TW201271B - - Google Patents

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201^71 Λ 6 Π 6 五、發明説明（1 ) f- ),:1 ίί 工 ft- / fi 發明節睡 本發明係關於新穎的免疫試劑且更 的具放射活性免疫試劑而發現此持刖 姐合物及方法。本發明進一步關於新 發明背吾 早在1980年代以前，由多種不同機 能Κ放射免疫球蛋白標的腫瘤存在位 ，"同位素免疫球蛋白在治療方面之 40 ,3001至 7 (1980年 8 證明出腫瘤能將經放射標記一抗體濃 且利用此種經放射標記試劑皆能藉影 如，以咖嗎（7)攝影法（放射免疫 X射線檢法），及治療性治療，例如 的放射活性免疫試劑： 早期之K經放射免疫試劑標的係以 然而，如由S c h e i n b e r g諸位在 ''以共 射活性之金屬蝥合劑進行腫瘤成像" 19號，151 1至 1513頁（1982年 3 月） 艮釘若干問題•特定言之，與盹丨3哼 ；Ί； ；!i inj \ίί ./!ί ；t：5 i-C '1' · ίϊί : 1 ί] /]ϊ ^ ί；ί； 具足夠短的半裒期而能安全地使用於 7牧射對於成俅則太弱：1 3 1 I已迓常 由於肢具艮半较期、a 7放射能反θ 亦已使用13 μ於大脛龆之治桥，叼巧 特定言之，係關於標 有用於治療及診斷像 穎的複合試劑。 構之實驗室内已證明 置（S.E. Order諸位 用途"，Cancer 月號）。1 9 8 0年代， 縮至腫瘤相關抗原上 像而診斷出腫瘤 > 例 閃墚儀）及質子局部 降低腿瘤大小而Μ標 具故射活性_進行= 扼至單株抗體之具故 1 Science 215 中所註明，硗同位素 之描描有關 在三Μ U Ij丨-Vi:放；.Η ί'ϊ 丨1: ii 診斷方而 而1 2 Μ之 ?拽使用丨「I並X理圯， 5收射保Η绌跑ii 對小！Ηί简方而之治給 ;?先閲-讦而之注*卞項洱("木玎) 本紙張尺度边用中S S家丨ί甲（CNS) Ή規W (’2丨〇 X 297公]i:) A β η 6 201271 五、發明説明（2 ) 卻無效。此外，由於经玫射碘化抗體具快速代謝作用而容 許將碘併入甲狀腺内且藉著胃及尿道而積極排泄碘。放射 活性碘之分敗作用干擾特殊腫頫成像，因為腫瘤受到背景 輻射所遮住。 除了以具放射活性抗體標的腫瘤用以診斷（腫瘤）成像 及治療性治療方面Μ外，已完成類似棵的而用於診斷梗塞 成像，詳细言之，心肌梗塞，而Κ使用抗體至拘心肌球蛋 白（khaw諸位•抗體對狗心肌球蛋白絪一111 ~二伸乙三 胺五乙酸之心肌梗塞成像術〃，Science 209 ，295至7 (19δ0年7月），且用於粥狀動脈硬化成像而Μ標的粥狀 動脈硬化斑。使用具&射活性碘於診斷梗塞成像方面之缺 點如同用於腫瘤成像及治療性治療方面。 已知"I η可與聚肢基羧酸複合，如伸乙二胺四乙酸（ EDTA)及二伸乙三胺五乙酸（DTPA):然而，ϋ活化羰基 醯化、芳香族重#偶合或溴乙醯化所完成而將蛋白質（抗 體）供價链接至這些複合劑上係不足夠的’即便產生Μ由 8「6(^1^61諸位在、'合成1^?6及£0了4之1—(對一-異硫氰 酸根苄基）衍生物’抗體標記及腫瘤成像研究"， [no「g. Chem_ 25 ’ 2772全 81 (1986))中所說明之異氣 ^消部屮火^^;0u r·消印^ 故Κί ΐ丛奶虫构亦n助於出Lj贤ίλ!设i r㈡行卜；奶接續 最近，諸多研究努力已指向改良抗奶（A b s )，例如， 單株抗鸦，用於再一性標的之再一性抗奶·與收射.核索釭 接複合或结合之抗93 ^較佳者偽牧射核名及代與抗S3和S 合試_之结合物"已完成其些1企丨袖即針針改良构合試劑 9.01271 Λ β Β6 五、發明説明（3 ) 但是，EDTA且詳细言之，DTPA及 複合劑共價结合抗體上並且配位複 。然而，例如，由Parker諸位在* 當處已有註明，即"實施用於腫瘤 Pure and A p p 1 . Chem.，&_L，第 9 •已將傳统的金靨放射核素複 例如EDTA或DTPA)，而係將彼共價 劑係合宜的因為金鼷在活體内傾向 位在合成在動力學方面係後定釔 其衍生物仍 合至金屬糸 下列文件中 標記之巨環 號，1637至 合而Μ非環 鍵合至抗體 於解離" 維持將一般 放射核素上 對DTPA不妥 共轆抗體" 41 ( 1 989) 系螯合劑（ 上。無蝥合 且由Cox諸 (請先閲1?背而之汶惡卞項外t夂木钉) —90標記之巨環一抗體 共轭物" Π 〇 m m u η 釔一 90在治療方面涤一和頗為吸引 方面之用途極為有限，因為對 Υ從抗體連接蝥合劑如二伸乙 J97 至 8 ( 人之同位素 骨越具毒性 三胺五乙酸 1989) …但是彼在 ，源自酸促 (DTPA)中 臨床 進 釋離"。 由於所提供材料具有其缺點而限制對複合劑之改良°例 λ' 平 J-：i Π r 消 ί\·η： 印 1.1 如， 促成腫瘤成像 至6 ( 1 989)中說明了巨環糸六配 此榷趨勢之缺點為於抗體共轭之 m Η (·ΐ) ir ii'i -r ϊΐ 3 7 c ί· 搮記…，因此將其它三鹽基系Η Μ 使彼等在溫和條件下（2 0 t：，pH 5 结合姻，而在活S3内於動力學上仍 然而•若配位艄濃度係10微铐η濟 C h m . So c . 裏己的巨環一抗體共扼物 r η ρ m . π u...... , 7 9 4 位之配位體，但描述了 前需要將1 1 1 1 η標記巨 Μ快迚出丨旮玫址行放射 雜臣環糸配位艄蒒選而 ，< ].小時）具有快速 能肜成磘定的极合肋·-_ 咩，⑴丨怦⑸說明有效’ 本紙?fc尺度边用屮H S家樣ίΜCfJS) 規烙Γ·! 1 〇 X 2lJ7公甘） 201271 A 6 η 6 五、發明説明（4 ) 今ί1 ·«*/ *.ϊ·Γ 部 t 央 I if. •T' i f- Π r. >/] fi' / l > if M' 且在這些條件下，測出故射標記產率為96% ( 30分鐘* cH5，20t： ) ·，。 但是，30分鐘仍然不能令人滿意的。掻需要具有優於 EDT A及DTP A之複合劑而能配位结合較佳的放射核素如In、 Y、Sc、Ga、Ge、等，而在若干分鑌內，即小於約5分鐘 内•而直接於投藥試劑至病患之前*詳妞言之•若於治療 病患之時，短期放射活素必須從具長期放射核素產生。 應註明銥複合體，一種較佳的放射核素，與傳统複合體 方面，傾向於比絪較不g定（Mathe「諸位，釔90標記 單株抗體，、、Eur. J. Nucl. Med. 15 ，307 — 312 ( 1989) ) 。Mather諸位教示在癌症病患中使用放射搮記抗 體之生物分佈研究中，已提議釔一檷記抗體之在活體内德 定性不如彼等111 I η —標記之相對物之大且由在此範璘中 之其它最近刊物支持這些發現。 若將螯合劑共價结合至蛋白質（Ab’s)上，則蛋白宵通 常能夠接受遠超過一個蝥合劑分子，因為彼等含有一祖胺 及硫氫基而經由此结合著蝥合劑=決定有多少蝥合位置结 合至每一個蛋白質分子上經常是極為重要的7完成此之最 方便方式係销著光譜工具。然而，先前技玆蝥含劑及其努 G物所具光譜你與ία些钌則的詉口 Π山齒，丨i以分析驹& 每分子蛋白筲之蝥合或蝥合位fZ之數目係不可能以光靖$ 成，因為里β光譜互相罩位：極理想方式係捋到用·以托_ 至蛋白質之毡合劑.而其光諶及金觸沄物光諶Μ不與釘夠 合劑行化學结合之蛋η筲之光譜相？η »· in 先 ifi 背 \Γι； 之 注 意 項 hj 木 頁 未认张义 + 家诈 iMCHS)lM«UM；n〇x297 公,ϊ) 201271 Λ 6 Η 6 五、發明説明（5 ) • .V ，.河 屮 J,IK •u: Y- J··! α r. -»'i ί丨， /. v. I 泎 fl- 丨屮 某些 素蝥合 形成係 使用之 合塔( 的蝥合 蝥合劑 還原之 射核素 則持定 括運原 缌而 用故射 應性蛋 及標的 1 )毒性 4)用以 5 )與金 ιτ-fc： Cl Μ 、時…] Λ .:成共 骷试劑 先前技藝 劑之前， 在形成放 還原劑可 Tc)及铼 劑必須Μ 之前活化 前形成， 複合之前 言之，用 劑之活化 言之，用 標記抗體 白質上， 治療方面 ;2 )由於 製潜共扼 屬慢速複 或pH方面 1¾ ii3 ii ；)\l :且9 )若 摘Mt 组成物 必須Μ 射核素 降解蛋 (Re) 還原劑 蝥合劑 則還原 能與蛋 於T c及 步驟。 Μ製得 及蝥合 且至其 係遣受 快速代 物方面 合；6) ;7)直 M Itl' fr 不以活 之其它 運原劑 蝥合劑 白質。 複合體 (二硫 。若含 劑能降 白質形 Re之蝥 免疫反 劑係藉 放射核 某些持 謝而分 ，與蛋 不穩定 到所需 ；8 )不 化步驟 問題係 活化之 之前， 例如* 至金鼷 蘇糖醇 二硫鐽 解蛋白 成共轭 合劑於 蝥合劑 。若蛋 則用Μ 經由含 上所經 )而於 之蛋白 質。若 體，則 複合之 於形成 白質共 活化複 硫基而 常使用 形成放 質共扼 蝥合劑 係極為 前並不 放射核 鈪物之 合劑所 用Κ複 之較佳 射核素 體係於 於與放 所需， 需要包 應性共軛物所使用之各種常 將Μ合劏共價结合至免疫反 素複合體上供用以診斷影像 定之下列缺點： 散試劏；3)不當放射特性； 白質不能充份共價鐽结； 的金屬複合，例如關於溫度 要之金.阐複合為[h ，m不能 能以兄S分诉技忐迓ήΓ (此分降解街白舀）刖不能 我們已發規標的具玫射活性免疫Κ劑能解決h所討論先 本V.法又/ί边用中a a家桴iMCNS) f Ί規岱（21 〇X297公.ΐ) (請先閲-背而之汶-市項再{^木頁) Λ 6 Π 6 201^1 五、發明説明（6) 前技藝之問題。標的本發明之具放射活性免疫試劑包括金 屬放射核素離子、一種複合劑而衍自吡啶、聯二吡啶、聯 三吡啶、聯四吡啶、聯五吡啶、聯六吡啶或菲佐啉，及一 種具免疫反應性基而經由蛋白質具反應性基共價结合至複 合劑上= 更特定言之，根據本發明所提供係： 一種標的具放射活性免疫試劑，包括金靨放射核素離子 、複合劑、及共價结合至複合劑上之具免疫反應性基，複 合劑具下列構造： (請先閲-背而之注-卞項#1^本玎)

$ R，代表氫原子、烷基、烷氣基、烷硫基、烷胺基：烷甲 I §§胺基、芳基、芳氧基、雜環或蛋白質具反®性S ; ΐ R1代表氫原子、烷基、烷氧基、烷硫S、烷胺基、烷甲 厂、

·. I ;'ί: .

!L 印 II . 本紙張尺度逋用中S Η家桴iMCNS)甲Ί说仿（2丨0 X 29'/公甘） 01C71 A β η 6 五、發明説明（7 ) 醯胺基 R2代 二乙酸 此類酸 需之原 含有一 R3代 藤胺基 R4代 η係 〇係 m係 但是η 係蛋白 吡啶 、芳氧基、雜環或蛋白質具反應性基； 、羧基、羥烷基、羰亞胺二乙酸、伸甲亞胺 硫伸乙基亞胺二乙酸、伸亞聯胺二乙酸，或 ，或二個R2基在一起而代表完成巨環構造所 此巨環含有至少一個雜原子配位位置且至少 二個較佳之伸烷基而形成環構造之部份； 子、烷基、烷氧基、烷疏基、烷胺基、烷甲 、芳氧基、雜環或蛋白質具反應性基； 子或蛋白質具反應性基； 、芳基 表羥基 、伸甲 之鹽類 子•而 個而以 表氫原 、芳基 表氫原 0至4 0或1 0或1 ; 及m至少有一種為0且R 質具反應性基。 類具有下列構造 R3及R4之至少一種 (請先閱讀背而之注-事項4{"木頁) A-11

R 3 ,1

R2 K 屮 央¥Π Γ— 'Vi fr /、 l »W- 其中R 1、R2及R3i系如上所界定： 聯二吡啶、聯三吡啶、聯四吡啶、聯五吡啶及聯六吡啶 ¥ 類係具有下列構造 11 201^71 Λ β Π6 五、發明説明（Q ) Α-ΙΙΙ

R

R

// N 、 有 R1. 具 、 啉 R 〇 佐 中4菲 其或

A

R 3

2 — R o 係 n 且 定 界 所 上 如 係 3 R 及 2 3 (請先間-背而之汶-市項孙广朽木頁) t

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IV 本紙張尺度边用屮S S家桴iMCNS) f 4規岱（210 X 297公:.y：) 201271 Λ 6 Η 6 五、發明説明（9) 構造較佳*其中至少一倨R4係蛋白質具反應性基。 本發明又提供治療及診斷姐成物，包括上述棵的具放射 活性免疫試劑。 本發明進一步提供在病患身上某一部位影像之方法包括 a)將有效量而能標的此位置之上述具放射活性免疫試劑投 藥至病患身上，且b)M從標的位置所放射出之辐射來成影 像活化對辐射一敏感之元件或装置，如底Η或電子感想器 (請先間¾背而之a*市項朱妁木玎) 濟 .郎 屮 央 X ti' t» 作 根據 有效置 試劑及 樣品上 本發 較低毒 本發 分散無 其它 物分子 仍屬 I ί •·Γ 奴 Η'Γ 此外 所要之 之活化 此外 本發明用Μ 之治療姐成 其Β藥上所 0 明有益持徵 性•例如* 明標的免疫 不利影W。 有益特遨為 形成共價鍵 本發明之其 •i ..t· j f ( I-·t ^ T T .，·- · λ·：ί J-i (ii ί'ΐ •可將複合 金騙複合為 步驟為止： ，複合劑與 治療在病患中疾病位 物包括上述能標的位 容許載體*而投藥至 為所説明標的具放射 與其它具放射活性釔 試劑之有益特徴係不 置之方法，包括將 置之放射活性免疫 病患上或從病患之 活性免疫試劏具育 蝥合劑相比較。 能快速被代謝且對 所說明複合體能有效與蛋白筲及其它生 它有益持徴為所說明之免疫試劑具有良 * · < . > - · \ I · ‘二 ，，， | ,— 111： Π 7t η,'ι 〇ϊ ίΜ 削之蛋白贸共妮物形 止R完成报合而不必 成fl貯存釭到诖成 利用β降解領白Η 金》4快速梅合，Μ所得努合劑關於時間 201^71 Λ 6η 6 五、發明説明（l〇) 、溫度及 若依照 了解本發 附騸簡述 出方面具有極佳穩定性。 附圈詳讀且參照下列較佳具體例說明•則很容易 明之其它有益持徵。 圖1描 免疫試劑 檢定。 圖2描 劑及未改 圖3描 疫試劑） 圖4描 試劑）及 述 B72.3-THT-SC — * ( )、B72.3-THT 共軛體 本發明之一種具改射活性 及未改良B72.3之免疫力 述B72.3-THT共轭體、二種B72.3-TMT共扼體製 良B72 . 3之免疫力檢定 述 B72.S-TMT-111；^ ( 及 ΒΤΖ^-ΟΤΡΑ-111^ 之 述 Β72·3-ΤΜΤ-βοΥ (— B72.3-DTPA-aoY之生物 圖5係殘存曲線，即用於低劑 一天接搔後，每天殘存小白鼠之 一種本發明具放射活性免 生物分佈研究结果。 種本發明具放射活性免疫 分沛研艽结果； 量療法及高劑最療法之第 數目- (諸先閲-;'*?背而之汶*市項\.,^木頁) .¾ :!Γ. 屮 央 1；Ά 大·)

