TW201136606A - Anticoagulant antidotes - Google Patents

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201136606 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於醫藥領域，特定言之係指抗凝血劑治療之 領域。 【先前技術】 抗凝血劑為預防血液凝固之物質；意即，抗凝血劑可以 使血液停止凝固。抗凝血劑廣泛用於作為治療人類血栓性 疾病之藥物，例如，預防易感者一級及次級深靜脈血栓形 成、肺栓塞、心肌梗塞及中風。 一類重要的口服抗凝血劑係藉由拮抗維生素κ效應而作 用的，例如，包括華法林（warfarin)在内之香豆素。第二類 化合物是經由輔因子（諸如，抗凝血酶III或肝素輔因子II) 間接抑制凝血，此包括數種低分子量之肝素產物，該等肝 素產物係經由抗凝血酶III主要催化抑制Xa因子（及針對凝 血酶之程度較小）（貝米肝素(bemiparin)、舍托肝素(certoparin)、 達肝素（dalteparin)、依諾肝素（enoxaparin)、那屈肝素 (nadroparin)、帕肝素（parnaparin)、瑞肝素（reviparin)、亭 扎肝素（tinzaparin)、小鏈募糖（方達帕魯（fondaparinux)、 艾屈帕魯（idraparinux))經由抗凝血酶III僅抑制Xa因子。類 肝素（達那肝素（danaparoid)、舒洛地特（sulodexide)、硫酸 皮膚素（dermatan sulfate))經由兩種輔因子起作用，且抑制 Xa因子及凝血酶兩者。第三類則為凝血之直接抑制劑。直 接Xa因子抑制劑包括阿派沙班（apixaban)、伊多沙班 (edoxaban)、奥米沙班（otamixaban)、利伐沙班（rivaroxaban)， 152708.doc 201136606 及直接凝血酶抑制劑包括二價水經素（比伐盧定 (bivalirudin)、來匹盧定（lepimdin)、地西盧定（desirudin))、 及單價化合物阿加曲班（argatroban)及達比加群 (dabigat.ran) 〇 由於血液凝固係停止出血之生物機制，因此抗凝血劑治 療之副作用是可能發生有害的出血情況。因此需要提供一 種能夠阻止當此等抗凝血劑相關出血情況發生時之解毒劑 (Zikda 及 Ansell，Current Opinion in Hematology 2009, 16(5): 347-356)。一種實現此目標之方法係在投與抗凝血 劑後’中和病患體中所存在之抗凝血劑化合物活性。 目前可使用之抗凝血劑解毒劑為魚精蛋白（用於中和肝 素）及維生素K(用於中和類似華法林之維生素κ枯抗劑）。 對於罹患嚴重創傷及嚴重出血且接受低分子量肝素治療之 病患而言，新鮮冰凍血漿及重組因子VIIa亦可作為非特異 性解毒劑使用（Lauritzen B·等人，Blood，2005，607A- 608A·) »亦有報導指出魚精蛋白片段（美國專利第6 624 14i 號）及小合成肽（美國專利第6,200,955號）可作為肝素或低分 子量肝素解毒劑之用；及凝血酶蛋白變體（美國專利第 6,060,300號）可作為凝血酶抑制劑之解毒劑之用。已有報 導指出凝血酶原中間體及衍生物可作為水蛭素及合成凝血 酶抑制劑解毒劑之用（美國專利第，817,3〇9號及第6,〇86,871 號）。對於直接Xa因子抑制劑而言，已有報導指出失活χ& 因子類似物可作為解毒劑之用（W〇 2009042962)。此外， 重組VIIa因子業已用以逆轉間接抗凝血酶III依賴性Xa因子 152708.doc 201136606 抑制劑（諸如，方達帕魯及艾屈帕魯）之效應（Bijsterveld NR 等人，Circulation，2002，106:2550-2554 ； Bijsterveld NR等人，British J. of Haematology，2004(124): 653-658)。 有關抗凝血劑逆轉之方法之綜述提供於Schulman及 Bijsterveld，Transfusion Medicine Reviews 2007: 21(1)， 37-48中。 需要提供針對抗凝血劑療法提供經改良之解毒劑，且特 定言之，係針對類似達比加群之直接凝血酶抑制劑提供解 毒劑，此特異性解毒劑至今尚無人揭示。 【發明内容】 在一個態樣中，本發明係關於一種能夠中和抗凝血劑之 活性之抗體分子。 在另一態樣中，該抗體分子針對抗凝血劑具有結合特異 性。 在另一態樣中，該抗凝血劑係一種直接凝血酶抑制劑、 Xa因子抑制劑、或維生素K拮抗劑。 在另一態樣中，該抗凝血劑係達比加群（dabigatran)、阿 加曲班（argatroban)、美拉加群（melagatran)、希美加群 (ximelagatran)、水虫至素（hirudin)、比伐盧定（bivalirudin)、 來匹盧定（lepirudin)、地西盧定（desirudin)、阿D底沙班 (apixaban)、奥米沙班（otamixaban)、利伐沙班（rivaroxaban)、 去纖維蛋白多核苦酸（defibrotide)、雷馬曲班（ramatroban)、 抗凝血酶 III、或地克精-a(drotrecogin alpha)。 在另一實施例中，該抗凝血劑係通式（I)之經二取代之二 152708.doc 201136606 環系雜環’及其互變異構體、立體異構體及鹽：

Ra - A - Het - B - Ar - E ,(I) 其中 A表示連接至該Het基之苯并基、吡啶并基或噻吩并基部 份基團之羰基或磺醯基， B表示伸乙基，其中連接至該Ar基之亞曱基可經氧或硫 原子或經-NR!-基置換，其中

Rl表不氣原子或C〗.4-烧基， E表示RbNH-C(=NH)-基，其中

Rb表示氫原子、羥基、C!·9-烷氧基羰基、環己氧基 幾基、苯基- Ci·3-院氧基幾基、苯曱醯基、對 基-苯曱醯基或吡啶酼基，同時上述〇^_9-烷氧基幾基 之2-位置中之乙氧基可再經匸丨·3·烷基磺醯基或 烷氧基）-乙基取代，

Ar表示視情況經氣原子或經甲基、乙基或甲氧基取代之 1,4-伸笨基，或其表示2,5-伸嗟吩基，

Het表示l-(Ci.3·烧基）-2,5-伸苯并。米n坐基、ι_環丙基·2,5_ 伸苯并咪唑基、2,5·伸苯并噻唑基、烷基）-2,5-伸 吲哚基、l-(Ci-3-院基）-2,5-伸咪唑并[4,5-1>]°比咬基、3-(Ci.3-烷基）-2,7-伸咪唑并[l，2-ap比啶基或1-((^.3-烷基）-2,5-伸噻 吩并[2,3-d]咪唑基，及 Ra表示R2NR3-基，其中 係Clc烷基’其可經羧基、Ci-6-烷氧基羰基、苄 氧基羰基、Cn-烷基磺醯胺基羰基或1H-四唑-5-基取 152708.doc -6 - 201136606 代， c：2·4-烷基’其可經羥基、苄氧基、羧基_Ci 3_烷基 胺基、C^-烷氧基羰基_Cl3_烷基胺基、 基）-羧基-Cw烷基胺基或N_(Cl 3_烷基）_Ci-3_烷氧基羰 基-Ci·3-烷基胺基取代’同時在上述基團中，與氮原 子相鄰之α-位置中之碳原子可未經取代， R·3表示C：3·7-環烷基、炔丙基（其中該不飽和部份可 不直接連接至該RZNR3基之氮原子）、視情況經氟或氣 原子、或經甲基或曱氧基取代之苯基、視情況經曱基 取代之吡唑基、嗒唑基或。比啶基，或 R2及R3與在其之間的氮原子一起表示5-或7-員伸環 烷基亞胺基’其視情況經羧基或Ck烷氧基羰基取 代，其可再與笨基環稠合。 在另一實施例中，該抗凝血劑係選自以下之化合物： (a) 2-[N-(4-曱脒苯基）-胺基曱基]-苯并嗟嗤_5_缓酸-N-苯基-N-(2-羧乙基）-醯胺、 (b) 2-[N-(4-甲脒苯基）-N-甲基-胺基曱基]•笨并噻唑_5_ 基-羧酸-N-苯基-N-(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (c) 1-曱基-2-[N-(4-甲脒苯基）-胺基曱基]-苯并咪唑_5_ 基-叛酸-N-苯基·Ν-(2-經基幾基乙基）-酿胺、 (d) 1-甲基-2-[Ν-(4-甲脒苯基）-胺基甲基]-苯并咪唑_5· 基-羧酸-Ν-苯基-Ν-(3·羥基羰基丙基）-醯胺、 (e) 1 -曱基- 2-[Ν-(4-曱眯苯基）-胺基曱基]•笨并η米吐-5· 基-羧酸-Ν-(2-η比啶基）-Ν-(羥基羰基曱基）_醯胺、 152708.doc 201136606 (f) 1-甲基-2-[2-(2-曱脒基噻吩-5_基）乙基]-苯并味唾·5_ 基-羧酸-N-(2-吡啶基）-Ν-(2·羥基羰基乙基）-醯胺、 (g) 1-甲基-2-[Ν-(4-甲脒苯基）-胺基甲基]-苯并咪唾·5_ 基-叛酸-Ν-(2-。比咬基）-Ν-(2_經基幾基乙基）_醯胺、 (h) 1-甲基-2-[2-(4-甲脒苯基）乙基]•苯并味0坐_5_基_緩 酸-Ν-(2-咬啶基）-Ν-(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (Ο 1-甲基-2-[2-(4-曱脉苯基）乙基]•苯并味。坐_5_基_幾 酸-Ν-本基-Ν-(2-經基幾基乙基）-酿胺、 (j) 丨_甲基-2-[2-(4-甲脒苯基）乙基]-苯并咪唾_5_基緩 酸-N-苯基-Ν-[2-(1Η-四唾-5-基）乙基]-醯胺、 (k) 1-曱基-2-[N-(4-甲脒苯基）-胺基甲基]-苯并咪唑_5_ 基-羧酸-N-苯基-Ν-[2-(1Η_四唑-5-基）乙基]-醯胺、 ⑴1-曱基-2-[N-(4-曱脒苯基）-N-甲基-胺基甲基]-笨并 咪唾-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基）-N-(2-羥基羰基乙基）·醯胺、 (m) 1-甲基-2-[N-(4-曱脒苯基）-N-曱基-胺基曱基]-苯并 咪"坐-5·基-羧酸_N-(3-吡啶基）-N-(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (η) 1-甲基·2-[Ν-(4-甲脒苯基）·Ν-甲基-胺基甲基]-苯并 味。坐-5-基·缓酸苯基-Ν-(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (〇) 1-甲基-2-[Ν-(4-甲肺苯基）·胺基甲基]-苯并咪唑·5- 基-叛酸-Ν-苯基-Ν·[(Ν-羥基羰基乙基-Ν-甲基）-2-胺基乙 基]·酿胺、 (P) 1-甲基-2-[N-(4-曱脒苯基）-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-缓酸-N-(3-氟苯基）-N-(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (q) 1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基）-胺基甲基]•苯并咪唑-5- 152708.doc 201136606 基-羧酸-N-(4-氟苯基）·Ν-(2·羥基羰基乙基）_醯胺' (Ο 1-曱基-2-[Ν-(4_甲脒基_2_甲氧基_苯基）_胺基曱基]· 苯并咪唑-5-基-羧酸-Ν-苯基_Ν_(2_羥基羰基乙基）_醯胺、 (s) 1-曱基-2-[Ν-(4-甲脒基_2_曱氧基_苯基）_胺基甲基]_ 苯并咪唑-5-基-羧酸-Ν-(2-η比啶基）·Ν_(2-羥基羰基乙基）_醯 胺、 ⑴1-曱基-2-[Ν-(4-曱脒苯基）胺基曱基]•吲哚·5_基-叛 酸-Ν-苯基-Ν_(2_甲氧基羰基乙基）_醯胺、 (u) 1-甲基-2-[Ν-(4-甲脒笨基）胺基曱基卜噻吩并[2.3_d] °米。坐-5-基-羧酸苯基·Ν-(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 Ο) 1-甲基-2-[Ν-(4-甲脒笨基）_胺基曱基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-Ν-苯基_Ν-(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (w) 1-甲基-2-[Ν-(4-曱脒苯基）-胺基曱基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-Ν-(2-吡啶基）-Ν-(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (X) 1-甲基-2-[Ν-(4-甲脒基-2-甲氧基-苯基）-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-Ν-(2-吡啶基）-Ν-(2-羥基羰基乙基）-醯 胺、 (y) 1-曱基-2-[Ν-[4-(Ν·正己氧基羰基甲脒基）苯基]-胺基 甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-Ν-(2-«比啶基）-Ν-(2-乙氧基羰基 乙基）-醯胺、及 其互變異構體、立體異構體及鹽。 在另一態樣中，該抗體分子係多株抗體、單株抗體、人 類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、抗體之片段（特定言之 Fab、Fab'、或F(ab')2片段）、單鏈抗體（特定言之單鏈可變 152708.doc 201136606 片& (scFv))、域抗體、奈米抗體、雙功能抗體、或 DARPin。 在另一態樣中，本發明係關於一種如上所述之抗體分 子，其係用於醫藥中。 在另一態樣中，本發明係關於一種如上所述之抗體分 子’其係用於治療抗凝血劑療法所產生之副作用。 在另一態樣中，該副作用係出血。 在另一態樣中，本發明係關於一種治療抗凝血劑療法所 產生之副作用的方法，該方法包括將有效量之如上所述抗 體分子投與有此需要之病患。 【實施方式】 在一個態樣中，本發明係關於一種能夠中和抗凝血劑之 活性之抗體分子。 抗體（亦稱為免疫球蛋白，縮寫為Ig)係發現於脊椎動物 血液或其他體液之γ球蛋白蛋白質，且可藉由免疫系統用 以識別及中和外來物體，諸如細菌及病毒。該等抗體通常 係由各具有兩個大重鏈及兩個小輕鏈之基本結構單元所組 成，以形成（例如）具有1個單元之單體、具有2個單元之二 聚體或具有5個單元之五聚體。抗體可藉由非共價鍵相互 作用而結合至所謂的抗原之其他分子或結構。此結合係具 有特異性的，也就是抗體會以高親和力方式僅結合至特= 結構《被抗體所識別之抗原的獨特部分稱為抗原決定基或 抗原決定簇。結合至該抗原決定基之抗體部分有時稱為互 補位，且位於該抗體之所謂的可變域或可變區（Fv)中。該 152708.doc •10· 201136606 可變域包括三個被框架區（FR)隔開之所謂的互補決定區 (CDR)。 在本發明上下文中，所稱提及CDr係根據chothia的定義 (Chothia及 Lesk，J. Mol. Biol. 1987，196: 901-917)、及 Kabat(E.A. Kabat、T.T· Wu、H. Bilofsky、M. Reid-Miller 及 H. Perry > Sequence of Proteins of Immunological

