TW201412768A - Ｄｎａ聚合酶突變株及其應用 - Google Patents

Abstract

本發明係關於突變DNA聚合酶，至少有一個突變胺基酸，會增加PCR效率或突變率，可用以增幅長片段DNA或製備高突變率之DNA片段。

Description

DNA聚合酶突變株及其應用

本發明係關於突變之新穎DNA聚合酶及其應用。特言之，本發明係提供新穎高活性或高突變率Taq DNA聚合酶及其基因，包括突變之蛋白質及DNA序列，進一步包括以及其製備長片段DNA或高突變率DNA片段之應用。

DNA聚合酶負責複製及維持基因組的完整性，可正確將遺傳訊息一代一代傳遞下去。DNA聚合酶在細胞的功能是種負責合成DNA的酵素，其以金屬離子當活化劑，例如Mg²⁺，以DNA為模板，用鹼基互補的原理，依模板DNA的序列將去氧核苷三磷酸，一一聚合成互補股去氧多核苷酸鏈。在生物體內DNA聚合酶參與DNA合成程序包括DNA複製、DNA修補、重組及基因增幅(Korberg and Baker,DNA Replication,W.H.Freeman and Co.,New York(1992))。DNA聚合酶依其胺基酸序列可分為三族(D.K.and Ito,J.(1993)Nucl.Acids Res,21,787-802)。DNA聚合酶I除具有合成DNA功能外一般有5`→3`及3`→5`外切酶活性是一種修補DNA酶，聚合酶II以損壞模板開始進行DNA合成，用以防止突變，聚合酶III是細胞進行複製DNA之酵素具高合成速率(約30,000/分)，其沒有5`→3`外切酶活性。其他DNA聚合酶之特性則來自出處，例如原自高溫菌之耐熱性DNA聚合酶。所有種類DNA聚合酶立體折疊形式，大致相似於拇指與其它手指張開之人類右手型狀，包括手掌、拇指及其他手指等三個不同次區塊，(Beese et al.Science260,352-355(1993)；Patel etal.,Biochemistry34：5351-5363(1995)，手指及拇指次區塊在不同DNA聚合酶之大小不同，而進行催化反應之手掌次區塊則所有種類DNA聚合酶都一致重疊。X-光散射研究DNA聚合酶I、DNA模板及核苷酸基質三者之共結晶， 指出每個區塊在催化反應中的功能(S.Doublie.et al.Nature 391(1998)251-258；Y.Li,et.al.EMBOJ.17(1998)7514-7525；J.R.Kiefer.et.al.Nature391(1998)304-307)DNA聚合酶是維持基因組完整性之中心。他們催化DNA合成反應以DNA其中一股為模板指引加入互補去氧核苷酸到一條DNA引子進行引子延伸反應，其功能為複製、修復及重組DNA。酵素使用其掌狀及拇指區塊把握住DNA引子及模板之雙股DNA，而手指則彎曲靠近掌部而形成新鹼基對之咬合袋。引子-模板聚合反應有方向性，引子3`端接近手指而5`端接近拇指。進行催化反應時，此些DNA聚合酶區塊會進行二種構型轉換。第一種開放(open)構型是將拇指移離手掌，打開拇指-手掌以咬住DNA基質，第二種閉合(closed)構型是將手指彎曲轉向手掌，並進行核苷酶接合，酵素由”開放(open)”到”閉合(closed)”構型轉變會限制活性位置大小，形成手指與核苷酸重要接觸及協助建立基質辨識及併入所需的構型正確核苷酸。

