JP2002541809A - カロテンヒドロキシラーゼおよびキサントフィル誘導体の製造方法 - Google Patents

カロテンヒドロキシラーゼおよびキサントフィル誘導体の製造方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、β-カロテンをゼアキサンチンに、またはカンタキサンチンをアスタキサンチンに変換する酵素活性を有するタンパク質、これらのタンパク質をコードする核酸、これらの核酸を含む核酸構築物、遺伝子改変により該核酸の遺伝子発現が生じるか、もしくは野生型と比べて高められる遺伝子改変された生物、およびキサントフィル誘導体の製造方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、β-カロテンをゼアキサンチンに、またはカンタキサンチンをアス
タキサンチンに変換する酵素活性を有するタンパク質、これらのタンパク質をコ
ードする核酸、これらの核酸を含む核酸構築物、遺伝子操作によりこの核酸の遺
伝子発現が生じるかまたは野生型と比べて高くなる遺伝子操作された生物、およ
びキサントフィル誘導体の製造方法に関する。
【０００２】 キサントフィルは、動物、植物または細菌由来の酸素含有カロテノイドである
。ルテイン、ゼアキサンチンまたはアスタキサンチンなどのキサントフィルは、
着色物質およびビタミンＡ誘導体の前駆体としてヒトおよび家畜用の食物の重要
な添加物である。さらに、キサントフィルは、免疫反応を増強するなど健康増進
作用を有し、また、その抗酸化特性により癌予防作用を有するため、これらを栄
養補給品(nutraceutical)として使用する関心が高い。従って、キサントフィル
および高キサントフィル含量食品を調製する経済的なプロセスが非常に重要とな
る。キサントフィルを調製するための特に経済的なプロセスは、キサントフィル
産生生物由来のキサントフィル生合成によるタンパク質および生合成遺伝子を利
用する生物工学的プロセスである。
【０００３】 β-カロテンがβ-クリプトキサンチンを経てゼアキサンチンへ酵素変換するの
を触媒する原核生物β-カロテンヒドロキシラーゼ、およびこれらのタンパク質
をコードする遺伝子は、細菌エルウィニア・ウレドヴォラ(Erwinia uredovora)(
Misawaら, J. of Bacteriology 1990, 6704-6712; EP 393690 B1)、エルウィニ
ア・ハービコラ(Erwinia herbicola)(WO 9113078)、アグロバクテリウム・オラ
ンティアカム(Agrobacterium aurantiacum)(Misawaら, J. of Bacteriology 199
5, 6575-6584; EP 735 137 A1)、アルカリゲン(Alcaligenes)種 PC-1(EP 735 13
7 A1)、フラボバクテリウム(Flavobacterium)種株R1534(Pasamontesら, Gene 19
97, 185, 35-41; EP 747483 A2)、およびシアノバクテリウム・シネコシスティ
ス(Cyanobacterium Synechocystis)種 PCC6803(Masamotoら, Plant Cell Physio
l. 1998, 39(5), 560-564)に由来するものが知られている。
【０００４】 また、アグロバクテリウム・オランティアカム、アルカリゲンおよびエルウィ
ニア・ウレドヴォラ由来の原核生物β-カロテンヒドロキシラーゼが、さらにカ
ンタキサンチンをアドニルビン(adonirubin)を経てアスタキサンチンに変換しう
ることも知られている(Misawaら, J. of Bacteriology 1995, 6575-6584；Frase
rら, J. Biol. Chem. 1997, 272, 6128-6135)。
【０００５】 真核生物由来の３つの植物β-カロテンヒドロキシラーゼが、β-カロテンがβ
-クリプトキサンチンを経てゼアキサンチンに酵素変換するのを触媒することが
知られている。対応するcDNAが、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)(Cunni
nghamら, J. Biol. Chem. 1996, 271, 24349-24352, WO 9736998)、およびトウ
ガラシ(Capsicum annuum)L.(Bouvierら, Biochimica et Biophysica Acta 1998,
1391, 320-328)から単離されている。
【０００６】 真核生物由来の遺伝子は、原核生物遺伝子と比べて、植物などの高等なトラン
スジェニック生物においてより良好に発現するという利点を有する。いずれにせ
よ、真核生物核酸を生物に取り込むことでキサントフィル誘導体または高キサン
トフィル含量食品を調製する経済的なプロセスのために、キサントフィル生産性
を改善および増加する必要がまだある。
【０００７】 さらに、従来技術において適切な真核生物β-カロテンヒドロキシラーゼは、
基質範囲が狭いために、ヒドロキシラーゼによって変換されずに、ヒドロキシラ
ーゼに対して阻害作用を有しうる代謝産物が形成されるという欠点があった。
【０００８】 本発明の目的は、記載した従来技術の欠点を改善し、改善された性質を有する
真核生物β-カロテンヒドロキシラーゼを提供することである。
【０００９】 本発明者らは、本目的が、β-カロテンをゼアキサンチンにまたはカンタキサ
ンチンをアスタキサンチンに変換する酵素活性を有するタンパク質であって、配
列番号２のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失により該配
列から誘導され且つ配列番号２の配列とアミノ酸レベルで少なくとも50％の相同
性を有する配列を含むタンパク質により達成されることを発見した。
【００１０】 以下、カロテンヒドロキシラーゼとは、本発明のタンパク質、すなわち、β-
カロテンをゼアキサンチンにまたはカンタキサンチンをアスタキサンチンに変換
する酵素活性を有するタンパク質であって、配列番号２のアミノ酸配列、または
アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失により該配列から誘導され且つ配列番号２の
配列とアミノ酸レベルで少なくとも50％の相同性を有する配列を含むタンパク質
を意味する。
【００１１】 配列番号２に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すcDNA配列の翻訳により誘
導される。
【００１２】 本発明のタンパク質は、β-イオノン構造エレメントを3-ヒドロキシ-β-イオ
ノン構造エレメントに変換すること(例えば、β-カロテンをゼアキサンチンに、
β-カロテンをβ-クリプトキサンチンに、β-クリプトキサンチンをゼアキサン
チンに、エチネノン(echinenone)を3’-ヒドロキシエチネノンに、3’-ヒドロキ
シエチネノンをアドニキサンチン(adonixanthin)(4-ケトゼアキサンチン)に、α
-カロテンをα-クリプトキサンチンに、もしくは40個以下のＣ原子を有し且つβ
-イオノン環を含む他の化合物を対応する3-ヒドロキシ-β-イオノン化合物に変
換すること)、または4-ケト-β-イオノン構造エレメントを3-ヒドロキシ-4-ケト
-β-イオノン構造エレメントに変換すること(例えば、カンタキサンチンをアス
タキサンチンに、カンタキサンチンをフェニコキサンチン(phoenicoxanthin)(ア
ドニルビン)に、フェニコキサンチン(アドニルビン)をアスタキサンチンに、エ
チネノンを3-ヒドロキシエチネノンに、3’-ヒドロキシエチネノンをアドニキサ
ンチン(4-ケトゼアキサンチン)に、もしくは40個以下のＣ原子を有し且つ4-ケト
-β-イオノン環を含む他の化合物を対応する3-ヒドロキシ-4-ケト-β-イオノン
化合物に変換すること)を触媒できる。
【００１３】 β-カロテン由来のキサントフィルの例として、Misawaら, J. Biotechnol. 19
98, 59, 174頁(上)に記載の生合成スキームを参照する。ルテインの生合成は、
α-カロテンから出発し、α-クリプトキサンチンを経て行われる。アミノ酸の置
換、挿入もしくは欠失により配列番号２のアミノ酸配列から誘導され且つ配列番
号２とアミノ酸レベルで少なくとも50％の相同性を有する配列を含むタンパク質
は、β-カロテンをゼアキサンチンにまたはカンタキサンチンをアスタキサンチ
ンに変換する酵素活性(好ましくは、配列番号２を含むタンパク質に匹敵する活
性)を有する。
【００１４】 置換とは、１つ以上のアミノ酸を１つ以上のアミノ酸で置き換えることを意味
する。置換は、いわゆる保存的であることが好ましく、置換後のアミノ酸が元の
アミノ酸と同様の性質を有し、例えば、GluをAspに、GlnをAsnに、ValをIleに、
LeuをIleに、SerをThrに置換することが挙げられる。
【００１５】 欠失とは、アミノ酸を直接連結に置き換えることである。欠失に好ましい位置
は、ポリペプチドの末端、および個々のタンパク質ドメインの間の連結部である
。
【００１６】 挿入とは、アミノ酸のポリペプチド鎖への導入であり、形式的には直接連結を
１つ以上のアミノ酸により置き換えることである。
