis ）的天然蝦紅素較於合成蝦紅素更適於作為自由基清除劑（free radical scavenger）和抗氧化劑。

蝦紅素為具有應用潛力的功能性食物和醫藥成分，並可做為水產養殖業的食用色素添加劑等。由於天然蝦紅素（特別是3S, 3’S型的酯化蝦紅素）無法由化學合成所取代，科學和工業領域亟欲發展生物合成法，在一適當的生物反應器內建立一套類胡蘿蔔素的生合成方法，據以生產相關產品。本發明即是利用已知的類胡蘿蔔素生物合成路徑（第2a及2b圖）來建立一可生產高價值蝦紅素（例如3S, 3’S型的酯化蝦紅素）的生物細胞工廠。已知多種包含鮭魚、蝦、藻類、植物、紅發夫酵母（Phaffia rhodozyma ; Xanthophyllomyces dendrorhous ）和基因轉殖微生物，皆可用以製備不同形式之蝦紅素及其衍生物。然而，該些生物工廠往往受限於宿主本身的生產條件，例如飼養於冷水的魚和蝦僅能產生低濃度的蝦紅素、植物系統則會進行非預期的酮化反應（ketolation）、紅發夫酵母生產的最終產物抗氧化活性過低，以及飼養藻類時需要大土地面積和很長時間。

有鑑於此，相關領域亟需一種可用以穩定生物合成蝦紅素的新穎方法。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

本揭示內容旨在提供一用以生物合成蝦紅素、蝦紅素前趨物或蝦紅素衍生物的重組多核苷酸序列、載體、宿主細胞及方法。基於蝦紅素和／或其前趨物或衍生物的抗氧化功效，本揭示內容亦提供一種用以改善宿主細胞對壓力之耐受性的方法，以及一種用以增加宿主細胞製備乙醇或漿果赤黴素III（baccatin III）之產量的方法。

本揭示內容的第一態樣是關於一種用以在宿主細胞中，製備蝦紅素或其前趨物或衍生物的重組多核苷酸序列。該重組多核苷酸序列包含四組基因組：（1）第一基因組，其係包含一第一啟動子及一可操作式地連結至該第一啟動子的第一核酸序列，其中該第一核酸序列係用以編碼一焦磷酸香葉香葉酯合成酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase, GGPP synthase）；（2）第二基因組，其係包含一第二啟動子及一可操作式地連結至該第二啟動子之第二核酸序列，其中該第二核酸序列係用以編碼一3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl–coenzyme A reductase，HMG-CoA reductase，以下簡稱HMG-CoA還原酶）；（3）第三基因組，其係包含一第三啟動子及一可操作式地連結至該第三啟動子之第三核酸序列，其中該第三核酸序列係用以編碼一八氫茄紅素去飽合酶（phytoene desaturase）；以及（4）第四基因組，其係包含一第四啟動子及一可操作式地連結至該第四啟動子之第四核酸序列，其中該第四核酸序列係用以編碼一具有八氫茄紅素合成酶（phytoene synthase）和茄紅素環化酶（lycopene cyclase）個別功能之雙功能酵素。所述重組多核苷酸序列中各基因組的3’端序列與位於其下游之下一組基因組的5’端序列彼此為相互同源序列，其順序皆可調動。

依據本揭示內容一實施方式，第一核酸序列為一包含序列編號：1之序列的crtE 基因，第二核酸序列為一包含序列編號：2之序列的HMG1 基因，第三核酸序列為一包含序列編號：3之序列的crtI 基因，而第四核酸序列則為一包含序列編號：4之序列的crtYB 基因。

依據本揭示內容某些實施方式，生物製成的蝦紅素是3S, 3S’-蝦紅素。依據本揭示內容其他實施方式，生物製成的蝦紅素是3R, 3R’-蝦紅素。

依據本揭示內容一實施方式，蝦紅素之前趨物可以是焦磷酸香葉香葉酯（geranylgeranyl-pyrophosphate, GGPP）、尼基葉黃素（phenicoxanthin）、茄紅素（lycopene）、海膽酮（echinenone）、斑螯黃質（又名角黃素，canthaxanthin）、八氫番茄紅素（phytoene）、玉米黃質（zeaxanthin）、β-隱黃素（β-cryptoxanthin）或β-胡蘿蔔素（β-carotene）。依據本揭示內容另一實施方式，蝦紅素之衍生物可以是蝦紅素單酯體（monoester）或蝦紅素雙酯體（diester）。

在本揭示內容某些實施方式中，重組多核苷酸序列更包含一第五基因組和一第六基因組。第五基因組包含一第五啟動子及一可操作式地連結至該第五啟動子之第五核酸序列，其中該第五核酸序列係用以編碼一β-胡蘿蔔素羥化酶（β-carotene hydroxylase）。第六基因組則包含一第六啟動子及一可操作式地連結至該第六啟動子之第六核酸序列，其中該第六核酸序列係用以編碼一β-胡蘿蔔素酮醇酶（β-carotene ketolase）。

依據本揭示內容一實施方式，第五核酸序列為一包含序列編號：5、6或7之序列的chYb 基因；而第六核酸序列則為一包含序列編號：8之序列的bkt 基因。

依據本揭示內容之實施方式，第一至第六啟動子係分別選自由ScGapDH啟動子、KlGapDH啟動子、ScPGK啟動子、KlPGK啟動子、KlADHI啟動子、ScADHI啟動子、KlADH4啟動子、ScADH4啟動子、KlLac4啟動子和ICL啟動子所組成的群組。較佳情況是，第一至第六啟動子係為不同的啟動子，其順序皆可調動。

在本揭示內容其他實施方式中，除了第一、第二、第三和第四基因組外，重組多核苷酸序列更包含一第七基因組和一第八基因組。第七基因組包含一第七啟動子及一可操作式地連結至該第七啟動子之第七核酸序列，其中該第七核酸序列係用以編碼一P450還原酶（P450 reductase）。第八基因組包含一第八啟動子及一可操作式地連結至該第八啟動子之第八核酸序列，其中該第八核酸序列係用以編碼一β-胡蘿蔔素氧化酶（β-carotene oxygenase）。

依據本揭示內容一實施方式，第七核酸序列為一包含序列編號：9之序列的crtR 基因；而第八核酸序列則為一包含序列編號：10之序列的crtS 基因。

依據本揭示內容另一實施方式，第一、第二、第三、第四、第七和第八啟動子係分別選自由ScGapDH啟動子、KlGapDH啟動子、ScPGK啟動子、KlPGK啟動子、KlADHI啟動子、ScADHI啟動子、KlADH4啟動子、ScADH4啟動子、KlLac4啟動子和ICL啟動子所組成的群組。較佳的情況是，第一、第二、第三、第四、第七和第八啟動子係為不同的啟動子，其順序皆可調動。

在本揭示內容某些實施方式中，重組多核苷酸序列更包含一篩選標記基因組，其係包含一篩選標記啟動子及一可操作式地連結至該篩選標記啟動子之篩選標記基因。

本揭示內容的第二態樣是關於一種用以在宿主細胞中，製備蝦紅素或其前趨物或衍生物的重組載體。該重組載體包含上述任一種重組多核苷酸序列，以及一可操作式地連結至該重組多核苷酸序列的控制序列（control sequence），據以表現本發明重組多核苷酸序列。

本揭示內容的第三態樣是關於一種用以製備蝦紅素或其前趨物或衍生物的宿主細胞，其中該宿主細胞包含本揭示內容所述之任一種重組多核苷酸序列或重組載體。因應不同的重組多核苷酸序列或重組載體，生物製成的蝦紅素可以是3S, 3S’-蝦紅素或3R, 3R’-蝦紅素。蝦紅素之前趨物可以是焦磷酸香葉香葉酯、尼基葉黃素、茄紅素、海膽酮、斑螯黃質、八氫番茄紅素、玉米黃質、β-隱黃素或β-胡蘿蔔素。蝦紅素之衍生物可以是蝦紅素單酯體或蝦紅素雙酯體。

在任選的實施方式中，宿主細胞可以是真核細胞或原核細胞。

本揭示內容的第四態樣是關於一種用以製備蝦紅素或其前趨物或衍生物的方法。依據更多的實施方式，本發明方法包含將上述宿主細胞培養於一培養液中，其中該培養液包含一種選自由葡萄糖、半乳糖、甘油和脂肪酸所組成之群組的成分，藉以製備蝦紅素或其前趨物或衍生物。在一特定實施方式中，該培養液包含0.5-40%甘油（glycerol）。在另一特定實施方式中，該培養液包含0.001-5%脂肪酸，例如辛酸（octanoic acid）。

本揭示內容的第五態樣是關於一種用以改善宿主細胞對壓力之耐受性的方法。該方法包含將本揭示內容之重組多核苷酸序列和／或重組載體轉殖至宿主細胞中。依據一實施方式，壓力可以是來自於宿主細胞被暴露在乙醇、異丁醇（butanol）、紫外光照射、糠醛（furfural）或藥物前趨物下所造成。依據一實施方式，該藥物前趨物可以是10-去乙醯漿果赤黴素III（10-deacetyl baccatin III, 10 DB）。

本揭示內容之第六態樣則是關於一種用以增加宿主細胞製備乙醇或漿果赤黴素III之產量的方法。該方法包含將本揭示內容之重組多核苷酸序列和／或重組載體轉殖至宿主細胞中。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神和其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對本發明的實施態樣與具體實施例提出說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例和其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。

在本說明書中，「控制序列」（control sequence）一詞係指可調控編碼序列（coding sequence）的多核苷酸序列，其中該編碼序列係可操作式地連接至該控制序列。控制序列的特性會依宿主生物體的差異而有所不同。在原核生物體中，控制序列通常包含啟動子（promoter）、核醣體結合位置（ribosomal binding site）和終止子（terminator）。在真核生物體中，控制序列通常包含啟動子、終止子和促進子（enhancer）或緘默子（silencer）。 「控制序列」（control sequence）一詞包含最少量之可調控編碼序列表現的所有元件，亦包含其他可增加或控制特定基因之表現時間、表現量和表現位置的附加元件。在某些實施方式中，「控制序列」（control sequence）包含特定啟動子以外的調控元件。

「啟動子」（promoter）一詞在本說明書係指一合成或融合的分子或其衍生物，可據以活化或增加細胞、組織或器官之核酸序列的表現。

「核酸序列」（nucleic acid sequence）、「多核苷酸」（polynucleotide）或「核酸」（nucleic acid）在本說明書中可交替使用，可指一雙股去氧核糖核酸（deoxyribonuclic acid, DNA）、一單股DNA或所述DNA之轉錄產物（例如核糖核酸分子，ribonucleic acid，RNA）。需知本揭示內容無關乎自然界或自然狀態下的基因多核苷酸序列。能用以分離或純化（或部份純化）本發明之核酸、多核苷酸或核苷酸序列的方法包含，但不限於離子交換色層分析（ion-exchange chromatography）、分子篩選色層分析（molecular size exclusion chromatography）或是可用於基因工程技術諸如擴增（amplification）、扣除雜交法（subtractive hybridization）、轉殖（cloning）、次轉殖（sub-cloning）、化學合成（chemical synthesis）或其組合等基因工程技術。

「序列相同性」(sequence identity)一詞在此是指二條或多條序列或次序列在進行比較或比對時的最大對應值，其中該些序列或次序列係相同或具有一特定比例之相同的胺基酸殘基或核苷酸。為取得相同百分比，該些序列是以最佳化的比對方式進行比對(例如，可在第一胺基酸序列中插入或刪去間隙，使其與第二胺基酸序列比對時可達最大序列相同性)。再比對位於對應位置的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置與第二序列中相對應的位置具有相同的胺基酸殘基或核苷酸時，則該位置的二個分子係為相同。二條序列的相同百分比是序列間相同位置的數量函數(即，相同百分比＝相同位置的數量／位置的總數量(例如，兩兩排列的位置數量) × 100)。在某些實施方式中，二條序列具有相同的長度。用來比對序列的方法是相關領域人士所熟知的，例如GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。

如上所述，目前以生物方式合成蝦紅素仍有諸多限制，利用生物合成蝦紅素的成本明顯高出化學合成許多。然而，化學合成往往會導致環境污染，且合成產物不易保存，亦不易被人體所吸收。有鑑於此，本發明旨在提供一種策略（第3圖），能有效且大量地於宿主細胞中製備蝦紅素或其前趨物或衍生物。相較於傳統方法（例如基因轉殖微生物）或化學合成，本發明策略具有4項優勢：（1）可合成較高量的前趨物，（2）較短的代謝路徑，（3）最終產物的立體結構具有生物活性，以及（4）酯化形式易於吸收。

具體來說，本揭示內容提供一重組多核苷酸序列，其係用以編碼數種調控生物合成蝦紅素的多條胜肽；一包含本發明重組多核苷酸序列的載體；一包含本發明重組多核苷酸序列和／或載體的宿主細胞；以及一種利用本發明宿主細胞來生物合成蝦紅素或其前趨物或衍生物的方法。基於蝦紅素和／或其前趨物或衍生物的抗氧化功效，本揭示內容亦提供一種用以改善宿主細胞對壓力之耐受度的方法，以及一種用以增加宿主細胞製備乙醇或漿果赤黴素III之產量的方法。

本發明製備出的蝦紅素可以是3S, 3S’-蝦紅素或3R, 3R’-蝦紅素。蝦紅素的前趨物可以是焦磷酸香葉香葉酯（geranylgeranyl-pyrophosphate）、尼基葉黃素（phenicoxanthin）、茄紅素（lycopene）、海膽酮（echinenone）、斑螯黃質（canthaxanthin）、八氫番茄紅素（phytoene）、玉米黃質（zeaxanthin）、β-隱黃素（β-cryptoxanthin）或β-胡蘿蔔素（β-carotene）。蝦紅素的衍生物可以是蝦紅素單酯體（monoester）或蝦紅素雙酯體（diester）。

1. 重組多核苷酸序列

本揭示內容的第一態樣是關於一重組多核苷酸序列，其中重組多核苷酸序列是依據以啟動子為基礎的基因組合及同步表現（Promoter-based Gene Assembly and Simultaneous Overexpression, PGASO）方法（Chang et al., 2012）來建構完成。PGASO方法是一種利用具有重疊區域之多核苷酸序列來重組帶有不同啟動子之基因組的選殖方法；利用該方法可將多個基因組依特定順序插入宿主細胞的基因體（genome）中。簡單來說，各基因組包含二部份：（1）一段連接於啟動子之5’端的基因序列，以及（2）一段位於基因組之3’端且與其鄰近基因組之5’端相同的基因序列。第一基因組啟動子的5’端序列與第二基因組的3’端序列係與宿主基因體之特定位置相互同源的基因序列，故可利用同源重組（homologous recombination）的機制將二基因組插入宿主基因體之特定位置。各基因組中啟動子的序列應為不同的序列。而基因組之3’端序列則應與鄰近下游基因組的部份啟動子序列相互同源。當將各基因組轉殖至宿主細胞內後，各基因組會藉由啟動子與對應序列間的重疊序列進行同源重組，重組後的重組多核苷酸序列會再利用第一基因組中的啟動子序列與基因體中預設的同源序列和最後一組基因組中的3’端序列與基因體中預設的同源序列，以預先設定的順序插入宿主細胞的基因體中。

以下所有重組多核苷酸序列皆是利用PGASO的技術建構而成。

1.1 包含二基因組的重組多核苷酸序列

依據本揭示內容一實施方式，本發明重組多核苷酸序列包含二組基因組。第一基因組包含以第一啟動子驅動的第一核酸序列，其中該第一核酸序列係用以編碼焦磷酸香葉香葉酯合成酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase, GGPP synthase）；已知焦磷酸香葉香葉酯合成酶可催化焦磷酸香葉（geranyl pyrophosphate, FPP）形成焦磷酸香葉香葉酯（geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP）。第二基因組包含由第二啟動子驅動的第二核酸序列，其中該第二核酸序列係用以編碼3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl–coenzyme A reductase，HMG-CoA reductase，以下簡稱HMG-CoA還原酶）；已知HMG-CoA還原酶可催化甲基二羥戊酸（mevalonic acid）形成乙醯輔酶A（Acetyl-CoA）。基於PGASO的建構策略，一基因組的3’端會與位於該基因組下游之另一基因組的5’端相互同源。據此，當二基因組同時轉殖至宿主細胞後，其會進行同源重組形成一重組多核苷酸序列。

舉例來說，依據本揭示內容一實施方式，第一基因組的3’端序列係與第二啟動子的部份序列相互同源。經同源重組後，重組多核苷酸序列會包含二基因組；其由5’端至3’端分別為第一基因組和第二基因組。

可選擇性地，本發明重組多核苷酸序列可更包含一標記基因組，該標記基因組包含一標記啟動子及一可操作式地連結至該標記啟動子之標記基因。依據本揭示內容另一實施方式，第一基因組的3’端序列與標記啟動子的部份序列相互同源，而標記基因組的3’端序列則與第二啟動子的部份序列相互同源。據此，經同源重組後，標記基因組會位於第一和第二基因組之間。

為製備焦磷酸香葉香葉酯合成酶，第一核酸序列為一crtE 基因或其片段；其中該crtE 基因或其片段可以源自紅發夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous ）、天藍色鏈黴菌（Streptomyces coelicolor ）、麩胺酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum ）、嗜高溫放線菌（Thermobifida fusca ）或雙叉桿菌（Bifidobacterium longum ）的crtE 基因。在一特定實施方式中，第一核酸序列係源自紅發夫酵母之crtE 基因的催化域，且包含序列編號：1的序列。

為製備HMG-CoA還原酶，第二核酸序列為一HMG1 基因或其片段，其中該HMG1 基因或其片段可以源自馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus ）、 啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae ）、 史特卡雲杉（Picea sitchensis ）、土麴黴（Aspergillus terreus ）或靈芝（Ganoderma lucidum ）的HMG1 基因。在一實施方式中，第二核酸序列係源自馬克斯克魯維酵母之HMG1 基因的催化域。已知截斷型HMG-CoA還原酶（truncated HMG-CoA reductase, tHMG1）會減少反饋抑制（feedback inhibition），進而增加焦磷酸香葉香葉酯的產量。據此，在一特定實施方式中，第二核酸序列為一tHMG1 基因，且包含序列編號：2的序列。

標記基因可以是螢光基因、β-葡萄醣醛酸酶（β-glucuronidase）基因和LacZ 基因等篩分（screening）標記基因，亦可以是抗生素抗藥性基因等篩選（selection）標記基因。依據本揭示內容一實施方式，本發明標記基因是一種抗生素抗藥性基因，例如可對康黴素（kanamycin）／建那黴素（geneticin, G418）／新黴素（neomycin）產生抗性的KanMX 標記基因，或是可對金黃擔子素A（aureobasidin A, AbA）產生抗性的AUR1-C 基因。

適用於驅動第一、第二及標記核酸序列／基因表現的啟動子包含，但不限於，ScGapDH啟動子、KlGapDH啟動子、ScPGK啟動子、KlPGK啟動子、KlADHI啟動子、ScADHI啟動子、KlADH4啟動子、ScADH4啟動子、KlLac4啟動子和ICL啟動子。較佳的情況是，利用不同的啟動子來驅動重組多核苷酸序列中各核酸序列或基因組的表現。在一實施方式中，第一啟動子是KlLac4啟動子，第二啟動子是ScADHI啟動子，而標記啟動子則為KlGapDH啟動子。

1.2 包含四基因組的重組多核苷酸序列

依據本揭示內容另一實施方式，本發明重組多核苷酸序列包含四組基因組。具體來說，除了本揭示內容1.1 所述之用以編碼焦磷酸香葉香葉酯合成酶和HMG-CoA還原酶的第一及第二基因組外，本發明重組多核苷酸序列更包含第三和第四基因組。第三基因組包含以第三啟動子驅動的第三核酸序列，其中該第三核酸序列係用以編碼八氫茄紅素去飽合酶（phytoene desaturase）；已知八氫茄紅素去飽合酶可催化順-八氫茄紅素（cis -phytoene）形成茄紅素（lycopene）。第四基因組包含以第四啟動子驅動的第四核酸序列，其中該第四核酸序列係用以編碼一具有八氫茄紅素合成酶（phytoene synthase）和茄紅素環化酶（lycopene cyclase）個別功能之雙功能酵素（以下簡稱八氫茄紅素合成酶／茄紅素環化酶）；已知八氫茄紅素合成酶和茄紅素環化酶皆可催化茄紅素形成β-胡蘿蔔素（β-carotene）。

利用PGASO的建構策略來重組該四組基因組。亦即，各基因組的3’端會與位於其下游之下一基因組的5’端相互同源。舉例來說，在本揭示內容一實施方式中，第三基因組的3’端序列係與第一啟動子的部份序列相互同源；第一基因組的3’端序列係與第四啟動子的部份序列相互同源；而第四基因組的3’端序列係與第二啟動子的部份序列相互同源。據此，該四組基因組將會於活體內自發性地重組形成一重組多核苷酸序列，其由5’端至3’端依序包含第三基因組、第一基因組、第四基因組和第二基因組。

可選擇性地，本發明重組多核苷酸序列可包含一標記基因組，該標記基因組包含一標記啟動子和一可操作式地連結至該標記啟動子之標記基因。包含標記基因組的重組多核苷酸序列係利用PGASO方法建構而成；因此，為簡潔起見在此省略其詳細描述。依據本揭示內容一實施方式，標記基因組是位於第一和第四基因組之間。

為製備八氫茄紅素去飽合酶，第三核酸序列為一crtI 基因或其片段；其中該crtI 基因或其片段可以源自紅發夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous ）、 聚球藻WH 8102（Synechococcus sp. WH 8102）、 集胞藻PCC 6803（Synechocystis sp. PCC 6803）、 念珠藻PCC 7120（Nostoc sp. PCC 7120）或番茄（Solanum lycopersicum ）之crtI 基因。在一特定實施方式中，第三核酸序列係源自紅發夫酵母之crtI 基因的催化域，且包含序列編號：3的序列。

為製備具有八氫茄紅素合成酶和茄紅素環化酶個別功能之雙功能酵素，第四核酸序列包含crtYB 基因或其片段；其中該crtYB 基因或其片段可以源自紅發夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous ）、玉米黑穗菌521（Ustilago maydis 521）、硫化葉菌（Sulfolobus solfataricus ）或嗜苦古菌（Picrophilus torridus ）之crtYB 基因。在一特定實施方式中，第四核酸序列係源自紅發夫酵母之crtYB 基因的催化域，且包含序列編號：4的序列。

標記基因可以是篩分標記基因或篩選標記基因。依據本揭示內容一實施方式，標記基因為一抗生素抗藥性基因KanMX 。

適用於驅動第一、第二、第三、第四及標記核酸序列／基因表現的啟動子包含，但不限於，ScGapDH啟動子、KlGapDH啟動子、ScPGK啟動子、KlPGK啟動子、KlADHI啟動子、ScADHI啟動子、KlADH4啟動子、ScADH4啟動子、KlLac4啟動子和ICL啟動子。較佳的情況是，利用不同的啟動子來驅動重組多核苷酸序列中各核酸序列或基因組的表現。在一實施方式中，第一啟動子是ScPGK啟動子，第二啟動子是ScADHI啟動子，第三啟動子是KlLac4啟動子，第四啟動子是KlADHI啟動子，而標記啟動子則是KlGapDH啟動子。

1.3 用以表現 3S, 3S’- 蝦紅素之包含六基因組的重組多核苷酸序列

依據本揭示內容另一實施方式，本發明重組多核苷酸序列包含用以製備3S, 3S’-蝦紅素的六組基因組。具體來說， 除了本揭示內容1.2 所述之用以編碼焦磷酸香葉香葉酯合成酶、HMG-CoA還原酶、八氫茄紅素去飽合酶和八氫茄紅素合成酶／茄紅素環化酶的第一至第四基因組外，本發明重組多核苷酸序列更包含二基因組，其係分別用以表現β-胡蘿蔔素羥化酶（β-carotene hydroxylase）和β-胡蘿蔔素酮醇酶（β-carotene ketolase）；已知β-胡蘿蔔素羥化酶和β-胡蘿蔔素酮醇酶係為將β-胡蘿蔔素轉換為3S, 3S’-蝦紅素的必要性酵素。更具體來說，第五基因組包含以第五啟動子驅動的第五核酸序列，其中該第五核酸序列係用以編碼β-胡蘿蔔素羥化酶。第六基因組包含以第六啟動子驅動的第六核酸序列，其中該第六核酸序列係用以編碼β-胡蘿蔔素酮醇酶。