Interest，National Institutes of Health，Bethesda (1983))。 相關技藝業已進一步開發出抗體’且使該等抗體成為醫 學及技術中具有多功能的工具。因此，在本發明上下文 中，術語「抗體分子」或「抗體」（本文係以同義詞使用） 並不但包括自然界中所發現的抗體，此抗體包括（例如）兩 條輕鍵及兩條重鍵，或僅兩條重鍵（如在路乾物種中），也 包括所有包含至少一個具有抗原結合特異性之互補位及具 有與免疫球蛋白可變域類似結構之分子。 因此’本發明抗體分子可為多株抗體、單株抗體、人類 抗體、人源化抗體、嵌合抗體、抗體之片段（特定言之 Fv、Fab、Fab，、或F(ab，)2片段）、單鏈抗體（特定言之單鏈 可變片段（scFv))、小模組化免疫藥劑（SMIP)、域抗體、奈 米抗體、雙功能抗體。 多株抗體意謂具有不同胺基酸序列之抗體分子的集合， 且可藉由技術所熟知之方法，從經接受抗原免疫後之脊椎 動物的血液中獲得。 單株抗體（mAb或moAb)係胺基酸序列相同之單一特異性 抗體，單株抗體係藉由融合瘤技術’從（被稱為融合瘤）雜 152708.doc 201136606 交細胞株製備產生的’該稱為融合瘤之雜交細胞係指可產 生特異性抗體之B細胞與骨髓瘤（B細胞癌）細胞融合之純系 (Kohler G ' Milstein C » Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975;256:495-7·)。或者’可藉由在宿主細胞中之重組表現 法，製備單株抗體（Norderhaug L、Olafsen T、Michaelsen TE、Sandlie I. (1997 年 5 月），「Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells」，J Immunol Methods 204 (1): 77-87 ;參見下文）。 對應用於人類而言，降低原來衍生自其他物種（如小鼠） 之抗體的免疫原性往往才會令人滿意。此可藉由構建嵌合 抗體，或藉由稱為「人源化」之方法來實現。在本文中， 「嵌合抗體」應理解成包含衍生自一種物種（例如，小鼠） 之序列部分（例如’可變域）融合至衍生自不同物種（例如， 人類）之序列部分（例如’不變域）之抗體。「人源化抗體」 係一種包括原來衍生自非人類物種之可變域的抗體，其中 某些胺基酸經發生突變’使該可變域整體序列更類似接近 於人類可變域之序列《抗體之嵌合化及人源化之方法也是 相關技術所熟知的（Billetta R、Lobuglio AF，「Chimeric antibodies」.Int Rev Immunol. 1993; 10(2-3):165-76 ;

Riechmann L ' Clark M ' Waldmann H ' Winter G (1988) > 「Reshaping human antibodies for therapy」’Nature: 332:323)。此外’業已開發以衍生自人類基因序列為基礎 152708.doc •12· 201136606 以產生抗體之技術，例如藉由噬菌體呈現技術或使用轉殖 基因動物（WO 90/05144 ; D. Marks、H.R. Hoogenboom、 T.P. Bonnert、J. McCafferty、A.D. Griffiths及 G. Winter (1991)， 「By-passing immunisation. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage.」 J. Mol. Biol.， 222, 581-597 ； Knappik 等人，J. Mol. Biol. 296: 57-86, 2000 ; S. Carmen 及 L. Jermutus， 「Concepts in antibody phage display」，Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2):189-203 ; Lonberg N、Huszar D， 「Human antibodies from transgenic mice」 ，Int Rev

Immunol. 1995; 13(1):65-93 ； Bruggemann M ' Taussig MJ ， 「Production of human antibody repertoires in transgenic mice」，Curr Opin Biotechnol. 1997年 8月， 8(4):455-8)。此等抗體係本發明上下文中之「人類抗 體」。 本發明抗體分子亦包括保有抗原結合特性之免疫球蛋白 片段，如Fab、Fab·、或F(ab')2片段。藉由免疫球蛋白之斷 裂（例如藉由蛋白質消化）或藉由重組表現此等片段可獲得 此等片段。例如，藉由常規技術，例如，使用木瓜蛋白酶 或胃蛋白酶（WO 94/29348)、或内切蛋白酶Lys-C(Kleemann等 人，Anal. Chem. 80，2001-2009，2008)可完成免疫球蛋白 消化作用。以木瓜蛋白酶或Lys-C消化抗體通常會產生兩 個相同稱為Fab片段之抗原結合片段（每一片段具有單一的 抗原結合位點）及殘留之Fc片段。經胃蛋白酶處理則會產 152708.doc •13· 201136606 生F(ab’）2。藉由宿主細胞中重組表現製備Fab分子之方法 詳細說明於下文中。 已開發出多種技術，以將免疫球蛋白可變域、或衍生自 此等可變域之分子置於不同的分子背景内。根據本發明， 此等亦應視為「抗體分子」。一般而言，此等抗體分子在 尺寸上小於免疫球蛋白，且包括單一胺基酸鏈或由數條胺 基酸鏈組成。例如，單鏈可變片段（scFv)係免疫球蛋白重 鏈及輕鏈之可變區的融合體，利用.短鏈結（通常係絲胺酸 (S)及甘胺酸（G))連在一起（WO 88/01649 ; WO 91/17271 ; Huston等人，International Reviews of Immunology，第 10 卷，1993，195 - 217)。「單域抗體」或「奈米抗體」在單 一之類Ig域中具有抗原結合位點（WO 94/04678 ; WO 03/05053 1 ; Ward 等人，Nature. 1989 年 10 月 12 日；341 (6242):544-6 ; Revets 等人，Expert Opin Biol Ther. 5(1):1 1 1-24, 2005)。一或多個具有針對相同或不同抗原之 結合特異性之單域抗體可連在一起。雙功能抗體係由兩條 胺基酸鏈（其包括兩個可變域）組成之二價抗體分子（WO 94/13804 ; Holliger等人，Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 年7月15日；90(14):6444-8)。類抗體分子之其他實例係免 疫球蛋白超級家族抗體（IgSF ; Srinivasan及Roeske， Current Protein Pept. Sci. 2005，6(2): 185-96)。有一種不 同概念導致所謂之小模組化免疫藥劑（SMIP)，其包括連接 至單鏈鉸鏈之Fv域及缺乏不變域CH1之效應物域（WO 02/056910)。 152708.doc -14- 201136606 在另一態樣中，本發明抗體分子甚至可能與免疫球蛋白 可變域僅具有遠距結構相關性，或根本沒有此等相關性， 只要其具有相當於免疫球蛋白可變域之一定的結合特異性 及親和力即可。此等非免疫球蛋白「抗體模擬物」（有時 稱為「蛋白質主幹」）可能基於蛋白質A、載脂蛋白、纖維 網蛋白域、錨蛋白共同序列重複域、及硫氧還蛋白之基因 (Skerra > Current Opinion in Biotechnology 2007, 18(4): 295-304)。本發明上下文中之較佳實施例係抗體分子設計 之錨蛋白重複蛋白（DARPin's ; Steiner等人，J Mol Biol. 2008 年 8 月 24 曰；382(5): 121 1-27 ； Stumpp MT、Amstutz P » Curr Opin Drug Discov Devel. 2007年 3 月；10(2):153-9)。 可將抗體分子融合（成為融合蛋白）或另外連接（藉由共價 鍵或非共價鍵）至對該抗體分子之特性具有所需影響之其 他分子實體。例如，可能需要改善抗體分子之藥物動力學 性質、（例如）體液（如血液）中之安定性，特定言之在單鏈 抗體或域抗體之情況下。已在此方面開發諸多技術，特定 言之延長此等抗體分子在循環中之半衰期（如聚乙二醇 化）（WO 98/25971 ; WO 98/48837 ; WO 2004081026)、將抗 體分子與對血清蛋白質（如白蛋白）具有親和力之另一抗體 分子融合或共價附接（WO 2004041865 ; WO 2004003019)、 或使抗體分子表現為具有全部或部份血清蛋白（如，白蛋 白或轉鐵蛋白）之融合蛋白質（WO 01/79258)。 在另一態樣中，抗體分子具有針對抗凝血劑之結合特異 152708.doc •15- 201136606 性。「結合特異性」意指抗體分子對該抗凝血劑的結合親 和力顯著高於對結構上無關之分子的結合親和力。 親和力係抗體分子上之單一抗原結合位點與單一抗原決 定基之間的相互作用。其以締合常數KA=kass/kdiss、或離解 常數 KD=kdiss/kass表示。 在本發明之一態樣中，如藉由表面電漿共振分析法 (Malmqvist M.， 「Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics·」，Curr Opin Immunol. 1993 Apr; 5(2):282-6.)所 測定，該抗體與抗凝血劑之結合親和性之KD值範圍為1 pM至100 μΜ，較佳係1 pM至1 μΜ。亦可使用動態排除檢 定（KinExA)技術，測量抗體親和性（Darling, R.J.及Brault P-A. > 「Kinetic exclusion assay technology: Characterization of Molecular Interactions.」，ASSAY and Drug Development Technologies. 2004年 12月，2(6): 647-657) ° 可藉由稱為親和性成熟之方法，來增強抗體分子之結合 親和性（Marks 等人，1992, Biotechnology 10:779-783 ; Barbas,等人，1994，Proc. Nat. Acad. Sci，USA 91:3809-3813 ; Shier等人，1995，Gene 169:147-155)。因此，本發 明亦包括親和性成熟之抗體。 在本發明另一態樣中，該抗體分子能夠中和抗凝血劑之 活性。意即，在與該抗體分子結合之後，該抗凝血劑即無 法發揮其抗凝血活性，或此活性程度已顯著下降。當針對 所討論之抗凝血劑採用適當活性試驗，特定·言之係採用對 152708.doc -16- 201136606 凝血酶敏感之凝血試驗，如蛇靜脈酶（ecarin)凝血時間或 凝血酶凝血時間測定時（H. Bounameaux、Marbet GA、 Lammle B,等人，「Monitoring of heparin treatment. Comparison of thrombin time, activted partial thromboplastin time, and plasma heparin concentration, and analysis of the behaviour of antithrombin III」，American Journal of Clinical Pathology 1980 74(1): 68-72)，抗體結合後之抗凝血劑活 性會下降至少2倍、5倍、10倍、或100倍較佳。 爲製造本發明抗體分子，熟習此項技術者可自多種相關 技術已熟知之方法中選擇（Norderhaug等人，J Immunol Methods 1997，204 (1): 77-87 ; Kipriyanow及 Le Gall， Molecular Biotechnology 26: 39- 60，2004 ; Shukla等人， 2007, J. Chromatography B，848(1): 28-39) ° 抗凝血劑係相關技藝已熟知，如上文所述。在本發明另 一態樣中，該抗凝血劑係直接凝血酶抑制劑、Xa因子抑制 劑、或維生素K拮抗劑。維生素K拮抗劑之實例係包括華 法林在内之香豆素。Xa因子之間接主要抑制劑實例係經由 抗凝血酶III之活化產生作用之肝素類物質，其包括數種低 分子量之肝素產物（貝米肝素（bemiparin)、舍托肝素 (certoparin)、達肝素（dalteparin)、依諾肝素（enoxaparin)、 那屈肝素（nadroparin)、帕肝素（parnaparin)、瑞肝素 (reviparin)、亭扎肝素（tinzaparin))、某些寡酶（方達帕魯 (fondaparinux)、艾屈帕魯（idraparinux))、類肝素（達那肝 素（danaparoid)、舒洛地特（sulodexide)、硫酸皮膚素 152708.doc -17- 201136606 (dermatan sulfate))，及Xa因子之直接抑制劑（阿略沙班 (apixaban)、奥米沙班（otamixaban)、利伐沙班（rivaroxaban)) 〇 凝血酶抑制劑之實例包括二價水蛭素（比伐盧定 (bivalirudin)、來匹盧定（lepirudin)、地西盧定（desirudin))、 及單價化合物阿加曲班（argatroban)及達比加群 (dabigatran) 〇 因此’在另一態樣中’該抗凝血劑係達比加群、阿加曲 班、美拉加群（melagatran)、希美加群（ximelagatran)、水 虫至素、比伐盧定（bivalirudin)、來匹盧定（lepirudin)、地西 盧定（desirudin)、阿哌沙班、奧米沙班、利伐沙班、去纖 維蛋白多核苷酸、雷馬曲班（ramatroban)、抗凝血酶III、 或地克精-(X。 在另一實施例中，該抗凝血劑係通式（I)之經二取代之二 環系雜環，及其互變異構體、立體異構體及鹽：

Ra - A - Het - B - Ar - E ,(1) 其中 A表示連接至該Het基之苯并基、n比啶并基或噻吩并基之 羰基或磺醯基， B表示伸乙基’其中連接至該Ar基之亞甲基可經氧或硫 原子或經-NR!-基置換，其中

Ri表示氫原子或Ck烷基， E表示RbNH-C(=NH)-基，其中

Rb表示氫原子、羥基、C〗·^烷氧基羰基、環己氧基 幾基、苯基-C〗_3-烷氧基羰基、苯曱醯基、對_c丨.3-烷 I52708.doc 201136606 基-苯甲醯基或吡啶醯基，同時上述Ci 9_烷氧基羰基 之2_位置中之乙氧基可再經匸^-烷基磺醯基或2-((:,-3-烷氧基）-乙基取代，

Ar表示視情況經氯原子或經甲基、乙基或甲氧基取代之 1,4 -伸本基，或其表示2,5 -伸嘆吩基，

Het表示1_(Ci-3·烷基）-2,5-伸苯并咪唑基、丨_環丙基_25_ 伸苯并咪唑基、2,5-伸苯并噻唑基、•烷基）_2,5•伸 吲哚基、1-((：丨-3-烷基）_2,5_伸咪唑并[4,5_b]吡啶基、3-(0^-3-烷基）-2,7-伸咪唑并n，2_a]。比啶基或^烷基）_2,5_伸噻 吩并[2,3-d]咪唑基，及

