PT99460B - Processo para a preparacao de agentes complexantes e de imunoreagentes radioactivos discriminantes uteis para composicoes formadoras de imagem para diagnostico e em terapeutica - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

Âmbito da Invenção

A presente invenção refere-se a novos imuno-reagentes e, mais particularmente, a imuno-reagentes radioactivos discriminantes que têm particular utili dade em composições e métodos terapêuticos e para a formação de imagens para diagnóstico. A presente invenção refere-se ainda a novos agentes complexantes.

Antecedentes da invenção

Até 1980 a discriminação de sítios que suportavam tumores por radio-imunoglobulina foi demonstrada por vários laboratórios e diferentes instituições (S.E. Order et al., Use of Isotopic Immunoglobulin in Therapy, Câncer Research 40, 3001-7 (Agosto de 1980)).

Em 1980 demonstrou-se que os turno1

res concentravam os anticorpos marcados com rádio de antígenos aasociados ao tumor e que os reagentes marcados com rádio utilizados permitiam a formação de imagens de diagnóstico de tumores, por exemplo, por formação de imagens de camara gama (radio-imuno-cintigrafia) e tomografia de positrão, e tratamento terapêutico, isto é, redução do tamanho do tumor por um imunoreagente radioactivo discriminante

Anteriormente a discriminação com imuno-reagentes marcados com rádio efectuava-se com iodo radioactivo. Contudo, como verificado por Scheinberg e al

Tumor Imaging with Radioactive Metal Chelates Conjugated to

Monoclonal Antibodies, Science 215 n² 19, 1511-13, (Março de

1982), os isotopos de iodo levantam vários problemas, particularmente, com respeito ao varrimento das imagens de tumor. Das formas isotópicas comummente disponíveis, apenas o 123

I possui as caracteristicas de emissão apropriadas para a formação de imagem e uma semi-vida suficientemente curta para ser utilizado com segurança em diagnóstico. A radiação gama de ¹²⁵I θ demasiado fraca para a formação de imagens. 0 _tem sido muitas vezes utilizado mas é indesejável devido à sua longa semi-vida e elevada energia gama e citotoxicidade das radiações beta.O ¹³¹j tem também sido utilizado terapeuticamente para pequenos tumores mas parece ineficaz no tratamento de grandes tumores. Além disso, o metabolismo rápido de anti-corpos marcados com iodo radioactivo permite a incorporação do iodo na tiróide e a excreção activa do iodo pelo estomago e vias urinárias. Esta dispersão do iodo radioactivo impede a formação de imagens de tumores específicos uma vez que os tumores são ocultados pela radiação de fundo.

Em adição à discriminação de tumores com anti-corpos radioactivos para a formação de imagens de diagnóstico e tratamento terapêutico tem-se efectuado discriminação semelhante para a formação de imagens de diagnóstico de enfartes, especificamente, enfartes de miocárdio utilizando anti-corpos para a miosina cardíaca canina (Khaw et

al., Myocardial Infarct Imaging of Antibodies to canine Cardiac Myosinyincfium-lll - Diethymenetriamina Pentaacetic Acid',' Science 209, 295—7 (Julho de 1980) e para a formação de imagens de aterosclerose por discriminação de placas ateroscleroticas. Existe a mesma desvantagem na utilização de iodo radioactivo para a formação de diagnóstico do enfarte que para a formação de imagens de tumores e para tratamento terapêutico.

É conhecido que o H^-In pode ser complexado com ácidos poliaminocarboxílicos tais como ácido etileno-diamino-tetra-acético (EDTA) e ácido di-etileno-tri-amino-penta-acético (DPTA). Contudo, a ligação covalente de proteínas (anticorpos) a estes agentes complexantes efectuada por acilaçâo com carbonilos activados, acoplamento de diazonio aromáticos ou bromoacetilação é ineficaz, apesar dos derivados de isocianatobenzilo descritos por Brechbiel et al Synthesis of l-(p-isotiocianatobenzilo) Derivatives of DTPA and EDTA. Antibody Labeling and Tumor Imaging Studies, Inorg. Chen. 25, 2772-81 (1986) terem sido criados para facilitar a ligação covalente de proteínas com agentes complexante.

Recentemente têm-se desenvolvido esforços de investigação para anticorpos (Ac) aperfeiçoados, por exemplo, anticorpos específicos monoclonais para determinação especifica, anticorpos que se complexam ou se ligam directamente com radionuclidos, radionuclidos preferidos e suas combinações com anticorpos e agentes complexantes.

Algumas tentativas tem sido feitas no sentido de aperfeiçoar os agentes complexantes.

Contudo, a EDTA e especialmente a DTPA e seus derivados tem permanecido como os agentes complexantes prevalescentes para ligar covalentemente anticorpos e complexar por coordenação radionuclidos metálicos. Contudo, a inadequação de DTPA tem sido notada, por exemplo, por Parker et al., Implementation of Macrocycle Conjugated Abtibodies for Tumor Targeting, Pure and Appl. Chem., 61, n² 9,

1637-41 (1989) Convencionalmente o radionuclido metálico tem sido complexado por um quelato aciclico, por exemplo, (EDTA ou DTPA) que é covalentemente ligado ao anticorpo. Nenhum dos quelatos é adequado uma vez que o metal tende dissociar-se in vivo... e por Cox et al, Synthesis of a Kinetically Stable Yttrium-90 Labelled Macrocycle-Antibody Conjugate,

J. Chem. Soc., Commum. 797-8 (1989)... ltrio-90 é um isótopo atractivo para terapia . . . mas a sua utilização clínica é muito limitada devido à sua toxicidade para a medula óssea resultante da libertação promovida por ácido de 9θγ _ao quelato ligado ao anticorpo tal como ácido di-etileno-tri-amina-penta-acético (DTPA).

As tentativas para desenvolver complexantes melhorados têm proporcionado materiais que têm os seus inconvenientes. Por exemplo, Craig et al., Towards Tumor

Imaging with Iridium-111 Labeled Macrocycle-Antibody

Conjugates, J. Chem. Soc. Chem. Commum., 794-6 (1989) descreve ligandos hexacoordenados macrocíclicos mas estabelece que 0 aspecto limitante desta tentativa é que a marcação por 111

In do macrociclo é necessária antes da conjugação de anticorpo. A ligação do índio por (4) é insuficientemente rápida a 37° C para uma marcação por rádio eficiente... foram estudados outros ligantes triazamacrocíclicos tribásicos para a sua capacidade para ligar o índio rápidamente sob condições suaves (20° C, pH 5, <lh) e formarem ainda um complexo cinéticamentes estável in vivo... Contudo, apenas (6) provou ser eficaz quando a concentração do ligando era de 10 uM e sob estas condições determinou-se um rendimento de marcação por rádio de 96% (30 min, pH 5, 20°C).

No entanto, 30 minutos é ainda insa tisfatório. É muito desejável possuir agentes complexantes superiores a EDTA e DTPA que se liguem por coordenação a radionuclidos preferidos tais como In, Y, Sc, Ga, Ge, etc. em alguns minutos, isto é, menos do que 5 minutos aproximadamente imediatamente depois da administração do reagente ao paciente,

especialmente quando o radionuclido é de vida curta tem que ser necessáriamente gerado de um radionuclido de vida mais longa na altura do tratamento do paciente.

É de notar que os complexos de ítrio, um radionuclido preferido, tendem a ser menos estáveis do que os de Índio (Mather et al., Labelling Monoclonal Antibodies with Yttrium 90, Eur. J. Nucl. Med. 15, 307-312 (1989)) relativamente aos complexos convencionais. Mather et al., perceitua que estudos de biodistribuição em doentes de cancro utilizando anticorpos marcados com rádio sugeriram que a estabilidade in vivo de anticorpos marcados com ítrio não é tão grande como com os seus contrários marcados com _e que estas descobertas são suportadas por outras publicações recentes neste âmbito.

Quando os agentes quelantes são covalentemente ligados a proteínas (Ac), as proteínas normalmente são susceptíveis de aceitarem mais do que uma molécula de agente quelante uma vez que contêm um hospedeiro de amina e grupos sulfidrilo através dos quais os agentes quelantes são ligados. É muitas vezes muito importante determinar quanto sítios quelantes se ligam a cada molécula de proteína. 0 método mais conveniente para efectuar isto é por meios espectrofotométricos. Contudo, os agentes quelantes da técnica anterior e os seus quelatos possuem espectros que se sobrepõem com os de proteínas úteis, e uma determinação analítica do número de sitios quelantes ou quelatos por molécula de proteina não se pode fazer por espectroscopia uma vez que a sobreposição de espectros os mascaram entre si. É, assim, muito desejável obter agentes quelantes para a conjugação a proteínas cujo espectro e cujo espectro de quelato metálico, não se sobreponham com o das proteínas às quais os agentes quelantes estão quimicamente ligados.

Um outro problema com algumas composições da técnica anterior é que o quelante tem que ser acti’ vado por um agente redutor antes da formação do:quelato radio5

nuclido. Se os conjugados de proteína são para se formarem antes da formação do quelato de radionuclido então o agente redutor utilizado para activaçáo do agente complexante pode degradar a proteína. Por exemplo, os agentes quelantes preferidos normalmente utilizados para a complexação de tecnécio (Tc) e rénio (Re) complexam em metais por intermédio de grupos contendo enxofre que tem que ser reduzidos com um agente redutor (Ditiotreitol) para activar o quelante antes da formação do quelato radionuclido. Se o conjugado proteico contendo ligações dissulfureto se forma antes da redução então o agente redutor pode degradar a proteína. É desejável possuir agentes quelantes susceptíveis de formarem conjugados com proteínas antes da complexação com radionuclidos e, particularrnente, agentes quelantes para Tc e Re que não necessitem de um passo de activaçáo envolvendo um agente redutor antes da complexação. Em resumo, os vários anticorpos marcados com rádio normalmente disponíveis e agentes utilizados para fazer conjugados imuno-reactivos por ligação covalente de um agente à proteina imuno-reactiva e seus complexos radionuclidos para utilização na formação de imagens de diagnóstico e terapêutica discriminatória têm determinadas desvantagens tais como:

1) toxicidade; 2) dispersão do reagente devido ao matebolismo rápido; 3) características de emissão inadequadas; 4) ligação covalente ineficaz com proteínas para a preparação de conjugados; 5) complexação lenta com metais; 6) complexação de metais instável, por exemplo, relativamente à temperatura, tempo ou pH; 7) incapacidade para formar conjugados e armazená-los até ser desejável a complexação metálica; 8) incapacidade para a análise espectrofométrica dos reagentes complexos de radionuclido; e 9) incapacidade para complexar sem passos de activação que degrada a proteína.

Sumário da invenção

Descobriu-se agora, imuno-reagentes discriminantes que resolvem os problemas da técnica anterior

discutidos anteriormente. Os imuno-regantes readioctivos discriminantes desta invenção incluem um ião radionuclidico de um metal, um agente complexante que é um derivado de uma piridina, bipiridina, terpiridina, quaterpiridina, quiquepiridina, sexipiridina ou fenantrolina e um grupo imuno-reactivo covalente ligado através de um grupo reactivo proteico ao agente complexante.

Mais -particularmente, de acordo com esta invenção proporciona-se:

Um imuno-reagente radioctivo discriminante incluindo um ião radionuclidico metálico, um agente complexante e um grupo imuno-reactivo covalentemente ligado ao agente complexante, possuindo o agente complexante a estrutura

em que o radical R representa hidrogénio, alquilo, alcoxi, alquil-tio, alquil-amino, alquil-formamido, arilo, ariloxi, heterocíclico ou um grupo reactivo proteico; o radical R¹ representa hidrogénio, alquilo, alcoxi, alquil-tio, alquil-amino, alquil-formamido, arilo, ariloxi, heterocíclico ou um grupo reactivo proteico; o radical R² representa hidroxi, carboxi, hidroxi-alquilo, ácido carbonil-imino-di-acético, ácido metileno-imino-di-acético, ácido metileno-di-etileno-imino-di-acético ácido-hidrazinilideno-acético, 2,6-dicarboxi-piperidino ou um

sal de tais ácidos, ou 2 grupos R², _em conjunto, representam os átomos necessários para completar uma estrutura de anel macroci clico contendo pelo menos um sítio de coordenação de heteroátomo e pelo menos, um, de preferência, dois grupos alquileno formando parte da estrutura de anel; o radical R³ representa hidrogénio, alquilo, alcoxi, alquil-tio, alquil-amino, alquil-formamido, arilo, ariloxi, heterocíclico ou um grupo reactivo proteico; o radical R^ representa hidrogénio ou um grupo reactivo proteico; n representa um número inteiro entre 0 e 4; o representa um número inteiro entre 0 e 1; m representa um número entreO e 1; desde que, pelo menos, um de n e m seja 0 e pelo menos um dos radicais R, Rl, R³, r4 sejam um grupo reactivo proteico.

As piridinas possuem a estrutura

A-II R3

Á z^El à I r2 em que Rl, R² e R³ possuem as significações dadas anteriormente

As bipiridinas, terpiridinas, quaterpiridinas, quinquepiridinas e sexipiridinas possuem a estrura,

em que R, R¹, R² e R³ possuem as significações dadas anterior mente e n representa 0, 1, 2, 3 ou 4.

As fenantrolinas possuem a estru8 tura IV

I I

R2 R² em que R², R² e R⁴ possuem as significações dadas anteriormente

Esta invenção proporciona novas fenantrolinas possuindo de preferência a estrutura A-III em que n representa 1, R representa

R5 representa alcoxi ou alquilo, e o radical Κθ representa um grupo reactivo proteico.

Esta invenção proporciona ainda novas fenantrolinas possuindo, de preferência, a estrutura A-IV anterior em que pelo menos um dos radicais R⁴ representa um grupo reactivo proteico.

Esta invenção proporciona também composições terapêuticas e de diagnóstico incluindo os imunoreagentes radioactivos discriminantes anteriormente descritos.