【００１７】 ２つのタンパク質間の相同性は、各タンパク質の全長にわたるアミノ酸の同一
性を意味する。これは、コンピュータプログラムGAP(UWGCG, University of Wis
consin, Genetic Computer Group, NeedlemanおよびWunsch, J. Mol. Biol. 197
0, 48, 443-453のプログラムアルゴリズム)の助けを借り、以下のパラメータに
設定した比較により計算される。 ギャップ重み: 12 長さ重み: 4 平均マッチ： 2.912 平均ミスマッチ： -2.003
【００１８】 従って、アミノ酸レベルで配列番号２と少なくとも50％の相同性を有するタン
パク質は、上記パラメーターセットを有する上記プログラムアルゴリズムを用い
て配列番号２と配列を比較した場合に、少なくとも50％、好ましくは60％、特に
好ましくは70％の同一性を有するタンパク質を意味する。
【００１９】 本発明のカロテンヒドロキシラーゼは、公知の原核生物β-カロテンヒドロキ
シラーゼと、29.9％(フラボバクテリウム)、36.8％(エルウィニア・ウレドヴォ
ラ)、38.5％(エルウィニア・ハービコラ)、35.0％(アルカリゲン)および35.6％(
アグロバクテリウム・オランティアカム)の相同性を有し、シロイヌナズナ由来
の公知の真核生物β-カロテンヒドロキシラーゼと41.2％の相同性を有する。
【００２０】 好ましいタンパク質は、β-カロテンをゼアキサンチンに変換する酵素活性、
およびカンタキサンチンをアスタキサンチンに変換する酵素活性を有し、配列番
号２のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失により該配列か
ら誘導され、配列番号２の配列とアミノ酸レベルで少なくとも50％の相同性を有
するタンパク質を含む。
【００２１】 上記好ましいタンパク質は、β-イオノン構造エレメントを3-ヒドロキシ-β-
イオノン構造エレメントに変換すること(例えば、β-カロテンをゼアキサンチン
に、β-カロテンをβ-クリプトキサンチンに、β-クリプトキサンチンをゼアキ
サンチンに、エチネノンを3’-ヒドロキシエチネノンに、3’-ヒドロキシエチネ
ノンをアドニキサンチン(adonixanthin)(4-ケトゼアキサンチン)に、α-カロテ
ンをα-クリプトキサンチンに、もしくは40個以下のＣ原子を有し且つβ-イオノ
ン環を含む他の化合物を対応する3-ヒドロキシ-β-イオノン化合物に変換するこ
と)、および4-ケト-β-イオノン構造エレメントを3-ヒドロキシ-4-ケト-β-イオ
ノン構造エレメントに変換すること(例えば、カンタキサンチンをアスタキサン
チンに、カンタキサンチンをフェニコキサンチン(アドニルビン)に、フェニコキ
サンチン(アドニルビン)をアスタキサンチンに、エチネノンを3-ヒドロキシエチ
ネノンに、3’-ヒドロキシエチネノンをアドニキサンチン(4-ケトゼアキサンチ
ン)に、もしくは40個以下のＣ原子を有し且つ4-ケト-β-イオノン環を含む他の
化合物を対応する3-ヒドロキシ-4-ケト-β-イオノン化合物に変換すること)を触
媒できる。
【００２２】 特に好ましいタンパク質は、配列番号２を有する、緑藻類ヘマトコッカス・プ
ルヴィアリス(Haematococcus pluvialis)Flotow NIES-144由来の真核生物カロテ
ンヒドロキシラーゼである。この特に好ましいタンパク質は、β-イオノン構造
エレメントを3-ヒドロキシ-β-イオノン構造エレメントに変換すること(例えば
、β-カロテンをゼアキサンチンに、β-カロテンをβ-クリプトキサンチンに、
β-クリプトキサンチンをゼアキサンチンに、エチネノンを3’-ヒドロキシエチ
ネノンに、3’-ヒドロキシエチネノンをアドニキサンチン(4-ケトゼアキサンチ
ン)に、α-カロテンをα-クリプトキサンチンに、もしくは40個以下のＣ原子を
有し且つβ-イオノン環を含む他の化合物を対応する3-ヒドロキシ-β-イオノン
化合物に変換すること)、および4-ケト-β-イオノン構造エレメントを3-ヒドロ
キシ-4-ケト-β-イオノン構造エレメントに変換すること(例えば、カンタキサン
チンをアスタキサンチンに、カンタキサンチンをフェニコキサンチン(アドニル
ビン)に、フェニコキサンチン(アドニルビン)をアスタキサンチンに、エチネノ
ンを3-ヒドロキシエチネノンに、3’-ヒドロキシエチネノンをアドニキサンチン
(4-ケトゼアキサンチン)に、もしくは40個以下のＣ原子を有し且つ4-ケト-β-イ
オノン環を含む他の化合物を対応する3-ヒドロキシ-4-ケト-β-イオノン化合物
に変換すること)を触媒できる。
【００２３】 カロテンヒドロキシラーゼは、以下に記載するように、天然生物または遺伝子
操作型生物に由来する上記タンパク質をコードする適切な核酸の遺伝子発現によ
り調製できる。
【００２４】 本発明はさらに、上記本発明のタンパク質をコードし、以下においてカロテン
ヒドロキシラーゼ遺伝子と称する核酸に関する。適切な核酸配列は、遺伝コード
に従ったポリペプチド配列の逆翻訳により得られる。この目的において使用する
コドンは、生物特異的なコドン使用頻度に応じてよく使用されるものが好ましい
。コドン使用頻度は、関連生物における他の公知遺伝子をコンピュータ分析する
ことにより容易に分かる。
【００２５】 例えば植物においてタンパク質を発現する場合、植物のコドン使用頻度を逆翻
訳において利用することが有利である場合が多い。
【００２６】 好ましい核酸は、配列番号１を有する。この核酸は、緑藻類ヘマトコッカス・
プルヴィアリス Flotow NIES-144由来の真核生物cDNAであり、これは配列番号２
のカロテンヒドロキシラーゼをコードする。cDNAのリーディングフレームは5’
末端に向かってオープンであるため、配列番号１はとうていcDNAの完全な配列を
表さない。このcDNAの発現により、機能的タンパク質が得られる。5’末端を欠
くいかなる部分配列も、本質的に公知の手法で、ヘマトコッカス・プルヴィアリ
ス Flotow NIES-144由来のcDNAライブラリーの重複するcDNA断片を分析すること
により作製することができる。
【００２７】 緑藻類ヘマトコッカス・プルヴィアリスは、好ましくない環境条件下(例えば
、リン酸塩もしくは窒素不足、または高い光強度下)で、大量のアスタキサンチ
ンを生成して、光酸化ストレスから保護することが知られている(Kobayashiら,
Appl. Environ. Microbiol. 1993, 59, 867-873；Boussibaら, Methods Enzymol
1992, 213, 386-391)。このプロセスは、通常、緑藻類の栄養細胞が嚢胞細胞に
発達する形態学的変化を伴う。
【００２８】 酢酸ナトリウムおよびFeSO4の添加、ならびに光強度を上げることにより、ヘ
マトコッカス・プルヴィアリス Flotow NIES-144の懸濁培養液においてアスタキ
サンチン生合成および嚢胞細胞形成が生じた。この段階で、ヘマトコッカス・プ
ルヴィアリスからRNAを単離して、cDNAライブラリーを構築した。このcDNAライ
ブラリーから配列番号１を有するcDNAを単離した。
【００２９】 上記した全てのカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子は、本質的に公知の手法で、
ヌクレオチドビルディングブロックからの化学合成(例えば、二重らせんの個々
の重複する相補的核酸ビルディングブロックの断片縮合)により調製できる。オ
リゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、ホスホロアミダイト法による公知の手
法で行うことができる(Voet, Voet, 第二版, Wiley Press New York, 896-897頁
)。合成オリゴヌクレオチドを添加し、DNAポリメラーゼのクレノウ断片および連
結反応を用いてギャップを埋めること、ならびに全般的なクローニング法は、Sa
mbrookら(1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harb
or Laboratory Pressに記載されている。本発明はさらに、遺伝子発現を高める
ために１つ以上の調節シグナルに結合された、上記本発明のカロテンヒドロキシ
ラーゼ遺伝子の１つを含む核酸構築物に関する。これらの調節配列は、例えば、
インデューサーまたはリプレッサーが結合して、核酸の発現を調節する配列であ
る。これらの新規の調節配列に加えて、またはこれらの配列の代わりに、これら
の配列の天然調節配列が実際の構造遺伝子の前に存在したままでもよく、適切で
あれば、遺伝子改変されて天然調節性がスイッチオフされて遺伝子の発現が高め
られるようにしてもよい。
【００３０】 しかし、核酸構築物は、より単純な構造を有していてもよい。つまり、さらな
る調節シグナルが上記カロテンヒドロキシラーゼ遺伝子の前に挿入されずに、調
節性を有する天然型プロモーターが欠失されていない構造でもよい。あるいはま
た、天然型調節配列を突然変異させて、調節が生じないようにして、遺伝子発現
を高める。これらの改変型プロモーターをまた、天然型遺伝子の前に単独で配置
して、活性を高めてもよい。核酸構築物は、さらに、プロモーターに機能的に結
