JP3358141B2 - 錯化剤と金属放射性核種イオンとの錯体及びそれを含む診断用組成物 - Google Patents

錯化剤と金属放射性核種イオンとの錯体及びそれを含む診断用組成物

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明に従えば、式： （式中、各R2は基−CH2N（CH2COOH）２又はカルボキシ
アルキルチオアルキル基であるか又は両方のR2基が一緒
になって式： を表し、そしてＲは、任意的に免疫反応性有機化合物に
共有結合していてもよい、タンパク質反応性基を表す
が、各R2が基−CH2N（CH2COOH）２を表す場合にはＲは
３位置にアミノ、イソチオシアナト又は−NHC（＝Ｓ）
Ｎ（NH2）CH3が置換した４−メトキシフェニル基であ
る） 又はその塩の錯化剤と、金属放射性核種イオンとの錯体
が提供される。
発明の背景 1980年以前に、放射性免疫性グロブリンによる腫瘍形
成性部位の標的化は、異なった学会の多数の研究所によ
り示されていた（S.E.Order他、“Use of Isotopic Imm
unogloblin in Therapy,"Cancer Research 40巻、3001
〜７頁（1980年８月）。1980年までに、腫瘍が放射性同
位元素標識抗体を腫瘍連合抗原（tumor associated ant
igen）にまで濃縮すること及び使用した放射性同位元素
標識試薬により、例えば、ガンマ線カメラ画像形成（放
射性同位元素標識免疫シンチグラフィ）及び陽電子断層
撮影法による腫瘍の画像形成並びに治療処置、即ち標的
化放射性免疫試薬による腫瘍サイズの減少の両方が可能
になったことが示された。
放射性同位元素標識免疫試薬による初期の標識化は放
射性ヨウ素により行われた。しかしながら、Scheinberg
他、“Tumor Imaging with Radioactive Metal Chelate
s Conjugated to Monoclonal Antibodies,"Science 21
5巻、19号、1511〜13頁（1982年３月）により示されて
いるように、ヨウ素同位元素は特に腫瘍画像の走査に関
して幾つかの問題点を持ち出した。３種の普通利用され
る同位元素形態の中で、123Iのみが画像形成にとって適
当な発光特性及び診断に安全に使用するために十分短い
半減期を有している。125Iのガンマ放射線は画像形成す
るためには弱すぎる。131Iはしばしば使用されてきた
が、その長い半減期並びに高いエネルギーガンマ放射線
及び細胞に毒性のベータ放射線のために望ましくない。
125Iはまた、大きな腫瘍の治療に使用されてきたが、小
さい腫瘍の処置では効果がないと思われる。更に、放射
性沃素化抗体の急速な代謝は甲状腺内にヨウ素を含有さ
せ、胃及び尿路によるヨウ素の活性な排出をさせる。放
射性ヨウ素のこの分散は、腫瘍がバックグラウンド放射
により隠蔽されるので特定腫瘍の画像形成を妨害する。
診断画像形成及び治療処置のための放射性抗体による
腫瘍標的化に加えて、同様の標的化が、イヌ心臓ミオシ
ンに対する抗体を使用して梗塞、特に心筋梗塞の診断画
像形成について行われており〔Khaw他、“Myocardial I
nfarct Imaging of Antibodies to Canine Cardiac Myo
sin Indium−111−Diethylenetriamine Pentaacetic Ac
id,"Science 209巻、295〜７頁（1980年７月）〕、アテ
ローム斑を標的化することによるアテローム硬化の画像
形成について行われている。放射性ヨウ素を使用する際
の腫瘍画像形成及び治療処理についとも同じ欠点が、診
断梗塞画像形成の場合に存在する。
111Inがエチレンジアミン四酢酸（EDTA）及びジエチ
レントリアミン五酢酸（DTPA）のようなポリアミノカル
ボン酸と錯体化することが知られている。しかしなが
ら、活性化カルボニル類でのアシル化、芳香族ジアゾニ
ウムカプリング又はブロモアセチル化により行われる、
これらの錯化剤へのタンパク質（抗体）の共有結合は、
Brechbiel他〔“Synthesis of 1−（ｐ−Isothiocyanat
obenzyl）Derivatives of DTPA and EDTA.Antibody Lab
eling and Tumor Imaging Studies,"Inorg.Chem.25巻、
2772〜81頁（1986年）〕に記載されているイソシアナト
ベンジル誘導体が、タンパク質と錯化剤との共有結合を
容易にするために作られたとしても、効果がない。
最近、研究努力は、改良された抗体（Ab）、例えば、
特異的標的化のためのモノクローナル特異抗体、放射性
核種と錯体形成又は直接結合する抗体、好ましい放射性
核種並びに抗体及び錯化剤とのその組合せに指向してい
る。幾つかの試みが錯化剤を改良することに向けられ
た。
にもかかわらず、EDTA及び特にDTPA及びその誘導体
は、抗体を共有的に結合し金属放射性核種を共有的に錯
体形成するための広く用いられている錯化剤に留まって
いる。しかしながら、DTPAの不適性は、例えば、Parker
他、“Implementation of Macrocycle Conjugated Anti
bodies for Tumor Targeting"Pure and Appl.Chem.,61
巻、９号、1637〜41頁（1989年）により、「従来、金属
放射性核種は、抗体に共有結合する非環式キレート（例
えば、EDTA又はDTPA）により錯体形成されていた。この
キレートの何れも金属がin vivoで解離する傾向がある
ので適当ではなく、…」と指摘され、Cox他、“Synthes
is of a Kinetically Stable Yttrium−90 Labelled Ma
crocycle−Antibody Conjugate,"J.Chem.Soc.,Chem.Com
mun.797〜８頁（1989年）により、「イットリウム−90
は治療にとって魅力的な同位元素であるが、その臨床的
使用は、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）のような
キレートを結合した抗体からの90Yの酸促進放出の結果
である骨髄毒性のために非常に制限されるであろう」と
指摘されている。
改良錯化剤を開発する以前の試みはそれ自身の欠点を
有する材料を提供している。例えば、Craig他“Towards
Tumor Imaging with Indium−111 Labelled Macrocycl
e−Antibody Conjugates,"J.Chem.Soc.Chem.Commun.,79
4〜６頁（1989年）には、大環状六配位リガンドが記載
されているが、「このアプローチの限定された特徴は、
大環状物の111In標識化が抗体複合（antibody conjugat
ion）の前に必要なことである。（４）によるインジウ
ム結合は有効な放射性同位元素標識化のために37℃では
不十分な速さである。…それで、まだ動力学的に安定な
錯体をin vivoで形成する穏和な条件（20℃、pH5、＜１
時間）下でインジウムを急速に結合するその能力のため
に、他の三塩基性トリアザ大環状リガンドを遮蔽した。
しかしながら、リガンド濃度が10μＭであるとき（６）
のみが有効であることがわかり、これらの条件下で96％
放射性同位元素標識収率が測定された（30分、pH5、20
℃）。」と述べられている。
にもかかわらず、30分はまだ不満足である。特に、患
者の処置の時点でより短い寿命の放射性核種をより長い
放射性核種から必然的に発生させなくてはならないと
き、数分内で即ち患者に薬物を投与する直前の約５分以
内に、In,Y,Sc,Ga,Ge等のような好ましい放射性核種を
共有的に結合させる、EDTA及びDTPAより優れた錯化剤を
持つことが非常に望ましい。
治療用に好ましい放射性核種であるイットリウムの錯
体は、従来の錯体に関してインジウムの錯体よりも安定
性が悪い傾向があることに注目すべきである〔Mather
他、“Labelling Monoclonal Antibodies with Yttrium
90,"Eur.J.Nucl.Med.15巻、307〜312頁（1989年）〕。
Mather他では、放射性同位元素標識抗体を使用する癌患
者に於ける生体分布（biodistribution）研究で、in vi
voでイットリウム標識抗体の安定性がその111In標識対
応部分（counterparts）のそれよりも大きくないこと及
びこれらの発見が当該技術分野の他の最近の刊行物によ
り支持されていることが教示されている。
キレート化剤が（Abのような）タンパク質に共有結合
しているとき、タンパク質はキレート化剤が結合してい
るアミン及びスルフヒドリル基のホスト（host）を含ん
でいるので、タンパク質は普通１分子より遥かに多いキ
レート化剤を受容し得る。多数のキレート化部位が各タ
ンパク質分子にどのようにして結合しているかを決定す
ることがしばしば非常に重要である。これを行うための
殆どの便利な方法は分光光度法的手段によるものであ
る。しかしながら、先行技術のキレート化剤及びそのキ
レートは有用なタンパク質のものと重なるスペクトル吸
収を有しており、重なるスペクトル吸収が互いに覆うの
でタンパク質１分子当たりのキレート化する部位又はキ
レート化された部位の数の分析的測定を分光光度法によ
り明確に行うことはできない。それで、その分光光度法
的吸収及びその金属キレート分光光度法的吸収が、キレ
ート化剤が化学的に結合するタンパク質のものと重なら
ない、タンパク質に複合するためのキレート化剤を得る
ことが非常に望ましい。
幾つかの先行技術の組成物に伴うその他の問題点は、
放射性核種キレートを形成する前にキレート化剤を還元
剤により活性化しなくてはならないことである。タンパ
ク質複合体（protein conjugates）が放射性核種キレー
トの形成の前に形成されるようにした場合には、錯化剤
を活性化するために使用された還元剤が蛋白質を分解し
得る。例えば、テクネチウム（Tc）及びレニウム（Re）
を錯体形成するために現在使用されている好ましいキレ
ート化剤は、還元剤（ジチオトレイトール）で還元され
放射性核種キレートを形成する前にキレート化剤を活性
化しなくてはならない硫黄含有基を介して金属に錯体化
する。若しジスルフィド結合を含むタンパク質複合体が
還元の前に形成されると、還元剤は蛋白質を分解し得
る。放射性核種で錯体化される前にタンパク質と共に複
合体を形成し得るキレート化剤を持つことが非常に望ま
しい。
要約すれば、キレート化剤を免疫反応性タンパク質に
共有結合で結合させることにより免疫反応性複合体を作
るために使用される種々の現在利用可能な放射性同位元
素標識抗体及びキレート化剤並びに診断画像形成及び標
的化治療で使用するためのその放射性核種錯体は、下記
の欠点、即ち、１）毒性;2）急速代謝のための試薬の分
散;3）不適当な発光特性;4）複合体製造のために不十分
なタンパク質との共有結合;5）遅い金属との錯体形成;
6）不安定な金属錯体形成、例えば、温度、時間又はpH
に関して;7）複合体を形成することと金属錯体形成を望
むまで貯蔵中に安定に留めることができないこと;8）放
射性核種錯体試薬を分光光度的に分析できないこと及び
９）タンパク質を分解する活性化工程無しに錯体形成す
ることができないことの１個又はそれ以上を持ってい
る。
発明の要約 本発明者等は、上記の従来技術の問題点を解決した標
的化放射性免疫試薬を見出した。本発明の標的化放射性
免疫試薬は、金属放射性核種イオン；ピリジン、ビピリ
ジン、テルピリジン、四ピリジン（quaterpyridine）、
五ピリジン（quiquepyridine）、六ピリジン（sexipyri
dine）又はフェナントロリンの誘導体である錯化剤：及
びタンパク質反応性基を介して錯化剤に共有結合してい
る免疫反応性基からなる。
更に詳しくは、本発明により、金属放射性核種イオ
ン、錯化剤及び錯化剤に共有結合している免疫反応性基
からなり、錯化剤が下記構造式Ａ−Ｉを有する標的化放
射性免疫試薬が提供される。
（式中、Ｒは、水素、アルキル、アルコキシ、アルキル
チオ、アルキルアミノ、アルキルホルムアミド、アリー
ル、アリールオキシ、複素環又はタンパク質反応性基を
表わし、 R1は、水素、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、
アルキルアミノ、アルキルホルムアミド、アリール、ア
リールオキシ、複素環（heterocyclyl）又はタンパク質
反応性基を表わし、 R2は、ヒドロキシ、カルボキシ、ヒドロキシアルキ
ル、チオアルキル、カルボニルイミジノ酢酸、メチレン
イミノジ酢酸、メチレンチオエチレンイミノジ酢酸、カ
ルボキシアルキルチオアルキル、ヒドラジニリデンジ酢
酸若しくはこのような酸の塩を表わすか又は２個のR2基
は一緒になって、少なくとも１個の複素原子配位部位及
び少なくとも１個の、好ましくは２個の環構造の一部を
形成するアルキレン基を含む大環状環構造を完結するた
めに必要な原子群を表わし、 R3は、水素、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、
アルキルアミノ、アルキルホルムアミド、アリール、ア
リールオキシ、複素環（heterocyclyl）又はタンパク質
反応性基を表わし、 R4は、水素又はタンパク質反応性基を表わし、 ｎは0,1,2,3又は４であり、 ｏは０又は１であり、 ｍは０又は１であるが、 ｎ及びｍの少なくとも１個は０であり、そしてR,R1,R
3及びR4の少なくとも１個はタンパク質反応性基であ
る。） ピリジン類は構造式Ａ−II: （式中、R1,R2及びR3は上記定義した通りである） を有する。
ビピリジン類、テルピリジン類、四ピリジン類、五ピ
リジン類及び六ピリジン類は、構造式Ａ−III: （式中、R,R1,R2及びR3は上記定義した通りであり、ｎ
は0,1,2,3又は４である） を有する。
フェナントロリン類は構造式Ａ−IV: （式中、R2,R3及びR4は上記定義した通りである） を有する。
本発明は、構造式Ａ−Ｉを有する新規なテルピリジン
類、四ピリジン類、五ピリジン類及び六ピリジン類を提
供する。本発明の好ましいテルピリジン類は上記構造式
Ａ−III〔式中、ｎ＝１であり、Ｒは （式中、R5はアルコキシ又はアルキルであり、ｐは0,1,
2,3又は４であり、そしてR6はタンパク質反応性基を表
わす）である〕を有する。
本発明は更に、好ましくは上記構造式Ａ−IV（式中、
少なくとも１個のR4はタンパク質反応性基である）を有
する新規なフェナントロリン類を提供する。
本発明はまた、前記標的化放射性免疫試薬からなる治
療及び診断用組成物を提供する。
本発明は更に、ａ）患者に有効量の上記の部位を標的
化し得る放射性免疫試薬を投与すること及びｂ）例え
ば、フィルム又は電子センサーのような放射線感光性要
素又はデバイスを標的化部位から発光される放射線で画
像様に活性化することからなる、患者の部位の診断画像
形成方法を提供する。
本発明による患者の疾患部位の治療方法は、患者又は
患者からの標本に有効量の上記の部位を標的化し得る放
射性免疫試薬及びそのための医薬的に受容し得るキャリ
ヤーからなる治療組成物を投与することからなる。
イットリウムを含有する上記標的化放射性免疫試薬
が、他のイットリウムキレート化剤で製造した放射性免
疫試薬と比較したときより低い放射毒性を示すことが本
発明の有利な特徴である。
本発明の標的化免疫試薬が急速に代謝せず、有害に分
散しないことも、有利な特徴である。
上記錯体がタンパク質及びその他の生物学的分子と共
有結合を有効に形成することが他の有利な特徴である。
本発明の更に他の有利な特徴は、上記免疫試薬が良好
な発光特性を示し、容易に分光光学的分析に付されるこ
とである。
更に、この錯化剤のタンパク質複合体を形成し、金属
錯化を望むまで貯蔵することができ、そしてタンパク質
を分解する活性化工程を必要とすることなく、錯体形成
を行うことができる。
更に、この錯化剤は金属と急速に錯体を形成し、得ら
れるキレートは時間、温度及びpHに関して優れた安定性
を示す。
本発明のその他の利点は、添付する図面に照らして読
むとき、好ましい態様の下記の記述を参照して容易に明
らかになるであろう。
図面の簡単な説明 図１は、B72.3−THT−Sc+++、本発明の放射性免疫試
薬、B72.3−THT複合体及び未変性B72.3の免疫能アッセ
イを示す。
図２は、B72.3−THT複合体、B72.3−TMT複合体の２種
の製剤及び未変性B72.3の免疫能アッセイを示す。
図３は、B72.3−TMT−111In、本発明の放射性免疫試
薬、及びB72.3−DTPA−111Inの生体分布研究の結果を示
す。
図４は、B72.3−TMT−90Y、本発明の放射性免疫試
薬、及びB72.3−DTPA−90Yの生体分布研究の結果を示
す。
図５は、B72.3−DTPAの低用量養生並びにB72.3−TMT
及びB72.3−DTPAの高用量養生についての延命曲線、即
ち、接種の最初の日以降各日の生き残ったマウスの数で
ある。
図６及び図７は、TMT,TMT−Y+++及びTMT−Pb++の吸収
スペクトルである。
好ましい態様の説明 以下の記述は、第一に治療及び診断画像形成用組成物
及び方法に於ける標的化放射性免疫試薬の用法に関す
る。更に、標的化放射性免疫試薬は診断試薬として、例
えば、放射性免疫電気泳動試薬として有用である。
本発明の免疫試薬は、金属放射性核種イオン、錯化剤
及びタンパク質反応性基を介して錯化剤に共有結合して
いる免疫反応性基からなる。
錯化剤は、好ましくは前記発明の開示に記載した構造
式Ａ−Ｉを有する、ピリジン、ビピリジン、テルピリジ
ン、四ピリジン、五ピリジン、六ピリジン又はフェナン
トロリンの誘導体である。
式Ａ−Ｉに於いて、各Ｒは独立に、水素；メチル、エ
チル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓ−ブチル、
ｔ−ブチル、２−エチルヘキシル、デシル、ヘキサデシ
ル、オクタデシル等のような好ましくは炭素数１〜約20
の直鎖又は分枝アルキル；アルコキシ（そのアルキル部
分は上記Ｒについて記載したように炭素数１〜約20であ
る）；アルキルチオ（そのアルキル部分は上記Ｒについ
て記載したように炭素数１〜約20である）；アルキルア
ミノ（そのアルキル部分は上記Ｒについて記載したよう
に炭素数１〜約20である）；アルキルホルムアミド（そ
のアルキル部分は上記Ｒについて記載したように炭素数
１〜約20である）；フェニル、ナフチル、フェナントリ
ル、ニトロフェニル、ヒドロキシフェニル、アミノフェ
ニル、ヘキサデシルアミノフェニル、オクタデシルアミ
ノフェニル、トリル、キシリル、メトキシフェニル、３
−アミノ−４−メトキシフェニル、４−メトキシ−３−
（Ｎ−メチルヒドラジノチオホルムアミド）フェニル、
３−イソシアナト−４−メトキシフェニル、３−イソチ
オシアナト−４−メトキシフェニル、メチルチオフェニ
ル、カルボキシフェニル及びアルキルフェニルのような
アルキルアリール（そのアルキル部分は上記Ｒについて