Ra表不R2NR3_基，其中 R2係Ck烷基，其可經羧基、Ci6_烷氧基羰基、苄 氧基幾基' C!·3·烷基磺醯胺基羰基或1H_四唑_5_基取 代， ο：2·4·烷基，其可經羥基、苄氧基、羧基_Ci3_烷基 胺基、Cw烧氧基羰基_Ci3_烷基胺基、 基）缓基-Cw-燒基胺基或N_(Ci3_烷基）_Ci3_烷氧基羰 基-Ci·3·炫基胺基取代，同時在上述基團中，與氮原 子相鄰之α-位置中之碳原子可未經取代， R3表示C3_7-環烷基、炔丙基（其中該不飽和部份可 不直接連接至該hNR3基之氮原子）、視情況經氟或氯 原子、或經甲基或曱氧基取代之苯基、視情況經甲基 取代之吡唑基、嗒唑基或吡啶基，或 R2及R3與在其之間的氮原子一起表示5_或7_員伸環 152708.doc •19· 201136606 烷基亞胺基，其視情況經羧基或Ci4_烷氧基羰基取 代，可再與苯基環稠合， 式⑴化合物、該等化合物之製法及其作為抗凝血劑之用 途已描述於WO 98/37075中。 在另一貫施例中，該抗凝血劑係選自以下之化合物： (a) 2-[N-(4-甲脒苯基）-胺基曱基]_苯并嗔唑_5_叛酸_N_ 笨基-N-(2-羧乙基）-醯胺、 (b) 2-[N-(4-甲脒苯基）-N-曱基-胺基甲基]_苯并噻唑_5_ 基-羧酸-N-苯基-N-(2-經基幾基乙基）_醢胺、 (c) 1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基）_胺基曱基]-苯并咪唑_5_ 基-叛酸-N-苯基-N-(2-經基幾基乙基）_醯胺、 (d) 1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基）_胺基曱基]•苯并咪唑5-基-敌酸-N-苯基-N-(3-經基幾基丙基）·醯胺、 (e) 1-曱基-2-[N-(4-曱脒苯基）_胺基曱基]_苯并咪唑_5_ 基-羧酸-N-(2_吡啶基）-N-(羥基羰基甲基>醯胺、 (f) 1-曱基-2-[2-(2-甲脒基噻吩·5-基）乙基]_苯并咪唑_5_ 基-叛酸-Ν-(2-«比啶基）-Ν-(2-羥基幾基乙基醯胺、 (g) 1-曱基-2-[Ν-(4-甲脒苯基）·胺基甲基]•笨并〇米。坐-5_ 基-羧酸-Ν-(2-吡啶基）-Ν-(2-羥基羰基乙基醯胺、 (h) 1·甲基-2-[2-(4_甲脒苯基）乙基]_苯并咪唑巧基·羧 酸-N-(2-。比啶基）-N-(2-羥基羰基乙基）_醯胺、 (1) 1-甲基-2-[2-(4-甲脒苯基）乙基]-苯并咪唑_5_基-叛 酸-N-苯基-N-(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (j) 1-甲基-2-[2-(4-甲脒苯基）乙基]_苯并咪唑_5基-羧 152708.doc •20- 201136606 酸-N-苯基·Ν-[2-(1 Η-四唑-5-基）乙基]-醯胺、 (k)卜甲基_2·[ν-(4-甲腓苯基）-胺基曱基]-苯并咪唑_5_ 基-羧酸-Ν-苯基_Ν-[2-(1Η-四唑-5-基）乙基]-醯胺、 ⑴1-甲基-2·[Ν-(4-甲胨苯基）-Ν-曱基-胺基曱基]-苯并 咪"坐-5-基-羧酸_Ν_(2-吡啶基）-Ν-(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (m) 1-甲基_2-[Ν-(4_曱脒苯基）-Ν-甲基-胺基甲基]-笨并 味α坐-5-基-致酸_Ν-(3-β比咬基）-Ν-(2-經基叛基乙基）-酿胺、 (η) 1-甲基-2-[Ν-(4-甲脎苯基）-Ν-曱基-胺基甲基]-笨并 咪唑-5-基-羧酸-Ν-苯基-Ν-(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (〇) 1-甲基-2-[Ν-(4-甲脒苯基）-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-Ν-苯基-Ν-[(Ν-羥基羰基乙基-Ν-甲基）-2-胺基乙 基]-酿胺、 (P) 1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基）-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(3-氟苯基）-N-(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (q) 1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基）-胺基曱基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(4-氟笨基）-N_(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (Ο 1-甲基-2-[N-(4-甲肺基-2-甲氧基-苯基）-胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-Ν-(2·羥基羰基乙基）-酿胺、 (s) 1-甲基-2-[Ν-(4-曱脒基-2-甲氧基-苯基）-胺基甲基]· 苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-^b啶基）-Ν-(2-羥基羰基乙基）-醯 胺、 (t) 1-甲基·2-[Ν-(4-甲脒苯基）胺基甲基]-吲哚-5-基-羧 酸-Ν-苯基-Ν-(2-甲氧基羰基乙基）-醯胺、 (u) 1-甲基-2-[Ν-(4-甲脒苯基）胺基甲基]-噻吩并[2.3-d] 152708.doc •21· 201136606 咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N_(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (v) 1-甲基-2-[N-(4-曱脒苯基）-胺基甲基]苯并咪唑_5_ 基-羧酸-N-苯基-N-(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (w) 1-曱基-2-[N-(4-甲脒苯基）-胺基曱基]-苯并咪唑_5_ 基-羧酸-N-(2-吡啶基）-N-(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (X) 1-甲基-2-[N-(4_曱脒基-2-甲氧基-苯基）-胺基甲基;|_ 苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-"比啶基）-N-(2-羥基羰基乙基）-醯 胺、 (y) 1-甲基-2-[N-[4-(N-正己氧基羰基甲脒基）苯基]-胺基 曱基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-吡啶基）-N-(2-乙氧基羰基 乙基）-酿胺、及 其互變異構體、立體異構體及鹽，其等全部描述於W〇 98/37075中。 本發明上下文中較佳的抗凝血劑係達比加群（CAS 211914_51·1，3-[(2-{[4·(己氧基羰基胺基-亞胺基-甲基苯 基胺基]-甲基}-1-甲基-1Η-苯并咪唑-5-羰基）-吡啶-2-基-胺 基]-丙酸乙酯），其具有化學式（11):

達比加群係自WO 98/37075已知，其揭示具有凝血酶抑 152708.doc -22- 201136606 制作用及延長該凝血酶時間之作 基-2- 1 之作用之化合物，名稱為1-甲

并咪 胺°亦可參見Hauel等人，j Med 66 ° 達比加群係呈式（III)前藥提供：

該式（in)化合物（稱為達比加群醋（dabigatran etexiiate)， CAS 211915-06-9)進入人體後即轉化為活性化合物（π)。 達比加群主要適應症係手術後預防深靜脈血栓形成、治 療經確診之深靜脈血栓形成及預防罹患心房纖維性顫動病 患中風（Eriksson等人，Lancet 2007, 370 (9591)·· 949-56; Schulman S等人，N Engl J Med 2009, 361 (24): 2342-52 ; Connolly S等人 ’ N Engl J Med 2009, 361 (12): 1 139-51)。 在人體内’羧酸根部分基團之葡糖醛酸化係達比加群之 主要人體代謝途徑（Ebner等人，Drug Metab· Dispos. 2010, 38(9):1567-75)。其結果形成了卜〇-醯基葡糖苷酸（β雙旋異 構體）。該1-0-醯基葡糖苷酸除了少數水解為糖苷配基 外’亦可在水溶液中發生非酶性醯基轉移，導致形成2_〇_ 、3-0-、及4-0-醯基葡糖苷酸。使用純化之ι_〇·醯基葡糖 152708.doc -23· 201136606 苷8夂及其異構性重排產物之實驗顯示 酶原時間征且 再使活化部份凝血 咬長之效力與達比加群相等。 在本發明另—態樣中，該抗體分 比加群酯。 會、，，。合達比加群及達 在本發明另—態樣中，該抗體分子進—步會結合達比加 群之2-0-、3_〇•、及4_〇•醯基葡糖苷酸。 、在本發明另一態樣中’該抗體分子能夠中和達比加群及 達比加群之0·醯基葡糖㈣的活性，特定言之為達比加群 之1-0-醯基葡糠苷酸之活性。 在本發明另一態樣中，該抗體分子對達比加群具有結合 特異性’且包括如圖5及6中所述之CDR序列。 在本發明另一態樣中，該抗體分子包括如圖5中所述之 重鍵CDR序列，及如圖6中所述之輕鏈CDR序列。 在本發明之另一態樣中’該抗體分子包括如圖5中所述 之重鏈可變域序列，及如圖6中所述之輕鏈可變域序列。 在本發明另一態樣中，該抗體分子包括如圖5中所述名 稱為DBG 13 VH之重鏈可變域序列，及如圖6中所述名稱 為DBG 13 VK之輕鏈可變域序列。 在本發明另一態樣中’該抗體分子包括如圖5中所述名 稱為DBG 14 VH之重鍵可變域序列，及如圖6中所述名稱 為DBG 14 VK之輕鏈可變域序列。 152708.doc •24- 201136606 在本發明另一態樣中，該抗體分子包括如圖5中所述名 稱為DBG 22 VH之重鏈可變域序列，及如圖6中所述名稱 為DBG 22 VK之輕鏈可變域序列。 在本發明另一態樣中，該抗體分子包括如圖5中所述名 稱為Eng VH# 14之重鏈可變域序列，及如圖6中所述名稱 為Eng VK# 11之輕鏈可變域序列。 在本發明另一態樣中，該抗體分子包括如圖5中所述名 稱為Eng VH# 15之重鏈可變域序列，及如圖6中所述名稱 為Eng VK# 17之輕鏈可變域序列。 在本發明另一態樣中’該抗體分子包括如圖5中所述名 稱為Eng VH# 15之重鍵可變域序列，及如圖6中所述名稱 為Eng VK# 1 8之輕鍵可變域序列。 在本發明另一態樣中’該抗體分子包括如圖5中所述名 稱為Eng VH# 31之重鏈可變域序列，及如圖6中所述名稱 為Eng VK# 18之輕鍵可變域序列。 在本發明另一態樣中，該抗體分子對達比加群具有結合 特異性’且包括具有選自由SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2 組成之群之CDR1及選自由SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、及 SEQ ID NO: 8組成之群之CDR2、及選自由SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 10組成之群之CDR3之重鏈可變域，及具有選自由 SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、及 SEQ ID NO: 13 組成 之群之 CDR1、SEQ ID NO: 14 之 CDR2、及 SEQ ID NO: 15 之CDR3之輕鏈可變域。 152708.doc ·25· 201136606 在本發明另一態樣中，該抗體分子包括具有SEQ ID NO: 1 之 CDR1、選自由 SEQ ID NCh 6、SEQ ID NO: 7、及 SEQ ID NO: 8組成之群之CDR2、SEQ ID NO: 10之CDR3之重鏈 可變域，及具有 SEQ ID NO: 13 之 CDR1、SEQ ID NO: 14 之CDR2、SEQ ID NO: 15之CDR3之輕鏈可變域。 在本發明另一態樣中，該抗體分子包括選自由SEQ ID NO: 16、18、20、22、24、及26組成之群之重鏈可變域， 及選自由 SEQ ID No: 17、19、21、23、25、及 27組成之 群之輕鏈可變域。 在本發明另一態樣中，該抗體分子包括SEQ ID NO: 16 之重鏈可變域，及SEQ ID No: 17之輕鏈可變域。 在本發明另一態樣中，該抗體分子包括SEQ ID NO: 1 8 之重鏈可變域，及SEQ ID No: 19之輕鏈可變域。 在本發明另一態樣中，該抗體分子包括SEQ ID NO: 20 之重鏈可變域，及SEQ ID No: 21之輕鏈可變域。 在本發明另一態樣中，該抗體分子包括SEQ ID NO: 22 之重鏈可變域，及SEQ ID No: 23之輕鏈可變域。 在本發明另一態樣中，該抗體分子包括SEQ ID NO: 24 之重鏈可變域，及SEQ ID No: 25之輕鏈可變域。 在本發明另一態樣中，該抗體分子包括SEQ ID NO: 24 之重鏈可變域，及SEQ ID No: 27之輕鏈可變域。 在本發明另一態樣中，該抗體分子包括SEQ ID NO: 26 之重鏈可變域，及SEQ ID No: 27之輕鏈可變域。 在本發明另一態樣中，該抗體分子係scFv分子。在此情 152708.doc -26- 201136606 況下，本文所揭示之可變域可利用適宜的鏈結肽（例如， 選自由SEQ ID No: 28、29、30、或31組成之群）彼此融 合。該構築體可依N末端至C末端順序包括此等元素：（重 鏈可變域）-(連接肽）-(輕鏈可變域）、或（輕鏈可變域）-(連接 肽）-(重鏈可變域）。 在本發明另一態樣中，該抗體分子係scFv分子，其包括 SEQ ID NO: 32，或 SEQ ID NO: 33。 提供可編碼sFv構築體之核酸在宿主細胞（如，大腸桿菌 (E. coli)、畢赤酵母菌（Pichia pastoris)、或哺乳動物細胞 系，例如CHO或NS0)中重組表現以產生功能性scFv分子之 方法是相關技術已熟知的（參見（例如）：Rippmann等人， Applied and Environmental Microbiology 1998，64(12): 4862-4869 ; Yamawaki等人，J. Biosci. Bioeng. 2007，104(5): 403-407 ; Sonoda 等人，Protein Expr. Purif. 2010，70(2): 248-253) ° 特定言之，可如下製備本發明scFv抗體分子。可在可誘 導之啟動子之控制下，於不同大腸桿菌菌株（如W3 110、 TGI、BL21、BL21(DE3)、HMS174、HMS174(DE3)、 MM294)中表現該構築體。該啟動子可選自lacUV5、tac、 T7、trp、trc、T5、araB。培養基較佳係完全根據Wilms等 人，2001(Wilms等人，Biotechnology and Bioengineering 2001，73(2): 95-103)、DeLisa等人，1999 (DeLisa等人， Biotechnology and Bioengineering 1999，65(1): 54-64)所限 定或為其等效物。然而，可能宜在批次培養基及/或補料 152708.doc -27- 201136606 培養基中補充諸如異亮胺酸、亮胺酸、賴胺酸、甲硫胺 酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色胺酸及纈胺酸之胺基酸或諸如 大丑蛋白脒或酵母提取物之複合培養基組分。以補料-分 批模式進行發酵製程。條件：溫度20至401：、pH 5.5至 7.5、DO保持在20%以上。消耗初始碳源之後，用如上所 述之補料培養基（或等效物）補充該培養物。當發酵槽中之 細胞乾物重達到40至100 g/L時，用對應於所使用之啟動子 系統（例如，IPTG、乳糖、阿拉伯糖）之適當誘導物誘導該 培養物。可由各誘導物長時間饋入發酵槽中，依脈衝式全 誘導或部份誘導之形式或其組合方式，來進行該誘導。生 產階段應持續至少4小時。藉由在碗式離心機、管碗式離 〜機或多盤式離心機中離心，回收該等細胞，捨棄培養物 上清液。 將大腸桿菌細胞塊懸浮於4 -至8 _倍量之溶胞緩衝液（磷酸 鹽或Tris緩衝液，PH 7至8.5)中。較佳藉由高壓均質化溶 解細胞，接著於碗式、管碗式或多盤式離心機中離心回收 細胞集結塊。用 20 mM Tris、150 mM NaCl、5 mM EDTA、2 M尿素、0.5°/。Triton X-100，pH 8.0清洗含有 scFv包涵體之細胞塊2至3次，接著使用2〇 mM Tris、15〇 mM NaCl、5 mM EDTA，pH 8·0清洗兩個步驟。最終，藉 由碗式、管碗式或多碟式離心機離心，回收scFv包涵體。