Esta invenção proporciona ainda um método para a formação de imagens de diagnóstico num sitio num paciente que consiste em a) administrar ao paciente uma quar. tidade eficaz do imuno-reagente radioactivo anteriormente descrito susceptível de discriminar o sitio e b) activação imagem a imagem de um elemento ou dispositivo sensível à radiação, tal como, por exemplo, uma película ou um sensor electrónico com a radiação emitida do sítio discriminado.

Um método para o tratamento de • sítios de doença num paciente de acordo com esta invenção consis, te na administração ao paciente ou a uma parte do paciente de uma quantidade eficaz de uma composição terapêutica incluindo o imuno-reagente radioactivo anteriormente descrito susceptível de discriminar o sitio e um seu veículo farmaceuticamente aceitável.

É um aspecto vantajoso desta invenção que os imuno-reagentes radioactivos discriminantes descritos apresentem toxicidade inferior, por exemplo, quando comparada com outros quelantes de ítrio radioactivo.

É um aspecto vantajoso que os imuno -reagentes discriminantes desta invenção nao são rápidamente metabolizados e não se dispersam de forma prejudicial.

É ainda um outro aspecto vantajoso que os complexos descritos formam eficazmente ligações covalentes com proteínas e outras moléculas biológicas.

É ainda um outro aspecto desta invenção que os imuno-reagentes descritos apresentam boas carac terísticas de emissão e são fácilmente submetidos a análises es pectrofotométricas.

Adicionalmente, os conjugados de proteínas dos agentes complexantes podem formar-se e armazenarem-se até se desejar a complexação do metal e a complexação pode efectuar-se sem os passos de activação que degradam a proteina.

Além disso, os agentes complexantes complexam-se rápidamente como metais e os quelatos resultantes apresentam estabilidade excelente relativamente ao tempo, tempe ratura e pH.

Outros aspectos vantajosos desta in venção tornam-se fácilmente evidentes depois da referência á

10ί:

descrição seguinte das formas de realização preferidas, quando lidas à luz dos desenhos que a acompanham.

Sumário resumido dos desenhos

A figura 1 representa ensaios de imunocompetência de B72.3-THT-Sc⁺⁺⁺} um imuno-reagente radioactivo desta invenção, um conjunto Β72.3-ΊΉΤ e um B72.3 não modificado.

A figura 2 representa ensaios de imunocompetência de um conjunto B72.3-THT, duas preparações de conjugados B72.3-TMT e B72-3 não modificado.

A figura 3 representa resultados de um estudo de biodistribuição de B72.3-TMR^^^-In, um imuno-reagente radioactivo desta invenção e B72.3-DPTA-Hljn.

A figura 4 representa o resultado de um estudo de biodistribuição de B72.3-ΤΜΤ-^θγ, um imuno -reagente radioactivo desta invenção e B72.3-ϋΡΤΑ-^θγ,

A figura 5 é a curva de sobrevivência isto é, o número de ratos sobreviventes por dia depois do primeiro dia de inoculação para um regime de baixa dose e para um regime de dose elevada.

As figuras 6 e 7 são espectros de TMT, TMT-Y⁺⁺⁺ e TMT-Pb⁺⁺.

Descrição das formas de realização preferidas

A descrição que se segue refere -se principalmente à utilização de imuno-reagentes radioactivos discriminantes em composições e métodos terapêuticos e de formação de imagem de diagnóstico. Em adição, os

imuno-reagentes radioactivos discriminantes são uteis como reagentes de diagnóstico, por exemplo, reagentes de radio-imuno-electroforese.

Os imuno-reagentes desta invenção incluem um ião radionuclídico de um metal, um agente complexante e um grupo imuno-reactivo covalentemente ligado ao agente complexante através de um grupo reactivo proteico.

agente complexante é um derivado de uma piridina, bipiridina, terpiridina, quaterpiridina, quiquepiridina, sexipiridina ou fenantrolina, possuindo de preferencia a fórmula estrutural A-I apresentada no sumário anterior.

Cada radical R na fórmula A-I representa, independentemente, hidrogénio; alquilo linear ou ramificado contendo de preferância, entre 1 e 20 átomos de carbono tais como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, s-butilo, t-butilo, 2-etil-hexilo, decilo, hexadecilo, octadecilo, etc.; alcoxi, possuindo o radical alquilo entre 1 e 20 átomos de carbono como descrito para o R anterior; alquil-tio, contendo o radical alquilo entre 1 e 20 átomos de carbono como descrito para o radical R anterior; alquilamino, possuindo o radical entre 1 e 20 átomos de carbono como descrito para o radical R anterior; alquil-formamido, contendo o radical alquilo entre 1 e 20 átomos de carbono como descrito para o radical R anterior; arilo substituido ou não substituido, contendo, de preferência, entre 6 e 20 átomos de carbono tais como fenilo, naftilo, fenantrilo, nitrofenilo, hidroxifenilo, aminofenilo, hexadecilaminofenilo, octadecilaminofenilo, tolilo xililo, metoxifenilo, 3-amino-4-metoxifenilo, 4-metoxi-3-(N-metil-hidrazino-formamido)fenilo, 3-isocianato-4-metoxi-fenilo

3-isocianato-4-metoxifenilo, metiltiofenilo, carboxifenilo e alquil-arilo, tal como, alquilfenilo, contendo o radical alquilo entre 1 e 20 átomos de carbono como descrito para o radical R anterior; ariloxi, contendo o radical arilo entre 6

e 20 átomos de carbono como descrito para o radical R anterior, um heterociclico substituido ou não substituido contendo de preferência entre 5 e 6 átomos de carbono nucleares e heteroátomos tais como N, S, P ou 0, tais como piridilo, metilpiridilo, nitropiridilo, metoxipiridilo, oxazolilo, imidazolilo, pirazolilo e quinolilo; ou um grupo reactivo proteico. Nas formas de realização especialmente preferidas o radical R representa um grupo 4-alcoxi-3-amino-fenilo ou 4-alcoxi-3-isocianato-fenilo.

Cada um dos radicais R¹ é independentemente, seleccionado dos 1 grupos especificados para o radical R. 0 radical R-¹- representa, de preferência, hidrogénio ou um grupo reactivo proteico.

Cada radical R é, independentemente, seleccionado de hidroxi; carboxi; hidroxi-alquilo em que o radical alquilo contém de preferência entre 1 e 4 átomos de carbono tais como hidroximetilo; ácido carbonil-imino-di-acético |-CON(CH₂COOH₂)|;

ácido metileno-imino-di-acético |-CH₂N(CH₂C00H)₂|;

ácido metileno-tio-etileno-imino-di-acético |-CE^SCE^CE^NÍ CH₂C00H)₂J.

ácido hidrazinilideno-di-acético, tal como ácido l-hidrazinil-2-ilideno-di-acético |-NHN(CH₂C00H)₂| e ácido 1-metil-l-hidrazinil-2-ilideno-di-acético |-N(CH3)N(CH2C00H)2|; _e 2,6-dicarboxi-piperidino ou os sais desses ácidos, incluindo, por exemplo, sais de metais desses ácidos formados a partir de metais tais como Na, K, Li, etc., e sais de amónio tais como sais de amónio, tetra-etil-amónio e tetra-metil-amónio. Alternativamente os dois grupos R^z em conjunto representam os átomos necessários paracompletar uma estrutura de anel macrocíclico contendo a) pelo menos um sitio de coordenação de um heteroátomo para iões e b) pelo menos um, de preferência, dois grupos alquileno que formam parte da estrutura de anel. Os grupos formadores do anel macrocíclico podem ser um alquileno substituido com um grupo heteroátomo tais como 2,2-bis(etoxicarbonil)-l,3-propileno; ou grupos contendo heteroátomos tais como oxibis(alquileno) tais

como oxibis(etileno), oxibis(etileno-oximetileno), oxibis (etileno-oxi-etileno); alquileno-oxi-alquileno-oxi-alquileno, tais como metileno-oxi-etileno-oxi-metileno; arileno-di-(oxi-alquileno), tais como 1,4-dimetil-5,6-fenileno-bis (oximetileno 2,6-piridileno-bis (metileno-oxi-metileno); 2-metoxi-5-metil-l,3 -fenileno-bis (metileno-oxi-metileno) e 1,10-fenantrolin-2,9-ile -no-bis-(metileno-oxi-metileno); carboximetil-il-imino-bis(trimetileno-carboxi-metil)-imino-metileno) | -CH2N(CH2COOH) (CH₂) ₃N(CH₂COOH)-(CH₂)₃N(CH₂COOH)CH2-1 ; carboxi-metil-tio-etil-imino-bis(trimetileno-carboxi-metil-tio-etil-imino-metileno) |-ch₂n(ch₂ch₂sch₂cooh)₂-(ch₂)₃n(ch₂-ch₂sch₂cooh)₂-(ch₂)₃n(ch₂ch₂

SCH₂COOH)CH₂ ^_1; carboximetil-imino-bis(etileno-carboxi-metil-imino-metileno) |-CH2N(CH2COOH)CH2-CH2N(CH2COOH)CH2CH2N(CH2COOH CH2~ | carboxi-metil-tio-etil-imino-bis-(etileno-carboxi-metil-tio-imino-etileno) | -C^NtC^^S^COOHjCI^CI^NÍCI^C^SC^COOH CH^-CH^NÍCH^CH^SCH^COOHj-CH^^-| etileno-bis (carboxi-metil-imino -metileno |C^NÍC^COOH^CI^C^NÍC^COOÍÚC^-b carboxi-metil-imino-bis(metileno) |-CH^NÍCH^COOHjCH^^-|j carboxi-metil-tio-etil-imino-bis(metileno) |-CH2N(CH2SCH2COOH)CH2^-(; etileno-bis(carboxi-metil-tio-etil-imino-metileno) |-CH2N(CH2CH2SCH2COOH) (CH2)2N(CH2CH2SCH2-^COOH)^CH2Iί etileno-bis (carboxi-metil-metil-hidrazinil-ilideno) |-N(CH3)N(CH2C00H)-(CH2)2N(CH₂C02H)(CH3)N-| ou os sais dos grupos contendo ácidos carboxílicos exemplificados incluindo, por exemplo, os sais de metal e de amónio desses átomos como descrito para o radical R² anterior. Nas formas de realizaçao especialmente preferidas o radical R^ representa ácido metileno-imino-di-acético ou um seu sal.

Cada radical R² é independentemente, seleccionado dos grupos especificados para o radical R. 0 radical R³ representa, de preferência hidrogénio.

Cada radical R^ θ independentemente, seleccionado de hidrogénio ou de um grupo reactivo proteico.

Na fórmula A-I anterior, n represen ta 0, 1, 2, 3 ou 4; m representa 0 ou 1; e 0 representa 0 ou 1

desde que pelo menos um de n e m seja 0.

3

Pelo menos um dos grupos R, R, r _e R^ presente é um grupo reactivo proteico. De preferência, não mais do que um dos radicais R, R^_> r³ e R^ em cada anel aromático representa um grupo reactivo proteico. Mais preferivelmente, apenas um dos grupos R, R¹, R³ _e r4 _{por mo}lécula representa um grupo reactivo proteico.

Por grupo reactivo proteico pretende-se significar qualquer grupo que possa reagir com quaisquer grupos funcionais normalmente encontrados nas proteínas. Contudo, é especificamente contemplado que o grupo reactivo proteico pode ser conjugado com biomoléculas não proteicas. Assim os grupos reactivos proteicos úteis na prática desta invenção incluem os grupos que podem reagir com qualquer molécula biológica contendo um grupo imuno-reactivo, seja a molécula biológica ou não uma proteína, para formar um grupo de ligação entre o agente complexante e o grupo imuno-reactivo.

Os grupos reactivos proteicos preferidos podem ser seleccionados a partir de, mas não são limitados a: (1) um grupo que reaja directamente com a amina ou grupos sulfidrilo na proteina ou molécula biológica contendo um grupo imuno-reactivo, por exemplo, grupo contendo halogéneo activo, por exemplo, grupos clorometilfenilo e grupos cloro-acetilo |Cl-CH^CO-|; grupos etil-sulfonilo e etil-carbonilo substituídos com grupos removíveis em 2 activados tais como 2-cloro-etil-sulfonilo e 2-cloro-etil-carbonilo; vinil-sulfonilo, vinil-carbonilo; epoxi; isocianato; isotiocianato; aldeído; aziridina; succinimidoxicarbonilo; grupos acilo activados tais como halogenetos de ácidos carboxílicos; anidridos mistos e análogos; e outros grupos conhecidos como sendo úteis em agentes fotográficos de endurecimento de gelatina convencionais.

(2) um grupo que possa reagir facil15

mente com proteínas ou moléculas biológicas modificadas contendo o grupo imuno-reactivo, isto é, proteínas ou moléculas biológicas contendo o grupo reactivo modificadas para conterem grupos reactivos tais como referidos em (1) anterior, por exemplo, por oxidação da proteína a um aldeído ou a um ácido carboxílico, caso em que o grupo reactivo proteico pode ser seleccionado dos grupos amino, alquil-amino, aril-amino, hidrazino, alquil-hidrazino, aril-hidrazino, carbazido, semicarbazido, tio-carbazido, tio-semicarbazido, sulfidrilo, sulfidril-arilo, hidroxi, carboxi, carboxi-alquilo e carboxi-arilo.

Os radicais alquilo dos grupos reactivos proteicos podem conter entre 1 e 20 átomos de carbono como descrito para o radical R anterior. Os radicais arilo dos grupos reactivos proteicos podem conter entre 6 e 20 átomos de carbono como descrito para o radical R anterior.