記載したように炭素数１〜約20である）のような、好ま
しくは炭素数約６〜20の置換若しくは非置換のアリー
ル；アリールオキシ（そのアリール部分は上記Ｒについ
て記載したように炭素数６〜約20である）；ピリジル、
メチルピリジル、ニトロピリジル、メトキシピリジル、
オキサゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル及びキノリル
のような好ましくは５個又は６個の核炭素原子及びN,S,
P若しくはＯのようなヘテロ原子を含む置換若しくは非
置換の複素環；又はタンパク質反応性基である。特に好
ましい態様に於いて、Ｒは４−アルコキシ−３−アミノ
フェニル基又は４−アルコキシ−３−イソチオシアナト
フェニル基である。
各R1は独立に、Ｒについて特定した基から選択され
る。R1は好ましくは水素又はタンパク質反応性基を表わ
す。
各R2は独立に、ヒドロキシ；カルボキシ；ヒドロキシ
アルキル（そのアルキル部分は好ましくは炭素数１〜４
である）例えば、ヒドロキシメチル；カルボニルイミノ
ジ酢酸、〔−CON（CH2COOH）２〕；メチレンイミノジ酢
酸、〔−CH2N（CH2COOH）２〕；メチレンチオエチレン
イミノジ酢酸、〔−CH2SCH2CH2N（CH2COOH）２〕；カル
ボキシアルキルチオアルキル（そのアルキル部分は独立
に炭素数１〜４である）例えば、−CH2CH2SCH2CH2COOH;
1−ヒドラジン−２−イリデンジ酢酸、〔−NHN（CH2COO
H）２〕及び１−メチル−１−ヒドラジン−２−イリデ
ンジ酢酸、〔−Ｎ（CH3）Ｎ（CH2COOH）２〕のような１
−ヒドラジン−２−イリデンジ酢酸；並びに2,6−ジカ
ルボキシ−４−ピペリジニル又は例えば、Na,K,Li等の
ような金属から形成されるこのような酸の金属塩並びに
アンモニウム塩、テトラエチルアンモニウム塩及びテト
ラメチルアンモニウム塩のようなアンモニウム塩を含む
このような酸の塩から選択される。また、２個のR2基は
一緒になって、（ａ）少なくとも１個のイオンのための
複素原子配位部位及び（ｂ）少なくとも１個の、好まし
くは２個の環構造の一部を形成するアルキレン基を含む
大環状環構造を完結するために必要な原子群を表わす。
大環状環形成基は、2,2−ビス（エトキシカルボニル）
−1,3−プロピレンのような複素原子基置換アルキレ
ン；オキシビス（アルキレン）、例えば、オキシビス
（エチレン）、オキシビス（エチレンオキシメチレ
ン）、オキシビス（エチレンオキシエチレン）のような
複素原子含有基；メチレンオキシエチレンオキシメチレ
ンのようなアルキレンオキシアルキレンオキシアルキレ
ン;1,4−ジメチル−5,6−フェニレンビス（オキシメチ
レン）、2,6−ジピリジレンビス（メチレンオキシメチ
レン）、２−メトキシ−５−メチル−1,3−フェニレン
ビス（メチレンオキシメチレン）及び1,10−フェナント
ロリン−2,9−イレンビス（メチレンオキシメチレン）
のようなアリーレン−ジ（オキシアルキレン）；カルボ
キシメチルイミノビス〔トリメチレン（カルボキシメチ
ル）（CH2COOH）イミノメチレン〕、〔−CH2N（CH2COO
H）（CH2）3N（CH2）3N（CH2COOH）CH2−〕；カルボキ
シメチルチオエチルイミノビス〔トリメチレン（カルボ
キシメチルチオエチル）イミノメチレン〕、〔−CH2N
（CH2CH2SCH2COOH）（CH2）3N（CH2CH2SCH2COOH）（C
H2）3N（CH2CH2SCH2COOH）CH2−〕；カルボキシメチル
イミノビス〔エチレン（カルボキシメチル）イミノメチ
レン〕、〔−CH2N（CH2COOH）CH2CH2N（CH2COOH）CH2CH
2N（CH2COOH）CH2−〕；カルボキシメチルチオエチルイ
ミノビス〔エチレン（カルボキシメチルチオエチル）イ
ミノメチレン〕、〔−CH2N（CH2CH2SCH2COOH）CH2CH2N
（CH2CH2SCH2COOH）CH2CH2N（CH2CH2SCH2COOH）CH
2−〕；エチレンビス〔（カルボキシメチル）イミノメ
チレン〕、〔−CH2N（CH2COOH）CH2CH2N（CH2COOH）CH2
−〕；カルボキシメチルイミノビス（メチレン）、〔−
CH2N（CH2COOH）CH2−〕；又は例えば、R2について上記
したような酸の金属塩及びアンモニウム塩を含む例示し
たカルボン酸含有基の塩であってよい。特に好ましい態
様に於いて、R2はメチレンイミノジ酢酸又はその塩であ
る。
各R3は独立にＲについて特定した基から選択される。
R3は好ましくは水素を表わす。
各R4は独立に水素又はタンパク質反応性基から選択さ
れる。
上記式Ａ−Ｉに於いて、ｎは0,1,2,3又は４であり、
ｍは０又は１であり、ｏは０又は１であるが、ｎ及びｍ
の少なくとも１個は０である。
R,R1,R3及びR4基の少なくとも１個はタンパク質反応
性基を表わす。好ましくは、各芳香環のR,R1,R3及びR4
基の１個以下はタンパク質反応性基である。最も好まし
くは、１分子当たりのR,R1,R3及びR4基の１個のみがタ
ンパク質反応性基である。
「タンパク質反応性基」なる用語は、典型的にタンパ
ク質に見出されるか又はタンパク質に導入される全ての
官能基と反応し得る全ての基を意味する。しかしなが
ら、タンパク質反応性基は非タンパク質生物分子に複合
化し得ることが特に意図される。即ち、本発明の実施で
有用なタンパク質反応性基には、反応性基又は特異レセ
プター−リガンド相互作用基を含む（炭水化物、核酸及
び脂質を含む）全ての生物分子と反応して、錯化剤と免
疫反応性基との間の結合基を形成し得るこれらの基が含
まれる。
好ましいタンパク質反応性基は下記のものから選択す
ることができるが、これらに限定されるものではない。
（１）タンパク質又は免疫反応性基を含む生物分子のア
ミン又はスルフヒドリル基と直接反応する基、例えば、
クロロメチルフェニル基及びクロロアセチル〔ClCH2CO
−〕基を含む活性ハロゲン含有基;2−クロロエチルスル
ホニル及び２−クロロエチルカルボニルのような活性化
２−放出基置換エチルスルホニル及びエチルカルボニル
基；ビニルスルホニル；ビニルカルボニル；エポキシ；
イソシアナト；イソチオシアナト；アルデヒド；アジリ
ジン；スクシンイミドオキシカルボニル；カルボン酸ハ
ライドのような活性化アシル基；混合無水物など；並び
に従来の写真ゼラチン硬膜剤で有用であることが知られ
ているその他の基；（２）変性したタンパク質又は免疫
反応性基を含む生物分子、即ち、例えば、アルデヒド又
はカルボン酸を導入するためのタンパク質の部分酸化に
より、上記（１）に記載したもののような反応性基を含
むように変性されたタンパク質又は免疫反応性基を含む
生物分子と容易に反応し得る基、この場合に、「タンパ
ク質反応性基」は、アミノ、アルキルアミノ、アリール
アミノ、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、アリールヒ
ドラジノ、カルバジド、セミカルバジド、チオカルバジ
ド、チオセミカルバジド、スルフヒドリル、スルフヒド
リルアルキル、スルフヒドリルアリール、ヒドロキシ、
カルボキシ、カルボキシアルキル及びカルボキシアリー
ルから選択される。タンパク質反応性基のアルキル部分
は、前記Ｒについて記載したように１〜約20個の炭素原
子を含んでいてよい。タンパク質反応性基のアリール部
分は、前記Ｒについて記載したように約６〜約20個の炭
素原子を含んでいてよい。（３）架橋剤を使用すること
によって、上記（１）及び（２）に記載したようなタン
パク質若しくは免疫反応性基を含む生物分子又は変性タ
ンパク質に結合し得る基。例えば、二官能性ゼラチン硬
膜剤、ビスエポキシド及びビスイソシアナートのような
ある種の有用な架橋剤は、架橋反応の間にタンパク質−
錯化剤複合体の一部、即ち架橋基になる。しかしなが
ら、例えば、消費性触媒のようなその他の有用な架橋剤
は架橋を容易にし、最終複合体中には存在しない。この
ような架橋剤の例は、米国特許第4,421,847号（この引
用によってその開示全体を本明細書に含めるものとす
る）に開示されているようなカルボジイミド及びカルバ
モイロニウム架橋剤並びに米国特許第4,877,724号（こ
の引用によってその開示全体を本明細書に含めるものと
する）に開示されているようなジカチオンエーテルであ
る。これらの架橋剤で、反応剤の一方はカルボキシル基
を有していなくてはならず、他方はアミン又はスルフヒ
ドリル基を有していなくてはならない。この架橋剤は先
ずカルボキシル基と選択的に反応し、次いで「活性化」
カルボキシル基とアミンとの反応の間に分離してタンパ
ク質と前記構造式Ａ−Ｉを有する金属錯化剤との間にア
ミド結合を形成し、そうして二つの単位を共有結合で結
合する。このアプローチの利点は、類似の分子、例え
ば、錯化剤と錯化剤との架橋が避けられ、一方では二官
能性架橋剤の反応が非選択性であり望まない架橋した分
子が得られることである。特に好ましいタンパク質反応
性基にはアミノ及びイソチオシアナトが含まれる。
特に好ましい錯化剤には下記の種１〜59が含まれる。
本発明で使用するための錯化剤の好ましい種類には、
前記構造式Ａ−IIIによって表わされるテルピリジン類
及び前記構造式Ａ−IVにより表わされるフェナントロリ
ン類が含まれる。錯化剤の特に好ましい種類は上記構造
式Ａ−III（式中、ｎ＝１であり、Ｒはアルキル又はア
ルコキシ置換基及びタンパク質反応性基を含む置換フェ
ニルである）を有する。錯化剤の代表的な好ましい種類
には上記の化合物20〜32が含まれる。現在最も好ましい
錯化剤はTMTイソチオシアナート（化合物24）である。
本発明は前記発明の開示に記載した構造式Ａ−III
〔式中、ｎ＝１であり、Ｒは （式中、R5はアルコキシ又はアルキルであり、ｐは0,1,
2,3又は４であり、そしてR6はタンパク質反応性基を表
わす）である〕を有する新規なテルピリジン類を提供す
る。R5は、メチル、エチル等のような好ましくは炭素数
１〜約20の、更に好ましくは炭素数１〜８のアルキル又
はメトキシ、エトキシ等のようなアルコキシ（そのアル
キル部分は好ましくは炭素数１〜約20、更に好ましくは
炭素数１〜８である）である。R6は前記のようなタンパ
ク質反応性基である。好ましいタンパク質反応性基に
は、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、カルバ
ジド、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオカル
バジド、イソシアナト及びイソチオシアナトが含まれ
る。特に好ましいタンパク質反応性基には、アミノ、イ
ソチオシアナト及びセミカルバジドが含まれる。特に好
ましい種にはTMT（化合物21）、TMTイソチオシアナート
（化合物24）及びTHT（化合物20）が含まれる。
本発明による好ましいフェナントロリン類は、前記構
造式Ａ−IV（式中、少なくとも１個のR4はタンパク質反
応性基である）を有する。好ましいタンパク質反応性基
には上記R6について特定したものが含まれる。
金属錯化部位、例えば複素原子及びイミノジアセテー
ト基を有するポリピリジン及びフェナントロリン錯化剤
は、当該技術分野で公知の技術により製造することがで
きる。適当な反応スキムは米国特許第4,837,169号及び
米国特許第4,859,777号（この引用によってその開示を
本明細書に含めるものとする）に示されている。
本発明のある種の現在好ましい化合物、即ち、４′−
（３−アミノ−４−メトキシフェニル）−6,6″−ビス
（Ｎ′,N′−ジカルボキシメチル−Ｎ−メチルヒドラジ
ノ）−2,2′:6′,2″−テルピリジン、四ナトリウム塩
（THT）及び４′−（３−アミノ−４−メトキシフェニ
ル）−6,6″−ビス〔N,N−ジ（カルボキシメチル）アミ
ノメチル〕−2,2′:6′,2″−テルピリジン、四ナトリ
ウム塩（TMT）の製造は、下記の反応スキムＩに示され
る。
本発明の錯化剤への上記の必須のタンパク質反応性基
の導入は従来の化学反応により行うことができる。例え
ば、アミノ基は、ニトロ化し次いでニトロ基をアミンに
還元することによってフェニル置換ポリピリジン及びフ
ェナントロリンに加えることができる。所望ならば、ホ
スゲンと反応させてカルバモイルクロリドを作り、加熱
してHClを放出させてイソシアナートを作ることによっ
てアミノ基をイソシアナート基に容易に転化することが
できる。カルボキシ基は、アミン含有ポリピリジン及び
フェナントロリンを無水グルタル酸のような試薬で処理
し、次いでカルボキシル官能基の適当な選択的活性化に
より加えることができる。環式アセタール保護アルデヒ
ドをポリピリジンキレート化剤を合成するために必要な
一連の反応に付し、次いでタンパク質複合化の前に脱保
護する。
前記構造式Ａ−IIIに合致し、アルキル置換基又はア
ルコキシ置換基で置換されたフェニル基及びタンパク質
反応性基を含むテルピリジン類の種類が、合成の観点か
ら特に有利である。例えば、ジブロム化中間体（63）に
アルキル基又はアルコキシ基が存在すると、中間体ジオ
ール（66）の製造で使用される好ましい溶媒であるTHF
中の増加した溶解度を与える。
更に詳しくは、TMT（70）は構造式Ａ−IIIのピリジン
含有キレート化種、即ち、製造式（71）（式中、４′−
位のＲはタンパク質反応性基である）の下位分類の一員
である。実際、これは化合物（72）（式中、Ｘ又はＹの
何れかはタンパク質反応性基である）の４′−アリール
置換テルピリジン同族体のものとして定義される（71）
内の別の下位分類の一員である。
Ｘ又はＹでタンパク質反応性基を含む（72）の誘導
体、特に、Ｘ又はＹの何れかがヒドロキシル、アルキ
ル、アルコキシ又はタンパク質反応性基に結合した窒素
若しくは酸素誘導体である幾つかの誘導体を生じるため
に適用できる幾つかの合成ルートを以下に記載する。
TMTの合成に於ける中間体はテトラエステル（73）で
ある。これは水酸化ナトリウムを用いて鹸化し、次いで
HI及び赤燐を用いて脱メチル化してフェノール（75）を
与える。
フェノール（75）をアクリロニトリルでシアノエチル
化し、次いで無水HClの存在下でエタノールのようなア
ルコールで処理してアミデート（76a）を与えることが
できる。また、フェノールをα−シアノ−ω−ハロアル
カンでフェノラートとしてアルキル化し、次いで再びア
ルコール性HClで処理することにより（76b）を与えるこ
とができる。
フェノール（75）はまた、ジビニルスルホンで処理し
て、ビニルスルホンタンパク質反応性基を与えるモノ付
加化合物（77a）を得ることができる。また、（75）は
ω−ヒドロキシ−α−アルキルハライド（又はスルホネ
ート）で又はω−ヒドロキシ−α−ポリアルキレンオキ
シアルキルハライド（又はスルホネート）でアルキル化
し、次いでジビニルスルホンで処理してビニルスルホン
（77b）を形成することができる。（77b）を生じるため
に使用したハロゲノアルコールを例えば、テトラヒドロ
ピラニル（THP）エーテル誘導体のような保護アルコー
ルに変えることも可能である。それをジビニルスルホン
と反応させる前に、ケタールを酸水溶液で処理すること
によって遊離のアルコールを遊離させることができる。
ジビニルスルホンとの反応は好ましくは塩基で触媒作用
させる。（77b）に於いて、ｍはゼロ又は１であり、ｎ
はゼロ又は１〜200の整数であるが、どのようなオキシ
アルキレン系も有用であろう。
他の合成スキムに於いて、（75）はブロモ酢酸メチル
のようなα−ハロアセテートエステルでアルキル変し、
次いでヒドラジンで処理して、例えば、抗体に結合した
炭水化物単位の酸化により導入されるもののようなアル
デヒド官能基と反応し得るヒドラジド（78）を与えるこ
とができる。
また、ヒドラジド（78）はHClのような酸水溶液で処
理し、次いで亜硝酸ナトリウムで処理してカルボニルア
ジド（79）を与えることができる。これは７より高いpH
でタンパク質のアミンと反応してアミド結合キレートを
与えることができる。
また、フェノール（75）をアルキル化して、ビニルス
ルホン（77b）の製造の場合のようにヒドロキシル又は
保護ヒドロキシル官能基で末端閉塞されるアルキレン又
はオキシアルキレンスペーサー基を作ることができる。
次いで脂肪族アルコールをｐ−ニトロフェニルクロロホ
ルメート又は2,4,5−トリクロロフェニルクロロホルメ
ートのようなアリールクロロホルメートで処理してカー
ボネート（80）を作ることができる。このアリールクロ
ロホルメートはリシンのアミンのようなタンパク質のア
ミン基とペプチドアミン末端で反応し得る。
また、（75）は塩化シアヌール酸と直接反応してシア
ヌレート（81a）を作るか、又は（80）の製造に於ける
アルコール中間体のようなスペーサー結合を含む、アル
キル化により（75）から誘導されるアルコールをそのよ
うに処理してシアヌレート（81b）を作ることができ
る。これらのクロロシアヌレートはタンパク質のアミン
基と反応し得る。
また、フェノール（75）をアクロレインで処理してア
ルデヒド（82a）にそして（アルデヒド保護基として）
ハロアルキルアセタールで処理してアルデヒド（82b）
に変え、次いで酸水溶液でアルデヒドを脱保護すること
ができる。これらのアルデヒドは、タンパク質のアミン
へのアルデヒドの結合のための還元アミノ化方法（例え
ば、４〜７の範囲のpH、好ましくは約６のpHで、水性系
で還元剤として水素化シアノホウ素ナトリウム（sodium
cyanoborohydride）を使用することを含むもの）用に
適している。
また、フェノール（75）を（例えば、触媒としてＮ−
メチルイミダゾールの存在下で）アクリロニトリルで処
理し、次いでニトリルを温酢酸溶液中で水素及び触媒と
しての炭素上10％パラジウムを使用してニトリルを水素
化することによりアミン（83a）に変えることができ
る。更に、（75）をω−ハロアルキルニトリルでアルキ
ル化し、次いでニトリルを温酢酸溶液中で水素及び触媒
としての炭素上10％パラジウムを使用してニトリルを水
素化することによりアミン（83b）に変えることができ
る。
上記のアミンは幾つかの様式でタンパク質に結合して
いてよい。例えば、これらは、（抗体のような）タンパ
ク質に結合した炭水化物への過ヨウ素酸ナトリウムのよ
うな酸化剤の作用により生じるアルデヒド官能基とアミ
ンとを結合させるための、（例えば、約６のpHで水性系
で還元剤として水素化シアノホウ素ナトリウムを使用す
ることを含む）還元アミノ化方法で使用するために適し
ている。アルデヒド官能基はまた、タンパク質のアルギ
ニン残基と選択的に反応する４−アゾ−フェニルグリオ
キサール（APG,Pierce Chemical Co.から入手可能）の
ような試薬を使用してタンパク質に生じさせることがで
きる。これらのアルデヒドは次いで上記のアミン（83
a）及び（83b）と反応させることができる。
更に、これらのアミンは、最初に（Pierce Chemical
Companyから市販されているような）普通に入手できる
複素二官能性試薬で更に磨きを掛けることによってタン
パク質に結合させることができる。例えば、（83b）に
より表わされるアミンを２−イミノチオランで処理して