Vi (ϊ.,,- 作 ft 印 圖6及 較样具 唼著說 矜斷影像 .¾役I丨式站 本發明 由蛋白質 袍合劏 啶、聯四 7 係 TMT 、TMT-Y—及 TMT-Pb 一光譜 明偽主要關於標的具放 姐成物及方法中之用途1¾ u ;υ μ ir an ^ m m 免疫试劑包括金屬放射 具反想性基共價粧合至 係下列物锊之衍生物： 吡啶、聯五吡啶、聯六 射活性免疫試劑在治療及 ，此外，搮的具畋射活性 如政4丨龙以7丨+? ‘小· ^阳 核漭離孑、複合劑、及姓 複合劑之免疫反應·基。 吡啶、聯二吡啶、聯三ρ丨上 耻啼戌菲佐啉，而只'其冇 201271 A 6 Η 6 五、發明説明（1;L) 在上面 在式 Κ含1 基、丁 六综基 於上面 係含有 ，烷基 :烷甲 20個碳 約20個 基、胺 摘要說明所述構造式Α — I者較 氫原； 甲基、 A — I中每 至約20個碳原 基、第二丁基 、十八燒基， R所述之1至 如用於上面R 部份含有如用 醯胺基 > 烷基 原子者；被取 碳原子較佳| 笨基、十六焼 種R單獨為 子較佳，如 、第三丁基 等；焼氧基 約2 0個碳原 所述之1至 於上面R所 部份含有如 代或不被取 如苯基、萘 胺笨基、十 甲苯基、甲氧笨基、3 —胺呈 、2 — •而综 子者； 約2 0個 述之1 用於上 代芳基 基、菲 八烷胺 4 -—中 佳。 直鏈或側 乙基、丙 乙己基、 基部份涤 烧硫基· 碳原子者 至約2 0個 面R所述 ，而以含 基、硝笨 笨基、甲 氧笨基、 鏈烷基· 基、異丙 癸基、十 含有如用 烷基部份 ;烷胺基 碳原子者 之1至約 有約6至 基、羥苯 苯基、二 4 甲氧 基一3

(N 甲基聯胺硫代甲醯胺）笨基、3 —異氰 根一4 一甲氧 硫笨基 上面R ，而以 ，如吡 ΐ:ΐ啤 屮 央 -Ι,ί J··! 'll· ΐ)：· fl· 印 、羧笨 所述之 含有5 啶基、 -叫：[丨坐 尤佳具體例 3 —異 裡R 1單 筲具反 ti - %蛋白 苯基、 基及烷 1至約 至6個 甲褡吡 I* · i'll 中，R 硫氰酸 獨選自 3 —異硫氰酸根一 4 一甲氧笨基、甲 基，烷基部份含有如用於 ;被取代或不被取代雜環 子如N . S ，P或0較佳 吡啶祛、甲氧《吡啶荜、 芳基如烷苯 20個碳原子 核碳及雑原 啶基、硝華 根笨埜· ©指明用 R之 表蚨張厂、度通用中S S孓找iMCHS) T4WlM210x297公迂） 201iL7i Λ 6 W 6 五、發明説明（12) 每一種R2單獨選自羥基；羧基；羥烷基，烷基部份M含 有1至4個碳原子較佳*如羥甲基、羰亞胺基二乙酸 [-C0N(CH2C00H)2];伸甲亞瞭二乙酸[-CH2N(CH2COOH)2] ;伸甲硫伸乙亞胺二乙酸[-CH2SCH2CH2N(CH2COOH)2];亞 聯胺二乙酸，如1 一亞聯胺一2 —基二乙酸 [1(^((^2(：001〇2]且 1 -甲基一1 —亞梅胺 酸[-N (CH3) 或此種酸之 )所形成酸 銨鼸類。或 原子類而包 N(CH2COOH)2];且 2 鹽類，包含例如此種 之金颺鹽類且銨鹽類 6 —二羧 者，二 含（a>至少一種 至少一個（而Μ二 金靨類（如 如铵鹽、四 個R2基在一起而代表完成 子之雜原子 )並形成部 環形成基可為雜原 )一 1 ，3 —伸丙 如氧代雙( 雙（伸乙氧 伸乙基 合伸甲 伸乙氧伸甲基；伸 甲驻一 5 ，6 —伸 ΫΛΙ) ' iV /【.ί '1，央 厂；π广 χ'ίf.'- /ifΐΐ 雙（伸甲氧 :i:: S ί 相1 ψ Ψ.(伸甲氣 Ψ埜） 伸甲褡 紅伸Ψ 伸甲越 個伸烷 子取代 基；或 )、氧 基）； 芳基二 苯雙( );2 Μ ) ΰ. ):梭 用於雜 基較佳 伸烷基 含雜原 代雙（ 伸馆氣 (氧化 如2，2 子基如氧代 伸乙氧合伸 伸烷氧伸烷 伸烷基）， 氧化伸甲基 一甲氧 cy —2 — 基六氫 納、鉀 乙銨鹽 巨瓖構 配位置 份環構 雙（乙 雙（伸 甲基） 基，如 如1 ， ，6 — —1 ， 1 -ίο- !;m: |財 2， 甲亞胺雙（三伸甲坫梭甲 -c II 2 H ( c H 2 C 0 0 H ) ( C Η ^ ) 3 N (C IL> C 0 0II) - ( C il ·^ )：, Η2 - i ;梭甲硫乙基亞胺.M w (二伸Ψ垆琦 基二乙 吡啶基 、鋰等 及四甲 造所需 ，且（b) 造。巨 氧羰基 烷基） 、氧合 伸甲氧 4 -二 伸吡喷 —伸 ύ Ά 亞胺伸 N ( CII 2 C 0 0 Ιί ) 甲碲乙站ft Λ 6 Π 6 201^1 五、發明説明（13) (請先閱請背而之注-卞項#-^.6木玎) 伸甲基） [-CH2N(CH2CH2SCH2C00H)2(CH2)3N(CH2-CH2SCH2C00H)2-( CH2)3H(CH2CH2SCH2COOH)-CH2-];羧甲亞胺雙（伸 $基羧 甲基亞胺伸甲基） [-CH2N(CH2C00H)CH2CH2N(CH2C00H)CH2CH2N(CH2C00H)CH2 -];羧甲硫乙基亞胺雙（伸乙羧甲硫乙基亞胺伸甲基） [-CH2N(CH2CH2SCHzC00H)CH2CH2N(CH2CH2SCH2C00H)CH2 CH2H(CH2CH2SCH2C00H)-CH2-];伸乙基雙（羧甲基亞胺伸 甲基）[-CH2N(CH2C00H)CH2CH2H(CH2C00H)CH2-];梭甲亞 胺雙（伸甲基）[-ch2mch2cooh)ch2-];含示範羧酸基之 鹽類，包含例如上面用於R2所說明酸類之金靥及銨鹽類。 在尤佳的具體例中，R2涤伸甲亞胺二乙酸或其鹽。 每一種R3單阖選ϋ專指明用於R之II，： R 3 Μ代表鉍原+ 較佳。 每一種R4單獨選自氫原子或蛋白質具反懸性者： 在上述式A — I中，η丨条0 、 1 、2 、3或4 ; m ί糸0 或1 :且〇係0或1 :但是nam之至少其一褪為岑： R 、R 1、R3及R4基所存在之至少一種像蛋白K具反®性 Μ。在每一棰芳番環中Μ具有不超過R 、R1、R3^R4坫之

Wl 1¾ in iiii ιίL· !；；： · Hi m i—:] Π U ::〈；:」：Π: Vi i；：/ ii： «ί i，'i： y/ 夾 i 1f> •I'/·* f X·, ii »· i'i- /.. ti 汴 ；κ 印 子中M R 、R 1、R 3及R 4 41之其中唯一沌為氓白芭H反魅砝 j ·

所澍 > 迓白質1¾反®越〃 sm仔Μ沾而能與典ϊί在® p 上所見之任何官能基。然而，持別拟期可將此柿岽A 11 201饥 Λ It 6 五、發明説明 (14 ) y(n 十火cv,i ¾ 具反應性 明實務中 反懕性基 蛋白質而 較佳的 種基而與 ，而此種 包含例如 一移除基 一氛化羰 ;異硫氰 被活化醯 傳统照相 有具免疫 含有具免 如在上面 ib成為醛 烷胺基、 二胺脲葙 ϋ fcii !'ji 基共扼 之蛋白 之任何 介於複 蛋白質 在蛋白 分子含 氯甲苯 取代之 基；乙 酸根； 基如鹵 明膠硬 反應性 疫反應 ⑴中所 或竣酸n mm 、腺胺 Μ； ' iiii 至非蛋 質具反 生物分 合劑及 具反應 質或生 有免疫 基及氯 乙磺醯 烯磺醯 醛；氮 化浚酸 化劑之 基之經 性基之 提這些 1其中 、聯胺 辖、硫 白質生 應性基 子起反 免疫具 性基係 物分子 具反應 乙醯基 基及乙 基；乙 雜環丙 類；混 其它基 改良蛋 蛋白質 具反應 ''蛋白 基、烷 代均二 沾、 物分子上 包含這些 應者，抑 反應性基 選自下列 上之胺或 性基•例 。因此 基而能 或生物 之間形 但不限 氫硫基 如含具 [Cl-CH2-C〇-] 羰基如2 烯羰基； 烷基；丁 合酸酐類 類 β -· 白質或生 或生物分 性基•例 質具反應 基聯胺基 胺腺《 、 一氯乙 乙氧基 二醯亞 等；及 湩基而 物分子 子而迓 如，藉 性基ί条 、芳基 豚胺 有用於本發 與含有免疫 分子係一種 成鐽接基。 於此：⑴一 直接起反麽 活性氫基* 迓被活化2 磺醯基及2 :異氰酸根 胺氧羰基； 已知有用於 很容易與含 起反應，即 改良使含有 將蛋白質氧 選自胺基、 聯胺基、均 褚、氡硫瑀 ί-i )j - ih $ 於9抟 1用此！S 之加將或 述ri能， 所&而 t R 份¾T-而 r=砘分 匕诘 一¾ 用之 戌 Π 仁-二 i> I Τ*τί. 有性原白 含應碳蛋 份反個之 部！Ιί20® 笹質約性 烷甶至嗯 之IS6 反 基 ο 約疫 性子之免 ® 原述！IT 反碳所有 ft個 R 含 过20面至 白约上传 表 汰又度Λm S ΐ揉肀（CNS)HUM21 〇X297 公 Ji：) •π 先 閲 ifl 背 而 之 注 市 項 h 木 η 201271 Α β η 6 五、發明説明（15) 至在 聯劑 雙環 白質 交聯 终共 劑而 部内 二陽 。能 且其 ，然 蛋白 胺鐽 為能 複合 不具 白質 尤 .1.. f- ί\ r 费 /.. I t 忭 上面⑴ 。某些 氧化物 、複合 劑係有 轭體中 如在美 容於此 離子醚 與這些 它種係 後裂開 質及具 结，此 避免類 劑與複 選擇性 具反應 佳的複 Β—1 R1 及⑵中所註明之經改良蛋 特定有用的交聯劑，如二 及雙異氰酸鹽類·於交聯 劑共扼體中鐽接基之一部 助於交聯例如作 。此種交聯劑之 國專利第4,421， 併於本文供參考 類，所揭示之全 交聯劑起反應之 胺或锭基。交聯 ，而於'經活化 有上述構造式A 因而將二部份形 似分子之交聯· 合劑之交聯，然 旦所得到者係非 性基係包含胺基 為耗損性 例係羰二 847中所 ，及美國 部内容亦 其一種反 劑首先選 〃羧基與 一 I之金 成共價鐽 例如蛋白 而，二官 所肷之羥 及異硫氣 1至58類 白質而以使 官能基明膠 反懕期間， 份。然而， 觸媒，且不 亞胺及铵甲 揭示者，所 專利4 , 8 7 7 , 於此併於本 應物係必須 擇性地與羧 胺反應期間 屬複合劑之 结：此種方 質與蛋白質 能基交聯劑 交聯分子 用一種交 硬化劑、 寒成在蛋 其它有用 存在於最 醯基交聯 揭示之全 724號之 文供參考 具有羧基 基起反應 ，在介於 開形成醯 式之S點 之交聯或 之反應係 尤佳的蛋 (請先閲請背而之注&卞項外ί. h木ϊί)

R 合劑包含下述之 R3

R R'

E —CH--N(CH2C00H)^

鬌- V 一OCK- Λ β Η 6 201271 五、發明説明（16) 在全部羧基（-C00H)中之氫原子可Μ金屬陽離子或銨陽 離子取代。 ** 全部 ΝΗ2 基可 WNCS 或 NHCSN(CH3)NH2 取代。 ?先閲請背而之注意卞項k "木^) -:!Γ' 小 k i；；s- % 本边用中S3 S家丨規岱(JlOx：：·)·/公坫） 201X71 Λ 6 H 6 五、發明説明（L7.) 2. li

2個R2在一起為 CH2COOB —CH〗-】卜(C丑2.2 I CH2COOH

-OCH

^NH 2 3 q-CE2cooii 3.

H 2個R2在一起為 CHoC00H I 2 , —CH2-1^-( CH2. CE 2—N- ( CH^ ) 3 CH2C00n

^-CH2C00H

-OCH

» ^NCS 3 屮央榀平XJn.LAfr八：：

；CH2C00H —K—) 〇 2^-CE2C00H

2個R2在一起為 Η ' —CH2 -*CH2—N—( CH2 ) 3 ch2cooh

木紙尺度边用中阈S家诈iM c N S) τ <1規岱（21 ο x 2 9 v公没） -;ν -¾ 201L71 五、發明説明（18) 6. Η Η

H 2個R2在一起為 -OCR.

CH2CH2SCH2C00H n-ce2ce2sch2cooh

CE2CH2SCE2COOH 2涸R2在一起為 CE2CH;SCE2C0Cm —OH?—(CH? OH?—1卜（匸丑2 .