相似地，包含六組基因組之重組多核苷酸序列亦是利用PGASO的建構策略重組而成；其中，各基因組的3’端會與位於其下游之下一基因組的5’端相互同源。舉例來說，在一特定實施例中，第三基因組的3’端序列係與第一啟動子的部份序列相互同源，第一基因組的3’端序列係與第五啟動子的部份序列相互同源，第五基因組的3’端序列係與第六啟動子的部份序列相互同源，第六基因組的3’端序列係與第四啟動子的部份序列相互同源，而第四基因組的3’端序列則係與第二啟動子的部份序列相互同源。一旦轉殖至宿主細胞內後，該六組基因組會自發性地重組形成一重組多核苷酸序列，其由5’端至3’端依序包含第三基因組、第一基因組、第五基因組、第六基因紅、第四基因組和第二組基因。

可選擇性地，本發明重組多核苷酸序列可包含一標記基因組，該標記基因組包含一標記啟動子及一可操作式地連結至該標記啟動子之標記基因。在一實施例中，建構的標記基因組是位於第五和第六基因組之間。

為製備β-胡蘿蔔素羥化酶，第五核酸序列包含一chYb 基因或其片段，其中該chYb 基因或其片段可以源自萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii ）、小球藻（Chlorella zofingiensis ）或雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis ）之chYb 基因。在一實施方式中，第五核酸序列是源自萊茵衣藻之chYb 基因的催化域，且包含序列編號：5的序列。在另一實施方式中，第五核酸序列是源自小球藻之chYb 基因的催化域，且包含序列編號：6的序列。在再另一實施方式中，第五核酸序列是源自雨生紅球藻之chYb 基因的催化域，且包含序列編號：7的序列。

為製備β-胡蘿蔔素酮醇酶，第六核酸序列包含一bkt 基因或其片段，其中該bkt 基因或其片段可以源自萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii ）、 念珠藻PCC 7120（Nostoc sp. PCC 7120）、 無類囊體藍藻PCC 7421（Gloeobacter violaceus PCC 7421）、 聚球藻CC9902（Synechococcus sp. CC9902）或聚球藻WH 8102（Synechococcus sp. WH 8102）之bkt 基因。在一特定實施方式中，第六核酸序列係源自萊茵衣藻之bkt 基因的催化域，且包含序列編號：8的序列。

標記基因可以是篩分標記基因或篩選標記基因。依據本揭示內容一實施方式，標記基因為一抗生素抗藥性基因KanMX 。

適用於驅動第一至第六核酸序列及標記基因表現的啟動子包含，但不限於，ScGapDH啟動子、KlGapDH啟動子、ScPGK啟動子、KlPGK啟動子、KlADHI啟動子、ScADHI啟動子、KlADH4啟動子、ScADH4啟動子、KlLac4啟動子和ICL啟動子。較佳情況是，利用不同的啟動子來驅動重組多核苷酸序列中各核酸序列或基因組的表現。在一實施方式中，第一啟動子是ScGapDH啟動子，第二啟動子是ScADHI啟動子，第三啟動子是KlLac4啟動子，第四啟動子是KlADHI啟動子，第五啟動子是ScPGK啟動子，第六啟動子是KlPGK啟動子，而標記啟動子則是KlGapDH啟動子。

1.4 用以表現 3R, 3R’- 蝦紅素之包含六基因組的重組多核苷酸序列

本揭示內容亦提供一用以於宿主細胞中製備3R, 3R’-蝦紅素的重組多核苷酸序列。依據本揭示內容的實施方式，本發明用以製備3R, 3R’-蝦紅素的重組多核苷酸序列包含六組基因組，其中前四組基因組為本揭示內容1.2 所述之基因組，其係分別用以表現焦磷酸香葉香葉酯合成酶、HMG-CoA還原酶、八氫茄紅素去飽合酶和八氫茄紅素合成酶／茄紅素環化酶；另外二組基因組（即第七基因組和第八基因組）則分別用以表現P450還原酶（P450 reductase）和β-胡蘿蔔素加氧酶（β-carotene oxygenase）；已知P450還原酶和β-胡蘿蔔素加氧酶在催化β-胡蘿蔔素形成3R, 3R’-蝦紅素的生物合成路徑中扮演著重要的角色。具體來說，第七基因組包含以第七啟動子驅動的第七核酸序列，其中該第七核酸序列係用以編碼P450還原酶。第八基因組包含以第八啟動子驅動的第八核酸序列，其中該第八核酸序列係用以編碼β-胡蘿蔔素加氧酶。

同樣地，用以製備3R, 3R’-蝦紅素的重組多核苷酸序列也是利用PGASO策略建構而成，其中，各基因組的3’端會與位於其下游之下一基因組的5’端相互同源。舉例來說，依據本揭示內容一實施方式，第三基因組的3’端序列係與第七啟動子的部份序列相互同源；第七基因組的3’端序列係與第一啟動子的部份序列相互同源；第一基因組的3’端序列係與第八啟動子的部份序列相互同源；第八基因組的3’端序列係與第四啟動子的部份序列相互同源；而第四基因組的3’端序列則係與第二啟動子的部份序列相互同源。利用基因組間的同源序列，該七組基因組可於活體內進行同源重組，以形成一重組多核苷酸序列，其由5’端至3’端依序包含第三基因組、第七基因組、第一基因組、第八基因組、第四基因組和第二基因組。

可選擇性地，本發明用以製備3R, 3R’-蝦紅素的重組多核苷酸序列可更包含一標記基因組，該標記基因組包含一由標記啟動子驅動的標記基因。在一較佳的實施方式中，標記基因組是位於第一和第八基因組之間。

為製備P450還原酶，第七核酸序列包含一crtR 基因或其片段，其中該crtR 基因或其片段可以源自紅發夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous ）、黑麴菌（Aspergillus niger ）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）、形馬拉色菌CBS 7966（Malassezia globosa CBS 7966）或玉米黑穗菌521（Ustilago maydis 521）之crtR 基因。 在一特定實施方式中，第七核酸序列係源自紅發夫酵母之crtR 基因，且包含序列編號：9的序列。

為製備β-胡蘿蔔素加氧酶，第八核酸序列包含一crtS 基因或其片段，其中該crtS 基因或其片段可以源自紅發夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous ）、智人（Homo sapiens ）、溝鼠（Rattus norvegicus ）、家兔（Oryctolagus cuniculus ）或果蠅（Drosophila melanogaster ）之crtS 基因。在一實施方式中，第八核酸序列係源自紅發夫酵母之crtS 基因，且包含序列編號：10的序列。

標記基因可以是篩分標記基因或篩選標記基因。依據本揭示內容一實施方式，所述標記基因為一抗生素抗藥性基因KanMX 。

適用於驅動第一、第二、第三、第四、第七、第八和標記核酸序列／基因表現的啟動子包含，但不限於，ScGapDH啟動子、KlGapDH啟動子、ScPGK啟動子、KlPGK啟動子、KlADHI啟動子、ScADHI啟動子、KlADH4啟動子、ScADH4啟動子、KlLac4啟動子和ICL啟動子。較佳的情況是，利用不同的啟動子來驅動重組多核苷酸序列中各核酸序列或基因組的表現。在一實施方式中，第一啟動子是ScPGK啟動子，第二啟動子是ScADHI啟動子，第三啟動子是KlLac4啟動子，第四啟動子是KlADHI啟動子，第七啟動子是ScGapDH啟動子，第八啟動子是KlPGK啟動子，而標記啟動子則是KlGapDH啟動子。所有上述啟動子皆為酵母菌組成型啟動子（constitutive promoter），不論在何種環境下皆具有活性且可有效驅動酵母菌細胞中基因的表現。

依據某些實施方式，本揭示內容1.1 至1.4 所述之各啟動子（即第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八和標記啟動子）包含特定的核苷酸序列。在一特定實施方式中，KlLac4啟動子包含序列編號：63的核苷酸序列；ScGapDH啟動子包含序列編號：64的核苷酸序列；ScPGK啟動子包含序列編號：65的核苷酸序列；KlGapDH啟動子包含序列編號：66的核苷酸序列；KlPGK啟動子包含序列編號：67的核苷酸序列；KlADHI啟動子包含序列編號：68的核苷酸序列；而ScADHI啟動子則包含序列編號：69的核苷酸序列。

當可想見，也可以以其他組成型啟動子來取代本揭示內容1.1 至1.4 所述之各啟動子（即第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八和標記啟動子），其中該些組成型啟動子可在酵母菌以外的物種中驅動下游基因的表現；據此，本發明基因組可於原核宿主細胞（例如細菌宿主細胞）或其他真核宿主細胞（例如真菌、植物、哺乳動物細胞）中有效進行表現。適用於在原核宿主細胞中驅動基因表現的啟動子包含，但不限於，T3啟動子、T5啟動子、T7啟動子、trp 啟動子、lac 啟動子、tac 啟動子（為trp 和lac 啟動子的雜合體）、lac 衍生的啟動子、araBAD 啟動子、recA 啟動子、proU 啟動子、cst-1 啟動子、tatA 啟動子、cadA 啟動子、nar 啟動子、cspA 啟動子、SP6啟動子、Rhamnose啟動子和phoA 啟動子。適用於在哺乳動物細胞中驅動基因表現的啟動子可選擇自，但不限於，由SV40早期啟動子（SV40 early promoter）、勞斯肉瘤病毒啟動子（Rous sarcoma virus promoter）、腺病毒主要晚期啟動子（adenovirus major late promoter）、人類巨細胞病毒即時早期啟動子（human cytomegalovirus (CMV) immediate early promoter）、小鼠幹細胞病毒啟動子（murine stem cell virus (MSCV) promoter）、病毒內部啟動子（virus's internal promoter）、泛素啟動子（Ubiquitin C (UbC) promoter）、延長因子－1α啟動子（elongation factor-1α (EF-1α) promoter）、磷酸甘油酸激酶啟動子（phosphoglycerate kinase (PGK) promoter）或CMV早期啟動子（CMV early enhancer）／雞隻β肌動蛋白啟動子（chicken β actin (CAG) promoter）所組成的群組。

除了PGASO建構方法外，亦可採用所屬領域具有通常知識者所熟知的任何方法，來重組建構本揭示內容1.1 至1.4 所述之基因組（即第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八和標記基因組），例如適當的限制酶和Gateway^® 轉殖系統，前提是只要能製備出欲求之特定產物（3S, 3S’-蝦紅素或3R, 3R’-蝦紅素）即可。

當使用不同方法來建構本發明基因組時，本揭示內容1.1 至1.4 所述之基因組（即第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八和標記基因組）可能會以不同的順序進行重組。舉例來說，在使用不同的重疊／同源序列時，所建構重組的產物可能會與本發明重組多核苷酸序列具有不同的基因組排列順序。或者是，可依據特定的排列順序來使用不同的限制酶，藉以產生不一樣的基因產物。因此，包含本發明基因組且具有不同排列順序的重組多核苷酸序列亦屬本揭示內容之範疇。

可利用任何實驗室或臨床研究常用之方法來確認及分析重組多核苷酸序列的組成順序。舉例來說，可藉由基因定序、限制酶酶切或長聚合酶連鎖反應（long-PCR）試驗來進行分析。依據本揭示內容一實施方式，是利用長聚合酶連鎖反應來分析重組多核苷酸序列的組成順序。一般來說，長聚合酶連鎖反應是一種用以放大極長PCR產物（長達40 kb DNA）的技術，可由巿售的商業套組，並參閱其所附之操作手冊來進行試驗。

2. 包含本發明重組多核苷酸序列的載體

本揭示內容的第二態樣是關於一包含本發明重組多核苷酸序列和控制序列的載體，其中該控制序列是可操作式地連結至該重組多核苷酸序列。

控制序列是用以輔助重組多核苷酸序列於不同類型之宿主細胞中進行表現。因此，控制序列可包含不同的成分（例如啟動子、核醣體結合位置、促進子／緘默子及終止子）。舉例來說，於酵母菌中表現的控制序列通常包含一自主複製序列（autonomously replicating sequence, ARS），其係包含酵母菌基因體中的複製起始序列（replication origin, ori）；自主複製序列通常包含四個區域（A、B1、B2及B3），其係以於質體表現的穩定度來依序命名。A區域為高度保留性區域，任何的突變皆會使複製起始序列的功能喪失。相較之下，B1、B2和B3區域的突變則僅會影響、而不會抑制複製起始序列的功能。一般來說，為了起始載體於酵母菌的複製，控制序列中的複製起始序列是由一可與複製蛋白結合的必要性DNA序列（即ARS保守序列，ARS consensus sequence，ACS）所組成。

在原核宿主細胞表現的控制序列可包含一複製起始序列和一操縱子（operon）。一般而言，複製起始序列 可以是一源自大腸桿菌（Escherichia coli ,E. coli ）基因體的oriC ，或是一源自pBR322（一種大腸桿菌的質體）且包含二突變的pUC。操縱子通常可用以調控啟動子的表現；適用的操縱子包含，但不限於lac 操縱子、trp 操縱子或源自Tn10之抗四環素操縱子（Tn10-derived tetracycline resistance (Tet ) operon）。

在哺乳動物細胞表現的控制序列則可包含一複製起始序列及一促進子／緘默子。用以起始載體於哺乳動物細胞表現的複製起始序列可以是一源自SV40病毒基因體的SV40起始序列，或是一源自哺乳動物細胞基因體的oriC 。促進子為一位於調控基因上游或下游的短片段DNA（50-1500 bp），通常為順式作用（cis -acting），可與蛋白質（活化子）結合來活化基因的轉錄；緘默子則為一位於調控基因上游或下游的DNA序列，可與轉錄因子（抑制子）結合來抑制基因的轉錄。

可利用習知技藝人士所熟知的任一方法，將本發明重組多核苷酸序列以可操作方式連結至控制序列。舉例來說，可利用適當的限制酶、Gateway^® 轉殖系統或同源重組進行分子選殖。依據本揭示內容一實施方式，係以同源重組的方式將本發明重組多核苷酸序列可操作式地連結至控制序列。具體來說，本發明重組多核苷酸序列是與控制序列共轉殖至酵母菌中，其中重組多核苷酸序列的5’端和3’端是分別與控制序列中之標記基因的3’端和5’端相互同源。據此，包含於重組多核苷酸序列的基因組可於活體內自發性地與控制序列進行重組。在一特定實施方式中，控制序列是質體pRS426，而標記基因為URA3 基因。

依據本揭示內容一實施方式，控制序列是一高拷貝數（high-copy-number）質體。因此，在進行同源重組後，本發明重組多核苷酸序列可於酵母菌中高度表現。

3. 用以表現本發明重組多核苷酸列的宿主細胞

本揭示內容的第三態樣是關於一種用以製備蝦紅素、蝦紅素前趨物及／或蝦紅素衍生物的宿主細胞。在某些實施方式中，是將本揭示內容2 所述之包含1.1 、1.2 、1.3 或1.4 之重組多核苷酸序列的載體轉殖至宿主細胞中。

所製備而成的蝦紅素可以是3S, 3S’-蝦紅素或3R, 3R’-蝦紅素。蝦紅素的前趨物可以是焦磷酸香葉香葉酯、尼基葉黃素、茄紅素、海膽酮、斑螯黃質、八氫番茄紅素、玉米黃質、β-隱黃素或β-胡蘿蔔素。蝦紅素的衍生物可以是蝦紅素單酯體或蝦紅素雙酯體。

可利用任何習知技藝人士所熟知的方法將本發明重組多核苷酸序列及／或載體轉殖至宿主細胞中。具體來說，用以將外源性DNA及／或載體轉殖至一原核宿主細胞（例如細菌宿主細胞）的方法包含化學處理（例如將宿主細胞培養於包含二價陽離子的溶液中，再以熱進行處理），以及電穿孔（electroporation，例如以電場刺激宿主細胞，使其於細胞膜上產生孔洞）。

用以將外源性DNA及／或載體轉殖至一酵母菌的方法包含，但不限於，酵素處理（以酵素降解酵母菌的細胞壁）、化學處理（以鹼性陽離子處理酵母菌）、電穿孔及玻璃珠攪拌。依據本揭示內容一實施方式，是利用電穿孔將本發明重組多核苷酸序列及／或載體轉殖至酵母菌細胞中。

用以將外源性DNA及／或載體轉殖至一真核宿主細胞（例如哺乳動物細胞）的方法包含以化學（例如磷酸鈣、高分支有機化合物／樹枝狀聚合物(dendrimer)、脂質體及陽離子聚合物）處理宿主細胞、電穿孔、細胞擠壓（cell squeezing，輕壓細胞膜）、超音波穿孔（sonoporation，包含利用高強度超音波於細胞膜形成孔洞）、光轉染（optical transfection，利用高聚焦電射於細胞膜製造一微小孔洞）、基因交付（impalefection，將DNA連接至一可穿透細胞之奈米纖維的表面）、基因槍（gene gun，將DNA連接至一奈米粒子後，直接注入標的細胞核內）、磁轉染（magnetofection）／磁輔助轉染（magnet assisted transfection，利用磁力將DNA送至標的細胞內），以及病毒法／病毒轉染（利用病毒作為轉體，將DNA送至標的細胞內）。

因此，適用以表現蝦紅素、蝦紅素前趨物及／或蝦紅素衍生物的宿主細胞可以是原核細胞（例如細菌細胞）或真核細胞（例如酵母菌細胞及哺乳動物細胞）。依據本揭示內容一較佳實施方式，適用的宿主細胞為一酵母菌細胞。

依據某些實施方式，宿主細胞可以是馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus ）、土麴黴（Aspergillus terreus ）、博伊丁假絲酵母（Candida boidinii ）、畢赤酵母（Pichia pastoris ）、漢遜氏酵母（Hansenula polymorpha ）、乳酸克魯維酵母（Klyveromyces lactis ）、 耶氏解脂酵母（Yarrowia lipolytica ）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）、啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae ）、 蠟蚧輪枝菌屬（Lecanicillium ）、覆膜酵母屬（Galactomyces ）、地絲菌屬（Geotrichum ）、帚樣黴菌屬（Scopulariopsis ）、鐮孢菌屬（Fusarium ）、德巴利酵母（Debaryomyces, Dekkera ）、 孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora ）、瑟氏哈薩克酵母屬（Kazachstania ）、 郎香菌屬（Lachancea ）、 美極梅奇酵母（Metschnikowia ）、 畢赤酵母屬（Pichia ）、圓酵母屬（Torulopsis ）、 許旺酵母屬（Schwanniomyces ）、斯塔摩酵母屬（Starmerella ）、 三角酵母屬（Trigonopsis ）、 威克漢遜酵母屬（Wickerhamomyces ）、 結合酵母屬（Zygosaccharomyces ）、接合囊孢菌（Zygotorulaspora ）、 孢圓酵母屬（Torulaspora ）、 紅黴菌屬（Neurospora ）、 麴黴菌屬（Aspergillus ）、 青黴菌屬（Penicillium ）、 絲胞菌屬（Sporendonema ）、 隱球酵母屬（Cystofilobasidium ）、 耐冷酵母屬（Guehomyces ）、 白黴菌屬（Mucor ）、 黑黴菌屬（Rhizopus ）、 大腸桿菌（Escherichia coli ）、 雙叉桿菌屬（Bifidobacterium ）、 短桿菌屬（Brevibacterium ）、 棒狀桿菌屬（Corynebacterium ）、短狀桿菌屬（Brachybacterium ）、 微桿菌屬（Microbacterium ）、 節桿菌屬（Arthrobacter ）、 庫克菌屬（Kocuria ）、 細球菌屬（Micrococcus ）、 丙酸桿菌屬（Propionibacterium ）、 鏈黴菌屬（Streptomyces ）、 芽孢桿菌屬（Bacillus ）、 肉食桿菌屬（Carnobacterium ）、 腸球菌屬（Enterococcus ）、 四聯球菌屬（Tetragenococcus ）、 乳酸桿菌屬（Lactobacillus ）、 小球菌屬（Pediococcus ）、 白念珠球菌屬（Leuconostoc ）、 酒酒球菌屬（Oenococcus ）、 魏斯氏菌屬（Weissella ）、 大型球菌屬（Macrococcus ）、 葡萄球菌屬（Staphylococcus ）、 乳酸球菌屬（Lactococcus ）、 鏈球菌屬（Streptococcus ）、 醋酸菌屬（Acetobacter ）、 葡糖酸醋桿菌屬（Gluconacetobacter ）、 哈夫尼亞菌屬（Hafnia ）、 鹽單胞菌屬（Halomonas ）或發酵單孢菌屬（Zymomonas ）細胞。在一特定實施方式中，宿主細胞為馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus ）。

依據一實施方式，宿主細胞可以包含一或多拷貝數之本揭示內容1 和2 所述的本發明基因組／重組多核苷酸序列／載體，藉以有效率地製備蝦紅素、蝦紅素前趨物及／或蝦紅素衍生物。

有鑑於發酵過程中，常伴隨產生對宿主細胞具有毒性的中間產物，或是需利用該些中間產物來大量製備最終產物；利用本發明重組多核苷酸序列／載體所產生的蝦紅素／蝦紅素前趨物／蝦紅素衍生物可保護宿主細胞，避免在發酵過程中受到毒性中間產物的傷害。

依據本揭示內容的實施方式，產生的蝦紅素／蝦紅素前趨物／蝦紅素衍生物具備抗氧化功效，可改善宿主細胞對壓力的耐受性。壓力可以來自乙醇、異丁醇、紫外光照射、糠醛及／或抗癌藥物的前趨物。在一特定實施例中，宿主細胞係對一用以製備抗癌藥物紫杉醇（paclitaxel）的前趨物10-去乙醯漿果赤黴素III（10-deacetyl baccatin III, 10 DB）具有耐受性。可依實驗需求使用不同的方法來測量宿主細胞對各式壓力的耐受度。舉例來說，可藉由測量菌落數、細胞生長、細胞密度或基因表現來了解耐受性。

4. 用以製備蝦紅素、蝦紅素前趨物或蝦紅素衍生物的方法

本揭示內容的第四態樣是關於一種用以製備蝦紅素、蝦紅素前趨物及／或蝦紅素衍生物的方法。該方法包含將本揭示內容3 所述之宿主細胞培養於一培養液（例如，一酵母菌萃取物-蛋白腖-甘油培養液，yeast extract-peptone-glycerol medium, YPG medium）中，其中該培養液包含一種選自由葡萄糖、半乳糖、甘油、脂肪酸和／或其組合所組成之群組的成分。在一實施方式中，培養液包含甘油。在另一實施方式中，培養液包含葡萄糖。在另一實施方式中，培養液包含半乳糖。在再另一實施方式中，培養液包含脂肪酸，例如辛酸。

足以誘發本發明宿主細胞表現各基因組的葡萄糖、半乳糖或甘油濃度約為0.5-40%（重量濃度，重量／重量）；亦即，濃度可以是0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%或40%；而足以誘發本發明宿主細胞表現各基因組的脂肪酸濃度則為0.001%-5%（重量濃度，重量／重量）；亦即，濃度可以是0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%、0.006%、0.007%、0.008%、0.009%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%或5%。

較佳的情況是，用以誘發本發明宿主細胞表現各基因組的葡萄糖、半乳糖或甘油濃度約為5-30%；而用以誘發本發明宿主細胞表現各基因組的脂肪酸濃度則為0.005-0.5%。