（84a）を生じさせるか又はＮ−スクシンイミジル Ｓ
−アセチルチオアセテート（SATA）で処理し次いでヒド
ロキシルアミンで処理して（84b）を生じさせることが
できる。これらの種にはSMCC〔Ｎ−（４−カルボキシシ
クロヘキシルメチル）マレイミド Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミデート〕等のような試薬を使用してタンパク質
のアミン部位に導入できるマレイミド官能基と反応させ
ることができる遊離のスルフヒドリルSH基が含まれてい
る。
更に、（83b）により表わされるアミンはSMCC〔Ｎ−
（４−カルボキシシクロヘキシルメチル）マレイミド
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミデート〕で処理して（84
c）を生じさせることができる。これらの基には、２−
イミノチオランのような試薬を使用してタンパク質のア
ミン部位に導入することができる遊離のスルフヒドリル
SH基と、又は次いでヒドロキシルアミンで処理するＮ−
スクシンイミジル Ｓ−アセチルチオアセテート（SAT
A）と反応し得るマレイミド官能基が含まれている。遊
離のスルフヒドリル部位はまた、タンパク質中に又は所
望のタンパク質断片中に存在することがあるジスルフィ
ド結合へのジチオトレイトールのようなスルフヒドリル
含有還元剤の作用によりタンパク質中に生じ得る。
また、本発明の範囲内でアミン（85）（Ｘは前記定義
の通りである）からの結合化学現象の発生がある。アミ
ン（85）は、塩酸水溶液と次いでアミンと反応してジア
ゾニウム塩（86）を形成する（HONOを形成するための）
亜硝酸ナトリウムとで処理することができる。この物質
はジアゾ結合を介してチロシン単位にカプリングし、ヒ
ドロキシル基を含有する芳香環にすることができる。こ
れは（87）〔式中、 は（ING−１のような抗体中のチロシンのような）チロ
シンヒドロキシ−芳香環を含む抗体単位のようなタンパ
ク質を表わす〕として図解的に表わされる。
更に、アミン（85）は、過剰の塩化シアヌール酸で処
理してジクロロシアヌールアミド（88）を作り、そして
２−メトキシシアヌール酸ジクロリドで処理してクロロ
メトキシシアヌールアミド（89）を作ることができる。
これらの誘導体の両方がタンパク質中のリシンアミン又
はペプチド鎖の末端アミン基のようなアミン基で反応し
得る。反応はトリアジン環からの塩化物の置換を介して
起こる。
更に、アミン（85）は、α−ヨード酢酸のＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステルと又はα−ヨード酢酸無水
物と反応してヨードアセトアミド誘導体（90）を作るこ
とができる。この物質は、上記マレイミド誘導体（84
c）の反応で使用したもののような遊離のスルフヒドリ
ル基を含むタンパク質と反応し得る。ヨードアセトアミ
ド（90）はまた、リシンのε−アミン及びペプチド鎖の
末端アミンのようなタンパク質のアミンと反応するであ
ろう。
更に、アミン（85）は、Br−（CH2）ｎ−CN（式中、
ｎは１〜20の整数である）のようなニトリル含有ハロゲ
ン化アルキルでアルキル化してニトリル（91）を与える
ことができる。アミン（85）はまた、α−ブロモメチル
ベンゾニトリルのようなニトリル含有ハロゲン化ベンジ
ルでアルキル化してニトリル（92）を与えることができ
る。更に、アミン（85）は、（シアノベンゾイル系及び
シアノ酢酸誘導体のような脂肪族酸誘導体のような）ニ
トリル官能基を含むカルボン酸の活性誘導体（又は同様
の活性化カルボニル誘導体）でアシル化してニトリルア
ミド（93）及び（94）を与えることができる。これらの
ニトリルの何れもアルコール及び無水HClの作用により
相当するアミデートに変え、それぞれ（95），（96），
（97）及び（98）を与えることができる。これらのアミ
デートはリシンのε−アミン及びペプチド鎖の末端アミ
ンのようなタンパク質のアミンと反応するであろう。
上記の反応スキムの全てに於いて、イミノジ酢酸単位
のカルボン酸種はプロトン化するか又は（例えば、ナト
リウム塩として表わされる）イオン性種として存在させ
ることができる。何れの種のプロトン化の及び脱プロト
ン化の範囲は、タンパク質反応性基含有試薬及びタンパ
ク質の両方を含む反応媒体のpHの関数である。反応媒体
のpHを制御するために例えば、リン酸塩、ホウ酸塩、ク
エン酸塩及び酢酸塩緩衝剤のような緩衝剤塩を使用する
ことは本発明のこの面の一部である。
代表的なタンパク質反応性基の製造に有用な合成経路
の前記の記載は、構造式71により定義されるある種の好
ましいテルピリジン系に焦点を当てたが、これらの化学
現象は本発明の目的を遂行するために必要なとき構造式
Ａ−Ｉにより更に一般的に定義される広範囲の種々の化
合物に適用できることが理解されるであろう。
タンパク質（又は他の免疫反応性基）とのこれらのタ
ンパク質反応性基含有キレート化剤の全ての反応の生成
物は、透析濾過、HPLC、電気泳動等のような従来の技術
により精製することができる。タンパク質（又はその他
の免疫反応性基）は、当該技術分野でよく知られている
ようにPEG（ポリエチレングリコール）試薬のような試
薬で続いて変性して、変性タンパク質に減少した免疫原
性を与えることができる。
変性タンパク質は（限定されない例として）90Y+3の
ような金属イオンの放射性同位元素で処理することがで
き、この放射性核種−キレート−タンパク質は、特に若
しタンパク質が腫瘍抗原特異抗体又はそのフラグメント
であるならば、腫瘍の治療処置のために使用することが
できる。
変性タンパク質は（限定されない例として）111In+3
又は187Y+3のような金属イオンの放射性同位元素で処理
することができ、そのようにして製造された放射性核種
−キレート−タンパク質は、特に若しタンパク質が腫瘍
抗原特異性抗体又はそのフラグメントであるならば、癌
患者の腫瘍の診断画像形成のために使用することができ
る。
本発明の新規なテルピリジン類及びフェナントロリン
類は上記の合成技術により製造することができる。追加
の例示的製造は下記の例に記載する。
本発明の標的放射性免疫試薬には放射性核種イオンが
含まれる。放射性核種イオンは、Sc,Fe,Pb,Ga,Y,Bi,Mn,
Cu,Cr,Zn,Ge,Mo,Tc,Ru,In,Sn,Sm,Sb,W,Re,Po,Ta及びTl
イオンから選択することができる。好ましい放射性核種
には、44Sc+++,64,67Cu++,111In+++,212Pb++,68Ga++,90
Y+++及び212Bi+++イオンが含まれる。これらの中で最も
好ましいものは90Y+++イオンである。
金属放射性核種イオン及び錯化剤は、錯化剤の水溶液
を好ましくは４〜11のpHを有する水溶液中で金属放射性
核種塩と単に混合することによって容易に錯体化され
る。この塩はハロゲン塩のような金属のどのような水溶
性塩であってもよい。キレートは一般に５〜９の、好ま
しくは６〜８のpHで水溶液中で製造される。錯体は任意
に最適pHを作るための酢酸塩、リン酸塩及びホウ酸塩の
ような緩衝剤と混合される。
本発明の標的化免疫試薬には錯化剤に共有結合してい
る免疫反応性基が含まれている。それで標的化免疫試薬
は上記構造式Ａ−Ｉを有する錯体と免疫反応性基との複
合体からなる。錯化剤と金属放射性核種とは錯化剤を免
疫反応性基に結合させる前又は後の何れかで錯体化させ
ることができる。本明細書で使用する用語「免疫反応性
基」は、錯化剤に共有結合することができる有機化合物
及び生きた有機体中に見出されるか又は細胞物質若しく
は生きた有機体の診断、治療若しくは遺伝子工学で有用
である有機化合物並びに生物学的液体中に見出されるか
又は腫瘍細胞のような治療すべき細胞に付随する他の成
分と相互作用する能力を有する有機化合物の全てを含む
ことを意味する。
意図する用途に依存して、免疫反応性基は広範囲の種
々の天然に生じるか又は合成的に製造した物質から選択
することができる。このような物質には、酵素、アミノ
酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、リポタンパ
ク質、糖タンパク質、ホルモン、薬剤（例えば、ジゴキ
シン、フェニトイン、フェノバルビトール、チロジン
（thyrozine）、トリヨードチロニン、ゲンタマイシ
ン、カルバマゼピン及びテオフィリン）、ステロイド、
ビタミン、多糖類、ウイルス、原生動物（protozoa）、
真菌、寄生生物、リケッチア属、カビ、及びそれらの成
分、血液成分、組織及び器官成分、医薬、ハプテン、レ
クチン、トキシン、核酸（オリゴヌクレオチドを含
む）、抗体（遺伝子工学による抗体及びそのフラグメン
トを含む）、抗体フラグメント、抗生物質（タンパク質
及び炭水化物を含む）、アビジン及びその誘導体、ビオ
チン及びその誘導体、並びに当業者に公知のその他のも
のが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の実施に使用するための好ましい免疫反応性基
は、目的のリガンドに特異的なレセプター分子を有する
ものである。即ち、試薬を含む特異結合反応を期待する
標的化のために使用することができる。このようなリガ
ンド−レセプター錯体の例には、抗体−抗原、アビジン
−ビオチン、レセプター（インデューサー）−オペロン
のプロモーター及び蔗糖−レクチン錯体が含まれるが、
これらに限定されない。更に相補的核酸、即ち相補的糸
状体の混成生成物も、この用語を本明細書で使用する場
合には特異結合物質と考える。
特に好ましい免疫反応性基には、（１）免疫応答性ホ
ストに与えるとき、この物質と結合し得る特異抗体が産
生する結果になる全ての物質又は（２）抗原−抗体反応
に関係するそのようにして産生された抗体が含まれる。
即ち、免疫反応性基は抗原物質、抗体又は抗抗体であっ
てよい。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の
両方が有用である。抗体は、それが少なくとも１個の、
本明細書に記載したような錯化剤の反応性基又は結合基
との反応のための反応部位を含む限り、全体分子又はそ
の種々のフラグメントであってよい。分子生物学の技術
により製造された抗体及びタンパク質が、これらの好ま
しい免疫反応性基に含まれるものとして特に意図され
る。このような技術は当該技術分野でよく知られてお
り、例えば、米国特許第4,816,397号及び同第4,816,567
号に記載されている。
ある態様に於いて、免疫反応性基は錯化剤への結合の
ための反応性基を含む酵素であってよい。代表的な酵素
には、アスパラギン酸アミノトランスアミナーゼ、アラ
ニンアミノトランスアミナーゼ、乳酸デヒドロゲナー
ゼ、クレアチンホスホキナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、アルカリ酸
ホスファターゼ、プロスタチン酸（prostatic acid）ホ
スファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ及び種
々のエステラーゼが含まれるが、これらに限定されな
い。
所望ならば、免疫反応性基を変性するか又は化学的に
変えて、当業者に公知の技術により錯化剤に結合させる
ための反応性基を得ることができる。このような技術に
は、オリゴヌクレオチドの変性に指向している。WO−Ａ
−89/02931及びWO−Ａ−89/02932並びに米国特許第4,71
9,182号（この引用によってこれらの全ての開示全体を
本明細書に含めるものとする）に記載されているような
結合単位及び化学変性の使用が含まれる。
本発明の標識化免疫試薬の二つの非常に好ましい使用
は、腫瘍の診断画像形成用及び腫瘍の放射線医学治療用
である。それで好ましい免疫学的基には腫瘍結合抗原に
対する抗体が含まれる。具体例には、結腸直腸腫瘍を識
別するB72.3抗体（米国特許第4,522,918号及び同第4,61
2,282号に記載されている）、9.2.27抗黒色腫抗体、結
腸直腸腫瘍を識別するD612抗体、小細胞肺癌を識別する
UJ13A抗体、小細胞肺癌及び結腸直腸腫瘍を識別するNRL
U−10（Tfs−２）抗体、前立腺腫瘍を識別する7E11C5抗
体、結腸直腸腫瘍を識別するCC49抗体、壊死性組織を識
別するTNT抗体、結腸癌を識別するPR1A3抗体〔Richman,
P.I.及びBodmer,W.F.（1987年）Int.J.Cancer、39巻、3
17〜328頁〕、国際特許公開WO−Ａ−90/02569に記載さ
れているING−１及びその他の遺伝子工学による抗体、
鱗状細胞癌を識別するB174抗体（カナダ、EdmontonのBi
omira,Inc.で開発）、ある種のリンパ腫及び白血病と反
応性であるB43抗体並びに特定の目的のものであるその
他のものが含まれる。
上記のこのような抗体及びその他の免疫学的基は、錯
化剤の付属物（appendage）のための複数の部位を有す
る大きな錯体分子である。結果的に、免疫反応性基はタ
ンパク質反応性基の一つを介してそれに追加の錯化剤を
付属させることができる。かくして、用語反応性基は１
個又はそれ以上のタンパク質反応性基を介してそれに結
合した錯化剤分子を有する免疫学的基を含むことが意図
される。
更に、米国特許第4,937,183号（この引用によってそ
の開示全部を本明細書に含めるものとする）に記載され
ているように、炭水化物領域を含む抗体及びそのフラグ
メントは、抗体の炭水化物領域を介して錯化剤に結合す
ることができる。抗体を結合する有用な方法はまた、米
国特許第4,671,958号、同第4,699,784号、同第4,741,90
0号及び同第4,867,973号に記載されている。本明細書で
定義する用語「タンパク質反応性基」はこのような結合
を含めるものとする。
免疫反応性基の放射性金属錯化剤への共有結合を行う
ためのその他の方法は当該技術分野で公知であり、これ
には物質を単純に混合することが含まれる。
本発明の放射性免疫試薬には金属放射性核腫の錯化剤
に対するどのような比率も含まれていてよい。好ましい
態様に於いて、金属イオンの錯化剤に対するモル比は約
1:100〜約1:1である。
錯化剤の免疫反応性基に対する比は約0.5:1〜10:1又
はそれ以上に広範囲に変えることができる。ある態様に
於いて、錯化剤の免疫反応性基に対するモル比は約1:1
〜約6:1である。
図６及び図７は、本発明の錯化剤及び金属錯体の吸収
スペクトルである。スペクトルの一部は錯化剤が化学的
に結合しているタンパク質のスペクトルと重なっていな
い。同様のスペクトルシフトが本発明の錯化剤とGa+3,B
i+3,In+3,Sc+3及びCu+2のような他の代表的カチオンと
の間で得られた。即ち、本発明の免疫試薬は容易に分光
光学的に分析することができる。
下記の例は本発明を更に示す。
セクションI:錯化剤／キレーター 製造1:4′−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）−
6,6″−〔N,N−ジ（カルボキシメチル）アミノメチル〕
−2,2′:6′,2″−テルピリジン、四ナトリウム塩（TM
T）の製造 パートA:ピリジニウムブロミド、61 ２−アセチル−６−ブロモピリジン、60をJ.E.Parks,
B.E.Wagner及びR.E.Holm,J.Organometal,Chem.56巻、53
〜66頁（1973年）の方法により合成した。２−アセチル
−６−ブロモピリジン（20.0g、100ミリモル）を臭素
（6.2mL、0.12モル）で200mLのCHCl3中で還流下に45分
間処理した。溶液を室温にまで冷却し、次いでNaHCO3/N
a2S2O3の希水溶液で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥
し、濾過し、蒸発させて油を得た。この油を200mLのTHF
中に溶解し、30mLのピリジンを添加した。得られた溶液
を30分間還流させた。混合物を冷却し、濾過して26.1g
の淡黄白色又は灰白色粉末（73％）を得た。融点256℃
分解（245℃で変色）。分析、C12H10Br2N2Oとしての計
算値:C,40.26;H,2.82;N,7.82、実測値:C,40.12;H,2.85;
N,7.79。NMR及びIRスペクトルは指定構造と一致し、生
成物はTLCにより均質であった。
パートB:カルコン、62 水酸化カリウム（18.2g、325ミリモル）を100mLのH2O
に溶解し、100mLのメタノールを添加した。２−アセチ
ル−６−ブロモピリジン（65g、325ミリモル）及びｐ−
アニスアルデヒド（68g、650ミリモル）を一緒に400mL
のメタノールに溶解し、この溶液をKOH溶液中に注い
だ。生成物の沈殿が数分以内に始まり、反応物を室温で
一夜放置した。沈殿を捕集し、イソプロパノールで洗浄
し、乾燥して黄色固体の生成物79g（76％）を得た。融
点100〜102℃、FDMS（m/e）317M。アリコートをWoelmシ
リカゲル、100％ジクロロメタンで溶出のカラムクロマ
トグラフィーにより精製した。分析、C15H12BrNO2とし
ての計算値:C,56.63;H,3.80;N,4.40、実測値:C,56.66;
H,3.87;N,4.41。NMR及びIRスペクトルは指定構造と一致
し、生成物はTLCにより均質であった。
パートC:ジブロモテルピリジン、63 ピリジニウムブロミド１（11.3g、31.6ミリモル）及
びカルコン62（10.0g、31.4ミリモル）を10gのNH4OAcを
含む100mLのAcOH中で16時間還流させた。この溶液を冷
却し、濾過し、固体をAcOH次いでEtOHで洗浄して、白色
結晶13.48g（86％）を得た。融点203〜204.5℃、FDMS
（m/e）495（M+）。分析、C22H15Br2N3Oとしての計算
値:C,53.1;H,3.0;N,8.5、実測値:C,52.9;H,3.1;N,8.4。
NMR及びIRスペクトルは指定構造と一致し、生成物はTLC
により均質であった。
パートD:テルピリジンジオール、66 100mLの乾燥THF中のジブロミド63（7.46g、15.5ミリ
モル）を20mLの乾燥THF中の1.6M ｎ−BuLiの28.1mLの
溶液に、N2下で12分間かけて滴加した。添加の間ドライ
アイス／アセトン浴で温度を−75℃より低く維持した。
得られた暗緑色溶液を10分間攪拌し、次いで7.5mLの乾
燥DMFを２分間かけて添加した。10分後に90mLの10％HCl
溶液を添加し、得られた溶液を冷却を続けながら45分間
攪拌した。混合物を分液漏斗中でCHCl3とH2O（両方の溶
媒を４℃に予冷した）との間に分配した。両相を頻繁に
振盪し、有機相の色が緑色を帯びた色相から金黄色に徐
々に変化するまで環境温度で15〜30分間放置した。有機
相を飽和NaCl液で洗浄し、次いで蒸発させてクリーム色
の残渣を残した。この物質をCH3CNで処理して淡黄白色
又は灰白色固体（3.53g、60％）として生成物を得た。
融点225〜227℃、FDMS（m/e）395M。分析、C24H17N3O3
としての計算値:C,72.90;H,4.33;N,10.63,実測値:C,72.
