KR20020013847A - 카로틴 수산화효소 및 크산토필 유도체의 제조 방법 - Google Patents

카로틴 수산화효소 및 크산토필 유도체의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 β-카로틴을 제아크산틴으로 또는 칸타크산틴을 아스타크산틴으로 전환시키는 효소 활성을 가진 단백질, 이러한 단백질을 암호화하는 핵산, 이러한 핵산을 함유하는 핵산 구조물, 유전자 변형이 야생형에 비해 핵산의 유전자 발현을 일으키거나 증가시키는 유전자 변형된 유기체, 및 크산토필 유도체의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

카로틴 수산화효소 및 크산토필 유도체의 제조 방법{Carotene Hydroxylase and Method for Producing Xanthophyll Derivatives}
본 발명은 β-카로틴을 제아크산틴으로 또는 칸타크산틴을 아스타크산틴으로 전환시키는 효소 활성을 가진 단백질, 이러한 단백질을 암호화하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 핵산 구조물, 유전자 조작이 야생형에 비해 핵산의 유전자 발현을 일으키거나 증가시키는 유전자 조작된 유기체 및 크산토필 유도체의 제조 방법에 관한 것이다.
크산토필은 동물, 식물 또는 미생물 기원의 산소-함유 카로티노이드이다. 루테인, 제아크산틴 또는 아스타크산틴과 같은 크산토필은 인간 식품 및 가축 사료에서 착색 물질 및 비타민 A 유도체의 전구체로서 중요한 첨가제이다. 또한, 크산토필은 면역 반응을 증강시키는 것과 같은 건강-촉진 작용과, 이들의 항산화 성질로 인해 암-예방 작용을 가지며, 이로 인해 이것은 주요한 영양약제로서 사용된다. 따라서, 크산토필 및 증가된 크산토필 함량을 가진 식품을 제조하기 위한 경제적인 방법이 매우 중요하다. 특히, 크산토필의 경제적인 제조 방법은 크산토필-생성 유기체로부터 크산토필 생합성의 단백질 및 생합성 유전자를 이용하는 생물공학적 방법이다.
β-카로틴을 β-크립토크산틴을 거쳐 제아크산틴으로 효소적 전환시키는 것을 촉매하는 원핵 β-카로틴 수산화효소, 및 이러한 단백질을 암호화하는 유전자는 세균에르위니아 우레도보라(Erwinia uredovora) [Misawa 등, J. of Bacteriology 1990, 6704-6712; EP 393690 B1],에르위니아 헤르비콜라(Erwinia herbicola) (WO 9113078),아그로박테리움 아우란티아쿰(Agrobacterium aurantiacum) [Misawa 등, J. of Bacteriology 1995, 6575-6584; EP 735 137A1],알칼리게네스(Alcaligenes) 종 PC-1 (EP 735 137 A1),플라보박테리움(Flavobacterium) 종. 균주 R1534 [Pasamontes 등, Gene 1997, 185, 35-41; EP 747483 A2] 및시아노박테리움 시네코시스티스(Cyanobacterium Synechocystis)종. PCC6803 [Masamoto 등, Plant Cell Physiol. 1998, 39(5), 560-564]으로부터 공지되어 있다.
또한,아그로박테리움 아우란티아쿰,알카리게네스및에르위니아 우레도보라로부터의 원핵 β-카로틴 수산화효소는 추가로 칸타크산틴을 아도니루빈을 거쳐 아스타크산틴으로 전환시킬 수 있는 것이 공지되어 있다 [Misawa 등, J. of Bacteriology 1995, 6575-6584; Fraser 등, J.Biol.Chem. 1997, 272, 6128-6135].
진핵 원천으로부터, β-카로틴을 β-크립토크산틴을 거쳐 제아크산틴으로 효소적 전환시키는 것을 촉매하는 3종의 식물 β-카로틴 수산화효소가 공지되어 있다. 상응하는 cDNA들은아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) [Cunningham 등, J.Biol.Chem. 1996, 271, 24349-24352, WO 9736998] 및카프시쿰 안눔 엘.(Capsicum annuum L.) [Bouvier 등, Biochimica et Biophysica Acta 1998, 1391, 320-328]로부터 단리되었다.
진핵 기원의 유전자들은 식물과 같은 고도로 형질전환된 유기체에서 더욱 양호하게 발현된다는 점에서 원핵 유전자에 비해 장점을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 진핵 핵산을 유기체내에 혼입시킴으로써 크산토필 유도체 또는 증가된 크산토필 함량을 가진 식품을 제조하기 위한 경제적인 방법에서 크산토필 생산성을 개선 및 증가시키는 것이 여전히 요구되고 있다.
또한, 선행 기술에서의 적절한 진핵 β-카로틴 수산화효소는 단지 좁은 기질 범위를 갖고 있으며, 그 결과 수산화효소에 의해 전환될 수 없는 대사 생성물이 형성되고 수산화효소에 대한 억제 효과를 발휘할 수도 있다는 단점을 갖는다.
본 발명의 목적은 선행 기술의 상기 기재된 결점을 없애고, 개선된 특성을 가진 진핵 β-카로틴 수산화효소를 제공하는데 있다.
본 발명자들은 아미노산 서열 2 또는 이 서열로부터 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 유도되고 아미노산 수준에서 서열 2와 50 % 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는, β-카로틴을 제아크산틴으로 또는 칸타크산틴을 아스타크산틴으로 전환시키는 효소 활성을 가진 단백질에 의하여 상기 목적이 달성됨을 알아내었다.
이하에서, 카로틴 수산화효소란 아미노산 서열 2 또는 이 서열로부터 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 유도되고 서열 2와 아미노산 수준에서 50 % 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 본 발명에 따른 단백질, 다시말해서 β-카로틴을 제아크산틴으로 또는 칸타크산틴을 아스타크산틴으로 전환시키는 효소 활성을 가진 단백질을 의미한다.
서열 2에 나타낸 아미노산 서열은 서열 1에 나타낸 cDNA 서열의 번역으로부터 유도된다.
본 발명에 따른 단백질은 β-이오논 구조 요소를 3-히드록시-β-이오논 구조 요소로 전환시키는, 예컨대 β-카로틴을 제아크산틴으로, β-카로틴을 β-크립토크산틴으로, β-크립토크산틴을 제아크산틴으로, 에키네논을 3'-히드록시에키네논으로, 3-히드록시에키네논을 아도니크산틴 (4-케토제아크산틴)으로, α-카로틴을 α-크립토크산틴으로, 또는 40개 이하의 탄소 원자를 갖고 β-이오논 고리를 함유하는 다른 화합물을 상응하는 3-히드록시-β-이오논 화합물로, 또는 4-케토-β-이오논 구조 요소를 3-히드록시-4-케토-β-이오논 구조 요소로, 예를 들어 칸타크산틴을 아스타크산틴으로, 칸타크산틴을 포에니코크산틴 (아도니루빈)으로, 포에니코크산틴 (아도니루빈)을 아스타크산틴으로, 에키네논을 3-히드록시에키네논으로, 3'-히드록시에키네논을 아도니크산틴 (4-케토제아크산틴)으로, 또는 40개 이하의 탄소 원자를 갖고 4-케토-β-이오논 고리를 함유하는 다른 화합물을 상응하는 3-히드록시-4-케토-β-이오논 화합물로 전환시키는 것을 촉매할 수 있다.
β-카로틴으로부터 유래된 크산토필의 예증을 위하여, 문헌 [Misawa 등, J.Biotechnol. 1998, 59, 174 면 (상단)]에 기재된 생합성 반응식을 참조한다. 루테인의 생합성은 α-카로틴으로부터 시작하여 α-크립토크산틴을 통해 일어난다. 아미노산 서열 2로부터 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 유도된 서열을 포함하고, 서열 2와 아미노산 수준에서 50 % 이상의 상동성을 갖는 단백질은, β-카로틴을 제아크산틴으로 또는 칸타크산틴을 아스타크산틴으로 전환시키는 효소 활성, 바람직하게는 서열 2를 포함하는 단백질의 활성에 필적하는 활성을 갖고 있다.
치환이란 하나 또는 그 이상의 아미노산이 하나 또는 그 이상의 아미노산으로 대체되는 것을 의미한다. 대체는 바람직하게는 보존적(conservative)이라고 불리는 것이며, 여기에서 대체된 아미노산은 원래의 아미노산과 유사한 특성을 갖고, 예를 들면 Glu는 Asp로, Gln은 Asn으로, Val은 Ile로, Leu은 Ile로, Ser은 Thr로 대체된다.
결실은 아미노산을 직접 결합으로 대체하는 것이다. 바람직한 결실 위치는 폴리펩티드의 말단 및 각각의 단백질 도메인 사이의 연결부이다.
삽입은 폴리펩티드 사슬내로 아미노산이 도입되는 것이고, 통상 직접 결합을 하나 이상의 아미노산으로 대체한다.