生物體內在每種DNA合成程序中，DNA模板被複製一次，產生相同的複本。但在試管中，DNA複製可多次反覆進行，例如，聚合酶鏈反應(Mullis,U.S.Pat.No.4683202)，可多次反覆複製特定DNA片段，製備大量DNA。DNA聚合酶鏈反應技術在起始應用階段時，必須加入DNA聚合酶在每個複製DNA週期的起始步驟(U.S.Pat.NO.4683202)。後來由長在溫泉中菌株獲得耐熱性DNA聚合酶，耐熱性酵素參與PCR反應只需加入一次(Gelfand,U.S.Pat.NO.4889818)，在PCR高溫階段，這些酵素並不會被變性。因此，在聚合酶鏈反應的循環重覆之DNA合成週期中，並不需要在每週期DNA合成的起始步驟都補充新鮮DNA聚合酶。DNA聚合酶，尤其是耐熱性DNA聚合酶，在大部分有關重組DNA技術及病原核酸的醫學檢測都扮演著關鍵角色。尤其是檢驗方面的應用，一個標的核酸序列可能只是待測DNA或RNA中小部份，所以若沒有PCR增幅反應可能很難檢測到 標的核酸序列。因此DNA聚合酶在生物技術及醫學上應用層面廣泛其產業價值高。

許多DNA聚合酶演化出具有選擇基質及高效率催化DNA合成的功能。他們能夠剔除非互補鹼基去氧核苷酸及核苷酸，DNA聚合酶正確性缺陷可能會導致老化及增加癌症機率。DNA聚合酶正確性不但對生物學家很重要同樣對生物技術人員也很重要。高正確性耐熱DNA聚合酶可用以基因選殖而低正確性DNA聚合酶則用於突變PCR增幅反應。

在生技產業上PCR技術應用領域相當廣泛，由古生物DNA鑑定、刑事鑑定、親子鑑定、病毒檢測，每個領域對所使用DNA聚合酶特性要求不一，例如病毒檢測之PCR技術要求高效率、高靈敏性，鑑定PCR技術則需求高特異性，基因選殖要求高正確性，突變PCR則要求高突變性、低正確性，DNA Shuffing PCR技術則要求較低溫的最適延伸溫度，熱啟動PCR技術則要求低溫沒殘餘聚合酶活性，長片段PCR技術則需求快速合成及少許校讀活性的DNA聚合酶；不同PCR應用領域要求不同特性DNA聚合酶，因此有需要開發各種不同特性DNA聚合酶以合乎各領域的需求，例如破壞5`→3`外切酶活性可以增加DNA聚合酶耐熱性(Merkens,L.S.(1995)Biochem.Biophys.Acta 1264,243-248,Jacobsen,H.(1974)Eur.J.Biochem.45,623-627；Bames,W.M.(1992)Gene112,29-35)。減少區別雙去氧及去氧核苷酸能力以增加DNA定序的效能(Tabor S.and Richardson,C.C.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.92,6339-6343)。在生技產業製備DNA聚合酶層面，許多特性聚合酶將有利於產量增加，降低成本，增加產品市場競爭力，例如高比活性將會增加產量；高耐熱性會增加純化方便性，都能有效降低聚合酶成本，提高聚合酶品質，增加聚合酶市場競爭力。因應DNA聚合酶在生技產業多元化的應用，必需製備具有不同特性的DNA聚合酶突變株以符合不同領域的需求。

本發明目的即是篩選高效率或高突變率之新穎DNA聚合酶，可用以製備長片段或高突變率DNA片段。

發明簡述

本發明之目標係提供一種新穎突變之高效率或高突變率DNA聚合酶基因，蛋白質表現質體及轉形菌株等。

本發明另進一步之目標係提供製備長DNA片段或高突變率DNA片段之試劑組，其包含本發明所揭示之新穎突變DNA聚合酶。

發明詳細說明

本發明所揭示之高效率或高突變率之DNA聚合酶係根據先前申請案(第098115566號專利申請案)，所揭示之結果，得知Taq DNA聚合酶第676胺基酸位置突變會影響到DNA聚合酶活性，根據立體結構模擬圖，推測第677胺基酸也可能影響到Taq DNA聚合酶活性，所以我們進一步對編碼第676及677胺基酸之鹼基進行隨機突變，並以前案(第098115566號專利申請案)所揭示之快速篩選方法，篩選到許多有活性突變株。