(3) Um grupo que se possa ligar à proteina ou á molécula biológica contendo o grupo imuno-reactivo ou á proteina ou molécula biológica modificada como referido em (1) e (2) anteriores por utilização de um agente de reticulação. Determinados agentes de reticulação úteis, tais como, por exemplo, endurecedores de gelatina difuncionais, bisepóxidos e bis-isocianatos tornam-se numa parte de um grupo de ligação no conjugado proteinas-agente complexante durante a reacção de reticulação. Outros agentes de reticulação úteis, contudo, facilitam a reticulação, por exemplo, como catalisadores

consumíveis	e nãc	> estão	presentes no conjunto	final.	Os
exemplos de	tais	agentes	de reticulação são	agentes	de
reticulação	carbo-	di-imida	e carbamoílonio como	descrito	na

Patente Norte Americana 4421847, cuja descrição é aqui incorporada como referência completamente e os éteres de dicatião da Patente Norte Americana 4877724 cuja descrição é aqui incorporada como referência na sua totalidade. Com estes agentes de reticulação, tem de possuir um grupo carboxilo e o outro um grupo amina ou sulfidrilo. 0 agente de reticulação reage primeiro selectivamente com o grupo carboxilo e depois, separa-se durante a reacção do grupo carboxilo activado com uma amina para formar uma ligação amida entre a proteína e os agentes complexantes de metais possuindo a estrutura A-I anterior, ligando-se estes covalentemente aos dois radicais. Uma vantagem deste aspecto é que a reticulação de moléculas semelhantes, por exemplo, proteínas com proteínas ou agentes complexantes com agentes complexantes é evitada mesmo que a reacção do agente de reticulação difuncional seja não selectiva e se obtenham molécula reticuladas não pretendidas. Os grupos reactivos proteicos especialmente preferidos incluem amino e isotiocianato.

Os agentes complexantes especialmente preferidos incluem as espécies 1 a 58 apresentadas adiante.

R3 . -och₃ ___x — X

NH2* ** * 0 hidrogénio em todos os grupos carboxi (-COOH) pode ser substituído por um metal ou catião amónio.

** Todos os grupos NH2 podem ser substituídos por NCS ou NHCSN (CH3)NH2

os 2 Iv s em conjunto —

CH~COOH ι x < >-0% <t=« \e.

4. H

-CH₂-N-<CH₂

-CH₂-K”<CE₂)₃ os 2 R²S

-CH_oC00E ce₂cooh em conjunto—

CE-COQH r Z

-CK₂-N-(CE₂

-C^-N-CCH^ ch₂cooh

HCE₂C0QH < >^₃ \CS _)S 2 R^S em conjunto ~ ' :ch-cook

Ί ^^e2^H_<^CH2^<-C£₂C00H ch₂cooh ? X_OCE ' \ X’^^CE3 “Z· ^KHCNrííH :If

S

Gj KJ

ΪΓ

Ros 2 R“s em conjunto = ^„_Q£g

CELCELSCBLCOOH ’ ^X’=V ³

J ^{2 2 2} ......>nh₉ -CH₉-N-<CH₉K ^{Z Z z} ^N-CH.CH^SCHaCOOH

-CH₂-N-(CH₂)3 ^{z z z} ch₂c2₂sch₂cooh

6, · Η os 2Ks -em conjunto· —

CH₂CE₂SCH₂C00H

-<* '>-och₃

-CB₂-N-(CH₂

-CE₂-N-<CH₂)₂ :-ch₂ch₂sch₂cooh

CB₂CH₂SCH₂CÚOE

7. π · os 2 R S em conjunto

C^CE^SC^COOE

CZz*°^{CS3 A}' ^<CH2^_ch₂ck₂sch₂cooh

S CHr

-CH^N-OT^ ch₂ch₂$ch₂cooh

Β—2

8.

--OCfío bs₂

XE₂~N(CK₂C00H>₂

9.

—och_q / -⁵ %cs'

Z*~*b-OCE* bsC-ME?

CE_o-N<CBL,C00E)2 2 *S CEg

12.

.« ' -OCHo ν Ζ ³ ZíCS

—QCSo \hc-n-ns s ch₃

W

O o

c?

d tu o

<Z) d

•tí

V

em conjunto d

d co' o

d W? \W Q

V d

d

w.

o (Λ' d

W

O .

o o

o

M <n

W

O o

d //\/

to o

4-1 c

•Γ—3 c

o o

ε ω

ro d

&

d co o

//\r sí>

<r f

18.

-<’->-och₃ ♦az·

-€H₂SCE₂CH₂N(CE₂C00E>₂

19, ''ncs

-CE₂SCH₂CS₂N<CE₂COOH)₂ \hc-n-nh.

S CH,

B—3

R³ . I 5 . B³ \ z\j/ \ S \ Λ

U KJ

P?

p^J

R~

20. — \=Z—^0C?²'

-H<CE.)N<CH«C00E)_o H

J X x.

\h, < >-oce₃

Η -CH₂N(CB₂C00H)₂ h \h.

22.

-OCE₃ E -N<CE₃)N<CH₂C00H)₂ h \qcs

- 23 R

23.

CCH

«J CH₃

24.

<’ >-och₃

25. —

NlHCN^'

II CS,

26.

( /—°^ch3 «;=* '''NH.

27.

. \cs

R

1.

R^x

R‘

H ' -NCCSptfCCH^OQH^ ^E

-ce₂n<ch₂cooh)₂ s -ch₂n<ch₂cooh>₂ E os 2 Ics ^em conjunto — E ch₂cooh

-CH^-N-CH^CH -CE^-N-CE^>í-CH₂C00H ch₂cooh os 2 R S em conjunto

CH₀COOE

I ² ·—CB^-N—QE^CH.

-CH₂“N-CE₂-<H₂

-ch₂coob •ch₉cooe <ír

rr

28, — *€ *>“0^

NHC-N-NH-,

II I ² s (¾

29.

z--^0CH3 ^'nh,

30.

z*“~°^cfl3

CS

51. — <* >-OCH₃ \hc-me.

1' os 2 R ΰ em conjunto “ = E

CBLCOOE

I ² da₂ ’JX-CH^COOE CH₂-N-CH₂--€H₂ ch₂cooh

E os 2 Ryg em conjunto ;= E

CE^^SCH^OOH

-ce₂-n-ce₂-ch.

-ch₂-k-ch₂

J^>-ch₂ch₂sch₂cooe ch₂ch₂sch₂cooe

Ξ os 2 R S em cojunto — H cb₂ch₂sce₂cooh

-ch₂-n-ch₂~ch₂ • \-CE₀CSL,SCH_?COOE

-ch₂-n-ce₂-cs₂ ^{2 2}

CE₂CH₂SCE₂C00E

E os- 2 R^s em conjunto= fí ce₂ch₂sch₂cooh

S CH₃ -CH₂-N-CH₂-CH₂

-ck₂-n-ce₂-c..₂

-CH₂CE₂SCH₂C00E

CH₂CH₂SCH₂COOH

R

32.

B—4

33.

34.

R

-NCS

CHo

35. -NHCN-NH₉ il ² s

36. -N£₂

R'

R

H os. 2 R S -em conjunto jCB-CO-H _Z=<

(HQQCCH

R'WSo)

CE^CC^H ~CH₂-N<CE₂COOH)₂

-CH₂-N(CH₂C00H>₂

-CH₂-N(CH2COOH)₂ os 2 Rs ^em conjunto ,cé₂ 0¾ í-CE₂COOH ch₂cooh

- 26 R

39. -RH₂

wSSSuSi

. ¹ 38. -NHCN-NEL·

II ² . S

os 2 R²s em conjunto <H0QCCH₂SCH₂CE₂)

OS₂CS₂SCS₂COOE

R

40.

—NCS (HOOCCE^SO^^)

‘ CB^C^SCH^COOH

CH,

41.

B—5

-nhch-kh?

!1 ² s os 2 Rs em conjunto “ · (hooccEjSCh^h,)-/^ ^-ch₂ch₂sçh₂cooh % dT² /^Ch2

CB^CH^CH^COOE /V-Z /—Γ'¹ >=Z X A k 2 u /•=*\ —OCH, '''NH,

42, —/>-^3

R^J

H

-CH₂-N<CH₂C00H)₂

43.

z*“‘\ . z^OCHo

-cb₂-n<ch₂cooh)₂

- 28 R ⁴⁴ · -O·^-^ ^NHC-N-NÍ^ $ CE,

45. <‘’>-0CÈ₃ \h.

--ch₂hn<ch₂cooh>₂

E ' os 2 Zs en conjunto

CE^OOH /¾^-^¾

CH^-N-CE^ ch₂coos

46, — ς /*-0CE₃ *—♦.

^NCS

E os 2 R^XS em conjuntt

ÇH₂C00E ² I ² CH₂C00E

E os 2 E^S em conjunto

CELCOOE i S

S CH<

/^CV^N~?^H2 ^xch₂-n-ch₂ ce₂cooh

48. -< ’>-0Cfi₃ >NH,

E os 2 Zs em conjunto

CH₂CS₂$CH₂C00E _zCH₂-H-ÇE₂

ÇH₂~N-CH₂

CH₂CE₂SCH₂COOfí

R49 ^NCS •H os 2 R 8 em conjunt(

CH^SCH^OQH

CE₉—lí—CBL 2 , 2

C^C^SCE^COOH

50.

/-°¾

E ^os 2 R-8 θπι conjunto = \íHC-N-KSCE^CH^SCE^COOE

S CE, 'CH, 'CH₂-N-CE₂ cb₂ch₂sch₂coqe

B-6 .01.

O'^v\>

rS ô

V _K2^Z

51.

·=«

-CE₂-N(CH₂C00H)₂

52. -CH₂-N<CH₂COOB)₂ \cs

R

53. .< >-0®3

54. 55. 56. 57.

58. -

-^-^(0^0002)2 li l ² _ ^s

SiS \_nrn \ ^-°⁰¾ ^NCS ^X-OCÊs ^X'^<==*^xIíS.C-íH^<

S CE,

X Δ—OCE\ / o ’ 'hm₂ <' >-och₃ »55·,

Sícs < >~O^ch3 = ·.

NH,

S CH, os 2 K s em conjunto

XTX

CS₂C00S os 2 E £ em conjunto >T 'CH.

CE^COOH os 2 R^s em conjunto \

CH, ch₂cooh os 2 F/s em conjunto ce₂ce₂sch₂cqqh

CH₂ Cn₂

- T) os 2 Rs em conjunto

CE₂CH₂SCE₂C00E

os 2 R S em conjunto . i₂sch₂<

CH,CH„SCH,COOH ‘2 A

59.

As classes preferidas de agentes complexantes para utilização aqui incluem terpiridinas representadas pela estrutura A-III anterior e fenantrolinas representadas pela estrutura A-IV anterior. Uma classe particularmente preferida de agentes complexantes possui a estrutura A-III anterior em que n representa 1 e o radical R representa um grupo fenilo substituido contendo um substituinte alquilo ou alcoxi e um grupo reactivo proteico. As espécies preferidas representativas de agentes complexantes incluem os compostos 20 a 32 representados anteriormente. 0 agente complexante normalmente mais preferido é TMT (composto 21).

Esta invenção proporciona novas terpiridinas possuindo a estrutura A-III apresentada no sumário anterior em que n representa 1 e o radical

o radical r⁵ representa alcoxi ou alquilo e o radical R⁶ representa um grupo reactivo proteico. 0 radical representa alqui lo contendo, de preferência entre 1 e 20 átomos de carbono, mais preferivelmente, entre 1 e 8 átomos de carbono tais como metilo, etilo e análogos, ou alcoxi, contendo o radical alquilo entre 1 e 20 átomos de carbono, mais preferivelmente, entre 1 e 8 átomos de carbono tais como metoxi, etoxi e análogos.

radical R6_rep_resenta um grupo reactivo proteico como descrito anteriormente. Os grupos reactivos proteicos preferidos incluem amino, alquil-amino, aril-amino, carbazido, semicarbazido, tio-semicarbazido, tio-semicarbazido, tio-carbazido, isocianato e isotiocianato. Os grupos reactivos proteicos especialmente preferidos incluem amino, isotiocianato e semicarbazido. As espécies especialmente preferidas incluem TMT (composto 21) e composto 20 (THT) representados anteriormente. As fenantrolinas preferidas de acordo com esta invenção possuem a estrutura A-IV anterior em que pelo menos um dos radicais r4 representa um grupo reactivo proteico. Os grupos reactivos proteicos preferidos incluem os especificados pelo radical R⁶ * anterior.

•Á gruvjjxiww Πϊώί

Os agentes complexantes polipiridina e fenantrolina possuindo sitios de complexação de metais, por exemplo, heteroátomos e grupos iminodiacetato podem preparar -se por técnicas conhecidas na especialidade. Os esquemas de reacção adequados estão ilustrados na Patente Norte Americana 4837169 e na Patente Norte Americana 4859777 cujas descrições são aqui incorporadas como referência.

A preparação dos compostos normalmente preferidos desta invenção, nomeadamente:

sal-tetra-sódio de 4'-(3-amino-4-metoxifenil)-6-6-his(N}N-dicarboxi-metil-N-metil-hidrazino)-2,2':6',2-terpiridina, (ΊΉΤ) e sal tetra-sódio de 4'-(3-amino-4-metoxi-fenil)-6-6-bis(N,N-di-(carboxi-metil)amino-metil] -2,2'.6’,2-terpiridina, (TMT) estão ilustrados no esquema de reacção I seguintes:

Esquema Reacçao I Síntese de TMT e TMT

1) Br₂ .<# \

-II ^{1 0} _Br~

CH₃ í fl 2) yv

II i (I /^0CH3 ί ii , Í «I

Br N

OHC • ·

I II

KOH,MeOH

THT .Sintese de

QMe i

ch₃nhnh₂

h^n^xch₃

-> no₂

NH₂

->Na

1) (ΌΗ3δθ2)2θ?^Ε^3^Ν

2) HN(CH₂CO₂Et)₂ —> tetra ester 7

3)HN0₃;H₂S0₄ __ — +

4)Pd/C;HC0₂NH4

5)NaOH?MeOH ί 1 ¹ - ¹ ‘0 C - C0^C°^{2 C}°² -4Na+ 2 2 (TMT)

A adição a estas moléculas dos grupe reactivos proteicos pretendidos anteriormente descritos pode efectuar-se por reacções quimicas convencionais. Por exemplo, os grupos amina podem adicionar-se a polipiridinas e fenantrolinas por nitração seguida de redução dos grupos nitro a aminas. Se se desejar, os grupos amina podem converter-se a grupos isocianato por reacção com tiofosgéneo para produzir o cloreto de carbamoílo que, depois de aquecimento, liberta HCl para produzir o isocianato. Os grupos carboxi podem adicionar-se por tratamento das polipridinas e fenantrolinas substituídas com amina com agentes tais como anidro glutárico seguido da activação selectiva adequada da funcionalidade carboxilo. Os aldeídos protegidos com acetal cíclico podem ser transportados através da sequência de reacção necessária para sintetizar os quelantes polipiridina e depois desprotegidos antes da conjugação da proteina.