44;H,4.31;N,10.46。
この粗ジアルデヒド（3.53g、8.93ミリモル）を70mL
のTHF及び70mLの無水EtOHの混合物中で1gのNaBH4と共に
N2下で15分間還流させた。真空下で濃縮した後、残渣を
希NaHCO3中で30分間還流させ、冷却し、濾過し、H2Oで
洗浄し、次いで乾燥して白色固体（3.35g、94.4％）と
してジオール66を得た。融点187〜189℃、FDMS（m/e）4
00MH+、399M。分析、C24H21N3O3としての計算値:C,72.1
7;H,5.30;N,10.52、実測値:C,71.71;H,5.20;N,10.37。N
MR及びIRスペクトルは指定構造と一致し、生成物はTLC
により均質であった。
パートE:テトラエステル、67 ジオール66（15.4g、38.5ミリモル）を175mLのCH2Cl2
中の17mLのEt3Nの混合物中に８℃で攪拌しながら懸濁さ
せた。この懸濁液に、50mLのCH2Cl2中の（CH3SO2）2O
（16.8g、96.5ミリモル）の溶液を10分間かけて滴加し
た。反応混合物を水と共に振盪した。有機相をMg2SO4で
乾燥し、濾過し、殆ど乾固するまで濃縮した。EtOHを加
えて、白色固体としてビスメシラートを得、これを捕集
し、乾燥した（17.2g、80.4％）。ビスメシラート（0.5
0g、0.96ミリモル）、ジイソプロピルエチルアミン（0.
26g、2.0ミリモル）及びジエチル イミノジアセテート
（0.38g、2.0ミリモル）の混合物を20mLの乾燥DMF中で1
6時間攪拌した。混合物を真空濃縮し、残渣をEt2OとH2O
との間に分配した。Et2O相を水で２回洗浄し、次いでNa
2SO4で乾燥し、蒸発させて薄黄色油（0.58g、82％）と
して生成物を得た。分析、C40H47N5O9としての計算値:
C,64.76;H,6.39;N,9.44、実測値:C,64.35;H,6.17;N,9.3
9。NMR及びIRスペクトルは指定構造と一致し、生成物は
TLCにより均質であった。
パートF:ニトロテトラエステル、68 テルピリジンテトラエステル67（3.27g、4.41ミリモ
ル）を60mLの濃H2SO4に溶解して赤橙色溶液を得た。こ
の混合物を０℃に冷却し、濃H2SO4中の濃HNO3の1/10（v
/v）混合物を、4.41ミリモルのHNO3が加えられるように
添加した。添加が完結した後に溶液の色は薄黄色に変わ
った。反応混合物を０℃で15分間攪拌し、次いで砕いた
氷に注いだ。希K2CO3をpH8になるまで添加した。この水
溶液をCH2Cl2で３回抽出した。有機相を一緒にし、Na2S
O4で乾燥し、濃縮して黄色油を得、これをシリカゲルの
クロマトグラフィー（５％ MeOH/CH2Cl2）にかけた。
生成物を含むフラクションを一緒にし、蒸発させて生成
物を得、これをMeOHから３回再結晶して黄白色固体（1.
84g、53％）を得た。融点76〜79℃、FDMS（m/e）787M
H+、786M。分析、C40H48N6O11としての計算値:C,61.06;
H,5.89;N,10.68、実測値:C,60.69;H,6.22;N,11.04。NMR
及びIRスペクトルは指定構造と一致し、生成物はTLCに
より均質であった。
パートG:アミノテルピリジンテトラエステル、69 ニトロテトラエステル68（1.80g、2.29ミリモル）を9
0mLのTHF及び90mLの無水EtOHの混合物中に溶解した。16
mLのH2Oに溶解したギ酸アンモニウム（2.89g、45.8ミリ
モル）を添加し、次いで4.8gの10％ Pd/C（4.6ミリモ
ル）を添加した。室温で２時間攪拌した後、珪藻土フィ
ルターパッドを通して反応物を濾過した。このフィルタ
ーパッドをTHF、無水EtOH及びCH2Cl2でよく洗浄した。
濾液を濃縮し、残渣をCH2Cl2とNaCl水溶液との間に分配
した。有機相を濃縮し次いで10％ MeOH/CHCl3でシリカ
ゲルで精製して、麦わら色の油（0.80g、46％）として
生成物を得た。FDMS（m/e）757MH+、756M。分析、C40H
48N6O9・1/2H2Oとしての計算値C,62.73;H,6.45;N,10.9
7、実測値:C,62.98;H,6.47;N,10.67。NMR及びIRスペク
トルは指定構造と一致し、生成物はTLCにより均質であ
った。
パートH:アミノテトラ酸、70（TMT） アミンテトラエステル69（0.75g、0.99ミリモル）を5
0mLのMeOH及び2mLのH2Oの混合物中で４当量のNaOHと16
時間室温で攪拌した。混合物を濃縮して固体二水和物
（0.72g、94％）として生成物を得た。FABMS m/e 640
（テトラカルボキシレートについてのM+）。分析、C32H
28N6Na4O9・2H2Oとしての計算値:C,50.01;H,4.20;N,10.
93、実測値:C,49.82;H,4.12;N,10.74。NMR及びIRスペク
トルは指定構造と一致し、生成物はTLCにより均質であ
った。
製造1a:4′−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）−
6,6″−〔N,N−ジ（カルボキシメチル）アミノメチル〕
−2,2′:6′,2″−テルピリジン、四ナトリウム塩（TM
T）の別の製造 工程1:2−アセチル−６−ブロモピリジン、60 5L三ツ口フラスコに、2,6−ジブロモピリジン（181
g、0.75モル）及び2.0Lのエーテルを入れた。懸濁液を
窒素下に−60℃で攪拌し、次いでｎ−ブチルリチウム
（300mL、2.5M）を圧力均等化滴下漏斗から20分間かけ
て添加した。浴を下げ、近い溶液を−50℃に加温した。
15分後に、暗黄色溶液をドライアイス／エーテル浴中で
−78℃に再冷却し、70mLのエーテル中のジメチルアセト
アミド（70g、0.86モル）を、温度が−75℃を超えない
ような速度で添加した。完結させるために添加を約１時
間行い、その後浴を取り去って反応物を−60℃に加温し
た。150mLのH2O中の塩化アンモニウム（50g、0.93モ
ル）の溶液を10分間かけて窒素下に滴加し、温度を−40
℃に上昇させた。混合物を45分間攪拌し、層を分離させ
た。水層を500mLのエーテルで逆抽出し、一緒にした有
機層をH2Oで２回、飽和食塩水で１回洗浄した。有機層
をMgSO4で乾燥し、乾固するまで蒸発させた後、150gの
黄色油を得た。この物質を、同じ規模のもう一つの操作
のものと一緒にした後、80℃/0.1mmHgで蒸留して、冷却
すると容易に結晶化する殆ど無色の油257g（86％）を得
た。シリカゲルTLCシステム:90ヘキサン:10エーテル。
工程2:1−〔２−（６−ブロモ−２−ピリジニル）−２
−オキソエチル〕ピリジニウムヨーダイド 600mLのピリジン中の２−アセチル−６−ブロモピリ
ジン（100g、0.5モル）の攪拌した溶液に、ヨウ素（127
g、0.5モル）を添加した。この混合物をスチーム浴上で
45分間加熱し、冷却して生成物を結晶化させた。固体を
濾過し、薄黄色結晶ケーキを塩化メチレンで２回濯い
だ、乾燥した後、183g（90％）が得られた。融点176〜1
78℃；シリカゲルTLCシステム:95アセトン:5イソプロパ
ノール。
工程3:1−（２−ブロモピリジル）−３−（４−メトキ
シフェニル）−２−プロペノン、62 450mLのメタノール中の２−アセチル−６−ブロモピ
リジン（50g、0.25モル）の攪拌した溶液に、４−アニ
スアルデヒド（48g、0.35モル）を添加した。混合物を
水浴中で20℃に冷却し、次いで100mLのH2O中のKOH（18
g、0.28モル）の溶液を急速に添加した。約30秒後に、
生成物が結晶化し、温度を35℃に上げた。薄黄色混合物
を30分間攪拌し、濾過した。ケーキをイソプロパノール
で２回濯ぎ、乾燥後68g（86％収率）を得た。融点106.1
〜106.5℃；シリカゲルTLCシステム:90ヘキサン:10酢酸
エチル。
工程4:6,6″−ジブロモ−４′−（４−メトキシフェニ
ル）−2,2′:6′,2″−テルピリジン、63 600mLの酢酸中のカルコン（工程３の生成物）（64g、
0.20モル）、ピリジニウムヨーダイド（工程２の生成
物）（81g、0.20モル）及び酢酸アンモニウム（77g、1.
0モル）の混合物を95℃で３時間、次いで一夜60℃で加
熱した。反応混合物を15℃に冷却し、結晶ケーキをH2O
で３回濯いだ。一夜乾燥後、76.5g（83％）の薄黄色結
晶生成物が得られた。融点205〜206℃；シリカゲルTLC
システム:90ヘキサン:10酢酸エチル;H2O測定：（カール
フィッシャー）実測値0.02％H2O。
工程5:4′−（４−メトキシフェニル）2,2′:6′,2″−
テルピリジン−6,6″−ジカルボキシアルデヒド、63 3Lのフラスコに400mLのTHFを入れ、窒素下で攪拌しな
がらドライアイス／エーテル浴中で−78℃まで冷却し
た。ｎ−ブチルリチウム（55mL、2.5M）の溶液を窒素ポ
ンプを介して圧力均等化滴下濾斗へ移し、THF溶液に添
加した。15分間攪拌した後、混合物の温度は−78℃で、
固体ビス−ブロミド（工程４の生成物）（21g、42モ
ル）を11分間かけて少しずつ添加した（グーチ管）。添
加の間に温度は−75℃を超えなかった。次第に、懸濁液
は褐色から褐緑色に変化したが、10分後に固体がまだは
っきり見えていた。浴を下げ、反応混合物を10分間かけ
て−70℃に加温した。暗緑色の溶液を−78℃に再冷却
し、15mLのTHF中のDMF（ジメチルホルムアミド）（20m
L）の冷溶液（−15℃）を、窒素ポンプを使用して３分
間かけて添加した。温度を−60℃に上げ、10分間攪拌し
た後、混合物（−72℃）をHCl水溶液（80mLのHClを水中
で240mLに希釈した）で10分間かけてクエンチした。酸
クエンチの間、色は暗黄色に変わり、このことは生成物
が形成されたことの指標である。温度を−35℃に上げ、
緑黄色スラッジを外部冷却することなく45分間揺り動か
した。次いで反応混合物を2Lの水中にクエンチし、2.5
時間攪拌した。この黄色懸濁液を粗い濾紙を通して濾過
し、黄色ケーキを400mLのH2Oで洗浄した。一夜乾燥した
後、粗結晶性生成物の回収は72〜79％の範囲であった。
精製した試料（酢酸エチルから結晶化）は228〜229℃の
融点を有していた。シリカゲルTLCシステム:94トルエ
ン:4メタノール:2イソプロピルアミン。
工程6:6,6″−ビス（ヒドロキシメチル）−４′−（４
−メトキシフェニル）−2,2′:6′,2″−テルピリジ
ン、66 250mLの無水エタノール中の工程５からのビス−アル
デヒド（18.5g、46.8ミリモル）の攪拌した溶液に、室
温でNaBH4（2.3g、60.8ミリモル）を10分間かけて少し
ずつ添加した。混合物を15分間還流させて黄色溶液を
得、これを更に30分間攪拌し、次いで150mLのH2Oで希釈
した。沈殿が生じた。1.5時間攪拌した後、混合物を濾
過した。薄黄褐色の結晶は乾燥後16g（86％）の重量で
あった。粗結晶性生成物を更に精製することなく次の工
程で使用した。融点140〜141℃。
工程7:工程６のテルピリジンのビスメシラート 175mLのCH2Cl2中の工程６からのビス（ヒドロキシメ
チル）テルピリジン（15.4g、38.5ミリモル）及びトリ
エチルアミン（17mL、120ミリモル）の懸濁液を攪拌
し、８℃に冷却した。50mLのCH2Cl2中のメタンスルホン
酸無水物（16.8g、96.5ミリモル）の溶液を10〜15分間
かけて滴加した。混合物は次第に溶液になり、添加の終
わり近くで赤橙色から黄緑色への色の変化が観察され
た。後で短くとったシリカゲルTLC（トルエン:MeOH:イ
ソプロピルアミン−92:6:2）は出発物質及びシングルス
ポットを示さなかった。この混合物を200mLのH2O中にク
エンチし、層を分離した。水層をCH2Cl2で抽出し一緒に
した有機層をH2Oで洗浄した。MgSO4及び3/4インチシリ
カゲルのパッドを通した濾過により、殆ど無色の濾液が
得られ、濾液を乾固するまで濃縮した。粗混合物を酢酸
エチルで希釈し、結晶性スラリーを冷却し、濾過した。
一夜乾燥した後、17.2g（82％）の白色結晶を得た。融
点190〜192℃。
工程8:テトラエステル、67 180mLのＮ−メチルピロリジノン（NMP）中の工程７の
ビス−メシラート（32.5g、58.5ミリモル）及びエチル
ジイソプロピルアミン（17g、131ミリモル）の溶液に、
ジエチル イミノジアセテート（25g、131ミリモル）を
添加した。混合物をスチーム浴上で35分間加熱し、次い
で室温で一夜攪拌した。300mLのH2O中にクエンチした
後、混合物を酢酸エチル（２×250mL）で抽出し、次い
でH2Oで洗浄した。有機層を真空濃縮し、高真空下で乾
燥して薄赤色シロップ（51.7g）を得た。NMRスペクトル
（DMSO）は所望の生成物プラスNMPと一致した。粗シロ
ップを短いシリカゲルカラムを通して濾過し、エーテ
ル：ヘキサン−80:20での溶出で透明無色のシロップ（4
1g）が得られ、これはTLC（エーテル：ヘキサン：トリ
エチルアミン−60:38:2）により純粋であった。
工程9:ニトロテトラエステル、68 160mLのトリフルオロ酢酸中の工程８のテトラエステ
ル（テトラエステル67）（3.1g、40.6ミリモル）の溶液
を15℃に冷却し、硝酸カリウム（4.4g、44ミリモル）を
一時に添加した。混合物を数分間攪拌し、次いで濃H2SO
4（22g、230ミリモル）を15分間かけて滴加した。僅か
な発熱が観察された。添加の終わりに、温度は20℃に上
がった。薄黄色混合物を30分間攪拌し、TLC試料は出発
物質を示さなかった。トリフルオロ酢酸の大部分は減圧
下での蒸留により回収され、残渣を500mLの10％K2CO3及
び250mLの酢酸エチル中に傾瀉した。層を分離し、酢酸
エチルで再抽出した。一粗にした有機層をH2Oで次いで
食塩水で洗浄し、次いでMgSO4で乾燥した。濾液を殆ど
乾固するまで濃縮し、次いで90mLの熱無水エタノールに
溶解した。混合物を氷浴中で冷却し、結晶を濾過により
捕集し、エタノールで濯いだ。真空下で一夜乾燥した
後、29g（90％）の白色結晶性生成物が得られた。融点8
1〜82℃;TLCシステム:70エーテル:25ヘキサン:5トリエ
チルアミン。
工程10:アミノテルピリジンテトラエステル、69 700mLの1:1 THF/無水エタノール中のニトロテトラエ
ステル（工程９からの生成物）（28.3g、36ミリモル）
の溶液に、アルゴン下で10％ Pd/C（10g、10ミリモ
ル）を添加した。数分間攪拌した後、ギ酸アンモニウム
（9.4g、149ミリモル）の溶液を３〜５分間かけて滴加
した。10分以内に、攪拌機の渦で幾らか泡立ちがあり、
22℃から28℃への僅かな発熱が見られた。TLCは１時間
後に反応が約70％完結したことを示した。反応物を更に
１時間攪拌し、次いでスチーム浴上で1/2時間還流させ
た。攪拌を更に１時間続け、次いで反応混合物を20℃に
冷却した。混合物をSolka Flocのパッドを通して注意深
く濾過し、触媒を全部で400mLの無水エタノールで濯い
だ。薄黄色の濾液を真空下で乾固するまで蒸発させ、2
5.3g（95％回収）を得た。触媒を150mLのDMFで更に濯ぐ
と、蒸発させた後、別の1.4gの暗色シロップ（５％回
収）が得られ、これはアルコール濯ぎの生成物とは著し
く異なっていた。一緒にした物質を、窒素下で１％トリ
エチルアミンを含有するヘキサンで、シリカゲル60（EM
Science）で充填した（4.5インチ幅×2.5インチ高さ）
カラムを使用するフラッシュカラムクロマトグラフィー
により精製した。この物質を最小量のトルエンに溶解
し、カラムの頂上に適用した。カラムを30:70エーテル
／ヘキサンで溶出し、流速を約100mL/分に調節した。7
0:30エーテル／ヘキサン及び１％トリエチルアミンまで
極性を徐々に増加させて、全部で約15gの無色のシロッ
プを得、このシロップはTLCによりシングルスポットで
あった。
（TLCシステム−エーテル：ヘキサン：メタノール：ト
リエチルアミン−70:25:4:1）。
工程11:TMT、70 450mLの無水エタノール中の工程10のアミノテルピリ
ジンテトラエステル69（39.0g、51.5ミリモル）の溶液
に、NaOH（8.39g/100mLの三重に蒸留したH2O）の溶液を
添加した。約１分間攪拌した後、透明の薄黄色溶液が濁
ってきて、徐々に沈殿が生じた。２時間後に混合物を濾
過し、得られた薄黄色固体をエタノールで２回、ヘキサ
ンで１回濯いだ。偏光顕微鏡下での検査で結晶構造を確
認した。固体を真空オーブン中で15時間乾燥し、33.9g
（90％収率）を得た。NMR,IR及びUVスペクトルは指定構
造と一致し、生成物はTLC〔PAW40:アセトン10（PAW＝ピ
リジン54:酢酸16:水30）〕により均質であった。カール
フィッシャー（H2O）実測値6.18％H2O;融点＞290℃；ガ
スクロマトグラフィー（溶媒残渣）実測値0.07％エタノ
ール。
製造2:4′−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）−
6,6″−ビス（Ｎ′,N′−ジカルボキシメチル−Ｎ−メ
チルヒドラジノ）−2,2′:6′,2″−テルピリジン、四
ナトリウム塩（THT）、65の製造 パートA:6,6″−ビス（Ｎ−メチルヒドラジノ）−４′
−（４−メトキシフェニル）−2,2′:6′,2″−テルピ
リジン 6,6″−ジブロモ−４′−（４−メトキシフェニル）
−2,2′:6′,2″−テルピリジン、63（1.0g、２ミリモ
ル）を20mLのメチルヒドラジン中で窒素下に16時間還流
させた。溶液を冷却し、得られた沈殿を濾過し、一定の
重量になるまで乾燥して、クリーム状色の固体0.68gを
得た。融点218〜220℃。FDMS（m/e）428MH+、427M+。分
析、C24H25N7O・0.25H2Oとしての計算値:C,66.72;H,5.9
6;N,22.70,実測値:C,66.85;H,5.85;N,23.0。NMR及びIR
スペクトルは指定構造と一致した。
パートB:6,6″−ビス（Ｎ′,N′−ジ（エトキシカルボ
ニルメチル）−Ｎ−メチルヒドラジノ）−４′−（４−
メトキシフェニル）−2,2′:6′,2″−テルピリジン パートＡのビス（メチルヒドラジン）テルピリジン
（3.50g、82ミリモル）、ブロモ酢酸エチル（13.2mL、8
20ミリモル）、2,6−ルチジン（9.6mL、820ミリモル）
及びヨウ化ナトリウム（0.35g、２ミリモル）を350mLの
アセトニトリルに添加し、溶液をN2下で48時間還流さ
せ、次いで追加の4.1mL（370ミリモル）のブロモ酢酸エ
チル及び4.8mL（410ミリモル）の2,6−ルチジンを添加
した。反応溶液を更に48時間還流させ、冷却した。過剰
のブロモ酢酸エステル及びルチジンから得られる多量の
白色塩を濾過し、棄てた。濾液を濃縮し、濃縮した物質
をジクロロメタンに溶解し、希塩化ナトリウム水溶液で
２回抽出した。有機層を高真空下でブロモ酢酸エステル
及びルチジンの臭いがなくなるまで濃縮した。粗油をWo
elmシリカゲルカラム（36×２インチ）で精製した。カ
ラムを最初に100％ジクロロメタンで、次いで50/1ジク
ロロメタン／アセトンで、アセトンの濃度を25/1ジクロ
ロメタン／アセトンにまで漸進的増加させて溶出した。
精製したフラクションを濃縮して、薄淡黄色油2.91g（4
6％）を得た。精製した油のフラクションを室温で放置
すると結晶化し、メタノールで粉砕した後白色固体が得
られた。融点100〜103℃。分析、C40H49N7O9としての計
算値:C,62.24;H,6.40;N,12.70、実測値:C,62.31;H,6.3
2;N,12.69。NMR及びIRスペクトルは指定構造と一致し、
生成物はTLCにより均質であった。
パートC:6,6″−ビス（Ｎ′,N′−ジ（エトキシカルボ
ニルメチル）−Ｎ−メチルヒドラジノ）−４′−（４−
メトキシ−３−ニトロフェニル）−2,2′:6′,2″−テ
ルピリジン パートＢのテルピリジンテトラエステル（0.659g、0.