2개의 단백질 간의 상동성은 각각의 단백질의 전체 길이에 걸친 아미노산의 동일성을 의미하며, 하기 매개변수로 설정된 컴퓨터 프로그램 GAP (UWGCG, 유니버시티 오브 위스콘신, 제네틱 컴퓨터 그룹, 니들맨(Needleman) 및 원쉬(Wunsch)의 프로그램 알고리듬, J.Mol.Biol. 1970, 48, 443-453)의 도움을 받아 비교에 의해 산출된다:
갭 중량: 12
길이 중량: 4
평균 정합: 2.912
평균 부정합: -2.003
따라서, 아미노산 수준에서 서열 2의 서열과 50 % 이상의 상동성을 갖는 단백질이란 상기 매개변수 설정을 가진 상기 프로그램 알고리듬을 사용하여 서열 2와그의 서열을 비교했을 때, 50 % 이상, 바람직하게는 60 %, 특히 바람직하게는 70 %의 동일성을 갖는 단백질을 의미한다.
본 발명에 따른 카로틴 수산화효소는 공지된 원핵 β-카로틴 수산화효소와 29.9 % (플라보박테리움), 36.8 % (에르위니아 우레도보라), 38.5 % (에르위니아 헤르비콜라), 35.0 % (알칼리게네스) 및 35.6 % (아그로박테리움 아우란티아쿰)의 상동성을 갖고, 아라비도프시스 탈리아나로부터의 공지된 진핵 β-카로틴 수산화효소와 41.2 %의 상동성을 갖는다.
바람직한 단백질은 β-카로틴을 제아크산틴으로 전환시키는 효소 활성 및 칸타크산틴을 아스타크산틴으로 전환시키는 효소 활성을 가지며, 아미노산 서열 2 또는 이 서열로부터 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 유도되고 서열 2와 아미노산 수준에서 50 % 이상의 상동성을 갖는 단백질을 포함한다.
이러한 바람직한 단백질은 β-이오논 구조 요소를 3-히드록시-β-이오논 구조 요소로 전환시키는, 예컨대 β-카로틴을 제아크산틴으로, β-카로틴을 β-크립토크산틴으로, β-크립토크산틴을 제아크산틴으로, 에키네논을 3'-히드록시에키네논으로, 3-히드록시에키네논을 아도니크산틴 (4-케토제아크산틴)으로, α-카로틴을 α-크립토크산틴으로, 또는 40개 이하의 탄소 원자를 갖고 β-이오논 고리를 함유하는 다른 화합물을 상응하는 3-히드록시-β-이오논 화합물로, 4-케토-β-이오논 구조 요소를 3-히드록시-4-케토-β-이오논 구조 요소로, 예를 들어 칸타크산틴을 아스타크산틴으로, 칸타크산틴을 포에니코크산틴 (아도니루빈)으로, 포에니코크산틴 (아도니루빈)을 아스타크산틴으로, 에키네논을 3-히드록시에키네논으로, 3'-히드록시에키네논을 아도니크산틴 (4-케토제아크산틴)으로, 또는 40개 이하의 탄소 원자를 갖고 4-케토-β-이오논 고리를 함유하는 다른 화합물을 상응하는 3-히드록시-4-케토-β-이오논 화합물로 전환시키는 것을 촉매할 수 있다.
특히 바람직한 단백질은 서열 2를 갖는 녹조류 해마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis) 플로토우(Flotow) NIES-144로부터의 진핵 카로틴 수산화효소이다. 이러한 특히 바람직한 단백질은 β-이오논 구조 요소를 3-히드록시-β-이오논 구조 요소로, 예컨대 β-카로틴을 제아크산틴으로, β-카로틴을 β-크립토크산틴으로, β-크립토크산틴을 제아크산틴으로, 에키네논을 3'-히드록시에키네논으로, 3-히드록시에키네논을 아도니크산틴 (4-케토제아크산틴)으로, α-카로틴을 α-크립토크산틴으로, 또는 40개 이하의 탄소 원자를 갖고 β-이오논 고리를 함유하는 다른 화합물을 상응하는 3-히드록시-β-이오논 화합물로, 4-케토-β-이오논 구조 요소를 3-히드록시-4-케토-β-이오논 구조 요소로, 예를 들어 칸타크산틴을 아스타크산틴으로, 칸타크산틴을 포에니코크산틴 (아도니루빈)으로, 포에니코크산틴 (아도니루빈)을 아스타크산틴으로, 에키네논을 3-히드록시에키네논으로, 3'-히드록시에키네논을 아도니크산틴 (4-케토제아크산틴)으로, 또는 40개 이하의 탄소 원자를 갖고 4-케토-β-이오논 고리를 함유하는 기타 화합물을 상응하는 3-히드록시-4-케토-β-이오논 화합물로 전환시키는 것을 촉매할 수 있다.
카로틴 수산화효소는 이하 기재된 바와 같이, 천연 또는 유전자 조작된 유기체로부터 이러한 단백질을 암호화하는 적절한 핵산의 유전자 발현에 의해 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 기재된 본 발명에 따른 단백질을 암호화하는 핵산 (이하, 카로틴 수산화효소 유전자라고 일컬어짐)에 관한 것이다. 적절한 핵산 서열은 유전자 코드에 따라 폴리펩티드 서열의 역-번역에 의해 수득될 수 있다. 이 목적을 위해 바람직하게 사용되는 코돈은 유기체-특이적 코돈 용법(codon usage)에 따라 종종 사용되는 것이다. 코돈 용법은 관련된 유기체에서 공지된 다른 유전자의 컴퓨터 분석에 의해 쉽게 발견될 수 있다. 예를 들면, 단백질이 식물에서 발현된다면, 역-번역에서 식물의 코돈 관례를 사용하는 것이 종종 유리하다.
바람직한 핵산은 서열 1을 갖는다. 이러한 핵산은 서열 2의 카로틴 수산화효소를 암호화하는 녹조류해마토코쿠스 플루비알리스플로토우 NIES-144로부터의 진핵 cDNA이다. cDNA의 판독 프레임이 5' 말단쪽으로 개방되기 때문에, 서열 1은 가능하면 cDNA의 완전 서열을 나타내지 않는다. 이러한 cDNA의 발현에 의해 기능성 단백질이 얻어진다.해마토코쿠스 플루비알리스플로토우 NIES-144로부터 cDNA 라이브러리의 중복 cDNA 단편을 분석함으로써, 그 자체로 공지된 방법으로 5'말단이 결여된 어떠한 부분 서열이라도 만들 수 있다.
녹조류해마토코쿠스 플루비알리스는 인산염 또는 질소 결핍과 같은 좋지 못한 환경 조건하에서 또는 빛 강도가 높은 곳에서, 광산화 스트레스로부터 보호하기 위하여 다량의 아스타크산틴을 생성하는 것으로 공지되어 있다 [Kobayashi 등, Appl. Environ. Microbiol. 1993, 59, 867-873; Boussiba 등, Methods Enzymol 1992, 213, 386-391]. 이러한 방법은 녹조류의 영양 세포가 낭자 세포로 발전하는 형태학적 변화를 통상 수반한다.
아세트산나트륨 및 FeSO4의 첨가와 빛 강도에서의 증가는해마토코쿠스 플루비알리스플로토우 NIES-144의 현탁 배양액중에서 아스타크산틴 생합성 및 낭자 세포 형성을 유발하였다. 이 단계에서 cDNA 라이브러리를 구축하기 위하여해마토코쿠스 플루비알리스로부터 RNA를 단리하였다. 서열 1을 갖는 cDNA를 이 cDNA 라이브러리로부터 단리하였다.
모든 상기 언급된 카로틴 수산화효소 유전자는 뉴클레오티드 형성 블록으로부터 화학 합성에 의해, 예를 들어 이중 나선의 각각의 중복되는 상보성 핵산 형성 블록의 단편 축합에 의해 자체 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 화학 합성은, 예를 들어, 포스포르아미디트 방법에 의해 공지된 방법으로 가능하다 [Voet, Voet, 제 2 판, Wiley Press New York, 896-897면]. 합성 올리고뉴클레오티드의 첨가 및 DNA 폴리머라제의 클레노우 단편을 사용한 공간의 충진 및 결찰 반응과 일반적인 클로닝 방법은 문헌 [Sambrook 등, (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재되어 있다. 본 발명은 또한, 유전자 발현을 증가시키기 위해 하나 이상의 조절 시그날에 연결되어 있는, 본 발명에 따른 상기 기재된 카로틴 수산화효소 유전자의 하나를 포함하는 핵산 구조물에 관한 것이다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 유도인자 또는 억제인자가 결합되고 따라서 핵산의 발현을 조절하는 서열이다. 이러한 새로운 조절 서열에 추가로, 또는 이러한 서열 대신에 이러한 서열의 자연적인 조절이 실제 구조 유전자의 앞에 존재하는 것이 가능하고, 적절하다면 자연적 조절이중단되고 유전자의 발현이 증가되도록 유전적으로 변형되어진다.