A classe de terpiridinas de acordo com a estrutura A-III anterior e contendo um grupo fenilo substituido com um substituinte alquilo ou alcoxi e com um grupo reactivo proteico é particularmente vantajosa do ponto de vista de síntese. A presença do grupo alquilo ou alcoxi num material de partida dibromado (3) proporciona solubilidade me36

lhorada em THF que é um solvente preferido utilizado na preparação do intermediário diol (6).

As novas terpiridinas desta invenção podem preparar-se de acordo com as técnicas de síntese anteriormente descritas. As preparações ilustrativas adicionais apresentam-se nos exemplos que se seguem.

Os imuno-reagentes radioactivos discriminantes desta invenção incluem um ião radionuclídico. Os iões radionuclídicos podem ser seleccionados, por exemplo, a partir dos iões Sc, Fe, Pb, Ga, Y, Bi, Mn, Cu, Cr, Zn, Ge, Mo, Tc, Ru, In, Sn, Sm, Sb, W, Re, Po, Pa e TI. Destes, os mais preferidos são os iões ^Ζί^8ο⁺⁺⁺, ^^’^^0π^{++ 2}^²Pb +++ 212_.+++ _n ’ γ θ Bi . Destes os mais preferidos sao os ⁶⁸Ga⁺⁺,

Q(j + + + ioes ^yuY

Os iões radionuclídicos metálicos e os agentes complexantes são fácilmente complexados por mistura simples numa solução aquosa do agente complexante com o sal radionuclídico metálico numa solução aquosa possuindo, de preferência, um pH entre 4 e 11. 0 sal pode ser qualquer sal solúvel em água de um metal tais como os sais de halogéneo. 0 quelato prepara-se, e geral, em solução aquosa a um pH entre 5 e 6 e, de preferência, entre 6 e 8. Mistura-se facultativamente o complexo com agentes tampão tais como acetato, fosfato e borato para produzir o pH óptimo.

imuno-reagente discriminante desta invenção inclui um grupo imuno-reactivo covalentemente ligado ao agente complexante. 0 imuno-reagente discriminante inclui assim um conjugado de um complexo possuindo a estrutura A-I anterior e o grupo imuno-reactivo. 0 agente complexante e o radionuclido metálico podem ser complexados antes ou depois do agente complexante estar ligado ao grupo imuno-reactivo. Como aqui utilizado o termo grupo imuno-reactivo pretende incluir qualquer composto orgânico que seja susceptível de ligação co37. Λ¹ valente ao agente complexante e que se encontre num organismo vivo ou seja útil no diagnóstico, tratamento ou engenharia genética de material celular ou organismos vivos e que possua uma capacidade de interacção com um outro componente que se possa encontrar em fluidos biológicos ou associado com células a serem tratadas tais como células de tumor.

De acordo com a utilização pretendida, o grupo imuno-reactivo pode ser seleccionado de uma grande variedade de materiais que ocorrem naturalmente ou se preparam sintéticamente incluindo, mas não se limitando a,enzimas, amino-ácidos, peptídos, polipeptídos, proteínas, lipoproteinas, glicoproteinas, hormonas, fármacos (por exemplo digoxina, feneitoína, fenobarnitol, tirozina, tri-iodotironina gentamicina, carbamazepina, e teofilina), esteróides, vitaminas, polissacarídeos, vírus, protozoácios, fungos, parasitas, rickettsia, bolores, anticorpos, materiais antigénicos (incluindo proteínas e carbohidratos), avidina e seus derivados, biotina e seus derivados e outros grupos conhecidos dos especialistas.

Os grupos imuno-reactivos preferidos para utilização na prática desta invenção são aqueles que possuem uma molécula receptora especifica para um ligando de interesse. Assim, uma reacção ligante especifica envolvendo um reagente pode utilizar-se para a discriminação esperada. Os exemplos de tais complexos ligando-receptor incluem, mas não se limitam a complexos anticorpo-antígeno, avidina-biotina, repressor (indutor)-promotor de operons e açucar-lectina. Adicionalmente, ácidos nucleícos complementares, isto é, um produto hibridizado de espécies complementares, são também considerados materiais ligantes específicos de acordo com o termo aqui utilizado.

Os grupos imuno-reactivos úteis incluem (1) qualquer substância que, quando apresentada a um hos pedeiro imuno competente origine a produção de um anticorpo especifico susceptível de se ligar com essa substância ou (2)o

anticorpo assim produzido, que participa numa reacção antígeno-anticorpo. Assim, o grupo imuno-reactivo pode ser um material antigénico, um anticorpo ou um anti-anticorpo. Os anticorpos monoclonais e policlonais são adequados. Os anticorpos podem ser moléculas no seu todo ou vários fragmentos seus, desde que contenham pelo menos um sitio reactivo para a reacção com os grupos reactivos do agente complexante ou com grupos de ligação como aqui descrito.

Em determinadas formas de realização o grupo imuno-reactivo pode ser uma enzima que possua um grupo reactivo para a ligação ao agente complexante. As enzimas representativas incluem, mas não se limitam a, aminotransminase, de aspartato aminotrasminase de alanina, lactato-desidrogenase. fosfocinase de creatina, gama glutamil-transferase, fosfatase alcalinal ácida, fosfatase do ácido prostático, peroxidase de rábano e várias estearases.

Se se desejar, o grupo imuno-reactivo pode ser modificado pode ser modificado ou quimicamente alterado para proporcionar grupos reactivos para ligação a agentes complexantes por técnicas conhecidas dos especialistas. Tais técnicas incluem a utilização de radicais de ligação e modificações quimicas tais como as descritas em WO-A-89/O2931 e WO-A-89/2932 que são dirigidas à modificação de oligonucleotidos e Patente Norte Americana 4719182 cujas descrições são aqui incorporadas como referência na sua totalidade.

Duas utilizações muito preferidas dos imuno-reagentes discriminantes desta invenção são a formação de imagens de diagnósticos de tumores e o tratamento radiológico de tumores. Os grupos imuno-reactivos preferidos incluem, assim, anti-corpos de antígenos associados a tumores. Os exemplos específicos incluem anticorpos B72.3 (descritos nas Patentes Norte Americana n²s 4522918 e 4612282 que reconhecem tumores colo-rectais, anticorpos anti-melanoma 9.2.27, anticorpo D612 que reconhecem tumores colo-rectais, anticorpos UJ13A que

reconhecem pequenas células de carcinomas do pulmão, anticorpos NRLU-10 que reconhecem pequenas células de carcinomas de pulmão e tumores colo-rectais (Pancarcinoma), anticorpos 7E11C5 que reconhecem tumores da próstata, anticorpos CC49 que reconhecem tumores colo-rectais, anticorpos TNT que reconhecem tecido necrótico, anticorpos PR1A3 que reconhecem carcinomas do colon, anticorpos ING-1 que estão descritos na Patente Internacional publicação WO-A-90/02569, anticorpos B174 que reconhecem carcinomas de células escamosas, anticorpos B43 que são reactivos com determinados linfomas e leucemias e outros que podem ser de interesse particular.

Tais anticorpos e outros imunológicos úteis descritos anteriormente são moléculas complexas grandes possuindo múltiplos sítios para ligação do agente complexante. Consequentemente, o grupo imuno-reactivo pode possuir ligado a ele agentes complexantes adicionais por intermédio de um dos grupos reactivos proteicos.

Assim, o termo grupo imuno-reactivo pretende incluir grupos imunológicos possuindo moléculas de agente complexantes ligadas a eles atarvés de um ou vários grupos reactivos proteicos.

Adicionalmente, um anticorpo ou um seu fragmento contendo uma região hidrato de carbono pode estar ligado ao agente complexante através da região hidrato de carbono do anticorpo, tal como descrito na Patente Norte Americana 4937183 cuja descrição é aqui incorporada como referência na sua totalidade. Os métodos úteis para a ligação de um anticorpo estão também descritos nas Patentes Norte Americanas n²s 4671958; 4699784; 4741900 e 4867973. 0 termo grupo reactivo proteico como aqui definido pretende incluir tais ligações.

Outras técnicas para efectuar a ligação covalente do grupo imuno-reactivo aos agentes complexantes de metais radioactivos são conhecidos na especialidade e

incluem a mistura simples dos materiais em conjunto.

imuno-reagente radioactivo desta invenção pode conter qualquer proporção entre o ião radionuclidico metálico e o agente complexante. Nas formas de realização preferidas, a proporção em moles entre o ião metálico e o agente complexante varia entre 1:100 e 1:1 aproximadamente. . ~

A proporção entre o quelato e o imuno-reagente pode variar entre 0,5:1 e 10:1 ou mais. Nalgumas formas de realização, a proporção moolar entre o quelato e os grupos imuno-reactivos está compreendida entre 1:1 e 6:1 aproximadamente.

As figuras 6 e 7 são espectros de agentes complexantes e complexos metálicos desta invenção. As porções do espectro não se sobrepõem com o das proteínas às quais os agentes quelantes estão quimicamente ligados. Obtiveram-se desvios espectrais semelhantes entre agentes quelantes desta invenção e outros catiões representativos tais +3 +3 „ +3 „ +3 +2 como GA -' bí

In

Sc e Cu . Assim, o imuno-reagente desta invenção pode ser fácilmente analisado por espectrofotometria.

Os exemplos seguintes ilustram ainda esta invenção:

Preparação 1: Preparação de Sal tetra-sódio de 4'-(3-amino-4-fenil)-6,6¹ -|N,N-di(carboximetil)amino-metil|-2,2': 6 ¹,2-terpiridina, (TMT),

Parte A - Brometo de piridínio 1

Fez-se a síntese de 2-acetil-6-bromopiridina pelo método de J.E. Parks, B.E. Wagner, and R.E. Holm, J. Organometal. Chem 56, 53-66 (1973). Tratou-se a 2-acetil-6-bromopiridina (20,Og; 100 mmoles) com bromo (6,2 ml; 0,2 moles) ao refluxo de 200ml de CHCl^ durante 45 minutos. Arrefeceu-se a solução à temperatura ambiente e depois lavou— se com NaHCO^/Na^S^O^ aquosa diluída. Secou-se a fase orgânica

sobre Na2S0^, filtrou-se evaporou-se para proporcionar um óleo. Dissolveu-se o óleo em 200ml de THF e adicionaram-se 30ml de piridina. Fez-se o refluxo da solução resultante durante 30 minutos. Arrefeceu-se a mistura e filtrou-se para proporcionar 26,lg de um pó esbranquiçado (73%):jp.f. 256°C dec (descoloriu-se a 245°C). Análise calculada para C^H^qB^^O:

C, 40.26; H, 2.82; N, 7.82. Encontrado C, 40.12; H, 2.85; N, 7.79J. Os espectros de RMN e IV eram consistentes com a estrutura assinalada e o produto era homogéneo por CCF (Cromatografia de Camada Fina)

Parte B - Calcona 2

Dissolveu-se hidróxido de potássio (18,2g; 325 mmoles) em lOOml de água e adicionaram-se lOOml de metanol. Dissolveram-se 2-acetil-6-bromopiridina (65g; 325 mmoles) e (68g; 650 moles) de p-anisaldeído em conjunto em 400ml de metanol e verteu-se a solução numa solução de KOH. A precipitação do produto começou depois de alguns minutos e permitiu-se que a reacção repousa-se à temperatura ambiente durante a noite.

Recolheu-se o precipitado, lavou-se com isopropanol e secou-se para proporcionar 79g (76%) do produto como um sólido amarelo, p.f. 100-102°C.FDMS (m/e) 317 M Purificou-se um alíquota por cromatografia de coluna em gel de sílica Woelm, eluição com diclorometano a 100%. Análise calculada para C, 56.63; H, 3.80; N, 4.40. Encontrado

C, 56.66; H, 3.87; N, 4.41. Os espectros de RMN e IV eram consistentes com a estrutura verificada e o produto era homogéneo por CCF.

Parte C - Dibromoterpiridina 3

Fez-se o refluxo de brometo de piridinio 1 (11,3g; 31,6 mmoles) e calcona 2 (10,Og; 31,4 mmoles) em lOOml de AcOH com lOg de NH^OAc durante 16 horas. Arrefeceu-se a solução e, filtrou-se e lavou-se o sólido com AcOH e

depois com EtOH para proporcionar 13,48g de cristais brancos (86%): p.f. 203-204.5°C. FDMS (m/e) 495 (M+).

Análise calculada para 022^158^^0: C, 53,1; H, 3.0; N, 8.5. Encontrado: C, 52.9; H, 3.1; N,8.4. Os espectros de RMN e IV eram consistentes com a estrutura verificada e o produto era homogéneo por CCF.