合し、核酸配列の発現を高めることができる、１つ以上のいわゆるエンハンサー
配列を含むのが有利でありうる。また、別の有利な配列(例えば、別の調節エレ
メントまたはターミネーター)を、DNA配列の3’末端に挿入することも可能であ
る。上記カロテンヒドロキシラーゼ遺伝子は、遺伝子構築物中に１以上のコピー
数で存在しうる。
【００３１】 本発明の核酸構築物のため、以下に記載するキサントフィル製造方法のため、
および以下に記載する遺伝子改変型生物のために有利な調節配列は、例えば、グ
ラム陰性細菌において有利に用いられるcos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、la
c、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR、またはλ-PLプ
ロモーターなどのプロモーターに存在する。
【００３２】 さらに別の有利な調節配列は、例えば、グラム陽性プロモーターであるamyお
よびSPO2、酵母もしくは菌類プロモーターであるADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、
GAPDH、TEF、rp28、ADH、または植物プロモーターであるCaMV/35S[Franckら, Ce
ll 21(1980) 285-294]、PRP1[Wardら, Plant. Mol. Biol. 22(1993)]、SSU、OCS
、leb4、usp、STLS1、B33、nos、またはユビキチンもしくはファセオリン(phase
olin)プロモーターに存在する。
【００３３】 特に有利なのは、カロテノイドまたはそれらの前駆体の生合成が生じるか、ま
たは産物が有利に蓄積される組織または植物部分において確実に特異的発現をも
たらす植物プロモーターである。
【００３４】 特に以下のプロモーターに言及する。 例えば、CaMVプロモーター、アグロバクテリウム(Agrobacterium)由来のOCSプ
ロモーター(オクトピンシンターゼ)、アグロバクテリウム由来のNOSプロモータ
ー(ノパリンシンターゼ)、ユビキチンプロモーター、液胞型ATPアーゼサブユニ
ットのプロモーター、もしくはコムギ由来のプロリン富化タンパク質のプロモー
ター(WO 9113991)など、構成性発現に基づく全植物体のためのプロモーター、 例えば、ファセオリンプロモーターおよびソラマメ(Vicia faba)由来のUSPプ
ロモーター、ソラマメ属由来のレグミン遺伝子(leb4)のプロモーター、もしくは
アブラナ属由来のBce4遺伝子プロモーター(WO 9113980)など、種子特異的プロモ
ーター、 例えば、ルビスコ(リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ)のSSUプロモー
ター(小さいサブユニット)、もしくはSTLS1プロモーター(ソラナム・チュベロサ
ム(Solanum tuberosum)、ジャガイモ由来集光性(light harvesting)システム１)
など、緑色組織に特異的なプロモーター、 例えば、ジャガイモ由来細胞質ゾル(cytosolic)FBPアーゼのFBPアーゼプロモ
ーター(WO9705900)など、葉肉特異的プロモーター、 例えば、パタチン(patatin)プロモータークラスＩ(B33)、ジャガイモ由来カテ
プシンＤインヒビターのプロモーター、デンプンシンターゼのプロモーター(GBS
S1)、もしくはスポラミン(sporamin)プロモーターなど、塊茎、貯蔵根もしくは
根に特異的なプロモーター、 例えば、トマト由来の果実特異的プロモーター(EP 409625)など、果実特異的
プロモーター、 例えば、トマト由来の果実成熟特異的プロモーター(WO 9421794)など、果実成
熟特異的プロモーター、 例えば、フィトエンシンターゼプロモーター(WO9216635)、もしくはP-rr遺伝
子のプロモーター(WO9822593)など、花特異的プロモーター、 例えば、RNAポリメラーゼプロモーター(WO9706250)など、特異的プラスチドも
しくは有色体プロモーター、または 例えば、PRP1プロモーター、ベンゼンスルホンアミド誘導性プロモーター(EP
388186)、テトラサイクリン誘導性プロモーター(Gatzら, (1992) Plant J. 2,39
7-404)、アブシジン酸誘導性プロモーター(EP335528)、またはエタノールもしく
はシクロヘキサノン誘導性プロモーター(WO9321334)など、病原体または化学的
に誘導可能なプロモーターについて言及する。
【００３５】 ダイズ(Glycine max)由来のホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラ
ーゼのプロモーター(Genbank受託番号U87999も参照)、またはEP 249676に記載さ
れるような別の節特異的プロモーターを使用することも可能かつ有利である。
【００３６】 原則として、本発明のプロセスのために、上記したような調節配列を有するあ
らゆる天然型プロモーターが使用できる。また、合成プロモーターを使用するこ
とが可能かつ有利である。
【００３７】 核酸構築物はまた、生物に導入される他の遺伝子も含みうる。これらの遺伝子
は、別々の調節の下、または上記カロテンヒドロキシラーゼ遺伝子と同じ調節領
域下に置かれうる。これらの遺伝子の例としては、合成を高めることができるカ
ロテノイド生合成の他の生合成遺伝子が挙げられる。特に、生化学的に限定され
るカロテノイド生合成の他の遺伝子(例えば、フィトエンシンターゼ、フィトエ
ンデサチュラーゼ、イソペンチル-ピロリン酸イソメラーゼまたはβ-シクラーゼ
をコードする遺伝子など)が挙げられうる。
【００３８】 イソペンチルピロリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子は、例えば、生物フ
ァフィア・ロドジーマ(Phaffia rhodozyma)およびヘマトコッカス・プルヴィア
リス(EP 769 551)、またはシロイヌナズナおよびセンジュギク(Tagetes)(キンセ
ンカ(Marigold))(WO 9736998)に由来するものが知られている。
【００３９】 フィトエンシンターゼをコードする遺伝子は、例えば、生物エルウィニア・ウ
レドヴォラ(EP 393690)、エルウィニア・ハービコラ(WO 9113078)、トマト(WO 9
109128)、メロン(WO 9602650)、フラボバクテリウム(EP 747483)、またはタバコ
(Nicotiana)(US 5705624)由来のものが知られている。
【００４０】 フィトエンデサチュラーゼをコードする遺伝子は、例えば、生物エルウィニア
・ウレドヴォラ(EP 393690)、エルウィニア・ハービコラ(WO 9113078)、タバコ(
Nicotiana)(US 5539093)またはフラボバクテリウム(EP 747483)由来のものが知
られている。
【００４１】 β-シクラーゼをコードする遺伝子は、例えば、生物エルウィニア・ウレドヴ
ォラ(EP 393690)、エルウィニア・ハービコラ(WO 9113078)、フラボバクテリウ
ム(EP 747483)、タバコおよびトマト(WO 9628014)、またはトウガラシ(WO 96367
17)由来のものが知られている。
【００４２】 本発明はさらに、以下に記載する遺伝子改変型生物を作成する方法であって、
本発明のカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子または本発明の核酸構築物が開始生物
のゲノムに導入される方法に関する。開始生物とは、本発明による遺伝子改変前
の生物を意味する。
【００４３】 本発明のカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子または本発明の核酸構築物は、原則
として、当業者に知られているあらゆる方法により以下に記載する開始生物に導
入することができ、これにより該開始生物が遺伝子改変される。
【００４４】 これらは、開始生物またはその細胞に、形質転換、トランスフェクション、い
わゆる粒子銃を用いるエレクトロポーレーション、またはマイクロインジェクシ
ョンにより有利に導入される。
【００４５】 当業者は、Sambrook,J.ら(1989), Molecular cloning: A laboratory manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press、F.M. Ausubelら(1994) Current proto
cols in molecular biology, John Wiley and Sons、D.M. Gloverら, DNA Cloni
ng Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9)、Kaiserら(1994) Methods
in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press、またはGuthrieら
, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology,