依據本揭示內容某些實施方式，培養液包含一種選自由葡萄糖、半乳糖、甘油、脂肪酸及／或其組合所組成之群組的成分。在一實施方式中，培養液包含20%葡萄糖。在另一實施方式中，培養液包含20%半乳糖。在再另一實施方式中，培養液包含0.01-0.1%脂肪酸。在一較佳的實施方式中，培養液包含10-20%甘油。

當可想見，培養液可包含至少二種選自由葡萄糖、半乳糖、甘油、脂肪酸及／或其組合所組成之群組的成分，藉以更有效地誘發宿主細胞表現各基因組。

依據本揭示內容其他實施方式，適用於培養本發明宿主細胞生產蝦紅素的溫度約為18^° C-42^° C；舉例來說，溫度可以是18^° C、19^° C、20^° C、21^° C、22^° C、23^° C、24^° C、25^° C、26^° C、27^° C、28^° C、29^° C、30°C、31^° C、32^° C、33^° C、34^° C、35^° C、36^° C、37^° C、38^° C、39^° C、40^° C、41^° C或42^° C。在一實施方式中，溫度為30^° C。在另一實施方式中，溫度為37^° C。依據一較佳的實施方式，溫度為25^° C。

可利用任何本所屬領域習知技藝人士所熟知的方法來測量本發明重組多核苷酸序列／載體的表現。舉例來說，可直接目測及／或照像記錄菌落及／或培養液的顏色變化。或是，藉由測量細胞生長、細胞濃度、基因表現、高效能液相層析分析或液相層析法－質譜法來分析序列／載體的表現。

依據本揭示內容某些實施方式，本發明方法更可包含將製備之蝦紅素、蝦紅素前趨物及／或蝦紅素衍生物自宿主細胞或培養液中分離的步驟。在一實施方式中，是直接將蝦紅素由酵母菌中萃取出來；萃取方法包含，但不限於，自溶作用（autolysis，將酵母菌與甲苯／氫氧化銨均勻混合後，靜置於室溫24-48小時）、均質化（homogenization，使用均質機或法式壓碎機）、玻璃珠振盪（利用玻璃珠攪拌來破壞酵母菌細胞）、酵素水解（以消解酶(zymolase)或酶解酶(lyticase)來分解細胞壁）、冷凍及研磨（以液態氮冷凍細胞後，利用研缽和研杵來研磨冷凍的細胞）、超臨界萃取，以及化學處理（例如以SDS及／或丙酮處理宿主細胞）。依據本揭示內容一實施方式，是利用丙酮將蝦紅素由酵母菌中萃取出來。依據另一實施方式，是利用冷凍乾燥法及甲醇處理將蝦紅素由酵母菌中萃取出來。

依據本揭示內容某些實施方式，製備出的蝦紅素可以是3S、3S’-蝦紅素或3R、3R’-蝦紅素。

依據一實施方式，本發明方法所製備的產物是一蝦紅素前趨物，其可以是焦磷酸香葉香葉酯、尼基葉黃素、茄紅素、海膽酮、斑螯黃質、八氫番茄紅素、玉米黃質、β-隱黃素或β-胡蘿蔔素。

依據其他實施方式，本發明方法所製備的產物是一蝦紅素衍生物，其可以是蝦紅素單酯體或蝦紅素雙酯體。

依據本揭示內容的實施方式，本發明方法製備的蝦紅素及／或其前趨物或衍生物具有抗氧化功效，可作為一種抗氧化劑。可利用習知技藝人士所熟知的任何活體外及／或活體內方法來測量其抗氧化功效。舉例來說，活體外的測量方法可以是1、1-二苯基-2-苦基苯肼（1、1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，又稱α,α-二苯基-β-苦基苯肼，α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl， DPPH）清除活性試驗、過氧化氫清除活性試驗、一氧化氮清除活性試驗、過氧化亞硝酸鹽自由基（peroxynitrite radical）清除活性試驗、水溶性維生素E相似物等量抗氧化能力（Trolox equivalent antioxidant capacity、TEAC）試驗／ABTS自由基陽離子脫色（ABST radical cation decolorization）試驗、總自由基捕獲抗氧化參數（total radical-trapping antioxidant parameter、TRAP）試驗、鐵離子減少抗氧化力（ferric reducing-antioxidant power、FRAP）試驗、超氧化物自由基清除活性（superoxide radical scavenging activity、SOD）試驗、羥基自由基清除活性（hydroxyl radical scavenging activity）試驗、羥基自由基趨避能力（hydroxyl radical averting capacity、HORAC）試驗、氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity、ORAC）試驗、還原力（reducing power、RP）試驗、磷鉬（phosphomolybdenum）試驗、硫氰酸鐵（ferric thiocyanate、FTC）試驗、硫巴比妥酸（thiobarbituric acid、TBA）試驗、N,N-二甲基-對苯二胺二鹽酸鹽（N,N-dimethyl-p-phenylene diamine dihydrochloride、DMPD） 試驗、β-胡蘿蔔素亞油酸（β-carotene linoleic acid）試驗／共軛二烯（conjugated diene）試驗、黃嘌呤氧化酶 （xanthine oxidase）試驗、銅離子減少抗氧化能力（cupric ion reducing antioxidant capacity、CUPRAC）試驗，或是金屬螫合活性（metal chelating activity）試驗。活體內測量抗氧化活性的方法則包含，但不限於，血漿鐵還原能力（ferric reducing ability of plasma）、評估還原型麩胺基硫（reduced glutathione (GSH) estimation）、評估麩胺基硫過氧化酶（glutathione peroxidase (GSHPx) estimation）、麩胺基硫轉移脢（glutathione-S-transferase、GST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase、SOD）試驗、過氧化氫酶（catalase、CAT）、γ-麩胺酸轉胜肽酶（γ-glutamyl transpeptidase、GGT）活化試驗、麩胺基硫還元酶（glutathione reductase、GR）試驗、脂質過氧化（lipid peroxidation、LPO）試驗及低密度脂蛋白（low-density lipoprotein、LDL）試驗。依據本揭示內容一實施方式，是利用水溶性維生素E相似物等量抗氧化能力試驗／ABTS自由基陽離子脫色試驗來測量蝦紅素或其前趨物或衍生物的抗氧化活性。

下文舉出多種實施例來闡明本發明之部分態樣，以使本發明所屬技術領域中具有通常知識者能藉以實踐本發明。因此不應將這些實施例視為對本發明範圍之限制。本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於此處列舉的說明，當可在不需過度推衍的情形下運用本發明。此處提及的所有文獻，皆視為已完全引用而成為本說明書的一部份。

實施例

材料及方法

基因合成

分別以Art^® 基因合成（GENEART，德國）來合成萊茵衣藻的bkt 基因、萊茵衣藻的chYb 基因 （即CrChYb 基因）、小球藻（Chromochloris zofingiensis ）的chYb 基因（即CzChYb 基因）和雨生紅球藻的chYb 基因（即HpChYb 基因）。所有的合成基因序列皆基於宿主紅發夫酵母的蛋白質編碼，利用GeneOptimizer^® 處理，取得最佳化之多參數基因。

合成的bkt 基因具有序列編號：8的胺基酸序列；合成的CrChYb 基因具有序列編號：5的胺基酸序列；合成的CzChYb 基因具有序列編號：6的胺基酸序列；而合成的HpChYb 基因具有序列編號：7的胺基酸序列。

基因選殖（ gene cloning ）

利用PCR分別將crtE 基因、截斷型HMG1 基因（即tHMG1 基因）、crtI 基因、crtYB 基因、crtR 基因及crtS 基因由紅發夫酵母和馬克斯克魯維酵母增殖放大。表2總結用以擴增各基因的引子和其序列編號。

利用序列編號：70、71、72及73的引子以PCR來擴增KlLac4啟動子，擴增後的KlLac4啟動子具有序列編號：63的核苷酸序列。利用序列編號：74、75、76及77的引子以PCR來擴增ScGapDH啟動子，擴增後的ScGapDH啟動子具有序列編號：64的核苷酸序列。利用序列編號：82、83、84及85的引子以PCR來擴增ScPGK啟動子，擴增後的ScPGK啟動子具有序列編號：65的核苷酸序列。利用序列編號：86、87、88及89的引子以PCR來擴增 KlGapDH啟動子，擴增後的KlGapDH啟動子具有序列編號：66的核苷酸序列。利用序列編號：90、91、92及93的引子以PCR來擴增KlPGK啟動子，擴增後的KlPGK啟動子具有序列編號：67的核苷酸序列。利用序列編號：94、95、96及97的引子以PCR來擴增KlADHI啟動子，擴增後的KlADHI啟動子具有序列編號：68的核苷酸序列。利用序列編號：78、79、80及81的引子以PCR來擴增ScADHI啟動子，擴增後的ScADHI啟動子具有序列編號：69的核苷酸序列。

之後，利用限制酶Sal I和EcoR I分別將擴增後的啟動子轉殖至質體pUC18，以方便後續建構重組多核苷酸序列。

基因組重組

利用各基因組中的重疊序列來重組各基因組。以TaKaRa Ex Taq系統進行融合PCR（fusion PCR）以重組各基因組。反應混合液包含0.2 mM之特定引子、0.25 mM之三磷酸去氧核苷酸（deoxynucleoside triphosphate）、含有2 mM MgCl₂ 之1倍PCR緩衝液、2微升之DNA和2.5 U之Ex Taq DNA聚合酶。PCR反應時間及溫度為94^° C（1分鐘）、由58^° C至53^° C的黏著溫度1分鐘，以及72^° C（最適時間）；循環上述步驟10次。

培養酵母菌的最佳條件

為了解用以製備類胡蘿蔔素的最佳條件，將酵母菌轉殖株培養於包含1%酵母菌萃取物（Yeast Extract）、2%蛋白腖（Peptone）及2% D(+)-葡萄糖之YPG培養液中，並置於25^° C、30^° C或37^° C的環境中培養3天。為測試細胞生長時碳源的利用，將酵母菌轉殖株培養於包含20%葡萄糖、20%半乳糖或20%甘油的YPG培養液中。

酵母菌轉殖（ transformation ）及菌株篩選

將酵母菌培養於包含1%酵母菌萃取物、2%蛋白腖及2% D(+)-葡萄糖之5毫升的YPG培養液中，並置於30^° C、以200 rpm的轉速培養16小時。將各基因組以乳酸克魯維酵母蛋白表現套組（K. lactis Protein Expression Kit, New England Biolabs）共轉殖至乳酸克魯維酵母中，以表現各外源性基因。以高保真（high fidelity）的酵素（PrimeSTAR MAX DNA聚合酶，TaKaRa）進行聚合酶連鎖反應（即HiFi-PCR）來增殖放大各基因組；再將各基因組共同轉殖至酵母菌中，藉由各序列中的重疊序列來進行同源重組，使各基因組以預先設計的順序排列重組。之後，利用第一基因組之啟動子序列和最後一組基因組之3’端序列可將所得重組產物同源重組至宿主細胞的基因體中。以對抗生素G418具有抗性之新黴素磷酸轉移酶基因（neomycin phosphotransferase gene,Kan MX ）作為標記基因，進行特定菌株的篩選。將10微升（μg）之標的DNA片段以等莫耳比例共轉殖至40微升的勝任細胞（competent cell）中。以BioRad系統（gene PluserXcell^TM , Bio-Rad, Hercules, CA）在2毫米鋁製比色管中進行電穿孔（1.0 kV，400 Ω及25 μF電容）。之後，將細胞塗佈於包含1%酵母菌萃取物、2%蛋白腖、2%葡萄糖及每毫升200微克（mg）之含有抗生素G418的YPG培養基上。

為確認各片段的位置，以QucikExtract™ DNA萃取溶液（EPICENTRE, Madison, Wisconsin）分解酵母菌細胞壁。之後，以長-PCR法（Long-PCR method, EmeraldAmp MAX PCR Master Mix, TaKaRa），輔以特定引子（序列編號：23-36）及自動電泳分析系統（automatic electrophoresis analysis system, Fragment AnalyzerTM Automated CE System, Advanced Analytical Technologies）來確認各基因組順序的正確性。

反轉錄聚合酶連鎖反應（ Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction 、 RT-PCR ）試驗

利用DNA分離套組III（DNA Isolation Kit III, Roche）將基因體DNA由酵母菌中萃取純化出來。以RNeasy微套組（Qiagen, Chatsworth, CA）將模板mRNA由酵母菌中純化出來後，藉由反轉錄套組（SuperScript™ II kit, Invitrogen）合成cDNA。以即時qPCR（real-time qPCR）來分析確認菌株中各啟動子及其於不同培養溫度下的驅動表現能力。利用通用探針資料庫（Universal Probe Library Set, UPLS, LightCyclerW 480 Probes Master, Roche），輔以特定引子對（擴增產物長度約為100至150 bp），於LightCycler儀器（LightCycler 480, Roche）來定量各基因的相對表現量。表3總結用以分析各基因表現所使用的引子。

抗氧化功效試驗

在食品工業及農業相關研究中，常利用2,2'-二氮-雙(3-乙基苯並噻唑-6-磺酸（2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)、ABTS）來測量食品的抗氧化功效。該試驗係藉由添加過硫酸鈉使ABTS轉換為自由基陽離子後，測量自由基陽離子（藍色）於吸收波長734奈米時的吸收光譜。ABTS自由基陽離子會與多種抗氧化劑反應。在反應中，藍色的ABTS自由基陽離子會轉換回無色的中性形式。可利用分光光度計來測量反應。由於此試驗是以相對於水溶性維生素E相似物（Trolox）之抗氧化反應來計算表示，故亦稱為水溶性維生素E相似物等量抗氧化能力（Trolox equivalent antioxidant capacity, TEAC）試驗。操作時係先將ABTS受質加入細胞，再將細胞培養於YPG培養液，並置於25°C培養72小時；之後，冷凍乾燥細胞，利用甲醇萃取色素以進行後續分析。

高效能液相層析（ high performance liquid chromatography 、 HPLC ）試驗

收集培養3天的細胞，並以去離子水洗滌之。將細胞沉澱物置於冷凍乾燥機中冷凍乾燥。利用丙酮萃取乾燥細胞中的類胡蘿蔔素，進行反相高效能液相層析試驗。本發明是利用包含一PU-2089四元泵（PU-2089 Quaternary Pump）及一870-UV智慧型紫外光／可見光偵測器（870-UV intelligent UV-VIS detector）之佳世客（Jasco）HPLC儀器來進行相關分析。在操作時，是以野村化學（Nomura Chemical）製備的Develosil C30-UG管柱（3微米，ID 4.6毫米 x L 250毫米－UG17346250W），輔以甲醇／甲基第三丁基醚（methyl tert-butyl ether, MTBE）／水（比例為81：15：4）及甲醇／甲基第三丁基醚／水（比例為7：90：3）作為移動相，來進行HPLC分離及定量。將流速設定為每分鐘1毫升，並記錄吸收波長460奈米時的色層分析圖。

乙醇產量試驗

本發明是利用氣相分層分析法（Shimazdu，GC-14，日本），輔以一火焰游離偵檢器（flame ionization detector, FID）及一不銹鋼管柱（80/120 Carbopack B/6.6% Carbowax，2米 x 2 毫米），並以氮氣作為移動氣體，來分析乙醇的產量。操作步驟包含將管柱以每分鐘4^° C 的加熱速度由80^° C加熱至150^° C，柱入溫度為180^° C，偵測溫度則為250^° C。各發酵實驗及分析皆獨立重覆三次。

實施例 1 建構重組多核苷酸序列

1.1  crtE-Kan-tHMG1

在許多生物體中，焦磷酸香葉香葉酯為生物合成諸如類胡蘿蔔素、吉貝素（gibberellins）、生育醇（tocopherols）、葉綠素（chlorophylls）、萜烯類（terpenes）及類萜（terpenoids）等醫藥化合物的重要前趨物。HMG-CoA還原酶（由HMG1 基因所編碼）及焦磷酸香葉香葉酯合成酶（由crtE 基因所編碼）則是HMG-CoA還原酶路徑中的重要中間產物。已知截斷型HMG-CoA還原酶（truncated HMG-CoA reductase, tHMG1）會減少反饋抑制，進而增加焦磷酸香葉香葉酯於酵母菌中的產量。因此，本發明首先建構一包含一crtE 基因及一HMG1 基因的重組多核苷酸序列；並利用對抗生素G418具有抗性的新黴素磷酸轉移酶基因（Kan ）作為標記基因，以進行後續菌株篩選分析。

利用BLAST來分析源自不同宿主細胞之HMG-CoA還原酶及焦磷酸香葉香葉酯合成酶的胺基因酸序列（第4a和5a圖）。基於功能區域（functional domain）中預測的胺基酸序列（第4b和5b圖），將各基因以宿主表現之最佳化密碼子轉殖或合成後，與適當的啟動子連結，以建構出特定的基因組。

在操作上，利用序列編號：11及12的引子以PCR擴增crtE 基因，藉由限制酶Age I及Nco I將其轉殖至載有KlLac4啟動子之質體pUC18中，再利用序列編號：23及24的引子以PCR擴增得到KlLac4-crtE 基因組。利用序列編號：94及95的引子以PCR擴增Kan 基因，藉由限制酶Age I和Nco I將其轉殖至載有KlGapDH啟動子的質體pUC18中，再利用序列編號：25和26的引子以PCR擴增得到KlGapDH-Kan 基因組；其中序列編號：25的核苷酸序列部份互補於序列編號：24的核苷酸序列（即AGTATGGTAACGACCGTACAGGCAA與TTGCCTGTACGGTCGTTACCATACT）；據此， KlGapDH-Kan 基因組的5’端序列係與 KlLac4-crtE 基因組的3’端序列相互同源。利用序列編號：13及14的引子以PCR擴增tHMG1 基因，藉由限制酶Age I和Nco I將其轉殖至載有ScADHI啟動子的質體pUC18中，再利用序列編號：27和28的引子以PCR擴增得到ScADHI-tHMG1 基因組；其中序列編號：27的核苷酸序列部份互補於序列編號：26的核苷酸序列（即GTGTACAATATGGACTTCCTCTTTTC與GAAAAGAGGAAGTCCATATTGTACAC）；據此，ScADHI-tHMG1 基因組的5’端序列係與KlGapDH-Kan 基因組的3’端序列相同互源。

基於KlLac4-crtE 基因組與KlGapDH-Kan 基因組間的同源序列，以及KlGapDH-Kan 基因組與ScADHI-tHMG1 基因組間的同源序列，當三組基因組共轉殖至宿主細胞馬克斯克魯維酵母後，三組基因組會自發性地重組形成一重組多核苷酸序列crtE-Kan-tHMG1 （總結於第6圖及表4）。將包含重組多核苷酸序列crtE-Kan-tHMG1 的基因轉殖菌命名為Xd3.0。

1.2  crtI-crtE-Kan-crtYB-tHMG1

β-胡蘿蔔素是一種維生素A原類胡蘿蔔素（provitamin A carotenoid），已知可用以治療紅血球生成性原紫質病（erythropoietic protoporphyria）等疾病。此外，β-胡蘿蔔素亦經證實可減少女性更年期後罹患乳癌的機率，以及罹患老年性黃斑部病變（age-related macular degeneration、AMD）的機率。在製備下游類胡蘿蔔素的過程中，β-胡蘿蔔素是一項重要的中游前趨物； 而crtY 基因（用以編碼八氫茄紅素合成酶）和crtB 基因（用以編碼茄紅素環化酶）則為β-胡蘿蔔素生物合成路徑中重要的中間產物。據此，實施例1.2係關於建構一包含一crtI 基因、一crtE 基因、一crtYB 基因（用以編碼一具備八氫茄紅素合成酶和茄紅素環化酶活性的雙功能酵素）、一tHMG1 基因及一Kan 標記基因的重組多核苷酸序列crtI-crtE-Kan-crtYB-tHMG1 。

利用BLAST 來分析茄紅素環化酶域、反-異戊烯焦磷酸合成酶合成酶及NAD(P)-結合羅斯曼相似區域的胺基酸序列（第7a、7c和8a圖）。基於功能區域中預測的胺基酸序列（第7b、7d和8b圖），將各基因以宿主表現之最佳化密碼子轉殖或合成後，與適當的啟動子連結，以建構出特定的基因組。

藉由與實施例1.1相似的建構策略，利用序列編號：15和16的引子以PCR擴增crtI 基因，藉由限制酶Age I和Nco I將其轉殖至載有KlLac4啟動子之質體pUC18中，再利用序列編號：23和29之引子以PCR擴增得到KlLac4-crtI 基因組。利用序列編號：11及12之引子以PCR擴增crtE 基因，藉由限制酶Age I和Nco I將其轉殖至載有ScPGK啟動子之質體pUC18中，再利用序列編號：30和24之引子以PCR擴增得到ScPGK-crtE 基因組。利用序列編號：94和95之引子以PCR擴增Kan 基因，藉由限制酶Age I和Nco I將其轉殖至載有KlGapDH啟動子之質體pUC18中，再利用序列編號：25及31放大得到KlGapDH-Kan 基因組。利用序列編號：17及18之引子以PCR擴增crtYB 基因，藉由限制酶Age I和Nco I將其轉殖至載有KlADHI啟動子之質體pUC18中，再利用序列編號：32和26放大得到KlADHI-crtYB 基因組。利用序列編號：13和14之引子以PCR擴增tHMG1 基因，藉由限制酶XhoI 和NotI 將其轉殖至載有ScADHI啟動子之質體pUC18中，再利用序列編號：27和28放大得到ScADHI-tHMG1 基因組。

藉由各基因組間的同源序列，當五組基因組共轉殖至宿主細胞馬克斯克魯維酵母後，五組基因組會自發性地重組形成一重組多核苷酸序列crtI-crtE-Kan-crtYB-tHMG1 （總結於第9圖及表5）。將包含該重組多核苷酸序列crtI-crtE-Kan-crtYB-tHMG1 的基因轉殖菌株命名為Xd5.0。

1.3 crtI-crtR-crtE-Kan-crtS-crtYB-tHMG1

為使β-胡蘿蔔素有效轉換為蝦紅素，將二下游蝦紅素合成基因－crtS 基因（用以編碼β-胡蘿蔔素加氧酶）和crtR 基因（用以編碼p450還原酶）共轉殖至宿主細胞馬克斯克魯維酵母。在實施例1.3中，本發明建構一包含一crtI 基因、一crtR 基因、一crtE 基因、一crtS 基因、一crtYB 基因（用以編碼一具備八氫茄紅素合成酶和茄紅素環化酶活性的雙功能酵素）、一tHMG1 基因和一Kan 標記基因的重組多核苷酸序列crtI-crtR-crtE-Kan-crtS-crtYB-tHMG1 。

以催化域來分析β-胡蘿蔔素加氧酶和p450還原酶的保留性區域（第10a和11a圖）。此外，亦分析各保留性區域中的保留性殘基（第10b、11b和11c圖）。依據分析結果來建構重組多核苷酸序列crtI-crtR-crtE-Kan-crtS-crtYB-tHMG1 中的密碼子。藉由相似的PGASO建構方法，利用序列編號：15和16之引子以PCR擴增crtI 基因，再利用限制酶Age I和Nco I將其轉殖於載有KlLac4啟動子之質體pUC18中，之後利用序列編號：23和33之引子以PCR擴增得到KlLac4-crtI 基因組。利用序列編號：19和20之引子以PCR擴增crtR 基因，再利用限制酶SfiI 和NcoI 將其轉殖於載有ScGapDH啟動子之質體pUC18中，之後利用序列編號：34和29之引子以PCR擴增得到ScGapDH-crtRI 基因組。利用序列編號：11和12之引子以PCR擴增crtE 基因，再利用限制酶Age I和Nco I將其轉殖於載有ScPGK啟動子之質體pUC18中，之後利用序列編號：30和24之引子以PCR擴增得到ScPGK-crtE 基因組。利用序列編號：98和99之引子以PCR擴增Kan 基因，再利用限制酶Age I和Nco I將其轉殖於載有KlGapDH啟動子之質體pUC18中，之後利用序列編號：25和35之引子以PCR擴增得到KlGapDH-Kan 基因組。利用序列編號：21和22之引子以PCR擴增crtS 基因，再利用限制酶Age I和Nco I將其轉殖於載有KlPGK啟動子之質體pUC18中，之後利用序列編號：36和31之引子以PCR擴增得到KlPGK-crtS 基因組。利用序列編號：17和18之引子以PCR擴增crtYB 基因，再利用限制酶Age I和Not I將其轉殖於載有KlADHI啟動子之質體pUC18中，之後利用序列編號：32和26之引子以PCR擴增得到KlADHI-crtYB 基因組。利用序列編號：13和14之引子以PCR擴增tHMG1 基因，再利用限制酶NotI 和XhoI 將其轉殖於載有ScADHI啟動子之質體pUC18中，之後利用序列編號：27和28之引子以PCR擴增得到ScADHI-tHMG1 基因組。