進一步分析Taq DNA聚合酶突變株特性及其突變胺基酸種類，發現H676K突變株具高效率可合成長片段DNA，另H676L或H676RR677K突變株具高突變率，合成之DNA突變率較高。

所以本發明揭示新穎高效率H676K或高突變率H676L及H676R R677K Taq DNA聚合酶及其基因、表現質體及轉形細胞株，可用以製備長片段或高突變率DNA片段。

以下茲舉若干實例以具體說明本發明內容，但本發明之範圍並不受此等實例所限。

實例之實驗方法

1. Taq DNA聚合酶基因第676及677胺基酸之隨機突變基因庫構築Taq DNA聚合酶第676及677胺基酸隨機突變基因庫之表現質體的構築，如流程圖(圖一)所示，分成兩部分(1)表現載體的製備，(2)Taq DNA聚合酶基因編碼676及677胺基酸定點隨機突變之DNA片段製備。

(1)表現載體的構築

pUC18/Taq/His質體(第098115566號專利申請案)以限制酵素Nhe I及Ale I剪切，於37℃以NEB(New England Biolabs)4號緩衝液反應2小時，從pUC18/Taq/His切出Nhe I及Ale I DNA片段。酵素反應完之產物以0.8%洋菜膠分離，並切下4.4 Kb大片段以膠純化試劑組進行純化，純化出約4.4 Kb的線性DNA片段。

(2)Taq DNA聚合酶第676及677胺基酸定點隨機突變製備

Taq DNA聚合酶第676及677胺基酸定點隨機突變之DNA片段製備，設計第676及677胺基酸位置之隨機突變之正向引子T1342 F(SEQ ID NO：1)及反向引子T2052R(SEQ ID NO：2)，pUC18/Taq(T003)質體(第098115566號專利申請案)當模板，以PCR反應增幅出第676及677胺基酸位置隨機突變之DNA片段。PCR的反應液(200 μl)：20 μl 10x PCR buffer(1.5 mM MgCl₂)，4 μl 10 μM T1342 F(SEQ ID NO：1)，4 μl 10μM T2025 R(SEQ ID NO：2)，2 μl 25 mM dNTPs，1 μl pUC18/Taq質體及4 μl 2 U/μl Taq/pfu DNA polymerase補ddH₂O到200 μl。進行PCR反應條件為：94℃ 1分鐘；94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 1分鐘，進行35個循環；72℃延伸1分鐘。以0.8% agarose於1x TAE buffer進行PCR產物電泳分離，並將710 bp DNA片段之洋菜膠切下並以膠純化試劑組進行膠純化。

PCR產物經純化後以限制酵素Nhe I及Ale I剪切，於37℃在NEB 4號緩衝液反應2小時，以0.8%洋菜膠分離酵切產物，並切下710 bpDNA片段。使用膠純化試劑組(GeneMark)純化710 bp DNA片段。

(3)接合反應

以限制酵素Nhe I及Ale I剪切及純化之載體pUC18/Taq之4.4 Kb DNA片段及含第676及677隨機突變710 bp DNA片段，跑電泳檢視DNA量的對比。以DNA莫耳數比值約1：3(載體pUC18：嵌入片段Taq突變基因)混合，再加入等量DNA黏合酶緩衝液(TaKaRa)，置於16℃反應30分鐘後，加入勝任細胞混勻後，置於冰上20分鐘，接著置於42℃恆溫水浴槽中45秒，然後放回冰上1分鐘，再加入900 μl LB培養基混合均勻後，平均直接塗於3盤LB/Amp平盤上，置於37℃培養16~18小時，長出之菌株具有表現第676及677胺基酸隨機突變隨機之Taq DNA聚合酶質體(圖一)。