1994, Academic Pressの教本にて微生物に適した方法を見つけることができる。
【００４６】 挙げることができる有利な方法の例としては、例えばドイツ特許出願DE 19801
120.2に記載のようなura-3遺伝子(特にアシュビア(Ashbya)由来のura-3遺伝子)
を用いた同種組換えもしくは異種組換えに、および/または以下に記載するREMI
法(＝「制限酵素仲介型組込み(restriction enzyme mediated integration)」)
よるDNAの導入などがある。
【００４７】 REMI技法は、両端を同じ制限エンドヌクレアーゼで切断した線状DNA構築物と
、該DNA構築物の制限に使われた制限エンドヌクレアーゼを用いた生物の同時形
質転換に基づく。すると、制限エンドヌクレアーゼは、DNA構築物が制限酵素と
共に導入された生物のゲノムDNAを切断する。これにより、細胞自体の補修メカ
ニズムの活性化がもたらされる。これらの補修メカニズムは、エンドヌクレアー
ゼによるゲノムDNA中の鎖の破損を補修し、またその間、特定の頻度で同時形質
転換されたDNA構築物をゲノムに取り込む。通常、この間、DNAの両端の制限開裂
部位は保持される。
【００４８】 上記技術は、Bolkerら(Mol Gen Genet, 248, 1995: 547-552)により、菌類の
挿入突然変異誘発について記載されている。Von SchiestlおよびPetes(Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 88, 1991: 7585-7589)は本方法を使用して、サッカロミセ
ス(Saccharomyces)に異種組換えが生じているかどうかを調べた。本方法は、Bro
wnら(Mol. Gen. Genet. 251, 1996: 75-80)に、誘導性リポーター遺伝子の安定
した形質転換および調節された発現について記載されている。
【００４９】 REMI法を使って、本発明の核酸断片または上記の本発明のカロテンヒドロキシ
ラーゼ遺伝子を、ゲノム中の転写活性部位に配置することが可能である。
【００５０】 少なくとも１つのリポーター遺伝子と共にDNA構築物に組み込まれた核酸を、
クローニングし、それをゲノムに導入することが可能であり有利である。このリ
ポーター遺伝子は、成長、蛍光、化学発光もしくは生物発光アッセイ、または光
学的測定により簡単に検出できるものである必要がある。リポーター遺伝子の例
として挙げられるのは、抗生物質耐性遺伝子、ヒドロラーゼ遺伝子、蛍光タンパ
ク質遺伝子、生物発光遺伝子、グルコシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、
β-ガラクトシダーゼ遺伝子、gfp遺伝子、リパーゼ遺伝子、エステラーゼ遺伝子
、ペルオキシダーゼ遺伝子、β-ラクタマーゼ遺伝子、アセチルトランスフェラ
ーゼ遺伝子、ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、またはアデニルトランスフェラ
ーゼ遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子により、転写活性、つまり遺伝子の発
現の測定および定量が容易に可能となる。これは、生産率の相違が2倍までであ
るゲノム中の部位を同定することが可能であることを意味する。
【００５１】 例えば、カロテノイド生合成の他のcrt遺伝子などの複数の遺伝子を生物に導
入することが意図される場合、これらの遺伝子を全て１つのリポーター遺伝子と
共に１つのベクターに導入するか、または、個々の遺伝子をそれぞれ１つのリポ
ーター遺伝子と共に各々１つずつのベクターに導入して、様々なベクターを同時
にもしくは順番に生物に導入することもできる。REMI技法においては、それぞれ
の活性についてコードする遺伝子断片を挿入することも可能である。
【００５２】 本発明のカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子または核酸構築物を開始生物のゲノ
ムに組み込むのに原則的に適している制限酵素は、全て公知のものである。制限
切断部位として４塩基対を認識する制限酵素は、あまり好ましくない。なぜなら
、そのような酵素は、ゲノムまたは組み込まれるベクターにおいて多数の切断が
起こりすぎるからである。好ましい酵素は、６、７、８またはそれ以上の塩基対
を切断部位として認識するものである。例えば、可能性のある酵素を一部挙げる
とすると、BamHI、EcoRI、BglII、SphI、SpeI、XbaI、XhoI、NcoI、SalI、ClaI
、KpnI、HindIII、SacI、PstI、BpnI、NotI、SrfIまたはSfiIがある。使用され
る酵素が、導入されるDNAにおいて他に開裂部位を持たないことが有利であり、
このことにより、組込みの効率が向上する。通常、5〜500Ｕ、好ましくは10〜25
0U、特に好ましくは10〜100Ｕの酵素がREMI混合物において使用される。浸透性
を安定化するための物質(例えば、スクロース、トレハロースもしくはグルコー
スなどの糖類、グリセロールもしくはポリエチレングリコールなどのポリオール
)、pH５〜９、好ましくはpH６〜８、特に好ましくはpH７〜８の範囲での緩衝化
に有利な緩衝液(例えば、tris、MOPS、HEPES、MESもしくはPIPES)、および/また
は核酸を安定化させる物質(例えば、Mg、Cu、Co、Fe、MnもしくはMoの無機塩ま
たは有機塩)を含む水溶液中で、これらの酵素は有利に作用する。また、EDTA、E
DDA、DTT、β-メルカプトエタノールまたはヌクレアーゼ阻害剤などの物質が存
在することが適切である場合もある。しかし、これらの添加物なしに、REMI技法
を行うこともできる。
【００５３】 プロセスは、5〜80℃、好ましくは10〜60℃、特に好ましくは20〜40℃の温度
範囲にて行う。細胞膜を脱安定化させる他の公知の方法(例えば、エレクトロポ
レーション、充填した小胞との融合、または様々なアルカリ金属塩もしくはアル
カリ土類金属塩(例えば、リチウム、ルビジウムまたはカルシウム塩、特にリチ
ウム塩が好ましい)での脱安定化)も、本方法に適している。
【００５４】 本発明の反応には、単離または精製後の核酸を直接使用できる。
【００５５】 本発明のカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子または本発明の核酸構築物の植物へ
の導入は、原則として、当業者に公知のあらゆる方法で行うことができる。
【００５６】 外来遺伝子を植物のゲノムに導入することを形質転換という。この場合、一過
性形質転換または恒常的形質転換を目的とした形質転換、および植物組織または
植物細胞からの植物の再生について公開されている方法を利用する。
【００５７】 適切な方法は、ポリエチレングリコール誘導型DNA摂取、遺伝子銃の使用、エ
レクトロポレーション、DNA含有溶液中での乾燥胚のインキュベーション、マイ
クロインジェクションおよびアグロバクテリウムを介する遺伝子導入による、プ
ロトプラストの形質転換である。ここに挙げた方法は、例えば、B. Jenesら, 「
遺伝子トランスファーの技術（Techniques for Gene Transfer）」(Transgenic
Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, S.D.KungおよびR. Wu編, Acad
emic Press(1993) 128-143に掲載)、ならびにPotrykus Annu. Rev. Plant Physi
ol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225に記載されている。
【００５８】 発現される構築物は、例えばpBin19(Bevanら, Nucl. Acids Res. 12(1984) 87
11)など、アグロバクテリウム・ツメファシエン(Agrobacterium tumefaciens)の
形質転換に適したベクター内にクローニングされることが好ましい。
【００５９】 アグロバクテリウム・ツメファシエンによる形質転換は、例えば、Hofgenおよ
びWillmitzerによりNucl. Acids Res. (1988) 16, 9877に記載されている。
【００６０】 本発明の発現ベクターで形質転換されたアグロバクテリウムは、同様に、公知
の手法で使用されて、例えば損傷のある葉、または葉の断片をアグロバクテリウ
ムの溶液に漬け、適切な培地中で培養することにより、植物、特に、センジュギ
ク、ヒマワリ、シロイヌナズナ、タバコ、アカトウガラシ、ダイズ、トマト、ナ
ス、パプリカ、ニンジン、ジャガイモ、トウモロコシ、レタス、アブラナ種、エ
ンバク、ライムギ、コムギ、ライコムギ、アワ、コメ、アルファルファ、亜麻、
アブラナ科(例えば、ナタネ(oilseed rape)もしくはカノーラ)、テンサイ、サト
ウキビ、または木材植物(例えば、ヤマナラシもしくはイチイ)を形質転換するこ
とができる。
【００６１】 遺伝子改変植物細胞は、当業者に公知のあらゆる方法で再生できる。適切な方
法は、S.D. KungおよびR. Wu、Potrykus、またはHofgenおよびWillmitzerによる