；EnCE2SCH2COOB ce2ch2sch2co〇3 2個R2在一起為

-OCH 3 (請先閲背而之注*节項孙(.¾木IT)

Ncs -OCH,

XimC-N-NH2 -ch2-n-<ch2^_ce^ce^ch^c〇〇h 1 1ce3 -CH2-N-(CH2)3 ^

CH2CH2SCE2C00H 訂_ 23 201^1 ：·ι* 小 央 入:】 消 fi, / 作 fi. 五、發明説明 B-2 •—番、〆 > '=〆

y*_X

Nvn=*

V 8.

R ,2

·% ^NH ---OCH3 2 •--OCE. ^cs 10.--^ •__„—ocn' ^TEC-U-^2

"I S CB3 本A掁尺度边用中S a家堞準（CNS) T 4規tM 210 X 297公丨1:1 -CE7-iKCH2C00H)2 -CH?-IKCE2C00B ) 2 -CH2-IKCH2C00H)2 (請先閲讀背而之注-卞項^^木頁) 24 201-71 五、發明説明（2d * -——OCS-； 2 Λ 6 Π 6 2個R2在一起為

12. -·〆 ^--〇CH? * 2個R2在一起為

'CH. l2 CE2〇〇〇E

：CH 2 2 ®R2在一起為 13

,/ x.-OCH^、·一./ 3 ''"'ITHC-N - NHI! I s C1U 2 ：CH, 'CIL, 央 fr fi 本張尺度边用中S ®家從CMS) T Ί現岱（2川X297公ft) -€Π C00H HOOCCH^^I''-, CB.

五、發明説明（21) WD、t^/ HOODeEo^H^HYACJov-m q /-cvihhs^hoooc}» ^oxv/^wo, H00^sso4H0c43

Λ 6 Π 6

HOO^HHW HQSNanHD-

7 -濟郎屮火^;itx';uu;i,i卟八：汴-卬^ PHI, *=·Έ。。ζ w·—-二 so尸 • Π « 'so--ζ )-- θ/rs 丄 se, <Nv'c,H:^s^s:>〇onw/. = . HOScvlEOSt.rH.Ho (請先閱讀背而之注*事項/!->*>.,木玎) ¾.....π....線.

woo-//-\v·---9X -5

五、發明説明（22) R 17. nnh. "2 -0¾ SCH2CH2N ( CH2C00丑）2 18.

—OCR^ ^NCS -ch2sch2ce2n(ce2cooh>2 9 //

2

Ho oc 2 Hc /(\ N 2 Hc 2 CH s 2 H 2 (請先閲讀背而之注*卞項外1,>,木If) R.

X

3 - B / J 2 \ //i #-·3/ > 3

2 R 20 上 • — *

R R、 -〇CH* B —() N ( CH2COOH ) 2 Η _ p --5 i 1. I — -¾ 21 .

—OCE 3

H -CHoN(CH?C00H)2

H

^___Od Ii —N ( d :) 1“' CH,) COOn ) 0 H / ^ j : -- “ ^C-S 夂从汝又度边用中闹S家ii爭（CNS) 規岱（2丨ΠX2(J/公甘） 2Ί 201^1 五、發明説明（23) ,3 23. 上 ·〇·_^0C '=.^NHCIL s

Β -N(CH〇)N(CH2C00H)2 η 24.

OCHg、=<^CS Η -CH2^CCH2

COOS)2 H (坊先閲1?背而之注*市項再(.>,木頁) 25

E -ch2n(ce2cooh)2

H tv nr · 26 ·

v / 0CE3 H

2i@R2在一起為 CB2C〇〇H -CH2C00H CH2C00H -CH?U2CH2 > -CH〇-I'-<::B2_CH2

E

II 27 . 、cs‘ 2 闊 R27T: 一起. CH?C〇〇H 1 一 -CH2-1'-CH2CH2n T：

- CHr1卜 2 ! 一 GUCOOH

I】-CH2C00H ，价A-:" 本尺度边用中® S —iMCNSHM規tM21()x297公甘） /.η Ιΐ： \ι ι\ ϋ-- ff ί!' 201^1 Λ 6 η 6 五、發明説明（24 )

R

R R- 28. 29. 30. 31.

—OCH 3

H 2個R2在一起為

E

^NHC-NII I S CH

CH2C00H 3 —-OCH - 〆 :

E A2

—OCH

NCS CH?— CH2—N-CH2

-CH2COOH 2

CE2C00E 2個R2在一起為

CH2CH2SCH2C00H -CE2 — N-CE2_ -CH2-N-CH2»CB2

-€H2CE2SCH2C00H

CE2CH2SCH2CO〇H

E (請先閲請背而之：>.F-*市項再t ΪΓ木π) 訂 3

H 2個R2在一起為

CH2CE2SCH2CO〇H

^-CH2CH2SCH2C00H CE2CE2SCE2COOH —CH^-N-CE £-Cli 2

H 線.

-OCH^ / ό 'fflC-N-KH

IL 2 3

E 2個R2在一起為

CE〇CH〇SCH0CO〇H r .. -Cfi〇—N'—CH〇—Cti- •^-ci；2ci-；2sch2cooii ch7ch?sch7cooh 未y泣尺度边用中a ffl ίΜCNS)，ΓΊyifM210x297公甘） 2 9

H V. 201^1* Λ fi Η 6 五、 32. 發明説明) 2個R2在一起為 -OCH.

E

H

^NH 2 λ ch2c〇2h ch2c〇2h o- R. 2 、=·ς2 (婧先閲^背而之注-事項^匕木頁) 33. 34. 35 . 36 .

一iXXlg -NCS CH〇i 3 —ITHCN—师 IIs -ΝΉ, -CH2-N(CH2C00H)2 -CH2-N(CH2COOH)2 2 -€H -N(CH2C00H)2 2個R2在一起為 1 (eoocch2)-i〈 .CH,

1-CH2C00H C& CCV 2

Ci：2C00H 本泜汰八度边Ji]中围阁家 2〇1ώ^1 Λ 6 15 6 i、發明説明（26 )

37. -«CS (H00CCH72 2個R2在一起為 、

-CE2COOH 2 c

丄2

CH2COOH CH. I ' 38. -KHCN-iII s 2画R2在一起為

2V (請先閲,·*?背而之注意市項外本ΪΤ)

39. -NH 2 2画R2在一起鴻 χ£· (H00CCH2SCH2CH2)-<」 ^-CH2CH2SCH2C00H i /Cfi7 :.;V· t Ιΐ： -f- J，:i ίί Γ. ；Vi iv f)-

Γ WCH?COOH 201/71 五、發明説明（27)

40. -NCS 2個R2在一起為 (HOOCCE^SC^CEz )-]

-CH2CH2SCE2C00H 2

'2

CH2CH2SCH2C00H

CH (3 41. -NHCN-NH2 2個R2在一起為 -•n先間-背而之注^卞項洱(，：木页)

-CH2CH2SCH2C00E (H00CCH2SCH2CH2)-n( 2

CH

CH2CH2SCH2COOH

5 - B 2 *·- R /// / \ // y \ /> / « · 1 一| • κ 1//XX 2

R

R

R 2

H 央 ;lc- 人:1 Π Γ- 'ΐ* /.·! fr Λ_ij: fl.nr 71 >-0CH_5

ICS -C1I〇-K(CH?COOH)2 _CBq-IKCH2C00H )2 表紙汰尺度边用中围困家^iMCNS)lMyUS(210x2(jr：uM/> tr cl120 6 6 Λ:

五、發明説明（28)AA· -% >~°CE3 • — ♦^NBC-N-II IS CH

E -CH2-N(CH2COOH)2 3 45.

-OCE 3

H 2個R2在一起&

NNH

COOH 2 /CH \ 2-^2

CE2C00H (請先閲1?背而之it-ίν?事項#木1() 46.

-OCH 3

H 2個R2在一起為

Ntcs

CE2COOH

,ch2-n-ch2 'CH?~N—CE，2 CH2C00E

-OCH 3

H 2画R2在一起為 'nhc-n-nh, II I ‘S CE〇 CE^COOE I 2 ^CH 2 >：(；1 Ή 「丨 Ψ Ιί α Γ_ 消 fi' fi- f i. 丨f . ^8.

•一OCH 3 CH?—N-CEg ch2cooh

II 2個R2在一起為 CH^CE.SCKoC00H I 2 L· I CH。一I;-CH,：2 1 - "ck9-n-ch. ch2cr2sce2cooh 仁紙怅又度边用十围H家檁iMCNS) 規格（210X297公兑） 3 3 2〇lr- 五、發明説明（29) 49

*>-〇ch3 ^NCS 50 >-OCH3 ^nhc-n-nh,il I S CH3

r 2画R2在一起為 CH2CH2SCH2CO0H /CH2-N^H2 2 I CE2CH2SCH2C00H f 2個R2在一起為 €E2CH2SCH2C00H，人 \ I CH0-N-€H? 2 I CH2CH2SCH2C00H (诂先閲1?背而之注4卞項外{,'木頁) t I Λ4 · R. //

B \ / J //Ϊ// • I · / // / / v 2

R ////// *·—0♦w f \

R

R l·— Λ ^ Ur ^ MM ^ I 1·-- -I - -; ? . 51 . -a：2-inCn2co〇n； · s? -0CH. -Cl·:2-1' (c!】9 coo】o ‘ 、cs 本分,¾凡度述用中《阐家桴丨MCNS)们規m21〇x2(J7公处） 2〇l^71 A 6 H 6 「屮失^';ltx}n .1^^--:^4印^ 五、發明説明（30) 53. 54.

-OCE3II I S CE

-OCH

w ^NH 2 -CH?-N(CH2C00H)2 x2 3 3 55. -<_>-〇^3、cs 56 57 8 5 \\ 2個R2在一起為

ce2cooh 2画R2在一起為

丄2 2 ch2cooh2個R2在一起為

-OCH 3

^RHC-N·11 I S CE

CH2C00H 3 2個R2在一起為

-OCH 3

3 CE-0 /A ch2ch2sch2cooh

起 1 在 2 R 0 2 E c s ?- G ?--Π c

.COOH 59 .

-OCE 3 C—N—NH' lin 3 本紙怅又度边用中闺ffl家桴iMCNS) f 公Ji)

CH 2腿R2在一起為

CH2Cn2SCH2COOH Λ 6 Π 6 五、發明説明（31 ) 供於此所使用之較佳類複合劑包含由上構造式Α — Μ所 代表之參聯吡啶類及上面構造式A -IV所代表之菲佐啉類 。尤佳類之複合劑具有上構造式A — II ，其中n=l且R 係羥取代苯基而含有烷基或烷氧基取代基及蛋白質具反應 性基。代表性較佳類之複合劑包含上所描述之化合物類 20至32。通常最佳複合劑係TMT (化合物21)。

in yt 間 背 而 之 項 件 木 頁 本發明提供新穎的參聯吡啶類而具有在上摘要說明中所 述構造式Α— ϋ，其中n=l且R係 y • R5係烷氧基或烷基且”係蛋白質具反應性基。R5係烷基 ，而K含有1至約20個碳原子較佳（以含1至8個碳原子 更佳），如甲基、乙基等；或烷氧基|烷基部份以含有1 至約2 0個碳原子較佳，而以含1至約8個碳原子更佳_如 甲氧基、乙氧基等。Re (系如上述之蛋白質具反應性基··較 佳的蛋白質具反想性基包含胺基、垸胺基、芳胺基、均二 胺豚基、腺胺基、硫脲胺基、硫代均二胺脲基、異氰酸荃 及異硫氫酸基。尤佳的蛋白質具反應性基包含胺基、異硫 m酸基及腺胺基：其尤佳類包含上所描述之T M T ( 2 1 化 合物）及2 0號化合物（ΐ Η ΐ ) · 根據本發明之較^的菲佐啉係具有上述構造式Α至iV * 其中至少一個R 4係蛋白贾具反應性基：較佳的蛋白西具反 憋性基包含玛指明甩於上述R "之這些： 具有金屬複合位置（如雜原子及亞胺二乙的根驿）之聚 36 2〇lr^l Λ β Π 6 五、發明説明（3 2) 吡啶及菲佐啉複合劑係可以在技S上已知之技術製得。合 宜反應流程圖在美國專利4,837,169號及美國專利 4, 859,777號中有說明，所揭示内容於此併於本文供參考 〇 將本發明常用化合物，即：4'— (3 —胺基一 4 一甲氧 苯基）一6 ，6”一雙（Ν，，Ν’一二羧甲基一N —甲基聯胺 基）一2 ，2’：6，·2”一聯三吡啶四納鹽（ΤΗΤ )及4，一 3 —胺基一 4 一甲氧基苯基） 6 · 6 Ν (請先閲請背而之注*事項外1"木11) 二（羧甲基）胺甲基〕 2 ” 一聯三吡啶四納 鹽（ΤΜΤ )之製備說明於下列反應流程圖中 反膜流程圓 Τ 合成ΤΗΤ及ΤΜΤ 1) Br 2

CE 2) \ / «I! 〇

Q II 1 0 •戈·:

Er

OCH 3 OCH.