(4)突變菌株之篩選

利用第098115566號專利申請案之快速篩選方法擴增反應，篩選有Taq DNA聚合酶活性之pUC18/隨機突變Taq菌株。使用不含Taq DNA聚合酶之PCR反應液(25 μl)包含：2.5 μl 10x PCR buffer(1.5 mM MgCl₂)，0.5 μl 10 μM P18`5F(SEQ ID NO：3)、0.5 μl 10 μM P18`3R(SEQ ID NO：4)、0.25 μl 25 mM dNTPs、1 μl 20ng/μl pUC18質體、20.25 μl ddH₂O，以牙籤由LB/Amp平盤挑單一菌落在96孔平盤中攪拌及在新的LB/Amp平盤上留樣，平盤置於37℃培養12~16小時。96孔平盤進行PCR擴增反應95℃ 30秒，54℃ 30秒，72℃ 1分鐘，重複30個循環；然後再於72℃ 1分鐘。PCR擴增之1 Kb DNA片段以0.8%洋菜膠於1x TAE buffer進行電泳分離，並於UV燈下照相檢視(圖二)。有PCR產物的菌株就是有Taq DNA聚合酶活性的菌株分別抽取質體及進行突變株Taq DNA聚合酶純化。

2. Taq DNA聚合酶純化 (1)大量培養

培養1L的Taq DNA聚合酶，培養基為LB/Amp medium，種入2 mL隔夜菌液，以200 rpm培養8小時於37℃，直到O.D.595nm約為0.8時，進行1 mM IPTG誘導表現隔夜，再以5000 g離心30分收菌。

(2)破解菌塊

以100 mL Buffer A清洗菌塊，再加入100 mL含有4 mg/mL Lysozyme之Buffer A，將菌塊溶解，在室溫下反應15分鐘，完全破碎之細胞會釋放出DNA而造成溶液黏稠。再加入等量之Buffer B混合均勻，進行75℃煮1小時，使部分蛋白質沉澱，再以12,000 g高速離心10分鐘，留住上清液即為該酵素之粗萃液。

(3)硫酸銨沉澱

將75℃粗萃液加入30%之硫酸銨，於4℃下反應30分鐘充分混勻，再以13,000 g離心10分鐘，去除上清液，留下pellet，再以10 ml Nap A Buffer回溶。

(4)HisTrap親和性管柱層析

本研究利用蛋白質液相層析系統ÄKTA purifier進行蛋白質純化，所使用的是1 mL鎳離子(Ni²⁺)親和性樹脂HiTrap HP管柱，樣品為上述之硫酸銨沉澱以NaP A(20mM Nap pH7.4、0.5M NaCl、20mM Imidazole)溶解之溶液。純化條件：流速1 mL/min進行，先以10 ml(NaP A緩衝液)進行管柱平衡，再將樣品注入，再用10 ml(NaP A緩衝液)，清洗管柱，然後再連接ÄKTA FPLC純正系統進行蛋白質純化，FPLC純化條件：流速0.5 mL/min，管柱壓力極限0.35 MPa，波長1為280 nm，波長2為235 nm，樣品收集量為每管0.5 mL。A緩衝液為NaP A、B緩衝液為NaP B(20mM Nap pH7.4、0.5M NaCl、200mM Imidazole)，首先以5 ml之0~20% NaP B緩衝液梯度溶液進行連續沖提，之後再採用10 ml之20~100% NaP B緩衝液梯度溶液沖提最後在 以100% NaP B緩衝液進行管柱清洗。

將FPLC純化之Taq DNA聚合酶收集在一起，裝置10 K的透析膜中，以12.5%透析緩衝液在4℃下進行透析，每次透析5小時，透析2次。再用50%透析緩衝液在4℃下進行透析，每次透析5小時，透析1次。最後將收集於15 mL離心管中凍於-20℃保存。

3.蛋白質濃度測定(Bio-Rad Protein Assay Standard Procedure)