上記文献に記載されている。
【００６２】 細胞中のカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子産物の酵素活性を向上させるため可
能なことは数多くある。
【００６３】 １つの可能性は、内因性カロテンヒドロキシラーゼ遺伝子を改変して、元の酵
素よりも高いカロテンヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードするようにす
ることである。酵素活性の増加は他にも、例えば、触媒部位を改変して基質変換
を高めるか、酵素インヒビターの影響を消去すること、つまり比活性を高めるか
活性を阻害されないことで達成できる。また、さらに有利な実施形態では、例え
ば、酵素合成を抑制する因子を排除するか、合成の増大を促進する因子または調
節エレメントの活性を高めるか、または好ましくはさらに遺伝子コピーを導入す
ることにより細胞中の酵素合成を増大させて、酵素活性を高めることもできる。
この手段は、細胞中の遺伝子産物の全活性を、比活性を変化させずに、増大させ
る。また、これらの方法を組合せて用いることも可能である。つまり、比活性を
高め、同時に総活性を高めることができる。これらの改変は、原則として、当業
者に公知のあらゆる方法により、遺伝子の核酸配列、調節エレメントまたはそれ
らのプロモーターに組込むことができる。この目的のために、配列を、例えば、
D.M. Gloverら, DNA Cloning Vol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9),
第６章, 193頁以下に記載されている部位特異的突然変異誘発などの突然変異誘
発に供してもよい。
【００６４】 Speeら(Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 3, 1993: 777-778)は、ラン
ダム突然変異誘発のためにdITPを用いたPCR法を記載している。
【００６５】 分子進化のためのin vitro組換え技法の使用がStemmer(Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, Vol. 91, 1994: 10747-10751)に記載されている。
【００６６】 Mooreら(Nature Biotechnology Vol. 14, 1996: 458-467)は、PCRおよび組換
え法の組合せを記載している。
【００６７】 改変された核酸配列は、その後、ベクターを介して、生物に戻される。
【００６８】 酵素活性を増大させるためにはまた、改変型プロモーター領域を、天然型遺伝
子の前に置いて、該遺伝子の発現を増大させ、結果的に活性を高めることも可能
である。また、例えば、mRNAの安定性を向上させることにより翻訳の増強を可能
にする配列を3’末端に導入してもよい。これは、同様に、高い酵素活性をもた
らす。
【００６９】 さらに好ましい実施形態では、本発明のカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子また
は核酸構築物は、以下に記載する生物の１つで発現させるために、例えば原核生
物または真核生物内で最適な遺伝子発現を可能にするプラスミド、ファージまた
は他のDNAなどのベクターに挿入される。このベクターは、本発明のタンパク質
の発現のためのATG開始コドンを含みうる。
【００７０】 適切なプラスミドの例として、大腸菌においてはpLG338、pACYC184、pBR322、
pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290
、pIN-III113-B1、λgt11、pBdCI、pETベクターシリーズ(NovagenおよびStratag
ene)、pMALもしくはpQEベクターシリーズ(Qiagen)、真菌類においてはpALS1、pI
L2もしくはpBB116、酵母においては２μ、pAG-1、YEp6、YEp13もしくはpEMBLYe2
3、植物においてはpLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004、pDH51、または上記プラ
スミドの誘導物が挙げられる。
【００７１】 上記プラスミドは、可能性のあるプラスミドの選択肢のわずか一部である。こ
れ以外のプラスミドが当業者に周知であり、例えば、文献Cloning Vectors(Pouw
els P.H.ら編、Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 9040
18)に記載されている。適切な植物ベクターは、特に”Methods in Plant Molecu
lar Biology and Biotechnology” (CRC Press), 6/7章, 71-119頁に記載されて
いる。
【００７２】 存在する他の遺伝子の発現のために、核酸断片が、発現を高めることが3’お
よび/または5’末端調節配列も含むと有利であり、その配列は、選択される宿主
生物および１つまたは複数の遺伝子に応じた最適な発現のために選択される。
【００７３】 これらの調節配列は、特異的な遺伝子発現およびタンパク質発現を可能にする
ことを意図する。これは、例えば、宿主生物に応じて、遺伝子の誘導後にのみ発
現および/もしくは過剰発現されるか、または、すぐに発現および/もしくは過剰
発現されることを意味しうる。
【００７４】 調節配列または因子は、さらに、導入遺伝子の発現に対して有利な効果を有し
、すなわち発現を増加させるものが好ましい。つまり、調節エレメントの増強は
、プロモーターおよび/またはエンハンサーなどの強い転写シグナルを用いるこ
とにより、転写レベルにおいて有利となりうる。しかし、例えば、mRNAの安定性
を向上させることにより翻訳を増強することも可能である。
【００７５】 ベクターのさらなる実施形態では、本発明の核酸構築物はまた、直鎖状DNAの
形態で宿主生物内に有利に導入され、異種組換えまたは相同組換えにより宿主生
物のゲノムに組み込まれうる。この直鎖状DNAは、ベクターとして、直鎖状にし
たプラスミドまたは核酸断片のみから構成されうる。
【００７６】 また、ベクターとしては、細胞中で自律複製を行う任意のプラスミドが使用で
きるが、上記したように宿主のゲノムに組み込まれる直鎖状DNA断片を使用する
ことも可能である。この組込みは、異種組換えまたは相同組換えにより行うこと
ができるが、記載のように相同組換えで行われることが好ましい(Sterinerら, G
enetics, Vol. 140, 1995: 973-987)。また、上記カロテンヒドロキシダーゼ遺
伝子は、ゲノム中の様々な部位もしくは様々なベクター上にそれぞれ単独で存在
するか、またはゲノムまたは１つのベクター上に一緒に存在することが可能であ
る。
【００７７】 本発明はさらに、遺伝子改変生物を作製するための、本発明のカロテンヒドロ
キシラーゼ遺伝子の使用に関する。
【００７８】 本発明はさらに、遺伝子改変により、開始生物が本発明のカロテンヒドロキシ
ラーゼ遺伝子を含む場合には、野生型のものと比較して本発明のカロテンヒドロ
キシラーゼ遺伝子の発現が増大しているか、開始生物が本発明のカロテンヒドロ
キシラーゼ遺伝子を含まない場合には、本発明のカロテンヒドロキシラーゼ遺伝
子の発現が生じるように相応の遺伝子改変がなされた生物に関する。
【００７９】 遺伝子改変生物とは、本発明のカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子または核酸構
築物が、好ましくは上記方法の１つにより挿入された生物を意味する。
【００８０】 遺伝子改変生物は、本発明のカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子を少なくとも１
つ、または本発明の核酸構築物を少なくとも１つ含む。開始生物に応じて、核酸
は染色体内または染色体外に存在しうる。
【００８１】 遺伝子改変生物におけるカロテノイド代謝は、野生型と比べて変化しているこ
とが好ましい。
【００８２】 適切な遺伝子改変生物は、原則として、キサントフィルの合成が可能な全ての
生物である。
【００８３】 好ましい開始生物は、キサントフィルを天然に合成できるものである。しかし
、カロテノイド生合成遺伝子の導入によりキサントフィルの合成が可能である開
始生物も適切である。開始生物とは、例えば、微生物または植物などの原核生物
または真核生物を意味する。好ましい微生物は、細菌、酵母、藻類または菌類で
ある。
【００８４】 使用できる細菌は、例えばエルウィニア(Erwinia)由来のcrt遺伝子などを含む
大腸菌(Escherichia)属の細菌などの、カロテノイド産生生物のカロテノイド生
合成遺伝子の導入によりキサントフィルの合成が可能である細菌、および、例え
ばエルウィニア属、アグロバクテリウム属、フラボバクテリウム(Flavobacteriu
m)属、アルカリゲン(Alcaligenes)属の細菌またはシネコシスティス(Synechocys
tis)属のシアノバクテリアなど、キサントフィルを内因性に合成できる細菌の両
方が使用できる。好ましい細菌は、大腸菌（Escherichia coli）、エルウィニア