84ミリモル）を5mLの濃H2SO2に溶解して赤橙色の溶液を
得た。混合物を０℃に冷却し、濃H2SO2中の濃HNO3の混
合物を、0.84ミリモルのHNO3が加えられるように添加し
た。添加が終わった後溶液の色は薄黄色に変わった。反
応混合物を０℃で15分間攪拌し、次いで砕いた氷に注い
だ。希K2CO3をpH8になるまで添加した。この水溶液をCH
2Cl2で３回抽出した。有機相を一緒にし、Na2SO4で乾燥
し、濃縮して黄色油を得、これをシリカゲルのクロマト
グラフィー（20/1塩化メチレン／アセトン）にかけた。
生成物を含むフラクションを一緒にし、蒸発させて生成
物である薄黄色ガラス状物を得た。収量0.15g（22
％）。分析、C40H48N8O11としての計算値:C,58.82;H,5.
92;N,13.72、実測値:C,58.76;H,5.61;N,13.84。FDMS（m
/e）816M。NMR及びIRスペクトルは指定構造と一致し、
生成物はTLCにより均質であった。
パートD:4′−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）
−6,6″−ビス（Ｎ′,N′−ジ（エトキシカルボニルメ
チル）−Ｎ−メチルヒドラジノ）−2,2′:6′,2″−テ
ルピリジン パートＣのニトロテトラエステル（0.72g、0.88ミリ
モル）の30mLのTHF及び30mLのエタノールの混合物中に
溶解した。6mLのH2Oに溶解したギ酸アンモニウム（1.08
g、17.1ミリモル）を添加し、次いで1.8gの10％ Pd/C
（1.7ミリモル）を添加した。室温で一夜攪拌した後、
珪藻土フィルターパッドを通して反応物を濾過した。こ
のフィルターパッドをTHF、無水EtOH及びCH2Cl2でよく
洗浄した。濾液を濃縮し、残渣をクロロホルムに溶解
し、クロロホルム溶液を水で２回洗浄した。有機相を油
にまで濃縮した。この油にメタノールを添加すると油が
結晶化した。この物質を20mLのメタノール中にスラリー
化し、濾過し、空気乾燥してクリーム色の固体0.64g（9
2.7％）を得た。分析、C40H50N8O9としての計算値:C,6
1.06;H,6.40;N,14.24、実測値:C,60.74;H,6.39;N,14.0
1。NMR及びIRスペクトルは指定構造と一致し、生成物は
TLCにより均質であった。
パートE:4′−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）
−6,6″−ビス（Ｎ′,N′−ジカルボキシメチル−Ｎ−
メチルヒドラジノ）−2,2′:6′,2″−テルピリジン、
四ナトリウム塩（THT）、65 パートＤのアミンテトラエステル（0.60g、0.76ミリ
モル）を25mLのMeOH及び1mLのH2Oの混合物中で４当量の
NaOHと約16時間室温で攪拌した。混合物を濃縮して定量
的収量の固体テトラカルボキシレートを得た。分析、C
32H30N8Na4O9・2H2Oとしての計算値:C,48.12;H,4.29;N,
14.03、実測値:C,48.01;H,3.97;N,12.77。
製造例3:6,6″−ビス（Ｎ′,N′−ジカルボキシメチル
−Ｎ−メチルヒドラジノ）−４′−（３−イソチオシア
ナト−４−メトキシフェニル）−2,2′:6′,2″−テル
ピリジン、ナトリウム塩の製造 製造２、パートＥのTHTアミン四ナトリウム塩（0.39
g、0.51ミリモル）を80mLのメタノールに溶解した。室
温で、1.0mLのテトラヒドロフラン中の0.58g（0.50ミリ
モル）のチオホスゲンを添加し、次いで1.0mLのテトラ
ヒドロフラン中の0.51g（0.50ミリモル）のトリエチル
アミンを添加した。次いで反応物を残渣にまで濃縮し、
残渣をジクロロメタン中にスラリー化し、濾過して黄色
固体0.26g（65％）を得た。赤外スペクトルは指定の構
造式と一致した。この生成物はモノカルボン酸三ナトリ
ウム塩であると信じられた。
製造4:5−アミノ−2,9−ビス〔N,N−ジ（カルボキシメ
チル）アミノメチル〕−1,10−フェナントロリン、四ナ
トリウム塩の製造 パートA:2,9−ジメチル−５−ニトロ−1,10−フェナン
トロリン ネオクプロイン塩酸塩、ヘキ水和物（25.0g、99ミリ
モル）を100mLの濃硝酸に溶解した。200mLの濃硫酸を添
加し、反応物を還流下に2.5時間加熱し、次いで室温で
８日間放置した。次いで反応混合物を、約3Kgの氷と351
g（8.8モル）のLiOH・H2Oとの混合物に、ガラス棒で攪
拌しながら徐々に添加した。中和操作の間、中和の間に
溶けない氷が常に存在するように氷を必要に応じて添加
し、中和反応物も同時にアセトン／氷浴により冷却し
た。添加が終わった後、反応混合物のpHは12であった。
この水性混合物を塩化メチレンで２回、最初は1000mLで
次いで400mLで抽出した。塩化メチレンフラクションを
一緒にし、500mLの蒸留H2Oで１回抽出した。塩化メチレ
ン相を残渣にまで濃縮し、500mLのアセトニトリルで粉
砕した。固体を濾過し、アセトニトリルで洗浄し、真空
下に乾燥してクリーム黄色固体10.3gを得、これを100mL
の還流アセトニトリルに溶解し、室温で結晶化させ、濾
過してクリーム黄色結晶8.5g（34％）を得た。融点184
〜186℃。FDMA（m/e）253M。分析、C14H11N3O2・0.25H2
Oとしての計算値:C,65.23;H,4.50;N,16.30、実測値:C,6
5.57;H,4.45;N,16.27。NMR及びIRスペクトルは指定構造
と一致し、生成物はTLCにより均質であった。
パートB:2,9−ジ（ブロモメチル）−５−ニトロ−1,10
−フェナントロリン 2,9−ジメチル−５−ニトロ−1,10−フェナントロリ
ン（1.0g、４ミリモル）及びＮ−ブロモスクシンイミド
（1.42g、８ミリモル）を、ビーカー内で一緒に混合し
て均一な混合物にし、全部を一度に20mLの還流（181
℃）ｏ−ジクロロベンゼンに添加した。加熱を還流温度
で２分間続け、次いで反応物を室温にまで冷却した。反
応混合物をWoelmシリカゲルのカラム（18×２インチ）
で100％ジクロロメタンでの溶出により精製して、精製
した物質である黄色油0.47g（29％）を得た。TLCのRf、
0.5（40/1 CH2Cl2/アセトン）。精製した生成物のアリ
コートを粉砕して、146℃で分解する灰白色固体を得
た。分析、C14H9Br2N3O2・0.5H2Oとしての計算値:C,40.
02;H,2.39;N,10.00、実測値:C,40.36;H,2.67;N,9.77。F
DMS（m/e）409M。NMR及びIRスペクトルは指定構造と一
致した。
パートC:2,9−ビス〔N,N−ジ（エトキシカルボニルメチ
ル）アミノメチル〕−５−ニトロ−1,10−フェナントロ
リン 2,9−ジ（ブロモメチル）−５−ニトロ−1,10−フェ
ナントロリン（2.28g、5.5ミリモル）及び2.08g（11ミ
リモル）の1,8−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン
を、25mLの１−メチル−２−ピロリジノン中に一緒に溶
解し、2.08g（11ミリモル）のジエチル イミノジアセ
テートを添加した。反応物をグランドガラスストッパー
で封止し、室温で約10分間攪拌した後、白色沈殿が生成
し始めた。次いで反応物を冷蔵庫（４℃）に入れ、約20
時間貯蔵した。反応混合物を400mLのジエチルエーテル
と400mLの蒸留H2Oとの間に分配し、エーテルフラクショ
ンを400mL部分の蒸留H2Oで全部で５回抽出した。エーテ
ル相を濃縮し、400mLの塩化メチレンに溶解した。塩化
メチレン相を蒸留H2Oで１回抽出し、セライト珪藻土と
硫酸ナトリウムとの混合物で乾燥し、濾過し、次いで暗
色油にまで濃縮した。Woelmシリカゲルのカラムを、10/
1塩化メチレン／メタノール中で調製し（20インチ高さ
×２インチ直径）、粗油を塩化メチレン中でこのカラム
に適用した。約50mLの塩化メチレンをこのカラムに適用
し、次いでカラムを10/1 CH2Cl2/メタノールで溶出し
た。フラクション（約100mL）を集め、TLC（10/1塩化メ
チレン／メタノール、Rf0.4）により観察したとき純粋
の生成物のフラクションを一緒にし、濃縮して赤色がか
った琥珀色の油として生成物1.17g（34％）を得た。FDM
S（m/e）628MH+。分析、C30H37N5O10・2H2Oとしての計
算値:C,54.29;H,6.23;N,10.55、実測値:C,54.71;H,5.5
8;N,10.53。NMR及びIRスペクトルは指定構造と一致し
た。
パートD:5−アミノ−2,9−ビス〔N,N−ジ（エトキシカ
ルボニルメチル）アミノメチル〕−1,10−フェナントロ
リン 2,9−ビス〔N,N−ジ（エトキシカルボニルメチル）ア
ミノメチル〕−５−ニトロ−1,10−フェナントロリン
（3.37g、5.4ミリモル）を100mLのテトラヒドロフラン
及び200mLの無水エタノールの溶液に溶解した。22mL中
の蒸留H2O中の6.8g（108ミリモル）のギ酸アンモニウム
の溶液を添加し、次いで5.72gの炭素上パラジウム（10
％）（安全のために水で50％湿潤）を添加した。反応物
をガスバブラーで封止し、室温で30分間攪拌し、次いで
珪藻土フィルターパッドを通して濾過した。次いで溶媒
をロータリーエバポレーターで除去した。残渣を300mL
のジクロロメタンに溶解し、次いで300mLの蒸留水で抽
出した。有機相を300mLの飽和食塩水で抽出し、Celite
珪藻土及び硫酸ナトリウムの混合物で乾燥し、濾過し、
次いで高真空下で濃縮して、2.90g重量の暗琥珀色油を
得た。この油を9.0mLのプロピオニトリルで処理して黄
色固体の結晶化を起こさせた。この固体を濾過し、13mL
のプロピオニトリル及び15mLのヘキサンで洗浄し、次い
で1.04g（32％）の一定重量まで空気乾燥した。融点137
〜139℃。FDMS（m/e）598MH+、597M。分析、C30H39N5O9
・H2Oとしての計算値:C,58.52;H,6.71;N,11.38、実測
値:C,58.28;H,6.55;N,11.53。NMR及びIRスペクトルは指
定構造と一致した。
パートE:5−アミノ−2,9−ビス〔N,N−ジ（カルボキシ
メチル）アミノメチル〕−1,10−フェナントロリン、四
ナトリウム塩 ５−アミノ−2,9−ビス〔N,N−ジ（エトキシカルボニ
ルメチル）アミノメチル〕−1,10−フェナントロリン
（0.90g、1.5ミリモル）を20mLのメタノールに溶解し
た。10.0mLの蒸留H2Oに溶解した水酸化ナトリウム（0.2
5g、6.25ミリモル）を添加した。反応フラスコを封止
し、反応混合物を磁気的に24時間室温で攪拌した。溶媒
をロータリー蒸発により除去した。固体残渣を塩化メチ
レンで粉砕し、濾過して0.81g（94％）を得た。四ナト
リウム塩は吸湿性であり、多くの量が濾過漏斗のガラス
壁に付着して残った。分析、C22H19Na4N5O8・3H2Oとし
ての計算値:C,42.11;H,4.02;N,11.16、実測値:C,42.01;
H,3.71;N,11.03。IRスペクトル及びFAB質量スペクトル
は指定構造と一致した。
製造5:2,9−ビス〔N,N−ジ（カルボキシメチル）アミノ
メチル〕−５−イソチオシアナト−1,10−フェナントロ
リン、ナトリウム塩の製造 ５−アミノ−2,9−ビス〔N,N−ジ（カルボキシメチ
ル）アミノメチル〕−1,10−フェナントロリン、四ナト
リウム塩（0.16g、0.28ミリモル）を20mLのメタノール/
4mL蒸留H2Oの溶媒混合物に溶解した。チオホスゲン（0.