當將七組基因組共轉殖至宿主細胞馬克斯克魯維酵母後，七組基因組會藉由基因組間的同源序列而自發性地重組形成一重組多核苷酸序列crtI-crtR-crtE-Kan-crtS-crtYB-tHMG1 （總結於第12圖和表6）。將包含該重組多核苷酸序列crtI-crtR-crtE-Kan-crtS-crtYB-tHMG1 的基因轉殖菌株命名為Xd7-3。

基因轉殖菌株Xd7-3應可用以製備紅色類胡蘿蔔素－3R、3’R-蝦紅素立體異構物。然而，隨著黃色類胡蘿蔔素（β-胡蘿蔔素和玉米黃質）的表現累積，可發現Xd7-3會呈現的黃色（第13a圖和表7）。推測可能原因為紅發夫酵母之β-胡蘿蔔素加氧酶和P450 還原酶的酵素功效不佳，或／和ScPGapDH 的啟動子強度過低。

1.4 crtI-crtE-ChYb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1

為了製備3S、3’S-蝦紅素立體異構物，將二蝦紅素合成基因－bkt 基因（用以編碼β-胡蘿蔔素酮醇酶）和chYb 基因（用以編碼β-胡蘿蔔素羥化酶）共轉殖至宿主細胞馬克斯克魯維酵母中。

為建構重組多核苷酸序列crtI-crtE-ChYb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1 ，先分析β-胡蘿蔔素酮醇酶之保留性區域的胺基酸序列（第14a圖）；第14b圖則為各保留性區域中的保留性殘基。基於分析結果，將各基因以宿主表現之最佳化密碼子轉殖或合成後，與KlPGK啟動子連結，以建構出特定的基因組。

此外，為篩選出其餘在蝦紅素生物合成路徑中的重要酵素基因，分別由萊茵衣藻、小球藻和雨生紅球藻分離chYb 基因（即CrChYb 基因、CZChYb 基因和HpChYb 基因），第15a和15b為該些基因的保留性區域分析結果。將該些基因分別以宿主表現之最佳化密碼子轉殖或合成而後，與適當的啟動子連結，以建構出特定的基因組。。

利用與建構crtE-Kan-tHMG1 或crtI-crtE-Kan-crtYB-tHMG1 相似之方法來建構該重組多核苷酸序列crtI-crtE-ChYb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1 ，其中ChYb 基因可以是CrChYb 基因、CzChYb 基因或HpChYb 基因。簡單來說，以限制酶Age I和Nco I將crtI 基因轉殖至載有KlLac4啟動子之質體pUC18後，利用序列編號：23和33之引子以PCR擴增得到KlLac4-crtI 基因組。以限制酶Age I和Nco I將crtE 基因轉殖至載有ScGapDH啟動子之質體pUC18後，利用序列編號：34和29之引子以PCR擴增得到ScGapDH-crtE 基因組。以限制酶Xho I和Not I將ChYb 基因（即CrChYb 基因、CzChYb 基因或HpChYb 基因）轉殖至載有ScPGK啟動子之質體pUC18後，利用序列編號：30和24之引子以PCR擴增得到ScPGK-ChYb 基因組。以限制酶Age I和Nco I將Kan 基因轉殖至載有KlGapDH啟動子之質體pUC18後，利用序列編號：25和35之引子以PCR擴增得到KlGapDH-Kan 基因組。以限制酶Xho I和Not I將BKT 基因轉殖至載有KlPGK啟動子之質體pUC18後，利用序列編號：36和31之引子以PCR擴增得到KlPGK-BKT 基因組。以限制酶AgeI 和Not I將crtYB 基因轉殖至載有KlADHI啟動子之質體pUC18後，利用序列編號：32和26之引子以PCR擴增得到KlADHI-crtYB 基因組。以限制酶Xho I和Not I將tHMG1 基因轉殖至載有ScADHI啟動子之質體pUC18後，利用序列編號：27和28之引子以PCR擴增得到ScADHI-tHMG1 基因組。

藉由相似的建構概念，各基因組間的同源序列可使七組基因組在宿主細胞馬克斯克魯維酵母中進行同源重組，進而形成一重組多核苷酸序列crtI-crtE-ChYb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1 ，其中該ChYb 基因可以是CrChYb 基因、CzChYb 基因或HpChYb 基因（總結於第16圖和表8）。

接著，將建構的重組多核苷酸序列（即crtI-crtE-CrChYb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1 、crtI-crtE-HpChYb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1 和crtI-crtE-CzChYb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1 ）分別轉殖至宿主細胞馬克斯克魯維酵母的基因體中（第16圖）。將包含重組多核苷酸序列crtI-crtE-HpChYb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1 的基因轉殖菌株命名為Hp9；將包含重組多核苷酸序列crtI-crtE-CrChYb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1 的基因轉殖菌株命名為Cr1；而將包含重組多核苷酸序列crtI-crtE-CzChYb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1 的基因轉殖菌株命名為Cz5。

實施例 2 分析包含實施例 1.4 所述之重組多核苷酸序列的基因轉殖菌株

實施例2將進一步分析實施例1.4所建構的基因轉殖菌株－Cr1、Cz5和Hp9。其中，先於實施例2.1中確認各基因組和類胡蘿蔔素的表現後，再於實施例2.2來決定宿主表現類胡蘿蔔素的最佳條件。

2.1 實施例 1.4 之重組多核苷酸序列的表現

經過10次繼代培養後，篩選出穩定表現菌株Cr1、Cz5和Hp9。如第13a和表7所示，相較於CrChYb 和CZChYb ，HpChYb 具有較強的β-胡蘿蔔素羥化酶活性。利用長-PCR方法（EmeraldAmp MAX PCR Master Mix，TaKaRa）進一步檢驗各菌株之基因組的排列順序，可發現各穩定表現之菌株皆具有原始設計之基因組排列順序（第13b和13c圖）。

接著，利用50毫升的發酵培養液來比較各基因轉殖菌株的表現。經過3天培養後，觀察細胞生長曲線可知，相較於野生型、Cr1和Xd7-3菌株，Hp9和Cz5菌株生長較為快速（第17c圖）。該些菌株（特別是Hp9）培養液的顏色皆會明顯地由對照組之乳白色轉變為紅或深橘色（第17a和17b圖）。

利用丙酮萃取各酵母菌中的表現色素，據以評估類胡蘿蔔素於各菌株中的表現量。以全光譜紫外光／可見光分光光度計來測量類胡蘿蔔素和游離形式的類胡蘿蔔素化合物（包含β-胡蘿蔔素、蝦紅素、斑螯黃質和玉米黃質）的總量。所有類胡蘿蔔素化合物的吸收光譜皆介於400奈米到530奈米之間（結果未顯示）。除了野生型，由基因轉殖菌株（即Xd7-3、Cr1、Cz5和Hp9）萃取出之類胡蘿蔔素的吸收光譜亦介於400奈米至530奈米之間（第17d圖）。

為分析類胡蘿蔔素的成分，利用HPLC來檢驗類胡蘿蔔素的成分；藉由沖提時間差可分離游離形式的類胡蘿蔔素化合物，例如蝦紅素的沖提時間為7.8分鐘，玉米黃質的沖提時間為9.7分鐘，斑螯黃質的沖提時間為12.8分鐘，而β-胡蘿蔔素的沖提時間則為32分鐘。以標準曲線檢測各基因轉殖菌株中β-胡蘿蔔素表現量；結果顯示，Xd7-3菌株的表現量為每公克244.7微克，Cr1菌株的表現量為每公克59.6微克，Cz5菌株的表現量為每公克93.9微克，而Hp9菌株的表現量則為每公克224.4微克；亦即，Hp9菌株的產量是Cr1菌株產量的3.8倍。此外，除了野生型和Xd7-3菌株，所有具有藻類bkt 和chyb 基因的基因轉殖菌株皆可於菌株中表現累積斑螯黃質；其中，Cr1菌株的斑螯黃質表現累積量為每公克18.4微克，Cz5菌株的斑螯黃質表現累積量為每公克12.8微克，而Hp9菌株的斑螯黃質表現累積量為每公克39.8微克（表7）；亦即，Hp9菌株生產斑螯黃質的速率是Cz5菌株的3.1倍。

將由萊茵衣藻萃取的藻類β-胡蘿蔔素羥化酶基因Crchyb ，由小球藻萃取的Czchyb 基因，或由雨生紅球藻萃取的Hpchyb 基因和其他6種參與合成類胡蘿蔔素的基因共轉殖至一酵母菌宿主之基因體中。相較於由紅發夫酵母萃取的真菌基因，三種藻類基因（即Crchyb 、 Czchyb 和Hpchyb ）皆可有效地將β-胡蘿蔔素轉換為下游的類胡蘿蔔素。此外，相較於表現Crchyb 和Czchyb 的菌株，表現Hpchyb 的菌株可生產較高量的類胡蘿蔔素；亦即，Hpchyb 較Crchyb 和Czchyb 更具合成／轉換功效。該些結果指出，β-胡蘿蔔素羥化酶在類胡蘿蔔素的生物合成過程中扮演著重要的角色。

由HPLC於UV450奈米的光譜測定結果（第18a和18b圖）可知，基因轉殖菌株會表現游離形式之斑螯黃質（高峰1）、游離形式之β-胡蘿蔔素（高峰6）和某些未知的代謝產物（高峰2、3、4、5、7和8）。據此，基因轉殖菌株可用以製備類胡蘿蔔素及其衍生物，例如玉米黃質、3S、3’S-蝦紅素和／或其酯化衍生物。

2.2 實施例 1.4 之重組多核苷酸序列的最佳表現條件

在本實施例中，將測定用以表現類胡蘿蔔素及其衍生物的最佳條件；其中，實施例2.2.1為評估表現的最佳溫度，而實施例2.2.2則為確認表現的最佳培養溶液。

2.2.1 最佳溫度

為增加本發明載體之類胡蘿蔔素產量，將一或多拷貝數之本發明載體轉殖至Cz5菌株；所得的基因轉殖菌株為Cz30菌株。相較於Cz5菌株，Cz30菌株更具一明顯的紅色轉變（第19a圖）。

為評估用以製備類胡蘿蔔素的最佳條件，分別將Cz5和Cz30培養於YPG培養液中，並置於25^° C、30^° C和37^° C環境中培養3天。之後，可觀察到培養於25^° C和30^° C中的培養液（包含Cz5或Cz30）皆會轉變為紅色，而培養於37^° C中的培養液（包含Cz5或Cz30）則依然為乳白色（第19b圖）。此外，在培養2天後，僅有培養於25^° C 的Cz30會轉變為紅色。結果顯示，25^° C為用以製備類胡蘿蔔素的最佳溫度，且Cz30的產量高於Cz5的產量。

進一步分析Cz5和Cz30菌株於不同培養溫度下的基因表現。將二菌株培養於25^° C 、30^° C 或37^° C 的環境中；48小時後，萃取各菌株的mRNA。如第19c圖所示，不論在何種培養溫度下，Cz30菌株中的轉殖基因表現量皆高於Cz5菌株中的轉殖基因表現量；此結果與Cz30可產生高量之類胡蘿蔔素，並顯著轉換為紅色的結果相符。此外，轉殖基因於30^° C的表現量明顯高於25^° C和37^° C時的表現量。基於菌株培養於25°C時的顏色轉變最為明顯，25^° C係為酵素反應的最佳條件（第19c圖）。

基於八氫茄紅素去飽合酶（由crtI 基因所編碼）和β-胡蘿蔔素酮醇酶（由BKT 基因所編碼）在3S、3’S-蝦紅素的生物合成過程中扮演著極為重要的角色，分別利用二個較強的啟動子－pLac4和pKlPGK來驅動該些基因的表現。據此，CrtI 和CrBKT 為各基因組中表現量最高的二基因（第19c圖）。

HPLC光譜分析更進一步確認，Cz30基因轉殖菌株會累積較高量的β-胡蘿蔔素、斑螯黃質和酯化蝦紅素衍生物（即蝦紅素單酯體和蝦紅素雙酯體，第20a和20b圖）。

上述結果顯示，相較於Cz5菌株，Cz30可產生較高量的類胡蘿蔔素；此外，結果亦指出，25^° C為生產胡蘿蔔素的最佳溫度。

2.2.2 最佳培養液

為確認菌株生長時所使用的碳源，分別將野生型馬克斯克魯維酵母和基因轉殖菌株培養於包含20%葡萄糖、20%半乳糖和20%甘油的YPG培養液中。於25^° C培養2天後，野生型菌株的培養液依舊呈現乳白色，而Cz30的培養液則會呈現黃色（葡萄糖）、橘色（半乳糖）或紅色（甘油）（第21a圖）。結果指出，依據不同的添加物（即葡萄糖、半乳糖或甘油），Cz30可產生並累積不同成分的類胡蘿蔔素。不同碳源間顏色的差異有可能是因累積不同濃度之類胡蘿蔔素所導致。亦或是，因生成不同類型之類胡蘿蔔素所導致，例如黃色類胡蘿蔔素（β-胡蘿蔔素和玉米黃質）和粉紅色到紅色的類胡蘿蔔素（斑螯黃質、蝦紅素和其他酯化蝦紅素衍生物）（第21a圖）。然而，培養5天後，僅培養於包含20%甘油之培養液的菌株會持續呈現紅色，其餘培養於包含葡萄糖或半乳糖之培養液的菌株則皆會轉回乳白色。

於包含甘油之培養液中培養48和72小時後，收集基因轉殖菌株Cz5和Cz30的檢體，並利用即時PCR試驗來分析各菌株之mRNA的表現量。結果顯示，不論是於25^° C、30^° C或37^° C的環境中，48小時後，CzBKT 基因的表現量皆會高於HpCHYB 基因的表現量（表9）。此外，培養72小時後，HpCHYB 基因的表現量則會高於CzBKT 基因的表現量，據以將斑螯黃質轉換為蝦紅素（表9）。

表9  培養於包含20%甘油之YPG培養液中，基因轉殖菌株的基因表現量

基於LC之光譜分析結果，相較於包含20%半乳糖的培養液，將Cz30培養於含有20%甘油的培養液中，可累積較高量的β-胡蘿蔔素和斑螯黃質（表10）。經皂化（saponification）處理後，利用LC/MS來分析確認所得化合物，結果顯示Cz30生產的類胡蘿蔔素包含β-胡蘿蔔素、斑螯黃質和游離形式的蝦紅素（第22圖）。

^a —：無法偵測到

有趣的是，相較於包含其他碳源的培養液，培養於包含甘油之培養液的Cz30所產生的紅色轉變最為顯著；此結果代表Cz30將可用以發展綠色工業。此外，將Cz30培養於包含甘油之培養液5天後，其培養液仍持續呈現紅色。

接著，分別萃取類胡蘿蔔素自野生型和Cz30菌株，並利用ABTS受質反應來分析其抗氧化功效。將菌株培養於25^° C之YPG培養液72小時後，冷凍乾燥菌株，再利用甲醇將色素萃出。相較於野生型（52.3 %），Cz30具有較高的自由基清除功效（72.1 %）（第23a圖）。有鑑於野生型菌株亦具有抗氧化能力，推估在水溶性維生素E相似物等量抗氧化能力（Trolox equivalent antioxidant capacity、TEAC）的試驗中，約有20%的去自由基能力是源自於Cz30所產生的類胡蘿蔔素，而1克菌株（乾重）的去自由基能力約等於1.95毫克之水溶性維生素E相似物（Trolox）的去自由基能力（第23b圖）。

上述結果指出，包含20%甘油之培養液為製備本發明類胡蘿蔔素的最佳培養環境，而製備出的類胡蘿蔔素具有抗氧化功效。

實施例 3 改善蝦紅素的產量

基於β-胡蘿蔔素酮醇酶和β-胡蘿蔔素羥化酶在蝦紅素的生物合成過程中極為重要，進一步將蝦紅素合成基因組（即crtI -crtE -HpChYb-Kan -HpChYb-CrBKT -crtYB -tHMG1 ）與一額外的ChYb 基因組共轉殖至宿主基因體中，藉以製備基因轉殖菌株CA6（第24a圖）。轉殖後的菌株培養液會呈現紅色。

為增加製備蝦紅素時重要酵素的表現量，將蝦紅素合成酶基因－bkt （用以編碼β-胡蘿蔔素酮醇酶）和chYb （用以編碼β-胡蘿蔔素羥化酶）轉殖至CA6菌株之rDNA的內轉錄間隔區（internal transcribed spacer、ITS）；製得的基因轉殖菌株稱為CA6-ITS。該基因組包含aur-HpChYb-CrBKT 及一啟動子（第24b圖）。HpChYb 和CrBKT 的基因表現量會隨著主要酵素拷貝數的增加而增加（第24c圖）。

為了解細胞生長所使用的碳源，將基因轉殖菌株CA6-ITS培養於包含或不包含10%甘油之YPG培養液中。於25^° C培養2天後，相較於培養在不包含甘油之YPG培養液的菌株，培養於包含10%甘油之YPG培養液的菌株會產生較為顯著的紅色變化（第21b圖）。表11更指出，10%甘油即可有效引發CA6-ITS菌株製造蝦紅素。

此外，亦將蝦紅素合成基因組與一高拷貝數表現載體RS426共轉殖至宿主基因組中，以製得CA6－質體菌株（第24d圖）。基因組將會於宿主內自動與質體進行重組；轉殖株則會呈現橘到紅的顏色。該高拷貝數表現載體可大量表現本發明酵素，進而更有效率地將前趨物轉換為蝦紅素。

基於HPLC的光譜分析結果，基因轉殖菌株CA6-ITS可生產游離形式的蝦紅素、玉米黃質、斑螯黃質和β-胡蘿蔔素，其沖提時間分別為7.76、9.9、12.25和31.40分（第24e圖）。蝦紅素、玉米黃質、斑螯黃質、和β-胡蘿蔔素的產量則分別為每公克19.48、21.7、4.40和501.57微克（表12）。該些結果顯示，增加用以編碼β-胡蘿蔔素羥化酶之chYb 的基因拷貝數／表現量可改善類胡蘿蔔素的產量。

因此，本實施例提供了二種能有效將蝦紅素前趨物轉換為蝦紅素的基因轉殖菌株－CA6和CA6-ITS。結果亦顯示，相關基因的高拷貝數對於蝦紅素之製備極為重要。

實施例 4 製備單酯或雙酯形式之天然類胡蘿蔔素組合物

相較於非極性的類胡蘿蔔素，游離形式之蝦紅素的極性端（polar end）雖較易被生物體所吸收，然亦極易被氧化。自然界中的蝦紅素多以脂肪酸－酯類的形式存在；例如綠色藻類即具有一或二個脂肪酸，以形成較於穩定的單酯或雙酯形式。酯化蝦紅素經膽固醇酯酶（cholesterol esterase）水解後，可包覆於微胞（micelle）中，藉由小腸細胞的吸收作用進入生物體內。

本實施例將分析基因轉殖菌株中的類胡蘿蔔素酯類及其幾何異構物。由於克萊布特里陰性酵母菌（Crabtree negative yeast）－馬克斯克魯維酵母具有高生長率和高產量，且可有效將羥基團轉換形成諸如辛酸乙酯（octanoic acid-ethyl ester）、乙酸-2-苯基乙基酯（acetic acid-2-phenylethyl ester）和癸酸－乙基酯（decanoic acid-ethyl ester）等具有不同長度碳鏈之脂肪酸的單酯或雙酯結構，因此本實施例係以該酵母菌作為宿主細胞進行相關試驗。

由藻類分離之天然蝦紅素的羥基通常會與脂肪酸鍵結，藉以形成酯化蝦紅素。相較於合成或由細菌所產生的非酯化蝦紅素（即游離／自由形式之蝦紅素），酯化蝦紅素具有較高的穩定性及較佳的生物功效。為製備單酯或雙酯形式之蝦紅素，在加入半乳糖至CA6-ITS 菌株的同時或之後，加入脂肪酸（0.01%或0.1%之辛酸）。由第25a及25b圖可知，相較於對照組，加入辛酸會使菌株的顏色轉換為較深的紅色。

利用質譜分析儀（LC-MS/MS）來分析雙酯類中飽和脂肪酸的組合。結果指出，製備出的類胡蘿蔔素包含非尼基葉黃素、斑螯黃質、海膽酮、β-隱黃素、酯化金盞花紅素（esterified adonixanthin）、茄紅素、八氫番茄紅素、β-胡蘿蔔素和酯化蝦紅素（第26a及26b圖）。

實施例 5 分析包含本發明重組多核苷酸序列的基因轉殖菌株

類胡蘿蔔素化合物可基於其分別位於或靠近化合物兩端的二環結構來中和細胞內或外的單態和三態氧分子。此外，類胡蘿蔔素化合物亦可輔助Cz30減少因紫外光照射、溶劑壓力和氧化自由基（reactive oxygen species、ROS）所造成的傷害。Cz30可藉由減降生長細胞中脂質的過度氧化來抵抗環境壓力。據此，本揭示內容之基因轉殖菌株可用以製備具有附加價值的代謝產物，並改善產量。

5.1 增加宿主細胞對抗壓力的耐受性

第23圖指出，相較於野生型，Cz30的菌株萃取物具有抗氧化功效。在本實施例中，該分別利用紫外光照、糠醛、乙醇和異丁醇處理來檢測Cz30的抗壓功效。

分別以紫外光照射野生型和Cz30菌株5、10或20分鐘；接著，連續稀釋該些菌株，並將其塗覆培養於YPG培養基。48小時後，僅少數經紫外光照射20分鐘的Cz30可生長於YPG培養基（第27a圖）。該結果顯示，Cz30所表現的類胡蘿蔔素可有效減少紫外光的傷害，使其相較於野生型菌株具有較快的生長速度。

在生物煉製的應用領域中，植物生質（plant biomass）是地球上最豐富的可再生資源之一，且被視為發展永續經營使用的重要基石。植物的可再生資源可轉換為生物產物，例如生物燃料、生物化學品、生物潤滑劑及生物可降解材料等。舉例來說，相關業界常使用諸如酸水解（acid hydrolysis）、蒸汽爆裂（steam explosion）、氨纖維膨脹（ammonia fiber expansion）、有機溶劑法（organosolv ）、亞硫酸鹽預處理（sulfite pretreatment）、鹼性溼氧化（alkaline wet oxidation）、臭氧預處理（ozone pretreatment）和酵素處理等各式處理技術來破壞木質纖維素（lignocellulose），以取得植物生質中的糖類。然而，在利用酸和蒸氣來處理木質纖維素的過程中，往往會產生大量的毒性物質，例如由半纖維素和纖維素所釋放的糠醛，由木質素（lignin）所釋放的乙醇和醛類，以及由生物反應劑所釋放的重金屬。因此，本實施例亦檢測Cz30菌株對糠醛的抗壓功效。如第27b圖的結果所示， Cz30菌株可容忍濃度為100 mM的糠醛，相較之下，野生型菌株僅能忍受約80 mM的糠醛。

接著，進一步檢測野生型和Cz30菌株對乙醇及異丁醇的耐受性。分別將菌株置於包含0、4、8或12 %乙醇的環境中24小時，或是包含0、0.5、1 或2 %異丁醇的環境中24小時；之後，連續稀釋該些菌株，並將其塗覆培養於YPG培養基48小時。結果顯示，經12%乙醇（第27c圖）和2%異丁醇（第27d圖）處理24小時後，僅少量的Cz30可維持生長。據此，類胡蘿蔔素可使Cz30具備抗氧化功效，進而有效提升對乙醇及異丁醇的抗性。