・ハービコラ(Erwinia herbivola)、エルウィニア・ウレドヴォラ(Erwinia ured
ovora)、アグロバクテリウム・オランティアカム(Agrobacterium aurantiacum)
、アルカリゲン(Alcaligenes) 種PC-1、フラボバクテリウム(Flavobacterium)種
R1534株またはシアノバクテリウム・シネコシスティス(Cyanobacterium Synecho
cystis)種PCC6803である。
【００８５】 カンジダ(Candida)、サッカロミセス(Saccharomyces)、ハンセヌラ(Hansenula
)またはピッキア(Pichia)の使用が好ましい。
【００８６】 好ましい真菌類は、アスペルギルス(Aspergillus)、トリコダーマ(Trichoderm
a)、アシュビア（Ashbya）、ニューロスポラ(Neurospora)、フサリウム(Fusariu
m)、またはIndian Chem Engr. B章 Vol 37, No. 1,2 (1995), 15頁, 表６に記載
の他の菌類である。
【００８７】 好ましい緑藻類は、例えば、ヘマトコッカス(Haematococcus)属、フェダクチ
ラム・トリコーナタム(Phaedactylum tricornatum)属、ヴォルヴォックス(Volvo
x)属、またはドゥナリエラ(Dunaliella)属の藻類である。特に好ましい藻類はヘ
マトコッカス・プルヴィアリス(Haematococcus pluvialis)またはドゥナリエラ
・バーダウィル(Dunaliella bardawil)である。
【００８８】 好ましい実施形態では、開始生物として植物が使用され、従って遺伝子改変生
物としても植物が使用される。好ましい植物の例しては、センジュギク、ヒマワ
リ、シロイヌナズナ、タバコ、アカトウガラシ、ダイズ、トマト、ナス、パプリ
カ、ニンジン、ジャガイモ、トウモロコシ、レタス、アブラナ種、エンバク、ラ
イムギ、コムギ、ライコムギ、アワ、コメ、アルファルファ、亜麻、アブラナ科
(例えば、ナタネもしくはカノーラ)、サトウダイコン、サトウキビ、または木材
植物(例えば、ヤマナラシもしくはイチイ)が挙げられる。
【００８９】 シロイナズナ（Arabidopsis thaliana）、タジテス・エレクタ(Tagetes erect
a)、ナタネ、カノーラ、ジャガイモ、脂肪種子植物および典型的なカロテノイド
産生植物(例えば、ダイズ、ヒマワリ、パプリカ、ニンジン、トウガラシ、また
はトウモロコシ)が特に好ましい。
【００９０】 本発明はさらに、キサントフィル誘導体の調製方法に関し、該方法は、本発明
のタンパク質の存在下において、β-イオノン構造エレメントを3-ヒドロキシ-β
-イオノン構造エレメントに、および/または4-ケト-β-イオノン構造エレメント
を3-ヒドロキシ-4-ケト-β-イオノン構造エレメントに変換することを含む。
【００９１】 キサントフィル誘導体は、キサントフィル、好ましくは少なくとも１つのヒド
ロキシ基を含むキサントフィル、例えば、ゼアキサンチン、β-クリプトキサン
チン、3’-ヒドロキシエチネノン、3-ヒドロキシエチネノン、アドニキサンチン
(4-ケトゼアキサンチン)、アスタキサンチン、フェニコキサンチン(アドニルビ
ン)、α-クリプトキサンチン、もしくはルテイン、または分子中に40個以下のＣ
原子を有し且つ少なくとも１つの3-ヒドロキシ-β-イオノンまたは少なくとも１
つの3-ヒドロキシ-4-ケト-β-イオノン構造エレメントを含むこれらの誘導体(例
えば、3-ヒドロキシ-6-ビニル-β-イオノン、3-ヒドロキシ-4-ケト-6-ビニル-β
-イオノン、3-ヒドロキシレチノール、3-ヒドロキシ-4-ケトレチノール、3-ヒド
ロキシレチナール、3-ヒドロキシ-4-ケトレチナール、3-ヒドロキシレチノイン
酸または3-ヒドロキシ-4-ケトレチノイン酸)を意味する。
【００９２】 好ましいキサントフィル誘導体はゼアキサンチン、ルテインおよびアスタキサ
ンチンである。
【００９３】 本発明の方法では、本発明のタンパク質の存在下でβ-イオノン構造エレメン
トを3-ヒドロキシ-β-イオノン構造エレメントに変換すること(例えば、β-カロ
テンをゼアキサンチンに、β-カロテンをβ-クリプトキサンチンに、β-クリプ
トキサンチンをゼアキサンチンに、エチネノンを3’-ヒドロキシエチネノンに、
3’-ヒドロキシエチネノンをアドニキサンチン(4-ケトゼアキサンチン)に、α-
カロテンをα-クリプトキサンチンに、もしくは40個以下のＣ原子を有し且つβ-
イオノン環を含む化合物を対応する3-ヒドロキシ-β-イオノン化合物に変換する
こと)、または4-ケト-β-イオノン構造エレメントを3-ヒドロキシ-4-ケト-β-イ
オノン構造エレメントに変換すること(例えば、カンタキサンチンをアスタキサ
ンチンに、カンタキサンチンをフェニコキサンチン(アドニルビン)に、フェニコ
キサンチン(アドニルビン)をアスタキサンチンに、エチネノンを3-ヒドロキシエ
チネノンに、3’-ヒドロキシエチネノンをアドニキサンチン(4-ケトゼアキサン
チン)に、もしくは40個以下のＣ原子を有し且つ4-ケト-β-イオノン環を含む化
合物を対応する3-ヒドロキシ-4-ケト-β-イオノン化合物に変換すること)が含ま
れる。
【００９４】 本方法の好ましい実施形態では、上記の本発明の遺伝子改変生物を培養し、そ
の後該生物を回収し、そして、キサントフィル誘導体を該生物から単離する。
【００９５】 本発明の遺伝子改変生物の培養は、例えば適切な培地(例えば寒天プレート上
または懸濁培養液中)で微生物を培養する場合、または土壌もしく適切な栄養培
地中で植物を培養する場合のような、適切な野生型の培養などの本質的に公知の
手法で実施される。回収とは、微生物の場合には微生物の単離を意味し、植物の
場合には植物を、またはキサントフィル誘導体を含む特定の植物部分を適切に切
断することを意味する。キサントフィル誘導体は、例えば、生物細胞の剪断、キ
サントフィル誘導体の抽出およびその後の化学的または物理的分離方法(例えば
抽出またはクロマトグラフィー)によるキサントフィル誘導体の精製など、本質
的に公知の手法により単離される。
【００９６】 本発明はさらに、キサントフィル誘導体を調製するための、本発明のカロテン
ヒドロキシラーゼの使用、または本発明のカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子の使
用に関する。
【００９７】 以下の実施例により本発明を例証する。 実施例１ カロテンヒドロキシラーゼ遺伝子のβ-カロテンを産生する大腸菌へ
の組込み、トランスジェニック生物の培養、およびキサントフィルの単離 全般的な方法 カロテノイドの単離 カロテノイド(カロテンおよびキサントフィル)を単離するために、大腸菌細胞
を遠心分離により回収し、得られた細胞材料を24時間凍結乾燥させた。凍結乾燥
細胞を、アセトンに再懸濁し、55℃で15分間２回のアセトン抽出を行った。抽出
物を合わせて、ジエチルエーテル/石油エーテル(沸点35〜80℃)混合物(1:9、v/v
)で分離漏斗にて洗浄し、回転蒸発器にて窒素下で乾燥濃縮した。
【００９８】HPLC分析 抽出物を、Nucleosil 100-5 C18カラム(Macherey-Nagel)を用いて、溶出液流
速度1.5 ml/分で分画した。実施例１においてβ-カロテンおよびヒドロキシル化
キサントフィルを分画するために用いた溶出液は、アセトニトリル/メタノール/
2-プロパノール混合物(85:10:5、v/v/v；流動溶出)であった。
【００９９】 実施例２においてケト基を有するキサントフィルを分画するためには、溶出液
１としてアセトニトリル/メタノール/H2O混合物(50:44:6、v/v/v)を22分間、お
よび溶出液２としてメタノールを使用した。Waters 994ダイオードアレイ検出器
を用いて直接検出した。HPLC分析の比較基準は、SigmaまたはRothから購入した
β-カロテン、アスタキサンチンおよびゼアキサンチンとした。
【０１００】1. 1. β-カロテン産生大腸菌の作製 使用した生物は、JM101株の大腸菌細胞とした。プラスミドpACCAR16DcrtXは、
エルウィニア・ウレドヴォラ（Erwinia uredovora）由来の細菌カロテノイド生
合成遺伝子crtE、crtB、crtIおよびcrtYを含み、β-カロテンの生合成をもたら
す(N. Misawaら, J. Bacteriol. 172 (1990) 6704-6712；Biochem. Biophys. Re
s. Commun. 209 (1995) 867-876)。
【０１０１】 このプラスミドを調製するために、エルウィニア・ウレドヴォラ(プラスミドp
CAR16delB)由来のカロテノイド生合成遺伝子クラスターの6.0kbのAsp718(KpnI)-
EcoRI断片を、プラスミドpACY184のEcoRI部位にクローニングした(R.E. Rose, N
ucl. Acids Res. 16 (1988) 355)。プラスミドpCAR16delBは、β-カロテンヒド
ロキシラーゼORF(オープンリーディングフレーム)においてフレームシフト突然
変異を含む(Misawaら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 209 (1995) 867-876)