OIIC KOH, MeOii -)ι I) π 7ί 3 7 201^1 五、發明説明（33) Λ 6 Η 6 1 + 2

nh4〇ac ACOH OHe I 0 ^ / τ η /% 1 1 U /% 1 \ J • i i • 1 Br 3 1 Br OMe ih先Mi 背 而 之 it "i•事 項 /Η 上 >, 本 Ji THT合成 ch3nhnh2 3 裝 [ 2

I H 介 CH: 線 欠-1% Η1 又:1 消 1Ϊ' Α.ίί： fK 卬 1Ί 表叭U又度A用中a 8家作Ψ(CNS) 規fM21 〇X297公处） 38 2〇lr Λ 6 Π 6 五、發明説明（34) 1) BrCH2C〇2Et 2) HN〇3；H2S〇4 3) Pd/C;HC〇K4) NaOH;MeO丑 OMeI ^m2I i mI• It. ,/ γ γ \ / \ (請先閲請背而之注意^項外一^木!!) c

CE 3 C〇2 C〇2 C〇2 C〇2 · 4Na' 5 (THT)

tL ΤΜΤ合成

1 )η—BuLi ;* 2)DHF 3

3) KaBH

A OMe I1 0 II G / \ / \ / \ 屮 火 i'l'· Ίι 杓 Π 汴 / [_ 丨屮 li 表紙汝又度边用中S ®家標丨MCNS VP Ί規岱（2丨〇 X29'/公甘）

OH HO' 39 五、發明説明（35) 1) <CH3S〇2)2〇;Et3N 2) EN(CH2C〇2Et)2-^ 四 S旨 3) HN〇3；H2S〇4

>NO 2 6 A>Pd/C;HCO~NH^~>NH2 5)NaOE;MeOE-- 7 8 9 10 A fi Π 6

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/% / s/ \ 八U KJ (請先閲^背而之注*事項外( 「木Μ) -ι'/ ;」·） 郎 入:! !ί r. >ίι\ /v ίί- 印 V— 將這 知化學 M硝化 易將胺 以產製 S4K , lirt7 Μ - ΓΝ- 啶及菲 環糸縮 序列進 以合 镝造相 白苡具 在烷基 在製備 些分子 反懕達 作用， 基轉化 氯化胺 羧基加 佐啉類 醛保護 行，然 成之既 一致且 反應性 或烷氧 中間體 加至上 成。例 接著將 成為異 甲醯基 入而Κ ，接著 之醛類 後於蛋 點而a 含有以 基（系特 基捉供 二酵⑸ 述所要 如，將 5造基适 氰酸基 I -- 日 試劑（ 以合宜 可经由 白質共 「！ llv l·· '/'L ίιμ 烷基或 別有益 在THF 中所使 *4Na+ JL 厶 10 (TMT) 求之蛋白質具反應性基係Μ習 胺基加至聚吡啶及菲佐啉中而 原成胺類3視情況需要，很容 而Κ與光氣（C0CU )起反應 加熱，釋出H C 1以產製異鼠1$ 如戊二醛）處理胺取代之聚吡 地選擇性活化羧基官能基：经 合成聚吡啶蝥合劑所需之反S 轭之前去除保雄之： 二吡啶類丨Ϊ1]迨货與丄述Α — ϋ 烷氣站取代驻取代之笨基和蛋 的：在二沒化起始物苡C3)上存 中之迓強化溶解® •而T H F係 闬；2較佳涪劏： 〇2c co _C〇2 C〇2 2 本衹烺又度边用中a S家找iMCNS) ψΊ«^(210Χ21)7公¢) Λ () I? 6 五、發明説明（36) (-先閱-背而之注-市項洱^^-木玎) 本發明新穎的聪三吡啶及菲佐啉可根據上述合成技術製 得。額外說明性製備在下列實例中有說明。 本發明標的用放射活性免疫試劑包含放射核素離子。放 射核素離子選自例如Sc、Fe、Fb、Pb、Ga、Y、Βί、Μη、 Cu、C r ' Z η ' G e N Mo、Tc' Ru、In、Sn、Sm、Sb、W R e、P ο、T a及T 1雜子。較佳的放射活素包含4 4 S c 一 + 、 34，e>?Cu— 、1 1 1 I η — -、2 1 2 P b * * 、 ® 8 G a * * ' eoY**-及 212Bi—+離子。當然，最佳者係+ —離子。 很容易將金靨放射核素離子及複合劑複合而Μ單纯將複 合劑水溶液與金羼放射核素鹽在水溶液（以具有出4至 11較佳）中混合。鹽可為金鼷之任何水溶性鹽如鹵素鹽類 。蝥合劑一般係在出介於5及9之間（而以pH介於6及8 之間較佳）之水溶液中製得。任怠將拟合劏與缓衝劏如乙 酸鹽、磷酸鹽及硼酸鹽混合以產製最適當pH。 本發明標的用免疫試劑包含共潰结合至複合劑上之免疫 反應性基，標的免疫試劑因此包括一 Μ具有上述A至I構 造之複合體共扼物及免疫反應性基：將祖合劑與金觴放射 校索複合之時機係於將複合劑接_至免疫反應性基之前或 之後進行。如於此所使用"禺免疫反憋性褡"之名砑5指 •Ιί. ι.ί I ί; I：IJ )] \i-y. IL lj i J lilJ ；-)_ i!·; i>l "i'i , t i'- ;', i ：ϊί 1二 I ί ;;丄。:丨 0 : i:!> 钌脒龆中或有用於細胞物妁或活有敁龆之沴斷、治垛戍逍 沔工程方面，且具有與其它成份交互作用之能力而見諸於 物體液中或與受治厣之细胞如肫耑诎胞冇悶 依所欲用途而定，免疫反晚性峰m 4選！丨頃泛各珀弋蛘 表V、汰又度边用中S SΨ (CNS) f 4規仿（21 〇 X297公处） -41 五、發明説明㊁7 ) Λ 6 I? 6 十 央 Ιί f- 又:】 η Γ ,/ί ί\' / l / 作 fi-- 印 <n 發生或合成製得之物質， 酸類、肽類、多肽類、蛋 、藥劑（例如，配糖苷（ phenytoin )、笨巴必妥 (thyroxine )、三換甲 敬它徽素（gentamicin) )、及萘鹼）、類固醇、 真菌、寄生虫、立克氏次 (包含寡核苷酸）、抗體 水化合物類）、抗生物素 衍生物、和其它類而為精 供使用於本發明實務中 些而具有對所欲配位體具 包含試劑之專一性结合反 包含（但不限於此）》類、胺基 白質、脂蛋白、釀蛋白質、激素 digoxin )、芬尼妥（ (phenobarbital )、甲狀腺素 狀腺素（triiodothyronine)、 、氛甲縫笨革（canbamazepine 维生素、多醣類、病毒、原虫、 體、外源凝集素、毒素、核酸類 、抗原性物質（包含蛋白質及碳 蛋白及其衍生物類、生物素及其 於此項技藝者所熟知者。 之較佳之免疫具反應性基组為這 専一性之受體分子。因此，預期 應可用於搮的中，此類配位體一 受體複合體之例包含（但不限於此）抗體一抗原、抗生物 素蛋白一生物素、操縱子之抑制劏(m m ) 一故動者和 锱一外源凝集素複合體。此外|互補核酸類，g卩亦咸信互 補键之雜化產物為如於此所使用名稱之具專一性之结合物 i:i W 的 Η 免投反蹈性 # m Η 3 ⑴ ii: Η 1';] V) ' ίΐ ,'r 6； ^ ύ 免疫餃爭性宿主中ι刖導致齑製能叫此沌物Π结合之叶卯 --性抗肋•或（2)如此所產製之抗153而兮fA!抗取 抗幻反應 因此|具免疫反應性群姐可為抗原性物Π 、抗S3 、或抗 …抗體。窀株抗體及5株抗扣竚冷芎用的 抗扪可汶全ff 本紙法尺度边用十阐阁家找iMCNS)TU?m(210x297公¢) f請先閲讀背而之注*市項洱一 :木II) Λ 6 1$ 6 j 郎屮火«-f-而 α X 消1«''.-,.'作fl·卬纪 五、發明説明§8 ) 分子或其各類片段，只要彼等含有至少一個具反應性位置 而用於如於此所說明之在複合劑上之具反應基或與連接基 姐類起反應。 在某些特定具體例中，具免疫反應性群姐可為酶而具有 用於與複合劑接觸之具反應性群。代表性酶類包含（担不 限於此）天冬氨酸氛基轉化酶、丙氨酸氨基轉化酶、乳酸 去氫酶、肌酸磷酸激酶、7 —穀氨醯轉換酶、鹼性酸磷酸 酯酶、前列腺酸磷酸酯酶、棘根過氧化酶及各類酯酶。 視情況需要，可將免疫具反應性基改良或化學改變而以 精於此項技藝者所热知這些技術Μ提供具反應性基用以附 合至複合劑上。此類技術包括使用鏈接部份及化學改良如 在W0-A-89/02931及W0-A-89/2932中所說明•直指改良寡 核苷酸類，和美國專利4 , 7 1 9 , 1 8 2號，於此將所揭示内容 全部併於本文供參考。 本發明標的免疫試劑之二棰極佳用途涤用於診斷腫瘤影 像及放射治療腫頫。因此較佳的免疫群姐包含對腫陧相關 抗原之抗體。其持例包含Β72 . 3抗體（在美國専利 4，5 2 2，9 1 8及4 , 6 1 2 , 2 8 2號中所說明 > 而此能確認直腸结 腸瞠瘤，9 . 2 . 2 7抗一黒色素瘤抗髓，D R 1 2抗體能確涊芭叫 H wl · ϋ,Π3Α ί/ί； S ijr ai; ΙΙφ -i' ；i：i ；i；'i ：,：； ' iiki.i! · 10 jii； ;;；： 能確as肺N t细胞癌及i腺结臈腿龆（泛癌）、7EUC5抗肋 能認、前列腺癌、c C 4 9抗捫能確認南睬结脫_润、T N T抗 粑能確認壊死姐織、p R1 A 3抗33能確以结肱癌、Hi G -丨抗 奶在國際爯利公報y〇-A-g〇/〇25 6 9號中旮；1U明、B 1 7 4抗龆 (讣先閲^背而之注总市項外一‘-:木玎) 本紙汰尺度逋用中Η阄家從m(CNS) ΤΊ说岱（2IPX297公Ϊ) 201'71 a 6 Π 6 五、發明説明（39) 能確認鱗状细胞癌、Β 43抗體與某些特定淋巴瘤及血癌（ 白血病）具反應性而且其它類等可能特別有感興趣。 此類抗體及上述其它有用免疫群姐係大而複合分子，具 有多重位置用以附著至複合試劑上。结果•免疫具反應性 基經由其一種蛋白質具反應性群姐而將額外複合劑附險至 彼之上。因此，免疫具反應性群姐之名稱係欲包含具有複 合劑分子之免疫學群姐而經由一種或更多種蛋白質具反應 性群姐鍵合至那裡。 此外，如在美國專利4,937,183號中所說明，可將含有 碳水化合物區之抗體或其片段經由抗體之碳水化合物區而 附著至複合劑上，於此，將所揭示之全部内容併於本文供 參考。用以附著抗體之有用方法在美國專利4,671,958 ; 4，6 9 9 , 7 8 4 ; 4 , 7 4 1 , 9 0 0 ;及 4 , 8 6 7 , 9 7 3 號中有說明：如 於此所界定之“蛋白質具反應性群姐"之名稱係欲包含此 捶鍵结。 用以進行將免疫具應性群组共溜结合至具放射活性金騸 複合劑之其它技術在技藝上係已知且包含單純將此類物質 混合在一起。 木發明具放射活性免疫試劑可含有ff何比率之令㈣故射 fiii J- >1 1¾ ί; ίΐ ίΐ 較佳的 U I ；i； )¾) Sii 1' ΐΐ Rl ,1 劑之努耳比率係約1 : 10 0至約1 : 1 - 帑合劑對免疫反應物之比韦可闸泛地改雯而約0 . : 1 :Τί 10 ： 1或更多：在某些具奶冽中，Μ合颂對免疫反魁性 辭？π之Μ耳比率丨系約1 : 1至約Β ： 1 ' 未队汰尺度边用中a®家桴iMCNSpiM規公¢) 閲 背 而 之 注 意 % 項 Λ fl 五、發明説明（4〇) 圖6及圖7係本發明 光譜並不與有蝥合劑行 介於本發明蝥合劑及其 I η * 3、S c + 3 及 c u * 2 之（¾之免疫試劑很容易K光 Λ 6 Π 6 複合劑及金靨複合體之光譜。部份 化學鍵合之這些蛋白質相重β。在 它代表性陽離子如Ga + 3、Bi+3、 得到類Μ光道邊移。囚此，本發明 譜分析之。 下列實例進一步說明本發明： 製借1 ：製谌4'— (·? —胺某一4·—田Μ某笼某）一Α 6 「Ν Ν 二（羧申某）防某申某]一 2 2” 一瞄三吡啶四纳铺 （ΤΜΤ ) Α部份一海彳h 0Η:咛1 合成2 —乙醯基一6 —溴吡啶而M J. E. Parks Β

Holm'在 J. Organoraeta 1 . C h e m. 所說明之方法。M溴（6 . 2毫升， E. Wagner 及 R. E. 5 6 - 5 3 - 6 6 ( 1 97 3)中 0.12莫耳）處理2 —乙醯基一6 —溴吡啶（20.0克 100 (-先閲-背而之：r:-事項外{ ,·*") 濟 部 十 央 Ί1- 上) i\ Xfr 杜 印 毫莫耳）並在2 0 0毫升 卻至室溫然後以稀水性 il a 2 S 0 4之上乾燥、過濾 200毫升THF中後•加 3 0分鐘。將混合物冷卻 7 3¾ ):熔點 2 5 0 (:分 CuH1〇B「2N20之元素分 2 . 3 2 ; N ，7 . 8 2。實測 7 . 7 9 3其N M R及I R光諶 產物（系均勻的3 C H C 1 3中回流歷4 5分鐘。將溶液冷 NaHC〇3/Na2S2〇3清洗。將有機相在 、且蒸發之而得，將此種油溶於 入3 0毫升吡啶：将所得溶液回流歷 後過滤而得2 6 . 1克近白色粉末（ 解（在2 4 5 C 脫色） 對心 析，計算值：C ，4 0 . 2 6 ;Η· 值：C，40 . 12 ； Η 2.8 5'； Ν · 與所設定構造相合且以T L C證明 本紙怅尺度迖用中國S宋焓準（CNSllM規格（210x297公.¾) 201^1 Λ 6 Η 6 五、發明説明（41) R部汾一苦甚芮锸随关棵 （rha^onP2) 將氫氧化钾（18.2克，325毫莫耳）溶於100毫

中後，將 (65 克， 一起溶於 物在若干 。將沉澱 )產物， )317M 〇 100% 二 算值：C 100毫升甲醇加人 3 2 5毫μ耳）a對 400毫升甲醇中， 分鐘内開始沉澱出 物收集、以異丙醇 呈黃色固體|熔點 將一種酌量在Woe 1 經 濟 屮 火: Ιΐ： 节 人 U L / , ι I if: fi- 'Ί· %

氛甲烷洗出。用於 56.63 ; Η - 3 . 56.66 ； Η -3.87; Ν- 4. 造相一致且產物KTLC證明 C部份一二溴瞄三吡啶3 將溴化吡錠1 ( 11 . 3克， 烴2 (10.0克| 31. 4毫莫耳 A c 0 Η中回流歷1 6小時。將溶 AcOH及EtOH清洗而得13.48 2 0 3 至 2 0 4 . 5 t > i; U H S ( rn / e ) 4 <J [； ( H * ) 析計算值：C ，5 3 . 1 ; H C - 52.9； H - 3.1 ； N > 定描造相一致且產物以T L C 升h2〇 。將2 —乙醯基一 6 —溴吡咱 ι6δ 克，650 毫 II 耳） 將此溶液倒人Κ0Η溶液中。產 ，容許將反應在室溫放置過夜 清洗後乾燥之產得79克（76% 100 至 102 aC。FDMS (m / e m矽膠上以柱層析純化而K C: 5Η12ΒγΝ〇2之元素分析，計 80; Ν ， 4.40。實測值：C ， 41。NMR及IR光譜與所指定構 為均勻的。 31. 6毫莫耳）及芳基丙烯醯芳 )與10克NIUOAc在100毫升 液冷卻後過滅，固體先後以 克白色结晶（86% ):培點 )U /j ； t' ；- ·.· Η ； . i. ι- ；> Η ；! U ；u -ΐ； yJ •3.0 ; Ν - 8.5 窝测谄： 8.4 Μ R泛U光譜與所指 SS明除均匀的 (請先閲-背而之：.''-4卞項再{ 木π)