그러나, 핵산 구조물은 더욱 간단한 구조를 가질 수도 있고, 다시말해서 어떠한 추가의 조절 시그날도 상기 언급된 카로틴 수산화효소 유전자의 앞에 삽입되지 않으며, 조절 작용을 가진 천연 프로모터가 결실되지 않는다. 그 대신, 조절이 더 이상이 일어나지 않고 유전자 발현이 증가되도록 자연 조절 서열이 변형된다. 이러한 변형된 프로모터들은 활성을 증가시키기 위해 자연 유전자의 앞에 단독으로 위치할 수도 있다. 유리하게는, 핵산 구조물이 프로모터에 기능적으로 연결된 하나 이상의 이른바 인핸서 서열을 추가로 함유할 수도 있으며, 이는 핵산 서열의 발현을 증가시킬 수 있다. 또한, DNA 서열의 3' 말단에 추가의 유리한 서열, 예컨대 추가의 조절 요소 또는 터미네이터를 삽입할 수도 있다. 상기 언급된 카로틴 수산화효소 유전자는 유전자 구조물에 하나 이상의 복제물로 존재할 수도 있다.
본 발명에 따른 핵산 구조물, 크산토필을 제조하기 위해 이하 기재된 방법 및 이하 기재된 유전자 변형된 유기체를 위한 유리한 조절 서열은 예를 들어 cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR와 같은 프로모터에 또는 λ-PL프로모터에 존재하며, 이들은 그람-음성 세균에서 유리하게 사용된다.
더욱 유리한 조절 서열이 예를 들면 그람-양성 프로모터 amy 및 SPO2에, 효모 또는 진균 프로모터 ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH에, 또는 식물 프로모터 CaMV/35S [Franck 등, Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward 등,Plant.Mol.Biol. 22(1993)], SSU, OCS, leb4, usp, STLS1, B33, nos에, 또는 유비퀴틴 또는 파세올린 프로모터에 존재한다.
카로티노이드 또는 그의 전구체의 생합성이 일어나거나 생성물이 유리하게 축적되는 조직 또는 식물 부분에서 특이적인 발현을 보장하는 식물 프로모터가 특히 유리하다.
구성 발현을 기초로 한 전체 식물에 대한 프로모터로는, 예를 들어 CaMV 프로모터, 아그로박테리움으로부터의 OCS 프로모터 (옥토핀 합성효소), 아그로박테리움으로부터의 NOS 프로모터(노팔린 합성효소), 유비퀴틴 프로모터, 액포 ATP아제 소단위의 프로모터 또는 밀로부터의 프롤린-다량 단백질의 프로모터 (WO 9113991),
종자-특이적 프로모터로는, 예를 들어 파세올린 프로모터 및 누에콩(Vicia faba)으로부터의 USP 프로모터, 비시아로부터의 레구민 유전자의 프로모터 (leb4) 또는 브래지카(Brassica)로부터의 Bce4 유전자 프로모터 (WO 9113980),
녹색 조직에 대한 특이적 프로모터로는, 예를 들어 루비스코 (리불로스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제)의 SSU 프로모터 (작은 소단위) 또는 STLS1 프로모터 (감자 (Solanum tuberosum), 감자로부터의 광 수확 체계 1),
엽육-특이적 프로모터로는, 예를 들어 감자로부터의 사이토졸 FBP아제의 FBP아제 프로모터 (WO 9705900),
덩이줄기, 저장 뿌리 또는 뿌리에 대한 특이적 프로모터로는, 예를 들어 파타틴 프로모터 부류 I (B33), 감자로부터의 카텝신 D 억제제의 프로모터, 전분 합성효소 (GBSS1)의 프로모터 또는 스포라민 프로모터,
과일-특이적 프로모터로는, 예를 들어 토마토로부터의 과일-특이적 프로모터 (EP 409625),
과일 숙성-특이적 프로모터로는, 예를 들어 토마토로부터의 과일 숙성-특이적 프로모터 (WO 9421794),
꽃-특이적 프로모터로는, 예를 들어 피토엔 합성효소 프로모터 (WO 9216635) 또는 P-rr 유전자의 프로모터 (WO 9822593),
특이적 플라스티드 또는 크로모플라스트 프로모터로는, 예를 들어 RNA 폴리머라제 프로모터 (WO 9706250), 또는
병원체- 또는 화학적으로 유도가능한 프로모터로는, 예를 들어 PRP1 프로모터, 벤젠술폰아미드-유도가능한 프로모터 (EP 388186), 테트라사이클린-유도가능한 프로모터 (Gatz 등, (1992) Plant J. 2,397-404), 아브시신산-유도가능한 프로모터 (EP 335528) 또는 에탄올- 또는 시클로헥사논-유도가능한 (WO 9321334) 프로모터를 특히 언급할 수 있다.
또한, 글리신 맥스(Glycine max)로부터의 포스포리보실-피로포스페이트 아미도트랜스퍼라제의 프로모터 (Genbank 수탁 번호 U87999 참조) 또는 EP 249676에서와 같은 기타 결절-특이적 프로모터를 사용하는 것이 가능하고 유리하다.
원칙적으로, 본 발명에 따른 방법을 위해서는 상기 언급된 것과 같은 조절 서열을 가진 모든 천연 프로모터를 사용하는 것이 가능하다. 추가로, 합성 프로모터를 사용하는 것도 가능하고 유리하다.
핵산 구조물은 유기체에 도입되어지는 다른 유전자를 또한 함유할 수도 있다. 이러한 유전자는 별개의 조절하에 있거나 또는 상기 기재된 카로틴 수산화효소 유전자와 동일한 조절 영역하에 있을 수 있다. 이러한 유전자의 예는 증가된 합성을 가능하게 하는 카로티노이드 생합성의 기타 생합성 유전자이다. 생화학적으로 제한하는 기타 카로티노이드 생합성 유전자, 예를 들어 피토엔 합성효소, 피토엔 불포화효소, 이소펜틸-피로포스페이트 이성화효소 또는 β-시클라제를 암호화하는 유전자를 특히 언급할 수도 있다.
이소펜틸-피로포스페이트 이성화효소를 암호화하는 유전자는 예를 들어 유기체 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma) 및 해마토코쿠스 플루비알리스 (EP 769 551) 또는 아라비도프시스 탈리아나 및 타게테스(Tagetes) (금잔화) (WO 9736998)로부터 공지되어 있다.
피토엔 합성효소를 암호화하는 유전자는 예를 들어 유기체 에르위니아 우레도보라 (EP 393690), 에르위니아 헤르비콜라 (WO 9113078), 토마토 (WO 9109128), 멜론 (WO 9602650), 플라보박테리움 (EP 747483) 또는 니코티아나(Nicotiana) (US 5705624)로부터 공지된다.
피토엔 불포화효소를 암호화하는 유전자는 예를 들어 유기체 에르위니아 우레도보라 (EP 393690), 에르위니아 헤르비콜라 (WO 9113078), 니코티아나 (US 5539093) 또는 플라보박테리움 (EP 747483)으로부터 공지된다.
β-시클라제를 암호화하는 유전자는 예를 들어 유기체 에르위니아 우레도보라 (EP 393690), 에르위니아 헤르비콜라 (WO 9113078), 플라보박테리움 (EP 747483), 담배 및 토마토 (WO 9628014) 또는 카프시쿰 안눔 (WO 9636717)로부터 공지된다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 카로틴 수산화효소 유전자 또는 본 발명에 따른 핵산 구조물이 시원(始原) 유기체의 게놈내에 도입된, 하기 기재된 유전자 변형된 유기체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 시원 유기체란, 본 발명에 따라 유전자 변형이 일어나기 전의 유기체를 의미한다.
본 발명에 따른 카로틴 수산화효소 유전자 또는 본 발명에 따른 핵산 구조물은, 원칙적으로 당업자에게 공지된 모든 방법에 의하여, 하기 기재된 초기 유기체내에 도입될 수 있으며, 이 초기 유기체는 본 발명에 의해 유전자 변형된다.
이들은, 형질전환, 형질이입, 이른바 입자 건 (particle gun)을 사용하는 전기영동에 의해 또는 미소주입에 의해 시원 유기체 또는 그의 세포내에 유리하게 도입된다.
당업자라면 문헌 [Sambrook,J. 등, (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press], 문헌 [F.M.Ausubel 등, (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons], 문헌 [D.M.Glover 등, DNA Cloning vol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9)], 문헌 [Kaiser 등, (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press], 또는 문헌 [Guthrie 등, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press]에서 미생물을 위한 적절한 방법을 찾아낼 것이다.
언급될 수 있는 유리한 방법의 예는, 독일 출원 DE 19801120.2에 기재된 바와 같이 ura-3 유전자, 구체적으로 아쉬비야(Ashbya)로부터의 ura-3 유전자를 사용하는 동종 또는 이종 재조합에 의하고(거나) 하기 기재되는 REMI 방법 (= "제한 효소 매개 통합")에 의한 DNA의 도입이다.