Parte D - Terpiridinodiol 6

Adiciounou-se, gota a gota, dibrometo 3 (7,46g; 15,5 mmoles) em lOOml de THF seco a uma solução de 28,1 ml de n-BuLl 1,6M em 20ml de THF seco sob atmosfera de azoto durante um periodo de 12 minutos. Manteve-se a temperatura inferior a - 75°C durante a adição com um banho de gelo seco/acetona. Agitou-se a solução verde escura resultante durante 10 minutos e em seguida adicionaram-se 7,5 ml de DMF seco durante um periodo de 2 minutos. Depois de 10 minutos, adicionaram-se 90ml de uma solução a 10% de HC1 e agitou-se a solução resultante durante 45 minutos com arrefecimento contínuo. Fraccionou-se a mistura entre CHCL^ e H₂ 0 (os dois solventes pré-arrefecidos a 4²0) num funil separador. Agitaram-se as fases frequentemente e permitiu-se que repousassem à temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos até à cor da fase orgânica mudar gradualmente de um tom esverdeado a amarelo dourado. Lavou-se a fase orgânica com solução saturada de NaCl de depois evaporou-se para proporcionar um residuo cor de creme. Triturou-se este material com CHgCN para proporcionar o produto como um sólido esbranqueciçado (3,53g, 60%), p.f. 225-227°C. FDMS (m/e) 395M. Análise calculada para C24H17N3O3. _c 72.90; H, 4.33; N 10.63. Encontrado; C, 72.44; H, 4.31; N,10.46

Fez-se o refluxo do dl-aldeído impuro (3,53g; 8,93 mmoles) com lg de NaBH^ com uma mistura de 70ml de THF e 70ml de EtOH absoluto durante 15 minutos sob atmosfera de azoto. Depois da concentração por vácuo fez-se o refluxo do resíduo durante 30 minutos em solução diluída de NaHCOg, arrefeceu-se, filtrou-se, lavou-se com água e depois

secou-se para proporcionar o diol 6 como um sólido branco (3,35g; 94,4%) p.f. 187-189°C. FDMS (m/e) 400MH⁺, 399 M. Análise. Calculada para ^G24^H21^N3°3^{: Cj} 72.17; H, 5.30; N, 10.52. Encontrado: C, 71.71; H, 5.20; N, 10.37. Os espectros de RMN e IV eram consistentes com a estrutura verificada e o produto era homogéneo por CCF.

Parte E - Tetra-éster 7

Fez-se a suspensão do diol 6 (15,4g;

38,5 mmoles) numa mistura de 17ml de Et^N em 175ml de CH2CI2 com agitação a 8°C. A esta suspensão adicionou-se, gota a gota, uma solução de (CHgSO₂)₂O (16,8g; 96,5 mmoles) em 50ml de CH^C^ durante um periodo de 10 minutos. Agitou-se a mistura de reacção com água. Secou-se a camada orgânica sobre Mg₂S0^, filtrou-se e encontrou-se aproximadamente até à secagem. A adição de EtÔAc produziu o bismesilato como cristais brancos que se recolheram e secaram (17,2g; 80,4%). Agitou-se uma mistura do bismesilato (0,50g, 0,96 mmoles), di-isopropil-etilamina (0,26g; 2,0 mmoles) e dietil-imino-diacetato (0,38g; 2,0 mmoles) durante 16 horas em 20ml de DMF seco. Concentrou-se a mistura por vácuo e fraccionou-se o resíduo entre Et₂0 e H₂0. Lavou-se a fase Et20 duas vezes mais com água e depois secou-se sobre Νη₂30^ e evaporou-se para proporcionar o produto como um óleo amarelo pálido (O,58g; 82%). Análise. Calculada para ^40^47^5¾¹ θ’ 64.76; H, 6.39; N, 9.44. Encontrado C, 64.35; H, 6.17; N, 9.39. Os espectros de RMN e IV eram consistentes com a estrutura verificada e o produto era homogéneo por CCF.

Parte F-Nitro-tetra-éster 8

Dissolveu-se tetra-éster de terpiridina 7 (3,27g; 4,41mmoles) em 60 ml de H2SO4 concentrado para proporcionar uma solução vermelha alaranjada. Arrefeceu-se a mistura a 0°C e adicionou-se uma mistura 1/10 (v/v) de HNO3 concentrado em H^SO^ concentrado de tal forma que se libertaram

- 44 4,41 mmoles de HNO3. A cor da solução mudou para amarelo pálido depois de se ter completado a adição. Agitou-se a mistura de reacção durante 15 minutos a 0°C e depois verteu-se em gelo moído. Adicionou-se K^COg diluído até se atingir um pH de 8. Extraiu-se a solução aquosa 3 vezes com C^C^. Combinaram-se as camadas orgânicas, secaram-se sobre Na2S0^ e concentraram-se para proporcionar um óleo amarelo que se submeteu a cromatografia em gel de silica (5% de MeOH/C^C^). Combinaram-se as fracções contendo o produto e evaporaram-se para proporcionar o produto que se recristalizou três vezes a partir de MeOH para proporcionar um sólido esbranquiçado (l,84g; 53%): p.f. 76-79°C. FDMS (m/e) 787 MH⁺, 786 M. Análise. Calculado para C^QH^^NgOqq: C, 61.06; H, 5.89; N, 10.68. Encontrado: C, 60.69; H, 6.22; N, 11,04. Os espectros de RMN e IV eram consistentes com a estrutura verificada e 0 produto era homogéneo por CCF.

Parte G - Tetra-éster de amino-terpiridina 9

Dissolveu-se nitro-tetra-éster 8 (l,80g; 2,29 mmoles) numa mistura de 90ml de THF e 90ml de EtOH absoluto. Adicionou-se formiato de amónio (2,89g; 45,8 mmoles) dissolvido em 16 ml de água e, em seguida, 4,8g de 10% de Pd/C (4,6 mmoles). Depois de agitação à temperatura ambiente durante 2 horas filtrou-se a reacção através de um filtro de terra de diatomáceas. Lavou-se o filtro com THF, EtOH absoluto e CH2CI2. Concentrou-se o filtrado e fraccionou-se o resíduo entre CH2CI2 e NaCl aquoso. Concentrou-se a fase orgânica e depois purificou-se em SÍO2 com 10% de MeOH/CHCl^ para proporcionar 0 produto como um óleo cor de palha (0,80g; 46%). FDMS (m/e) 757 MH , 756 M. Análise. Calculada para C^qI^^O^. I/2H2O: C, 62.73; H, 6.45; N, 10.97. Encontrado: C, 62.98; H, 6.47; N, 10.67. Os espectros de RMN e IV eram consistentes com a estrutura verificada e o produto era homogéneo por CCF.

Parte H-Amino-tetra-ácido 10 (TMT)

Agitou-se tetra-éster-amina 9 (O,75g; 0,99 mmoles) com 4 equivalentes de NaOH numa mistura de 50ml de MeOH e 2ml de Hg 0 durante 16 horas à temperatura ambiente. Concentrou-se a mistura para proporcionar o produto com um di-hidrato sólido (0,72g; 94%): FABMS m/e 640 (M+ para tetracarboxilato). Análise. Calculada para C32^H28^N6^Na4°9-^2H2°^: C, 50.01; H, 4.20; N, 10.93. Encontrado; C, 49.82; H, 4.12; N, 10.74. Os espectros de RMN e IV eram consistentes com a estrutura verificada e o produto era homogéneo por CCF.

Preparação 2: Preparação de Sal tetra-sódio de 4'-(3-amino-4-metoxi-fenil)-6,6-bis(N¹,N'-dicarboximetil-N-metil-hidrazino)

-2,2':6¹,2-terpiridina (THT)

Parte A - 6,6-Bis(N-metil-hidrazi-no)-4'-(4-metoxi-fenil)-2,2':6'-2-terpiridina 4. Fez-se o refluxo de 6,6-dibromo-4'-(4-metoxifenil)-2,2';6',2-terpiridina 3 (l,g; 2 mmoles) em 20ml de metil-hidrazina durante 16 horas sob atmosfera de azoto. Arrefeceu-se a solução e filtrou-se o precipitado resultante, secou-se até um peso constante para proporcionar 0,68g de um sólido de cor creme, p.f. 218-220°C. FDMS (m/e) 428 MH⁺,427 M⁺. Análise: Calculada para C24H25N7O.O.25 HgO: C,66.72; H, 5.96; N, 22.70. Encontrado: C, 66.85; H, 5.85; N, 23.0. Os espectros de RMN e IV eram consistentes com a estrutura verificada.

Parte B-6,6-Bis(Ν',N'-di(etoxi-carbonil-metil)-N-metil-hidrazino)-4¹-(4-metoxi-fenil)-2,2':6',2-terpiridina.

Adicionou-se bis(metil-hidrazina) terpiridina 4 da parte A (3,50g; 82 mmoles), bromo-acetato de etilo (13,2ml, 820 mmoles), 2,6-lutidina (9,6ml; 820 mmoles) e iodeto de sódio (O,35g, 2 mmoles) a 350 ml de acetonitrilo e fez-se 0 refluxo da solução em atmosfera de azoto durante 48 horas, altura em que se adicionaram 4,1 ml (370 mmoles) de bromo-acetato de etilo e 4,8 ml (410 mmoles) de 2,6-lutidina. Fez-se o refluxo da solução de reacção durante mais 48 horas e

arrefeceu-se. Filtrou-se e refeitou-se uma quantidade apreciável de sal branco resultante de excesso de bromo-acetato e lntidina. Concentrou-se o filtrado e dissolveu-se o material concentrado em diclorometano e extraiu-se duas vezes com cloreto de sódio aquoso diluído. Concentrou-se a fase organica com vácuo elevado até ficar isenta de odores de bromo-acetato e lutidina. Purificou-se o óleo impuro numa coluna de gel de sílica (91,44cm x 5,08cm). Eluiu-se a coluna inicialmente com diclorometano a 100% e, em seguida, com 50/1 de diclorometano/acetona com um aumento gradual da concentração da acetona a 25/1 de diclorometano/acetona. A concentração das fracções purificadas proporcionou 2,91g (46%) de óleo cor de palha claro. Uma fracção do óleo purificado, depois de repousar á temperatura ambiente e cristalizar e triturar com metanol proporcionou um sólido branco, p.f. 100-103°C. Análise Calculada para C^QH^çNyOg: C, 62,24; H, 6.40; N, 12.70. Encontrado: C, 62.31; H, 6.32; N, 12.69. Os espectros de RMN e IV eram consistentes com a estrutura verificada e o produto era homogéneo por CCF.

Parte C - 6,6-Bis(Ν',N'-di(etoxi-carbonil-metil)-N-metil-hidrazino)-4¹-(4-metoxi-3-nitrofenil)-2,2':6',2-terpiridina

Dissolveu-se o tetra-éster de terpiridina da parte B (0,659g, 0,84 mmoles) em 5ml de B^SO^ concentrado para proporcionar uma solução vermelha alaranjada. Arrefeceu-se a mistura a 0°C e adicionou-se uma mistura de HNOg concentrado em í^SO^ concentrado de tal forma que se libertaram 0,84 mmoles de HNO3. A cor da solução mudou para amarelo pálido depois de se completar a adição. Agitou-se a mistura de reacção durante 15 minutos a 0°C e depois verteu-se em gelo moído. Adicionou-se K2CO3 diluido até se obter um pH de 8. Extraiu-se a solução aquosa três vezes com CH2CI2. Combinaram-se as camadas orgânicas e secaram-se sobre Na2S04 e concentraram-se para proporcionar um óleo amarelo que se submeteu a cromatografia em gel de sílica (20/1 de cloreto de metileno/acetona). Combinaram- 47 -

-se as fracções contendo o produto e evaporaram-se para propor· cionar o produto, um vidro amarelo pálido. Rendimento 0,15g (22%). Análise. Calculada para Ο^θΗ^β^δθΙΙ' ^-,58.82; H, 5.92;

N, 13.72. Encontrado C, 58.76; H, 5.61; N, 13.84. FDMS (m/e) 816 M. Os espectros de RMN e IV eram consistentes com a estrutura verificada e o produto era homogéneo por CCF.

Parte D - 4'-(3-amino-4-metoxi-fenil)-6,6-bis(Ν',N'-di(etoxi-carbonil-metil)-N-metil-hidrazino)-2,2':6’,2-terpiridina.

Dissolveu-se o nitro-tetra-éster da parte C (0,72g; 0,88 mmoles) numa mistura de 30ml de THF e 30ml de etanol. Adicionou-se formiato de amónio (l,08g; 17,1 mmoles) dissolvido em 6ml de água e, em seguida, l,8g de 10% de Pd/C (1,7 mmoles). Depois de agitação à temperatura ambiente durante a noite filtrou-se a mistura de reacção através de um filtro de terra de diatomáceas. Lavou-se o filtro com THF, EtOH absoluto e CH2CI2. Concentrou-se 0 filtra do e dissolveu-se o resíduo em clorofórmio e lavou-se a solução de clorofórmio duas vezes com água. Concentrou-se a fase organica num óleo. A adição de metanol ao óleo originou a cristalização do óleo. Fez-se a massa fluida do material em 20 ml de metanol, filtrou-se e secou-se ao ar para proporcionar

O, 64g de sólido cor de creme (92,7%). Análise. Calculada para θ40^Ε50^8θ9^: θ’ Η, 6.40; N, 14.24. Encontrado: C, 60.74;

H, 6.39; N, 14.01. Os espectros de RMN e IV eram consistentes com a estrutura verificada e o produto era homogéneo por CCF.

Parte E - Sal tetra-sódio de 4'-(3-amino-4-metoxi-fenil)-6-6-bis(Ν',N'-dicarboxi-metil-N-metil-hidrazino)-2,2':6',2-terpiridina, (THT)

Agitou-se o tetra-éster de amina da parte D (0,60g; 0,76 mmoles) com 4 equivalentes de NaOH numa mistura de 25 ml de MeOH e lml de H2O durante aproximadamente 16 horas à temperatura ambiente. Concentrou-se a mistura para proporcionar um rendimento quantitativo de tetracarboxilato ·»

sólido. Análise: Calculada para C32H3QNgNa40g.2H2O: C, 48.12;

H, 4.29; N, 14.03. Encontrado: C, 48.01; H, 3.97; N, 12.77.