LLSg fiL _il 吡啶 本叭汰尺度边用中Sffl家彳Ί規fM21〇x2l〕7H) Λ 6 Η 6 五、發明説明（42> 將在100毫升乾堞THF中之二溴化物3 (7.46克， 15.5毫莫耳）在1下滴加至由28.1毫升1.6卩正一丁基鋰（ n— BuLi)在20毫升乾燥THF中之溶液内歷12分鐘之期間 。於加入期間，Μ乾冰/丙嗣浴將溫度维持在-7 5 t Μ下 。將所得暗绿色溶液攪拌歷10分鐘•接著加人7.5毫升乾 燥DMF歷2分鐘期間。於10分鐘後，將90毫升10%HC1溶 液加入後，將所得溶液攪拌並持績冷卻歷45分鐘。將混合 物在分液漏斗内分佈介於CHC13及H20之間（皆將二種溶 液預冷卻至4 3C)=將二相快速振搖後，容許在周遭溫度 放置歷15至30分鐘，直到有機相顏色從淡綠色改變成金黃 色為止。將有機相以飽和食鹽水清洗，然後蒸發而得乳黃 色殘留物。將此物質M CH3CN和液研磨而得產物呈近白色 固體（3.53 克，60%)，熔點 225 至 227t 。FDMS (m / e ) 395M。用於C24H17N3〇3之元素分析•計算值：C ， 72.90 ; Η ， 4.33; N ， 10.63 。實測值：C ， 72.44 ; Η - 4.31； Ν - 10.48 〇 將粗製二醛（3.53克，8,93毫莫耳）與1克NaBH4在 7 0毫升T H F及7 0毫升絕對乙醇之混合物中於N 2下回流歷 1 5分鐘。於抽真空濃縮後，將殘留物在稀N a H C 0 3中回流歷 30分鐘，冷卻，過漶· ΜΗ20淸洗，然浚乾燥ίίίί斟二龄6 •呈白色固體（3 . 3 5克| 9 4 . 4 % ):瑢點1 8 7至1 8 9 =C : F D M S ( m / e ) 4 0 0 Μ Η * · 3 9 5 Μ :用於 C 2 4 H 2 i N 3 0 3 之元素 分析，計算值：C，72.17 ; Η > 5.30； Ν - 10.52 裳 剷值：C ，7 1 . 7 1 ; Η ，5 . 2 0 ; Ν ，1 0 · 3 7 :其 Ν M R 及 (-先間-背而之注-节唄祌{'--木頁) 本紙5良尺度边用中困a家樣iMCNS) f 4規岱（210x297公放） 201 五、發明説明) IR光譜與所指定之構造相一致且產物以TLC證明係均勻的 0 F部份一四酷7 將二醇6 (15.4克，38.5毫莫耳）懸浮於17毫升Ε1:3ΝΪ 名· 175毫升CH2CU中之混合物中並在83C下攫拌。將 ((^3$02) 20 ( 16.8克|96.5奄莫耳）在50毫升（^2(：12中之 溶液滴加至此種懸浮液中歷超過10分鐘期間。將反應混合 物與水振搖。將有楗層在Mg SO 4之上乾燥後過濾之，濃縮 至接近乾燥。加入EtOAc產得雙甲磺酸鹽，呈白色结晶， 加以收集後乾燥之（17.2克>80.4%)。將雙甲磺酸鹽（ 0.50克，0.96毫莫耳）、二異丙基乙胺（0.26克，2.0毫 莫耳）及二乙亞胺基二乙酸鹽（0.38克，2.0毫莫耳）在 20毫升乾燥THF中报拌歴16小時。將混合物抽真空濃縮後 ，將殘留物分佈介於E t 2 0及Η 2 0之間。將E t 2 0相以水清洗 額外二次·然後在Na2S04之上乾燥後蒸發而得產物，圼淡 黃色油（0.58克* 82%)。用於C4〇lU7N5〇e之元素分析， 計算值：C ， 64.76 ; Η ， 6.39; N ， 9.44。實測值：C ，64.35 ; Η ， 6.17; Ν ， 9.39。其 NMR 及 IR光譜與所指 定之構造相一致且產物M T L C證明係均勻的： ['_ui> f；!' —- 51¾ M tlti 8 將聯三吡啶四酯7 ( 3 . 2 7克· 4 . 4丨奄f4耳）溶於6 0奄升 消H 2 S 0 4中而得橘紅色溶液。將混合物冷卻至Ο Γ後，將 S Η Ν 0 3在濃H 2 S 0 4中之1 / 1 0 ( 33阽比（ν / ν ))混台物 加入因而給予I . 4 1老莫耳Η Μ 0 3，於加人完成後，溶液顏色 IV作f-i--印11 本紙汝尺度边用中国8家彳；^(1-(以5)'11(1規格（210乂297公迓） Λ fi B6 201^71 五、發明説明（l4 ) 圼淡黄色。將反應混合物在Ot攪拌歴15分鐘，然後將此 倒入碎冰中。將稀釋K2C〇3加入直到達到出8為止。水溶 液以CH2CU萃取3次。將有楗層结合、在Na2S〇4之上乾堞 後濃縮之而得黃色油，在矽膠上層析之（Μ 5 % MeOH / CH2CU洗出）。將含產物部份结合後蒸發之而得產物，從 MeOH再结晶3次而得近白色固體（1.84克，53%) : Πρ 76-79 1：。FDMS ( m / e ) 787 ΜΗ* ，786Μ。用於 CaUeOu之元素分析，計算值：C，61.06 ; Η，

5.89; Ν，10.68 。賁测值：C*60.69 ； Η · 6. 22 ； N ，11.04 。其HMR及IR光譜與所指定之構造相一致且產物 以TLC證明係均匀的。 Π部汾一肱某瞄三赃晾四酷9

將硝基四酯8 (1.80克，2.29鼍莫耳）溶於90奄升THF 及90毫升絕對EtOH之混合物中。將溶於16奄升H2〇中之甲 酸銨（2.89克，45.8毫莫耳）加入，接著加入4.8克10% Pd/C (4.6毫莫耳）。於室溫下攪拌歷2小時後，將反想 經由矽藻土濾墊過濾。將漶墊MTHF1 、絕對EtOH及 CH2C12充份清洗。將濾液濃縮後，將殘留物分佈介於 C H 2 C 1 2及含水N a C 1之間。將有機相濃縮後’在S丨0 2之上以 ΰ 0 % ί.Ι e U il / C H C U洗出之方Λ纯化Ιίι丨捋產物呈®荜色油（ 0.80 克，46%) 。FDMS (m / e ) 757 ΜΗ* ，756M。用於 “〇Η4βΝβ〇β. 1/2Η20 之元累分析，計 W 值：c ，62. 73 ; Η ，6 · 4 5 ; N ，10 . 9 7 。筲測值：C ，6 2 . 9 8 ; Η ， β . 4 7 ; Ν ，1 0.6 7 。其N M R及I R光譜與所指定之楢造相一 (請先閲請背而之注*市項外ί 6木頁) 經濟邶屮央從"·1^: '-作： -¾ 本紙汝尺度遄用中國S家诈iMCNS) ΤΊ規tM210x297公.¢) 五、發明説明（Λ 45

(請先閲^背而之注*市項#{ ㈠木IT 致且產物以TLC證明係均匀的。 Η部份：防某四辞10 ( TMT ) 將胺基四酯9 (0.75克，0.99奄莫耳）與4當量之

NaOH在50奄升MeOH及2毫升Η2〇中之混合物内而在室溫下 攪拌歷16小時。將混合物濃縮而得產物，圼二水合固體（ 0.72 克，94%) : FABMS m / e 640 (Μ* 用於四羧酸鹽） 。用於C32H2eNeNa^xOe· 2H2〇之元素分析，計算值：C . 50.01 ; Η，4.20; N，10.93 。霣測值：C，49.82 ; Η · 4.12; Ν，10.74 。其NMR及IR光譜與所指定之構造 相一致且產物MTLC證明係均匀的。 製備2 製備4, — ( 3 —胺某一4-—甲氣某苯某）一6 , 6”一等 （Ν’，Ν’一二搿渖某一Ν —甲瞄防某）一2 ，2 ” 一臌三吡啶四钠翰 (ΤΗΤ ) Α部份一6 ，6”一雙（N —甲基聯胺基）一4’一 （4 一甲 氧苯基）一2，2': 6'，2”一聯三吡啶 將 6 ，6”一二溴一4’一 （4 —甲氧笨基）一2 ，2·: 6’，2”一聯三吡啶（1.0克，2毫莫耳）在20毫升甲基聯 胺中而於氮氣下回流歷1 6小時。將溶液冷卻，將所得沉澱 物過濾後，乾燥至具固定重量而得0.68克乳黃色固體，熔 ϋ 2 1 8 Μ 2 2 0 」Π) Μ S ( m / e ) 4 2 8 Μ !Γ，4 2 7 !·Γ .用於 C24H25NtO · 0 . 2 5 Η 2 0 之元素分昕，計 ϊί 值：C ，6 6 . 7 2 ; Η ，5 . 9 6 ; Ν ，2 2 · 7 0 。實測值：C ，6 6 . 8 5 ; Η '， 5 . 3 5 ; Ν ，2 3 . 0。其N M R及I R光譜與所指定之構造相一致 /'',l;iLΉ1 本紙張尺度边用中S Θ家烊iMCNS)1?»!規格（210x297公龙） A,?-消邰屮央：^ Λ I? 6 五、發明説明（4 6 ) B部份一6 ，6”一雙（N，，N’一二（乙氧羰甲基）一N — 甲聯胺基）一4’一 （4 —甲氧笨基）一2 ，2’：6’*2”一 聯三吡啶 將A部份之雙（甲基聪胺基）聯三吡啶（3.50克，82毫 箅耳）、溴乙酸乙酯（13.2毫升，820毫莫耳）、2，6 —二甲基笨胺（9.6毫升，820毫奠耳），及碘化納（ 0.35克，2毫莫耳）加至350毫乙腈中，並將溶液在1下 回流歷48小時，而於此時加入額外4.1毫升（370毫莫耳 )溴乙酸乙酯及4.8毫升（410毫莫耳）2 ，6 —二甲基 苯胺。將反應溶液回流歷額外48小時後冷卻之。將從過刺 溴乙酸鹽及二甲基笨胺所得大量白色鹽過滹後棄置之。將 «液濃縮後，將經濃縮物質溶於二氯甲烷中，以稀水性氯 fb納萃取二次。將有機相在高真空下濃縮直到不存在溴乙 酸酯及二甲基笨甲胺為止。將祖製油在Woelm矽膠柱（ 36X2时）上纯化：將柱起初Μ 100% 二氛甲烷洗出，接 著以50/ 1二氯甲烷/丙酮再以逐漸增加丙嗣對25/ 1二 氯甲烷/丙酮之濃度。將经纯化部份濃縮而得2 . 9 1克（ 46% )淡稻草色油。純油部份在室溫放置後结晶且與甲醇 和液研，磨而得白色固體，熔點1 0 0至1 0 .VC :用於 L .1 ο H U !ί v ϋ η 7U /ί; >-) Ι^Γ ' ύΐ" >1 iii · ' ^ ' tj 2 . k! 4 ； H 1 6 . 4 0 ; N ，12 . 7 0 ，裒測值：C . 6 2 . 3 1 ； H -6.32； N ，1 2 . 6 9 。其N M R及[R光譜與所指定之構造相一致•而產 物以T L C證明係均匀的。 C 部份一6 ，6 ” -雙（N，，N . — 二（乙氧羰甲 1 ) — N — (猜先閲-背而之注悲苹項朴一-:木頁) ”^:"-印,¾ 本XUS：尺度边用中® S家详.iMCNS) ·Ρ4規怙（210X297公及） 五、發明説明) Λ (] B 6 經消部屮央標平：：Tnr-;/ifr5作fL印％ 甲基聪胺基）一4’一 （4~甲氧基一3 —硝苯基）一2 ， 2': 6，，2”一聯三吡啶。 將B部份之聯三吡啶四酯（0.659克，0.84毫莫耳）溶 於5毫升濃H2S〇4中而得橘紅色溶液。將混合物冷卻至〇 Ό，將濃硝酸在濃硫酸中之混合物加入因而轉送0.8 4毫莫 耳硝酸。於加入完成後，溶液之顔色轉變成淡黃色。將反 應混合物在0¾攪拌歷15分鐘，然後倒入碎冰中。將稀碳 酸鉀加入直到達到PH8為止。將水溶液以二氛甲烷萃取3 次。將有機層结合後在Na2S〇4之上乾燥•於濃縮後得到黃 色油，在矽膠上層析（20/ 1二氯甲烷/丙嗣）。將含產 物部份结合後蒸發之而得產物，圼淡黃色玻璃。產量： 0.15克（22%)。用於之元素分析，計算值 ：C > 58.82 ; Η ，5 · 9 2 ; N ，13.7 2 。赏測值：C ， 58.76 ； Η -5.61； Ν - 13.84 -FDMS(m/ e) 816M= 其NMR及IR光譜與所指定之構造相一致，而產物MTLC證 明除均勻的。 D部份一 4’一 （3 —胺基一 4 一甲氧笨基）一 6 ，6”一雙 —二（乙氧羰甲基）一N —甲聯胺基）一2 · 2. : 6，，2”一聯三吡啶。 ;ί.ϊ u 部份之 _ Μ ω 酷 ι 〇. 7 ^ >\l 〇. 〇 a -β α ) ίΰ )j'； jo-'g ?|- Τ Η F及3 0奄升乙醇之混合物中。將溶於6奄歼Η 2 0中之 甲酸铵（1 . 0 8克，1 7 . 1奄莫耳）加入•接著加入1, π克 1 0 % P d / C ( 1 . 7奄莫耳） 於宝溫Τ设邝過夜浚，將反 應烴由矽藻土濾墊過濾。將濾格Μ Τ Η P 、绳對乙It?及 本紙張尺度逸用中S Η家樣〗MCNS)甲4規岱（210X297公设） (請先間讀背而之汶意事項朴咖政木" 裝- 訂_ 線. 52 A 6 W 6 五、發明説明（48) CH2CU充份濟洗。將濾液濃縮後，將殘留物溶於氛仿中· 將氛仿溶液Μ水淸洗二次。將有櫬相濃縮成油。將甲酵加 入油中使油產生结晶。將此種物質在20毫升甲醇中拌漿、 過濾後空氣乾爍而產得0.64克乳黃色固體（92.7%)。用 於C4〇H5〇He〇e之元素分析，計算值：C，61.06 ; Η · 6.40; Ν，14.24 。實測值：C，60.74 ; Η，6.39; Ν ，14.01 。其NMR及IR光繒與所指定之構造相一致，而產 物以TLC證明係均勻的。 R部份一 4'一 （3 —肢基一4 一甲氧苯基）一6 *6”一雙 (γ，Ν· —二羧甲基一Ν —甲聪胺基）一2，2，：6，， 2” 一聯三吡啶四納醴（THT ) 將D部份之胺四酷（0.60克，0.76奄莫耳）與4當量氫 氧化納在25毫升甲醇及1毫升H2〇之混合物中而於室溫下 攪拌歴約16小時。將混合物澹縮而得近乎100% 產率之固 體四羧鹽。用於（：32Η3ΟΝβΝ3<ι0β· 2H20之元素分析，計算 值：C ， 48.12 ; Η ， 4.29; N ， 14.03 。實測值：C ， 48.01 ; Η · 3.97 ； Ν > 12 . 77 ° 勃備·Ί 製锚fi · R " - ^ ( K ' . Ν’ 一二羧甲某一 Μ 一甲瞄 v 1 . JM_