28ミリモル、即ち、10.0mLのTHF中の0.32gのチオホスゲ
ンの溶液の1.0mL）を添加し、次いで直ちに0.28ミリモ
ルのトリエチルアミン（10.0mLのTHF中の0.28gのトリエ
チルアミンの溶液の1.0mL）を添加した。反応物を室温
で攪拌し、次いで直ちに濃縮した。0.16g（94％）の黄
色固体の残渣が単離された。IRスペクトルは指定構造と
一致した。
製造6:6,6″−ビス〔Ｎ′,N′−ジ（カルボキシメチ
ル）アミノメチル〕−４′−（３−イソチオシアナト−
４−メトキシフェニル）−2,2′:6′,2″−テルピリジ
ン、四ナトリウム塩の製造 製造１のTMT、70（0.31g、0.42ミリモル）を30mLのメ
タノールに溶解した。0.42ミリモルのチオホスゲンを含
むTHF 1mLを添加し、次いで0.42ミリモルのトリエチル
アミンを含むTHF 1.00mLを添加した。反応溶液を直ちに
残渣まで濃縮し、次いで残渣をトリエチルアミンで粉砕
した。濾過により固体を捕集し、ジクロロメタンで洗浄
して生成物0.30gを得た。IRスペクトルは指定構造と一
致した。
製造7:三ナトリウム 15−アミノ−3,5,6,8,9,11−ヘキ
サヒドロ−4,7,10−トリス（カルボキシメチル）−2,1
7:12,14−ジエテノ−1,4,7,10,13−ペンタアザベンゾシ
クロペンタデシン パートA:3,5,6,8,9,11−ヘキサヒドロ−15−ニトロ−4,
7,10−トリス（ｐ−トルエンスルホンアミド）−2,17:1
2,14−ジエテノ−1,4,7,10,13−ペンタアザベンゾシク
ロペンタデシン 製造４、パートＢで製造した2,9−ビスブロモメチル
−５−ニトロ−1,10−フェナントロリン２重量％を含む
100mLのＮ−メチルピロリジン−２−オンを、注射筒ポ
ンプを経て２時間かけて、アルゴン下に20℃に維持した
20mLの磁気攪拌したＮ−メチルピロリジン−２−オン中
に添加する。同時に、１当量のジエチレントリアミンN,
N′,N″−トリ−ｐ−トルエンスルホンアミドの二ナト
リウム塩のＮ−メチルピロリジン−２−オン中の２％溶
液を添加する。反応物を添加後更に６時間20℃で攪拌
し、200mLの溶媒を高真空下で蒸発させ、残留する溶液
を冷却し、100mLの氷水に添加する。得られる沈殿を濾
過により単離し、冷水で洗浄し、アセトニトリルで粉砕
して粗トリ−ｐ−トルエンスルホンアミド誘導体を得
る。
パートB:3,4,5,6,7,8,9,10,11−ノナヒドロ−15−ニト
ロ−2,17:12,14−ジエテノ−1,4,7,10,13−ペンタアザ
ベンゾシクロペンタデシン パートＡで製造した粗大環状体の１部を10部の濃硫酸
（96％）に溶解し、反応混合物を攪拌し、アルゴン下で
110℃に加熱した。24時間後に、この溶液を氷水中で激
しく攪拌しながら冷却し、pHが10に達するまで10％水酸
化ナトリウム溶液で処理する。水相を等体積のクロロホ
ルムで５回抽出し、抽出物を一緒にして無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥する。次いで濾過により塩を除去し、濾液を
アルゴン下で蒸発させる。粗トリアミンはエタノール／
水から再結晶することにより精製することができる。
パートC:3,5,6,8,9,11−ヘキサヒドロ−15−ニトロ−4,
7,10−トリス（エトキシカルボニルメチル）−2,17:12,
14−ジエテノ−1,4,7,10,13−ペンタアザベンゾシクロ
ペンタデシン 無水アセトニトリル中の３重量％溶液としての、パー
トＢで製造したトリアミノ大環状物１部と炭酸ナトリウ
ム10部及びブロモ酢酸エチル３部との混合物を、アルゴ
ン下で24時間60℃で攪拌する。次いで反応混合物を室温
に冷却し、濾過し、溶媒を蒸発させる。残渣は冷エーテ
ル中での粉砕により更に精製することができる。
パートD:15−アミノ−3,5,6,8,9,11−ヘキサヒドロ−4,
7,10−トリス（エトキシカルボニルメチル）−2,17:12,
14−ジエテノ−1,4,7,10,13−ペンタアザベンゾシクロ
ペンタデシン パートＣのニトロトリエステル１重量部を、テトラヒ
ドロフラン（THF）及びエタノールの50/50混合物100重
量部中に溶解する。６重量倍の水中の２当量のギ酸アン
モニウムを添加し、次いで２当量の10％Pd/Cを添加す
る。反応混合物を室温でアルゴン下に一夜攪拌する。次
いで反応混合物をアルゴン下に濾過し、濾別した触媒を
THF、エタノール、次いでジクロロメタンでアルゴン下
によく洗浄する。一緒にした濾液及び洗液を濃縮し、残
渣をクロロホルムに溶解し、クロロホルム溶液を水で２
回洗浄する。有機相を油にまで濃縮し、メタノールを添
加することにより結晶化を促進する。生成物をメタノー
ル中で粉砕し、濾過し、次いで空気中で乾燥する。
パートE:生成物Ａ パートＤのアミントリエステルを、５％水性メタノー
ル中の３当量の水酸化ナトリウムと共に室温で24時間攪
拌する。溶媒を真空下で除去し、生成物Ａを少量の冷メ
タノールで粉砕する。濾過により生成物Ａを単離する。
製造8:三ナトリウム 15−イソチオシアナト−4,7,10−
トリス（カルボキシメチル）−2,17:12,14−ジエテノ−
1,4,7,10,13−ペンタアザベンゾシクロペンタデシン 製造７、１重量部のパートＥからのアミン三ナトリウ
ム塩を200部のメタノール中で室温で攪拌する。これを
周囲温度で２重量部のテトラヒドロフラン中に溶解した
１当量のチオホスゲンで処理し、次いで２重量部のテト
ラヒドロフラン中に溶解した１当量のトリエチルアミン
で処理する。１時間後、反応混合物を残渣にまで濃縮
し、ジクロロメタン中にスラリー化し、濾過により生成
物を単離する。
製造9:三ナトリウム ２−メチル−３−チオ−４−｛15
−〔3,5,6,8,9,11−ヘキサヒドロ−4,7,10−トリス（カ
ルボキシメチル）−2,17:12,14−ジエテノ−1,4,7,10,1
3−ペンタアザベンゾシクロペンタデシニル〕｝−セミ
カルバジド １重量部の製造８で製造した15−イソチオシアナト−
4,7,10−トリス（カルボキシメチル）−2,17:12,14−ジ
エテノ−1,4,7,10,13−ペンタアザベンゾシクロペンタ
デシンの三ナトリウム塩及び200重量部のメタノールの
新しく製造し攪拌した混合物に、アルゴン下で室温で、
10部のメタノール中に溶解した１当量のメチルヒドラジ
ンの溶液を急速に添加する。室温で１時間後、溶媒を減
圧下蒸発により除去し、残渣を無水の酸素を含まないエ
ーテル10部で粉砕し、固体を濾過により単離する。
製造10:四ナトリウム ２−メチル−３−チオ−４−
｛５−（〔6,6″−ジ−ビス（カルボキシメチル）アミ
ノメチル〕−2:2′,6′:2″−テルピリジン−４′−イ
ル）−２−メトキシフェニル｝−セミカルバジド １重量部の製造６で製造したTMT−イソチオシアナト
の四ナトリウム塩及び200重量部のメタノールの新しく
製造し攪拌した混合物に、アルゴン下で室温で、10部の
メタノール中に溶解した１当量のメチルヒドラジンの溶
液を急速に添加する。室温で１時間後、溶媒を減圧下蒸
発により除去し、残渣を無水の酸素を含まないエーテル
10部で粉砕し、固体を濾過により単離する。
製造11:四ナトリウム ２−メチル−３−チオ−４−
｛５−（〔6,6″−ビス（N,N′−ジカルボキシメチル−
Ｎ−メチルヒドラジノ）−2:2′,6′:2″−テルピリジ
ン−４′−イル〕−２−メトキシフェニル）｝−セミカ
ルバジド １重量部の製造３で製造したTHT−イソチオシアナト
の四ナトリウム塩及び200重量部のメタノールの新しく
製造し攪拌した混合物に、アルゴン下で室温で、10部の
メタノール中に溶解した１当量のメチルヒドラジンの溶
液を急速に添加する。室温で１時間後、溶媒を減圧下蒸
発により除去し、残渣を無水の酸素を含まないエーテル
10部で粉砕し、固体を濾過により単離する。
製造12:四ナトリウム ２−メチル−３−チオ−４−
〔2,9−ビス（カルボキシメチル）アミノメチル−1,10
−フェナントロリン−５−イル〕セミカルバジド １重量部の製造５で製造したPheMT−イソチオシアナ
トの四ナトリウム塩及び200重量部のメタノールの新し
く製造し攪拌した混合物に、アルゴン下で室温で、10部
のメタノール中に溶解した１当量のメチルヒドラジンの
溶液を急速に添加する。室温で１時間後、溶媒を減圧下
蒸発により除去し、残渣を無水の酸素を含まないエーテ
ル10部で粉砕し、固体を濾過により単離する。
製造13:大環状キレート化剤：二ナトリウム 1,7−ジカ
ルボキシメチル−〔４′−（３−アミノ−４−メトキシ
フェニル）−2,2′:6′,2″−テルピリジノ〕−1,4,7,1
0,13,16−ヘキサアザ−18−クラウン−６ パートA:6,6″−ジシアノ−４′−（４−メトキシフェ
ニル）−2,2′:6′,2″−テルピリジン 6,6″−ジブロモ−４′−（４−メトキシフェニル）
−2,2′:6′,2″−テルピリジン（0.0745モル）、シア
ノ化第一銅（0.296モル）、シアン化ナトリウム（0.297
モル）及び300mLのジメチルホルムアミドの混合物を160
℃で６時間反応させる。冷却した後、反応混合物を1500
mLの水中に移し、得られる混合物を２時間攪拌し、濾過
する。固体残渣をシアン化ナトリウムの溶液（400mL水
中200g）に溶解し、得られる溶液を一夜攪拌する。所望
の固体生成物を濾過し、水（６×600mL）で粉砕し、乾
燥して白色粉末を得る。
パートB:6,6″−ビス（アミノメチル）−４′−（４−
メトキシフェニル）−2,2′:6′,2″−テルピリジン 6,6″−ジシアノ−４′−（４−メトキシフェニル）
−2,2′:6′,2″−テルピリジン（４ミリモル）及び130
mLの酢酸中の10％Pd/C 480mgの混合物を、45℃で22時間
水素化する（H2、50psi）。反応混合物を濾過し、溶媒
を除去して所望のジアミンを酢酸塩として得、これをメ
タノールで粉砕し、次いで溶媒を除去し、乾燥して所望
のジアミン酢酸塩を得る。
パートC:6,6″−ビス（アミノメチル）−４′−（４−
メトキシフェニル）−2,2′:6′,2″−テルピリジンピ
リジン−2,6−ジカルボン酸環式ジラクタム テトラヒドロフラン（41mL）中の6,6″−ビス（アミ
ノメチル）−４′−（４−メトキシフェニル）−2,2′:
6′,2″−テルピリジン（２ミリモル）の溶液及びジメ
チルホルムアミド（9mL）中のジイソプロピルアミン
（４ミリモル）の溶液を、攪拌しながら350mLのTHF中に
添加する。上記の溶液に、THF（50mL）中の2,6−ピリジ
ンジカルボニルクロリドの溶液を滴加し、反応混合物を
一夜攪拌する。減圧下に溶媒を蒸留し、残渣を250mLのC
H2Cl2に溶解する。有機層を水（２×30mL）、0.01N HCl
溶液（２×25mL）、水（１×20mL）、５％ NaHCO3溶液
（２×25mL）及び水（２×20mL）で次々と洗浄する。乾
燥（Na2SO4）後、溶媒を蒸留して所望のジラクタムを
得、次いでこれをシリカゲルクロマトグラフィーにより
精製する。
パートD:二ナトリウム 1,7−ジカルボキシメチル−
〔４′−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）−2,
2′:6′,2″−テルピリジノ〕−1,4,7,10,13,16−ヘキ
サアザ−18−クラウン−６ 上記パートＣの環式ジラクタム（ａ）をジボランで還
元してジアミンを得、これをブロモ酢酸エチルと反応さ
せてビス（酢酸エチル）を得る。次いでこれを硝酸及び
硫酸でニトロ化して、４′−（４−メトキシ−３−ニト
ロフェニル）−2,2′:6′,2″−テルピリジニル誘導体
を得る。次いでニトロ基を炭素上パラジウムの存在下で
ギ酸アンモニウムで還元し、エステル基を水酸化ナトリ
ウムで鹸化して所望の大環状キレート化剤（ｂ）を得
る。
製造14:大環状キレート化剤：三ナトリウム 1,4,7−ト
リス（カルボキシメチル−〔４′−（３−アミノ−４−
メトキシフェニル）−2,2′:6′,2″−テルピリジノ〕
−1,4,7,10,13,16−ヘキサアザ−18−クラウン−６ パートA:テルピリジン−ヘキサ−アザ環式トリトルエン
スルホンアミド 窒素下で80℃に加温した。60mLのDMF/アセトニトリル
（1:1）中の6,6″−ビス（メシルオキシメチル）−４′
−（４−メトキシフェニル）2,2′:6′２″−テルピリ
ジン（２ミリモル）の溶液に、20mLのDMF中のN,N′,N″
−トリトシル−（N,N−ビスアミノエチル）アミノ二ナ
トリウム塩の溶液を少しずつ添加する。反応混合物を80
℃で７時間反応させ、溶媒を減圧下で蒸留する。残渣を
150mLの塩化メチレンに溶解し、有機層を水で洗浄し、
乾燥し、次いで溶媒を減圧下で蒸留して粗テルピリジン
−ヘキサアザ環式トリトルエンスルホンアミド、14
（ａ）を得る。所望のトリトルエンスルホンアミドをカ
ラムクロマトグラフィー（シリカゲル）により精製す
る。
パートB:三ナトリウム 1,4,7−トリス（カルボキシメ
チル−〔４′−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）
−2,2′:6′,2″−テルピリジノ〕−1,4,7,10,13,16−
ヘキサアザ−18−クラウン−６ 上記パートＡのトリトルエンスルホンアミド、14
（ａ）を硫酸中で加水分解してトルエンスルホンアミド
基を除いて、大環状テルピリジルトリアミン誘導体を得
る。このトリアミンをブロモ酢酸エチルと反応させてト
リス（酢酸エチル）を得る。これを硝酸及び硫酸でニト
ロ化して、４′−（４−メトキシ−３−ニトロフェニ
ル）−2,2′:6′,2″−テルピリジニル誘導体を得る。
次いでニトロ基を炭素上パラジウムの存在下でギ酸アン
モニウムで還元し、エステル基を水酸化ナトリウムで鹸
化して所望の大環状キレート化剤14（ｂ）を得る。
セクションII:免疫試薬 抗体とTMTとの及びTHTとの複合体（conjugates）の製造 パートA:キレート化剤を抗体に結合させる方法 抗体の炭水化物基をNaIO4で酸化し、抗体にアルデヒ
ド基を作ることによってTMT又はTHTを抗体に結合させ
た。精製した水中の0.1M NaIO4の溶液（110mL）を、1mL
の、PBS（10mMリン酸ナトリウム、0.15M NaCl）、pH6.0
中のB72.3＊〔＊B72.3は、National Institute of Heal
th（NIH）により最初に開示されたよく知られた結腸直
腸腫瘍付随抗原に対する抗体である（米国特許第4,522,
918号）〕抗体の4mg/mL溶液に添加した。得られた溶液
のpHを6.0に再調整し、１時間室温で暗室内でインキュ
ベーションした。このインキュベーションの後、抗体溶
液をPBS、pH6.0で平衡化させたセファデックス（Sephad
ex）G50カラムに通すことによって、過剰の過ヨウ素酸
塩を除去した。1mLのフラクションを捕集し、280nmで最
大吸収を与える２個のフラクションを一緒にした。
固体キレート化剤をPBS、pH6.0に溶解することによっ
て、各キレート化剤（TMT又はTHT）の0.33M溶液を製造
した。これは溶液のpHをpH9.0を超えるように上げ、そ
れで6M HClでpHを約6.8に調整した。200mL各キレート化
剤溶液を、抗体溶液の分けた2mL部分に添加し、各得ら
れた溶液のpHをpH6.0に調整した。これらの混合物を５
時間室温で暗室内でインキュベーションした。次いでNa
CNBH3（Aldrich 29,694−5;約1M NaOH中5M）を、10mM
の最終濃度まで各溶液に添加し、そしてpHを6.0に調整
してアルデヒドにより形成されるシッフ塩基を減少させ
た。混合物を一夜室温でインキュベーションした。次い
で溶液を遠心分離して（Eppendorf Model 5412）一夜で
沈殿した未溶解のキレート化剤を除去し、Centricon 30
（Amicon）マイクロ濃縮器で1mLにまで濃縮した。これ
らの溶液をSephadex G50カラムに通して過剰のキレート
化剤及びNaCNBH3を除去した。1mLのフラクションを捕集
し、280nmで最大吸収を含む各キレート化剤溶液の２個
のフラクションを一緒にした。一緒にしたフラクション
を0.01M酢酸ナトリウム、0.15M NaCl、pH6.0に対して
緩衝剤を２種変えて透析した。分析の間に更に沈殿が生
成した場合には、これらを遠心分離により除去した。
典型的に、この方法により製造された複合体標本は、
約1.7のTMT又はTHTの抗体に対する平均モル比を有して
いた。
パートB:キレート化剤の抗体に対する比の分析 複合体溶液中の抗体の濃度は、タンパク質標準物質と
してウシ免疫グロブリンを使用するバイオラド（BioRa
d）タンパク質アッセイを使用して測定した。THTの濃度
は、350nMでの測定消衰係数を使用して分光光学的に測
定した。TMT−B72.3複合体について、複合体の一部（約
0.5mg）を1mLの0.01M酢酸ナトリウム中に入れ、0.15M
NaCl緩衝液、pH6.0及び過剰のEu3+を添加した。330nmで
のこの溶液の吸収を、これらの溶液中のキレートの量を
測定するために使用した。
パートC:抗体−キレート複合体（免疫試薬）のin vitro
機能試験（functional test）（免疫適格アッセイ） Linbro EIA II Plusマイクロタイタープレートのウエ
ルを、PBS（燐酸塩緩衝食塩水）中のウシ下顎ムチン（S
igma M4503）、即ちB72.3抗体と反応性の抗原の4mg/mL
の溶液100mL/ウエルを添加することによって抗原で被覆
し、１時間室温でインキュベーションした。プレートを
PBS、pH6.8で３回洗浄した後、200mL/ウエルの１％BSA
（ウシ血清アルブミン、Sigma A−7906）−PBS、pH6.8
を添加することによってウエルを保護し、１時間室温で
インキュベーションした。プレートを再びPBS、pH6.8で
３回洗浄した。複合体の試料を１％ウマ血清（Sigma S
−7390）を含むPBS、pH6.8中の１×10-7Mの濃度で作
り、これらの溶液からこの同じ緩衝液中の希釈液を作っ
た。100μＬの各試料希釈液を、２個ずつウエルに添加
した。１時間室温インキュベーションした後、プレート
をPBS、pH6.8で３回洗浄し、次いで１％ウマ血清を含む
PBS、pH6.8中のウサギ抗−マウスＦ（ab′）２−HRP複
合体（Jackson Labs,315−035−047）の1:1000希釈液を
ウエル当たり100μＬ添加することにより評価した。１
時間室温インキュベーションした後、ウエルをPBS、pH
6.8で３回洗浄した。ABTS−HRP基質（Kirkegaard and P