可於含有離液劑（如6 Μ胍-HC1或8至10 mM尿素）之1〇〇 mM 甘胺酸/NaOH、5 mM EDTA、20 mM二硫蘇糖醇、pH 9.5 至10.5溶液中溶解scFv包涵體。在培養3〇至6〇分鐘之後， 152708.doc • 28 - 201136606 將/合液離％ ’並回收含有目標蛋白質之上清液，用於隨後 之復性。較佳以分批補料模式，藉由將該蛋白質溶液於復 性緩衝液中以1:1〇至1:5〇稀釋至〇丨至〇 5 之最終蛋白 質/辰度，來進行復性。復性緩衝液可含有5〇至i〇〇 Tris及 / 或 50 至 1〇〇 胺酸、5〇至15〇 NaC卜 1至3 μ 尿素、0.5至1 μ精胺酸、2至6 mM之氧化還原系統，例 如，半胱胺酸/胱胺酸或氧化/還原谷胱甘肽，pH 9.5至 10.5在4 C下，培養24至72小時之後，視情況使用〇 22 μπι過濾器過濾復性溶液，稀釋並將pH調整至pH 7 〇至 8.〇。經由結合模式之陽離子交換層析（例如，T〇y〇pearl

GigaCap S-650M、SP 瓊脂糖凝膠 FF 或 s HypeΓCelTM)在pH 7.0至8.5下，分離蛋白質。藉由線性遞增的NaCi梯度，進 仃洗脫。合併含有目標蛋白質之溶離份，且隨後在以非結 σ模式之陰離子父換管柱（例如，T〇y〇peari GigaCap 650M、Q_Sephar〇se FF、Q HyperCelTM)上分離，接著進行 陽離子交換純化步驟（例如，sp瓊脂糖凝膠Hp)〇合併含有 純度最少90%之目標蛋白質之溶離份，且藉由透析或尺寸 排除層析法，於PBS中調配。藉由還原性SDS_PAGE，分 析所製備之ScFv分子之同質性及產物品質，其中該可在約 26 kDa處單一主要條帶中檢測到該scFv。該scFv之其他特 徵分析法包括質譜、RP-HPLC及SE-HPLC。 在本發明另一態樣中’該抗體分子係免疫球蛋白，較佳 係IgGl、或其效應物功能剔除、或Ig(}4型之免疫球蛋白在 本發明另一態樣中’該抗體分子係免疫球蛋白，其具有包 152708.doc •29- 201136606 括 SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 40之重鏈、及包括 SEQ ID N 0: 3 5之輕鏈。 在本發明另一態樣中，該抗體分子係Fab分子。在此情 況下，以上所揭示之可變域各可與較佳係人源性之免疫球 蛋白不變域融合。因此，該重鏈可變域可與CH,域融合（所 謂之Fd片段），且該輕鏈可變域可與CL域融合。 在本發明另一態樣中，該抗體分子係Fab分子，其具有 包括SEQ ID NO: 36或SEQ ID NO: 3 8之Fd片段及包括SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 39之輕鏈。在本發明另一態樣 中，該抗體分子係Fab分子，其具有包括SEQ ID NO: 36之 Fd片段、及包括SEQ ID NO: 37之輕鏈。在本發明另一態 樣中，該抗體分子係Fab分子，其具有包括SEQ ID NO: 38 之Fd片段、及包括SEQ ID NO: 39之輕鏈。在本發明另一 態樣中，該抗體分子係Fab分子，其具有由SEQ ID NO: 3 6 組成之Fd片段、及由SEQ ID NO: 37組成之輕鏈。在本發 明另一態樣中，該抗體分子係Fab分子，其具有由SEQ ID NO: 38組成之Fd片段、及由SEQ ID NO: 39組成之輕鏈。 可使用編碼Fab構築體之核酸，以在宿主細胞（如，大腸 桿菌（E. coli)、畢赤酵母菌（Pichia pastoris)、或哺乳動物 細胞系（例如，CHO或NS0))中表現此等重鏈及輕鏈。相關 技術已知可提供此等鏈之適當摺疊、締合、及二硫鍵合至 包括Fd片段及輕鏈之功能性Fab分子之方法（Burtet等人，夂 Biochem. 2007，142(6)，665-669 ; Ning 等人，Biochem. Mol. Biol. 2005, 38: 204-299 ; Quintero-Hernandez等人， 152708.doc -30- 201136606

Mol. Immunol. 2007, 44: 13 07-1315 ; Willems 等人，J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2003; 786:161-176.)。 特定言之，可如下於CHO細胞中製備本發明Fab分子。 根據製造商的指示，使用Lipofectamine™及Plus™試劑 (Invitrogen)，用編碼該Fab分子之重鏈及輕鏈之表現構築 體轉染在不含血清之培養基之懸浮液中生長之CHO-DG44 細胞（Urlaub G.、Kas E.、Carothers，Α·Μ·、及 Chasin, L.A. (1983). Deletion of the diploid dihydrofolate reductase locus from cultured mammalian cells. Cell 33, 405-412.) o 48小時後，在含有200 pg/ml之抗生素G418且不含次黃嘌 呤及胸腺嘧啶之培養基中篩選出該等細胞，以產生經安定 轉染之細胞群。隨後，依遞增濃度（至高100或400 nM)添 加曱胺喋呤（MTX)至培養基，使該等安定轉染物進行基因 擴增。該等細胞一旦適應，則進行10至11天之分批補料發 酵，以製備Fab蛋白質物質。 於化學上受限制之不含血清之培養基中，培養CHO-DG44細胞及其安定轉染物之懸浮液培養物。每隔2至3 天，分別以3χ105至2χ105細胞/mL之接種密度傳代培養原 種培養物。細胞於5% C〇2、37°C及120 rpm下之Multitron HT培養器（Infors)中之搖瓶中生長。對於補料分批實驗而 言，在不含抗生素或MTX之BI-專用生產培養基中，將細 胞以3χ105細胞/ml接種至搖瓶中。在37°C及5% C02(隨 後，隨著細胞數增加，其降至2%)下，以120 rpm攪拌該等 152708.doc -31 · 201136606 培養物。每日測定包括細胞數、存活率、pH、葡萄糖及乳 酸濃度之培養參數，且根據需要，使用碳酸鹽將pH調整至 pH 7.0。每隔24小時，添加BI-專用補料溶液。在不同時間 點，自上清液取樣，藉由ELISA測定Fab產物濃度。10至 11天後，藉由離心，收穫該細胞培養液，並轉移至純化實 驗室。 藉由層析及過渡法，自該等補料-分批培養物之上清液 純化Fab分子。採用親和層析法（例如，蛋白G或蛋白L)作 為主要捕獲步驟。或者，在低結合親和性及能力下，藉由 利用該分子之pi之陽離子交換層析（CEX)，來捕獲該Fab。 藉由其他正交純化步驟，移除宿主細胞蛋白質及雜質，例 如，DNA或病毒。 藉由電泳分析法（例如，SDS-PAGE)，分析所製備之Fab 分子之同質性及產物品質，藉由SDS-PAGE，可在約50 kDa處之單一主要條帶檢測到Fab。該Fab產物之其他特徵 分析法包括質譜、等電點聚焦及尺寸排除層析。隨後，藉 由BIAcore分析法分析結合活性。 經由夾心酶聯免疫吸附檢定（ELISA)，定量該等細胞培 養物上清液中之Fab或全長IgG分子。可使用對抗人類-Fc 片段（Jackson Immuno Research Laboratories)及人類 κ輕鏈 (過氧物酶-共輛，Sigma)所產生之抗體檢測該全長IgG。藉 由山羊多株抗人類IgG(H及L，Novus)固定該Fab片段，並 藉由對抗人類IgG所產生之綿羊多株抗體（過氧物酶-共 轭，該結合位點）檢測。 152708.doc -32- 201136606 亦可藉由酶裂解，自全長抗體分子產生Fab分子。此方 法之優點係可應用穩健且高效的發酵及純化之平臺製程， 其適於在所需產物品質下擴大規模及高產率。對於純化而 言，可採用重組蛋白A樹脂之親和層析法作為主要捕獲步 驟’其通常產生高純度。 為此目的，將編碼Fab序列之重鏈融合至人類IgG抗體分 子之Fc區域。隨後，使用脂質轉染法，將所得之表現構築 體轉染至在不含血清之培養基懸浮液中生長之cH〇_Dg44 細胞中》48小時之後，在含有200 μ§/ιη12抗生素G418且 不含次黃嘌呤及胸腺嘧啶之培養基中選拔該等細胞，以產 生經安定轉染之細胞群。隨後，依遞增濃度（至高1 〇〇或 4〇〇 nM)添加甲胺喋呤（Μτχ)至培養基，使該等安定轉染 物進行基因擴增。該等細胞一旦適應，即進行1〇至丨丨天之 補料分批發酵，以製備IgG蛋白質物質。 使用重組蛋白A_親和層析法，自該培養物上清液純化該 IgG蛋白。為了獲得所需之中和Fab片段’則在木瓜蛋白酶 之存在下，培養該全長IgG,其在該鉸鏈區内裂解IgG，終 此釋放兩個Fab片段及Fc-部份。 藉由親和層析法（例如’蛋白質G或蛋白質L)，單離Fab 分子。或者，在低結合親和性及能力下，利用該分子之“ 之陽離子交換層析（CEX),來捕獲Fab。藉由其他正交純化 步驟，移除宿主細胞蛋白質及雜質，例如，木瓜蛋白酶、 DNA或病毒。 在本發明之另一態樣中，該抗體分子係如本文所述之抗 152708.doc -33· 201136606 體分子之胺基酸序列變體。 可藉由引入適當的核苷酸改變抗體DNA，或藉由肽合 成’來製備抗體之胺基酸序列變體。此等變體包括⑽如） 刪除及/或插人及/或取代本文實例之抗體之胺基酸序列内 之殘基。可進打刪除、插入、及取代之任何組合，以形成 最終構築體，限制條件為該最終構築體具有所需特性。胺 基酸變化亦可改變該人源化或變體抗體之轉譯後製程，如 改變醣基化位點之數量或位置。 鑒定抗體之某些殘基或區域係突變較佳位置之適用方法 係稱為「丙胺酸掃描突變」，如Cunningham&WeUs所述 (Science，244:1081·1085 (1989))。此處，藉由中性或帶負 電荷之胺基酸（通常係丙胺酸），來識別（例如，帶電殘基， 如arg、asp、his、lys、及glu)及置換目標殘基之殘基或基 團，以影響該等胺基酸與抗原之相互作用。隨後，藉由在 取代位點處或為其進一步引入或引入其他變體，來純化彼 等對該等取代官能展現敏感度之胺基酸位置。因此，雖然 預疋引入胺基酸序列變體之位點，但是無需預定突變本身 之性質。例如，爲了分析在指定位點之突變之性能’在該 目標密碼子或區域進行丙胺酸掃描或隨機突變，並針對所 需活性’篩選表現之抗體變體。 胺基酸序列插入法包括長度範圍為自一個殘基至含有 100個或更多殘基之多肽之胺基_及/或羧基·末端融合體， 及單個或多個胺基酸殘基之序列内插入體。末端插入體之 實例包括與抗原決定基標籤融合之抗體。抗體分子之其他 152708.doc -34 · 201136606 插入變體包括與酶或多肽之抗體之N-或C-末端之融合體， 其延長該抗體之血清半衰期。 另一類型之變體係胺基酸取代變體。此等變體已移除該 抗體分子中至少一個胺基酸殘基及一個插入其位置之不同 殘基。取代突變最受關注之位點包括高可變區，但是亦包 括FR變化。保留性取代基係示於以下表中，標題為「較佳 取代基」。如果此等取代造成生物活性之變化，則可引入 稱為「示例性取代基」、或如下參考胺基酸類別進一步所 述之更實質性變化，並篩選產物。 原始殘基 示例性取代基 較佳取代基 Ala (A) val、leu、ile val Arg(R) lys、gin、asn lys Asn (N) gin、his、asp、lys、arg gin Asp (D) glu 、 asn glu Cys (C) ser ' ala ser Gin (Q) asn ' glu asn Glu (E) asp ' gin asp Gly (G) ala ala His(H) arg、asn、gin、lys arg lie (I) leu、val、met、ala、phe、正亮胺酸 leu Leu (L) ile、正亮胺酸、val、met、ala、phe ile Lys (K) arg、gin、asn arg Met (M) leu、phe、ile leu Phe (F) tyr、leu、val、ile、ala tyr -35· 152708.doc 201136606 ala thr ser tyr phe leu