-火; I：： 肀 X; νί X Γΐ:/-:作·ΐ·.ΞΓ11 將E部份製_2 2THT胺四钠鹽（0.39克，0.51¾莫耳 )溶於80毫升甲9?中：於室溫，將0 . 53克（0 . 50¾炱耳） 硫光氣而在1 . 0奄升四氫呋喃中加入，接著加入0 . 5 1克（ 耳 莫 奄 在 而 胺 乙 三 反 將 後 '*- 中 喃 1"·' - 四 71- ¾ 本从汰尺度边用中S S Ϊ：诈if (CNS) 1Μ規ίΜ210χ29/公龙） 5 3 五、發明説明（49) Λ 6 Π 6 應濃缩成殘留物，在二氯甲烷中拌漿之，遇濾而產得 0.26克（65%)黃色固«。其紅外光譜與所指定之構造相 一致。咸信產物係單羧酸三納鹽。 Μ檐4· 脚楢R —肱其一2零 「Ν · Ν —二 f撖申 甚）昉甲某1 — 1 ，10—菲佐瞅闪纳隳 A部份一 2，9 —二甲基一 5 —硝基一 1 將半水合2 · 9 —二甲基一1 ，10—二 10—菲佐啉 氮雜 濟 部 屮 夾 X 消 么、 卬 (25.0克，99奄莫耳）溶於100奄升濃硝酸中 升濃硫酸加入並將反應在回流下加熱歷2.5小 許在室溫下放置歷8夭。然後將反應混合物逐 公斤冰及351克（8.8奠耳）LiOH· H2〇之混 Μ玻棒搰拌。於中和製程中•視情況需要而加 中和期間總是存在不溶解冰，亦同時將中和反 丙酮/冰浴。於加入完成後，反應混合物之pH 性混合物以一·氛甲烧萃取二次，首先以1〇〇〇毫 400毫升之二氯甲烷。將二氯甲烷部份结合， 升純水萃取乙次。將二氛甲烷相湄縮成為殘留 500毫升乙腈和液研磨，將固體過滤後以乙腈 抽真空下乾燥，得到10.3克乳黃色固體，溶於 流乙躺中，容許在室溫结品，過滤之而得8 . 5 乳黄结晶•培點184至186 °C - F D H S ( m / e 於C χ 4 H t i N 3 0 2 · 0 · 2 5 Η 2 0之元素分析，計订值 6 5 · 2 3 ; Η ，4 . 5 0 ; N ，1 6 . 3 0 > 贸測值·· c Η ， 4.45; N ， 16.27 。 菲氫氛化物 。將200毫 時，然後容 漸加至約3 合物•同時 入冰因此於 應冷卻而以 係12 。將水 升，然後以 而以5 0 0毫 物，而以 清洗而且在 1 0 0奄升回 兑（34%) )253M -用 ：C ' · -65.57 ； 本认汰尺度边用+ HS家你iMCNS)»fM規恪（210x297公设） 五、發明説明（5()) 其HMR及IR光譜與所指定之構造相一致，產物以TLC證明 係均勻的。 B部份一 2 ，9 —二（溴甲基）一5 —硝基一1 ，10—菲 佐啉 將2，9 —二甲基一5 —硝基一1 ，10 —菲佐啉（1.0 克| 4毫莫耳）及Ν—溴丁二醢亞胺（1.42克，8毫莫耳 )在燒杯中一起混合成為均匀混合物，同時加人20毫升回 流（181t；)之鄰一二氛苯。將加熱在回流溫度下持續進 行歷2小時•然後容許將反應冷卻至室溫。將反應混合物 在Woela矽膠柱（18X2吋）上纯化而Μ100% 二氛甲烷 洗出而得0.4 7克（2 9 % )純物質，圼一種黃色油。在T L C 上之I值係0.5 ( 40 / 1 CH2C12 /丙嗣）。將酌置的纯產 物和液研磨而得灰白色固體•在1 4 6 υ 分解。用於 CwFUBr^HsOz· 0.5Η20 之元素分析，計算值：C，40.02 ;Η ， 2.39; Ν ， 10.00 。實測值：C ， 40.36 ; Η ， 2.67； Ν ， 9.77。 FDMS ( m / e ) 409M。 其NMR及IR光譜與所指定構造相一致。 C部份一 2 ，9 一雙〔N ，N —二（乙氧羰甲基）胺甲基 〕一5 —硝基一 1 > 10 —菲佐啉 經消-屮央榀Ό工^价^作^印'" (請先閲請背而之注*事項神f 』木U) 將2 ，9 —二（沒屮丛）--5 L ，1 0…-菲佐啉 (2.28克，5.5奄莫耳）及2.08克（11奄與耳）1|8 — 雙（二甲胺基）萘一起溶於2 5奄升1 —甲基一 2 — ra S吡 塔飼中後，加人2.08克（11奄Μ耳）亞胺二乙齒二乙龅： 將反想以磨口玻璃塞封住 > 於室溫下搜伴约1 0分鐘後，問 本从张尺度逋用中S S 規格（210x297公龙） 201^ Ι α β Β 6 五、發明説明戶1) 妨濟部屮央榀準·-ΤΠΓ-消设合作；4印％ 始形成白色沉澱物。然後將反應（物）置於冰箱（4t) 中並貯存歷約20小時。將反應混合物分佈介於400毫升二 乙醚及40 0毫升鈍水中，醚部份Μ每次40 0毫升純水萃取 共5次。將醚相濃縮後，溶於400毫升二氯甲烷中。將二 氯甲烷相以純水萃取乙次，而以賽力持矽藻土及硫酸钠之 混合物乾燥，然後遇濾，將此濃縮成為暗色油。將一種 Woe U矽膠柱製成而在10/ 1二氛甲烷/甲醇中（高20吋 而直徑2吋）•將粗製油（在最低數量二氛甲烷中）施用 至柱内。將約50毫升二氯甲烷施用至柱，然後柱内物以 10/ 1CH2CU /甲醇洗出。將洗出部份收集（每次1〇〇毫 升）而將KTLC證明為純產物部份（10/ 1二氣甲烷/甲 酵，1U 0.4)结合後，濃縮之而得1.17克（34%)產物， 係一锺真正淡紅一琥泊色油。FDMS (m / e ) 628MH+°用 於（：3<^378501〇· 2H2〇之元素分析，計算值：C . 54.29 ;Η，6.23; N，10.55 。實測值：C，54.71 ; Η · 5.58; Ν ，10.53 其^^1?及IR光諶與所指定構造相一致 0 D部份一 5 —胺基一 2 ，9雙〔Ν ，Ν —二（乙氧羰甲基 )肢甲基〕一 1 *10 一菲佐咐 將2 ，9雙[Ν ，Ν —二（乙氣城Ψ丛）胺屮丛j · ΰ —硝基一1 ，1 0 —菲佐啉（3 . 3 7克· 5 . 4老.¾耳）洛於 1 0 0奄升四氫呋喃及2 0 0奄升絕對乙S?之溶液中’將6 · 8 克（丨0 8奄莫耳）甲酸銨在2 2奄升纯水中之溶液加入，接 荠加入5 . 7 2克P d / C ( 1 0 % )(冷了安全起見而以水濕化 f請先閲請背而之ii*卞項#.本U) 本紙法又度边用中®困宋诈iMCNS)f4規彷（210x297公兑） 五、發明説明（5 2 達50炻） 然後纆 發器。將 升純水萃 再以賽力 真空下濃 9.0毫升 3奄升丙 為固定重 F D MS ( m 元素分析 。實測值 及IR光譜 。將反 由矽膠 殘留物 取。然 特矽蒱 縮之而 丙臃處 聃淸洗 量逹1. / e ) ，計箅 ：C ， 與所指 應以氣泡劑塞住，在 土濾垫遇濾。然後將 溶於300毫升二氛甲 後將有機相以300毫 土及硫酸納之混合物 成為暗琥珀色油，稱 理，產生黃色固體结 ，最後Μ 15奄升己烷 04克（32% )，熔點 598ΜΗ*，597Μ 〇 用於 值：C - 58.52 ; Η 58.28 ： Η > 6.55； 定構造相一致。 Λ 6 Π 6 室溫下播拌歷 溶劑移除而Μ 烷中·然後以 升飽和氣化納 乾烽、過濾* 重2.90克。將 晶。將固體遇 清洗| Μ空氣 137 至 139¾ C3〇H3〇Ks0〇 * ，6.71； N ， N · 11.53 °

30分鐘 旋轉蒸 300奄 萃取· 在高抽 油Μ 濾，以 乾煉成 〇 η2〇之 11.38 其NMR (請先WI1,?背而之注*市項#^ 木頁) •.»/ :AV i!r* 十 央 Ιί λ：1 Μ .r. >/ί t'r / · I I 作 ft 印 % Ε部份一5 —胺基一 2，9 —雙〔Ν 胺甲基〕一1 ，10 —菲佐啉四纳鹽 將5 —胺基一2 ，9 一雙〔Ν ，Ν 胺甲基〕一1 ，1〇 —菲佐啉（0.90克 200毫升甲酵中。將溶於10.0毫升純 0 . 2 5克，6 . 2 5奄莫耳）加人，將反應 溫K m伴歴2 4小時」將溶剑移除问 固蹈殘留物與二氯甲烷和液研磨後， (94% )。四納鹽具吸潮性，留下大 斗之玻璃壁上。用於C^H^NaiNsU»’ 計算值：C ，4 2 . 1 1 ； Η -4.02； Ν Ν 二（羧甲基 二（乙氧羰甲基） ，1 . 5奄莫耳）溶於 水中之氫氧化納（ 塞往而Μ磁攪伴器.在 μ ；k m ；ύ m. h λ . ικί 過濾之而產衍ο. 8 1克 班物皙附著於'過漶漏 3il2〇之元索分析· -]1 . 1 6 - 萁測值： 5 7 201 71 Λ 6 It 6 五、發明説明（） 53 C ， 42.01 ; Η ， 3.71; N ， 11.03 。其 及 ir光譜與 所指定構造相—致。 製備2 ，...-.9 —雙「N ，N —二（羧田某）胺甲基· -a —星碕氰酸根一 ]__L10 —菲佐瞅钠薄 1_ 將5 —胺基—2，9 — 基〕_1 ，1〇 —菲佐啉納 20奄升甲酵/ 4毫升純水 0 . 28毫箅耳，即取1 . 〇奄 THF中之溶液）加入。接 1.0毫升由0.28克三乙胺 反應在室溫下進行’然後 0 . 16克（94% )黃色固體 。咸信產物係單羧酸三納 雙〔N，N 鹽（0.16克 之溶劑混合 升由0.32克 著立刻加入 在10.0毫升 立刻濃縮成 。其IR光譜 鹽。 一二（羧甲基）胺甲 ，0.28毫莫耳）溶於 物中。將硫光氣（ 硫光氣在10.0毫升 0 . 28毫莫耳三乙胺（ T H F中之溶液）。將 為殘留物•得到 與所指定構造相一致 卸插β —判齒R ，fi”一 「Ν ，Ν —二（羧甲基）防甲某1 — a硫氤酸枏~4·_甲氲苯基） 2 先 閲 'i* 背 而 之 注 意 市 項 t , 木 頁 2_ 嗌=0Η：晗四纳謅 經消郎屮央檫^劝以工消卟^作^-卬^ 將製備1之胺基四梭酸 30毫升甲醇中，先後將含 Τ丨丨F及含有0 · 4 2菌耳三 怨洛·液立即續縮成為殘留 以過滹方式收榘後，以二 U光譜與所指定之構造相 •^J 7 15 —胺基一 3 ， ，7 ，10—參（梭甲基） 納（0.31克，0.42毫莫耳）溶於 有0.42毫莫耳硫光氣之1.00毫升 乙胺之1 . 00¾升T1IF加入：將反 物而與二乙阪.fu液研ίΒ ，將凼超 氯甲烷淸洗而得〇 · 3 0克產物。其 —致’ 5 ，6 ’ d ’ ϋ ’ 11 一 六涵一 4 - 2 ，！ ： ] 2 ’ 1 4乙嫌基— 表祕疋度A爪中明B家糾(圓平4職(210><29/公处) 201^71 Λβ \\6 -央榀準XJnl ,1.^-¾ 五、發明説明（54) 1 ’ 4，7 ，10，13 —五氮雜苯并環十五炔 NH,

NaOOC^CH/ v N ^ vCH2〇〇〇Na CHrCOONa A 部份· 3 ’ 5 1 6 ，8，9 ，11—六氫一 15—確基一 4 ，7，10 —參（對甲苯磺醢胺基）一2 ，17: 12，14 —二 乙烯基一 1 ((…棺稽1熱撓熱捃稽箭片e并環十五炔

將100毫升含2重量％2 ，9 一雙溴甲基一5 —硝基一 1 ，10—菲佐啉之N —甲基四氫吡咯一2 —酮（前者係在 上製備4 ’ B部份中製得）经由注射幫浦加至20毫升羥磁 攪伴之N —甲基四氫吡咯一2 —嗣（在20t：及固定在氬氣 下）中：同時立刻將1當虽之二伸乙三胺N ，N '，N ” 一三 一對甲笨磺S3胺二納鹽在N —甲基四Μ吡咯一 2 —銅中之 2%溶液加入。於加入後，將反應在20Τ：加入歴額外6小 時’，然後在高真空下蒸餾出200奄升溶劑|將殘留溶液於 冷卻後，加至1 0 0牽升冰水内。將所得沉澱物以過逋單離 出，以冷水清洗後以乙腈和液研磨而得粗製三一對一甲苯 本蛱張尺度边用中S S家辟卑（cNS) T4規岱（210X297公没） (請先閲請背而之注*事項朴{:木頁) 2〇Ui Λ 6 Η 6 五、發明説明（55) (請先間-背而之注*卞項外{ 木頁) 磺醯胺衍生物。 B 部份· 3 ，4，5 ，6 1 7 ，8，9 ，10’11—九氫一 15—確基一2，17: 12，14 —二乙稀基一1 ’ 4 ’ 7 ’ 10，13 —五氮雜笨并環十五炔

將1份在Α部份中所製得粗製巨環物溶於10份濃硫酸（ 96%)中後，將反應混合物在氬氣下授拌並加熟至 。於2 4小時後，將溶液Μ冰水浴剌烈搜拌而以1 0 %氫氧化 納溶液處理直到出達到1 〇為止。將水相以等體積之氯彷萃 取5次，將萃取物结合後，在無水硫酸納之上乾燥。然後 將鹽類移除而以過滤方式’將滤液在氬氣下蒸發。將祖製 三胺纯化而Μ從乙醇/水结晶。 C 部份· 3 ，5 ，6 ，8 ，9 ’ 11 一六氣一15 —硝基一 4 ，7 . 10—參（對甲苯碩醯胺基）一2 ，17: 12· 14—二 乙捕基一1 ，4 ，7 ，10，丨3 —五氮·雜笨并環十五缺

CHyCOOC^Hj 本尺度边用中a SiU?iMCNS)T4規fM2l0x297公货） 60 aoi^1 Λ β _Η_6_ 五、發明説明（56) 將下列之一種混合物（1份在Β部份中所製成之三胺基 巨環物和10碳酸納及3份溴乙酸乙酯）作為在無水乙腈中 之3重量％溶液在60=〇及氬氣下攪拌歴24小時。然後將反 應混合物冷卻至室溫、過滤後、將溶劑蒸發之。將殘留物 進一步纯化而以在冷醚中和液研磨。 D 部份.15 —瞭基 一 3，5 ，6，8 ，9 ，11 —六氧一4 ，7 ，10 —參（乙氧羰甲基）一2 ，17: 12，14 —二乙烯 基一1 ，4，7 ，10，13 —五氮雜苯并環十五炔 (請先間-背而之注念事項朴{』木頁)