上述結果指出，類胡蘿蔔素的抗氧化活性可保護宿主細胞（即Cz30），有效抵抗紫外光照射、糠醛、乙醇和異丁醇等各式環境壓力所造成的傷害。

5.2增加宿主細胞於發酵過程中對乙醇的耐受性和產量

在發酵過程中，諸如乙醇等產物的累積往往會對宿主細胞產生毒性傷害，進而限制影響整體的生產製備。細胞會產生氧化自由基來因應外來壓力，該些自由基通常會進一步使脂質過氧化來攻擊細胞膜。細胞膜是生物體對外的第一道防線，可調控細胞對外來壓力的反應，也極易受到外界有機溶液的影響。

為測試野生型和基因轉殖菌株Cz30對乙醇的耐受性，分別將二種菌株培養於包含不同濃度之乙醇的YPG培養液中（第28a圖）。在不含乙醇的情況下，野生型和Cz30菌株具有相似的生長速度。在含有2、4或6%乙醇的培養環境中，可發現野生型菌株的生長會明顯地受到乙醇的抑制；相較之下，Cz30僅會受到輕微的影響。亦即，相較於野生型菌株，Cz30菌株在經過24小時的乙醇培養後，具有較高的細胞密度（第28a圖）。此結果顯示，Cz30所表現的類胡蘿蔔素可減少溶劑對菌株所造成的傷害，因而相較於野生型菌株，Cz30具有較快的生長速度。

為測試乙醇的產量，分別將野生型和Cz30菌株培養於包含20%半乳糖的YPG培養液中。72小時後，可觀察到相較於野生型（2.5%），Cz30會產生更高量的乙醇（3.5 %）（第28b圖）。因此，Cz30所表現的類胡蘿蔔素明顯具備抗氧化功效。

上述結果指出，類胡蘿蔔素可保護宿主細胞，減少發酵過程中乙醇所造成的傷害，進而改善整體的產量。

5.3 改善宿主細胞對毒素的耐受性和產量

自然界中，次級代謝物的產量通常會少於其前趨物。為了能得到足量的化合物，半合成（semi-synthesis）提供了一種將中間產物轉換為最終產物或相似物的化學方法。然而，化學 反應往往需要大量的人力，且會造成有機污染。一般來說，次級代謝物和其前趨物皆會對宿主細胞造成毒性傷害，影響整體的合成製造。

在紫杉醇的半合成醫藥產業中，漿果赤黴素III（Baccatin III）是一極為重要的前趨物。漿果赤黴素III的前趨化合物－10-去乙醯漿果赤黴素III（10-deacetyl baccatin III, 10 DB），可由觀賞植物紅豆杉（Taxus baccata ）中大量萃取，是一種較為廉價且較具經濟價值的前趨物。在處理該些前趨物和最終產物時，常使用乙醇作為溶劑來進行溶解及萃取。

在本實施例中，是利用預先溶於乙醇之10-去乙醯漿果赤黴素III來分析Cz30的抗毒性功效。分別將野生型和Cz30菌株培養於包含0、0.8、1.6或3.2 mM之10-去乙醯漿果赤黴素III的培養液中。24小時後，連續稀釋該些菌株，並塗覆培養於YPG培養基，培養48小時。如第29a圖所示，在經過溶於12%乙醇之3.2 mM的10-去乙醯漿果赤黴素III處理後，相較於野生型，Cz30菌株具有較佳的生長狀態。此外，亦將菌株培養於包含不同濃度之10-去乙醯漿果赤黴素III和乙醇的YPG培養液中，藉以測試菌株對10-去乙醯漿果赤黴素III的耐受性（第29b圖）。結果指出，在經過0.4-1.2 mM之10-去乙醯漿果赤黴素III處理後，相較於野生型，Cz30菌株具有較佳的生長狀態。相較於包含4%乙醇或6%乙醇的培養液，包含0.8 mM之10-去乙醯漿果赤黴素III和4%乙醇的培養液，或是包含1.2 mM之10-去乙醯漿果赤黴素III和6%乙醇的培養液，會對菌株產生更大的毒性傷害（第29b圖）。進一步利用生長曲線試驗來證實該結果，其係分別將菌株培養於包含0.8 mM之10-去乙醯漿果赤黴素III和4%乙醇的培養液（第30a圖），或是包含1.2 mM之10-去乙醯漿果赤黴素III和6%乙醇的培養液（第30b圖）。

上述結果指出，類胡蘿蔔素可保護宿主細胞，減少生醫藥物之前趨物（例如10-去乙醯漿果赤黴素III）對細胞造成的毒性傷害。此外，亦利用基因轉殖菌株來測試10-去乙醯漿果赤黴素III與漿果赤黴素III（baccatin III）之間的生物轉換（第31圖）。結果指出，相較於其他菌株，包含較高濃度之類胡蘿蔔素的YD8菌株，可將10-去乙醯漿果赤黴素III轉換為更多的漿果赤黴素III（表13）。結果指出，包含類胡蘿蔔素的菌株可改善其生物轉換能力。

總結上述，本揭示內容提供了不同的重組多核苷酸序列，該些重組多核苷酸序列皆可用於活體中製備類胡蘿蔔素。基於本發明重組多核苷酸序列具備高產量之特性，本揭示內容建立數株分別包含不同重組多核苷酸序列的基因轉殖菌株。此外，本揭示內容亦確認用以表現本發明重組多核苷酸序列／基因轉殖菌株的最佳條件；該表現條件可大幅提升產量，進而提供科學或產業領域一種生物合成蝦紅素的新方法。利用本發明重組多核苷酸序列所製備的產物可保護基因轉殖細胞，避免受到環境壓力、發酵產物或生醫藥物之前趨物所造成的傷害；藉以提升基因轉殖細胞的產業應用性。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

無

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1圖是分別用以繪示3S, 3’S-蝦紅素（上圖）、3R, 3’R-蝦紅素（中圖）及3R, 3’S-蝦紅素（下圖）的化學結構示意圖； 第2a和2b圖是用以繪示類胡蘿蔔素生物合成路徑的示意圖； 第3圖是關於本發明用以生物合成3S, 3’S-蝦紅素的示意圖； 第4a圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之序列比對資料，其係關於HMG-CoA還原酶（HMG-CoA reductase）的保留性區域（conserved region），並以底線標註其催化域（catalytic domain）1-6；其中，在圖中7208代表由馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus ）分離的HMG-CoA還原酶，P12683代表由啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae ）分離的HMG-CoA還原酶，ACN40476代表由史特卡雲杉（Picea sitchensis ）分離的HMG-CoA還原酶，XP_001211323代表由土麴黴（Aspergillus terreus ）分離的HMG-CoA還原酶，而ABY84848則代表由靈芝（Ganoderma lucidum ）分離的HMG-CoA還原酶； 第4b圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之示意圖，其係關於HMG-CoA還原酶之催化域1-6中的保留性殘基，並以底線標註該些保留性殘基； 第5a是依據本揭示內容另一實施例所繪示之序列比對資料，其係關於焦磷酸香葉香葉酯合成酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase, GGPP synthase）的保留性區域，並以底線標註其催化域1-3；其中，AAY33921代表由紅發夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous ）分離的焦磷酸香葉香葉酯合成酶，NP_624521代表由天藍色鏈黴菌（Streptomyces coelicolor ）分離的焦磷酸香葉香葉酯合成酶，BAB99565代表由麩胺酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum ）分離的焦磷酸香葉香葉酯合成酶，ZP_00056752代表由嗜高溫放線菌（Thermobifida fusca ）分離的焦磷酸香葉香葉酯合成酶，而NP_696587則代表由雙叉桿菌（Bifidobacterium longum ）分離的焦磷酸香葉香葉酯合成酶； 第5b圖是依據本揭示內容另一實施例所繪示之示意圖，其係關於焦磷酸香葉香葉酯合成酶之催化域1-2中的保留性殘基，並以底線標註該些保留性殘基； 第6圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之示意圖，其係關於包含本發明重組多核苷酸序列的基因轉殖菌株Xd3.0，其中該重組多核苷酸序列包含3組基因組（即crtE-Kan-tHMG1 ）； 第7a圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之序列比對資料，其係關於茄紅素環化酶（lycopene cyclase）的保留性區域，並以底線標註其催化域1-2；其中，CAB51949代表由紅發夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous ）分離的茄紅素環化酶，XP_762434代表由玉米黑穗菌521（Ustilago maydis 521）分離的茄紅素環化酶，NP_344223代表由硫化葉菌P2（Sulfolobus solfataricus P2）分離的茄紅素環化酶，而YP_024312則代表由嗜苦古菌（Picrophilus torridus ）分離的茄紅素環化酶； 第7b圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之示意圖，其係關於茄紅素環化酶之催化域1-2中的保留性殘基，並以底線標註該些保留性殘基； 第7c圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之序列比對資料，其係關於反-異戊烯焦磷酸合成酶合成酶（trans-isoprenyl diphosphate synthase）的保留性區域，並以底線標註其催化域1-2；其中，CAB51949代表由紅發夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous ）分離的反-異戊烯焦磷酸合成酶合成酶，NP_279693代表由嗜鹽菌NRC-1（Halobacterium sp. NRC-1）分離的反-異戊烯焦磷酸合成酶合成酶，NP_681887代表由嗜熱藻BP-1（Thermosynechococcus elongatus BP-1）分離的反-異戊烯焦磷酸合成酶合成酶，而ZP_00089878則代表由棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii ）分離的反-異戊烯焦磷酸合成酶合成酶； 第7d圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之示意圖，其係關於反-異戊烯焦磷酸合成酶合成酶之催化域1-2中的保留性殘基，並以底線標註該些保留性殘基； 第8a圖是依據本揭示內容另一實施例所繪示之序列比對資料，其係關於八氫茄紅素去飽合酶（phytoene desaturase）的保留性區域，並以底線標註其NAD(P)-結合羅斯曼相似區域（NAD(P)-binding Rossmann-like domain）；其中，AAO53257代表由紅發夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous ）分離的八氫茄紅素去飽合酶，CAE07416代表由聚球藻WH 8102（Synechococcus sp. WH 8102）分離的八氫茄紅素去飽合酶，BAA10798代表由集胞藻PCC 6803（Synechocystis sp. PCC 6803）分離的八氫茄紅素去飽合酶，BAB73763代表由念珠藻PCC 7120（Nostoc sp. PCC 7120）分離的八氫茄紅素去飽合酶，而AAL91366則代表由番茄（Solanum lycopersicum ）分離的八氫茄紅素去飽合酶； 第8b圖是依據本揭示內容另一實施例所繪示之示意圖，其係關於八氫茄紅素去飽合酶之NAD(P)-結合羅斯曼相似區域中的保留性殘基，並以底線標註該些保留性殘基； 第9圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之示意圖，其係關於包含本發明重組多核苷酸序列的基因轉殖菌株Xd5.0，其中該重組多核苷酸序列包含5組基因組（即crtI-crtE-Kan-crtYB-tHMG1 ）； 第10a和10b圖是依據本揭示內容另一實施例所繪示之序列比對資料，其係關於β-胡蘿蔔素加氧酶（β-carotene oxygenase）的保留性區域，並以底線標註其催化域1-3；其中，AAY33921代表由紅發夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous ）分離的β-胡蘿蔔素加氧酶，Q08477代表由智人（Homo sapiens ）分離的β-胡蘿蔔素加氧酶，P33274代表由溝鼠（Rattus norvegicus ）分離的β-胡蘿蔔素加氧酶，P11707代表由家兔（Oryctolagus cuniculus ）分離的β-胡蘿蔔素加氧酶，而P33270則代表由果蠅（Drosophila melanogaster ）分離的β-胡蘿蔔素加氧酶； 第10c圖是依據本揭示內容另一實施例所繪示之示意圖，其係關於β-胡蘿蔔素加氧酶之催化域1-3中的保留性殘基，並以底線標註該些保留性殘基； 第11a和11b圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之序列比對資料，其係關於P450還原酶（P450 reductase）的保留性區域，並以底線分別標註其黃素氧化還原蛋白域（flavodoxin domain）和NADPH細胞色素p450還原酶域（NADPH cytochrome p450 reductase domain）；其中，ACI43097代表由紅發夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous ）分離的P450還原酶，Q00141代表由黑麴菌（Aspergillus niger ）分離的P450還原酶，NP_596046代表由粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）分離的P450還原酶，XP_001731494代表由球形馬拉色菌CBS 7966（Malassezia globosa CBS 7966）分離的P450還原酶，而XP_762420則代表由玉米黑穗菌521（Ustilago maydis 521）分離的P450還原酶； 第11c圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之示意圖，其係關於P450還原酶之黃素氧化還原蛋白區域1-4中的保留性殘基，並以底線標註該些保留性殘基； 第11d圖依據本揭示內容一實施例所繪示之示意圖，其係關於NADPH細胞色素p450還原酶域1-5中的保留性殘基，並以底線標註該些保留性殘基； 第12圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之示意圖，其係關於包含本發明重組多核苷酸序列的基因轉殖菌株Xd7-3，其中該重組多核苷酸序列包含7組基因組（即crtI-crtR-crtE-Kan-crtS-crtYB-tHMG1 ）； 第13a圖是依據本揭示內容另一實施例之照片，其係關於特定菌株於洋菜培養基（agar plate）培養10代後的表型（phenotype）； 第13b圖是依據本揭示內容另一實施例所繪示之用以建構重組多核苷酸序列的示意圖； 第13c圖是依據本揭示內容一實施例之凝膠電泳（gel electrophoresis）照片，其該凝膠電泳中的DNA片段是由特定菌株萃出後，利用菌落聚合酶連鎖反應（colony polymerase chain reaction, colony PCR）放大（amplify）後之DNA 產物； 第14a圖是依據本揭示內容另一實施例所繪示之序列比對資料，其係關於β-胡蘿蔔素酮醇酶（β-carotene ketolase）的保留性區域，並以底線標註其催化域1-4；其中，XP_001698699代表由萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii ）分離的β-胡蘿蔔素酮醇酶，BAB74888代表由珠藻PCC 7120（Nostoc sp. PCC 7120）分離的β-胡蘿蔔素酮醇酶，NP_924674代表由無類囊體藍藻PCC 7421（Gloeobacter violaceus PCC 7421）分離的β-胡蘿蔔素酮醇酶，ABB25938代表由聚球藻CC9902（Synechococcus sp. CC9902）分離的β-胡蘿蔔素酮醇酶，而CAE07883則代表由聚球藻WH 8102（Synechococcus sp. WH 8102）分離的β-胡蘿蔔素酮醇酶； 第14b圖是依據本揭示內容另一實施例所繪示之示意圖，其係關於β-胡蘿蔔素酮醇酶之催化域1-4中的保留性殘基，並以底線標註該些保留性殘基； 第15a圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之序列比對資料，其係關於β-胡蘿蔔素羥化酶（β-carotene hydroxylase）的保留性區域，並以底線標註其催化域1-2；其中，XP_001698698代表由萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii ）分離的β-胡蘿蔔素羥化酶，ABS50237代表由小球藻（Chromochloris zofingiensis ）分離的β-胡蘿蔔素羥化酶，而Q9SPK6則代表由雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis ）分離的β-胡蘿蔔素羥化酶； 第15b圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之示意圖，其係關於β-胡蘿蔔素羥化酶之催化域1-2中的保留性殘基，並以底線標註該些保留性殘基； 第16a圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之示意圖，其係關於包含本發明重組多核苷酸序列的基因轉殖菌株Cr1，其中該重組多核苷酸序列包含7組基因組（即crtI-crtE-CrChYb-Kan- CrBKT -crtYB-tHMG1 ）； 第16b圖是依據本揭示內容另一實施例所繪示之示意圖，其係關於包含本發明重組多核苷酸序列的基因轉殖菌株Hp9，其中該重組多核苷酸序列包含7組基因組（即crtI-crtE-HpChYb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1 ）； 第16c圖是依據本揭示內容再另一實施例所繪示之示意圖，其係關於包含本發明重組多核苷酸序列的基因轉殖菌株Cz5，其中該重組多核苷酸序列包含7組基因組（即crtI-crtE-CzChYb-Kan-CrBKT-crtYB-tHMG1 ）； 第17a圖是依據本揭示內容一實施例所提供之包含特定菌株的培養液照片； 第17b圖是依據本揭示內容另一實施例所提供之包含特定菌株的培養液照片； 第17c圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之特定菌株的生長曲線圖； 第17d圖是依據本揭示內容另一實施例所繪示之曲線圖，其係利用光譜分析試驗來測量類胡蘿蔔素的紫外光／可見光（UV/V）全光譜； 第18a和18b圖是依據本揭示內容另一實施例所繪示之高效能液相層析（high performance liquid chromatography, HPLC）結果，該結果是利用HPLC光譜分析試驗、於UV450奈米波段來測量特定菌株；其中1代表游離形式的斑螯黃質，6代表游離形式的β-胡蘿蔔素，而2、3、4、5、7和8則代表未知高峰； 第19a圖是依據本揭示內容另一實施例所提供之特定菌株的照片； 第19b圖是依據本揭示內容另一實施例所提供之在不同溫度下培養特定菌株的培養液照片； 第19c圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之基因表現柱狀圖； 第20a和20b圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之特定菌株於UV450奈米波段的HPLC結果； 第21a圖是依據本揭示內容另一實施例所提供之包含特定菌株和成分的培養液照片； 第21b圖是依據本揭示內容另一實施例所提供之包含CA6-ITS菌株和成分的培養液照片； 第22圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之液相層析法－質譜法（liquid chromatography–mass spectrometry, LC/MS）分析結果，其係將化合物皂化（saponification）後，利用LC/MS於UV460奈米波段來進行分析； 第23a圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之柱狀圖，其係關於特定菌株的自由基清除比例，其中該比例是利用抗氧化能力試驗，並以2,2'-二氮-雙(3-乙基苯並噻唑-6-磺酸（2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid), ABTS）作為受質來定量； 第23b圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之柱狀圖，其係關於水溶性維生素E相似物等量抗氧化能力（Trolox equivalent antioxidant capacity, TEAC）試驗結果； 第24a圖是依據本揭示另一實施例所繪示之包含8組基因組的重組多核苷酸序列示意圖； 第24b圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之CA6-ITS菌株的內轉錄間隔區（internal transcribed spacer, ITS）示意圖，其中該CA6-ITS菌株包含7組基因組； 第24c圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之相對基因表現柱狀圖，其中萃取特定菌株之各基因之RNA，利用反轉錄聚合酶連鎖反應（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）放大分析； 第24d圖是依據本揭示另一實施例所繪示之載體RS426示意圖，其中該RS426載體為多拷貝數（high copy number）載體，且包含本發明重組多核苷酸序列； 第24e圖是依據本揭示內容一實施例所提供之電泳圖照片； 第24f圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之利用HPLC分析由CA6-ITS菌株製備之蝦紅素的分析結果； 第25a和25b圖是依據本揭示內容另一實施例所提供之包含特定菌株和成分的培養液照片； 第26a圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之利用液相層析法－質譜法於UV460奈米波段所分析的超高效液相層析（Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC）結果； 第26b圖是依據本揭示內容另一實施例所繪示之利用液相層析法－質譜法於UV460奈米波段所分析的質譜分析結果； 第27圖是依據本揭示內容一實施例所提供之野生型或Cz30菌株的照片，其中該些菌株是分別以（a）紫外光照射，（b）糠醛，（c）乙醇和（d）丁醇進行處理； 第28a圖是依據本揭示內容另一實施例所繪示之野生型和Cz30菌株的細胞密度柱狀圖，其中該些菌株是分別以不同濃度的乙醇進行處理； 第28b圖是依據本揭示內容另一實施例所繪示之野生型和Cz30菌株的細胞密度及乙醇產量圖，其中該些菌株是分別培養於包含20%半乳糖之YPG培養液中；左側y軸代表細胞密度，右側y軸代表乙醇產量，x軸則代表時間； 第29a圖是依據本揭示內容一實施例所提供之野生型或Cz30菌株的照片，其中該些菌株是分別以溶於特定濃度之乙醇的10-去乙醯漿果赤黴素III來進行處理； 第29b圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之野生型或Cz30菌株的細胞密度柱狀圖，其中該些菌株是分別以溶於特定濃度之乙醇的10-去乙醯漿果赤黴素III來進行處理； 第30圖是依據本揭示內容一實施例所繪示之野生型或Cz30菌株的生長曲線圖，其中該些菌株是分別以（a）0.8 mM之溶於4%乙醇的10-去乙醯漿果赤黴素III，和（b）1.2 mM之溶於6%乙醇的10-去乙醯漿果赤黴素III進行處理；以及 第31圖是關於漿果赤黴素III於特定菌株中的生物轉換（bio-conversion）。