REMI 기술은, DNA 구조물의 제한을 위해 사용되었던 제한 엔도뉴클레아제와 함께, 동일한 제한 엔도뉴클레아제로 양쪽 말단에서 절단된 선형 DNA 구조물을 유기체내에 동시형질전환하는 것을 기본으로 한다. 제한 엔도뉴클레아제는, 제한 효소와 함께 DNA 구조물이 도입된 유기체의 게놈 DNA를 절단한다. 이는 세포 고유의 회복 메카니즘을 활성화시킨다. 이러한 회복 메카니즘은 엔도뉴클레아제에 의해 유발된 게놈 DNA에서의 스트랜드 파괴를 회복시키고, 이 동안에 동시형질전환된 DNA 구조물을 게놈내에 특정한 빈도로 혼입시킨다. 통상, 제한 절단 부위는 이 동안에 DNA의 양쪽 말단에 유지된다.
이러한 기술은 진균의 삽입 돌연변이 유발을 위해 Bolker 등 [Mol Gen Genet, 248, 1995:547-552]에 의해 기술되었다. 이 방법은 사카로마이세스 (Saccharomyces)에서 이종 재조합이 존재하는지의 여부를 찾아내기 위해 본 쉬에스틀과 페테스(Von Schiestl and Petes) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1991: 7585-7589]에 의해 사용되었다. 이 방법은 유도가능한 리포터 유전자의 안정한 형질전환 및 조절된 발현을 위하여 브라운(Brown)등 [Mol. Gen. Genet. 251, 1996:75-80]에 의해 기술되었다.
본 발명에 따른 핵산 단편 또는 본 발명에 따른 상기 언급된 카로틴 수산화효소 유전자를 게놈내의 전사 활성 부위에 위치시키기 위해 REMI 방법을 사용하는것이 가능하다.
핵산을 하나 이상의 리포터 유전자와 함께 게놈내에 도입된 DNA 구조물내에 클론화하는 것이 가능하고 유리하다. 이러한 리포터 유전자는 성장, 형광, 화학- 또는 생체 발광 분석에 의해 또는 광도 측정에 의해 검출가능성을 용이하게 만들어야 한다. 리포터 유전자로 언급될 수 있는 예는 항생물질 내성 유전자, 가수분해효소, 형광 단백질 유전자, 생체발광 유전자, 글루코시다제 유전자, 발광효소 유전자, β-갈락토시다제 유전자, gfp 유전자, 리파제 유전자, 에스테라제 유전자, 퍼옥시다제 유전자, β-락타마제 유전자, 아세틸-, 포스포- 또는 아데닐트랜스퍼라제 유전자이다. 이러한 유전자들은 전사 활성 및 그에 따른 유전자의 발현을 용이하게 측정하고 정량할 수 있도록 한다. 이것은, 2 이하의 인자로 상이한 생산성을 가진 게놈내의 부위를 확인할 수 있음을 의미한다.
다수의 유전자, 예를 들어 추가의 카로티노이드 생합성 crt 유전자를 유기체내에 도입하고자 한다면, 이들은 모두 단일 벡터내에서 리포터 유전자와 함께 도입될 수 있거나, 또는 리포터 유전자를 가진 각각의 개별적인 유전자를 각각의 경우에 하나의 벡터에서 유기체내에 도입할 수 있고, 여러 벡터들을 동시에 또는 연속적으로 도입할 수도 있다. 또한, REMI 기술에서 각각의 활성을 암호화하는 유전자 단편을 삽입하는 것도 가능하다.
원칙적으로, 본 발명에 따른 카로틴 수산화효소 유전자 또는 핵산 구조물을 시원 유기체의 게놈내에 통합하기 위해 적절한 제한 효소는 모두 공지된 것이다. 제한 절단 부위로서 단지 4개의 염기쌍을 인식하는 제한 효소들은, 게놈내에서 또는 벡터내에서 너무 자주 절단되어 통합될 수 없기 때문에 덜 바람직한 반면, 바람직한 효소는 절단 부위로서 6, 7, 8 또는 그 이상의 염기쌍, 예컨대 BamHI, EcoRI, BglII, SphI, SpeI, XbaI, XhoI, NcoI, SalI, ClaI, KpnI, HindIII, SacI, PstI, BpnI, NotI, SrfI 또는 SfiI을 인식하며, 단지 몇 개의 가능한 효소들이 언급된다. 사용되는 효소들은 도입되는 DNA에서 더 이상 절단 부위를 갖지 않는 것이 유리하며; 이는 통합 효율을 증가시킨다. 통상, 5 내지 500 U, 바람직하게는 10 내지 250 U, 특히 바람직하게는 10 내지 100 U의 효소가 REMI 혼합물에서 사용된다. 효소는 삼투 안정화를 위한 물질, 예를 들어 슈크로스, 트레할로스 또는 글루코스와 같은 당류, 글리세롤 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올, pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 특히 바람직하게는 pH 7 내지 8 범위에서 유리한 완충작용하는 완충액, 예컨대 트리스, MOPS, HEPES, MES 또는 PIPES, 및(또는) 핵산을 안정화시키는 물질, 예컨대 Mg, Cu, Co, Fe, Mn 또는 Mo의 무기 또는 유기 염을 함유하는 수용액으로 유리하게 사용된다. 또한, 적절한 경우, EDTA, EDDA, DTT, β-메르캅토에탄올 또는 뉴클레아제 억제제와 같은 물질이 존재할 수 있다. 그러나, 이러한 첨가없이도 REMI 기술을 수행하는 것도 또한 가능하다.
방법은 5 내지 80 ℃, 바람직하게는 10 내지 60 ℃, 특히 바람직하게는 20 내지 40 ℃의 범위의 온도에서 수행된다. 세포 막을 탈안정화시키기 위한 다른 공지된 방법, 예를 들어 전기영동, 부하된 부형제와의 융합 또는 각종 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속, 예컨대 리튬, 루비듐 또는 칼슘 염 (리튬 염이 바람직하다)에 의한 탈안정화가 이 방법을 위해 적절하다.
단리 또는 정제 후에 직접 본 발명에 따른 반응을 위해 핵산을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 카로틴 수산화효소 유전자 또는 본 발명에 따른 핵산 구조물을 식물내에 도입하는 것은, 원칙적으로, 당업자에게 공지된 모든 방법에 의해 일어날 수 있다.
식물의 게놈내로 외래 유전자를 전달하는 것을 형질전환이라 한다. 이 경우에, 일시적 또는 안정한 형질전환을 위하여 식물 조직 또는 식물 세포로부터 식물의 형질전환 및 재생을 위해 기재된 방법이 사용된다.
적절한 방법은 폴리에틸렌 글리콜-유도된 DNA 섭취, 유전자 건 (gene gun)의 사용, 전기영동, DNA-함유 용액중에서 건조 배아의 배양, 미소주입 및 아그로박테리움-매개 유전자 전달에 의한 원형질체 형질전환이다. 언급된 방법은 예를 들어 문헌 [B.Jenes 등, Techniques for Gene Transfer, in:Transgenic Plants, Vol.1, Engineering and Utilization, S.D.Kung 및 R.Wu 저, Academic Press (1993) 128-143] 및 문헌 [Potrykus Annu.Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225]에 기재되어 있다.
발현되는 구조물은아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환하기 위해 적절한 벡터, 예를 들어 pBin19내에 클로닝되는 것이 바람직하다 (Bevan 등, Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711).
아그로박테리움 투메파시엔스로의 형질전환은 예를 들어 문헌 [Hofgen and Willmitzer, Nucl.Acids Res. (1988) 16, 9877]에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 발현 벡터로 형질전환된 아그로박테리아는, 공지된 방식으로, 예를 들면 상처난 잎 또는 잎 조각을 아그로박테리아의 용액에 침지시킨 다음 적절한 배지에서 배양함으로써, 식물, 특히 타게테스(tagetes), 해바라기, 아라비토프시스, 담배, 홍 후추, 대두, 토마토, 가지, 파프리카, 당근, 감자, 옥수수, 상치 및 유채 종, 귀리, 호밀, 밀, 트리티케일(triticale), 기장, 쌀, 알팔파, 아마, 브라시카시애(brassicaceae), 예를 들어 평지씨 기름 또는 카놀라, 슈가 비트, 슈가 캐인 또는 목재 식물, 예를 들어 아스펜 또는 주목을 형질전환하기 위해 사용될 수 있다.
유전자 변형된 식물 세포는 당업자에게 공지된 모든 방법에 의해 재생될 수 있다. 적절한 방법은 S.D.Kung 및 R.Wu,Potrykus 또는 Hofgen 및 Willmitzer에 의해 상기 언급된 문헌에서 찾아볼 수 있다.
세포에서 카로틴 수산화효소 유전자 생성물의 효소 활성을 증가시키기 위한 다수의 가능성이 존재한다.