。従って、得られるβ-カロテンがヒドロキシル化されてゼアキサンチンになる
ことは不可能である。
【０１０２】 プラスミドpACCAR16DcrtXの大腸菌への挿入、ならびに形質転換された大腸菌
細胞の調製および単離は、Sambrookら, Molecular cloning: a laboratory manu
al, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,
1989の記載などの、本質的に公知の手法で行った。
【０１０３】1. 2. ヘマトコッカス・プルヴィアリスλcDNA発現ライブラリーの構築、およ
びカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子を含むプラスミドの単離 ヘマトコッカス・プルヴィアリスFlotow NIES-144は、国立環境研究所 (NIES)
(筑波、日本)で始めて作製された。ヘマトコッカス・プルヴィアリスの増殖期の
基礎培地(pH6.8)には、１リットル当たり1.2 gの酢酸ナトリウム、2.0 gの酵母
抽出物、0.4 gのL-アスパラギン、0.2 gのMgCl2*6H2O、0.01 gのFeSO4*7H2Oおよ
び0.02 gのCaCl2*2H2Oが含まれていた。ヘマトコッカス・プルヴィアリスは、20
℃にて、12時間の明所(20μE/m2S)と12時間の暗所との暗/明サイクルで４日間培
養した。アスタキサンチン生合成および嚢胞細胞(cyst cell)形成を誘導するた
め、４日後に、酢酸ナトリウムおよびFeSO4をそれぞれ45 mMおよび450μMの濃度
まで添加した。添加後、明所条件を、Kajiwaraら, Plant Mol. Biol. 29(1995)
343-352に記載されているる連続光(125μE/m2S)に変更した。８時間の嚢胞細胞
形成の誘導後、ヘマトコッカス・プルヴィアリスのRNAを単離して、該嚢胞細胞
からcDNAライブラリーを構築した。
【０１０４】 ポリ(A)RNAを、オリゴ(dT)-セルロース(Biolabs)を用いて精製した。cDNAの合
成およびλZAP発現ライブラリーの構築は、cDNA合成およびZAP-cDNA Gigapack I
II Goldクローニングキット(Stratagene)を用いて行った。cDNAの第１鎖は、Str
atageneの使用指示書に従って、MMLV逆転写酵素、およびXhoI制限酵素認識部位
を含むポリ(dT)プライマーを使用して合成した。第２鎖は、DNAポリメラーゼＩ
を使用して相応に合成した。DNAの平滑末端をPfu DNAポリメラーゼを用いて埋め
ることにより作製し、EcoRIアダプターをそこに連結させた。次に、得られたcDN
A断片を大きさに応じて分画し、その後Uni-ZAP XRベクターのEcoRI-XhoI認識部
位に連結させた。カロテンヒドロキシラーゼ陽性プラークを単離精製後、カロテ
ンヒドロキシラーゼcDNAを含むpBluescriptファージミドを、Stratageneの使用
指示書に従い、ExAssistヘルパーファージおよびSOLR大腸菌株を使用して、in v
ivoで切出して回収した。得られたプラスミドは、DNA配列分析によると、5’末
端(5’-AATTCGGCACGAG-3’)および3’(5’-TCGAG-3’)末端における短いアダプ
ター配列に加えて、マルチクローニング部位のEcoRIおよびXhoI制限部位に連結
した1608bpの長さのcDNA断片を含んでいる。このプラスミドを、1.1節に記載す
るようにカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子をβ-カロテン産生大腸菌細胞に挿入
するために使用した。
【０１０５】1. 3. カロテンヒドロキシラーゼ遺伝子のβ-カロテン産生大腸菌細胞への組込 み、その形質転換細胞の培養、およびキサントフィルゼアキサンチンおよびβ-
クリプトキサンチンの単離 1.1.節に記載のプラスミドpACCAR16DcrtXを含むβ-カロテン産生大腸菌細胞の
1.3.節に記載のカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子を含むプラスミドによる形質転
換は、J. Sambrookら, Molecular cloning: a laboratory manual,第２版, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載され
ているように本質的に公知の手法により行った。
【０１０６】 形質転換した大腸菌細胞を、LB培地中で28℃にて、アンピシリン(50μg/ml；
カロテンヒドロキシラーゼ遺伝子を含むプラスミドのため)およびクロラムフェ
ニコール(30μg/ml；プラスミドpACCAR16DcrtX)を添加して48時間培養した。
【０１０７】 上記全般的な方法に記載したようにカロテノイドを単離した。図１は、以下の
(A)および(B)から抽出されたカロテノイドについてのHPLCの線図を示す； (A) 1.1に記載のプラスミドpACCAR16DcrtXを含む大腸菌細胞、および (B) プラスミドpACCAR16DcrtXを、1.2に記載のカロテンヒドロキシラーゼ遺
伝子と共に含む大腸菌細胞。
【０１０８】 図１においてピークに付した数字は、 ３ ゼアキサンチン ５ β-クリプトキサンチン ６ β-カロテン を指す。
【０１０９】 図１から明らかであるように、形質転換した大腸菌細胞は、本発明のカロテン
ヒドロキシラーゼ遺伝子を組込むことにより、ヒドロキシル化キサントフィルゼ
アキサンチンおよびβ-クリプトキサンチンを産生するが、形質転換していない
と、β-カロテンしか産生されなかった。従って、本発明のカロテンヒドロキシ
ラーゼは、β-カロテンをβ-クリプトキサンチンに、β-クリプトキサンチンを
ゼアキサンチンに、またはβ-カロテンをゼアキサンチンに変換できる。
【０１１０】実施例２ カロテンヒドロキシラーゼ遺伝子およびヘマトコッカス・プルヴィア リス由来β-カロテンケトラーゼ遺伝子(bkt)のβ-カロテン産生大腸菌細胞への
組込み、該形質転換細胞の培養、ならびにキサントフィルアスタキサンチン、カ ンタキサンチン、アドニキサンチン、ゼアキサンチンおよびβ-クリプトキサン
チンの単離 2. 1. ヘマトコッカス・プルヴィアリス由来β-カロテンケトラーゼ遺伝子(bkt )を含有するプラスミドの調製 ヘマトコッカス・プルヴィアリス由来β-カロテンケトラーゼ遺伝子を含有す
るプラスミドpRKbkt1(Kajiwaraら, Plant Mol. Biol. 29 (1995) 343-352)を調
製するために、pUC19bktプラスミドのPvuII部分消化による１kbの産物を、アガ
ロースゲル電気泳動により分画した(Breitenbachら, FEMS Microbiol. Lett. 14
0 (1996) 241-246)。このDNA断片は、lacZプロモーターを、ケトラーゼのORF(オ
ープンリーディングフレーム)と共に含み、予めHindIIIで消化してクレノウ酵素
で処理しておいたプラスミドpRK404にサブクローニングした。
【０１１１】 得られたプラスミドpRKbkt1を、単独で、および1.2節に記載のカロテンヒドロ
キシラーゼ遺伝子プラスミドと共に、β-カロテン産生大腸菌細胞に挿入した。
【０１１２】2. 2. プラスミドpRKbkt1のβ-カロテン産生大腸菌細胞への取込み、形質転換
細胞の培養、およびキサントフィルであるカンタキサンチンの単離 1.1節に記載したプラスミドpACCAR16DcrtXを含むβ-カロテン産生大腸菌細胞
の、2.1節に記載したβ-カロテンケトラーゼ遺伝子(bkt)を含むプラスミドpRKbk
t1での形質転換は、J. Sambrookら, Molecular cloning: a laboratory manual,
第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 19
89の記載など、本質的に公知の手法で行った。
【０１１３】 形質転換した大腸菌細胞を、クロラムフェニコール(30μg/ml；プラスミドpAC
CAR16DcrtX)、テトラサイクリン(10μg/ml；プラスミドpRKbkt1)およびイソプロ
ピルβ-D-チオガラクトピラノシド(0.5 mM)を添加したこと以外は1.3.節の記載
と同様に、LB培地中で28℃にて48時間培養した。
【０１１４】 カロテノイドを、上記全般的な方法に記載したように単離した。
【０１１５】 図2(A)は、プラスミドpACCAR16DcrtXと、β-カロテンケトラーゼ遺伝子(bkt)
を含むプラスミドpRKbkt1とを共に含む大腸菌細胞から抽出されたカロテノイド
のHPLCの線図を示す。
【０１１６】 プラスミドpRKbkt1の組込みにより、ケト基を有するキサントフィルであるカ
ンタキサンチンを産生する形質転換大腸菌細胞が生じる。
【０１１７】2. 3. プラスミドpRKbkt1およびカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子の、β-カロ
テン産生大腸菌細胞への取込み、形質転換細胞の培養、ならびにキサントフィル 、アスタキサンチン、カンタキサンチン、アドニキサンチン、ゼアキサンチンお よびβ-クリプトキサンチンの単離 1.1.節に記載したプラスミドpACCAR16DcrtXを含むβ-カロテン産生大腸菌細胞