Pr〇 (P) ala

Ser (S) thr

Thr(T) ser

Trp (W) tyr、phe

Tyr (Y) phe、trp、thr、ser

Val (V) leu、ile ' met、phe、ala、正亮胺酸 在蛋白質化學中，吾人普遍認為：可在保持以下各項性 質下選拔具有顯著不同效用的取代法，來達成抗體之生物 學特性：⑷取代區中之多狀骨架之結構，例如呈片型或螺 旋構象’（b)在目標位點之分子之電荷或疏水性，或（c)側 鍵之體積。基於共同舰性質將天然存在之殘基分為以下 群組： ⑴疏水性：正亮胺酸、met、a〗a、val、leu、; (2) 中性親水性：cys、ser、thr ; (3) 酸性：asp、glu ; (4) 驗性：asn、gin、his、lys、arg ; (5) 影響鏈定向之殘基：gly、pr〇 ;及 (6) 芳香性：trp、tyr、phe。 非保留性取代將會使此等類型中之一成員改變成另一類 型〇 任何不參與保持該人源化或變體抗體之適當構象之半胱 胺酸殘基亦可經（一般經絲胺酸）取代，以提高該分子之氧 化女疋、避免異常交聯、或為細胞毒性或細胞生長抑制 !生化口物提供可建立之共軛點。反之，可使該抗體增加半 152708.doc • 36 - 201136606 耽胺酸鍵（群），以提高其安定性（尤其係該抗體係抗體片段 (如Fv片段）時）。 一類取代變體涉及取代親本抗體（例如，人源化或人類 抗體）之一或多個高可變區殘基。一般而言，用於進一步 開發所選拔之所得變體將比其所產生之親本抗體具有改善 之生物特性。產生此等取代變體之一方便方法係使用噬菌 體呈現法之親和性成熟。簡而言之’使數個高可變區位點 (例如，6至7個位點）突變，以在各位點產生所有可能的胺 基取代。因此所產生之抗體變體會以單價方式，由絲狀噬 菌體顆粒呈現與各顆粒内包裝之Ml3之基因III產物之融合 體。隨後’針對其生物活性（例如，結合親和性），篩選該 等嗤菌體呈現之變體。爲了識別用於修飾之候選高可變區 位點’可進行丙胺酸掃描突變，以識別主要負貴抗原結合 之高可變區殘基《或者，或此外，可能宜分析該抗原-抗 體錯合物之晶體結構’以識別該抗體與人類達比加群之間 的接觸點。根據本文所述之技術，此等接觸殘基及鄰近殘 基係候選之取代基。一旦產生此等變體，則使一組變體接 受如本文所述之篩選，且可在一或多個相關檢定法中，選 拔具有卓越特性之抗體，用於進一步發展。 另一類抗體之胺基酸變體改變該抗體之初始醣基化模 式。「改變」意指刪除一或多個該抗體中出現之碳水化合 物部份、及/或添加一或多個該抗體中不存在之醣基化位 點。 在某些實施例中’需要改良本發明抗體，以添加醋基化 152708.doc •37- 201136606 位點。抗體之醣基化通常係N-連接或0-連接^ N_連接係指 該碳水化合物部份附接在天冬醯胺殘基之側鍵。三肽序列 天冬酿胺-X-絲胺酸及天冬酿胺-X-蘇胺酸（其中X係除脯胺 酸以外之任何胺基酸）係碳水化合物部份經酶促附接天冬 醯胺側鏈之識別序列。因此，多肽中出現其中任一種三肽 序列即產生可能的醣基化位點》0-連接之醣基化係指由糖 類N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖、木糖中之一附接羥基胺基 酸（最常使用絲胺酸或蘇胺酸），但是亦可使用5_經基脯胺 酸或5 -經基離胺酸《因此，爲了使既定蛋白質（例如抗體） 醣基化，將該蛋白質之胺基酸序列經工程改造為含有一或 多個上述三肽序列（針對N-連接之醣基化位點）。亦可藉由 添加、或取代一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基來改變原抗體 之序列（針對0-連接之醣基化位點）。 藉由各種相關技術已知之方法，製備編碼抗體之胺基酸 序列變體之核酸分子。該等方法包括（但不限於）自天然來 源中分離（若天然存在胺基酸序列變體時）或藉由如本文所 述之抗體分子之先前製備之變體或非變體型的寡核苷酸_ 介導（或定點）之突變、PCR突變、及序列盒誘變法製備。 如上所述’本發明抗體分子之抗原係抗凝血劑。使用該抗 原’藉由為動物免疫接種、或藉由如喔菌體呈現方法，自 序列庫選拔抗體序列，以產生抗體分子。 動物之免疫接種法係相關技術已熟知。爲了獲得適當的 免疫反應’可能需要將該抗原與佐劑（如，磷酸鋁、氫氧 化鋁、角鯊烯、或佛氏（Freund)完全/不完全佐劑）組合。 152708.doc •38· 201136606 本發明上下文中之抗原（如達比加群）大多數係相當小的 有機分子，有時在投與給動物後，其無法刺激抗體形成。 因此’可能需要將該抗原附接至大分子（如半抗原）上。 在另一態樣中，本發明係關於一種如上所述之抗體分 子’其用於醫學中。 在另一態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物，其包括 如上所述之抗體分子、及醫藥載劑。 爲了用於治療，將抗體分子併入有利於投藥給動物或人 類之適當醫藥組合物中。可藉由將該抗體分子與生理上可 接雙之載劑、賦形劑或安定劑混合’以凍乾或其他乾調配 物或水溶液或水性或非水性懸浮液之形式，來製備該抗體 分子之典型調配物。載劑、賦形劑、修飾劑或安定劑之使 用劑量及濃度應無毒性。其等包括緩衝液系統，如磷酸 鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽及其他無機或有機酸及其鹽；抗氧 化劑，其包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑，如十八烷基 二甲基苄基氣化銨、氣化己烷雙胺、氣化苄二甲烴銨、氯 化苄乙氧銨、苯酚、丁基或苄基醇、對羥基苯曱酸烷基酯 (如對羥基苯曱酸曱酯或丙酯）、鄰笨二酚、間笨二酚、環 己醇、3-戊醇、及間曱酚；蛋白質，如血清白蛋白、明 膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯d比咯啶酮或 聚乙二醇（PEG);胺基酸，如甘胺酸、谷胺酸、天冬醯 胺、組胺酸、精胺酸、或離胺酸；單醣、雙醣、寡醣或多 聰及其他醣類，包括葡萄糖、甘露糖、簾糖、海藻糖、糊 精或葡聚糖；螯合劑’如EDTA;糖醇，如甘露糖醇或山 152708.doc •39· 201136606 梨糖醇，形成鹽之抗衡離子，如納；金屬錯合物（例如，

Zn-蛋白質錯合物）；及/或離子或非離子界面活性劑，如 tween™(聚山梨醇醋）、PLUR〇NICSTM或脂肪酸醋類、脂 肪酸驗類或糖酯類。該抗體調配物中亦可含有有機溶劑， 如乙醇或異丙醇。該賦形劑亦可具有修飾釋放性或修釋吸 收性之功能。 在一態樣中，該醫藥組合物包括濃度為1〇至2〇 mg/m丨之 含抗體分子之水性緩衝溶液，或由此溶液製成之凍乾物。 較佳的施用模式係非經腸式，藉由輸注或注射（靜脈 内、肌肉内、皮下、腹腔内、皮内），但是亦可採用其他 施用模式，如藉由吸入、透皮、鼻内、頰内、口服。 在另態樣中，本發明係關於一種如上所述之抗體分 子，其用於治療抗凝血劑療法之副作用，尤其係出血。 在另態樣中，本發明係關於一種治療抗凝血劑療法之 田J作用之方法，其包括投與有效量之如上所述之抗體分子 給有此需要之病患。 所投與抗體之「治療上有效量」係預防、減輕或治療抗 凝血劑療法之副作用所需之最小量，特定言之可有效止血 之最小量。此點可使用化學計量之抗體分子達成。 例如，達比加群以推薦劑量給予時，可達到2〇〇 之血 漿濃度。當使用分子量為約50 kdal之單價抗體分子時，例 菖使用圑藥經靜脈注射時，可在約1 mg/kg之劑量下 達到中和。在另一實施例中，施用至人類患者之Fab分子 之劑量可以每次施用5〇至1〇〇〇 mg，例如1〇〇、2〇〇、、 152708.doc 201136606 750、或1000 mg。適當劑量可根據所投與之抗凝血劑之類 型及劑量、自投藥後所經歷之時間、該抗原分子之性質、 該患者之病症、及其他因素而不同。熟練的專家已知確定 治療上有效且安全劑量之方法。 在另一態樣中，本發明係關於一種抗體分子，其具有與 達比加群及/或達比加群酯之結合親和性。較佳地，如（例 如）藉由表面電漿共振分析（Malmqvist M.， 「Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics.」Curr Opin Immunol. 1993 Apr; 5(2):282-6.)或動態排除檢定（KinExA)技術（Darling， R.J. ' 及 Brault P-A·， 「Kinetic exclusion assay technology:

Characterization of Molecular Interactions.」 ASSAY and Drug Development Technologies. 2004年 12月 2(6): 647-657) 所測定，該抗體分子與達比加群及/或達比加群酯結合之 親和性之KD值範圍為1 pM至100 μΜ，較佳係1 pM至1 μΜ 〇 本發明抗體分子亦可用於分析及診斷程序，例如以確定 檢體（如血漿、血清、或其他體液）中之抗原濃度。例如， 該抗原分子可用於酶聯免疫吸附檢定法（ELISA)，如彼等 實例中所述者。因此，在另一態樣中，本發明係關於包含 如本文所述之抗體分子之分析及診斷套組，及關於各自的 分析及診斷方法。 在另一態樣中，本發明係關於一種製造如先前技術方案 中任一項之抗體分子之方法，其包括： 152708.doc -41- 201136606 a.長：供一種伯主細胞’其包括一或多個編碼與表現調控 序列功能相關之抗體分子之核酸， b_培養該宿主細胞，及 c.自該細胞培養物回收該抗體分子。 實例 I·多株抗達比加群抗體之製法 爲了製備多株抗達比加群抗體，用兩種不同的半抗原及 不同的半抗原與載體蛋白（BSA)之莫耳輸入比，來製備3種 不同的免疫原。 爲了篩選’製備酵素辣根過氧化物酶（HRP)_共軛物，並 展開酶·免疫吸附檢定法（EUSA)。 藉由在蛋白質A瓊脂糖凝膠FF上之親和層析法，進一步 純化多株抗體。 1·材料及方法 測試化合物（達比加群）

152708.doc •42· 201136606 代碼： 半抗原1 配體之結構式： ch3 Η 謂 Η2Ν-^^Νγ^Νγ% 2 〇 xHCI C3〇H36N8〇2 * HC1 分子量：577.13 g/mol

如下合成該等半抗原（半抗原1及半抗原2): 半抗原12-[(4-甲脒基-笨基胺基）-甲基]-1-甲基-1H-苯并 咪唑-5-羧酸[2-(4-胺基-丁基胺曱醯基）-乙基]-苯基-醯胺

la 3-[(4-甲基胺基-3-硝基-苯曱醯基）-苯基-胺基]-丙酸甲酯 152708.doc -43- 201136606 Λη

在室溫下，將三乙胺（50.2 mmol)在攪拌下，滴加至含於 80 mL無水四氫呋喃（THF)中之4-甲基胺基_3_硝基_苯甲酿 氣（23.3 mmol)及3-苯基-胺基-丙酸甲酯（23_3 mmol)之溶液 中。三小時後，將該反應混合物蒸發至乾燥，用水研磨剩 餘固體，並經由過濾單離該固體產物。 產率：99% C18H19N305 (357.36) TLC (矽膠；二氯曱烷/乙醇19:1) : Rf=0.48 lb 3-[(3-胺基-4-甲基胺基-苯甲醯基）-苯基-胺基μ丙酸曱酯

在室溫下，於乙醇中，使用Pd(l〇%，木炭上）作為觸媒 進行氫化反應，還原產物la之硝基。 產率：99% C18H21N303 (327.38) TLC (石夕膠；二氣甲烷/乙醇9:1) : Rf=0.23 質譜（ESI) : [M+H]+=328 152708.doc -44- 201136606 lc 3-({3-[2-(4-氰基-苯基胺基）-乙醯胺基]-4-曱基胺基-苯 曱醯基}-苯基-胺基）-丙酸曱酯

在室溫下，使lb產物（23.2 mmol)及N-(4-氰基-苯基）-甘 胺酸（23.2 mmol)與CDI (23.2 mmol)於無水THF中偶聯。反 應完成後’將該混合物蒸發至乾燥，且未再進一步純化即 使用該粗產物。 產率：97% C27H27N5O4 (485.54) 質譜（ESI) : [M+H]+=486

Id 3-({2-[(4-氰基-苯基胺基）_曱基]_ι_甲基_1H_苯并咪唑_ 5-羰基}-苯基-胺基）_丙酸曱酯

mmol)之溶液加熱 將含於100 mL濃乙酸中之1C產物（22.6 至回流’持續1小時。隨後’將該溶液蒸發至乾燥，用水 研磨剩餘固體，並在攪拌下，將pH調整至約8至9〇經由乙 酸乙醋萃取，單離該粗產物，並㈣膠層析法（洗脫液： 152708.doc -45· 201136606 二氣曱烷/乙醇1:1)純化。 產率：58% C27H25N503 (467.52) TLC (石夕膠；二氣曱烷/乙醇9:1) : Rf=〇.71 質譜（ESI) : [M+H]+=468 U 3-({2-[(4-氰基-苯基胺基）_曱基]甲基笨并咪唑 5 -幾基}-苯基-胺基）-丙酸

將氫氧化納（20.0 mmol)添加至含於1〇〇 mL甲醇中之id產 物（13.0 mmol)之溶液中。在40〇C下，攪拌該混合物2.5小 時’且隨後蒸發至乾燥。用100 mL水攪拌剩餘固體，並用 濃乙酸將pH調整至約6。藉由過濾單離沉殿產物，用水清 洗，並在60°C下乾燥。 產率：88% C26H23N5O3 (453.49) TLC (石夕膠；二氣甲烷/乙醇9:1): Rf=〇.33 質譜（ESI) : [M+H]+=454

If Η·[3-({2-[(4-氰基-苯基胺基）-甲基]_卜甲基_1H-苯并 咪唾-5-羰基}-苯基-胺基）_丙醯胺基]-丁基胺基甲酸第三 丁酯 152708.doc •46- 201136606 /CH3

在室溫下，攪拌含於2〇 mL DMF中之u產物（5 Μ mmol)、四氟硼酸2_(1H_苯并三唑_卜基卜丨丄^四曱基脲 鑌（TBTU ’ 5.23 _〇1)及\•曱基_嗎啉（5 23咖〇1)之溶液3〇 分鐘。隨後，添加（4-胺基-丁基）_胺基曱酸第三丁酯（523 mmol)，並在室溫下再攪拌該混合物24小時。隨後，用水 (100 mL)稀釋該混合物，並經由乙酸乙酯萃取，單離該產 物。 產率：92% C35H41N7O4 (623.75) TLC (石夕膠；二氣甲烧/乙醇9:1) : Rf=〇 5 1 lg 2-[(4-甲脒基-苯基胺基）-曱基]-1-甲基-1H-苯并咪唑·5_ 羧酸[2_(4_胺基-丁基胺甲醯基）_乙基]_苯基-醯胺 ch3

中，並在室溫下攪拌該混合物過夜，且隨後在3〇。〇下蒸發 至乾燥。將剩餘之粗物質溶於200 mL無水乙醇中，隨後添 加碳酸銨（48.1 mmol)，並在室溫下攪拌該混合物過夜。蒸 •47· 152708.doc 201136606 發該溶劑之後，用約5 mL乙醇研磨剩餘粗物質，過濾分離 未〉谷解之物質’且在30C下蒸發該溶劑。隨後，將該產物 溶於30 mL水中，並用約2 g木炭攪拌該溶液，過滤並蒸發 至乾燥。 產率：90% C30H36N8O2 (540.67) TLC (逆相 RP-8;甲醇/5%NaCl水溶液 9:1):Rf=〇 79 質譜（ESI): [M+H]+=541 [M+Cl]e=575/7 半抗原2 2·[(4-曱脒基·苯基胺基）-甲基μι_甲基_1H苯并 咪唑-5-羧酸[2_(2_胺基-乙基胺甲醯基）_乙基]_吡啶基·

2a 3·({2·[(4-氰基-苯基胺基）-甲基]曱基-1H•苯并咪唑 5-羰基}-吡啶-2-基-胺基）_丙酸

將3-({2·[(4·氰基-苯基胺基）-甲基μι•甲基·1H_苯并咪唑_ 5-羰基卜吡啶-2-基-胺基）-丙酸乙酯（41.4 mm〇i)添加至含於 152708.doc •48· 201136606 500 mL·乙醇及5〇 „^水中之氫氧化鈉（5〇 〇 minol)之溶液 中。在至溫下’擾拌該混合物3小時，隨後蒸傑出約3 5 0 mL乙醇，添加約丨〇〇 ，並將pH調整至6。隨後，添加 乙喊（50 mL)，並攪拌該混合物過夜。藉由過濾單離該產 物’且無需進一步純化使用。 產率：78% C25H22N6O3 (454.48) 2b {2-[3-({2-[(4-氰基-苯基胺基）_曱基]“_曱基_1H_苯并 咪唑-5-羰基卜吡啶_2_基-胺基）_丙醯胺基^乙基卜胺基甲酸 第三丁酯