用Bio-Rad公司蛋白質定量試劑組(Bio-Rad Protein Assay Standard Procedure)定量Taq DNA聚合酶蛋白質的量，以Coomassie Brilliant Blue G-250染劑結合蛋白質後顏色轉變來測定蛋白質含量的方法。當Coomassie Brilliant Blue G-250染劑與蛋白質結合後，其最大吸光值會從465 nm位移到595 nm。利用已知量BSA當標準品與吸光值建立標準曲線，再將樣品測得的吸光值帶入線性方程式即可求得相對於標準品的Taq DNA聚合酶蛋白質濃度。

4. Taq DNA聚合酶活性分析

Taq DNA聚合酶活性分析，係量測其單位時間內，DNA聚合酶引子延伸反應(primer extension)所複製DNA量。DNA聚合酶引子延伸反應係利用M13mp18單股DNA為模板，加入引子及dNTPs進行反應，不同反應時間之雙股M13mp18 DNA產物則以Pico Green雙股DNA定量試劑組定量(Invitrogen，Quant-iT^TM PicoGreen^® dsDNA Reagent and kit，Cat#P7589)。

Taq DNA聚合酶引子延伸反應之樣品反應液(25 μl)包含：2.5 μl10x Tris/HCl pH8.3、0.75 μl 10μM M13(SEQ ID NO：5)引子、0.2 μl 25 mM dNTPs、10 μl 5 mM MgCl₂、1.56 μl 0.2 μg/μl M13mp18單股DNA、8.99 μl ddH₂O，進行反應95℃ 5分鐘，55℃ 1分鐘，暫停取出置冰2分鐘，再加入1 μl 0.005 μg Taq DNA聚合酶，以72℃分別反應1、2.5 及4分鐘後置於冰上，並加入125 μl 100mM EDTA終止Taq DNA聚合酶反應。在不同時間點的雙股DNA產物量，以PicoGreen試劑組(Invitrogen，Quant-iT^TM PicoGreen^® dsDNA Reagent and kit，Cat#P7589)定量，加入150 μl1x PicoGreen混合液，在室溫下避光靜置20分鐘，利用螢光光譜分析儀(Fluorescence spectrophotometer；F-2500)測定，設定其激發波長與放射波長為485 nm及530 nm，來測定螢光強度，利用標準DNA製作之標準曲線來定雙股DNA產物量，並將Taq DNA聚合酶活性單位定義為每3分鐘合成1 nmol DNA。

5. Taq DNA聚合酶比活性

由3.測量之蛋白質濃度與4.測量之活性單位來計算每個酵素之比活性，比活性的計算公式：每μl的單位活性(U)/每μl的蛋白質濃度(μg)=U/μg

6. PCR效率及長片段DNA增幅效率

利用PCR方法，比較每個酵素在不同引子及不同延伸時間下所增幅之最長DNA片段大小，正向引子固定為L30350F(SEQ ID NO：6)，反向引子(SEQ ID NO：7到16)分別為0.5R、1R、2R、3R、4R、5R、8R、10R、12R、15R，擴增之DNA片段分別為0.5、1、2、3、4、5、8、10、12、15 Kb延伸時間分別測試30秒、60秒、2分、8分。PCR反應液(25 μl)配製：2.5μl 10x PCR buffer(1.5 mM MgCl₂)，0.625μl 10μM Primer F引子、0.625μl 10μM Primer R引子、0.2μl 25 mM dNTPs、0.01μg/μl Taq、1.5μl 2ng/μl λDNA、18.55μl ddH₂O，進行PCR反應：95℃ 30秒；95℃ 10秒、68℃(A)30秒或(B)60秒或(C)2分鐘或(D)8分鐘，重複30個循環；PCR擴增之DNA片段以0.8%洋菜膠於1x TAE buffer進行電泳分離，溴乙碇染色，並於UV燈下照相檢視PCR擴增產物的大小。