한가지 가능성은, 내인성 카로틴 수산화효소 유전자를, 이들이 초기 효소보다 더욱 높은 카로틴 수산화효소 활성을 가진 효소를 암호화하도록 변형시키는 것이다. 예를 들면, 기질 전환율을 증가시키기 위해 촉매 부위를 변형시킴으로써 또는 효소 억제제의 효과를 중단시킴으로써 효소 활성에서의 또 다른 증가가 달성될 수 있으며, 다시말해서 이들은 증가된 특이 활성을 갖거나 이들의 활성이 억제되지 않는다. 또 다른 유리한 실시양태에서, 세포에서의 효소 합성을 증가시킴으로써, 예를 들면 효소 합성을 억제하는 인자를 제거하거나 또는 합성 증가를 촉진하는 인자 또는 조절 요소의 활성을 증가시킴으로써, 또는 바람직하게는 추가의 유전자 카피를 도입함으로써, 효소 활성이 증가될 수 있다. 이러한 수단은 특이적 활성을 변경시키지 않고도 세포에서의 유전자 생성물의 전체 활성을 증가시킨다. 이러한 방법의 조합, 다시말해서 특이적 활성을 증가시키는 것에 합하여 전체 활성을 증가시키는 것을 사용할 수 있다. 원칙적으로, 이러한 변형은 당업자에게 공지된 모든 방법에 의해 유전자의 핵산 서열, 조절 요소 또는 그의 프로모터 내로 도입될 수 있다. 이 목적을 위하여, 문헌 [D.M.Glover 등, DNA Cloning Vol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), 제 6 장, 193 면 이하]에 기재된 것과 같이, 서열을 부위 특이적 돌연변이와 같은 돌연변이 유발시킬 수 있다.
문헌 [Spee 등, Nucleic Acids Research, Vol.21, No.3, 1993: 777-778]은 랜덤 돌연변이유발을 위해 dITP을 사용하는 PCR 방법을 기재하고 있다.
분자 진화를 위해 시험관내 재조합 기술을 사용하는 것은 문헌 [Stemmer, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, vol.91, 1994:10747-10751]에 기재되어 있다.
무어(Moore)등 [Nature Biptechnology Vol.14, 1996:458-467]은 PCR 및 재조합 방법의 조합을 기재하고 있다.
변형된 핵산 서열은 뒤이어서 벡터를 통해 유기체로 복귀된다.
효소 활성을 증가시키기 위하여, 유전자의 발현이 증가되고 따라서 결과적으로 활성이 높아지도록, 천연 유전자의 앞에 변형된 프로모터 영역을 위치시킬 수도 있다. 또한, 예를 들어 mRNA의 안정성을 증가시키고 따라서 번역을 가능한 한 증가시키기 위하여, 서열을 3' 말단에 도입할 수 있다. 유사하게, 이것은 효소 활성을 더욱 높인다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 하기 기재된 유기체중 하나에서의 발현을 위하여, 본 발명에 따른 카로틴 수산화효소 유전자 또는 핵산 구조물을, 원핵 또는 진핵 유기체에서 유전자의 적정한 발현을 가능하게 하는 벡터, 예를 들어 플라스미드, 파아지 또는 다른 DNA내에 삽입한다. 이러한 벡터는 본 발명에 따른 단백질의 발현을 위해 ATG 개시 코돈을 함유할 수도 있다.
이.콜리에서 적절한 플라스미드의 예는 pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgt11, pBdCI, pET 벡터 계열 (노바겐 및 스트라타겐 (Novagen and Stratagene)), pMAL 또는 pQE 벡터 계열 (퀴아겐 (Qiagen)), 진균에서의 pALS1, pIL2 또는 pBB116, 효모에서의 2μ, pAG-1, YEp6, YEp13 또는 pEMBLYe23, 또는 식물에서의 pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004, pDH51, 또는 상기 언급된 플라스미드의 유도체이다.
상기 플라스미드는 가능한 플라스미드의 작은 선택을 나타낸다. 추가의 플라스미드가 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들면 문헌 [클로닝 벡터(Cloning Vectors), Pouwels P.H.등, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018]에서 찾아볼 수 있다. 적절한 식물 벡터는 특히 ["Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology", (CRC 프레스), 6/7 장, 71-119면]에 기재되어 있다.
핵산 단편이 발현을 증가시키기 위해 3' 및(또는) 5' 말단 조절 서열을 추가로 함유하는 것이, 존재하는 다른 유전자의 발현을 위해 유리하며, 상기 서열은 선택된 숙주 유기체 및 유전자 또는 유전자들에 의존하여 최적의 발현을 위해 선택된다.
이러한 조절 서열은 유전자의 특이적 발현 및 단백질 발현을 가능하게 하기 위한 것이다. 이것은, 예를 들어, 숙주 유기체에 의존하여, 유전자가 단지 유도 후에만 발현되고(거나) 과다발현되거나, 또는 유전자가 즉시 발현되고(거나) 과다발현되는 것을 의미할 수도 있다.
조절 서열 또는 인자들은 바람직하게는 도입된 유전자의 발현에 대해 유리한 효과를 가질 수도 있고, 따라서 그것을 증가시킨다. 따라서, 프로모터 및(또는) 인핸서와 같은 강한 전사 시그날을 사용함으로써 전사 수준에서 조절 요소를 유리하게 증대시킬 수 있다. 그러나, 예를 들면 mRNA의 안정성을 개선시키기 위해 번역을 증대시킬 수도 있다.
벡터의 추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 핵산 구조물은 선형 DNA의 형태로 숙주 유기치내에 유리하게 도입될 수 있고 이종 또는 동종 재조합에 의해 숙주 유기체의 게놈내로 통합될 수 있다. 이러한 선형 DNA는 선형화된 플라스미드로 구성될 수도 있거나 또는 벡터로서 단지 핵산 단편만으로 구성될 수도 있다.
또한, 세포에서 자율 복제되는 임의의 플라스미드 뿐만 아니라, 상기 기재된 바와 같이 숙주의 게놈내로 통합하는 선형 DNA 단편을 벡터로서 사용할 수도 있다. 이러한 통합은 이종 또는 동종 재조합에 의해 일어날 수 있지만, 바람직하게는 언급된 바와 같이 동종 재조합에 의해 일어난다 (Steiner 등, Genetics, Vol.140, 1995: 973-987). 상기 언급된 카로틴 수산화효소 유전자가 게놈의 여러 부위에서 또는 여러 벡터 상에서 단독으로 존재하거나, 또는 게놈에서 또는 하나의 벡터상에서 함께 존재하는 것이 또한 가능하다.
본 발명은 또한, 유전자 변형된 유기체를 생성하기 위한 본 발명에 따른 카로틴 수산화효소 유전자의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 카로틴 수산화효소 유전자의 발현이, 시원 유기체가 본 발명에 따른 카로틴 수산화효소 유전자를 함유하는 경우에 야생형에 비해 증가되어지거나, 또는 시원 유기체가 본 발명에 따른 카로틴 수산화효소 유전자를 함유하지 않는 경우에 유전자 변형에 의해 유발되어지는, 상응하는 유전자 변형 유기체에 관한 것이다.
유전자 변형 유기체는, 본 발명에 따른 카로틴 수산화효소 유전자 또는 핵산 구조물이 바람직하게는 상기 기재된 방법의 하나에 의해 삽입되어진 유기체를 의미한다.
유전자 변형 유기체는 본 발명에 따른 하나 이상의 카로틴 수산화효소 유전자 또는 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 구조물을 함유한다. 시원 유기체에 의존하여, 핵산은 염색체 내부 또는 외부에 존재할 수도 있다.
유전자 변형 유기체에서 카로티노이드 대사는 바람직하게는 야생형에 비해 변경된다.
적절한 유전자 변형 유기체는 원칙적으로 크산토필을 합성할 수 있는 모든유기체이다.
바람직한 시원 유기체는 크산토필을 자연적으로 합성할 수 있는 것이다. 그러나, 카로티노이드 생합성 유전자의 도입이 또한 적절하기 때문에, 시원 유기체가 크산토필을 합성할 수 있다. 시원 유기체는 예를 들어 미생물 또는 식물과 같은 원핵 또는 진핵 유기체를 의미한다. 바람직한 미생물은 세균, 효모, 조류 또는 진균이다.
사용될 수 있는 세균은, 카로티노이드-생성 유기체의 카로티노이드 생합성 유전자의 도입으로 인해 크산토필을 합성할 수 있는 세균, 예를 들어 에르위니아로부터의 crt 유전자를 함유하는 에스케리키아 속의 세균, 및 본질적으로 크산토필을 합성할 수 있는 세균, 예컨대 에르위니아 속, 아그로박테리움 속, 플라보박테리움 속, 알카리게네스 속 또는 시네코시스티스 속의 시아노박테리아이다. 바람직한 세균은 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 에르위니아 헤르비콜라, 에르위니아 우레도보라, 아그로박테리움 아우란티아쿰, 알칼리게네스 종. PC-1, 플라보박테리움 종. 균주 R1534 또는 시아노박테리움 시네코시스티스 종. PCC6803이다.