=N 在室溫下’攪拌含於無水四氫呋喃（1〇〇 mL)中之2a產物 (2.20 mmol)、四氟侧酸2_(ih-苯并三。坐_1_基）_1，1，3,3-四甲 基腺鏽（TBTU，2.20 mmol)及N-曱基嗎啉（2.20 mmol)之溶 液15分鐘。隨後，添加胺基-乙基卜胺基甲酸第三丁酯 (2.20 mmol) ’並在室溫下再攪拌該混合物24小時。用4〇 mL水稀釋該混合物’經由乙酸乙酯萃取，單離該產物， 並藉由層析法（矽膠；二氣曱烷/甲醇15:1)純化。 產率：61% C32H36N8〇4 (596.68) 質譜（ESI): [M+H]+=597 [Μ+Η]·=595 152708.doc -49- 201136606 2c 2-[(4-甲脒基-苯基胺基）-甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羧酸[2-(2-胺基-乙基胺甲醯基）-乙基]-α比啶-2-基-醯胺 CH3

將2b產物（1.34 mmol)添加至含於無水乙醇（30 mL)中之 飽和HC1溶液中。在室溫下，攪拌該溶液5小時，隨後在30 °C下蒸發至乾燥。添加乙醇（30 mL)及碳酸銨（13.0 mmol)，並在室溫下攪拌該混合物過夜。隨後，蒸發該溶 劑，殘留物使用約4 mL二氣曱烷/曱醇（30:1)之混合物研磨 5次，過濾並蒸發，以自無機鹽中分離該產物。 產率：27% C27H31N902 (513.61) 質譜（ESI): [Μ+(：1]·=548/50 [M+HCl+Cl]'=584/6 [M+H]+=514 2. 化學品 2.1用於試劑合成之化學品 名稱 規格 供應商 目錄號 1，4-苯并醌 Fluka 12309 牛血清白蛋白(BSA) Serva 11920 1，Γ-羰基-二-(1，2,4-三唑） Fluka 21861 檸檬酸 分析級 Riedel-De Haen 33114 Ν,Ν-二曱基甲醯胺(DMF) 用於合成 Merck 822275 152708.doc -50- 201136606 乙醇 分析級 Baker 8006 佛氏佐劑(CFA) 完全 Sigma F-5881 佛氏佐劑(IFA) 不完全 Sigma F-5506 甘油 純 Merck 104093 辣根過氧物酶HRP 25000 U/100 mg Boehringer Mannheim 108090 h2so4 分析級 Riedel-De Haen 30743 kh2po4 分析級 Merck 4873 NaHC03 分析級 Merck 106329 N^CO^ 分析級 Merck 106392 (NH4)2S04 分析級 Merck 101217 鄰苯二胺 30 mg妓劑 Sigma P8412 過硼酸鈉 純 Riedel-De Haen 11621 百里酚 純 Merck 8167 2.2 用於ELISA之化學品 名稱 檸檬酸 H2so4 kh2po4

Na2HP04 · 2 H20

NaCl

NaOH 鄰苯二胺 過硼酸鈉

Tween 20 規格 分析級 分析級 分析級 分析級 分析級 分析級 30 mg鍵劑 純 純

Riedel-De Haen 供應商 Riedel-De Haen Merck Merck Merck Merck Sigma Riedel-De Haen Serva

2.3用於ELISA之緩衝液 名稱 成分 "ΪΪ5^ 、--- 緩衝液1 0.05 MNa2HP04/KH2P04 ' 〇·15 MNaCl * pH=7.4 塗層 、、 安定性： 在約+4°C下，4週 緩衝液2 安定性： 如緩衝液卜含5g/lBSA 在約+4°C下，10天 缓衝液3 安定性： 如緩衝液1，含5 g/1 BSA及0.1 g/L硫柳汞 ’ 在約+4°C下，4週 阻 Μ > 152708.doc -51 - 201136606 緩衝液4 安定性： 0.1 Μ檸檬酸，用NaOH調整至pH 5.0， 6.5 mmol/L過蝴酸納 檸檬酸： 在約+4°C下，6個月 用過硼酸鹽： 在約+4°C下，10天 鄰苯二胺之受質 緩衝液 清洗溶液 水、0.5 g/L Tween 20 清洗微量滴定盤 安定性： 在環境溫度下，10天 停止試劑 2.25 M H2S04 中止鄰笨二胺顏 安定性： 在環境溫度下，5年 色變化 使用自Elgastat Maxima-HPLC超純水處理系統之水’製 備緩衝溶液。 3.免疫原之合成法 爲了刺激兔子的免疫系統，以製備對抗達比加群之多株 抗體，使用1,4-苯并醌或1，1’-羰基-二-(1,2,4-三唑）作為偶 聯劑，使該等半抗原（半抗原1及半抗原2)與載體蛋白偶 聯’來合成三種免疫原（批號GL256、GL258、及 GL262) 〇 合成GL256時，使用1，4-苯并醌作為具有兩個反應性位 點之均雙官能性化合物。首先’在酸性pH下’僅在該兩個 位點中之一處與胺基反應，且在鹼性pH下，另一位點係在 最低聚合度下反應。 使用1，1··羰基-二-(1,2,4-三唑）作為偶聯劑，用不同的半 抗原對載體蛋白之輸入比，合成GL258及GL262。 3.1 GL256之合成法 將0.416 mMol 1，4-苯并醌（含於1.5 mL乙醇中）添加至含 於 8.5 mL 0.1 M KH2P〇4-緩衝液（ρΗ=4·5)中之 0.75 μΜοΙ 152708.doc •52- 201136606 BSA之溶液中，並在室溫及黑暗下，培養15 h。隨後，使 該溶液通過於〇_15 M NaCl中平衡isephadex G25管柱，以 除去過量之1，4-苯并醌（最終體積12 5 mL)。 在攪拌下，將2.5 mL(0.15 μΜοΙ)純化BSA-溶液緩慢添加 至溶於 2 mL 0.1 M NaHC〇3/Na2C03-緩衝液（ΡΗ=8.5)中之 525 μΜοΙ半抗原（半抗原丨）之溶液_。在添加該BSA溶液期 間，將PH調整至約8.0。該半抗原與該載體蛋白之莫耳輸 入比係3500:1。 在至溫下培養過夜之後，由該免疫原相對於丨公升蒸餾 水透析6次。薄層層析法顯示，沒有未結合之半抗原之斑 點殘留於該半抗原-載體共軛物中。 取該免疫原分裝冷凍儲存在_2〇<>c下。藉由uv吸收光譜 在302 nm處測定，該免疫原上清液中之bsa經半抗原取代 之程度係約1:18。最終溶液中之免疫原含量係〇 75邮 GL256/mL。 3.2 GL258之合成法 在至’皿下，製備含於6.3 mL n，N-二甲基甲醯胺（DMF)中 之158 μΜοΙ半抗原2之溶液。添加158 μΜ〇ι丨，1，幾基二 (1，2,4-三唑），並先在1〇t下培養4小時，且隨後在室溫下 培養30刀#肖薄層層析法檢查該化學反應，且係約 25%。 隨後’將〇_75 μΜ〇ΐ BSA溶於2社〇 13 M制⑽中， 並在授拌下滴加1 mL N，N_二甲基曱醯胺（dmf)。將阳調 整至約8·3。隨後’在㈣下’將該半抗原溶液(6.3 mL)及 152708.doc •53- 201136606 4 mL 0.13 M NaHC03滴加至該BSA溶液中，且將pH調整至 8.4 ^針對該免疫原GL258而言，該半抗原與該載體蛋白之 莫耳輸入比係210:1。 在授拌及室溫下，培養過夜之後，由該免疫原相對於i 公升蒸餾水透析6次。薄層層析法顯示，沒有未結合半抗 原之斑點殘留於該半抗原-載體共軛物中。 該免疫原分裝冷凍儲存在-2〇°C下。藉由xjv吸收光譜在 302 nm處測定’該免疫原上清液中之bSa經半抗原取代之 程度係約1 : 5。最終溶液中之免疫原含量係〇 28 mg GL258/mL。 3·3 GL262之合成法 在室溫下，製備含於8.75 mL Ν，Ν-二甲基甲醯胺（DMF) 中之225 μΜοΙ半抗原2之溶液。添加225 μΜοΙ 1，1，-羰基- 一-(1，2,4-三唑），並在1〇。〇下培養4小時。用薄層層析法檢 查該化學反應，且係約2 〇至2 5 %。 隨後’將 0.49 μΜοΙ BSA溶於2 mL 0.13 M NaHC03 中， 並在攪拌下滴加1 mL N，N-二甲基甲醯胺（DMF)。將pH調 整至約8.2。隨後’在攪拌下，將該半抗原溶液（8 75 mL) 及6 mL 0·13 M NaHC03滴加至該BSA溶液中，且將pH調整 至8.3。針對該免疫原GL262而言，該半抗原與該載體蛋白 之莫耳輸入比係460:1。 在攪拌及室溫下，培養過夜之後，由該免疫原相對於i 么升蒸館水透析6次。薄層層析法顯示，沒有未結合半抗 原之斑點殘留於該半抗原-載體共軛物中。 152708.doc •54· 201136606 該免疫原分裝冷凍儲存在_20°C下。藉由UV吸收光譜在 302 nm處測定，該免疫原上清液中之BSA經半抗原取代之 程度係約1 : 32。最終溶液中之免疫原含量係〇.71 mg GL262/mL。 4. 共軛物之合成法 4·1 GL261之合成 在室溫下，製備含於1.5 mL Ν，Ν-二曱基曱醯胺（DMF)中 之37.4 μΜοΙ半抗原2之溶液。添加37.5 μΜοΙ 1，1'·幾基-一 -(1 ’2,4-二β坐）’且先在1〇 C下培養4小時，隨後在室溫下 培養30分鐘。用薄層層析法檢查該化學反應，且係約2〇至 25%。 隨後’將1.125 μΜοΙ酵素辣根過氧物酶（HRP)溶於〇.4 mL 0·13 M NaHC03中’並在攪拌下滴加 0.267 mL Ν，Ν-二 甲基曱醯胺（DMF)。將pH調整至約8.2。隨後，在授拌下， 將該半抗原溶液（22.5 μΜοΙ)及0.57 mL 0.13 M NaHC03滴 加至該HRP溶液中，且將pH調整至8.4。針對該HRP共扼物 GL261而言，該半抗原與該HRP之莫耳輸入比係2〇:1。 在至 >凰及授掉下培養過仪之後’藉由凝膠層析法，將該 HRP共輛物自有機溶劑及過量之半抗原中分離。使該溶液 通過經0.1 Μ填酸鹽緩衝液pH 7.0平衡之sephadex G25管 柱。在半抗原-HRP共軛物（示蹤物，5.64 mg/mL)之最終濃 度中加上BSA(其造成約10 mg/mL之濃度）、等體積之甘油 (以避免結凍）及百里酚晶體（以避免細菌生長）。將該示蹤 物溶液標為批號GL261並分裝儲存在-20°C下。 152708.doc -55- 201136606 藉由UV光譜在302 nm處測定，HRP經半抗原取代之程 度係約1 : 0.2。 使用鄰苯二胺（OPD)作為受質及使用天然HRP作為參考 物質，於B SA-阻斷之微量滴定盤中，測量該示蹤物之比活 性。在黑暗中，培養經稀釋之HRP標準物或該半抗原-HRP 共輛物與受質溶液之混合物3 0分鐘，用硫酸停止反應，並 在490 nm處測量吸光度。殘留活性係天然HRP的94%，且 該共輛物調配物於甘油中之比活性係611 U/mL。 示蹤物規格之匯總： 類型： 半抗原2-辣根過氧物酶 (批號 GL261) 蛋白質含量： 5.64 mg/mL 比活性： 108U/mg，611 U/ml，（受質癒創木紛(Guajacol)及 H2〇2，25°C) 儲存： 在約-20°C下 操作稀釋度： 1 ： 40000 5. 抗體之免疫接種及製法 5.1兔子之免疫接種 用含於0.5 mL 0.9°/〇 NaCl溶液及0.5 mL完全佛氏佐劑 (CFA)中之100 pg免疫原GL256、GL258及GL262之乳液， 使12隻3個月大的雌性金吉拉兔子（Chinchilla Rabbit)免疫。在下 一個月進行數次追加免疫接種。針對第三次免疫接種，使 用0.5 mL非完全佛氏佐劑（IFA)。每次都在四個皮下位點及 四個肌肉内位點處進行免疫接種。 A組-免疫原G L 2 5 6 152708.doc -56- 201136606 兔子1 #50 兔子2 #51 兔子3 #52 兔子4 #53 B組-免疫原GL258 兔子5 #54 兔子6 #55 兔子7 #56 兔子8 #57 C組-免疫原GL262 兔子9 #46 兔子10 #47 兔子11 #48 兔子12 #49 免疫接種方案

第1天 第一次免疫接種，每隻動物用含於CFA中之lOOpg免疫原/mL 第29天 第二次免疫接種，每隻動物用含於CFA中之100 pg免疫原/此

第57天 第三次免疫接種，每隻動物用含於IFA中之100pg免疫原/mL 由於使用免疫原GL256及GL258，兔子之健康狀態可能變得 更差 未處理兔子7 #56 第67天第一次抽血(2 mL/動物）

第81天 第四次免疫接種，每隻動物用含於CFA中之100 免疫原/mL 第91天 第二次抽血(25 mL/動物） 第112天第五次免疫接種，每隻動物用含於CFA中之100μ§免疫原/mL 第122天錯置動物編號 _第三次最後抽血(放血)*_ 152708.doc •57- 201136606 *1至12號兔子在第5次免疫接種後10天完全放血。 在使用甲苯噻嗪(Rompun®，Bayer，Leverkusen，德國）及鹽酸氣胺綱 (Ketavet®，Parke-Davis，Freiburg，德國)之麻醉下之，自頸動脈放血。 5.2兔子血清之分析 由凝固之兔血離心’來製備血清。藉由硫酸錄沉澱法及 經由Sephadex G25管柱之脫鹽，獲得蛋白質組分。 藉由標準ELISA程序，在該兔血清所分離之各蛋白質組 分中碑選抗達比加群效價。 篩選-ELISA:

在環境溫度下，使來自每次抽血之蛋白質組分吸附在微量滴定盤 (100 μΙ7孔；1、2或4 pg/mL)之緩衝液1中一夜。

清洗微量盤4次，每次450 pL 用250 pL緩衝液3阻斷至少1小時 清洗微量盤4次，每次450 gL + 將以下添加至微量滴定盤之各孔中，相同孔製備三個重複 50 μι緩衝液2 + 50 μι含於緩衝液2中之校準標準物