將1重量份c部份之硝基三酯溶於1 ο 〇重量份由四氫呋 喃（THF )及乙醇之50 / 50混合物。將2當量甲酸菝（在 6倍重量水中）加入，接著加人2當量10%Pd / C。將反 應混合物於氬氣下，在室溫攪拌過夜後，將反應混合物在 氬氣下過滅，將烴過漶觸媒在氬氣下依順序Μ T H F 、乙醇 反二氮甲烷清洗。將羥结合之滤液及洗出液漶縮，將殘留 物溶於纪仿中後..，沄仿溶液Κ水洁洗2次。將有槠相濃縮 成油，促成结晶而以加入甲醇。將產物在甲酵中和液研磨 、過/滅、然後在空氣中乾堍。 Ε部份•將D部份之·胺三酷與3當量氫氧化納在5%含水 弔S5中而於室溫下攪拌歷24小時。將溶劑在抽與空下移除 木紙张尺度边用中a a 規^(210x297公垃） 6 1 五、發明説明（57) Λ 6 Η 6 後，將產物㈧與少量冷甲醇和液研磨。將產物1以過濾方 式單離出。 製備8 15—異硫氰酸根一 4 ，7 ，10 —參（羧甲基）一 2 . 17: 12，14 —二乙烯基一1 ，4，7 ，10— 13 —五氮 雜苯并環十五炔

NCS

將 1 重 量 份 從 製 備 7 1 E 部 份 之 胺 三 納 鹽 在 200 份 甲 醇 中 而 於 室 溫 下 m 拌 之 〇 將 此 在 周 遭 溫 度 下 先 後 以 1 當 量 硫 光 氣 ( 溶 於 2 重 量 份 四 氫 呋 喃 中 ) 及 1 當 量 份 三 乙 胺 ( 溶 於 2 重 量 份 四 氫 呋 喃 中 ) 處 理 ° 於 1 小 時 後 t 將 反 應 混 合 物 濃 m 成 為 殘 留 物 1 在 二 氯 甲 综 中 拌 漿 後 1 產 物 以 過 方 式 ero 単 離 出 -- 製 備 9 2 — 甲 基 — 3 — 硫 — 4 — { 15 — 3 » 5 1 6 > 8 f 9 1 11 — Λ,. 氫 — 4 1 7 1 10 — 參 ( 羧 甲 基 ) — 2 * 17 ： 12 1 14 — 一 乙 烯 基 — 1 ) 4 1 7 1 10 i 13 — 五 氮 雜 苯 并 iS 十 五 炔 Μ j 肢 脲 本紙張尺度边用中S Η家櫺f-(CNS) τ Ί規彷（210X297公龙） ?先間請背而之注*市項外(、木頁) 五、發明説明（58)

Λ 6 η 6 將1當量甲基聯胺溶於10份甲§1中之溶液快速加至由1 重量份15 —異硫氰酸根一4 ，7 ，10 —參（羧甲基）一2 ，17: 12，14 —二乙烯基 一1 ，4，7 ，10，13 —苯并五 氮雜環十五炔（在上製備8中所製得）及200重量份甲醇 而在氬氣下及在室溫中之新製成和羥攪拌之混合物中。於 室溫歷1小時後，將溶劑移除而K減壓揮發方式，將殘留 物與不含氣之無水醚和液研磨後•單離出固體而以過濾方 式。 製葡 1 0 2 一 甲基一3 —硫一4 — { 5 — ( 〔6 ，6” 一二 一雙（羧甲基）胺甲基〕一2 : 2 ，6’： 2”一聯三吡啶一 4’一基）一 2 —甲氧苯基）一胺腺 紀消部十央榣^工A卟''-作沁印虹

63 五、發明説明（59) 將1當量甲基聯胺溶於10份甲醇中之溶液快速加入至由 1重量份在製備6中所製得TMT-異硫氰酸四納鹽及200重 量份甲醇在氬氣下及在室溫下之新製成和經攪拌之混合物 中。於室溫歷1小時後，將溶劑移除而以減壓蒸發方式| 將殘留物與不含氧之無水醚和液研磨後，將固體K過濾方 式單離出。 郵備 1 1 2 —甲基一3 —硫 一 4 — { 5 一 ( 〔6 ，6” 一雙 (Ν，，Ν· —二羧甲基一N —甲聯胺基）一2 : 2 ，6.: 2”一聯三吡啶一 4'一基〕一2 —甲氧苯基））胺脲 (諳先間讀背而之注*卞項/|-&.木頁)

Ά 部 屮 央 準 A Π X ;/ί i'r /·、 ·. t 泎 f-L 丨:p 將1當最甲基聯_胺而溶於1 0份甲酵中之溶液快速加入至 由1重最份在製腐3中所製得Τ Η Τ -異硫四钠鹽及2 0 0 IS适，份甲醇而在Μ氣下及在室溫下之新製成和遝搅拌之混 合物中。於室溫歷1'小時後，將溶劑移除而Κ減壓揮發方 式|將殘留物與不含氧之無水_和液研賠後，將固SI Μ過 本WJfc尺度边用中ΗΗ家標iMCNS)T 4^^(210x297公犮） 五、發明説明（60) Λ fi II 6 濾方式單離出。 製備1 2 2_甲基一 3 —硫一4 — 〔2 ，9 —二一雙（疫 甲基）胺甲基一1 ，10 —菲佐啉一 5 —基〕胺脲四納 Η

NaOOC COONa NaOOC COONa (請先閱請背而之注意卞項外^‘：木頁} 裝. 屮 央 平 IS Γ， /··_ 丨·.!， 11 將1當量 1重量份在 2 0 0重量份 合物中-·於 式，將殘留 以過漶方式 A部份一將 將TMT或 碳水化合物 在纯水中之 PBS , ( 10毫 奄克/奄升 室溫及暗處 甲基聯胺而溶於 製備5中所製得 甲醇而在氬氣下 室溫歷1小時後 物與1 0份不含氧 單離出。 郸備杭ss a tmt 蝥合劑附著至抗 Τ Η Τ附著至抗體 群姐.使在抗體上 溶液（1 1 0奄升 莫耳漶度磷酸钠 溶液中。'將所得 下孵采歷1小時 ίο份甲醇中之溶液快速加至由 P h e Μ T -異硫·氫酸四納盩及 及室溫下新製成及經攪拌之混 ，將溶劑移除而Μ減壓蒸發方 之無水醚和液研磨後，將固體 及逛ΤΗΤ 之共扼鹊 體之方法 上而以N a I 0 4氣化在抗肊上之 產生醛群组·:將0 . 1 Μ N a I 0 Λ )加至1牽升由Β 7 2 . 3 抗脰在 -0 . 15M NaC 1 ) ·ρΗ6.0 之 4 溶液之pH再調堅至6.0後，在 。於孵養後，將過刺過換骹鹽 本紙沒又度边用中S Η家诈孕（CNS) 規格（210X297公没） 65 五、發明説明（61) Λ 6 It 6 央 平 A：, Π X 消 f；' 移除而Μ將抗體 出6 . 0 )平衡（ 最高吸收度（在 製得0 . 33Μ之 將囿體螯合劑溶 超過pH 9 . 0因此 每一棰蝥合劑溶 將每種所得溶液 及暗處孵養歷5 694-5 ； 5M在約 Μ耳濃度之最終 成之Sch i ff (許 袭將浴液離心（ 溶解螯合劑後， 器中將彼濃縮至 K移除過刺蝥合 含最高吸收度（ 份集合。將羥集 0 . 1 5 Μ N a C 1 ·出 以此棰方式所 比率為約1 . 7 。 ：Si s: B 7 2 . 3 (¾ 之抗體，而首先 溶液通過Sephadex G50柱而已M PBS ( 灌滿）。將每1毫升部收集之而集合具有 280奄微米處）之二部份。 每一棰蝥合劑（ΤΜΤ或ΤΗΤ )之溶液而Μ 於P B S (出6 . 0 )中。將溶液之出升高至 Μ6Μ HC1將pH調整至約6.8 。將200微升 液加至分開之2毫升部份之抗體溶液後， 之pH調整至PH6.0 。將這些混合物在室溫 小時。然後將 NaCNBH3 (Aldrich 29 · 1M HaOH中）加至每一種溶液中使達10毫 濃度後，將出調整至6.0以減少由醛所形 夫氏）鹼。將混合物在室溫孵養過夜。然 E p p e n d 〇 r f 5 4 1 2型）Μ移除過夜沉澱之不 在Centricon 30 (Amicon產品）之微濃縮 1毫升。將這些溶液通過Sephadex G50柱 劑及N a C N B Η 3 。收幣每1毫升部份後，將 2 8 0毫微米）之每一 Μ ϋ合劑溶液之2部 合部份透析而以對著0 . 0 1 Μ乙酸納， 6 . 0巨更換级衝劑2次 台於分析期問進 'iiij !hi :'-·ί- 1λ wll 4^' j) jX p；i； 產製共軛龆典型具有ΐ Μ ΐ或T H τ對抗扣之 廣為热知之一種對a腸结腸Μ溜相閟抗原 由國立衛生研究所所供;- (請先閱-背而之注*市項#^ 木^:)

f!-- 丨:P 201^1 Λ 6 Π6 五、發明説明（63 中失 平 ij(5Π 消tv ίί:· -ft印 1i

Β邰份一分析蝥合劑對抗體之比率 测定抗體在共軛體溶液中之濃度而Μ 檢定法並且使用牛免疫球蛋白作為蛋白 濃度以光譜方式測定而以使用在350毫 係數。用於ΤΜΤ-Β72.3共轭體方面，將 0.5毫克）置入1毫升0.01Μ乙酸納. (出6.0 )中後，加入過刺之Eu*3。使 毫微米處之吸收澜定蝥合劑在這些 C部份一抗體一！5合劑共轭體在活體外 疫競爭性檢定） 將Linbro ΕΙΑ I 加上微標度盤之槽 加入100微升/槽孔之4微克/毫升牛 M4503 )，（一棰對B72.3抗體之抗原 後，在室溫孵養歷1小時。於K P B S ( 次後，將槽孔阻斷而以加入2 0 0微并/ 牛血清白蛋白，A-7906 ) — P BS ( pH 6 . 室溫孵養歷1小時。將盤内物又以P B S 次製成共軛_樣品而以具有1 X 1 〇 -。 中，出6.8 )而含有1%馬血清（Sign 這些溶液中製成在此相同緩衝劑之稀釋 毎i ·沌丨5品加罕擠孔屮而Μ袒切u; 簖滂後，將盤Μ P B S ( pH (5 · 8 )浈洗3 而以每榧孔加入1 0 0微升兔抗一鼠[7 ( a t Jackson Labs， 315-035-047 )在 PBS 使用B ioRad蛋白質 質標準劑。將THT 微米之迓量得消光 一部份共轭體（約 0.15M NaCl緩衝劑 用此種溶液在330 溶液中之数量。 之功能性試驗（免 孔Μ抗原塗層而Μ 頜下鈷液（S Uma )在PBS中之溶液 r+i 6 . 8 >清洗骰3 槽孔之1 % BSA ( 8 )之溶液後，在 (pH 6 . 3 )清洗 3 «耳濟度（在P B S a S-7390)，且從 劑，將100奄升之 Γι ·' if.? !小丨j.'f 次，然後記下分數 ，）2 H R P 共 _ S3 ( (pH 6 . 8 )中而含 本认法尺度边用中田Η家《 iM C N S) 規fM 2 ΚΙ X 2 y 7公让） Λ Η 6 201^1 五、發明説明（63ί 1 %牛血清之1 : 1000稀釋劑。於室溫下孵養歷1小時後 ，將槽孔MPBS (出6.8 )清洗3次。一旦每槽孔加入 100 微升 ABTS-HRP受質（Kirkegarrd 及 Perry Labs， Product #506502及506402)後•則顯色。將反應中止而 K加入等體積之4N HzSOa。使用Titertek Multiscan儀 器之414毫微克濾器而於15分鐘後讀出顏色。 若以此種方法試驗|則發現B72 . 3與TMT或THT之免疫 共轭體具有免疫反應性而此係與負的B72.3相比較而言。 將数據列於圖1及圖2中。圖1亦含有用於B72 . 3-THT共 轭體之含ί複合體而此係Μ如前文所述之铕複合體之相同方 式製成。 例1罕2 製備及評估ΤΜΤ共扼鵂之的射栈素 （""Μη及 )怒合_抅会鵲•日W f)TPA共細聽之的射枝涊（