Preparação 3: Preparação de Sal sódio de 6,6-bis(N^t,N^l-di-carboxi-metil-hidrazini)-4'-(3-isocianato-4-metoxi-fenil)-2,2¹:

6', 2-terpiridina

Dissolveu-se o sal tetra-sódio de amina THT da praparação 2, parte E (0,39g; 0,51 mmoles) em

80ml de metanol. À temperatura ambiente adicionaram-se 0,58g (0,50 mmoles) de tiofosgéneo em l,0ml de tetra-hidrofurano e, em seguida, adicionaram-se 0,51g (0,50 mmoles) de trietilamina em l,0ml de tetra-hidrofurano. Concentrou-se depois a mistura de reacção até um resíduo que se transformou numa pasta fluída em diclorometano e se filtrou para proporcionar 0,26g (65%) de sólido amarelo. 0 espectro de infra-vermelhos era consistente com estrutura verificada. Acredita-se que o produto fosse um sal tri-sódio de ácido monocarboxílico.

Preparação 4: Preparação de sal tetra-sódio de 5-amino-2,9~ bis(N,N-di-(carboxi-metil-amino-etil | -1,10-fenantrolina .

Parte A - 2,9-dimetil-5-nitro-l,10-fenantrolina

Dissolveu-se cloridrato de neocuproína hemi-hidratado (25,Og; 99 mmoles) em lOOml de ácido nítrico concentrado. Adicionaram-se 200ml de ácido sulfúrico concentrado e aqueceu-se a reacção ao refluxo durante 2,5 horas e depois permitiu-se que repousasse à temperatura ambiente durante 8 dias. Adicionou-se, depois, gradualmente a mistura de reacção a uma mistura de aproximadamente 3 quilos de gelo e 351g (8,8moles) de LiOH.l^O com agitação com uma barra de vidro. Durante o procedimento de neutralização adicionou-se gelo conforme necessário de tal modo que gelo não fundido estivesse sempre presente durante a neutralização e arrefeceu-se também simultaneamente a reacção de neutralização num banho de acetona/gelo. Depois de se completar a adição, 0 pH da mistura de reacção era 12. Extraíu-se a mistura aquosa 2

vezes com cloreto de metileno, primeiro, com lOOOml e depois com 400ml. Combinaram-se as fracções de cloreto de metileno e extraíram-se uma vez com 50ml de água destilada. Concentrou-se a fase cloreto de metileno até um resíduo e triturou-se com 50ml de acetonitrilo. Filtrou-se o sólido, lavou-se com acetonitrilo e secou-se por vácuo para proporcionar 10,3g de um sólido amarelo creme, que se dissolveu em lOOml de acetonitrilo ao refluxo, permitiu-se que recristaliza-se à temperatura ambiente e filtrou-se para proporcionar 8,5g (34%) de cristais cor amarelo creme, p.f. 184-186°C. FDMS (m/e) 253M. Análise: Calculado para. C14HHN3Q2 .0.25 HgO: C, 65.23; H, 4.50; N, 16.30. Encontrado: C,65.57; H, 4.45; N, 16.27.) Os espectros de RMN e IV eram consistentes com estrutura verificada e 0 produto era homogéneo por CCF.

Parte B - 2,9-di(bromo-metil)-5-nitro-l,10-fenantrolina

Misturaram-se em conjunto 2,9-dimetil-5-nitro-l,10-fenantrolina (l,0g; 4 mmoles) e N-bromo-succinimida (l,42g; 8 mmoles) numa mistura homogénea num frasco e adicionou-se tudo de uma vez a 20ml de o-diclorobenzeno ao refluxo (181°C). Continuou-se o aquecimento à temperatura de refluxo durante 2 minutos e depois permitiu-se que a mistura de reacção aquecesse à temperatura ambiente. Purificou-se a mistura de reacção numa coluna (45,7cm x 5,O8cm) de gel de sílica de Woelm com eluição com diclorometano a 100% para proporcionar 0,47g (29%) de material purificado, um óleo amarelo. Rf em TLC, 0,5 (40/1 de CJ^C^/acetona). A trituração de uma alíquota do produto purificado proporcionou um sólido branco acizentado que se decompôs a 146°C. Análise: Calculada para *θ' ^Η2θ^: 40.02; H, 2.39; N, 10.00. Encontrado: C, 40.36; H, 2.67; N, 9.77. FDMS (m/e) 409 M. Os espectros de RMN e IV eram consistentes com a estrutura verificada.

Parte C - 2,9-bis|N,N-di(etoxi-carbonil-metil)-amino-metil|-5-nitro-1,10-fenantrolina

Dissolveram-se 2,9-di(bromo-metil)-5-nitro-l,10-fenantrolina (2,28g; 5,5 mmoles) e 2,08g (llmmoles) de l,8-bis(dimetil-amino)naftaleno, em cojunto, em 25ml de l-metil-2-pirrolidinona e adicionaram-se 2,08g (llmmoles) de iminodiacetato de di-etilo. Vedou-se a reacção com uma camada de vidro moído e depois de aproximadamente 10 minutos de agitação á temperatura ambiente começou a formar-se um precipitado branco.

Colocou-se depois a mistura de reacção num refrigerador (a 4°C) e armazenou-se durante 20 horas aproximadamente. Fraccionou-se a mistura de reacção entre 400ml de éter dietílico e 400ml de água destilada e extraiú-se a fracção éter num total de 5 vezes com porções de 400ml de água destilada. Concentrou-se a fase éter e dissolveu-se em 400ml de cloreto de metileno . Extraíu-se a fase cloreto de metileno uma vez com água destilada, secou-se com uma mistura de celite, terra de diatomáceas e sulfato de sódio, depois filtrou-se e concentrou-se num óleo escuro. Preparou-se uma coluna de gel de sílica Noelm em 10/1 de cloreto de metileno/ /metanol (5O,8cm de altura por 5,08cm de diâmetro) e aplicou-se o óleo impuro à coluna num minimo de cloreto de metileno. Aplicaram-se aproximadamente 50ml de cloreto de metileno à coluna e depois eluiu-se a coluna com 10/1 de CE^C^/metanol.

Recolheram-se fracçóes (lOOml cada) e combinaram-se as fracçóes de produto puro por TLC (10/1) cloreto de metileno/ /metanol, Rf 0,4) e concentraram-se para proporcionar l,17g (34%) de produto, um óleo cor de ambar avermelhado. FDMS (m/e) 628 MH⁺. Análise: Calculada para Ο^θΗ^γΝ^Οιθ.2H₂0: C, 54.29;

H, 6.23; N, 10.55. Encontrado: C, 54.71; H, 5.58; N, 10.53.

Os espectros de RMN e IV eram consistentes com a estrutura verificada.

Parte D - 5-amino -2,9-bis|N,N-di(etoxi-carbonil-metil)-amino-etil|-1,10-fenantrolina.

Dissolveu-se2,9-bis|N,N-di(etoxi51

-carbonil-metil)amino-metil|-5-nitro-l,10-fenantrolina (3,37g; 5,4 mmoles) numa solução de lOOml de tetra-hidrofurano e 200ml de etanol absoluto. Adicionou-se uma solução de 6,8g (108 mmoles) de formiato de amónio em 22ml de água destilada e, em seguida, 5,72g de paládio em carbono (10%) (50% húmido com água para segurança). Terminou-se a reacção com um borbulhar de gás, agitou-se à temperatura ambiente durante 30 minutos e depois filtrou-se através de um filtro de terra de diatomáceas. Removeram-se depois os solventes num evaporador rotativo. Dissolveu-se o resíduo em 300ml de diclorometano que depois se extraiu com 300ml de água destilada. Extraíu-se depois a fase orgânica com 300ml de cloreto de sódio saturado, secou-se depois com uma mistura de Celite, terra de diatomáceas e sulfato de sódio, filtrou-se e concentrou-se sob vácuo elevado até um óleo cor de ambar escuro que pesava 2,90g. Tratou-se o óleo com 9,02ml de propionitrilo que originou a cristalização de um sólido amarelo. Filtrou-se o sólido e lavou-se com 13ml de propionitrilo e finalmente lavou-se com 15ml de hexanos e secou-se ao ar até um peso constante de l,04g (32%) p.f. 137-139°C. FDMS (m/e) 598 MH⁺, 597 M. Análise Calculada para: C3OH39N5O9.H2O: C, 58.52; H, 6.71; N, 11.38. Encontrado. C,

58.28; H, 6.55; N, 11.53. Os espectros de RMN e IV eram consistentes na estrutura verificada.

Parte E - Sal tetra-sódio de 5-amino-2,9~bis]N,N-di(carboxil-metil)amino-metil|-1,10-fenantrolina.

Dissolveu-se 5-amino-2,9-bis|N,N-di (etoxi-carbonil-metil)-amino-etil|-1,10-fenantrolina (,90g;

1,5 mmoles) em 200ml de metanol. Adicionou-se hidróxido de sódio (0,25g; 6,25 mmoles) dissolvido em lOml de água destilada.

Parou-se a reacção e agitou-se com um agitador magnético durante 24 horas à temperatura ambiente. Removeu-se o solvente por evaporação rotativa e triturou-se 0 resíduo sólido com cloreto de metileno e filtrou-se para proporcionar 0,81g (94%). 0 sal de tetra-sódio era higroscópico e uma quantidade

significativa permaneceu aderente à parede de vidro do funil defiltração. Análise. Calculada para: 0₂₂Η₁₉Ν3₄Ν₅0θ.3 H₂0: C, 42.11; H, 4.02; N, 11.16. Encontrado: C, 42.01; H, 3.71; N, 11.03. Os espectros de IV e o espectro de massa FAB eram consistentes com a estrutura verificada.

Preparação 5: Preparação de Sal sódio 2,9-bis|N,N-di(carboxi-metil)amino-etil|-5-isotiocianato-l,10-fenantrolina.

Dissolveu-se sal tetra-sódio de 5-amino-2,9-bis(N,N-di(carboxi-metil)amino-etil)-l,10-fenantrolina, (0,16g; 0,28 mmoles) numa mistura solvente de 20ml de metanol/4ml de água destilada. Adicionou-se tiofosgéneo (0,28 mmoles), isto é, l,0ml de uma solução de 0,32g de tiofosgénio em 10,0ml de THF) seguido por adição imediata de 0,28 mmoles de trietilamina (l,0ml de uma solução de 0,28g de trietilamina em 10,0ml de THF). A reacção efectuou-se à temperatura ambiente e depois concentrou-se imediatamente num resíduo, 0,16g (94%) de sólido amarelo. 0 espectro de IV era consistente com a estrutura verificada. Acreditou-se que o produto era um sal tri-sódio de ácido monocarboxílico.

Preparação 6: Preparação de Sal tetra-sódio de 6,6-|N,N-di( carboxi-metil)amino-metil|-4¹-(3-isotio-cianato-4-metoxi-fenil)

2,2-6'-2-terpiridina

Dissolveu-se o tetracarboxilato de amino-sódio da preparação 1 (0,31g; 0,42 mmoles) em 30ml de metanol, adicionaram-se l,0ml de THF contendo 0,42 mmoles de tiofosgéneo e depois l,0ml de THF contendo 0,42 mmoles de trietilamina. Concentrou-se imediatamente a solução de reacção num resíduo triturado com trietilamina, recolheu-se o sólido por filtração e lavou-se com diclorometano para proporcionar 0,30g de produto. 0 espectro de IV era consistente com a estrutura verificada.

Preparaçao 7: 15 amino-3,5,6,8,9,ll-hexa-hidro-4,7,10-tris(car· boximetil)-2,17:12,14-dieteno-l/4,7/10,13-penta-azabenzo-ciclopentadecina de tri-sódio

CH₂C00na

Parte A. 3,5,6,8,9,ll-hexa-hidro-4,7,10-tris(p-tolueno-sulfonamido)-2,17;12,14-dieteno-l,4,10,13-penta-azabenzo-ciclopentadecina

SO2-C7H7

SO2-C7H7

Adicionou-se, por intermédio de uma bomba de seringa, lOOml de N-metil-pirrolidin-2-ona contendo 2% em peso de 2,9-bis-bromometil-5-nitro-l, 10-fenantrolina preparado na Preparação 4, Parte B, durante 2 horas em 200ml de N-metil-pirrolidin-2-ona agitada magneticamente que se manteve sob atmosfera de argon a 20SC. Simultâneamente, adicionou-se uma solução a 2&em n-metil-pirrolidin-2-ona de um equivalente do sal di-sódio de dietilenotriamina N,N',N-tri-p-tolueno-sulfonamida. Agitou-se a reacção durante mais 6 horas depois da adição a 20⁹C, e depois destilaram-se 200ml do solvente sob vácuo elevado, arrefeceu-se a solução residual e adicionou-se a 100 ml de água gelada. Isolou-se o precipitado resultante por filtração, lavou-se com água fria e triturou-se com acetonitrilo para proporcionar o derivado de tri-p-tolueno-sulfonamida impuro.

Parte B. 3,4,5,6,7,8,9,20,ll-nona-hidro-15-nitro-2,17:12,14-âieteno-1,4,7,10,13-penta-aza-benzociclopentadecina

Dissolveu-se uma parte do macrociclo impuro preparado na Parte A em 10 partes de ácido sulfúrico concentrado (96%) e agitou-se a mistura de reacção e aqueceu-se a HO^C sob atmosfera de argon. Depois de 14 horas arrefeceu-se a solução com agitação vigorosa num banho de água gelada e tratou-se com uma solução a 10% de hidróxide sódio até se obter um pH de 10. Extraíu-se a fase aquosa cinco vezes com volumes iguais de clorofórmio, combinaram-se os extractos e secaram-se sobre sulfato de sódio anidro.

Removeram-se depoiso os sais por fil tração e evaporou-se o filtrado sob atmosfera de argon. A triamina impura pode ser purificada por cristalização a partir de etanol/água.