+ 25pL達比加群_辣根過氧物酶（HRP)共軛物GL261(示蹤 物)(1/40000) 用膠黏箔密封微量盤’完成所有微量盤之樣品分配 在環境溫度下，在振動器中培養4小睹 清洗微量盤4次，每次450 gL 將100 μΐ^鄰笨二胺HC1 ’ 2.7 mg/ml (-種含於u此緩衝液4^^ 30 mg錠劑)添加至微量滴定盤之各孔中 在環境溫度下，黑暗中培養30分鐘

G 將100 μι H2SO4 (2.25 M)添加至微量滴定盤之各孔中 ________搖晃5分鐘 I讀取吸光度；測定波長：來昭冰县：fisn nm 152708.doc -58- 201136606 5.3於兔血清中檢測抗達比加群抗體 最後三個管柱：針對達比加群之值 第2次抽血 兔子 免疫原 :佈度 塗濃

度οι 濃EM

MW- tE

[%] 1 #50 GL256 2 0 2.E-12 2.E-11 2.E-10 1.812 1.574 0.461 0.059 100% 87% 25% 3% 2 #51 GL256 1 0 2.193 100% 2.E-12 2.086 95% 2.E-11 1.515 69% 2.E-10 0.207 9% 3 #52 6L256 2 0 1.513 100% 2.E-12 1.419 94% 2·Ε·11 0.728 48% 2.Ε-10 0.107 7% 4 #53 GL256 2 0 1.474 100% 2.Η-12 1.388 94% 2.Ε-11 0.848 58% 2.Ε-10 0.142 10% 5 #54 GL258 1 0 2.114 100% 2.Ε-12 1.892 89% 2.Ε·11 0.646 31% 2·ε·10 0.159 8% 6 #55 GL258 1 0 1.295 100% 2.Ε·12 0.937 72% 2.Ε.11 0.265 20% 2·ε·10 0.140 11% 7 #56 GL258 2 0 1.611 100% 2·Ε·12 1.372 85% 2.Ε-11 0.424 26% 2.ε-10 0.145 9% 8 #46 GL258 1 0 1.640 100% 2·Ε·12 1.290 79% 2.Ε-11 0.425 26% #47 GL262 2.Ε·10 0.196 12% 0 2.E-12 2·Ε·11 2.Ε-10 4 4 0 4 5^35 8 5 5 2 1·1·0·0· % % % % 0 3 9 4 ο 82'1 10 #48 GL262 11 #49 GL262 4 12 #50 GL262 2 0 1.458 100% 2.Ε-12 1.142 78% 2.Ε-11 0.300 21% 2.Ε-10 0.131 9% 0 1.646 100% 2.Ε-12 1.393 85% 2.Ε-11 0.460 28% 2.Ε-10 0.257 16% 0 1.605 100% 2.ε·12 1.400 87% 2.Ε-11 0.389 24% 2.Ε-10 0.109 7% -59- I52708.doc 201136606 最後抽血 兔子 免疫原 塗佈 濃度 濃度 [Mol] [Extl [%] 1 ? 1 0 1.589 100% 2.E-12 1.442 91% 2.E-11 0.491 31% 2.E-10 0.130 8% 2 ? 1 0 1.375 100% 2.E-12 1.041 76% 2.E-11 0.293 21% 2.E-10 0.101 7% 3 ? 1 0 1.400 100% 2.E-12 1.081 77% 2.E-11 0.288 21% 2.E-10 0.097 7% 4 ? 1 0 1.183 100% 2.E-12 0.882 75% 2.E-11 0.396 33% 2.E-10 0.183 15% 5 ? 1 0 1.335 100% 2.E-12 1.066 80% 2.E-11 0.183 14% 2.E-10 0.057 4% 6 ? 1 0 1.214 100% 2·Ε·12 0.976 80% 2.Ε-11 0.250 21% 2·Ε_10 0.123 10% 7 ? 2 0 1.822 100% 2.Ε-12 1.702 93% 2.Ε-11 0.661 36% 2.Ε-10 0.189 10% 8 ? 2 0 1.234 100% 2.Ε-12 1.085 88% 2.Ε-11 0.671 54% 2.Ε-10 0.147 12% 9 ? 1 0 1.911 100% 2.Ε-12 1.862 97% 2.Ε-11 0.980 51% 2.Ε-10 0.292 15% 10 7 1 0 1.933 100% 2.Ε-12 1.891 98% 2.Ε-11 1.055 55% 2.Ε-10 0.076 4% 11 ? 1 0 1.874 100% 2.Ε-12 1.817 97% 2.Ε-11 1.539 82% 2.Ε-10 0.181 10% 12 ? 2 0 1.599 100% 2.Ε-12 1.425 89% 2.Ε-11 0.475 30% 2.Ε-10 0.050 3% 自第2次抽血篩選所有兔子之蛋白質組分之後，顯然， 兔子5號（#54)與較佳的半抗原（半抗原2)具有抗達比加群抗 -60- 152708.doc 201136606 體之最高效價。此外，僅使用低濃 ® ^ ,4- 又之刀析物（達比加群） 即可置換抗體結合位點之示蹤物。 在最後之第3次抽血之篩選中，囡 说这 ^缺少關於所用免疫 原之資訊，所以使用低濃度之分析物 竹物（達比加群）置換抗體 結合位點之示蹤物用作主要決定標準。因此兔子2 3及 5號係用於進一步純化。 5.4多株抗體之純化 兔子5號（#54)第2次抽血及兔子2、3及5號第3次抽血（最 後一次抽血）之抗血清使用硫酸銨沉澱。在l〇<t下，以 4500 U/min離心該沉澱30分鐘，自該溶液分離，並再溶於 Tris緩衝液中。重複此程序。藉由在蛋白質a瓊脂糖凝膠 FF上之親和層析法進一步純化。該管柱緩衝液係〇 〇丨M Tris pH=7.5，且使用0.1 Μ甘胺酸ρη=3·0洗脫。合併含有 兔子IgG之溶離份。藉由在280 nm之UV光譜，測定蛋白質 濃度。 抗體規格說明： 免疫原： 半抗原2-BSA (批號GL258) 兔子： 5號(#54)血清(第2次抽金） 蛋白質含量： 1.85 mg/mL 儲存： 在約-20°C下 152708.doc •61 - 201136606 免疫原： 半抗原1-BSA(GL256)或 半抗原2-BSA(批號GL258)或 半抗原2-BSA(批號GL262) 兔子： 所收集之2號血清(最後一次抽血） 蛋白質含量： 3.9 mg/mL 儲存： 在約-20°C下 免疫原： 半抗原1-BSA(GL256)或 半抗原2-BSA (批號GL258)或 半抗原2-BSA (批號GL262) 兔子： 3號血清(最後一次抽血） 蛋白質含量： 9.96 mg/mL 儲存： 在約-20°C下 免疫原= 半抗原1-BSA(GL256)或 半抗原2-BSA (批號GL258)或 半抗原2-BSA (批號GL262) 兔子： 5號血清(最後一次抽血） 蛋白質含量： 5.72 mg/mL 儲存： 在約-20°C下 II. 達比加群之中和 進行兩個系列之實驗，以顯示該等抗體於活體外對抗達 比加群抗凝血劑活性之效果。在實驗室中收到四種多株抗 體，並在人類血漿中進一步測試。此係在功能檢測法中 (凝血酶凝血時間）測試。 檢測法描述： 簡言之，抽取全血至3.13%檸檬酸鈉中，獲得人類血 152708.doc •62· 201136606 二。隨後離心，獲得不含血小板之企漿，並轉移至分離試 b中’並冷凍’直至在檢測當天需要時。在檢測當天，使 血漿在37°C下解凍》 凝血酶凝A時間操作如下。首先，將凝血酶在所提供之 緩衝液（Dade Behring測試套組）中稀釋至製造商規格（3 IU/ml凝血酶）’並預熱至37。〇。在製成後2小時以内使 用。所有檢測法均在市售之CL4凝血機（Behnk ΕΐΜΓ〇η_ N〇rderSUdt，德國）上進行。用吸管吸取50卟血聚加至所 提供具有磁力授拌子之測光管中，並在c"機器中已預熱 至37°C之孔中攪拌2分鐘。此時，添加1〇〇吣凝血酶溶 液，並由該CL4自動記錄血漿樣品凝固所需之時間。在添 加凝血酶及開始測量之前，將達比加群先於所提供之測光 b中之血漿中預先培養5分鐘。如果亦測試抗體（至多 ml原液），則在開始凝固之前，需另外在3rc下培養5分鐘 (即，與達比加群一共培養1〇分鐘，與抗體一共培養5分 鐘’且隨後用凝血酶啟動凝血）。 首先，藉由將濃度遞增之達比加群添加至人類血漿中， 並測量在添加凝血酶之後的凝血時間，製成達比加群標準 曲線（圖1)。隨著達比加群之濃度增加，該凝企酶凝血時間 隨濃度增加。 對於第一組中和實驗而言，將臨床相關濃度之200 nM達 比加群添加至所有血漿樣品中用於中和。所有4種抗體製 劑均能使含有達比加群之血漿之凝血時間縮短（圖2)。中和 之程度係與各抗體製劑中之蛋白質濃度相關。隨後，將具 152708.doc -63- 201136606 有最高濃度（D)之抗體溶液連續稀釋，並在另一組實驗 中’測試其中和2〇〇 nM逹比加群抗凝血劑活性之能力。在 圖3中可看到，隨著抗體濃度增加，達比加群引起之抗凝 血劑活性隨濃度變化而受抑制。此外，當將非特異性兔子 夕株抗體（藍色方塊）添加至含有達比加群之血漿中時，其 沒有中和抗凝血劑活性之能力。其依賴濃度之變化及無法 中和非特異性抗體之結果表示該抗體逆轉之抗凝蠱作用係 特異針對達比加群。 然而，達比加群之此等濃度係臨床相關性，且使用更高 濃度可能發生出血或過量。因此，亦在圖丨中標準曲線之 最高達比加群濃度（5〇〇 ηΜ)下測試抗體抑制抗凝血劑活性 之能力。圖4說明抗體〇亦可抑制高濃度之達比加群。 ΙΠ·單株抗達比加群抗鳢之製法及特徵分析 Ϊ·單株抗達比加群抗體及Fab之製法 使用與載體蛋白質（如血藍蛋白及免疫球蛋白）共軛之半 抗原1(參見實例K1)為小鼠免疫接種，並根據標準程序， 產生融合瘤。藉由ELISA檢測培養物上清液（如實例5 2中 所述），來識別表現針對達比加群之抗體特異性之純系。 使自該培養物上清液純化之單株抗體結合至達比加群·蛋 白質共軛物’且可與溶液中之達比加群競爭結合，其最大 抑制性之半值在丨至1〇 nM範圍内之濃度下。藉由木瓜蛋白 酶裂解該等單株抗體，隨後經由蛋白質A消除Fc域，產生 Fab。 使用‘準方法，選殖該等小鼠抗體之重鍵及輕鏈之可變 152708.doc • 64 - 201136606 區並定序。藉由該等抗體之蛋白質質譜分析及沁末端定 序，來5五實該等序列。產生編螞嵌合抗體之dna構築體， 其包含特異性小鼠可變區及人類IgG不變區，並於HEK 293T細胞中表現該蛋白質，並純化。 2.單株抗達比加群抗體及Fab之特徵分析 依實例II中所述之凝血酶凝血時間檢測法，測試小鼠單 株抗體純系22中和人類血漿中之達比加群抗凝血劑活性之 能力。該抗體以隨劑量變化之方式完全逆轉達比加群在人 類血漿中所介導依賴凝血酶之凝血時間之延長（圖7)。該抗 體亦有效抑制人類全血中之達比加群功能。自此抗體產生 之Fab阻斷人類血漿中之達比加群活性，其證明單價抗原 結合域可中和化合物之抗凝血劑活性（圖8)。純系22之可變 域之胺基酸序列係描繪於圖5(DBg 22 VH，重鍵）及圖 6(DBG 22 VK，幸里鍵）中。 達比加群在人體中之主要代謝途徑係經由羧基部份基團 之葡糖醛酸化。達比加群醯基葡糖苷酸已顯示藥理活性 (Ebner等人，Drug Metab· DisP〇s. 2010’ 38(9):1567-75)。 為了測試該小鼠單株抗體純系22是否能中和此等代謝產 物，自經達比加群處理之恒河猴之尿液中純化達比加群醯 基葡糖苷酸，並在凝血酶凝血時間檢測法中評估。該抗體 隨劑量變化來逆轉達比加群醯基葡糖苷酸在人類血漿中所 介導依賴凝血酶之凝血時間之延長，其與使用達比加群所 觀察到之效力類似（圖9)。因此，該抗體可有效阻斷出現在 人體中之達比加群代謝產物之抗凝血劑活性。 152708.doc -65- 201136606 使用Kinexa技術，.測定該Fab及包括純系22、。及μ之 可變域及人類免疫球蛋白不變區之小鼠_人類嵌合抗體之 親和性。由恆定濃度之Fab或嵌合抗體與多種不同濃度之 達比加群培養，直至達成平衡。此培養之後’藉由與生物 素共耗之達比加群模擬物所耦合之中性鍵親和素 (neutravidin)珠捕獲該抗體，來測定游離抗體之濃度。用 經FITC標藏之抗小鼠IgG (Fab特異性）F(ab')2片段，檢測所 捕獲之Fab。用與Cy5共軛之抗人類IgG，檢測所捕獲之嵌 合抗體。使用1:1結合模型，計算離解常數，此等實驗之 結果匯總於下表中》 抗達比加群抗體之親和性

抗體 表觀Kd 純系22 Fab 48 pM 純系22嵌合抗體 34 pM 純系13嵌合抗體 60 pM 純系14嵌合抗體 46 pM 該Fab及該嵌合抗體皆以高親和性結合達比加群。 3.人源化單株抗達比加群抗體及Fab之產生 爲降低投與人類後之潛在免疫原性，將小鼠單株抗體進 行「人源化」《以框架同源性、CDR結構、保守性典型殘 基、保守性連接填裝殘基及其他參數為基礎，針對小鼠前 導鏈選擇人類框架序列。在此等框架位置中胺基酸殘基之 特異性取代可改善各種態樣之抗體性能，其包括結合親和 性及/或安定性，優於彼等在藉由CDR或HVL「直接交換 152708.doc •66· 201136606 進入人類生殖框架區所形成之人源化抗體中所顯示者。選 擇顯示比嵌合親本Fab更佳或相等之結合且可提高表現之 Fab，用於進一步分析特徵。該等人源化Fab可變域之胺基 酸序列係描繪於圖5(Eng VH 14、15與31)及圖6(Eng VK 11、17與18)中。將包括Eng VH 15及Eng Vk 18之Fab轉換 成以IgGIKO格式之全長IgG » IgGIKO(效應物功能之基因 剔除）在Fc區具有兩個突變（Leu234Ala及Leu235Ala)，其可 降低效應物功能’如FcgR與補體之結合。該lgG格式係描 述於文獻資料（參見（例如）Hezareh等人，（2001)Journal of Virology 75: 12161-12168)中。該等人源化抗達比加群抗 體視情況包括共同或生殖框架區中之特定胺基酸取代。在 HEK 293T細胞中表現該18/15抗體，並純化。完整抗體藉 由Lys-C裂解後可產生Fab片段，而Fab係經蛋白質A藉以消 除Fc域而經純化。 4.抗達比加群Fab之特徵分析 在實例II中所述之凝血酶凝血時間檢測法中測試該18/15