Y 锫合劑祷合艄作為hh較對眧物 在活體内行蝥合劑一抗體共轭體一生物分佈實驗之功能 性試驗 部 屮 火 芈 入:! α r. 消 Vi' L試驗材料。所試驗之免投共扼體除如上述所製成之 B 7 2 . 3 - Τ Μ T共铌體或B 7 2 . 3 - D T P A共扼體，其中將D T P A附替 <經由速接劑锊）至在抗粑h之绳^化碳水化介均而W使 nj -/I-i iW ij ； }fj ίί； 1 M i ft-j ϊ；ί* CJi 11½ iyi -il in )j (h ?- M放射同位素標記共扼艄' M 1 1 1 I n或45。Y罔紀之抗f3 --贷合劑共扼體係在經磷酸鹽坊衝这鹽水（出6 . 0 ')中--將政射核素(約1微居里）加至共轭33洁戕（1窀升含約 1奄克抗《 —蝥合劑共扼涠）中，混合後，在宽溫孵養约 .f丄 'Ί' 71 本认汰尺度边用中a S家樣準（CNS) 規岱（21 ο X297公甘） A β Π6 五、發明説明％4 ) (請先閲請背而之注意事項再{?木頁) 30分鐘。將任何不蝥合金臛従每一種共轆體製劑中移除而 M HPLC凝膠雇析（TSK 3000SW柱）。監測柱洗出物中之蛋 白質（0D 280毫微克）及放射活性（放射活性監測器）。 從此種數據中計算經純化及搮記共轭體之專一性活性。立 即使用此種共軛體於生物分佈研究中。 31 —般方法。使用五隻鼠於每一項試驗群组中而用於β°Υ 生物分佈研究且在每一群姐中使用3隻鼠用於"ηΐη研究 中。用於每隻鼠之標的劑fi為每劑量10微克具放射活性共 軛體*每微升20至100毫克抗體，每劑量大於50微居里。 具腫瘤及不具腫瘤鼠皆於第0天注射。 4·起始腫瘤生長。將每隻裸鼠（裸/裸：狃約 Germantown Taconic雇場而以瑞士背景之種）在其左後腰 经由皮下注射在指數期生長之1 0 0萬涸L S 1 7 4 T细胞而在约 0.2奄升滅菌介質或從佃胞培養之食鹽水中。檢驗鼠之睡 廇生長直到腫瘤大小可量測為止。此後，量測腫瘤達最接 近〇 . 1毫米，而以使用數值測徑器横過二個垂直直徑（長 度X寬度）直到用於全部鼠之長度和寬度乘積涤介於5 0反 1 0 0平方毫米為止。 注射計副。於接插肫屈细胞（第0天）之所需要天敬時 ，將每叟鼠注射紝標記共轭®。將m於w ®之适收；彳w 3己抗體抽取出而人具有28G 1/2时計頻之分別的1帝件 賊岛素注射器（用於投藥用）：，第三Μ 1 0微升酌®之毎_ M試驗物筲保留用於咖嗎（3 )計敝以測定经注射创M : 為了投销而將每一锺含試驗物皙之注射器编號：將每一 本ynt边用中S闲·ίαί 9 (CMS) τ Ί規tM 2川X 公处） 201^1 Λ fi W 6 五、發明説明（ 濟 :!|ί Ί' 央 平 X'/ ί| X w'i fi' f t I 作 ft- 'Ί' li 種注射 。記錄 之含鹽 濃度及 之滅菌 後，立 重、再 S·評估 恰於解 動物於 屍體於 即量測 二褪垂 樣品置 隻動物 腸、右 外來姐 之放射 结果 !H m μί 驗之數 屮濃度 ιίπ能使 器稱重 此項資 酸基它 賽拉嗪 溶液。 即將每 計數及 方法。 剖之前 劑量校 解剖後 每隻動 直直徑 入有標 殺死而 腎、左 碰，狄 ί*1! /、、、 活性而 ，在圖 活性免 據指出 放射活 比 Β 7 2 · 用前者 且在劑量校準器装置中計數 料。將鼠麻醉而Μ在腹膜腔 胺〔（ketamine HC1)而 Κ 〔（5〇162丨116)而以3毫克 將試驗物質涇由眼眶後靜脈 隻鼠在劑量校準器中計數， 記錄數據。 將每隻動物在第0天稱重達 進行。於射影及/或解剖之 準器中計數而K依照標準操 計數。而於解剖之前，使用 物所具腫瘤大小達最接近0. (長度X寬度）。將從每隻 記皮重之培養瓶中，然浚再 Ji(頚部脫位方式。將器官（ 腎、腫瘤、骨髓、肌肉）分 後稱虽達最接近奄克数。測 以咖嗎（δ )計數方式。 3中所顯示之生物分沛係用 & ；Λ Μ 4 m U, 'K yii : ! B 7 2 . :5之經放射搮紀T Μ ΐ共 性。雖然 Β 7 2 . 3 - T Η T - 1 1 Μ η 3 - D Τ Ρ A - 1 1 1 I η 共扼體，ϊ 二 ύ Μ定量放射核素 内注射0 . 15毫升 11毫克/毫升之 /毫升之濃度〕 簧注射。於注射 且將注射器再稱 最接近 前，立 作方法 數值測 1毫米 動物所 稱量瓶 肺、脾 釗且整 定经分 0 . 1克且 即將每隻 。將每隻 徑器，立 而以横過 收集血寂 重。將每 、肝、结 理以移除 割出器官 於6堪鼠而於汴 1 i π Ίλ V:i ->]- ίΦ »4 铌體與的能對腿 共扼w在肝及帑 中之濃度梢π ， (靖先間1?背而之注*卞項#ί. ,·木汀) 於 I η牲捆煦的 201L7i 補充娇曰 五、發明說明（） 於圖4中所示之生物分佈係於注射具放射活性免疫試驗 8天後之结果。將用於每姐5隻鼠之平均值製画而用於檢 驗姐嫌型式。由β°Υ生物分佈數據顯示B72.3-TMT-0°Y共 轆體對腫海檷記0Μ之效果如同B72.3-DTPA-e<)Y共輒體。 然而，若使用B 7 2 . 3 - Τ Μ T - β ° Y共輒雅與B 7 2 · 3 - D T P A - e ° Y共 輛體相比較，則前者之在股骨中頗少。既然股骨（母 路）係用於3σΥ治療之劑悬一限制器官，此項结果指出， 使用此種同位素而言· ΤΜΤ係用於抗體欏記放射核素治療 之較佳蝥合劑。在諸受檢驗之其它姐嫌中*若使用ΤΜΤ作 為螯合_以製備免疫共軛II，則僅發現血液具有較高eGY 。與 B72.3-DTPA-eoY 複合體相比較，咸信 Β72.3-ΤΜΤ-βοΥ 複合體在活應内具有優異的穩定度。 #活肼究 與 B72.3-DTPA-e°Y相比較，若 Β72.3-ΤΜΤ-β°Υ 複合 《降 低達到骨雔β0Υ之數量而此棰骨髓係此種劑量限制姐嫌， 則Μ共粝體接種鼠應發現B72.3-TMT-eQY共輛體比Μ Β72. 3-DTP Α-β°Υ接種之這些具較小毒性。試驗此種假說之 —般方法（殘存研究）如同用於生物分佈研究所說明之這 些但具下列例外。在每一項試驗群姐具8隻含腫溷裸鼠。 注射時間表如下：用於B72.3-TMT-eQY或 B72.3-DTPA-e°Y共轭體（低劑量攝生法）皆於第〇、4及 8天分別給予200微居里（MCi ) 、120微居里（ΜΠ ) 及120微居里。其它二姐鼠則在第〇、4及8天分別接受 400微居里、320微居里及320微居里之二種免疫共軛體 (請先《讀背面之注意事項再填寫本页) •装· •訂. 甲 4(210X297 公讀) -71- Λ 6 Μ 6 201^1 五、發明説明（67) (高劑置攝生法）。觀察殘存鼠（並未表現出試驗物質之 生物分佈）。结果（圖5)指出若使用Β72.3-ΤΜΤ共軛體 投藥·則延長鼠之殘存期。 具抗腫瘤專一性之ΤΜΤ-免疫共軛體

可將ΤΜΤ或其合適衍生物共扼至抗體分子Μ產得一棰抗 體一ΤΜΤ共軛體分子上，而顯示出具有能结合至由抗體可 爱區所確認之標的抗原上之能力。可使用此種共轭體分子 Μ输送放射同位素而Μ ΤΜΤ部份螫合之，此係為了局限化 及/或治療由此種免疫共鈪體所標的之區域。在較佳具體 例中•所選取之抗體係具有與在腫瘤细胞上所表現抗原分 子之廣泛反應性，因此提供一種抗體一 ΤΜΤ共轭體而能输 送放射同位素至匯瘤上用以治療或診斷目的。ING-1係一 種嵌合抗體（在1 9 9 0年3月2 2日刊戟之國際專利公報 y 0 9 0 / 0 2 5 6 9號中有說明）而由鼠科動物可變區及人類免疫 球蛋白恆定區所姐成。產製抗體分子而Μ培養鼠骨趑廇细 胞糸並表現出在基本上如在上面參考公報中所說明之联合 抗體。I N G - 1嵌合抗體所使用濃度係5 · 2奄克/毫升在 5 0毫Μ耳漶度乙酸納媛衝劑（dl 5 6 )並且_以t 5 0窀W (請先閲請背而之注意卞項外(i-木IT) 3Ί ,¾ i'tlrh iafE ¾¾ 析 之blο ^Ί. \_ IX ^ πη^ ~ fbsPD ¾';:)0*-.- . 4J 扦： 1 «π ?.a-li5t5 Ιϊ.·液 镇ttt溶 罘溶將 ο 之 。 oil· *—一 ί 充丨¾ 補 Ο 5 rcr> 2 -,iil為 钠 < 楨 化讷體 氮故终 度硼般 濃度违 耳 ：一而 JJ >,使 滿.克 0 出奄 ( ^ ο 之‘R 4 衡柱約 平從液 劑33溶 ®抗升 跗劏毎 硼姐縮 之納漶 液酸液 溶硼出 53的洗 抗同將 有相30 加升η-以毫Co 内 ΓΟ t- 其 3nt 0 d ·、 -{ Hr. ...! 本紙張又度迈用中S Η家桴中（CNS)亇<1規tM210X297公延） 五、發明説明（6 8) Λ βη 6 ING-1嵌合抗體之濃度。製成ΤΜΤ之NCS 6)，即TMT其中NH2係以“5取代（於 TMT-NCS )〕之溶液而Μ在硼酸納媛衝劑 毫升之濃度，將此加至抗體溶液中使達最 奠耳濃度之ΤΜΤ-NCS 。將溶液溫和混合且 度（約22力）下孵養過夜（約12小時）。 共轆體從TMT-HCS及其它低分子量產物分 滿之超级醣（Superose) 12 HPLC柱且Μ 耳濃度氯化納之50奄莫耳濃度乙酸納緩衝 出。然後試驗ΤΜΤ免疫共扼體用於彼结合 及亦结合至釔一 90同位素之能力而證明了 Μ放射標記在THT部份且可標的腥溷细胞 本發明已以特別參考某些特定較佳R ί3 是應知在本發明精餸及範圍内仍可有效進 衍生物〔（製備 此命名為 中且具10毫克/ 终濃度為1 3 8微 在暗處及周遭溫 將 IHG-1 : ΤΜΤ 離而Μ使用經灌 補充有150毫莫 劑（pH 5 . 6 )洗 至腫瘤细胞抗原 此種共軛體可加 Ο 例詳诎説明，但 行改變及改良。 (^*Kl1?^lrrJta*^Jli#i.^^) C： f- 人:! ί\ 本紙汰尺;用中S Η家堞孕（CNS)T<t規岱（210x297公:i)

Claims (1)

1. 201^*71第义"…svffct請專钊範修色

   l 一種搮的放射活性兔疫試劑，包括 一種金靥系放射性核素離子， 一種複合劑，及 一種共價结合至該禊合劑之免疫反應性群姐， 該複合萷具有下列構造： I3/

   (請先閱讀背面之注意事項再填"本页) •装. •打· 經濟部中夹採準扃印装 其中 R代表氫原子、烷基、烷氧基、烷硫基、烷肢基、烷甲 醯胺基、芳基、芳氧基、雜環或蛋白質具反應性基； R1代表氳原子、烷基、烷氧基、烷硫基、烷胺基、烷甲 醯胺基、芳基、芳氧基、雜環或蛋白質具反應性基； R2代表羥基、羧基、羥烷基、羰亞胺二乙酸、伸甲亞胺

   74(210X297 公廣） •線· A7 201271 BT

   六、申請專利範® —乙酸、伸甲硫伸乙基亞胺二乙酸、伸亞聯胺二乙酸， 或此類酸之鹽類，或二届R2基在一起而代表完成巨環構 造所需之原子，而此巨環含有至少—涸雜原子配位位置 且至少含有一涠而Μ二個較佳之伸烷基而形成環構造之 部份； R3代表氡原子、烷基、烷氧基、烷碕基、烷胺基、烷甲 睡胺基、芳基、芳氧基、雜環或蛋白霣具反應性基； R 4代表氫原子或蛋白質具反應性基； η係0至4 〇係0或1 m係〇或1 ; 但是η及IT1至少有一種為0且R、R1、R3及R4之至少一 種係蛋白質具反II性基。 2 根據申謫專利範画第1項之免疫試劑，包括具下列構造 之複合劑： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本页)

   蛭濟部中央搮準扃印裝 其中R1、R2及R3偽如在申請專利範圓第1項中所界定。 造 構 列 下 具 括 包 劑 試 疫 免 之 項 1 第 圃 範 利 専： 請劑 申合 據裡 根之 A 2 f 4(210X297 公廣) 201L71 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範®

   (請先閱讀背面之注意事項再填弈本頁) •装. 其中R1、R2及R3係如在申講專利範圃第1項中所界定且 η 係 0、1、2、3 或 4〇 4 根據申請専利範園第1項之免疫試劑，其中該複合劑係 ΤΜΤ 或 ΤΗΤ 。 a 根據申請專利範園第1項之免疫試劑，包括具下列構造 之複合繭： •打.

   R3

   .綠· 經濟部中央搮準局印焚 中 其 定 界 所 中 項 1X 第 園 範 利 * 請 申 在 如 係 4 R 及 3 3 f 4 (210X297公 *) 201271 A7 B7 C7 D7_ A、申請專利获面 (請先閑讀背面之注意事項再填窩本頁) & 根據申請專利範圍第1項之免疫試劑*其中該蛋白質具 反應性群姐係選自下列所姐成群姐：胺基、烷胺基、芳 胺基、《胺基、烷基聯胺基、芳基聯胺基、卡肼基、胺 腺基、碕卡肼基、碲胺脲基、擁基、疏烷基、輓芳基、 羥基、羧基、羧烷基、羧芳基、含活性鹵基、2 —移雕 基取代之乙羰基、乙烯磺醢基、乙烯羰基、環氧基、異 氰酸基、異硫氰酸根、醛、伸乙亞胺、丁二醮亞胺氧羰 基；經活化醚基，及混合酸酐類。 7· 根據申請専利範圍第1項之免疫試劑•其中該免疫反應 性群姐係選自下列所姐成群姐：梅、胺基酸、多肽、蛋 白霣、脂蛋白、醣蛋白、激素、蕖劑、類固酵、維生素 、多_類、病毒、原虫、真菌、寄生虫、立克氏次體、 徽菌、血液成份、外源凝集素、毒素、核酸、抗體、抗 原系物質•抗生物素蛋白及生物素蛋白。 a 根據申請專利範圍第1項之免疫試劑，其中具免疫反應 性群姐係抗體。 a 根據申請專利範圍第1項之免疫試劑•其中該免疫具反 應性群姐係一種抗體選自下列所姐成群姐：B72.3 、 9.2.27 ' D612 ' UJ13A 、 NRLU-10 - 7E11C5' CC49' TNT 、 PR1A3 、 ING-4 ' B174及 B43 抗播 ° lft 根據申請專利範園第9項之免疫試劑，其中該抗《係 IHG-1 ° 11 根據申請専利範画第1項之免疫試劑•其中該金饜放射 經濟部中央橾準扃印裝 核素離子係。 -4 -甲 4(210X297 公廣) 201271 Α7 Β7 C7 D7 …、申請專利範面 Ά 一種診斷用成像姐成物，包括如申請專利範園第1項之 玫射活性免疫試劑β ia 一種治療用姐成物’包括如申謫專利範園第1項之放射 活性免疫試劑及其》蕖上可容許載體。 14· 一種具下列構造物霣之姐成物：

   經濟部中央揉準局印焚 其中 R1代表氫原子、烷基、烷氧基、烷确基、烷胺基、烷甲 醢胺基、芳基、芳氧基、雜環或蛋白質具反應性基； 表羥基、羧基、羥烷基、羰亞胺二乙酸、伸甲亞胺 二乙酸、伸甲疏伸乙基亞胺二乙酸、伸亞«胺二乙酸， 或此類酸之鹽類，或二個R 2基在一起而代表完成巨環構 造所需之原子，而此環含有至少一個雜原子配位位置 且至少含有一涸而Μ二個較佳之伸烷基而形成環構造之 部份； R3代表氫原子、烷基、烷氧基、烷硫基、烷胺基、烷甲 .....................................^ .............裝..............................訂..........^ ...............綠 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本页) f 4(210X297 公灃) 201-71 六'申請專利範ffl A7 B7 C7 D7 15· 醢胺基、芳基、芳氧基、雜環或蛋白霣具反應性基； R5代表烷基或烷氧基；且 1?8代表一種蛋白質具反應性基。 根據申請專利範圍第14項之姐成物，其係具有下列構造 OMe

   (請先閱讀背面之注意事項再填荈本页) -装· .訂. ia 一種具有下列構造物質之姐成物：

   R3 •綠. 螆濟部中喪搮準扃印裂 其中 R2代表羥基、羧基、羥烷基、羰亞胺二乙酸、伸甲亞胺 二乙酸、伸甲硫伸乙基亞胺二乙酸、伸亞瞄胺二乙酸， 甲4(210X297 公尨）

   7 7 7 7 A B c D 六、申請專利範圊 或此類酸之鹽類，或二個R2基在一起而代表完成巨環構 造所需之原子，而此巨環含有至少一個雜原子配位位置 且至少含有一個而Μ二個較佳之伸烷基而形成環構造之 部份； R3代表氫原子、烷基、烷氧基、烷硫基、烷胺基、烷甲 醢胺基、芳基、芳氧基、雜環或蛋白質具反應性基；而 且 R4代表氫原子或蛋白具反應性基，但是至少一個R 4基係 一種蛋白質具反應性基。 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) ，装· •訂. .線· 經濟部中央橾準局印裝 f 4(210X297 公廣)