erry Labs,Product ＃506502及び＃506402）をウエル当
たり100μＬ添加すると色が生じた。この反応は等体積
の4N H2SO4を添加することによって停止した。この色を
15分後にTitertek Multiscan装置で414nmフィルターを
使用して読み取った。
この方法により試験したとき、B72.3とTMT又はTHTと
の免疫複合体は、生のB72.3に匹敵する免疫反応性を有
することが分かった。このデータを図１及び２に示す。
図１にはまた前記のユウロピウム錯体と同じ方法で製造
したB72.3−THT複合体のスカンジウム錯体についての曲
線も含める。
例１〜2:比較対照として使用する、DTPA複合体の放射性
核種（111In90Y）で標識化した放射性免疫試薬（抗体−
TMT複合体）の製造及び評価 A.キレート−抗体複合体−生体分布実験のin vivo機能
試験 1.試験物質。試験した免疫複合体は、上記のようにして
製造したB72.3−TMT複合体又はTMT結合について記載し
たものと同様の方法を使用してDTPAが（リンカーアーム
を介して）抗体の酸化炭水化物に結合しているB72.3−D
TPA複合体であった。
2.放射性同位元素を有する標識複合体。111In又は90Yで
標識化すべき抗体−キレート複合体を燐酸塩緩衝食塩
水、pH6.0に入れた。放射性核種（約1mCi）を複合体溶
液（約1mgの抗体−キレート複合体を含む1mL）に添加
し、混合し、そして約30分間室温でインキュベーション
した。全てのキレート化しなかった金属を、HPLCゲル濾
過（TSK3000SWカラム）により各複合体調製物から除去
した。カラム溶出液をタンパク質（OD280nm）及び放射
能（放射能モニター）の両方についてモニターした。精
製した標識複合体の特異活性をこのデータから算出し
た。この複合体を生体分布研究のために直ちに使用し
た。
3.一般的方法。５匹のマウスを各試験群で90Y生体分布
研究用に使用し、３匹のマウスを各群で111In研究用に
使用した。各マウスについての目標適用量（Target dos
es）は、適用量当り放射性複合体10mg、即ち、μＬ当た
り抗体20〜100μｇで適用量当たり50μCiより大きかっ
た。
腫瘍を有しないマウス及び腫瘍を有するマウスの両方に
第０日に注射した。
4.腫瘍成長開始、各ヌードマウス（nu/nu:Swiss Backgr
ound,Taconic Farms,Germantown,NY）に左後側腹部に、
細胞培養からの無菌媒体又は食塩水約0.25mL中の指数増
殖期の100万個のLS174T細胞を皮下注射した。マウスを
腫瘍が測定可能になるまで腫瘍成長について検査した。
その後、全てのマウスについて長さ×幅の積が50〜100m
m2になるまで、デジタルカリパスを用いて２本の直交す
る直径（長さ×幅）を最近接（nearest）0.1mmまで測定
した。
5.注射プロトコール。腫瘍細胞接種（第０日）以後の所
望の日に、各マウスに標識複合体を注射した。各適用量
について放射性同位元素標識抗体を、適用のための28
G、1/2インチ針を取り付けた1ccインスリン注射器内に
吸い上げた。各試験物質の３個の10μＬアリコートを注
射適用量を決定するためのガンマカウント用に取ってお
いた。
試験物質を入れた各注射器に適用の順番に番号を付け
た。各注射器を秤量し、放射性核種を定量するためにセ
ットしたドーズキャリブレータでカウントした。この情
報を記録した。ケタミン（Ketamine）HClを11mg/mLでキ
シラジン（xylazine）を3mg/mL含む無菌溶液0.15mLを腹
腔内注射することによってマウスを麻酔した。試験物質
を後眼窩静脈洞（retroorbital venous sinus）を介し
て注射した。各マウスを注射直後にドーズキャリブレー
タでカウントし、注射器を再秤量し、再カウントし、そ
してデータを記録した。
6.評価方法。各動物を第０日及び解剖直前に最近接0.1g
まで秤量した。画像形成及び／又は解剖の直前に、各動
物をドーズキャリブレータでカウントし、次いで標準操
作方法を行った。各死体を解剖後にカウントした。解剖
直前に、各動物はデジタルカリパスを用いて２本の直交
する直径（長さ×幅）を最近接0.1mmまで測定したその
腫瘍を有していた。血液試料を各動物から風袋を測った
培養管に集め、次いでこの管を再秤量した。各動物を頸
部転位（cervicaldislocation）により犠牲にした。器
官（肺臓、脾臓、肝臓、結腸、右腎臓、左腎臓、腫瘍、
骨髄、筋肉）を解剖し無関係の組織を除去するために切
り取り、次いで最近接ミリグラムで秤量した。解剖した
器官の放射能をガンマカウントにより測定した。
7.結果。図３に示す生体分布は、放射性免疫試薬の注射
後４日目の６匹のマウスについてのものである。111In
生体分布試験からのデータは、B72.3の放射性同位元素
標識TMT複合体が腫瘍に対して放射能を標的化したこと
を示している。肝臓及び腎臓レベルはB72.3−DTPA−111
In複合体よりも僅かに大きかったけれども、B72.3−TMT
−111In複合体は111In腫瘍標的化用に使用することがで
きた。
図４に示す生体分布は、放射性免疫試薬の注射後８日
目に得られたものである。５匹のマウスの各群について
の平均生体分布値を、試験した組織種類についてグラフ
にした。90Y生体分布からのデータは、B72.3−TMT−90Y
複合体が、B72.3−DTPA−90Y複合体と同様に腫瘍に対し
て90Yを標的化したことを示している。しかしながら、B
72.3−DTPA−90Y複合体に比較してB72.3−TMT−90Y複合
体を使用したとき著しく少ない90Yが大腿に見出され
た。大腿（骨髄）は90Y治療にとって適用量制限器官で
あるので、この結果は、TMTがこの同位元素を使用する
抗体標的化放射性治療のためのより良いキレートである
ことを示している。試験した他の組織の中で、TMTが免
疫複合体を製造するために使用したキレート化剤である
とき、血液のみがより高い90Yレベルを有することが分
かった。これは、B72.3−DTPA−90Y錯体に比較してB72.
3−TMT−90Y錯体の優れたin vivo安定性のためであると
信じられる。
B.延命研究 B72.3−TMT−90Y錯体がB72.3−DTPA−90Yに比較して
骨髄に達する90Yの量を減少させる場合には、そして骨
髄が適用量制限器官である場合には、これらの複合体で
接種されたマウスは、B72.3−TMT−90Y複合体がB72.3−
DTPA−90Y複合体で接種されたものよりも少ない毒性で
あることを見出すべきである。この仮説を試験するため
の一般的な方法（延命研究）は、下記のこと以外は生体
分布研究について記載したものと同じであった。各試験
群において８匹の腫瘍を有するヌードマウスがいた。注
射スケジュールは次の通りであった。200μCi,120μCi
及び120μCiをそれぞれ0.4及び８日目にB72.3−TMT−90
Y複合体又はB72.3−DTPA−90Y複合体の両方について与
えた（低適用量養生）。二つの他のマウスのセットに
は、それぞれ0.4及び８日目に400μCi,320μCi及び320
μCiの２種の免疫複合体を与えた（高適用量養生）。マ
ウスの延命を観察した（試験物質の生体分布は行わなか
った）。結果（図５）は、B72.3−TMT−90Y複合体を使
用して90Yを適用した場合にマウスの延命されたことを
示している。
C.抗腫瘍特異性に有するTMT免疫複合体 TMT又はその適当な誘導体は抗体分子に複合化させ
て、抗体可変部により認識される標的抗原に結合する能
力を演ずる抗体−TMT複合体を生じることができる。こ
のような複合体は、このような複合体により標的化され
る傷害を限局化及び／又は治療するためにTMT単位によ
りキレート化される放射性同位元素を分配するために使
用することができる。一つの好ましい態様において、抗
体は、それが腫瘍細胞に表れる抗原分子との広い反応性
を有し、それにより治療又は診断目的のために腫瘍に放
射性同位元素を分配させることができる抗体−TMT複合
体を与えるように選択される。ING−１はマウス可変部
及びヒト免疫グロブリン定常部からなるキメラ抗体であ
る（国際特許出願公開番号WO 90/02569,1990年３月22日
に記載されている）。この抗体分子は、本質的に上記参
照刊行物に記載されているようにキメラ抗体を表わすマ
ウス骨髄腫細胞を培養することによって作られる。キメ
ラING−１抗体は50mM酢酸ナトリウム緩衝液中pH5.6で、
150mM NaClで補足して5.2mg/mLの濃度で使用される。抗
体溶液1.15mLに、100mM食塩水で補足したpH9.9の50mMホ
ウ酸ナトリウムの溶液を添加して最終全体積を2.5mLに
する。この溶液を、抗体溶液に添加したホウ酸ナトリウ
ム緩衝液で平衡化したPD−10クロマトグラフィーカラム
にかける。抗体を同じホウ酸ナトリウム緩衝液3.5mLで
カラムから溶出する。溶出液を、Centricon−30限外濾
過装置を使用して濃縮して、溶液1mL当たりING−１キメ
ラ抗体約4.0mgの濃度にする。TMTのNCS誘導体（製造６
から、以後TMT−NCSと言う）の溶液を、ホウ酸ナトリウ
ム緩衝液中で10mg/mLの濃度で製造し、TMT−NCS 138μ
Ｍの最終濃度になるまで抗体溶液に添加する。この溶液
をゆっくり混合し、暗室内で環境温度（約22℃）で一夜
（約12時間）インキュベーションする。ING−1:TMT複合
体を、150mM塩化ナトリウムを補充したpH5.6の50mM酢酸
ナトリウム緩衝液で平衡化し溶出したSuperose 12 HPLC
カラムを使用して遊離のTMT−NCS及びその他の低分子量
生成物から分離する。次いでTMT免疫複合体を、この複
合体がTMT単位に放射性同位元素標識することができそ
して腫瘍細胞を標的化することができることを示すため
に、腫瘍細胞抗原に結合するその能力及びまたイットリ
ウム−90同位元素を結合するその能力について試験す
る。
例3:TMTを含むING−１の複合体の製造 抗体ING−１を上記のようにして製造した。精製後、I
NG−１を50mM酢酸ナトリウム及び150mM塩化ナトリウム
緩衝液、pH5.6中で5.0mg/mLの濃度で使用した。
TMT−NCSに対するING−１の複合化を、抗体溶液が9.0
のpHに達するまで先ず1.0M炭酸塩、150mM塩化ナトリウ
ム緩衝液、pH9.3を添加することにより行った。次いで5
mgのタンパク質を含むこのING−１溶液の試料を、酸洗
浄したコニカルガラス反応バイアルにピペットで入れ
た。TMT−NCS（製造６）の溶液を、1mLの1.0M炭酸塩、1
50mM塩化ナトリウム緩衝液、pH9.3中に100mg溶解させる
ことによって製造した。96.5μＬのTMT−NCS溶液を抗体
溶液に添加することによって複合化反応を開始させて、
ING−１上の４倍モル過剰のTMT−NCSを得た。この溶液
を簡単に攪拌して反応剤を混合し、次いで暗室内に室温
で放置した。16時間後、反応混合物を、予め洗浄し150m
M塩化ナトリウム中50mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.6で
平衡化させたPD10クロマトグラフィーカラムにかけるこ
とによって、TMTを含むING−１複合体を複合化しなかっ
たTMTから分離した。純粋の複合体を3.5mLの同じ緩衝液
でカラムから溶出した。
抗体比に対するキレート化剤の分析 複合体溶液中のING−１の濃度を、タンパク質標準物
質としてウシ免疫グロブリンを使用するBioRadタンパク
質アッセイにより測定した。
抗体当たりの官能性TMT分子の数を計算するために、T
MTを含むING−１複合体（ING−1/TMT）を、TMTの金属結
合容量の飽和が生じるまで塩化ユウロピウムの溶液と反
応させた。2.5mLの0.05M Tris HCl緩衝液、pH7.5中のI
NG−1/TMTの0.5mgアリコートを、5mL石英キュベット中
にピペットで入れた。0.05M Tris HCl緩衝液、pH7.5中
の20μＭ塩化ユウロピウム（塩化ユウロピウム６水和
物:Aldrich）溶液を製造した。この塩化ユウロピウム溶
液のアリコート（50μＬ）をING−1/TMTを入れたキュベ
ットに添加し、得られた溶液を、キュベットの中に入れ
た小さい磁気攪拌棒を使用して磁気攪拌機上で室温で10
分間ゆっくり攪拌した。金属−ING−1/TMTの蛍光を、34
0nmの励起波長を使用しパーキンエルマーLS 50分光蛍光
計（10nmスリット幅）で測定した。10nmスリット幅及び
430nmカットオフフィルターを使用して蛍光発光を618nm
でモニターした。上記の手順を繰り返し、各添加の後で
蛍光読み取りを行った。蛍光強度の増加が前の読み取り
の５％より小さくなるまで、塩化ユウロピウムのアリコ
ートを添加した。試験溶液の体積の変化を補償するため
に各モル比で測定した蛍光強度に希釈補正を適用した。
ING−1/TMT複合体の各キレート化部位は１個のユウロピ
ウムイオンに結合するので、そして１個のユウロピウム
イオンは蛍光を生じるために１個のキレート部位になく
てはならないので、この方法は官能性キレート化部位の
数を定量化させる。
この方法を使用して、抗体の１分子当たりのTMT分子
の比率は1:1〜2:1の範囲内である。
ING−1/TMT免疫反応性アッセイ ａ）ELISAによる 抗体、ING−１が結合した抗原を、細胞スクレーパー
を有する培養フラスコの壁から細胞の集密的単層を掻き
落とすことによりLS174T又はHT29細胞（ATCCから入手可
能）から製造した。多数のフラスコからの細胞を一緒に
し、試料を取り出して計数して、収穫した細胞の全数を
推定した。全ての時点で細胞を氷に保存した。1500rpm
で10分間４℃で細胞を遠心分離した後、細胞を150mM塩
化ナトリウムで補足した氷冷50mMリン酸ナトリウム緩衝
液、pH7.4（PBS）で一度洗浄し、同じ条件下でペレット
にし、氷冷したガラス製乳鉢に移した。モーター駆動乳
棒を使用し４℃で細胞をホモジナイズし、次いで3000×
ｇで５分間遠心分離した。この抗原に富んだ上澄液を他
の細胞破片より取り、４℃で更に１時間100,000×ｇで
遠心分離した。この最終工程からのペレット（抗原フラ
クション）を、収穫した100万個の細胞毎に100μＬのPB
S中に懸濁させた。タンパク質濃度の推定（タンパク質
標準物質としてウシ免疫グロブリンを使用するBioRad B
CAタンパク質アッセイ）に続いて、抗原を−20℃で使用
するまで貯蔵した。
96ウエルのCostarマイクロタイタープレートの各ウエ
ルを、上記のようにして製造した細胞溶解物（10μg/m
L）の100μL/ウエルを添加することによって抗原で被覆
した。マイクロタイタープレートを一夜37℃インキュベ
ータ内で乾燥させた。プレートを0.05％Tween−20（Sig
ma）で５回洗浄した後、PBS中の１％BSA（ウシ血清アル
ブミン、Sigma A−7906）溶液を125μL/ウエル添加する
ことによって保護し、１時間室温でインキュベーション
した。プレートを0.05％Tween−20で５回洗浄した。ING
−1/TMT複合体及び標準ING−１抗体の試料（二重で50μ
L/ウエル）をPBS中の濃度の範囲で製造した。ビオチン
化ING−１（0.1％BSA中1.0μg/mL）を各ウエルに添加し
（50μL/ウエル）、次いでプレートを２時間室温でイン
キュベーションした。0.05％Tween−20で５回洗浄した
後、プレートを吸い取り乾燥し、希釈した（0.1％BSA中
1:4000）ストレプトアビジン−アルカリホスフェターゼ
（Tago;＃6567）と共に室温で１時間インキュベーショ
ンした。更に５回洗浄した後、ホスファターゼ基質試薬
（10mLの蒸留水及び20μＬのSigma 221アルカリ性緩衝
液に溶解した２個のSigma 104ホスファターゼ錠剤）を1
00μL/ウエル添加すると、各ウエルに色が生じた。室温
で１時間、この色をTitertek Multiscanマイクロプレー
ト読み取り装置で405nmフィルターを使用して読み取っ
た。
この方法により試験したとき、TMTを含むING−１の免
疫複合体は生ING−１に匹敵する免疫活性を有すること
が分かった。
ING−1/TMT免疫活性アッセイ ｂ）フローサイトメトリーによる 標的HT29細胞を、10％ウシ胎児血清で補足したDMEM培
地を使用して組織培養フラスコ内で集密まで成長させ
た。細胞スクレーパーでフラスコの壁を掻き落とすこと
によって細胞を収穫した。多数の別のフラスコからの細
胞を一緒にし、ペレットまで遠心分離し、0.1％ウシ血
清アルブミン（Sigma）及び0.02％アジ化ナトリウム
（フロー緩衝液）で補足した氷冷した150mM塩化ナトリ
ウムを含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4（PBS）
の溶液中に５×105/mLで再懸濁させた。細胞をこの同じ
緩衝液で洗浄し、次いでカウントした。抗体標準曲線は
ING−１を無関係（結合無し）イソタイプ合致対照抗体
（ヒトIgG1）で希釈して、ING−１含有量が10％〜100％
の範囲の多数の試料を得ることによって作った。標準曲
線を各試料にmL当たり1.0μｇのタンパク質が含まれる
ようにフロー緩衝液中で作った。次いで標準曲線からの
試料及び未知の試料を、５×105HT29細胞と共に４℃で
１時間インキュベーションした。多数回洗浄して未結合
の抗体を除去した後、細胞を100μＬのフロー緩衝液に
再懸濁させ、蛍光イソチオシアナート（FITC）で標識し
たヤギ−抗ヒト抗体と共に４℃で１時間インキュベーシ
ョンした。フロー緩衝液中で更に洗浄した後、試料をCo
ulter EPICS 753フローサイトメーターでフローサイト
メトリーにより分析した。蛍光イソチオシアナート（FI
TC）及びヨウ化プロピジウム（propidium iodide）（P
I）をアルゴンレーザ488nm発光線を使用して励起した。
出力は光調節モードで500mwで同定した。単一細胞を90
度及び前方角光散乱器により同定した。凝集体及び細胞
残骸から単一細胞を分離するために、分析窓をこれらの
パラメーターに適用した。FITC及びプロピジウムからの
蛍光を500nmロングパス緩衝フィルターで分離し、（FIT
C用に）530nmバンドパス（band pass）フィルター及び
（PI用に）635nmバンドパスフィルターを通して集め
た。光散乱パラメーターは集積パルスとして集め、蛍光
は対数集積パルスとして集めた。死んだ細胞は分析窓を