7. Taq DNA聚合酶PCR擴增反應之鹼基突變率測量

以各突變株之Taq DNA聚合酶進行PCR擴增反應，PCR反應 液包括2.5 U Taq DNA聚合酶、20 ng pUC18/EGFP模板、0.2 μM EGFPF(SEQ ID NO：17)及XER(SEQ ID NO：18)引子對、0.25 mM dNTPs、1.5 mM MgCl₂反應總體積100μl，PCR反應程式為94℃ 1分；94℃ 30秒、54℃ 30秒、72℃ 1分；72℃ 1分，共進行35週期反應，可擴增出750 bp全長之EGFP基因且5`端及3`端分別有EcoRI及XhｏI切位，以EcｏRI及XhｏI限切酶在37℃反應2小時後，經電泳分離及膠純化，得到750 bp全長之EGFP基因。另以EcoRI及XhoI限切酶切pUC18/Taq，並經電泳分離及膠純化得到2.5 Kb之pUC18載體。以DNA莫耳數比值約1：3(載體pUC18：嵌入片段EGFP基因)混合，再加入等量DNA黏合酶緩衝液(TaKaRa)，置於16℃反應30分鐘，EGFP基因及pUC18載體，轉形至DH5α勝任細胞，置於冰上20分鐘，接著置於42℃恆溫水浴槽中45秒，然後放回冰上1分鐘，再加入900 μl LB培養基混合均勻後，平均200 μl塗於1盤LB/Amp平盤上，置於37℃隔夜培養。

在UV燈上觀察並計算有螢光菌數及無螢光菌數，並將無螢光菌種於3 ml LB/Amp培養基中，37℃隔夜培養，抽取質體，以EcｏRI及XhｏI限切酶切割，跑電泳膠，並計算有750 bp之EGFP基因嵌入片段之質體數為有效無螢光菌落數，進一步將此些質體利用引子TD1190F(SEQ ID NO：19)、TD2202R(SEQ ID NO：20)、P2118F(SEQ ID NO：21)定序，計算其鹼基突變數，並以EGFP基因片段大小為750 bp計算其鹼基突變率。

有效總菌落數=有螢光菌落數+有效無螢光菌落數

菌落突變率=(有效無螢光菌落數/有效總菌落數)×100%

鹼基突變率=(有效無螢光菌落數×1 bp)/(有效總菌落數×750 bp)

實例之實驗結果 1.定點隨機突變株的構築及篩選

設計定點隨機突變之引子正向為T1342F帶有AleI切位，反向引子為T2052R帶有NheI切位且在編碼676及677胺基酸位置設計NNM之隨機鹼基可隨機編碼20種胺基酸，N可為A或T或C或G鹼基，M可為A或C鹼基，利用PCR增幅出Taq基因第1342到2052鹼基之DNA片段且編碼676及677胺基酸密碼子為NNM可隨機編碼20種胺基酸，利用AleI及NheI之限切酶與pUC18/Taq質體之相對應Taq基因之DNA片段置換，將其轉形至DH5 α勝任細胞，長出含突變Taq基因之菌株，建立編碼第676或677突變Taq基因庫(圖一)。後續以未加Taq DNA聚合酶之PCR反應液篩選具有DNA聚合酶活性之菌株(圖二)。

2.定點隨機突變株之鑑定

將篩選到有活性之菌株，以引子TD1190F進行定序，將定序結果與野生株比對如(圖三)所示，發現共有5種不同序列菌株，分別與野生株(WT)及本實驗室先前報告M70菌株(專利申請號098115566，DNA聚合酶突變株)相同及另有3株新穎菌株M5、M6、M9此些Taq DNA聚合酶定序結果，其編碼第676胺基酸之密碼子WT株為CAC編碼His(H)，M5株為TTG編碼Leu(L)，M6株為CGT編碼Arg(R)，M9株為AAG編碼Lys(K)，M70株為CAC編碼Arg(R)。編碼第677胺基酸之密碼子WT、M5、M9、M70等株皆為AGG編碼Arg(R)，另，M6株為AAG編碼Lys(K)如表(一)所示。