칸디다, 사카로마이세스, 한세눌라 또는 피키아가 바람직하게 사용된다.
바람직한 진균은 아스페르길루스(Aspergillus), 트리코데르마(Trichoderma), 아쉬비야(Ashbya), 뉴로스포라(Neurospora), 푸사리움(Fusarium) 또는 문헌 [Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No. 1,2 (1995) 15면, 표 6]에 기재된 기타 진균이다.
바람직한 조류는 녹조류, 예를 들어 해마토코쿠스 속, 패닥틸럼 트리코르나툼(Phaedactylum tricornatum), 볼복스(Volvox) 또는 두날리엘라 (Dunaliella)의 조류이다. 특히 바람직한 조류는 해마토코쿠스 플루비알리스 또는 두날리엘라 바르다윌(Dunaliella bardawil)이다.
바람직한 실시양태에서, 식물이 시원 유기체로서, 또한 유전자 변형된 유기체로서 사용된다. 바람직한 식물의 예는 타게테스, 해바라기, 아라비도프시스, 담배, 홍 후추, 대두, 토마토, 가지, 파프리카, 당근, 감자, 옥수수, 상치 및 유채 종, 귀리, 호밀, 밀, 트리티케일, 기장, 쌀, 알팔파, 아마, 브라시카시애, 예를 들어 평지씨 기름 또는 카놀라, 슈가 비트, 슈가 캐인 또는 목재 식물, 예를 들어 아스펜 또는 주목이다.
아라비도프시스 탈리아나, 타게테스 에렉타(Tagetes erecta), 평지씨유, 카놀라, 감자, 및 유종자 및 대두, 해바라기, 파프리카, 당근, 후추 또는 옥수수와 같은 전형적인 카로티노이드 생산물이 특히 바람직하다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 단백질의 존재하에서, β-이오논 구조 요소를 3-히드록시-β-이오논 구조 요소로 전환시키고(거나) 4-케토-β-이오논 구조 요소를 3-히드록시-4-케토-β-이오논 구조 요소로 전환시키는 것을 포함하는, 크산토필 유도체의 제조 방법에 관한 것이다.
크산토필 유도체는 크산토필, 바람직하게는 하나 이상의 히드록실 기를 함유하는 크산토필, 예를 들어 제아크산틴, β-크립토크산틴, 3'-히드록시에키네논, 3-히드록시에키네논, 아도니크산틴 (4-케토제아크산틴), 아스타크산틴, 포에니코크산틴 (아도니루빈), α-크립토크산틴 또는 루테인 또는 40 개 이하의 탄소 원자를 갖고 분자에 하나 이상의 3-히드록시-β-이오논 또는 하나 이상의 3-히드록시-4-케토-β -이오논 구조 요소를 갖는 그의 유도체, 예를 들어 3-히드록시-6-비닐-β-이오논, 3-히드록시-4-케토-6-비닐-β-이오논, 3-히드록시레티놀, 3-히드록시-4-케토레티놀, 3-히드록시레티날, 3-히드록시-4-케토레티날, 3-히드록시레티논산 또는 3-히드록시-4-케토레티논산을 의미한다.
바람직한 크산토필 유도체는 제아크산틴, 루테인 및 아스타크산틴이다.
본 발명에 따른 방법에서, 본 발명에 따른 단백질의 존재하에, β-이오논 구조 요소가 3-히드록시-β-이오논 구조 요소로, 예컨대 β-카로틴이 제아크산틴으로, β-카로틴이 β-크립토크산틴으로, β-크립토크산틴이 제아크산틴으로, 에키네논이 3'-히드록시에키네논으로, 3-히드록시에키네논이 아도니크산틴 (4-케토제아크산틴)으로, α-카로틴이 α-크립토크산틴으로, 또는 40 개 이하의 탄소 원자를 갖고 β-이오논 고리를 함유하는 화합물이 상응하는 3-히드록시-β-이오논 화합물로, 또는 4-케토-β-이오논 구조 요소가 3-히드록시-4-케토-β-이오논 구조 요소로, 예컨대 칸타크산틴이 아스타크산틴으로, 칸타크산틴이 포에니코크산틴 (아도니루빈)으로, 포에니코크산틴 (아도니루빈)이 아스타크산틴으로, 에키네논이 3-히드록시에키네논으로, 3'-히드록시에키네논이 아도니크산틴 (4-케토제아크산틴)으로, 또는 40 개 이하의 탄소 원자를 갖고 4-케토-β-이오논 고리를 함유하는 화합물이 상응하는 3-히드록시-4-케토-β-이오논 화합물로 전환된다.
방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 언급된 본 발명에 따른 유전자 변형된 유기체를 배양하고, 이 유기체를 수확하고, 이어서 크산토필 유도체를 유기체로 부터 단리한다.
본 발명에 따른 유전자 변형 유기체의 배양은 그 자체로 공지된 방법, 예컨대 미생물의 경우에는 적절한 배지, 예를 들어 한천 평판 위 또는 현탁 배양액중에서 적절한 야생형을 배양하거나, 또는 식물의 경우에는 토양 또는 적절한 영양 배지에서 적절한 야생형을 배양함으로써 수행된다. 수확이란, 미생물의 경우에는 미생물을 단리하는 것을 의미하고, 식물의 경우에는 식물 또는 적절한 경우에 크산토필 유도체를 함유하는 특정한 식물 부위를 절단하는 것을 의미한다. 크산토필 유도체는 그 자체로 공지된 방법, 예를 들어 유기체 세포의 붕괴, 크산토필 유도체의 추출, 및 이어서 화학 또는 물리적 분리 방법, 예컨대 추출 또는 크로마토그래피에 의한 크산토필 유도체의 정제에 의해 단리된다.
본 발명은 또한, 크산토필 유도체를 제조하기 위한 본 발명에 따른 카로틴 수산화효소의 용도 또는 본 발명에 따른 카로틴 수산화효소 유전자의 용도에 관한 것이다.
하기 실시예가 본 발명을 예증한다.
실시예 1
β-카로틴 생성 이.콜리 내로의 카로틴 수산화효소의 혼입, 형질전환 유기체의 발효 및 크산토필의 단리
일반적 방법
카로티노이드의 단리
카로티노이드 (카로틴 및 크산토필)를 단리하기 위하여, 이.콜리 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 얻어진 세포 물질을 24 시간동안 동결 건조시켰다. 동결 건조된 세포를 아세톤에 재현탁하고, 55 ℃에서 15 분동안 아세톤으로 2회 추출하였다. 합한 추출물을 분리 깔때기에서 디에틸 에테르/석유 에테르 (비점 35 - 80 ℃) 혼합물 (1:9, v/v)로 세척하고, 회전 증발기에서 질소하에 농축 건조시켰다.
HPLC 분석
1.5 ml/분의 용리액 유량으로 뉴클레오실(Nucleosil) 100-5 C18 컬럼 (마쉐리-나겔 (Macherey-Nagel))을 사용하여 추출물을 분별하였다. 실시예 1에서 β-카로틴 및 수산화 크산토필을 분별하기 위해 사용된 용리액은 아세토니트릴/메탄올/2-프로판올 혼합물 (85:10:5, v/v/v; 유량)이었다. 실시예 2에서 케토기를 가진 크산토필을 분별하기 위해, 아세토니트릴/메탄올/H2O 혼합물 (50:44:6, v/v/v)을 용리액 1로서 22분동안 사용하고, 메탄올을 용리액 2로서 사용하였다. 워터스 994 다이오드(Waters 994 diode) 분석 검출기를 사용하여 검출을 직접 수행하였다. HPLC 분석을 위한 비교 표준은 시그마(Sigma) 또는 로쓰(Roth)로 부터 구입된 β-카로틴, 아스타크산틴 및 제아크산틴이었다.
1.1 β-카로틴-생산 이.콜리의 생성
사용된 유기체는 균주 JM101의 이.콜리 세포를 포함하였다. 플라스미드 pACCAR16DcrtX는 에르위니아 우레도보라로부터의 세균 카로티노이드 생합성 유전자 crtE, crtB, crtI 및 crtY를 함유하고, 그 결과 β-카로틴이 생합성된다 [N.Misawa등, J.Bacteriol. 172 (1990) 6704-6712; Biochem. Biophys. Res. Commun. 209 (1995) 867-876].
이 플라스미드를 제조하기 위하여, 에르위니아 우레도보라로부터의 카로티노이드 생합성 유전자 집괴의 6.0 kb Asp718(KpnI)-EcoRI 단편 (플라스미드 pCAR16delB)을 플라스미드 pACY184의 EcoRI 부위내에 클로닝하였다 [R.E.Rose, Nucl.Acids Res. 16 (1988) 355]. 플라스미드 pCAR16delB는 β-카로틴 수산화효소 ORF(개방 판독 프레임)에서 프레임시프트 돌연변이를 갖는다 [Misawa 등, Biochem.Biophys.Res.Commun. 209(1995) 867-876]. 따라서, 얻어진 β-카로틴이 제아크산틴으로 수산화되는 것이 불가능하다.