Parte C. 3,5,6,8,9,ll-hexa-hidro-15-nitro-4,7,10-tris(etoxi-carbonil-metil)2,17:12,14-dieteno-l,4,7,10,13-penta-azabenzociclopentadeceno

CH2COOC2H5

Agitou-se uma mistura de uma parte

do macrociclo triamina preparado na Parte B com 10 partes de carbonato de sódio e 3 partes de bromo-acetato de etilo como uma solução a 3% em peso em acetonitrilo anidro, sob atmosfera de árgon durante 24 horas a 602C. Arrefeceu-se depois a mistura de reacção à temperatura ambiente, filtrou-se e evaporou-se o solvente. 0 residuo pode ser purificado posteriormente por trituração em éter frio.

Parte D. 15-amino-3,5,6,8,9,22-hexa-hidro-4,7,10-tris(etoxi-carbonil-metil)-2,17:12,14-dieteno-l,4,7,10,13-penta-azabenzo-ciclopentadecina

CH2COOC2H5

Pode dissoAver-se uma parte em peso do nitro-triéster da parte C em 100 partes em peso de uma mistura 50/50 de tetra-hidrofurano (THF) e etanol. Adicionaram-se 2 equivalentes de formiato de amónio em 6 vezes o peso de água seguido por 2 equivalentes de 10 % de Pd/C. Agitou-se a mistura de reacção à temperatura ambiente durante a noite sob atmosfera de árgon, filtrou-se a mistura de reacção sob atmosfera de árgon e lavou-se o catalisador filtrado com THF, metanol e depois diclorometano sob atmosfera de argon. Concentraram-se os filtrados e lavagens combinados, dissolveu-se o residuo em clorifórmio e lavou-se a solução de clorofórmio 2 vezes com água. Concentrou-se a fase orgânica num óleo e promoveu-se a cristalização por adição de metanol. Triturou-se o produto em metanol, filtrou-se e depois secou-se ao ar.

Parte E. Agitou-se o tri-éster de amina da parte D à temperatura ambiente com 3 equivalentes de hidróxido de sódio

Cl

em metanol aquosa a 5 % durante 24 horas. Removeu-se o solvente sob vácuo e triturou-se o produto A com um pouco de metanol frio. Um produto Ά pode ser isolado por filtração.

Preparação 8 : 15-isotiocianato~4,7,lO-tris(carboxi-metil)-2,17:12,14-dieteno-l, âZL. 10/13-penta-azabenzo-ciclopentadecina de tri-sódio

NaOOC

CH2-C00Na

CH2C00Na

Agitou-se uma parte em peso do sal tri-sódio de amina de Preparação 7, parte E em 200 partes de metanol à temperatura ambiente.

Tratou-se este à temperatura ambiente com 1 equivalente de tiofosgéneo dissolvido em 2 partes em peso de tetra-hidrofurano e, em seguida, 1 equivalente de trietilamina dissolvido em duas partes em peso de tetra-hidrofurano. Depois de 1 hora concentrou-se a mistura de reacção num resíduo, transformou-se numa pasta fluída em diclorometano e isolou-se o produto por filtração.

Preparação 9. 2-metil-3-tio-4- 15-(3,5,6,8,9,11-hexa-hidro4,7,10-tris(carboxi-metil) -2,17:12,14-díeteno-l,4,7,10,13penta-azabenzo-ciclopentadecinil 1 -semicarbazida de tri-sódio

NaOOC.CH₂

CH2·COONa

A uma mistura acabada de preparar e agitada de uma parte em peso o sal tri-sódio de 15-isotiocianato-4,7-10-tris(carboxi-metil)2,17:12,14-dieteno-l,4,7,10-13-benzo-penta-azaciclopentadecina preparada na. Preparação 8 e 200 partesem peso de metanol, sob atmosfera de árgon à temperatura ambiente, adicionou-se rapidamente uma solução de um equivalente de metil-bidrazina dissolvida em 10 partes de metanol.Depois de 1 hora à temperatura ambiente removeu-se o solvente por evaporação sob pressão reduzida, triturou-se o resíduo com 10 partes de éter isento de oxigénio anidro e isolou-se o sólido por filtração.

Preparação 10; 2-metil-3-tio-4- 5-(f 6,6-di-bis(carboximetil )amino-metil 1 -2;2',6';2-terpiridin-4^l-il)-2-metoxi-fenil -semicarbazida de tetra-sódio.

NaOOC COONa NaOOC COONa

A mistura acabada de preparar e agitada de uma parte em peso do sal tetra-sódio do TMT-isocianato preparado na Preparação 6 e 200 partes em peso de metanol, sob atmosfera de árgon à temperatura ambiente, adicionou-se répidamente uma solução de um equivalente de metil-hidrazina dissolvido em 10 partes de metanol.Depois de 1 hora à temperatura ambiente removeu-se o solvente por evaporação a pressão reduzida, triturou-se o resíduo com 10 • partes de éter anidro isento de oxigénio e isolou-se o sólido por filtraçao.

Preparação 11. 2-metil-3-tio-4 5- ([6,6^^8(^,1^dicarboximetil-N-metil-hidrazino)-2;2' , 6:2^l'-terpiridina-4-¹ -il]

-2-metoxi-fenil)semicarbazida de tetra-sódio.

η n

NaOOC COONa NaOOC COONa

Ά uma mistura acabada de preparar e agitada de uma parte em peso do sal tetra-sódio de THT-isocianato preparado na Preparação 3 e 200 partes em peso de metanol, sob atmosfera de árgon à temperatura ambiente, adicionou-se rápida· mente uma solução de 1 equivalente de metil-hidrazina dissolvida em 10 partes de metanol. Depois de 1 hora à temperatura ambiente, removeu-se o solvente por evaporação a pressão reduzida, triturou-se o resíduo com 10 partes de éter anidro isento de oxigénio e isolou-se o sólido por filtração.

Preparação 12. 2-metil-3-tio-4-[2,9-di-bis(carboxi-metil)-aminometil-1,10-fenantrolin-5-il]semicarbazida de tetra-sódio

A mistura acabada de preparar e agitada deuma parte em peso do sal tetra-sódio do PheMT-isocianato preparado na preparação 5 e 200 partes em peso de metanol, sob atmosfera de árgon à temperatura ambiente, adicionou-se rápidamente uma solução de 1 equivalente de metil-hldrazlna dissolvida em 10 partes de metanol. Depois de 1 hora à temperatura ambiente, removeu-se o solvente por evaporação a pressão reduzida, triturou-se o resíduo com 10 partes de éter anidro isento de oxigénio e isolou-se o sólido por filtração.

Preparação de Conjugados de um anticorpo com TMT e com THT

Parte A- Procedimento para ligar quelatos a anticorpos

Ligou-se TMT ou THT a anticorpos por oxidação dos grupos carbo-hidratos nos anticorpos com NalO^ para produzir grupos aldeído nos anticorpos. Adicionou-se uma solução (llOml) de NaIC>4 O,1M em água purificada a lml de uma solução de 4mg/ml de anticorpo B72.3* em PBS (fosfato de sódio lOmM, NaCl 0,15M), pH 6,0. Reajustou-se o pH da solução resultante a 6,0 e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro. Depois desta incubação, removeu-se o periodato em excesso passando a solução de anticorpo através de uma coluna Sephadex G50 que tinha sido equilibrada com PBS, pH 6,0. Recolheram-se fracções de lml e retiraram-se as fracções que proporcionaram a absorvância mais elevada a 280 m.

Preparou-se uma solução 0,33M de cada agente quelante (TMT ou THT) por dissolução do agente quelante sólido em PBS, pH 6,0. Isto elevou o pH da solução a um pH superior a 9,0 de tal modo que se ajustou o pH a 6,8 aproximadamente com HCE 6M. Adicionaram-se 200 ul de cada solução quelante a porções separadas de 2ml da solução de anticorpo e ajustou-se o pH de cada solução resultante a pH 2,0. Incubou-se esta mistura durante 5 horas à temperatura

ambiente no escuro. Adicionou-se depois NaCNBHg (Aldrich 29,694 -5; 5M em NaOH 1M) a cada solução até uma concentração final de lOmM e ajustou-se o pH a 6,0 para reduzir a base Schiff formada pelo aldeído. Incubaram-se as misturas durante a noite à temperatura ambiente. Centrifugaram-se as soluções (Eppendorf Modelo 5412) para remover o quelato não dissolvido que precipitou durante a noite e concentraram-se até lml num microconcentrador Centricon 30 (Amicon). Passaram-se estas soluções através de colunas Sephadex G50 para remover o quelante em excesso e NaCNBHg. Recolheram-se fracções de lml e retiraram-se as 2 fracções de cada solução quelante contendo a absorvância mais elevada a 280nm. Fez-se a diálise das fracções retiradas de novo com acetato de sódio 0,01M, NaCl 0,15M, pH 6,0 com duas mudanças de agente tampão. Se se formavam mais precipitados durante as análises removiam-se por centrifugação.

Normalmente os conjugados produzidos por este processo possuem uma proporção entre TMT ou THT e anticorpo de 1,7 aproximadamente.

* B72.3 é um anticorpo bem conhecido para os antigenos associados a tumores colorectais que foi primeiro descrito pelo National Institute of Healt (NIH).

Parte B - Análise da proporção entre quelate e anticorpo

Determinaram-se as concentrações de anticorpo nas soluções de conjugado utilizando o ensaio de proteína BioRad utilizando imunoglubina de bovino como na proteína padrão. Determinou-se a concentração de THT por espec trofotometria utilizando o coeficiente de extinção medido a 350nm. Para um conjugado TMT-B62.3 colocou-se uma porção (aproximadamente 0,5mg) do conjugado em lml de acetato de sódio Ο,ΟΙΜ, tampão NaCl 0,15M, pH 6,0 e adicionou -se um excesso de Eu⁺³. Utilizou-se a absorvância desta solução a 330nm para determinar a quantidade de quelato nestas soluções.

Parte C - Ensaio funcional in vitro (Ensaio de imunocompetência) de conjugados anticorpo-quelato.

Revestiram-se os tubos de placas de microtitulação Linbro EIA II Plus com antigeno por adição de 100 ul/tubo de uma solução de 4 ug/ml de mucina submaxilar de bovino (Sigma N4503), um antigeno para o anticorpo B72.3, em PBS e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois de lavagem das placas, 3 vezes, com PBS, pH 6,8, bloquearam-se os tubos por adição de 200 ul/tubo de uma solução a 1% de BSA (albumina de soro de bovino, Sigma A-7906)-PBS) pH 6,8 e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavaram-se de novo as placas 3 vezes com PBS, pH 6,8.

Prepararam-se amostras dos conjugados a concentrações de 1 x 10~^M em PBS, pH 6,8 contendo 1% de soro de cavalo (Sigma S-7390) e fizeram-se diluições deste com o mesmo tampão a partir destas soluções. Adicionaram-se lOOml de cada diluição da amostra aos tubos em duplicado. Depois de uma incubação à temperatura ambiente durante 1 hora lavaram-se as placas 3 vezes com PBS, pH 6,8 e classificaram-se por adição de 100 ul por tubo de uma diluição 1:1000 de um anticorpo F(ab')2~ de rato conjugado no coelho com HRP (Jackson Labs, 315-035-047) em PBS, pH 6,8 contendo 1% de soro de cavalo. Depois de uma incubação à temperatura ambiente durante 1 hora lavaram-se os tubos 3 vezes com PBS, pH 6,8. Desenvolveu-se cor depois da adição de 100 ul por tubo de substrato ABTS-HRP (Kirkegaard and Perry Labs, Product # 506502 e 506402). Parou-se a reacção por adição de um volume igual de H2SO44N. Leu-se a cor utilizando um filtro 414 nm num instrumento Titertek Multiscan depois de 15 minutos.

Quando ensaiados por este procedimen to, verifica-se que os imuno-conjugados de B72.3 com TMT ou THT possuem imuno-reactividade comparada ao B72.3 nativo. Os dados apresentam-se nas figuras 1 e 2. A figura contém também

a curva para um complexo de escândio do conjugado B72.3-THT preparado de uma forma semelhante ao do complexo Európio descrito anteriormente.

Exemplos 1 2- Preparação e avaliação de complexos radionuclí111 90 çlicos ( In e Y) quelatos de um conjugado TMT e, como um controlo comparativo, de um conjugado DTPA.

Ensaio funcional in vivo de conjugados quelato-anticorpo. Experiências de bio-distribuição.

1. Materiais de Ensaio. Os imuno-conjugados ensaiados eram um conjugado B72.3 em TMT preparado como descrito anteriormente ou num conjugado B72.3-DTPA em que o DPTA estava ligado (através de um braço de ligação) ao carbo-hidrato oxidado no anticorpo utilizando procedimentos semelhantes aos descritos para as ligações TMT.

2. Marcação dos conjugados com radio-isótopos. Os conjugados anticorpo-quelato a serem marcados 111 90 com In ou Y estavam em solução salina de fosfato tamponada pH 6,0.

Adicionaram-se os radionuclidos (aproximadamente 1 mCl) à solução de conjugado (1 ml contendo aproximadamente Img do conjugado anticorpo-quelato), misturaram-se e incubaram-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. Removeu-se qualquer metal não quelatado de cada preparação de conjugado por filtração em gel CLEP (coluna TSK3000SW).

Gontrolou-se o efluente da coluna para as proteínas (OD280nm) e para a radioactividade (controlo da radioactividade). Calculou-se a actividade especifica dos conjugados marcados purificados a partir destes dados. Utilizaram-se os conjugados para estudos de biodistribuição imediatamente .

3. Procedimento geral. Utilizaram-se 5 ratos em cada grupo de ensaio para o estudo da biodistribuição de 90γ _e 3 _rat_{os em} cada grupo para o estudo de mIn. As doses discriminantes para cada rato foram de 10 ug de conjugado radioactivo por dose., 20-100mg de anticorpo por ml, superior a 50 uCi por dose. Injectaram-se ratos com tumor e sem tumor no dia 0.