PI吸収に関しネガティブな細胞上に置くことによってア
ッセイから除外した。試料当たりの平均蛍光発光（2500
個の細胞からの重量平均）を各ヒストグラムについて計
算した。標準曲線を確定するために、FITC較正ビーズを
各実験で分析した。次いで各試料についての平均蛍光強
度を細胞当たり平均FITC当量として表わした。免疫反応
性は未知試料の平均蛍光強度を標準曲線からの値と比較
することによって計算した。ING−1/TMTの試料はこの方
法により生ING−１抗体に匹敵する免疫反応性値を有し
ていた。
サイズ排除HPLCによる凝集体形成の決定 同じ材料のガードカラムを取り付けた30cm×7.5mmのT
SK−C3000SWサイズ排除HPLCカラム（Supelco）を、12カ
ラム体積の、150mM塩化ナトリウムで補足した10mMリン
酸ナトリウム緩衝液、pH6.0で、Waters 600E HPLCシス
テムを使用し1.0mL/分の流速で400〜600PSIで平衡化さ
せた。BioRadゲル濾過タンパク質標準物質の試料（25μ
Ｌ）をカラムの上に注入した。各標準物質の保持時間を
280nmでセットしたWaters 490 UV検出器によりモニター
した。カラムから最後の標準物質を回収した後、これを
更に10体積の、150mM塩化ナトリウムで補足した10mMリ
ン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0で洗浄した。生ING−１抗
体又はING−1/TMTの何れかの試料（50μＬ）をカラムの
上に注入し、それらの保持時間を記録した。保持ピーク
の面積及び保持時間から、ING−1/TMT試料中の凝集した
物質の量を計算した。
この方法により、生ING−１抗体は9.1分の保持時間を
有していた。ING−1/TMTはまた9.1分で大ピークを有し
ていたが、ときには凝集体に帰属させることができる小
ピークが7.3分に見られた。ピーク面積を比較すること
によって、凝集体ピークは全体の５％より少なかった。90 Yを有するING−1/TMTの放射性同位元素標識 放射性塩化イットリウムの１体積（＞500Ci/gの比活
性で0.04M塩酸中の90Y、Amersham−Mediphysics）を、
２体積の0.5M酢酸ナトリウムpH6.0を使用して中和し
た。中和した90Y（1.0mCi）をpH5.6の150mM塩化ナトリ
ウムを含む50mM酢酸ナトリウム緩衝液中の1.0mLのING−
1/TMT（1mg/mL）に添加した。標識化を１時間進め、次
いで反応混合物を、予備洗浄し150mM塩化ナトリウムと
共に50mMリン酸ナトリウムを含む緩衝液pH7.4（PBS）中
で平衡化させたPD−10クロマトグラフィーカラムにかけ
た。試料を1.5mLのPBSでカラムから溶出した。放射性同
位元素標識したING−1/TMTのフラクション（0.5mL）を
集め、放射能について分析し、プールした。標識化効率
は、1.0μＬの試料を取り出し、それをGelman ITLC−SG
片にスポッティングすることによって決定した。この片
を0.1Mクエン酸ナトリウム、pH6.0を入れたガラス製ビ
ーカー内で、溶媒の先端が紙の上端への道の四分の三に
達するまで数分間現像した。この片を、90Yについて最
適化されCompaq 386/20eコンピュータによりコントロー
ルされたSystem 200 Imaging Scanner（Bioscan）内に
入れた。このシステム内で遊離の90Yは溶媒先端に移動
し、一方ING−1/TMT（90Y）は元の位置に残っている。
このシステムを使用して、全部の90Y放射能の98％よ
り多くが、常にING−1/TMTに付随していることが分かっ
た。
蛍光金属でのING−1/TMTの標識化 ユウロピウム（III）のようなランタニド類の、配位
球面（coordination sphere）に近接して保持された芳
香属単位を含むキレート化剤への結合は、光が芳香環を
通して吸収され、エネルギーが金属に転移する「増感さ
れた」蛍光になる。次いで金属は非常に大きいストーク
スシフト（Stokes shift）及び数秒以下の蛍光寿命によ
り特徴付けられる発光を作る。0.05M Tris HCl緩衝液p
H7.5中の2.5mL中のING−1/TMTの0.5mgのアリコートを、
小さな攪拌棒を入れた4mLコニカル反応バイアルにピペ
ットで入れた。0.05M Tris HCl緩衝液pH7.5中の250μ
Ｍ塩化ユウロピウム（塩化ユウロピウム６水和物:Aldri
ch）溶液を製造した。この塩化ユウロピウム溶液のアリ
コート（50μＬ）をING−1/TMTを入れた反応バイアルに
添加し、得られた溶液を、磁気攪拌機上で室温で非常に
ゆっくり攪拌した。標識化を１時間進め、次いで反応混
合物を、予備洗浄しpH6.0で10mMリン酸ナトリウム及び1
50mM塩化ナトリウムを含む緩衝液（PBS）中で平衡化さ
せたPD−10クロマトグラフィーカラムにかけた。試料を
3.5mLのPBSでカラムから溶出した。金属−ING−1/TMT錯
体の50μＬの蛍光を、340nmの励起波長を使用しPerkin
Elmer LS 50分光蛍光計（10nmスリット幅）で測定し
た。10nmスリット幅及び430nmカットオフフィルターを
使用して蛍光発光を618nmで記録した。ING−1/TMT複合
体の各官能性キレート化部位は１個のユウロピウムイオ
ンと結合する。この方法を使用して、１〜３個の蛍光ユ
ウロピウムイオンが抗体の１分子当たり結合した。
例４−TMTを含むPR1A3の複合体の製造 PR1A3はマウス抗体である（ICRF、英国により開発さ
れた）。この抗体を50mM酢酸ナトリウム緩衝液pH5.6中
の4.0mg/mLの濃度で使用し、150mMのNaClで補足した。
1.0mgの抗体溶液に、100mM塩化ナトリウムで補足したpH
9.0の50mMホウ酸ナトリウム緩衝液を添加し、最終全体
積を2.5mLにした。この溶液を、抗体溶液に添加したホ
ウ酸ナトリウム緩衝液で平衡化したPD−10クロマトグラ
フィーカラムにかけた。抗体を3.5mLの同じホウ酸ナト
リウム緩衝液でカラムから溶出した。溶出液を、Centri
con−30限外濾過装置を使用して濃縮して、溶液1mL当た
りPR1A3抗体5.0mgの濃度にした。TMTのNCS（製造６）の
溶液を、ホウ酸ナトリウム緩衝液中で2.0mg/mLの濃度で
製造し、TMT−NCS 104μＭの最終濃度になるまで抗体
溶液に添加した。この溶液をゆっくり混合し、暗室内で
環境温度（約22℃）で一夜（14〜16時間）インキュベー
ションした。PR1A3:TMT複合体を、150mM塩化ナトリウム
で補足したpH7.2の50mMリン酸ナトリウム緩衝液で平衡
化し溶出したSuperose 6 HPLCカラムを使用して遊離のT
MT−NCS及びその他の低分子量生成物から分離した。溶
出液をCentricon−30限外濾過装置を使用して濃縮し
て、溶液1mL当たりPR1A3:TMT 0.25mgの濃度にした。次
いでTMT免疫複合体を、腫瘍細胞抗原に結合するその能
力及びまたイットリウム−90同位元素を結合するその能
力について試験する。
PR1A3/TMT複合体についての分析試験 PR1A3/TMT複合体について行った分析試験は、ING−1/
TMT複合体の試験について前記概説したものと非常に似
たものであった。最大の注目すべき例外は、フローサイ
トメトリーを使用する免疫反応性を試験するためにSW12
22細胞を使用したことである。これらの細胞（ATCC）
は、アールの平衡塩溶液中の10％胎児ウシ血清及び非必
須アミノ酸で補足されたMEM培地で成長させた。免疫反
応性についてのELISA試験はPR1A3/TMT複合体について行
わなかった。
例５−TMTを含むNRLU−10の複合体の製造 NRLU−10はマウス抗体である（OkabeによりTFS−２と
して開発された）。この抗体を50mMリン酸ナトリウム緩
衝液pH7.2中の3.4mg/mLの濃度で使用し、150mMのNaClで
補足した。12mgの抗体溶液に、100mM塩化ナトリウムで
補足したpH9.0の50mMホウ酸ナトリウム緩衝液を添加し
た。この溶液の２個のアリコート（それぞれ2.5mL）
を、50mMホウ酸ナトリウム緩衝液pH9.0で平衡化した別
々のPD−10クロマトグラフィーカラムにかけた。抗体を
3.5mLの同じホウ酸ナトリウム緩衝液で各カラムから溶
出した。これらの溶出液を一緒にした。TMT−NCSの溶液
をホウ酸ナトリウム緩衝液中で10mg/mLの濃度で製造
し、19μＬを抗体製造物に添加した。この溶液をゆっく
り混合し、暗室内で環境温度（約22℃）で一夜（約12時
間）インキュベーションした。NRLU−10:TMT複合体を、
150mM塩化ナトリウムで補足したpH6.0の50mMリン酸ナト
リウム緩衝液で平衡化し溶出したSuperose 12 HPLCカラ
ムを使用して遊離のTMT−NCS及びその他の低分子量生成
物から分離した。次いでTMT免疫複合体を、腫瘍細胞抗
原に結合するその能力及びまたイットリウム−90同位元
素を結合するその能力について試験する。
NRLU−10/TMT複合体についての分析試験 NRLU−10/TMT複合体について行った分析試験は、ING
−1/TMT複合体の試験について前記概説したものと非常
に似たものであった。
例６−錯化剤に共有結合したオリゴヌクレオチドからな
る免疫反応試薬の製造 錯化剤TMTは、抗体以外の免疫反応性基、例えば、オ
リゴヌクレオチドに共有結合させることができる。この
免疫試薬は90Yで標識化することができ、このようにし
て製造された放射性免疫試薬はその補体、即ち相補的オ
リゴヌクレオチドと反応することができる。
パートA:オリゴヌクレオチド、cIの製造 ３′−アミン基を含む20−体（20−mer）、５′−TTA
GCTTCTCCGTCCATAA−C5アミン−Ｔ−３′、cIを、３′−
アミン基への前駆体及び２−デオキシヌクレオチドホス
ホルアミダイト（phosphoramidite）薬前駆体５′−ジ
メトキシトリチルシチジン−３′−Ｏ−ホスホルアミダ
イト、５′−ジメトキシトリチルアデノシン−３′−Ｏ
−ホスホルアミダイト、５′−ジメトキシトリチルグア
ノシン−３′−Ｏ−ホスホルアミダイト及び５′−ジメ
トキシトリチルチミジン−３′−Ｏ−ホスホルアミダイ
ト（Applied Biosystems）としてUniLink Amino Modifi
er（Clonetech）を使用し、装置メーカーにより支持さ
れているようにApplied Biosystem DNAシンセサイザー
で製造した。保護基を水酸化アンモニウムで脱保護した
後、アミン官能化オリゴヌクレオチドを、脱イオン水で
OPEC Cantridge（Polymer PRI）カラム（Clonetech）を
溶出して更に精製した。オリゴヌクレオチドの濃度は26
0nmでの吸収を使用してモニターした。
パートB:MTに複合化したオリゴヌクレオチド、cI−TMT
の製造 pH9.0の0.033mM炭酸塩／重炭酸塩緩衝液中のパートＡ
の2.5mMオリゴヌクレオチド溶液に、10mgの製造６のTMT
イソチオシアナートを添加する。反応混合物を渦巻き混
合し23℃で16時間保持する。生成物を脱イオン水で溶出
するセファデックス（Sephadex）Ｇ−25カラムクロマト
グラフィーにより精製する。
パートC:放射線核種で標識化したパートＢのオリゴヌク
レオチドTMT複合体の製造 20℃の0.01mM酢酸ナトリウム緩衝液中のパートＢのオ
リゴヌクレオチドTMT複合体の溶液を、pH6.0の0.01M酢
酸ナトリウム緩衝液中の90YC13の溶液で処理した。複合
体中への放射性同位元素標識の取込は薄層クロマトグラ
フィーを使用して示される。
パートD:パートＡのオリゴヌクレオチドcIに対して相補
的であるオリゴヌクレオチド、Ｉの製造 ３′−アミン基を含む20−体、５′−TCT TAT GGA CG
G AGA AGC−C5アミン−Ｔ−３を、３′−アミン基への
前駆体及び２−デオキシヌクレオチドホスホルアミダイ
ト試薬前駆体５′−ジメトキシトリチルシチジン−３′
−Ｏ−ホスホルアミダイト、５′−ジメトキシトリチル
アデノシン−３′−Ｏ−ホスホルアミダイト、５′−ジ
メトキシトリチルグアノシン−３′−Ｏ−ホスホルアミ
ダイト及び５′−ジメトキシトリチルチミジン−３′−
Ｏ−ホスホルアミダイト（Applied Biosystems）として
UniLink Amino Modifier（Clonetech）を使用し、パー
トＡに於けるようにApplied Biosystem DNAシンセサイ
ザーで製造した。保護基を水酸化アンモニウムで脱保護
した後、アミン官能化オリゴヌクレオチドを、脱イオン
水でOPECカートリッジ（Polymer PRI）カラム（Clonete
ch）を溶出して更に精製した。オリゴヌクレオチドの濃
度は260nmでの吸収を使用してモニターした。
パートE:TMTに対して複合化させ相補的オリゴヌクレオ
チド、Ｉに対して90Yで標識化したcIのハイブリッド形
成 pH7.4及び４℃の燐酸塩緩衝食塩水中のパートＤで製
造したオリゴヌクレオチドＩの溶液に、前記のような90
Y標識化TMC−cIの溶液を添加する。１時間後、反応混合
物の成分をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析
する。ハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドに相
当するゲルの位置で放射能レベルが観察される。
本発明をその或好ましい態様を特に参照して詳細に記
載したが、その変形及び修正が本発明の精神及び範囲内
で可能であることはいうまでもない。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ６１Ｋ 49/02 Ｃ 43/00 (72)発明者 マーレイ，ブルース ジェイ. アメリカ合衆国，ニューヨーク 14568, ウォルワース，セイジ テラス 1575 (72)発明者 ハウセイン，ティモシー ゼット. アメリカ合衆国，ニューヨーク 14850, イシカ，ウエスト，レキシントン ドラ イブ 110 (72)発明者 スノウ，ロバート エー. アメリカ合衆国，ペンシルバニア 19380，ウエストチェスター，クラティ ン レーン 118 (72)発明者 サハ，アシス ケー. アメリカ合衆国，ペンシルバニア 19355，フレイザー，＃508，ランカスタ ー アベニュ 333 (72)発明者 フィリオン，リチャード アメリカ合衆国，ニューヨーク 12018, アベリルパーク，ルーラルデリバリー ＃１ (72)発明者 シェアマン，クライド ダブリュ. アメリカ合衆国，ペンシルバニア 19382，ウエストチェスター，チェスタ ービル ウェイ 607 (72)発明者 シャー，チャンドラ アメリカ合衆国，ペンシルバニア 19355，マルバーン，ランカスター ア ベニュ 333，＃500，ウエストゲート ビレッジ (56)参考文献 特表 平６−501703（ＪＰ，Ａ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式： （式中、各R2は基−CH2N（CH2COOH）２又はカルボキシ
    アルキルチオアルキル基であるか又は両方のR2基が一緒
    になって式： を表し、そしてＲは、任意的に免疫反応性有機化合物に
    共有結合していてもよい、タンパク質反応性基を表す
    が、各R2が基−CH2N（CH2COOH）２を表す場合にはＲは
    ３位置にアミノ、イソチオシアナト又は−NHC（＝Ｓ）
    Ｎ（NH2）CH3が置換した４−メトキシフェニル基であ
    る） 又はその塩の錯化剤と、金属放射性核種イオンとの錯
    体。
  2. 【請求項２】基Ｒが、任意的に免疫反応性有機物質に共
    有結合していてもよい、アミノ、アルキルアミノ、アリ
    ールアミノ、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、アリー
    ルヒドラジノ、カルバジド、セミカルバジド、チオカル
    バジド、チオセミカルバジド、スルフヒドリル、スルフ
    ヒドリルアルキル、スルフヒドリルアリール、ヒドロキ
    シ、カルボキシ、カルボキシアルキル、カルボキシアリ
    ール、活性ハロゲン含有基、２−放出基置換エチルカル
    ボニル、ビニルスルホニル、ビニルカルボニル、エポキ
    シ、イソシアナト、イソチオシアナト、アルデヒド、ア
    ジリジン、スクシンイミドオキシカルボニル、活性化ア
    シル基及び混合無水物からなる群から選択される、請求
    の範囲第１項記載の錯体。
  3. 【請求項３】基Ｒが酵素、アミノ酸、ポリペプチド、タ
    ンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ホルモン、
    薬剤、ステロイド、ビタミン、多糖類、ウイルス、原生
    動物、真菌、寄生生物、リケッチア属、カビ、血液成
    分、組織及び器官成分、医薬、ハプテン、レクチン、ト
    キシン、核酸、抗体、抗原物質、アビジン及びビオチン
    からなる群から選択される、請求の範囲第１項又は第２
    項に記載の錯体。
  4. 【請求項４】基Ｒが抗体である請求の範囲第３項記載の
    錯体。
  5. 【請求項５】基ＲがB72.3,9.2.27,D612,UJ13A,NRLU−1
    0,7E11C5,CC49,TNT,PR1A3,ING−1,B174及びB43抗体から
    なる群から選択される抗体である、請求の範囲第４項に
    記載の錯体。
  6. 【請求項６】基Ｒが抗体ING−１である請求の範囲第５
    項記載の錯体。
  7. 【請求項７】該金属放射性核種イオンが90Y3+である請
    求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の錯体。
  8. 【請求項８】Ｒが、任意的に免疫反応性有機化合物に共
    有結合していてもよい、３−又は４−位置に反応性置換
    基が置換したフェニル基である請求の範囲第１〜７項の
    いずれか１項に記載の錯体。
  9. 【請求項９】前記置換基が酸素−、窒素−結合フェニル
    基である請求の範囲第８項に記載の錯体。
  10. 【請求項１０】請求の範囲第１〜９項のいずれか１項に
    記載の免疫反応性基含有錯体と医薬的に支障のない担体
    とを含んでなる診断用組成物。
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