이.콜리내로 플라스미드 pACCAR16DcrtX의 삽입 및 형질전환된 이.콜리 세포의 제조 및 단리는 방법은 문헌 [Sambrook 등, Molecular cloning: a laboratory manual, 제 2 판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재된 바와 같이 그 자체로 공지된 방법으로 수행되었다.
1.2 해마토코쿠스 플루비알리스 λcDNA 발현 라이브러리의 구축 및 카로틴 수산화효소 유전자를 함유하는 플라스미드의 단리
해마토코쿠스 플루비알리스 플로토우 NIES-144는 일본 쓰꾸바 소재의 환경 연구를 위한 국립 연구소 (the National Institute for Environmental Studies) (NIES)에서 유래되었다. 해마토코쿠스 플루비알리스의 생육 단계에서 기본 배지 (pH 6.8)는 1 리터당 1.2 g의 아세트산나트륨, 2.0 g의 효소 추출물, 0.4 g의 L-아스파라긴, 0.2 g의 MgCl2*6H2O, 0.01 g의 FeSO4*7H2O 및 0.02 g의 CaCl2*2H2O를 함유하였다. 해마토코쿠스 플루비알리스를 12 시간 밝은 곳 (20 μE/m2s) 및 12 시간 어두운 곳의 명/암 사이클로 20 ℃에서 4 일동안 생육시켰다. 아스타크산틴 생합성 및 난포 세포 형성을 유도하기 위하여, 4 일 후에 아세트산나트륨 및 FeSO4를 각각 45 mM 및 450 μM의 농도로 첨가하였다. 첨가 후에, 문헌 [Kajiwara 등, Plant Mol. Biol. 29 (1995) 343-352]에 기재된 바와 같이, 빛 조건을 연속적인 빛 (125 μE/m2s)으로 변화시켰다. 난포 세포 형성을 8 시간동안 유도한 후에, 해마토코쿠스 플루비알리스의 RNA를 단리하여 난포 세포로부터 cDNA 라이브러리를 구축하였다.
올리고(dT)-셀룰로스 (Biolabs)를 사용하여 폴리(A)RNA를 정제하였다. cDNA 합성 및 ZAP-cDNA 기가팩 III 골드 클로닝 키트 (cDNA Synthesis and ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit) (스트라타겐)의 도움을 받아, cDNA의 합성 및 λZAP 발현 라이브러리의 구축을 수행하였다. 스트라타겐의 사용 지시에 따라서, XhoI 제한 효소 인식 부위를 함유하는 폴리(dT) 프라이머 및 MMLV 역 전사효소를 사용하여 cDNA의 첫번째 스트랜드를 합성하였다. 그와 상응하여, DNA 폴리머라제 I을 사용하여 두번째 스트랜드를 합성하였다. Pfu DNA 폴리머라제로 채워넣음으로써 블런트 DNA 말단을 생성하고, EcoRI 어댑터를 그곳에 결찰시켰다. 얻어진 cDNA 단편을 크기에 따라 분별하고, 이어서 Uni-ZAP XR 벡터의 EcoRI-XhoI 인식 부위 내에 결찰시켰다. 포지티브 카로틴 히드록실라제 플라그를 단리 및 정제한 후에, 스트라타겐의 사용 지시에 따라서, 엑스어시스트(ExAssist) 헬퍼 파아지 및 SOLR 이.콜리 균주를 사용하여 생체내 절단함으로써, 카로틴 히드록실라제 cDNA를 함유하는 p블루스크립트(pBluescript) 파아지미드를 회수하였다. 얻어진 플라스미드는, DNA 서열 분석에 따라 5'-(5'-AATTCGGCACGAG-3') 및 3'-(5'-TCGAG-3') 말단에서의 짧은 어댑터 서열 이외에도, 다중 클로닝 부위의 EcoRI 및 XhoI 제한 부위내에 결찰된 1608 bp- 긴 cDNA 단편을 함유한다. 카로틴 수산화효소 유전자를 1.1에 기재된 바와 같이 β-카로틴-생성 이.콜리 세포내로 삽입하기 위해, 이 플라스미드를 사용하였다.
1.3 β-카로틴-생성 이.콜리 세포내로의 카로틴 수산화효소의 혼입, 형질전환된 세포의 배양 및 크산토필 제아크산틴 및 β-크립토크산틴의 단리
문헌 [J.Sambrook 등, Molecular cloning: a laboratory manual, 제 2 판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재된 바와 같은 공지된 방식으로, 1.1에 기재된 플라스미드 pACCAR16DcrtX를 함유하는 β-카로틴-생성 이.콜리 세포를, 1.3에 기재된 카로틴 수산화효소 유전자를 함유하는 플라스미드로 형질전환하였다.
형질전환된 이.콜리 세포를 암피실린 (50 ㎍/ml; 카로틴 수산화효소 유전자를 함유하는 플라스미드에 대해) 및 클로람페니콜 (30 ㎍/ml; 플라스미드 pACCAR16DcrtX)이 첨가된 LB 배지에서 28 ℃에서 48 시간동안 배양하였다.
일반적 방법에 기재된 바와 같이 카로티노이드를 단리하였다. 도 1은
(A) 1.1로부터의 플라스미드 pACCAR16DcrtX를 함유하는 이.콜리 세포, 및
(B) 1.2로부터의 카로틴 수산화효소 유전자와 함께 플라스미드 pACCAR16DcrtX를 함유하는 이.콜리 세포
로부터 추출된 카로티노이드에 대한 HPLC 도표를 나타낸다.
도 1에서의 피크 번호는
3 제아크산틴
5 β-크립토크산틴
6 β-카로틴을 의미한다.
도 1로부터 명백히 알 수 있듯이, 형질전환된 이.콜리 세포는, 본 발명에 따른 카로틴 수산화효소 유전자의 혼입으로 인해, 수산화된 크산토필 제아크산틴 및 β-크립토크산틴을 생성하는 반면, 형질전환되지 않은 경우에는 β-카로틴만을 생성한다. 따라서, 본 발명에 따른 카로틴 수산화효소는 β-카로틴을 β-크립토크산틴으로, β-크립토크산틴을 제아크산틴으로, 또는 β-카로틴을 제아크산틴으로 전환시킬 수 있다.
실시예 2
β-카로틴-생성 이.콜리 세포내로 해마토코쿠스 플루비알리스로부터의 카로틴 수산화효소 유전자 및 β-카로틴 케톨라제 유전자(bkt)의 혼입, 형질전환된 세포의 배양, 및 크산토필 아스타크산틴, 칸타크산틴, 아도니크산틴, 제아크산틴 및 β--크립토크산틴의 단리
2.1 해마토코쿠스 플루비알리스로부터 β-카로틴 케톨라제 유전자 (bkt)를 함유하는 플라스미드 제조
해마토코쿠스 플루비알리스로부터 β-카로틴 케톨라제 유전자를 함유하는 플라스미드 pRKbkt1 (Kajiwara 등, Plant Mol.Biol. 29(1995) 343-352)을 제조하기 위하여, pUC19bkt 플라스미드의 PvuII 부분 소화물의 1 kb 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분별하였다 [Breitenbach 등, FEMS Microbiol.Lett. 140 (1996) 241-246]. 이 DNA 단편은 케톨라제의 ORF (개방 판독 프레임)와 함께 lacZ 프로모터를 함유하며, 이것을 HindIII로 미리 소화되고 클레노우 효소로 처리되어진 플라스미드 pRK404내로 서브클로닝하였다.
얻어진 플라스미드 pRKbkt1을 한번은 단독으로, 그리고 한번은 1.2에 기재된 카로틴 수산화효소 유전자 플라스미드와 함께, β-카로틴-생성 이.콜리 세포내로 삽입하였다.
2.2 β-카로틴-생성 이.콜리 세포내로 플라스미드 pRKbkt1의 혼입, 형질전환된 세포의 배양, 및 크산토필 칸타크산틴의 단리
문헌 [J.Sambrook 등, Molecular cloning: a laboratory manual, 제 2 판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재된 바와 같은 공지된 방법으로, 1.1에 기재된 플라스미드 pACCAR16DcrtX를 함유하는 β-카로틴-생성 이.콜리 세포를, 2.1에 기재된 β-카로틴 케톨라제 유전자 (bkt)를 함유하는 플라스미드 pRKbkt1으로 형질전환하였다.
형질전환된 이.콜리 세포를, 클로람페니콜 (30 ㎍/ml; 플라스미드 pACCAR16DcrtX), 테트라사이클린 (10 ㎍/ml; 플라스미드 pRKbkt1) 및 이소프로필β-D-티오-갈락토피라노시드 (0.5 mM)을 첨가하여, 1.3에 기재된 것과 유사하게 LB 배지에서 28 ℃에서 48 시간동안 배양하였다.
일반적 방법에 기재된 것과 같이 카로티노이드를 단리하였다.