3. Taq DNA聚合酶比活性分析

將純化之各株Taq DNA聚合酶，取1 μg用8% SDS-PAGE分析其 特性，其結果顯示5種不同Taq DNA聚合酶分子量、完整性、蛋白質量及純度也都相當一致(圖四)。

4. PCR增幅長片段DNA之比較

我們以λ噬菌體DNA基因組為模板，固定正向引子並搭配各種不同反向引子0.5R、1R、2R、3R、4R、5R、8R、10R、12R、15R，利用PCR擴增出0.5、1、2、3、4、5、8、10、12、15 Kb各不同長度DNA片段，可用以測試各株酵素在不同時間所能擴增之最大DNA片段，PCR結果經電泳膠分析，結果如(圖五)所示引子延伸時間A：30秒時WT、M5、M6、M9、M70各株酵素最大PCR擴增長度分別為0.5，1，2，2、2 Kb，B：60秒時分別為2，3，3，3，4 Kb，C：2分時分別為8，10，8，12，12 Kb，D：8分時分別為12，12，10，15，15 Kb，比較各株酵素之增幅DNA長度，如(表二)所示。

結果顯示在任何引子延伸時間M70及M9都有最長的增幅DNA片段尤其在8分時都可增幅到15 Kb DNA片段。

5. Taq DNA聚合酶突變率的分析

以各株Taq DNA聚合酶擴增EGFP基因，並選殖到pUC18表現質體，經轉形DH5 α菌株，塗抹於LB/Amp平盤上，經隔夜37℃培養，在UV盒上，即可觀察到每個菌落是否有綠螢光，可用以評估各株Taq DNA聚合酶PCR擴增反應的突變率。用於估算每株Taq DNA聚合酶正確性的有效總菌落數，WT、M5、M6、M9及M70分 別為1203、1268、1277、1149、1435個菌落，其中有效無螢光菌落數分別為11、30、32、12、18，計算其菌落的突變率分別為0.91、2.37、2.72、1.04及1.25%。DNA定序有效無螢光菌落之質體，定序後發現皆為單點突變，EGFP基因全長有750 bp，計算WT、M5、M6、M9及M70株之鹼基突變率分別為：1.20×10^-5、3.15×1^-5、3.63×10^-5、1.40×10^-5及1.70×10^-5，結果如(表三)所示。

顯示M5及M6株之鹼基突變率分別為野生株之2.6及3.0倍，而M70為野生株之1.5倍，而M9則與野生株相似。

實例總結

本發明我們進一步對Taq DNA聚合酶第676及相鄰位點677胺基酸進行定點隨機突變，並篩選到M5、M6及M9等新穎突變株，發現M9株Taq DNA聚合酶比活性為W17野生株2倍，且可增加長片段DNA(15 Kb)合成效率，此突變株經大量(1L)Taq DNA聚合酶製備，証實其總比活性約為野生株的2倍，總活性產量亦增加2倍，而M5及M6株鹼基突變率為WT野生株之2.6倍及3倍，可應用於高突變之PCR擴增反應。