根據慣常的作業方式，圖中各種特徵與元件並未依比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。

＜110＞ 中央研究院   ＜120＞ 用以製備蝦紅素之重組多核苷酸序列及其用途   ＜130＞ P2804-TW   ＜160＞ 99   ＜170＞ BiSSAP 1.3   ＜210＞ 1 ＜211＞ 1128 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ crtE 基因   ＜400＞ 1 atggactacg ccaacatcct caccgccatc cccctcgagt tcacccccca ggacgacatc      60   gtcctcctcg agccctacca ctacctcggc aagaaccccg gcaaggagat ccgctcccag     120   ctcatcgagg ccttcaacta ctggctcgac gtcaagaagg aggacctcga ggtcatccag     180   aacgtcgtcg gcatgctcca caccgcctcc ctcctcatgg acgacgtcga ggactcctcc     240   gtcctccgcc gcggctcccc cgtcgcccac ctcatctacg gcatccccca gaccatcaac     300   accgccaact acgtctactt cctcgcctac caggagatct tcaagctccg ccccaccccc     360   atccccatgc ccgtcatccc cccctcctcc gcctccctcc agtcctccgt ctcctccgcc     420   tcctcctcct cctccgcctc ctccgagaac ggcggcacct ccacccccaa ctcccagatc     480   cccttctcca aggacaccta cctcgacaag gtcatcaccg acgagatgct ctccctccac     540   cgcggccagg gcctcgagct cttctggcgc gactccctca cctgcccctc cgaggaggag     600   tacgtcaaga tggtcctcgg caagaccggc ggcctcttcc gcatcgccgt ccgcctcatg     660   atggccaagt ccgagtgcga catcgacttc gtccagctcg tcaacctcat ctccatctac     720   ttccagatcc gcgacgacta catgaacctc cagtcctccg agtacgccca caacaagaac     780   ttcgccgagg acctcaccga gggcaagttc tccttcccca ccatccactc catccacgcc     840   aacccctcct cccgcctcgt catcaacacc ctccagaaga agtccacctc ccccgagatc     900   ctccaccact gcgtcaacta catgcgcacc gagacccact ccttcgagta cacccaggag     960   gtcctcaaca ccctctccgg cgccctcgag cgcgagctcg gccgcctcca gggcgagttc    1020   gccgaggcca actccaagat cgacctcggc gacgtcgagt ccgagggccg caccggcaag    1080   aacgtcaagc tcgaggccat cctcaagaag ctcgccgaca tccccctc                 1128     ＜210＞ 2 ＜211＞ 1638 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ HMG1 基因   ＜400＞ 2 atggagctca ccgccaacga catccagaag aagcgcgccg ccaagctcgt ccccaagccc      60   tactccaacc acaacgagaa gcagtccccc tcctcctccg cctccaacga gaccaaggtc     120   gagaccatca ccgagcgcat gcccgtcgtc gcctccatcc agcacgagat cgacaccgag     180   tccgactccg acaacggccc ctccgaggtc cgccccgtcg aggagctcgt cgaggtcctc     240   aagggcggcg 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caaggtcctc aagtccgacg tcaaggccct cgtcgacctc    1080   aacatctcca agaacctcat cggctccgcc atggccggct ccatcggcgg cttcaacgcc    1140   cacgcctcca acctcgtcac cgccgtctac ctcgccctcg gccaggaccc cgcccagaac    1200   gtcgagtcct ccaactgcat gaccctcatg aaggaggtcg acggcgacct ccgcatctcc    1260   gtctccatgc cctccatcga ggtcggcacc atcggcggcg gcaccatcct cgagccccag    1320   tccgccatgc tcgacctcct cggcgtccgc ggcccccacc ccaccgagcc cggcaagaac    1380   gcccgccagc tcgccaagat cgtcgcctcc gccgtcatgg ccggcgagct ctccctctgc    1440   tccgccctcg ccgccggcca cctcgtccag tcccacatgg tccacaaccg cgccaagcag    1500   cccgtcgcca ccggcgccgg cgcccccgtc tccggccccg gccccgtctc cacccccgcc    1560   atggccacca acggcaagga gctctccgcc gagcagctca agaccctcaa ggagggctcc    1620   gtcatctgca tcaagtcc                                                  1638     ＜210＞ 3 ＜211＞ 1746 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ crtI 基因   ＜400＞ 3 atgggcaagg agcaggacca ggacaagccc accgccatca tcgtcggctg cggcatcggc      60   ggcatcgcca ccgccgcccg cctcgccaag gagggcttcc aggtcaccgt cttcgagaag     120   aacgactact ccggcggccg ctgctccctc atcgagcgcg acggctaccg cttcgaccag     180   ggcccctccc tcctcctcct ccccgacctc ttcaagcaga ccttcgagga cctcggcgag     240   aagatggagg actgggtcga cctcatcaag tgcgagccca actacgtctg ccacttccac     300   gacgaggaga ccttcaccct ctccaccgac atggccctcc tcaagcgcga ggtcgagcgc     360   ttcgagggca aggacggctt cgaccgcttc ctctccttca tccaggaggc ccaccgccac     420   tacgagctcg ccgtcgtcca cgtcctccag aagaacttcc ccggcttcgc cgccttcctc     480   cgcctccagt tcatcggcca gatcctcgcc ctccacccct tcgagtccat ctggacccgc     540   gtctgccgct acttcaagac cgaccgcctc cgccgcgtct tctccttcgc cgtcatgtac     600   atgggccagt ccccctactc cgcccccggc acctactccc tcctccagta caccgagctc     660   accgagggca tctggtaccc ccgcggcggc ttctggcagg tccccaacac cctcctccag     720   atcgtcaagc gcaacaaccc ctccgccaag ttcaacttca acgcccccgt ctcccaggtc     780   ctcctctccc ccgccaagga ccgcgccacc ggcgtccgcc tcgagtccgg cgaggagcac     840   cacgccgacg tcgtcatcgt caacgccgac ctcgtctacg cctccgagca cctcatcccc     900   gacgacgccc gcaacaagat cggccagctc ggcgaggtca agcgctcctg gtgggccgac     960   ctcgtcggcg gcaagaagct caagggctcc tgctcctccc tctccttcta ctggtccatg    1020   gaccgcatcg tcgacggcct cggcggccac aacatcttcc tcgccgagga cttcaagggc    1080   tccttcgaca ccatcttcga ggagctcggc ctccccgccg acccctcctt ctacgtcaac    1140   gtcccctccc gcatcgaccc ctccgccgcc cccgagggca aggacgccat cgtcatcctc    1200   gtcccctgcg gccacatcga cgcctccaac ccccaggact acaacaagct cgtcgcccgc    1260   gcccgcaagt tcgtcatcca caccctctcc gccaagctcg gcctccccga cttcgagaag    1320   atgatcgtcg ccgagaaggt ccacgacgcc ccctcctggg agaaggagtt caacctcaag    1380   gacggctcca tcctcggcct cgcccacaac ttcatgcagg tcctcggctt ccgcccctcc    1440   acccgccacc ccaagtacga caagctcttc ttcgtcggcg cctccaccca ccccggcacc    1500   ggcgtcccca tcgtcctcgc cggcgccaag ctcaccgcca accaggtcct cgagtccttc    1560   gaccgctccc ccgcccccga ccccaacatg tccctctccg tcccctacgg caagcccctc    1620   aagtccaacg gcaccggcat cgactcccag gtccagctca agttcatgga cctcgagcgc    1680   tgggtctacc tcctcgtcct cctcatcggc gccgtcatcg cccgctccgt cggcgtcctc    1740   gccttc                                                               1746     ＜210＞ 4 ＜211＞ 2019 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ crtYB 基因   ＜400＞ 4 atgaccgccc tcgcctacta ccagatccac ctcatctaca ccctccccat cctcggcctc      60   ctcggcctcc tcacctcccc catcctcacc aagttcgaca tctacaagat ctccatcctc     120   gtcttcatcg ccttctccgc caccaccccc tgggactcct ggatcatccg caacggcgcc     180   tggacctacc cctccgccga gtccggccag ggcgtcttcg gcaccttcct cgacgtcccc     240   tacgaggagt acgccttctt cgtcatccag accgtcatca ccggcctcgt ctacgtcctc     300   gccacccgcc acctcctccc ctccctcgcc ctccccaaga cccgctcctc cgccctctcc     360   ctcgccctca aggccctcat ccccctcccc atcatctacc tcttcaccgc ccacccctcc     420   ccctcccccg accccctcgt caccgaccac tacttctaca tgcgcgccct ctccctcctc     480   atcacccccc ccaccatgct cctcgccgcc ctctccggcg agtacgcctt cgactggaag     540   tccggccgcg ccaagtccac catcgccgcc atcatgatcc ccaccgtcta cctcatctgg     600   gtcgactacg tcgccgtcgg ccaggactcc tggtccatca acgacgagaa gatcgtcggc     660   tggcgcctcg gcggcgtcct ccccatcgag gaggccatgt tcttcctcct caccaacctc     720   atgatcgtcc tcggcctctc cgcctgcgac cacacccagg ccctctacct cctccacggc     780   cgcaccatct acggcaacaa gaagatgccc tcctccttcc ccctcatcac cccccccgtc     840   ctctccctct tcttctcctc ccgcccctac tcctcccagc ccaagcgcga cctcgagctc     900   gccgtcaagc tcctcgagaa gaagtcccgc tccttcttcg tcgcctccgc cggcttcccc     960   tccgaggtcc gcgagcgcct cgtcggcctc tacgccttct gccgcgtcac cgacgacctc    1020   atcgactccc ccgaggtctc ctccaacccc cacgccacca tcgacatggt ctccgacttc    1080   ctcaccctcc tcttcggccc ccccctccac ccctcccagc ccgacaagat cctctcctcc    1140   cccctcctcc ccccctccca cccctcccgc cccaccggca tgtaccccct cccccccccc    1200   ccctccctct cccccgccga gctcgtccag ttcctcaccg agcgcgtccc cgtccagtac    1260   cacttcgcct tccgcctcct cgccaagctc cagggcctca tcccccgcta ccccctcgac    1320   gagctcctcc gcggctacac caccgacctc atcttccccc tctccaccga ggccgtccag    1380   gcccgcaaga cccccatcga gaccaccgcc gacctcctcg actacggcct ctgcgtcgcc    1440   ggctccgtcg ccgagctcct cgtctacgtc tcctgggcct ccgccccctc ccaggtcccc    1500   gccaccatcg aggagcgcga ggccgtcctc gtcgcctccc gcgagatggg caccgccctc    1560   cagctcgtca acatcgcccg cgacatcaag ggcgacgcca ccgagggccg cttctacctc    1620   cccctctcct tcttcggcct ccgcgacgag tccaagctcg ccatccccac cgactggacc    1680   gagccccgcc cccaggactt cgacaagctc ctctccctct ccccctcctc caccctcccc    1740   tcctccaacg cctccgagtc cttccgcttc gagtggaaga cctactccct ccccctcgtc    1800   gcctacgccg aggacctcgc caagcactcc tacaagggca tcgaccgcct ccccaccgag    1860   gtccaggccg gcatgcgcgc cgcctgcgcc tcctacctcc tcatcggccg cgagatcaag    1920   gtcgtctgga agggcgacgt cggcgagcgc cgcaccgtcg ccggctggcg ccgcgtccgc    1980   aaggtcctct ccgtcgtcat gtccggctgg gagggccag                           2019     ＜210＞ 5 ＜211＞ 891 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ CrChYb 基因   ＜400＞ 5 atgatgctcg cctcccgccc cgccgtcgcc ctcggcgccc gcgcccagcc ccaggtcctc      60   cgccccaccc tcgtcccccg ccccggcatg gtctccaacc tccgcctcca gcccgtcaag     120   gtcgccgacc ccatcgtcgc ctccgagacc tcccaggtca tggaggcccc ccaggagaag     180   aagctctccg agttcgagct caagcgcctc gagcgcaagc agcagcgcgc ccaggaggcc     240   gccacctaca agttctccgc catcgccgcc accgtcctcg tcctctccat cgccgtcgtc     300   gccacctact accgcttcgc ctggcacttc gccgaggacg gcgacctccc cgtcgacgag     360   atggccgcca ccctcctcct cgtcttcggc ggcatgttcg gcatggagat gtacgcccgc     420   ttcgcccaca aggtcctctg gcacgacttc gagcccggct gggccctcca caagtcccac     480   cacgagcccc gcaccggccc cttcgagctc aacgacatct acgccgtcgc caacgccctc     540   cccgccatgg ccctctgcgc ctacggcttc ttcacccccc acgtcatcgg cggcgtctgc     600   ttcggcgccg gcctcggcat caccctcttc ggcatcgcct acatgttctt ccacgacggc     660   ctcgtccacc gccgcttccc cgtcggcccc atcgccaacc tcccctacat gaagcgcatc     720   atggtcgccc accagatcca ccacaccaac aagttcggcg gcgtcccctt cggcatgttc     780   ctcggcgtcc aggagctcga ggccgtcccc ggcggcaagg aggagctcga caagctcatg     840   gccgacctcg aggcccgcga ggccgccgcc gccaaggccg ccggctcctc c              891     ＜210＞ 6 ＜211＞ 897 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ CzChYb 基因   ＜400＞ 6 atgcagaccg tcttccagcc ctcctccgtc tggcacctcc gcaaccgcca cgtcctcggc      60   gaccgcacct gcgtcccctg ccgcacctcc ctctccacct gccgccacgc cgtccgcctc     120   gtccgcgcca acgtcgccga gacccaggcc acccccacca cctcccagat gctcgaggag     180   gtccacgacg agtcccacgc cgcctccgcc tcctcccaga tcttcgagct cgccgtcaag     240   acctccatca agcgccagca gcgcaaccgc cagcagctca cctaccaggg ctccgccatc     300   gccgcctccc tcggcgtcgg cgccctcgcc gtcgccgcca cccactacaa gttctcctac     360   cacatgccct ccgagtcccc cttcccctgg ctcgacatgg ccggcaccct cgccctcgtc     420   atcggcggcg tcttcggcat ggagatgtgg gcccgctacg cccacaaggc cctctggcac     480   gacttccagc ccggctgggc cctccacaag tcccaccacg agccccgcat cggccccttc     540   gaggccaacg acatcttcgc cgtcatcaac gccgtccccg ccttctccct ctgcctctac     600   ggcttcctca cccccaacct cgtcggctcc ctctgcttcg gcgccggcct cggcatcacc     660   ctcttcggca tcatgtacat gttcatccac gacggcctcg tccacaagcg cttccccgtc     720   ggccccatcg cccagatgcc cgccatgaag cgcgtcgcca tcgcccacaa gctccaccac     780   tccgagaagt acggcggcgt cccctggggc atgttcttcg gcccccagga gctcgaggcc     840   atcggcgccg gccccgagct cgaccgcctc tgcgccgagc tcgactccaa gtcctcc        897     ＜210＞ 7 ＜211＞ 879 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ HpChYb 基因   ＜400＞ 7 atgctctcca agctccagtc catctccgtc aaggcccgcc gcgtcgagct cgcccgcgac      60   atcacccgcc ccaaggtctg cctccacgcc cagcgctgct ccctcgtccg cctccgcgtc     120   gccgcccccc agaccgagga ggccctcggc accgtccagg ccgccggcgc cggcgacgag     180   cactccgccg acgtcgccct ccagcagctc gaccgcgcca tcgccgagcg ccgcgcccgc     240   cgcaagcgcg agcagctctc ctaccaggcc gccgccatcg ccgcctccat cggcgtctcc     300   ggcatcgcca tcttcgccac ctacctccgc ttcgccatgc acatgaccgt cggcggcgcc     360   gtcccctggg gcgaggtcgc cggcaccctc ctcctcgtcg tcggcggcgc cctcggcatg     420   gagatgtacg cccgctacgc ccacaaggcc atctggcacg agtcccccct cggctggctc     480   ctccacaagt cccaccacac cccccgcacc ggccccttcg aggccaacga cctcttcgcc     540   atcatcaacg gcctccccgc catgctcctc tgcaccttcg gcttctggct ccccaacgtc     600   ctcggcgccg cctgcttcgg cgccggcctc ggcatcaccc tctacggcat ggcctacatg     660   ttcgtccacg acggcctcgt ccaccgccgc ttccccaccg gccccatcgc cggcctcccc     720   tacatgaagc gcctcaccgt cgcccaccag ctccaccact ccggcaagta cggcggcgcc     780   ccctggggca tgttcctcgg cccccaggag ctccagcaca tccccggcgc cgccgaggag     840   gtcgagcgcc tcgtcctcga gctcgactgg tccaagcgc                            879     ＜210＞ 8 ＜211＞ 1332 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ bkt 基因   ＜400＞ 8 atgggccccg gcatccagcc cacctccgcc cgcccctgct cccgcaccaa gcactcccgc      60   ttcgccctcc tcgccgccgc cctcaccgcc cgccgcgtca agcagttcac caagcagttc     120   cgctcccgcc gcatggccga ggacatcctc aagctctggc agcgccagta ccacctcccc     180   cgcgaggact ccgacaagcg caccctccgc gagcgcgtcc acctctaccg ccccccccgc     240   tccgacctcg gcggcatcgc cgtcgccgtc accgtcatcg ccctctgggc caccctcttc     300   gtctacggcc tctggttcgt caagctcccc tgggccctca aggtcggcga gaccgccacc     360   tcctgggcca ccatcgccgc cgtcttcttc tccctcgagt tcctctacac cggcctcttc     420   atcaccaccc acgacgccat gcacggcacc atcgccctcc gcaaccgccg cctcaacgac     480   ttcctcggcc agctcgccat ctccctctac gcctggttcg actactccgt cctccaccgc     540   aagcactggg agcaccacaa ccacaccggc gagccccgcg tcgaccccga cttccaccgc     600   ggcaacccca acctcgccgt ctggttcgcc cagttcatgg tctcctacat gaccctctcc     660   cagttcctca agatcgccgt ctggtccaac ctcctcctcc tcgccggcgc ccccctcgcc     720   aaccagctcc tcttcatgac cgccgccccc atcctctccg ccttccgcct cttctactac     780   ggcacctacg tcccccacca ccccgagaag ggccacaccg gcgccatgcc ctggcaggtc     840   tcccgcacct cctccgcctc ccgcctccag tccttcctca cctgctacca cttcgacctc     900   cactgggagc accaccgctg gccctacgcc ccctggtggg agctccccaa gtgccgccag     960   atcgcccgcg gcgccgccct cgcccccggc cccctccccg tccccgccgc cgccgccgcc    1020   accgccgcca ccgccgccgc cgccgccgcc gccaccggct cccccgcccc cgcctcccgc    1080   gccggctccg cctcctccgc ctccgccgcc gcctccggct tcggctccgg ccactccggc    1140   tccgtcgccg cccagcccct ctcctccctc cccctcctct ccgagggcgt caagggcctc    1200   gtcgagggcg ccatggagct cgtcgccggc ggctcctcct ccggcggcgg cggcgagggc    1260   ggcaagcccg gcgccggcga gcacggcctc ctccagcgcc agcgccagct cgcccccgtc    1320   ggcgtcatgg cc                                                        1332     ＜210＞ 9 ＜211＞ 2238 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ crtR 基因   ＜400＞ 9 atggccaccc tctccgacct cgtcatcctc ctcctcggcg ccctcctcgc cctcggcttc      60   tacaacaagg accgcctcct cggctcctcc tcctcctccg cctccaccac ctccggctcc     120   tccgccgcca ccgccaacgg ctccaagccc acctactcca acggcaacgg caacgccttc     180   aagggcgacc cccgcgactt cgtcgcccgc atgaaggacc agaagaagcg cctcgccgtc     240   ttctacggct cccagaccgg caccgccgag gagtacgcca cccgcatcgc caaggaggcc     300   aagtcccgct tcggcgtctc ctccctcgtc tgcgacatcg aggagtacga cttcgagaag     360   ctcgaccagg tccccgagga ctgcgccatc gtcttctgca tggccaccta cggcgagggc     420   gagcccaccg acaacgccgt ccagttcatc gagatgatct cccaggacga ccccgagttc     480   tccgagggct ccaccctcga cggcctcaag tacgtcgtct tcggcctcgg caacaagacc     540   tacgagcagt acaacgtcgt cggccgccag ctcgacgccc gcctcaccgc cctcggcgcc     600   acccgcgtcg gcgagcgcgg cgagggcgac gacgacaagt ccatggagga ggactacctc     660   gcctggaagg acgacatgtt cgccgccctc gccaccaccc tctccttcga ggagggcgcc     720   tccggcgaga cccccgactt cgtcgtcacc gaggtcccca accaccccat cgagaaggtc     780   ttccagggcg agctctcctc ccgcgccctc ctcggctcca agggcgtcca cgacgccaag     840   aacccctacg cctcccccgt cctcgcctgc cgcgagctct tcaccggcgg cgaccgcaac     900   tgcatccacc tcgagttcga catcaccggc tccggcatca cctaccagac cggcgaccac     960   gtcgccgtct ggccctccaa ccccgacgtc gaggtcgagc gcctcctcgc cgtcctcggc    1020   ctcacctccc ccgagaagcg ccgcatgatc atccaggtcg tctccctcga ccccaccctc    1080   gccaaggtcc ccttccccac ccccaccacc tacgacgccg tcttccgcca ctacctcgac    1140   atctccgccg tcgcctcccg ccagaccctc gccgtcctcg ccaagtacgc cccctccgag    1200   caggccgccg agttcctcac ccgcctcggc accgacaagc aggcctacca caccgaggtc    1260   gtcggcggcc acctccgcct cgccgaggtc ctccagctcg ccgccggcaa cgacatcacc    1320   gtcatgccca ccgccgagaa caccaccgtc tggaacatcc ccttcgacca cgtcgtctcc    1380   gacgtctccc gcctccagcc ccgcttctac tccatctcct cctcccccaa gctccacccc    1440   aactccatcc acgtcaccgc cgtcatcctc aagtacgagt cccaggccac cgaccgccac    1500   cccgcccgct gggtcttcgg cctcggcacc aactacctcc tcaacgtcaa gcaggccgcc    1560   aacaacgaga ccacccccat gatctccgac ggccaggacg acgtccccga gcacgtctcc    1620   gcccccaagt acaccctcga gggcccccgc ggctcctaca agcacgacga ccagctcttc    1680   aaggtcccca tccacgtccg ccgctccacc ttccgcctcc ccacctcccc caagatcccc    1740   gtcatcatga tcggccccgg caccggcgtc gcccccttcc gcggcttcat ccaggagcgc    1800   atcgccctcg cccgccgctc catcgccaag aacggccccg acgccctcgc cgactgggcc    1860   cccatctacc tcttctacgg ctcccgcgac gagcaggact tcctctacgc cgaggagtgg    1920   cccgcctacg aggccgagct ccagggcaag ttcaagatcc acgtcgcctt ctcccgctcc    1980   ggcccccgca agcccgacgg ctccaagatc tacgtccagg acctcctctg ggaccagaag    2040   gaggtcatca agtccgccat cgtcgagaag cgcgcctccg tctacatctg cggcgacggc    2100   cgcaacatgt ccaaggacgt cgagcagaag ctcgccgcca tgctcgccga gtccaagaac    2160   ggctccgccg ccgtcgaggg cgccgccgag gtcaagtccc tcaaggagcg ctcccgcctc    2220   ctcatggacg tctggtcc                                                  2238     ＜210＞ 10 ＜211＞ 1671 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ crtS 基因   ＜400＞ 10 atgttcatcc tcgtcctcct caccggcgcc ctcggcctcg ccgccttctc ctgggcctcc      60   atcgccttct tctccctcta cctcgccccc cgccgctcct ccctctacaa cctccagggc     120   cccaaccaca ccaactactt caccggcaac ttcctcgaca tcctctccgc ccgcaccggc     180   gaggagcacg ccaagtaccg cgagaagtac ggctccaccc tccgcttcgc cggcatcgcc     240   ggcgcccccg tcctcaactc caccgacccc aaggtcttca accacgtcat gaaggaggcc     300   tacgactacc ccaagcccgg catggccgcc cgcgtcctcc gcatcgccac cggcgacggc     360   gtcgtcaccg ccgagggcga ggcccacaag cgccaccgcc gcatcatgat cccctccctc     420   tccgcccagg ccgtcaagtc catggtcccc atcttcctcg agaagggcat ggagctcgtc     480   gacaagatga tggaggacgc cgccgagaag gacatggccg tcggcgagtc cgccggcgag     540   aagaaggcca cccgcctcga gaccgagggc gtcgacgtca aggactgggt cggccgcgcc     600   accctcgacg tcatggccct cgccggcttc gactacaagt ccgactccct ccagaacaag     660   accaacgagc tctacgtcgc cttcgtcggc ctcaccgacg gcttcgcccc caccctcgac     720   tccttcaagg ccatcatgtg ggacttcgtc ccctacttcc gcaccatgaa gcgccgccac     780   gagatccccc tcacccaggg cctcgccgtc tcccgccgcg tcggcatcga gctcatggag     840   cagaagaagc aggccgtcct cggctccgcc tccgaccagg ccgtcgacaa gaaggacgtc     900   cagggccgcg acatcctctc cctcctcgtc cgcgccaaca tcgccgccaa cctccccgag     960   tcccagaagc tctccgacga ggaggtcctc gcccagatct ccaacctcct cttcgccggc    1020   tacgagacct cctccaccgt cctcacctgg atgttccacc gcctctccga ggacaaggcc    1080   gtccaggaca agctccgcga ggagatctgc cagatcgaca ccgacatgcc caccctcgac    1140   gagctcaacg ccctccccta cctcgaggcc ttcgtcaagg agtccctccg cctcgacccc    1200   ccctccccct acgccaaccg cgagtgcctc aaggacgagg acttcatccc cctcgccgag    1260   cccgtcatcg gccgcgacgg ctccgtcatc aacgaggtcc gcatcaccaa gggcaccatg    1320   gtcatgctcc ccctcttcaa catcaaccgc tccaagttca tctacggcga ggacgccgag    1380   gagttccgcc ccgagcgctg gctcgaggac gtcaccgact ccctcaactc catcgaggcc    1440   ccctacggcc accaggcctc cttcatctcc ggcccccgcg cctgcttcgg ctggcgcttc    1500   gccgtcgccg agatgaaggc cttcctcttc gtcaccctcc gccgcgtcca gttcgagccc    1560   atcatctccc accccgagta cgagcacatc accctcatca tctcccgccc ccgcatcgtc    1620   ggccgcgaga aggagggcta ccagatgcgc ctccaggtca agcccgtcga g             1671     ＜210＞ 11 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 順向引子_crtE 基因_AgeI   ＜400＞ 11 accggtatgg attacgcgaa catcct                                         26     ＜210＞ 12 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 反向引子_crtE 基因_NcoI   ＜400＞ 12 ccatggtcac agagggatat cggcta                                         26     ＜210＞ 13 ＜211＞ 28 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 順向引子_HMG1 基因_NotI   ＜400＞ 13 gcggccgcat ggaactaact gctaatga                                       28     ＜210＞ 14 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 反向引子_HMG1 基因_XhoI   ＜400＞ 14 ctcgagtcac gatttgatgc aaatca                                         26     ＜210＞ 15 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 順向引子_crtI 基因_AgeI   ＜400＞ 15 accggtatgg gaaaagaaca agatca                                         26     ＜210＞ 16 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 反向引子_crtI 基因_NcoI   ＜400＞ 16 ccatggtcag aaagcaagaa caccaa                                         26     ＜210＞ 17 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 順向引子_crtYB 基因_AgeI   ＜400＞ 17 accggtatga cggctctcgc atatta                                         26     ＜210＞ 18 ＜211＞ 28 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 反向引子_crtYB 基因_NotI   ＜400＞ 18 gcggccgctt actgcccttc ccatccgc                                       28     ＜210＞ 19 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 順向引子_crtR 基因_NcoI   ＜400＞ 19 ccatggatgg ccacactctc cgatct                                         26     ＜210＞ 20 ＜211＞ 33 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 反向引子_crtR 基因_SfiI   ＜400＞ 20 ggcccaacag gccctacgac cagacgtcca tca                                  33     ＜210＞ 21 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 順向引子_crtS 基因_AgeI   ＜400＞ 21 accggtatgt tcatcttggt cttgct                                         26     ＜210＞ 22 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 反向引子_crtS 基因_NcoI   ＜400＞ 22 ccatggtcat tcgaccggct tgacct                                         26     ＜210＞ 23 ＜211＞ 25 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-KlPLac4   ＜400＞ 23 ccgcggggat cgactcataa aatag                                          25     ＜210＞ 24 ＜211＞ 82 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-ScTTPGK_KlPGapDH   ＜400＞ 24 ggactccagc ttttccattt gccttcgcgc ttgcctgtac ggtcgttacc atactaagct     60   ttttcgaaac gcagaatttt cg                                              82     ＜210＞ 25 ＜211＞ 25 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-KlPGapDH   ＜400＞ 25 agtatggtaa cgaccgtaca ggcaa                                          25     ＜210＞ 26 ＜211＞ 78 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-ScTTGap_ScPADHI   ＜400＞ 26 ggaatcccga tgtatgggtt tggttgccag aaaagaggaa gtccatattg tacactggcg     60   gaaaaaattc atttgtaa                                                   78     ＜210＞ 27 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-ScPADHI   ＜400＞ 27 gtgtacaata tggacttcct cttttc                                         26     ＜210＞ 28 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-ScTTADHI_KlPLac4   ＜400＞ 28 gaaatttagg aattttaaac ttg                                            23     ＜210＞ 29 ＜211＞ 78 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-ScTTGap_ScPGK   ＜400＞ 29 ggactccagc ttttccattt gccttcgcgc ttgcctgtac ggtcgttacc atacttggcg     60   gaaaaaattc atttgtaa                                                   78     ＜210＞ 30 ＜211＞ 25 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-ScPGK   ＜400＞ 30 actgtaattg cttttagttg tgtat                                          25     ＜210＞ 31 ＜211＞ 80 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-ScTTPGK_KlPADHI   ＜400＞ 31 aggtaagtat ggtaacgacc gtacaggcaa gcgcgaaggc aaatggaaaa gctggaagct     60   ttttcgaaac gcagaatttt                                                 80     ＜210＞ 32 ＜211＞ 30 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-KlPADHI   ＜400＞ 32 ccagcttttc catttgcctt cgcgcttgcc                                     30     ＜210＞ 33 ＜211＞ 78 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-KlTTLac4_ScPGapDH   ＜400＞ 33 ctactattaa ttatttacgt attctttgaa atggcagtat tgataatgat aaacttatac     60   aacatcgaag aagagtct                                                   78     ＜210＞ 34 ＜211＞ 25 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-ScPGapDH   ＜400＞ 34 agtttatcat tatcaatact gccat                                          25     ＜210＞ 35 ＜211＞ 81 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-ScTTGap_KlPGK   ＜400＞ 35 catatacctt tgataccata aaaacaagca aatattctta cttcaaacac acccgtggcg     60   gaaaaaattc atttgtaaac t                                               81     ＜210＞ 36 ＜211＞ 25 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-KlPGK   ＜400＞ 36 cgggtgtgtt tgaagtaaga atatt                                          25     ＜210＞ 37 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-crtE-UPL#1-F   ＜400＞ 37 cgagatgctt tccctccata                                                20     ＜210＞ 38 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-crtE-UPL#1-R   ＜400＞ 38 ttcgctagga cacgtcagac t                                              21     ＜210＞ 39 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-crtI-UPL#155-F   ＜400＞ 39 ccgatccttc