도 2(A)는, β-카로틴 케톨라제 유전자 (bkt)를 함유하는 플라스미드 pRKbkt1과 함께, 플라스미드 pACCAR16DcrtX를 함유하는 이.콜리 세포로부터 추출된 카로티노이드의 HPLC-도표를 나타낸다.
플라스미드 pRKbkt1의 혼입에 의해, 케토기 칸타크산틴을 가진 크산토필을 생성하는 형질전환된 이.콜리 세포가 얻어진다.
2.3 β-카로틴-생성 이.콜리 세포내로 플라스미드 pRKbkt1 및 카로틴 수산화효소 유전자의 혼입, 형질전환된 세포의 배양, 및 크산토필, 아스타크산틴, 칸타크산틴, 아도니크산틴, 제아크산틴 및 β-크립토크산틴의 단리
문헌 [J.Sambrook 등, Molecular cloning: a laboratory manual, 제 2 판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재된 바와 같은 공지된 방법으로, 1.1에 기재된 플라스미드 pACCAR16DcrtX를 함유하는 β-카로틴-생성 이.콜리 세포를, 2.1에 기재된 β-카로틴 케톨라제 유전자 (bkt)를 함유하는 플라스미드 pRKbkt1과, 1.3에 기재된 카로틴 수산화효소 유전자를 함유하는 플라스미드로 형질전환하였다.
형질전환된 이.콜리 세포를, 암피실린 (50 ㎍/ml; 카로틴 수산화효소 유전자를 함유하는 플라스미드), 클로람페니콜 (30 ㎍/ml; 플라스미드 pACCAR16DcrtX), 테트라사이클린 (10 ㎍/ml; 플라스미드 pRKbkt1) 및 이소프로필 β-D-티오-갈락토피라노시드 (0.5 mM)을 첨가하여, 1.3에 기재된 것과 유사하게 LB 배지에서 28 ℃에서 48 시간동안 배양하였다.
일반적 방법에 기재된 것과 같이 카로티노이드를 단리하였다. 도 2는
(A) 플라스미드 pRKbkt1과 함께, 1.1로부터의 플라스미드 pACCAR16DcrtX를 함유하는 이.콜리 세포 및
(B) 플라스미드 pRKbkt1 및 1.2로부터의 카로틴 수산화효소 유전자와 함께, 플라스미드 pACCAR16DcrtX를 함유하는 이.콜리 세포
로부터 추출된 카로티노이드에 대한 HPLC 도표를 나타낸다.
도 2(C)는 비교 표준으로서 아스타크산틴을 나타낸다.
도 2에서의 피크 번호는
1 아스타크산틴
2 아도니크산틴
3 제아크산틴
4 칸타크산틴
5 β-크립토크산틴
6 β-카로틴을 의미한다.
도 2에서 알 수 있듯이, 형질전환된 이.콜리 세포는, β-카로틴 케톨라제 유전자 (bkt)를 함유하는 플라스미드 pRKbkt1과 함께 본 발명에 따른 카로틴 수산화효소 유전자의 혼입으로 인하여, 수산화 및(또는) 케토-함유 크산토필 아스타크산틴, 칸타크산틴, 아도니크산틴, 제아크산틴 및 β-크립토크산틴을 생산하는 반면,본 발명에 따른 카로틴 수산화효소 유전자가 없으면 단지 칸타크산틴만이 생산된다.
해마토코쿠스 플루비알리스로부터의 β-카로틴 케톨라제에 대한 효소 연구에서, 효소는 주로 β-카로틴을 칸타크산틴으로 전환시키는 반면, 제아크산틴 및 β-크립토크산틴과 같은 히드록실-함유 크산토필은 아도니크산틴으로만 전환되고 아스타크산틴으로는 전환되지 않는다 [T.Lotan, J.Hirschberg, FEBS Lett. 364 (1995) 125-128; J.Breitenbach, N.Misawa, S.Kajiwara, G.Sandmann, FEMS Microbiol. Lett. 140 (1996) 241-246; P.D.Fraser, H.Shimada, N.Misawa, Eur.J.Biochem. 252 (1998), 229-236].
실시예 2.3에서 형질전환된 이.콜리 세포가 아스타크산틴을 생성할 수 있다는 사실은, 본 발명에 따른 카로틴 수산화효소가 칸타크산틴을 포에니코크산틴(아도니루빈)을 거쳐 아스타크산틴으로 전환시킬 수 있음을 입증한다.
따라서, 본 발명에 따른 카로틴 수산화효소는 β-이오논 구조 요소를 3-히드록시-β-이오논 구조 요소로 전환시키는, 예컨대 β-카로틴을 제아크산틴으로, β-카로틴을 β-크립토크산틴으로, β-크립토크산틴을 제아크산틴으로, 에키네논을 3'-히드록시에키네논으로, 3-히드록시에키네논을 아도니크산틴 (4-케토제아크산틴)으로, α-카로틴을 α-크립토크산틴으로, 또는 40개 이하의 탄소 원자를 갖고 β-이오논 고리를 함유하는 다른 화합물을 상응하는 3-히드록시-β-이오논 화합물로, 또는 4-케토-β-이오논 구조 요소를 3-히드록시-4-케토-β-이오논 구조 요소로, 예를 들어 칸타크산틴을 아스타크산틴으로, 칸타크산틴을 포에니코크산틴 (아도니루빈)으로, 포에니코크산틴 (아도니루빈)을 아스타크산틴으로, 에키네논을 3-히드록시에키네논으로, 3'-히드록시에키네논을 아도니크산틴 (4-케토제아크산틴)으로, 또는 40개 이하의 탄소 원자를 갖고 4-케토-β-이오논 고리를 함유하는 다른 화합물을 상응하는 3-히드록시-4-케토-β-이오논 화합물로 전환시키는 것을 촉매할 수 있다.
<서열목록>

Claims (16)

  1. 아미노산 서열 2 또는 이 서열로부터 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 유도되고 서열 2와 아미노산 수준에서 50 % 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는, β-카로틴을 제아크산틴으로 또는 칸타크산틴을 아스타크산틴으로 전환시키는 효소 활성을 갖는 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서, 단백질이 β-카로틴을 제아크산틴으로 전환시키는 효소 활성 및 칸타크산틴을 아스타크산틴으로 전환시키는 효소 활성을 갖는 단백질.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 청구된 단백질을 암호화하는 핵산.
  4. 제 3 항에 있어서, 서열 1에 나타낸 서열로 구성된 핵산.
  5. 하나 이상의 조절 시그날에 기능적으로 연결되어 유전자 발현을 증가시키는, 제 3 항 또는 제 4 항에 청구된 핵산을 포함하는 핵산 구조물.
  6. 제 5 항에 있어서, 제 3 항 또는 제 4 항에 청구된 핵산이 원핵 또는 진핵 유기체에서의 유전자 발현에 적절한 벡터내로 삽입된 핵산 구조물.
  7. 제 3 항 또는 제 4 항에 청구된 핵산의 유전자 발현이, 시원 유기체가 제 3 항 또는 제 4 항에 청구된 핵산을 포함하는 경우에는 야생형에 비해 증가되거나, 또는 시원 유기체가 제 3 항 또는 제 4 항에 청구된 핵산을 포함하지 않는 경우에는 유전자 조작에 의해 유발되어지는 유전자 조작된 유기체.
  8. 제 7 항에 있어서, 카로티노이드 대사가 야생형의 대사와 상이한 유전자 조작된 유기체.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 사용되는 유기체가 진핵 유기체인 유전자 조작된 유기체.
  10. 제 9 항에 있어서, 식물이 진핵 유기체로서 사용되는 유전자 조작된 유기체.
  11. 제 3 항 또는 제 4 항에 청구된 핵산 또는 제 5 항 또는 제 6 항에 청구된 핵산 구조물을 시원 유기체의 게놈 내에 도입하는 것을 포함하는, 제 7 항 내지 제 10 항중 어느 한 항에 청구된 유전자 조작된 유기체의 제조 방법.
  12. 유전자 조작된 유기체를 생성하기 위한, 제 3 항 또는 제 4 항에 청구된 핵산의 용도.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 청구된 단백질의 존재하에서 β-이오논 구조 요소를 3-히드록시-β-이오논 구조 요소로 전환시키고(거나) 4-케토-β-이오논 구조 요소를 3-히드록시-4-케토-β-이오논 구조 요소로 전환시키는 것을 포함하는 크산토필 유도체의 제조 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 제 7 항 내지 제 10 항중 어느 한 항에 청구된 유기체를 배양하고, 유기체를 수확한 후 유기체로부터 크산토필 유도체를 단리하는 것을 포함하는, 크산토필 유도체의 제조 방법.
  15. 크산토필 유도체를 제조하기 위한, 제 1 항 또는 제 2 항에 청구된 단백질의 용도.
  16. 크산토필 유도체를 제조하기 위한, 제 3 항 또는 제 4 항에 청구된 핵산의 용도.
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