圖一、Taq DNA聚合酶第676及677胺基酸定點隨機突變基因庫的構築

以T1342F及T2052R引子製備Taq DNA聚合酶基因1342到2052片段，並以Ale I及Nhe I位點與pUC18/Taq相對片段置換。

圖二、Taq DNA聚合酶有活性菌株篩選

將各株菌落直接點在不含Taq DNA聚合酶之PCR混合液，進行PCR擴增反應及DNA電泳膠分析，有產物即表示此株菌落有Taq DNA聚合酶活性。

圖三、Taq DNA聚合酶胺基酸定點隨機突變有活性株之序列

各Taq DNA聚合酶之第676及677胺基酸序列分別為WT(H,R)、M70(R,R)、M5(L,R)、M6(R,K)、M9(K,R)。

圖四、Taq DNA聚合酶之SDS-PAGE蛋白質純度分析

取1 μg純化Taq DNA聚合酶以8% SDS-PAGE分析，其結果顯示5種不同Taq DNA聚合之分子量、完整性、蛋白質量及純度都相當一致。

圖五、Taq DNA聚合酶PCR效率比較

使用λ噬菌體DNA當模板，PCR反應程式，95℃ 30sec；95℃ 10sec，68℃(A)30 sec、(B)60 sec、(C)2 min、(D)8 min進行30循環，以0.8%洋菜膠進行PCR產物電泳分析。引子延伸時間30秒(A)，M6、M9、M70可擴增到2 Kb，M5為1 Kb，WT為0.5 Kb；時間60秒(B)，M5、M6、M70可擴增到3 Kb而WT為2 Kb；時間2分(C)，M9、M70可擴增到12 Kb，M5為10 Kb，M6、WT為8 Kb；時間8分(D)，M9、M70可擴增到15 Kb，M5、WT為12 Kb，M6為10 Kb。

<110> 國立高雄海洋科技大學

<120> DNA聚合酶突變株及其應用/DNA polymerase mutant and uses therefor

<160> 19

<210> SEQ ID NO：1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T1342F引子

<400> 1

<210> SEQ ID NO：2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> m表示a或c；n表示a或g或c或t

<223> T2052R引子

<400> 2

<210> SEQ ID NO：3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P18-5 F引子

<400> 3

<210> SEQ ID NO：4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P18-3R引子

<400> 4

<210> SEQ ID NO：5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> M13引子

<400> 5

<210> SEQ ID NO：6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L30350F引子

<400> 6

<210> SEQ ID NO：7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 0.5R引子

<400> 7

<210> SEQ ID NO：8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1R引子

<400> 8

<210> SEQ ID NO：9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2R引子

<400> 9

<210> SEQ ID NO：10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3R引子

<400> 10

<210> SEQ ID NO：11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 4R引子

<400> 11

<210> SEQ ID NO：12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5R引子

<400> 12

<210> SEQ ID NO：13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 8R引子

<400> 13

<210> SEQ ID NO：14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 10R引子

<400> 14

<210> SEQ ID NO：15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 12R引子

<400> 15

<210> SEQ ID NO：16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 15R引子

<400> 16

<210> SEQ ID NO：17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFP F引子

<400> 17

<210> SEQ ID NO：18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> XE R引子

<400> 18

<210> SEQ ID NO：19

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TD1190 F引子

<400> 19

<210> SEQ ID NO：20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TD2202 R引子

<400> 20

<210> SEQ ID NO：21

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P2118 F引子

<400> 21

<210> 25

<211> 2

Claims (9)

1. 一種新穎突變Taq DNA聚合酶，其第676位置胺基酸為白胺酸。
2. 一種新穎突變Taq DNA聚合酶基因，其編碼之第676位置胺基酸為白胺酸。
3. 一種試劑組，其含有申請專利範圍第1項之新穎突變Taq DNA聚合酶。
4. 一種新穎性突變Taq DNA聚合酶，其第676位置胺基酸為精胺酸677位置胺基酸為離胺酸。
5. 一種新穎突變Taq DNA聚合酶基因，其編碼之第676位置胺基酸為精胺酸編碼第677位置為離胺酸。
6. 一種試劑組，其含有申請專利範圍第4項之新穎突變Taq DNA聚合酶。
7. 一種新穎突變Taq DNA聚合酶，其第676位置胺基酸為離胺酸。
8. 一種新穎突變Taq DNA聚合酶基因，其編碼之第676位置胺基酸為離胺酸。
9. 一種試劑組，其含有申請專利範圍第7項之新穎突變Taq DNA聚合酶。