cttttacgtg                                                20     ＜210＞ 40 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-crtI-UPL#155-R   ＜400＞ 40 cggcacaaga atgacgatag                                                20     ＜210＞ 41 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-crtR-UPL#41-F   ＜400＞ 41 acgtcgtctc tgacgtttcc                                                20     ＜210＞ 42 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-crtR-UPL#41-R   ＜400＞ 42 ttgggtgaag tttcggagaa                                                20     ＜210＞ 43 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-crtS-UPL#149-F   ＜400＞ 43 ggatgttcaa ggtcgggata                                                20     ＜210＞ 44 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-crtS-UPL#149-R   ＜400＞ 44 cggacagctt ttgagattca g                                              21     ＜210＞ 45 ＜211＞ 25 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-crtYB-UPL#34-F   ＜400＞ 45 cactgatctt atctttccct tatcg                                          25     ＜210＞ 46 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-crtYB-UPL#34-R   ＜400＞ 46 gtggtctcga taggcgtctt                                                20     ＜210＞ 47 ＜211＞ 18 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-tHMG-UPL#119-F   ＜400＞ 47 ttctgctatg gcgggttc                                                  18     ＜210＞ 48 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-tHMG-UPL#119-R   ＜400＞ 48 gctgtaacca aattcgaagc a                                              21     ＜210＞ 49 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-CrBKT-UPL#159-F   ＜400＞ 49 gctgctgcaa ctggttcac                                                 19     ＜210＞ 50 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-CrBKT-UPL#159-R   ＜400＞ 50 gcactagcgg aactagcaga a                                              21     ＜210＞ 51 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-CrChYb-UPL#48-F   ＜400＞ 51 ttctttcacg atggattggt c                                              21     ＜210＞ 52 ＜211＞ 22 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-CrChYb-UPL#48-R   ＜400＞ 52 tgtatggtaa gttggcgata gg                                             22     ＜210＞ 53 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-CZChYb-UPL#157-F   ＜400＞ 53 cgcccacaaa ttacaccatt                                                20     ＜210＞ 54 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-CZChYb-UPL#157-R   ＜400＞ 54 tccgaaaaac ataccccaag                                                20     ＜210＞ 55 ＜211＞ 22 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-HpChYb#139-F   ＜400＞ 55 aacgacttgt tcgcaatcat ta                                             22     ＜210＞ 56 ＜211＞ 18 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-HpChYb#139-R   ＜400＞ 56 cccaacacgt ttggcaac                                                  18     ＜210＞ 57 ＜211＞ 22 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-Kan-UPL#144-F   ＜400＞ 57 agactaaact ggctgacgga at                                             22     ＜210＞ 58 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-Kan-UPL#144-R   ＜400＞ 58 catcaggagt acggataaaa tgc                                            23     ＜210＞ 59 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-Actin-UPL #9-F   ＜400＞ 59 gcgtagattg gaacaacgtg                                                20     ＜210＞ 60 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-Actin-UPL #9-R   ＜400＞ 60 agaactaccg gtattgtgtt gga                                            23     ＜210＞ 61 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-alg9-UPL #132-F   ＜400＞ 61 caatcaatgg cccgtatcat                                                20     ＜210＞ 62 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 引子-alg9-UPL #132-R   ＜400＞ 62 tgtctcagaa gcacagtttg g                                              21     ＜210＞ 63 ＜211＞ 2292 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ KlLac4 啟動子   ＜400＞ 63 ccgcggggat cgactcataa aatagtaacc ttctaatgcg tatctattga ctaccaacca      60   ttagtgtggt tgcagaaggc ggaattttcc cttcttcgaa tttagcttgc tttttcattt     120   tttattttcc atttttcagt ttttgtttgt gtcgaattta gccagttgct tctccaagat     180   gaaaaaaacc cctgcgcagt ttctgtgctg caagatccta atcgactttt ccacccccca     240   caaaagtaaa tgttcttttg ttacattcgc gtgggtagct agctccccga atcttcaaag     300   gacttaggga ctgcactaca tcagagtgtg ttcacctggt ttgctgcctg gtttgaaaga     360   aaagagcagg gaactcgcgg gttcccggcg aataatcatg cgatagtcct ttggccttcc     420   aagtcgcatg tagagtagac aacagacagg gagggcagga aggatctttc actgagatcc     480   tgtatcttgt tgggtaagtc ggatgaaagg ggaatcgtat gagattggag aggatgcgga     540   agaggtaacg ccttttgtta acttgtttaa ttattatggg gcaggcgaga gggggaggaa     600   tgtatgtgtg tgaggcgggc gagacggagc catccaggcc aggtagaaat agagaaagcc     660   gaatgttaga caatatggca gcgtagtaga gtaggtaggt aggcaagtac tgctagcaaa     720   gaggagaagg gtaagctcac tcttcgcatt ccacaccgtt agtgtgtcag tttgaacaaa     780   aaaacaatca tcataccaat tgatggactg tggactggct tttggaacgg cttttcggac     840   tgcgattatt cgtgaggaat caaggtagga atttggtcat atttacggac aacagtgggt     900   gattcccata tcgagtagga aaacgagatc atggtatcct cagatatgtt gcggaaatct     960   gttcaccgca aagttcaggg tgctctggtg ggtttcggtt ggtctttgct ttgcttctcc    1020   cttgtcttgc atgttaataa tagcctagcc tgtgagccga aacttagggt aggcttagtg    1080   ttggaacgta catatctatc acgttgactt ggtttaacca ggcgacctgg tagccagcca    1140   tacccacaca cgttttttgt atcttcagta tagttgtgaa aagtgtagcg gaaatttgtg    1200   gtccgagcaa cagcgtcttt ttctagtagt gcggtcggtt acttggttga cattggtatt    1260   tggactttgt tgctacacca ttcactactt gaagtcgagt gtgaagggta tgatttctag    1320   tggtgaacac ctttagttac gtaatgtttt cattgctgtt ttacttgaga tttcgattga    1380   gaaaaaggta tttaatagct cgaatcaatg tgagaacaga gagaagatgt tcttccctaa    1440   ctcgaaaggt atatgaggct tgtgtttctt aggagaatta ttattctttt gttatgttgc    1500   gcttgtagtt ggaaaaggtg aagagacaaa agctggaatt gtgagcggat aacaagctca    1560   acacttgaaa tttaggaaag agcagaattt ggcaaaaaaa ataaaaaaaa aataaacaca    1620   catactcatc gagaccggtg gcgcgcccct aggggccggc cacgcgtcca tgggcggccg    1680   cttaattaag gcctgttggg ccctcgagat ttatacttag ataagtatgt acttacaggt    1740   atatttctat gagatactga tgtatacatg catgataata tttaaacggt tattagtgcc    1800   gattgtcttg tgcgataatg acgttcctat caaagcaata cacttaccac ctattacatg    1860   ggccaagaaa atattttcga acttgtttag aatattagca cagagtatat gatgttatcc    1920   gttagattat gcatgattca ttcctacaac tttttcgtag cataaggatt aattacttgg    1980   atgccaataa aaaaaaaaaa catcgagaaa atttcagcat gctcagaaac aattgcagtg    2040   tatcaaagta aaaaaaagat tttcactaca tgttcctttt gaagaaagaa aatcatggaa    2100   cattagattt acaaaaattt aaccaccgct gattaacgat tagaccgtta agcgcacaac    2160   aggttattag tacagagaaa gcattctgtg gtgttgcccc ggactttctt ttgcgacata    2220   ggtaaatcga ataccatcat actatctttt ccaatgactc cctaaagaaa gactcttctt    2280   cgatgttgta ta                                                        2292     ＜210＞ 64 ＜211＞ 1047 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScGapDH 啟動子   ＜400＞ 64 agtttatcat tatcaatact gccatttcaa agaatacgta aataattaat agtagtgatt      60   ttcctaactt tatttagtca aaaaattagc cttttaattc tgctgtaacc cgtacatgcc     120   caaaataggg ggcgggttac acagaatata taacatcgta ggtgtctggg tgaacagttt     180   attcctggca tccactaaat ataatggagc ccgcttttta agctggcatc cagaaaaaaa     240   aagaatccca gcaccaaaat attgttttct tcaccaacca tcagttcata ggtccattct     300   cttagcgcaa ctacagagaa caggggcaca aacaggcaaa aaacgggcac aacctcaatg     360   gagtgatgca acctgcctgg agtaaatgat gacacaaggc aattgaccca cgcatgtatc     420   tatctcattt tcttacacct tctattacct tctgctctct ctgatttgga aaaagctgaa     480   aaaaaaggtt gaaaccagtt ccctgaaatt attcccctac ttgactaata agtatataaa     540   gacggtaggt attgattgta attctgtaaa tctatttctt aaacttctta aattctactt     600   ttatagttag tctttttttt agttttaaaa caccaagaac ttagtttcga ataaacacac     660   ataaacaaac aaaaaaaccg gtggcgcgcc cctaggggcc ggccacgcgt ccatgggcgg     720   ccgcttaatt aaggcctgtt gggccctcga ggtgaattta ctttaaatct tgcatttaaa     780   taaattttct ttttatagct ttatgactta gtttcaattt atatactatt ttaatgacat     840   tttcgattca ttgattgaaa gctttgtgtt ttttcttgat gcgctattgc attgttcttg     900   tctttttcgc cacatgtaat atctgtagta gatacctgat acattgtgga tgctgagtga     960   aattttagtt aataatggag gcgctcttaa taattttggg gatattggct ttttttttta    1020   aagtttacaa atgaattttt tccgcca                                        1047     ＜210＞ 65 ＜211＞ 1239 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScPGK 啟動子   ＜400＞ 65 actgtaattg cttttagttg tgtattttta gtgtgcaagt ttctgtaaat cgattaattt      60   ttttttcttt cctcttttta ttaaccttaa tttttatttt agattcctga cttcaactca     120   agacgcacag atattataac atctgcataa taggcatttg caagaattac tcgtgagtaa     180   ggaaagagtg aggaactatc gcatacctgc atttaaagat gccgatttgg gcgcgaatcc     240   tttattttgg cttcaccctc atactattat cagggccaga aaaaggaagt gtttccctcc     300   ttcttgaatt gatgttaccc tcataaagca cgtggcctct tatcgagaaa gaaattaccg     360   tcgctcgtga tttgtttgca aaaagaacaa aactgaaaaa acccagacac gctcgacttc     420   ctgtcttcct attgattgca gcttccaatt tcgtcacaca acaaggtcct agcgacggct     480   cacaggtttt gtaacaagca atcgaaggtt ctggaatggc gggaaagggt ttagtaccac     540   atgctatgat gcccactgtg atctccagag caaagttcgt tcgatcgtac tgttactctc     600   tctctttcaa acagaattgt ccgaatcgtg tgacaacaac agcctgttct cacacactct     660   tttcttctaa ccaagggggt ggtttagttt agtagaacct cgtgaaactt acatttacat     720   atatataaac ttgcataaat tggtcaatgc aagaaataca tatttggtct tttctaattc     780   gtagtttttc aagttcttag atgctttctt tttctctttt ttacagatca tcaaggaagt     840   aattatctac tttttacaac aaatataaaa caaaaaaaac cggtggcgcg cccctagggg     900   ccggccacgc gtccatgggc ggccgcttaa ttaaggcctg ttgggccctc gagattgaat     960   tgaattgaaa tcgatagatc aatttttttc ttttctcttt ccccatcctt tacgctaaaa    1020   taatagttta ttttattttt tgaatatttt ttatttatat acgtatatat agactattat    1080   ttacttttaa tagattatta agatttttat taaaaaaaaa ttcgtccctc tttttaatgc    1140   cttttatgca gttttttttt cccattcgat atttctatgt tcgggtttca gcgtatttta    1200   agtttaataa ctcgaaaatt ctgcgtttcg aaaaagctt                           1239     ＜210＞ 66 ＜211＞ 1090 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ KlGapDH 啟動子   ＜400＞ 66 agtatggtaa cgaccgtaca ggcaagcgcg aaggcaaatg gaaaagctgg agtccggaag      60   ataatcattt catcttcttt tgttagaaca gaacagtgga tgtccctcat ctcggtaacg     120   tattgtccat gccctagaac tctctgtccc taaaaagagg acaaaaaccc aatggtttcc     180   ccagcttcca gtggagccac cgatcccact ggaaaccact ggacaggaag agaaaatcac     240   ggacttcctc tattgaagga taattcaaca ctttcaccag atcccaaatg tcccgcccct     300   attcccgtgt tccatcacgt accataactt accatttcat cacgttctct atggcacact     360   ggtactgctt cgactgcttt gcttcatctt ctctatgggc caatgagcta atgagcacaa     420   tgtgctgcga aataaaggga tatctaattt atattattac attataatat gtactagtgt     480   ggttattggt aattgtactt aattttgata tataaagggt ggatcttttt cattttgaat     540   cagaattgga attgcaactt gtctcttgtc actattactt aatagtaatt atatttctta     600   ttaacctttt ttttaagtca aaacaccaag gacaagaact actcttcaaa ggtatttcaa     660   gttatcatac gtctcacaca cgcttcacag tttcaagtaa aaaaaaagaa tattacacaa     720   ccggtggcgc gcccctaggg gccggccacg cgtccatggg cggccgctta attaaggcct     780   gttgggccct cgaggtgaat ttactttaaa tcttgcattt aaataaattt tctttttata     840   gctttatgac ttagtttcaa tttatatact attttaatga cattttcgat tcattgattg     900   aaagctttgt gttttttctt gatgcgctat tgcattgttc ttgtcttttt cgccacatgt     960   aatatctgta gtagatacct gatacattgt ggatgctgag tgaaatttta gttaataatg    1020   gaggcgctct taataatttt ggggatattg gctttttttt ttaaagttta caaatgaatt    1080   ttttccgcca                                                           1090     ＜210＞ 67 ＜211＞ 1236 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ KlPGK 啟動子   ＜400＞ 67 cgggtgtgtt tgaagtaaga atatttgctt gtttttatgg tatcaaaggt atatgttgta      60   gaagacaatt tccggtaatc caattgtctg tctgctcagt ttagcacatg tatagtacgt     120   tgcacatagt ctacaatatt cagcattcag cattcagtat acagcatatg gctaaatgat     180   cacaaatgtg attgatgatt tgacacgact agaaaagaga acgaaaaagg gaaattccat     240   gtcacgtgcg ttggcacgtg acatggaata tcgaagaaag aaaaaaaaaa cgatctcgtc     300   ctagtggaag cccagagtct ggtccccccg gagtcttccc aaaacaagaa gctgacacat     360   gttgacacag aacaccccac agcaaatgca ccacgctacg tagatcagga agcttaactc     420   tagcgacctg tcgctcgccc cacagaacct cacccgagaa ccacacatta cacgccgcca     480   gctcccacta tactcatctt gcttccctta agcgttctca cgattcgttc gctgcccttc     540   ttcaagagtc ttctgattct aattctcatt cgaaatcctc tacagttaat gaattgcttg     600   acatgacatt cattgtctca tggttttggc tttttggctt ttgtctttta aagctatatc     660   aactttacat ataaatatac gtcaaaaggg gattcattaa ttagaaaatt ctctttttca     720   atagttgcta ttcattatca atctattcaa ctcaattggt tattattttc atctttttgt     780   catcctaaac catcaacaat atttaaatat atctgttgct acattaagag ttacttcaga     840   aataacaaaa aaatcgatca agaattaata aaaaaaccgg tggcgcgccc ctaggggccg     900   gccacgcgtc catgggcggc cgcttaatta aggcctgttg ggccctcgag attgaattga     960   attgaaatcg atagatcaat ttttttcttt tctctttccc catcctttac gctaaaataa    1020   tagtttattt tattttttga atatttttta tttatatacg tatatataga ctattattta    1080   cttttaatag attattaaga tttttattaa aaaaaaattc gtccctcttt ttaatgcctt    1140   ttatgcagtt tttttttccc attcgatatt tctatgttcg ggtttcagcg tattttaagt    1200   ttaataactc gaaaattctg cgtttcgaaa aagctt                              1236     ＜210＞ 68 ＜211＞ 1246 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ KlADHI 啟動子   ＜400＞ 68 ccagcttttc catttgcctt cgcgcttgcc tgtacggtcg ttaccatact tacctttctt      60   gcttcttctc aaaatggaat ccaggttttt agcttcgtgt ttcttttttt tttttaccat     120   ttttcaaatt tcagtcttcc attttcagct tcttgttttt tttttttttt ttttttttca     180   tttcagtttt tacagcttcc agtctccctc tttccttcga tttccatctt cttgtttctg     240   tagccatctt cctatcacgt gcaagggaag aaagtggggg cccagcacct tcttttttgt     300   tctttggtgg gggctcgttt tagtttttac gtgcgtaatt gggaatcttc cgaggtagta     360   tgacatgtcc ggtggtgacc tgatactttc tgtttctccg agtaggacag aagaggaaaa     420   aaaaatagcg tgtgatgttc ttctattcta gtagtgtatt gatctattca caatcagatc     480   acaatcatat gagcagatga tgtattttgg gttgcttttc accaacccaa gtattcgatt     540   gatctttata tactgcggtt atttctaggt cttaaacggt taacacctgt tgcagggtgg     600   tatgtatttt tctcaaagtg tgctattttc acaccagcta gaaatcagct gtcttacttg     660   tatacaatta gaccagccat ttggtcttct ggaatatgta tataaacacc cggtcgattc     720   tgacaatcca tccacttttg tagtaggtct ctctatatcc atttgtacaa tgttgtttct     780   gttttgccct acatcatcat caagcaaaaa caatagtttc aattgaaaca taaacaagct     840   ttaaacacac aaactctata ctaaaaaaag ataaaaccgg tggcgcgccc ctaggggccg     900   gccacgcgtc catgggcggc cgcttaatta aggcctgttg ggccctcgag gtgaatttac     960   tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt tatgacttag tttcaattta    1020   tatactattt taatgacatt ttcgattcat tgattgaaag ctttgtgttt tttcttgatg    1080   cgctattgca ttgttcttgt ctttttcgcc acatgtaata tctgtagtag atacctgata    1140   cattgtggat gctgagtgaa attttagtta ataatggagg cgctcttaat aattttgggg    1200   atattggctt ttttttttaa agtttacaaa tgaatttttt ccgcca                   1246     ＜210＞ 69 ＜211＞ 2068 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScADHI 啟動子   ＜400＞ 69 gtgtacaata tggacttcct cttttctggc aaccaaaccc atacatcggg attcctataa      60   taccttcgtt ggtctcccta acatgtaggt ggcggagggg agatatacaa tagaacagat     120   accagacaag acataatggg ctaaacaaga ctacaccaat tacactgcct cattgatggt     180   ggtacataac gaactaatac tgtagcccta gacttgatag ccatcatcat atcgaagttt     240   cactaccctt tttccatttg ccatctattg aagtaataat aggcgcatgc aacttctttt     300   cttttttttt cttttctctc tcccccgttg ttgtctcacc atatccgcaa tgacaaaaaa     360   atgatggaag acactaaagg aaaaaattaa cgacaaagac agcaccaaca gatgtcgttg     420   ttccagagct gatgaggggt atctcgaagc acacgaaact ttttccttcc ttcattcacg     480   cacactactc tctaatgagc aacggtatac ggccttcctt ccagttactt gaatttgaaa     540   taaaaaaaag tttgctgtct tgctatcaag tataaataga cctgcaatta ttaatctttt     600   gtttcctcgt cattgttctc gttccctttc ttccttgttt ctttttctgc acaatatttc     660   aagctatacc aagcatacaa tcaagcaatt ccagatctaa aaaaaccggt ggcgcgcccc     720   taggggccgg ccacgcgtcc atgggcggcc gcttaattaa ggcctgttgg gccctcgagc     780   ccgggggggg ctcgatcccc tcgcgagttg gttcagctgc tgcctgaggc tggacgacct     840   cgcggagttc taccggcagt gcaaatccgt cggcatccag gaaaccagca gcggctatcc     900   gcgcatccat gcccccgaac tgcaggagtg gggaggcacg atggccgctt tggtcgatct     960   agattacgtg gaagaaaggt agtaaaagta gtagtataag tagtaaaaag aggtaaaaag    1020   agaaaaccgg ctacatacta gagaagcacg tacacaaaaa ctcataggca cttcatcata    1080   cgacagtttc ttgatgcatt ataatagtgt attagatatt ttcagaaata tgcatagaac    1140   ctcctcttgc ctttactttt tatacataga acattggcag atttacttac actactttgt    1200   ttctacgcca tttcttttgt tttcaacact tagacaagtt gttgagaacc ggactactaa    1260   aaagcaatgt tcccactgaa aatcatgtac ctgcagcata ataaccccct aattctgcat    1320   cgatccagta tgtttttttt tctctactca tttttacctg aagatagagc ttctaaaaca    1380   aaaaaaatca gtgattacat gcatattgtg tgttctagta accaaaggaa aggaacagat    1440   agataaaatt ccgagactgt caaattaggt ttttttcttt ttttttggcg ggagtcagtg    1500   ggccgaaata tgttcttggc ctagaactta atctggtttg atcatgccaa tacttgcctg    1560   agtgcccgac tttttgccca ccctcttgcc ttctgtcatc cttcaaaacc cacctgtttt    1620   ccagccgtat cttcgctcgc atctacacat actgtgccat atcttgtgtg tagccggacg    1680   tgactatgac caaaaacaaa caaggagaac tgttcgccga tttgtaacac tcctgcatcc    1740   atccaagtgg gtatgcgcta tgcaatgtta agctaggtca ggtcagacca ggtccaagga    1800   cagcaacttg actgtatgca acctttacca tctttgcaca gaacatactt gtagctagct    1860   agttacactt atggaccgaa aaggcacccc accatgtctg tccggcttta gagtacggcc    1920   gcagaccgct gatttgcctt gccaagcagt agtcacaatg catcgcatga gcacacgggc    1980   acgggcacgg gcacaggaac cattggcaaa aataccagat acactatacc gacgtatatc    2040   aagcccaagt ttaaaattcc taaatttc                                       2068     ＜210＞ 70 ＜211＞ 28 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ KlPLac4-3’_SalI-F   ＜400＞ 70 taggtcgacc cgcggggatc gactcata                                       28     ＜210＞ 71 ＜211＞ 92 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ KlPLac4-3’-R   ＜400＞ 71 aagcggccgc ccatggacgc gtggccggcc cctaggggcg cgccaccggt ctcgatgagt     60   atgtgtgttt attttttttt tatttttttt gc                                   92     ＜210＞ 72 ＜211＞ 93 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ KlTTLac4-F   ＜400＞ 72 gccacgcgtc catgggcggc cgcttaatta aggcctgttg ggccctcgag atttatactt     60   agataagtat gtacttacag gtatatttct atg                                  93     ＜210＞ 73 ＜211＞ 46 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ KlTTLac4_EcoRI-R   ＜400＞ 73 taggaattcc tactattaat tatttacgta ttctttgaaa tggcag                    46     ＜210＞ 74 ＜211＞ 46 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScPGapDH_SalI-F   ＜400＞ 74 taggtcgaca gtttatcatt atcaatactg ccatttcaaa gaatac                    46     ＜210＞ 75 ＜211＞ 90 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScPGapDH-R   ＜400＞ 75 aagcggccgc ccatggacgc gtggccggcc cctaggggcg cgccaccggt ttttttgttt     60   gtttatgtgt gtttattcga aactaagttc                                      90     ＜210＞ 76 ＜211＞ 104 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScTTGap-F   ＜400＞ 76 gccacgcgtc catgggcggc cgcttaatta aggcctgttg ggccctcgag gtgaatttac     60   tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt tatg                     104     ＜210＞ 77 ＜211＞ 30 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScTTGap_EcoRI-R   ＜400＞ 77 taggaattcg gactccagct tttccatttg                                     30     ＜210＞ 78 ＜211＞ 35 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScPADHI_SalI-F   ＜400＞ 78 taggtcgacg tgtacaatat ggacttcctc ttttc                                35     ＜210＞ 79 ＜211＞ 82 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScPADHI -R   ＜400＞ 79 aagcggccgc ccatggacgc gtggccggcc cctaggggcg cgccaccggt ttttttagat     60   ctggaattgc ttgattgtat gc                                              82     ＜210＞ 80 ＜211＞ 75 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScTTADHI_KlPLac4 -5'端-F   ＜400＞ 80 gccacgcgtc catgggcggc cgcttaatta aggcctgttg ggccctcgag cccggggggg     60   gctcgatccc ctcgc                                                      75     ＜210＞ 81 ＜211＞ 44 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScTTADHI_KlPLac4-5'端_EcoRI-R   ＜400＞ 81 taggaattcg aaatttagga attttaaact tgggcttgat atac                      44     ＜210＞ 82 ＜211＞ 44 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScPGK_SalI-F   ＜400＞ 82 taggtcgaca ctgtaattgc ttttagttgt gtatttttag tgtg                      44     ＜210＞ 83 ＜211＞ 100 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScPGK-R   ＜400＞ 83 aagcggccgc ccatggacgc gtggccggcc cctaggggcg cgccaccggt tttttttgtt     60   ttatatttgt tgtaaaaagt agataattac ttccttgatg                          100     ＜210＞ 84 ＜211＞ 94 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScTTPGK-F   ＜400＞ 84 gccacgcgtc catgggcggc cgcttaatta aggcctgttg ggccctcgag attgaattga     60   attgaaatcg atagatcaat ttttttcttt tctc                                 94     ＜210＞ 85 ＜211＞ 46 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScTTPGK_EcoRI-R   ＜400＞ 85 taggaattcc atataccttt gataccataa aaacaagcaa atattc                    46     ＜210＞ 86 ＜211＞ 30 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ KlPGapDH_SalI-F   ＜400＞ 86 taggtcgaca gtatggtaac gaccgtacag                                     30     ＜210＞ 87 ＜211＞ 88 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ KlPGapDH-R   ＜400＞ 87 aagcggccgc ccatggacgc gtggccggcc cctaggggcg cgccaccggt tgtgtaatat     60   tctttttttt tacttgaaac tgtgaagc                                        88     ＜210＞ 88 ＜211＞ 104 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScTTGap-F   ＜400＞ 88 gccacgcgtc catgggcggc cgcttaatta aggcctgttg ggccctcgag gtgaatttac     60   tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt tatg                     104     ＜210＞ 89 ＜211＞ 49 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScTTGap_EcoRI-R   ＜400＞ 89 taggaattct ggcggaaaaa attcatttgt aaactttaaa aaaaaaagc                 49     ＜210＞ 90 ＜211＞ 36 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ KlPGK_SalI-F   ＜400＞ 90 taggtcgacc gggtgtgttt gaagtaagaa tatttg                               36     ＜210＞ 91 ＜211＞ 98 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ KlPGK -R   ＜400＞ 91 aagcggccgc ccatggacgc gtggccggcc cctaggggcg cgccaccggt ttttttatta     60   attcttgatc gatttttttg ttatttctga agtaactc                             98     ＜210＞ 92 ＜211＞ 94 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScTTPGK -F   ＜400＞ 92 gccacgcgtc catgggcggc cgcttaatta aggcctgttg ggccctcgag attgaattga     60   attgaaatcg atagatcaat ttttttcttt tctc                                 94     ＜210＞ 93 ＜211＞ 36 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScTTPGK_EcoRI-R   ＜400＞ 93 taggaattca agctttttcg aaacgcagaa ttttcg                               36     ＜210＞ 94 ＜211＞ 30 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ KlPADHI_SalI-F   ＜400＞ 94 taggtcgacc cagcttttcc atttgccttc                                     30     ＜210＞ 95 ＜211＞ 91 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ KlPADHI -R   ＜400＞ 95 aagcggccgc ccatggacgc gtggccggcc cctaggggcg cgccaccggt tttatctttt     60   tttagtatag agtttgtgtg tttaaagctt g                                    91     ＜210＞ 96 ＜211＞ 104 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScTTGap-F   ＜400＞ 96 gccacgcgtc catgggcggc cgcttaatta aggcctgttg ggccctcgag gtgaatttac     60   tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt tatg                     104     ＜210＞ 97 ＜211＞ 28 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ ScTTGap_EcoRI-R   ＜400＞ 97 taggaattcg gaatcccgat gtatgggt                                       28     ＜210＞ 98 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 順向引子_kan 基因_AgeI   ＜400＞ 98 accggtatgg gtaaggaaaa gactca                                         26     ＜210＞ 99 ＜211＞ 26 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列   ＜220＞ ＜223＞ 反向引子_kan 基因_NcoI   ＜400＞ 99 ccatggttag aaaaactcat cgagca                                         26