4.Iniciação do crescimento de tumor Injectou-se cada um dos ratos sem pelo (nu/nu: Swiss Background, Taconic Farms Germantown, NY) subcutâneamente no flanco posterior esquerdo com um milhão de células LS174T na fase de crescimento exponencial, em aproximadamente 0,2ml de meio estéril ou solução salina de cultura de células.

Examinaram-se os ratos para os crescimentos do tumor até os tumores se tornarem mensuráveis.

Em seguida medfiram-se os tumores com uma aproximação de

0,lmm, através de 2 diâmetros perpendiculares (comprimento x largura) utilizando compassos digitais até o produto do 2 comprimento x a largura estar compreendido entre 50 e lOOmm para todos os ratos.

5.Protocolo de injecção. Num dia desejável depois de inoculação de células de tumor (dia 0), injectou-se cada rato com o conjugado marcado. Os anticorpos marcados com rádio para cada dose foram retirados numa seringa de insulina de lcm^ separada, com uma agulha 28G,l,27cm para cada administração. Guardaram-se 3 alíquotas de 10 ul de cada material de ensaio para a contagem gama para determinar a dose injectada.

Numerou-se cada seringa contendo o material de ensaio pela ordem de administração. Pesou-se cada seringa e contou-se num calibrador de dose para quantificar o radionuclido. Registou-se esta informação. Anestesiaram-se os ratos por injecção i.p. de 0,15ml de uma solução estéril con64

tendo HC1 a 11 mg/ml e xilazina a 3 mg/ml. Injectou-se o material de ensaio por intermédio da cavidade venosa rectro-orbital.

Contou-se a radiação em cada rato no calibrador de dose imediatamente depois da injecção e pesaram-se de novo as seringas, recontaram-se e registaram-se os dados.

6. Métodos de avaliação. Pesou-se cada animal com uma aproximação de 0,lgr no dia 0 e antes da dissecação. Imediatamente antes da formação da imagem e/ou dissecação contou-se a radiação em cada animal no calibrador de dose seguindo o procedimento de operação padrão. Contou-se a radiação de cada carcaça depois da dissecação. Imediatamente antes da dissecação, cada animal possuía o seu tumor medido com uma aproximação de 0,lmm através de dois diâmetros perpendiculares (comprimento x largura) utilizando compassos digitais.

Recolheu-se uma amostra de sangue de cada animal num tubo de cultura calibrado e depois repesou-se o tubo. Sacrificou-se cada animal por deslocamento cervical. Dissecaram-se e prepararam-se orgãos (pulmão, bexiga, figado, cólon, rim direito, rim esquerdo, tumor, medula óssea, músculo) para remover tecidos exterior e depois pesaram-se até ao miligrama aproximadamente. Determinou-se a radioactividade dos orgãos dissecados por contagem gama.

7. Resultados. As biodistribuiçoes apresentadas na figura 3 são para 6 ratos, 4 dias depois da injecção de imuno-reagentes radioactivados. Os dados do ensaio de biodistribuição de In indicam que o conjugado TMT marcado com rádio de B72.3 não descriminou a radioactividade no tumor. Embora os níveis no figado e rim fossem Çigeiramente superiores aos do conjugado B72.3-DPTA- mIn, pode utilizar-se o conjugado B72.3-TMT- In para a discrina~ 111 ção do tumor por In.

As biodistribuições apresentadas na figura 4 são de 8 dias depois da injecção do imuno-reagente radioactivo. 0 valor médio para cada grupo de 5 ratos está apresentado em gráfico para os tipos de tecidos examinados. Os dados da biodistribuição de 90γ mostram que o conjugado B72.3 90 . 90

-TMT- Y discriminou o Y no tumor assim como o conjugado ^õ

B72.3-DPTA- Y. Contudo, verificou-se consideravelmente menos 9θΥ no fémur quando se utilizou o conjugado B72.3-ΤΜΤ-^θΥ em comparação com o conjugado B72.3-ϋΡΤΑ-^θΥ. Uma vez que o fémur (medula óssea) é o orgão limitante de dose para a terapia por 9θΥ este resultado indica que o TMT é um quelato melhor para a terapia de anticorpos discriminados por radionuclidos utilizando este isótopo. Dos outros tecidos examinados verificou-se que apenas o sangue possuía um nível superior de 90

Y quando o TMT era quelato utilizado para preparar o imuno-conjugado.Acredita-se que isto é devido à superior estabilidade in vivo do complexo B72.3-TMT- 9¾ em comparação com o complexo B72.3-ϋΤΡΑ-9θΥ.

Estudo de Sobrevivência

Se o complexo B72.3-TMT- Y diminui 90 a quantidade de Y qua atinge a medula ossea em comparação com o complexo B72.3-ΤΜΤ-^θΥ e a medula óssea é o tecido limitante de dose então o rato inoculado com os conjugados devem notar o 90 conjugado B72.3-TMT- Y menos tóxico do que os inoculados com 90

B72-3-DTPA- Y. 0 procedimento geral para o ensaio desta hipótese (estudo de sobrevivência) era semelhante ao descrito para o estudo de biodistribuição com as seguintes excepções. Eram 8 os ratos com tumor em cada grupo de ensaio. 0 esquema de injecção era como se segue: administraram-se 200 UCi, 120 UCi e 120 UCI nos dias 0, 4 e 8, respectivamente para os

90 conjugados B72-3-TMT- Y ou B72.3-DTPA- Y (regime de baixa dose). As outras duas séries de ratos receberam 400 UCi, 320 UCi e 320 UCi de dois imuno-conjugados nos dias 0, 4 e 8 respectivamente (regime de dose elevada). Observou-se a sobrevivência dos ratos (não se realizou qualquer biodistribuição do material de ensaio). Os resultados (figura 5) indicam que a sobrevivência dos ratos se prolongava se se administrava 9θγ utilizando o conjugado B72.3-TMT.

TMT-Imuno-conjugado com especificidade anti-tumor.

TMT ou um seu derivado adequado pode ser conjugado com uma molécula de anticorpo para proporcionar uma molécula de conjugado anticorpo-TMT que apresenta a capacidade de se ligar a um antígeno discriminante reconhecido pela região variável de anticorpo. Uma tal molécula de conjugado pode utilizar-se para libertar um radioisótopo que é quelato pelo radical TMT para localizar e/ou tratar a lesão que é discriminada por esse imunoconjugado. Numa forma de realização preferida, o anticorpo é seleccionado de tal forma que possui uma vasta reactividade como molécula de antígeno expressa em células de tumor, proporcionando assim um conjugado anticorpo-TMT que pode libertar radioisótopos para os tumores para objectivos terapêuticos ou de diagnóstico. 0 ING-1 é um anticorpo quimérico (descrito na Patente Internacional publicação n² WO 90/02569, datada de 22 de Março de 1990) constituído por uma região variável murina e uma região constantes de imunoglobulina humana. A molécula de anticorpo é produzido por cultura de uma célula de mieloma de rato expressando o anticorpo quimérico essencialmente como descrito na publicação anteriormente referida. 0 anticorpo quimérico ING.l é utilizado a uma concentração de 5,2mg/l em tampão acetato de sódio 50nM a PH 5,6 e suplementado com NaCl 150mM. A l,5ml da solução de anticorpo adicionou-se uma solução de borato de sódio 50mM a pH 9.0 suplementada com lOOmM de cloreto de sódio até um volume total final de 2,5ml. Aplicou-se a solução a uma coluna cromatográfica PD-10 equilibrada com um tampão borato de sódio adicionado á solução de anticorpo. 0 anticorpo é eluido da coluna com 3,5ml do mesmo tampão borato de sódio.

Concentrou-se o eluido utilizando um Centricon-30 até uma concentração aproximada de 4,0mg de anticorpo quimérico ING-1 por mililitro de solução. A solução do derivado NCS de TMT (Preparação 6), isto é, TMT em que o NH₂ é substituído com NCS, (designado aqui como TMT-NCS) é pre parada no tampão borato de sódio a uma concentração de lOmg/ml e adicionada á solução de anticorpo até uma concentração final de 138uM de TMT-NCS. Mistura-se suavemente a solução e incubou-se no escuro á temperatura ambiente (apro ximadamente 22°C) durante a noite (durante aproximadamente 12 horas). Separou-se o'conjugado ING-1 do TMT-NCS livre e de outros produtos de baixo peso molecular utilizando uma coluna HPLC Superose 12 equilibrada e eluida em tampão acetato de sódio 50mM pH 5,6 suplementado com cloreto de sódio 150mM. Ensaia-se depois o imuno-conjugado TMT para a sua capacidade para se ligar ao antigeno da célula de tumor e também para se ligar ao isótopo ítrio-90 para demonstrar que o conjugado pode ser marcado com rádio no radical TMT e podia discriminar a célula de tumor.

Esta invenção foi descrita com pormenor com referência particular a determinadas formas de realização preferdias mas é de notar que podem efectuar-se variações e modificações dentro do espirito e âmbito da invenção.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - is Processo para a preparação de um imuno-reagente radioactivo discriminador caracterizado pelo facto de se incorporar um ião radionuclídico de um metal e um agente complexante numa proporção compreendida entre 1:100 e 1;1, e ainda um grupo imuno-reactivo covalentemente ligado ao referido agente complexante' de estrutura em que o radical R representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, alcoxi, alquil-tio, alquil-amino, alquil-formamido, arilo, ariloxi, heterocílico ou um grupo reactivo proteico;

   0 radical R¹ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, alcoxi, alquil-tio, alquil-amino, alquil-formamido, arilo, ariloxi, heterocíclico ou um grupo reactivo proteico;

   0 radical R² apresenta um grupo hidroxi, carboxi, hidroxi-alquilo, ácido carbonil-imino-diacético, ácido metileno-iminodiacético, ácido metileno-tio-etileno-imino-diacético, ácido hidrazinil-ilideno-diacético, 2,6 dicarboxi-piperidino ou um sal desses ácidos, ou os dois grupos R² considerados em conjunto representam os átomos necessários para completar uma estrutura em anel macrocíclico contendo pelo menos um sitio de coordenação do heteroátomo e pelo menos um grupo alquileno formando parte da estrutura em anel;

   0 radical R3 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, alcoxi, alquil-tio, alquil-amino, alquil-formamido, arilo, ariloxi, heterocíclico ou um grupo reactivo proteico;

   0 radical R⁴ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo reaç tivo proteico;

   0 simbolo n representa um inteiro compreendido entre 0 e 4;

   0 simbolo 0 representa o inteiro 0 ou 1;

   0 simbolo m representa o inteiro 0 ou 1;

   desde que pelo menos um dos símbolos nem seja 0 e pelo menos nm dos radicais R, R© R³ e R⁴ seja um grupo reactivo proteico.

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o agente complexante possuir a estrutura:

   R²

   R¹

   R² em que os radicais R¹, r² e R³ possuem as significações anteriormente definidas.

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o agente complexante possuir a estrutura:

   anteriormente definidas e o símbolo n representa um inteiro compreendido entre 0 e 4.

   - 4* Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido agente complexante pos suir a formula estrutural,

   R em que o radical R representa um grupo de fórmula __ OCHg

   NH2 os radicais R¹ e R³ representarem o átomo de hidrogénio e o radical R³ representar um grupo

   - N (CH3)N(CH₂COOH)2 ou o radical R representa um grupo .— och₃ nh₂ os radicais R¹ e R³ representam o átomo de hidrogénio e o radi cal R^ representa um grupo

   -CH₂N(CH₂COOH)₂

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o agente complexante possuir a fófcmula estrutural:

   P⁴ P⁴ em que os radicais , r3 e P⁴ possuem as significações definidas na reivindicação 1.

   - 6^ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido grupo reactivo proteico ser seleccionado no grupo constituído por amino, alquil-amino, aril-amino, hidrazino, alquil-hifrazino, aril-hidrazino, carbazido, semicarbazido, tio-carbazido, tio-semicarbazido, sulfidrilo, sulfidril-alquilo, sulfidril-arilo, hídroxi, carboxi, carboxi-alquilo, carboxi-arilo, grupos contendo átomos de halogéneo activos, etil-carbonilo substituído por um grupo removível na posição 2, etil-sulfonilo, vinil-sulfonilo, vinil-carbonilo, epoxi, isocianato, isotiocianato, aldeído, aziridina, succinimidoxicarbonilo; grupos acilo activados e anidridos mistos.

   _ 7a _

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o grupo imuno-reactivo ser seleccionado no grupo constituído por enzimas aminoácidos, polipeptidos, proteínas, lipoproteinas, glicoproteinas, hormonas, fármacos, esteróides, vitaminas, polissacaridos, virus, protozoários, fungos, parasitas, rickettsiaceas, bolores, componentes do sangue, componentes de tecidos e de orgãos, produtos farmacêuticos, haptenos, lac72 - tinas, toxinas, ácidos nucleícos, anticorpos, substâncias antigénicas, avidina e biotina.

   - 85 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o grupo imuno-reactivo ser um anticorpo.

   - 9 § Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido grupo imunoreactivo ser um anticorpo seleccionado no grupo constituído pelos anticorpos B72.3, 9.2.27, D612, UJ13A, NRLU-10, 7E11C5, CC49, TNT, PR1A3,ING-1, B174 e B43.

   - 10^â Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o anticorpo ser ING-1.

   - Il³ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o ião radionuclídico de um metal ser 90γ+++.

   - 125 _

   Processo para a preparação de uma composição para a formação de imagens para diagnóstico caracterizado pelo facto de se incorporar um imuno-reagente radioactivo quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações anteriores e um adjuvante fisiologicamente aceitável.

   - 135 _

   Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado pelo facto de se incor73

   Jf porar uma quantidade eficaz de um imuno-reagente radioactivo quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações anteriores e um veículo farmaceuticamente aceitável.

   A requerente reivindica as prioridades dos pedidos de patente norte-americanos