の、2.1.節に記載したβ-カロテンケトラーゼ遺伝子(bkt)を含むプラスミドpRKb
kt1での形質転換、1.3.節に記載したカロテンヒドロキシラーゼ遺伝子を含むプ
ラスミドによる形質転換は、J. Sambrookら, Molecular cloning: a laboratory
manual,第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, 1989の記載など、本質的に公知の手法により行った。
【０１１８】 形質転換した大腸菌細胞を、アンピシリン(50μg/ml；カロテンヒドロキシラ
ーゼ遺伝子を含むプラスミド)、クロラムフェニコール(30μg/ml；プラスミドpA
CCAR16DcrtX)、テトラサイクリン(10μg/ml；プラスミドpRKbkt1)およびイソプ
ロピルβ-D-チオ-ガラクトピラノシド(0.5 mM)を添加したこと以外は1.3.節の記
載と同様に、LB培地中で28℃にて48時間培養した。
【０１１９】 カロテノイドを、上記全般的な方法に記載したように単離した。図２は、以下
の(A)および(B)から抽出されたカロテノイドのHPLC図を示す： (A) 1.1.節に記載したプラスミドpACCAR16DcrtXを、プラスミドpRKbkt1と共に
含む大腸菌細胞、および (B) プラスミドpACCAR16DcrtXと、プラスミドpRKbkt1および1.2.節で得たカロ
テンヒドロキシラーゼ遺伝子とを共に含む大腸菌細胞。
【０１２０】 図2(C)は、比較基準としてアスタキサンチンを示す。
【０１２１】 図２において、ピークに付した数字は、 １ アスタキサンチン ２ アドニキサンチン ３ ゼアキサンチン ４ カンタキサンチン ５ β-クリプトキサンチン ６ β-カロテン を意味する。
【０１２２】 図２から分かるように、形質転換した大腸菌細胞は、本発明のカロテンヒドロ
キシラーゼ遺伝子およびβ-カロテンケトラーゼ遺伝子(bkt)を含むプラスミドpR
Kbkt1の組込みにより、ヒドロキシル化および/またはケト含有キサントフィルで
ある、アスタキサンチン、カンタキサンチン、アドニキサンチン、ゼアキサンチ
ン、およびβ-クリプトキサンチンを産生するが、本発明のカロテンヒドロキシ
ラーゼがないと、カンタキサンチンしか産生されなかった。
【０１２３】 ヘマトコッカス・プルヴィアリス由来β-カロテンケトラーゼについての酵素
学的研究では、該酵素が主にβ-カロテンをカンタキサンチンに変換するが、ヒ
ドロキシル含有キサントフィル(例えば、ゼアキサンチンおよびβ-クリプトキサ
ンチン)は殆ど変換されず、アドニキサンチンにのみ変換され、アスタキサンチ
ンには変換されないことが示された(T. Lotan, J. Hirschberg, FEBS Lett. 364
(1995) 125-128；J. Breitenbach, N. Misawa, S. Kajiwara, G. Sandmann, FE
MS Microbiol. Lett. 140 (1996) 241-246；P.D. Fraser, H. Shimada, N. Misa
wa, Eur. J. Biochem. 252 (1998) 229-236)。
【０１２４】 実施例2.3において形質転換された大腸菌細胞がアスタキサンチンを産生でき
るという事実は、本発明のカロテンヒドロキシラーゼが、カンタキサンチンをフ
ェニコキサンチン(アドニルビン)を経てアスタキサンチンに変換できることを証
明する。
【０１２５】 従って、本発明のカロテンヒドロキシラーゼは、β-イオノン構造エレメント
の3-ヒドロキシ-β-イオノン構造エレメントへの変換(例えば、β-カロテンをゼ
アキサンチンに、β-カロテンをβ-クリプトキサンチンに、β-クリプトキサン
チンをゼアキサンチンに、エチネノンを3’-ヒドロキシエチネノンに、3’-ヒド
ロキシエチネノンをアドニキサンチン(adonixanthin)(4-ケトゼアキサンチン)に
、α-カロテンをα-クリプトキサンチンに、もしくは40個以下のＣ原子を有し且
つβ-イオノン環を含む他の化合物を対応する3-ヒドロキシ-β-イオノン化合物
に変換すること)、または4-ケト-β-イオノン構造エレメントの3-ヒドロキシ-4-
ケト-β-イオノン構造エレメントへの変換(例えば、カンタキサンチンをアスタ
キサンチンに、カンタキサンチンをフェニコキサンチン(アドニルビン)に、フェ
ニコキサンチン(アドニルビン)をアスタキサンチンに、エチネノンを3-ヒドロキ
シエチネノンに、3’-ヒドロキシエチネノンをアドニキサンチン(4-ケトゼアキ
サンチン)に、もしくは40個以下のＣ原子を有し且つ4-ケト-β-イオノン環を含
む他の化合物を対応する3-ヒドロキシ-4-ケト-β-イオノン化合物に変換するこ
と)を触媒できる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１で抽出されたカロテノイドについてのHPLCのクロマトグラムを示す図
である。
【図２】 実施例２で抽出されたカロテノイドについてのHPLCのクロマトグラムを示す図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 BA08 BA80 CA01 FA01 GA11 GA17 4B050 CC03 DD02 EE10 LL05 4B064 AC13 CA19 CB12 CC24 CD04 DA01 DA10 4B065 AA25Y AA88X AA89X AB01 AC14 BA02 BB22 CA05 CA41 CA44 CA52

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 β-カロテンをゼアキサンチンに、またはカンタキサンチン
    をアスタキサンチンに変換する酵素活性を有するタンパク質であって、配列番号
    ２のアミノ酸配列、または該配列から、アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によ
    り誘導され、かつ配列番号２の配列とアミノ酸レベルで少なくとも50％の相同性
    を有する配列を含む、タンパク質。
  2. 【請求項２】 β-カロテンをゼアキサンチンに変換する酵素活性、および
    カンタキサンチンをアスタキサンチンに変換する酵素活性を有する、請求項１に
    記載のタンパク質。
  3. 【請求項３】 請求項１または２に記載のタンパク質をコードする核酸。
  4. 【請求項４】 配列番号１に示す配列からなる、請求項３に記載の核酸。
  5. 【請求項５】 １以上の調節シグナルと機能的に連結していることにより、
    遺伝子発現が高められている、請求項３または４に記載の核酸を含む核酸構築物
    。
  6. 【請求項６】 請求項３または４に記載の核酸が、原核生物または真核生物
    中での遺伝子の発現に適したベクターに挿入されている、請求項５に記載の核酸
    構築物。
  7. 【請求項７】 遺伝子操作された生物であって、開始生物が請求項３または
    ４の核酸を含む場合には、請求項３または４に記載の核酸の遺伝子発現が該遺伝
    子操作によって野生型と比べて高められており、開始生物が請求項３または４に
    記載の核酸を含まない場合には、請求項３または４に記載の核酸の遺伝子発現が
    該遺伝子操作によってもたらされている、生物。
  8. 【請求項８】 カロテノイド代謝が野生型のものと異なる、請求項７に記載
    の遺伝子操作された生物。
  9. 【請求項９】 使用する生物が真核生物である、請求項７または８に記載の
    遺伝子操作された生物。
  10. 【請求項１０】 植物が真核生物として使用される、請求項９に記載の遺伝
    子操作された生物。
  11. 【請求項１１】 請求項３または４に記載の核酸、または請求項５または６
    に記載の核酸構築物を、開始生物のゲノムに導入することを含む、請求項７〜１
    ０のいずれか１項に記載の遺伝子操作された生物の作成方法。
  12. 【請求項１２】 遺伝子操作された生物を作成するための請求項３または４
    に記載の核酸の使用。
  13. 【請求項１３】 請求項１または２に記載のタンパク質の存在下で、β-イ
    オノン構造エレメントを3-ヒドロキシ-β-イオノン構造エレメントに、および/
    または4-ケト-β-イオノン構造エレメントを3-ヒドロキシ-4-ケト-β-イオノン
    構造エレメントに変換することを含む、キサントフィル誘導体の製造方法。
  14. 【請求項１４】 請求項７〜１０のいずれか１項に記載の生物を培養し、該
    生物を回収し、その後該生物からキサントフィル誘導体を単離する、請求項１３
    に記載のキサントフィル誘導体の製造方法。
  15. 【請求項１５】 キサントフィル誘導体を製造するための請求項１または２
    に記載のタンパク質の使用。
  16. 【請求項１６】 キサントフィル誘導体を調製するための請求項３または４
    に記載の核酸の使用。
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