Claims (57)

1. 一種用以製備蝦紅素、蝦紅素之前趨物或蝦紅素之衍生物的方法，包含： (1)將一重組多核苷酸序列轉殖至一宿主細胞；以及 (2)將該宿主細胞培養於一培養液中，其中該培養液包含一種選自由葡萄糖、半乳糖、甘油和脂肪酸所組成之群組的成分； 其中，該重組多核苷酸序列包含： 一第一基因組，其係包含一第一啟動子及一可操作式地連結至該第一啟動子的第一核酸序列，其中該第一核酸序列係用以編碼一焦磷酸香葉香葉酯合成酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase）； 一第二基因組，其係包含一第二啟動子及一可操作式地連結至該第二啟動子的第二核酸序列，其中該第二核酸序列係用以編碼一3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl–coenzyme A reductase）； 一第三基因組，其係包含一第三啟動子及一可操作式地連結至該第三啟動子的第三核酸序列，其中該第三核酸序列係用以編碼一八氫茄紅素去飽合酶（phytoene desaturase）；以及 一第四基因組，其係包含一第四啟動子及一可操作式地連結至該第四啟動子的第四核酸序列，其中該第四核酸序列係用以編碼一具有八氫茄紅素合成酶（phytoene synthase）和茄紅素環化酶（lycopene cyclase）個別功能之雙功能酵素； 其中，該重組多核苷酸序列之各基因組的3’端與位於其下游之下一組基因組的5’端係為相互同源。
2. 如請求項1所述之方法，其中該培養液包含0.5-40%甘油。
3. 如請求項1所述之方法，其中該培養液包含0.001%-5%脂肪酸。
4. 如請求項3所述之方法，其中該脂肪酸是辛酸。
5. 如請求項1所述之方法，其中該蝦紅素可以是3S、3S’-蝦紅素或3R、3R’-蝦紅素。
6. 如請求項1所述之方法，其中該蝦紅素之前趨物可以是焦磷酸香葉香葉酯（geranylgeranyl-pyrophosphate）、尼基葉黃素（phenicoxanthin）、茄紅素（lycopene）、海膽酮（echinenone）、斑螯黃質（canthaxanthin）、八氫番茄紅素（phytoene）、玉米黃質（zeaxanthin）、β-隱黃素（β-cryptoxanthin）或β-胡蘿蔔素（β-carotene）。
7. 如請求項1所述之方法，其中該蝦紅素之衍生物可以是一蝦紅素單酯體（monoester）或一蝦紅素雙酯體（diester）。
8. 如請求項1所述之方法，其中該第一、第二、第三和第四核酸序列分別包含序列編號：1、2、3和4的序列。
9. 如請求項1所述之方法，其中該重組多核苷酸序列更包含： 一第五基因組，其係包含一第五啟動子及一可操作式地連結至該第五啟動子的第五核酸序列，其中該第五核酸序列係用以編碼一β-胡蘿蔔素羥化酶（β-carotene hydroxylase）；以及 一第六基因組，其係包含一第六啟動子及一可操作式地連結至該第六啟動子的第六核酸序列，其中該第六核酸序列係用以編碼一β-胡蘿蔔素酮醇酶（β-carotene ketolase）。
10. 如請求項9所述之方法，其中該第五核酸序列包含序列編號：5、6或7的序列。
11. 如請求項9所述之方法，其中該第六核酸序列包含序列編號：8的序列。
12. 如請求項9所述之方法，其中該第一至第六啟動子係分別選自由ScGapDH啟動子、KlGapDH啟動子、ScPGK啟動子、KlPGK啟動子、KlADHI啟動子、ScADHI啟動子、KlADH4啟動子、ScADH4啟動子、KlLac4啟動子和ICL啟動子所組成的群組。
13. 如請求項12所述之方法，其中該第一至第六啟動子係為不同的啟動子。
14. 如請求項1所述之方法，其中該重組多核苷酸序列更包含： 一第七基因組，其係包含一第七啟動子及一可操作式地連結至該第七啟動子的第七核酸序列，其中該第七核酸序列係用以編碼一P450還原酶（P450 reductase）；以及 一第八基因組，其係包含一第八啟動子及一可操作式地連結至該第八啟動子的第八核酸序列，其中該第八核酸序列係用以編碼一β-胡蘿蔔素加氧酶（β-carotene oxygenase）。
15. 如請求項14所述之方法，其中該第七核酸序列包含序列編號：9的序列。
16. 如請求項14所述之方法，其中該第八核酸序列包含序列編號：10的序列。
17. 如請求項14所述之方法，其中該第一、第二、第三、第四、第七和第八啟動子係分別選自由ScGapDH啟動子、KlGapDH啟動子、ScPGK啟動子、KlPGK啟動子、KlADHI啟動子、ScADHI啟動子、KlADH4啟動子、ScADH4啟動子、KlLac4啟動子和ICL啟動子所組成的群組。
18. 如請求項17所述之方法，其中該第一、第二、第三、第四、第七及第八啟動子係為不同的啟動子。
19. 如請求項1所述之方法，其中該重組多核苷酸序列更包含一標記基因組，其係包含一標記啟動子及一可操作式地連結至該標記啟動子之標記基因。
20. 一種用以製備蝦紅素、蝦紅素之前趨物或蝦紅素之衍生物的重組多核苷酸序列，包含： 一第一基因組，其係包含一第一啟動子及一可操作式地連結至該第一啟動子的第一核酸序列，其中該第一核酸序列係用以編碼一焦磷酸香葉香葉酯合成酶； 一第二基因組，其係包含一第二啟動子及一可操作式地連結至該第二啟動子的第二核酸序列，其中該第二核酸序列係用以編碼一3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶； 一第三基因組，其係包含一第三啟動子及一可操作式地連結至該第三啟動子的第三核酸序列，其中該第三核酸序列係用以編碼一八氫茄紅素去飽合酶；以及 一第四基因組，其係包含一第四啟動子及一可操作式地連結至該第四啟動子的第四核酸序列，其中該第四核酸序列係用以編碼一具有八氫茄紅素合成酶和茄紅素環化酶個別功能之雙功能酵素； 其中該重組多核苷酸序列之各基因組的3’端與位於其下游之下一組基因組的5’端係為相互同源。
21. 如請求項20所述之重組多核苷酸序列，其中該蝦紅素可以是3S、3S’-蝦紅素或3R、3R’-蝦紅素。
22. 如請求項20所述之重組多核苷酸序列，其中該蝦紅素之前趨物可以是焦磷酸香葉香葉酯、尼基葉黃素、茄紅素、海膽酮、斑螯黃質、八氫番茄紅素、玉米黃質、β-隱黃素或β-胡蘿蔔素。
23. 如請求項20所述之重組多核苷酸序列， 其中該蝦紅素之衍生物可以是一蝦紅素單酯體或一蝦紅素雙酯體。
24. 如請求項20所述之重組多核苷酸序列，其中該第一、第二、第三和第四核酸序列分別包含序列編號：1、2、3和4的序列。
25. 如請求項20所述之重組多核苷酸序列，更包含： 一第五基因組，其係包含一第五啟動子及一可操作式地連結至該第五啟動子的第五核酸序列，其中該第五核酸序列係用以編碼一β-胡蘿蔔素羥化酶；以及 一第六基因組，其係包含一第六啟動子及一可操作式地連結至該第六啟動子的第六核酸序列，其中該第六核酸序列係用以編碼一β-胡蘿蔔素酮醇酶。
26. 如請求項25所述之重組多核苷酸序列，其中該第五核酸序列包含序列編號：5、6或7的序列，且該第六核酸序列包含序列編號：8的序列。
27. 如請求項25所述之重組多核苷酸序列，其中該第一至第六啟動子係分別選自由ScGapDH啟動子、KlGapDH啟動子、ScPGK啟動子、KlPGK啟動子、KlADHI啟動子、ScADHI啟動子、KlADH4啟動子、ScADH4啟動子、KlLac4啟動子和ICL啟動子所組成的群組。
28. 如請求項27所述之重組多核苷酸序列，其中該第一至第六啟動子係為不同的啟動子。
29. 如請求項20所述之重組多核苷酸序列，更包含： 一第七基因組，包含一第七啟動子及一可操作式地連結至該第七啟動子的第七核酸序列，其中該第七核酸序列係用以編碼一P450還原酶；以及 一第八基因組，包含一第八啟動子及一可操作式地連結至該第八啟動子之第八核酸序列，其中該第八核酸序列係用以編碼一β-胡蘿蔔素加氧酶。
30. 如請求項29所述之重組多核苷酸序列，其中該第七核酸序列包含序列編號：9的序列，且該第八核酸序列包含序列編號：10的序列。
31. 如請求項29所述之重組多核苷酸序列，其中該第一、第二、第三、第四、第七和第八啟動子係分別選自由ScGapDH啟動子、KlGapDH啟動子、ScPGK啟動子、KlPGK啟動子、KlADHI啟動子、ScADHI啟動子、KlADH4啟動子、ScADH4啟動子、KlLac4啟動子和ICL啟動子所組成的群組。
32. 如請求項31所述之重組多核苷酸序列，其中該第一、第二、第三、第四、第七和第八啟動子係為不同的啟動子。
33. 如請求項20所述之重組多核苷酸序列，更包含一標記基因組，其係包含一標記啟動子及一可操作式地連結至該標記啟動子之標記基因。
34. 一種用以改善一宿主細胞對一壓力之耐受性的方法，包含將請求項1所述之重組多核苷酸序列轉殖至該宿主細胞。
35. 如請求項34所述之方法，其中該壓力是由乙醇、異丁醇、紫外光照射、糠醛（furfural）或藥物前趨物所產生。
36. 如請求項35所述之方法，其中該藥物前趨物是10-去乙醯漿果赤黴素III（10-deacetyl baccatin III, 10 DB）。
37. 如請求項34所述之方法，其中該第一、第二、第三及第四核酸序列分別包含序列編號：1、2、3及4的序列。
38. 如請求項34所述之方法，其中該重組多核苷酸序列更包含： 一第五基因組，其係包含一第五啟動子及一可操作式地連結至該第五啟動子的第五核酸序列，其中該第五核酸序列係用以編碼一β-胡蘿蔔素羥化酶；以及 一第六基因組，其係包含一第六啟動子及一可操作式地連結至該第六啟動子的第六核酸序列，其中該第六核酸序列係用以編碼一β-胡蘿蔔素酮醇酶。
39. 如請求項38所述之方法，其中該第五核酸序列包含序列編號：5、6或7的序列，且該第六核酸序列包含序列編號：8的序列。
40. 如請求項38所述之方法，其中該第一至第六啟動子係分別選自由ScGapDH啟動子、KlGapDH啟動子、ScPGK啟動子、KlPGK啟動子、KlADHI啟動子、ScADHI啟動子、KlADH4啟動子、ScADH4啟動子、KlLac4啟動子和ICL啟動子所組成的群組。
41. 如請求項40所述之方法，其中該第一至第六啟動子係為不同的啟動子。
42. 如請求項34所述之方法，其中該重組多核苷酸序列更包含： 一第七基因組，其係包含一第七啟動子及一可操作式地連結至該第七啟動子的第七核酸序列，其中該第七核酸序列係用以編碼一P450還原酶；以及 一第八基因組，其係包含一第八啟動子及一可操作式地連結至該第八啟動子的第八核酸序列，其中該第八核酸序列係用以編碼一β-胡蘿蔔素加氧酶。
43. 如請求項42所述之方法，其中該第七核酸序列包含序列編號：9的序列，且該第八核酸序列包含序列編號：10的序列。
44. 如請求項42所述之方法，其中該第一、第二、第三、第四、第七和第八啟動子係分別選自由ScGapDH啟動子、KlGapDH啟動子、ScPGK啟動子、KlPGK啟動子、KlADHI啟動子、ScADHI啟動子、KlADH4啟動子、ScADH4啟動子、KlLac4啟動子和ICL啟動子所組成的群組。
45. 如請求項44所述之方法，其中該第一、第二、第三、第四、第七和第八啟動子係為不同的啟動子。
46. 如請求項34所述之方法，其中該重組多核苷酸序列更包含一標記基因組，其係包含一標記啟動子及一可操作式地連結至該標記啟動子之標記基因。
47. 一種用以改善一宿主細胞製備乙醇或漿果赤黴素III（baccatin III）之產量的方法，包含將請求項1所述之重組多核苷酸序列轉殖至該宿主細胞。
48. 如請求項47所述之方法，其中該第一、第二、第三和第四核酸序列分別包含序列編號：1、2、3及4的序列。
49. 如請求項47所述之方法，其中該重組多核苷酸序列更包含： 一第五基因組，其係包含一第五啟動子及一可操作式地連結至該第五啟動子的第五核酸序列，其中該第五核酸序列係用以編碼一β-胡蘿蔔素羥化酶；以及 一第六基因組，其係包含一第六啟動子及一可操作式地連結至該第六啟動子的第六核酸序列，其中該第六核酸序列係用以編碼一β-胡蘿蔔素酮醇酶。
50. 如請求項49所述之方法，其中該第五核酸序列包含序列編號：5、6或7的序列，且該第六核酸序列包含序列編號：8的序列。
51. 如請求項49所述之方法，其中該第一至第六啟動子係分別選自由ScGapDH啟動子、KlGapDH啟動子、ScPGK啟動子、KlPGK啟動子、KlADHI啟動子、ScADHI啟動子、KlADH4啟動子、ScADH4啟動子、KlLac4啟動子和ICL啟動子所組成的群組。
52. 如請求項51所述之方法，其中該第一至第六啟動子係為不同的啟動子。
53. 如請求項47所述之方法，其中該重組多核苷酸序列更包含： 一第七基因組，其係包含一第七啟動子及一可操作式地連結至該第七啟動子的第七核酸序列，其中該第七核酸序列係用以編碼一P450還原酶；以及 一第八基因組，其係包含一第八啟動子及一可操作式地連結至該第八啟動子的第八核酸序列，其中該第八核酸序列係用以編碼一β-胡蘿蔔素加氧酶。
54. 如請求項53所述之方法，其中該第七核酸序列包含序列編號：9的序列，且該第八核酸序列包含序列編號：10的序列。
55. 如請求項53所述之方法，其中該第一、第二、第三、第四、第七和第八啟動子係分別選自由ScGapDH啟動子、KlGapDH啟動子、ScPGK啟動子、KlPGK啟動子、KlADHI啟動子、ScADHI啟動子、KlADH4啟動子、ScADH4啟動子、KlLac4啟動子和ICL啟動子所組成的群組。
56. 如請求項55所述之方法，其中該第一、第二、第三、第四、第七和第八啟動子係為不同的啟動子。
57. 如請求項47所述之方法，其中該重組多核苷酸序列更包含一標記基因組，其係包含一標記啟動子及一可操作式地連結至該標記啟動子之標記基因。