Fab片段中和人類血漿中達比加群抗凝血劑活性之能力。 »亥Fab元全逆轉達比加群延長人類金漿中所介導依賴凝血 酶的凝血時間是一種隨劑量變化方式，其IC50為2.6 nM(圖 10) 〇 利用SPR技術，在BIAcore儀器上，測定該18/15 Fab之 親彳（·生在至溫下，將該Fab與濃度遞增之達比加群預先 培養30分鐘。使該混合物流過塗佈經固定的生物素-共軛 之達比加群模擬物之感測器晶片，並監測游離Fab之結合 152708.doc -67- 201136606 性。利用此溶液競爭檢測設計，測得該Fab針對達比加群 之 Kd為 210 pM(圖 11)。 【圖式簡單說明】 圖1 ·利用凝血酶凝血時間檢測法，可觀察到凝血時間 會隨著達比加群濃度增加而增長。200 nM濃度會造成凝企 時間比基線增加〜5倍，且係用於第一組及第二組實驗中。 最後一組實驗中採用50〇 nM濃度（超過治療濃度）^ 圖2·四種針對達比加群之不同抗體（八至D)均可使人類 血漿中達比加群所延長的凝血時間中和。人類血漿中之基 線凝血時間係10.9秒，當使2〇〇 nM達比加群與血漿預先培 養時，凝血時間延長至51秒。將各抗體添加至經2〇() nM連 比加群預先培養之血漿中，並再培養5分鐘。隨後，藉由 添加凝血酶，開始凝血酶凝血時間。各抗體會使達比加群 之凝血時間逆轉至不同程度。濃度最高的溶液會造成抗凝 血劑活性之最大逆轉。 圖3 :濃度遞增之多株抗體（抗體D)添加至已與2〇〇 nM達 比加群預先培養之人類血漿中之影響。基線凝血時間係i i 秒，添加達比加群延長凝血時間至63 7秒。隨後，測試增 加抗體稀釋度對逆轉達比加群所延長凝血酶凝血時間之影 響。最低濃度將凝血酶凝血時間降低至43 9秒。較高濃度 將凝血酶凝血時間完全降至基線水準，並造成達比加群之 抗凝血作用之完全中和。添加非特異性兔子多株抗體（方 塊）對逆轉達比加群之抗凝血作用無影響。 圖4:濃度遞增之多株抗體（抗體D)添加至已與5〇〇 達 152708.doc •68· 201136606 比加群預先培養之人類血漿中之影響。基線凝血時間係 10.9秒，添加此較高濃度達比加群時，延長凝血時間至 Π1.7秒（增加〜1〇倍）^抗體之丨：2稀釋液或原液逆轉達比 加群所延長凝血酶凝血時間之效應與濃度具有相關性。最 回濃度亦會使凝企酶凝血時間完全逆轉至基線水準，並使 甚至超過達比加群治療濃度之抗凝血作用完全中和。 圖5 ·抗達比加群抗體分子重鍵之序列。 圖6 :抗達比加群抗體分子輕鏈之序列。 圖7 :小氣單株抗體（純系22)會逆轉人類血漿及人類全 血中達比加群之抗凝血作用。將濃度遞增之小鼠單株抗體 添加至已與30 nM達比加群預先培養之人類血漿或全血 中。藉由添加1.5至2 U/ml之凝血酶開始該檢測法，並測量 凝血時間。以存在及不存在該化合物下之凝血時間差異定 義為100%達比加群活性。該抗體會以隨劑量變化方式抑 制達比加群所介導延長之凝血時間。 圖8自該純系22抗體產生之小鼠Fab會逆轉人類血漿中 達比加群之抗凝血作用。將濃度遞增之小鼠添加至已 與7 nM達比加群預先培養之人類血漿中。亦測試完整抗 體，作為陽性對照組。藉由添加〇 4 u/ml之凝血酶開始該 檢測法，並測量凝血時間。以完全阻斷達比加群所介導凝 寺間增加疋義為1 〇〇%抑制坪。該Fab會以隨劑量變化方 式抑制達比加群在人類血漿中所誘發之凝企時間延長。 圖9 ·小鼠單株抗體（純系22)會逆轉人類血漿中之達比 加群醯基葡糖苷酸之抗凝血作用。將濃度遞增之小鼠抗體 152708.doc •69· 201136606 添加至已與7 nM達比加群醯基葡糖苷酸或達比加群預先培 養之人類血漿中。藉由添加〇.4 U/ml之凝血酶開始該檢測 法，並測量凝血時間。以完全阻斷該化合物所介導凝血時 間增加定義為100%抑制性。該抗體會以隨劑量變化方式 抑制達比加群醯基葡糖苷酸在人類血漿中所誘發之凝血時 間延長。 圖10:人源化Fab(Fab 18/15)會逆轉人類血漿中達比加

群之抗凝血作用。將濃度遞增之Fab 18/15添加至已與7 nM 達比加群預先培養之人類血漿中。藉由添加〇4 u/m丨之凝 血酶開始該檢測法，並測量凝血時間。以完全阻斷達比加 群所介導凝血時間增加定義為1〇〇%抑制性。該Fab會以隨 劑量變化方式抑制達比加群在人類血漿中所誘發之凝血時 間延長。

計算Kd 〇 圖11 :使用SPR技術（BIAc〇re)測定該 18/15)對達比加群之結合親和性。 152708.doc -70· 201136606 序列表 <ιιυ> 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 <120> 抗凝血劑解毒劑 <130> P02585AJS/1 ,<140> 100102006 <141〉 2011-01-19 <150> 10151239.0; 61/383,914 •<151> 2010-01-20, 2010-09-17 <160> 40 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> CDR <400> 1

Gly Phe Ser Leu Thr ser Tyr lie val Asp 15 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> CDR <400> 2

Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr lie Val Asp 15 10

<210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> CDR <400> 3 val lie Trp Gly Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys ser IS 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> CDR <400> 4

Val lie Trp Ala Gly Gly ser Thr ser Tyr Asn ser Ala Leu Arg Ser 15 10 15 152708-序列表.doc 201136606 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> CDR <400> 5 val lie Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn ser Ala Leu Arg ser 1 5 10 15 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> CDR <400> 6 val lie Trp Ala Gly Gly ser Thr A「g Tyr Asn ser Ala Leu Arg ser 1 5 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> CDR <400> 7

Val lie Trp Ala Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Asn Ser Ala Leu Arg Set* 1 5 10 15 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> CDR <400> 8 val lie Trp Ala Gly Gly ser Thr Ala Tyr Asn Ser Ala Leu Arg Ser <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> CDR <400> 9 ^la Ala Tyr Tyr |er Tyr Tyr Asn Phe Asp Gly Phe Ala Tyr 152708·序列表.doc -2- 201136606 <210> <211> <212> <213> 10 14 PRT 人造序列 <220> <223> CDR <400> 10 Ala Ala Tyr Tyr 1 Ser Tyr Tyr Asn <210> <211> <212> <21B> 11 16 PRT 人造序列 <220> <223> CDR <400> 11 Lys Ser Ser Gin 1 Ser Leu Leu Tyr <210> <211> <212> <213> 12 16 PRT 人造序列 <220> <223> CDR <400> 12 Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr 10

Thr Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr 10 15

Lys Ser ser Gin ser Leu Leu Tyr 1 5

Thr Asn Gly Lys Ser Tyr Leu Tyr 10 15 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213>人造序列 <220>

<223> CDR <400> IB

Lys Ser ser Gin ser Leu Leu Tyr Thr Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213>人造序列 <220> <22B> CDR <400> X4 152708-序列表.doc 201136606

Leu val Ser Lys Leu Asp ser 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> COR <400> 15

Leu Gin ser Thr His Phe Pro His Thr <210> 16 <211> 122 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>工程化抗體序列 <400> 16

Asp val Gin Leu Lys Gin ser Gly Pro Gly Leu val Ala Pro Ser Gin 1 5 10 15

Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr val Ser Gly Phe ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 ne val ASP Trp va! Arg Gin ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

Gly val lie Trp Gly Ala Gly ser Thr Asn Tyr Asn ser Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Asn lie Thr Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gin val Phe Leu 65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala He Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Ser Ala Ala Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Asn Phe Asp Gly Phe Ala Tyr Trp 100 105 no

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr val ser Ala 115 120 <210> 17 <211> 112 <212> PRT <2Ϊ3>人造序列 <220> <223>工程化抗體序列 4- J 52708-序列表.doc 201136606 asp He val Met Thr cm xhr Pro Leu Thr Leu Sen val Thr lie Gly

Gin Pro Ala ser He ser cys Lys ser Ser Gin ser Leu Leu Tyr Thr 2〇 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Lys Arg Leu ne Tyr ,eu val Ser Lys Leu Asp ser Gly val Pro

Asp Arg Phe Ser Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie

Ser Arg val Glu Ala 61u Asp Leu Gly val Tyr Tyr Cys Leu Gin Ser 85 90 95

Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 no <210> 18 <211> 122 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>工程化抗體序列 <400> 18

Gin Val Gin Leu Glu Gin ser Gly Pro Gly Leu val Ala Pro ser Gin 1 5 l〇 15

Arg Leu Ser He Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 2〇 25 3〇 7 lie val Asp Trp val Arg Gin ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly val He Trp Ala Gly Gly ser Thr ser Tyr Asn ser Ala Leu Arg

Ser Arg Leu Ser He Thr Lys Asn Asn Ser Lys Ser Gin val Phe Leu 65 70 75 80

Gin Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Ser Ala Ala Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Asn Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp 152708-序列表.doc 201136606

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr val Ser Ala 115 120 <210> 19 <211> 112 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>工程化抗翘序列 <400> 19

Asp val val Leu Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu ser val Thr lie Gly 1 5 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys ser ser Gin Ser Leu Leu Tyr Thr 20 25 30

Asn Gly Lys Ser Tyr Leu Tyr Trp Leu Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Lys Arg Leu lie Tyr Leu val ser Lys Leu Asp ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe ser Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys iTe 65 70 75 80

Ser Gly val Glu Ala Glu Asp Val Gly lie Tyr Tyr cys Leu Gin Ser 85 90 95

Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly ^ Gly Thr Lys Leu clu He Lys <210> 20 <211> 122 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>工程化抗體序列 <4〇〇> 20

Gin val Gin Leu Glu Gin Ser Gly Pro Gly Leu val Ala Pro Ser Gin 15 10 15

Arg Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 20 25 3〇 lie Val Asp Trp val Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 dy val lie Trp Ma Gly Gly ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Arg 152708·序列表.doc -6- 201136606 ser Arg Leu Ser lie Thr Lys ser Asn Ser Lys ser Gin val Phe Leu 65 70 75 80

Gin Met Asn ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala lie Tyr Tyr cvs Ala 85 90 95

Ser Ala Ala Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Asn Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp 100 105 110

Glv Gin Gly Thr Leu val Thr val Ser Ala 115 120 <210> 21 <211> 112 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> 工程化抗體序列 <400> 21

Asp val val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu ser val Thr lie Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser lie ser Cys Lys Ser ser Gin Ser Leu Leu Tvr Thr 20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Lys Arg Leu lie Tyr Leu val Ser Lys Leu Asp ser Gly val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg val Glu Ala Glu Asp val Gly lie Tyr Tyr Cys Leu Gin Ser 85 90 95

Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 110 <210> 22 <211> 122 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>工程化抗體序列 <400> 22

Gin Val Gin Leu Gin Glu ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 152708-序列表.doc 201136606

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr ser Tyr 20 25 30 lie val Asp Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly val lie Trp Ala Gly Gly Ser Thr Arg Tyr Asn Ser Ala Leu Arg 50 55 60

Ser Arg val Thr lie ser Lys Asp Thr Ser L^s Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 80

Lys Leu ser ser val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Ser Ala Ala Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Asn Tvr Asp Gly Phe Ala Tyr Tr〇 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu val Thr val ser ser 115 120 <210> 23 <211> 112 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>工程化抗體序列 <400> 23

Asp Val Val Met Thr Gin ser Pro Leu Ser Leu Pro val Thr Leu Gly 1 5 l〇 is

Gin Pro Ala 托r lie ser cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Thr 2〇 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Lys Arg Leu lie Tyr Leu val Ser Lys Leu Asp ser Gly val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe ser Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie

Ser Arg val Glu Ala Glu Asp val Gly lie Tyr Tyr cys Leu Gin ser 85 90 95

Thr His Phe Pro His Thr phe Gly Gly Gly Thr Lys val Glu lie Lys 105 110 <210> 24 <211> 122 152708-序列表.doc 201136606 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>工程化抗體序列 <400> 24

Gin val Gin Leu Gin Glu ser Gly Pro Gly Leu val Lys Pro ser Glu 15 10 is

Thr Leu ser Leu Thr cys Thr val ser Gly Phe ser Leu Thr ser Tyr 20 25 3〇

He val Asp Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu TrD lie 35 40 45

Gly va"I lie Trp Ala Gly Gly ser Thr Gly Tyr Asn ser Ala Leu Arg 50 55 60

Ser Arg val ser He Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe ser Leu 65 70 75 80

Lys Leu ser ser val Thr Ala Ala Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys Ala 85 90 95 ser Ala Ala Tyr Tyr ser Tyr Tyr Asn Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu val Thr val ser ser 115 120 <210> 25 <211> 112 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> 工程化抗體序列 <400> 25

Asp val val Met Thr Gin ser pro Leu ser Leu Pro Val Thr Leu Glv 1 5 l〇 is

Gin Pro Ala ser He ser cys Lys ser ser Gin ser Leu Leu Tvr Thr 20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45 pro Lys Arg Leu lie Tyr teu val 50 55

Ser Lys Leu Asp Ser Gly val Pro

Asp Arg Phe ser Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80 -9- 152708-序列表.doc 201136606

Ser Arg Val g"Iu Als Glu Asp Val Gly lie Tyr Tvr cvs Leu Gin Ser 85 90 ^ 7 95

Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Glu lie Lys 100 105 no <210> 26 <213> 122 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>工程化抗體序列 <400> 26

Gin Val Gin Leu Gin Glu ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15

Thr Leu ser Leu Thr cys Thr val Ser Gly Phe ser Leu Thr ser Tvr ,20 25 30 lie val Asp Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly val He Trp Ala Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Asn Ser Ala Leu Arg 50 55 60

Ser Arg Val Thr lie ser Lys Asp Thr ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80

Lys Leu ser ser val Thr Ala Ala Asp Thr Ala He Tyr Tyr cys Ala 85 90 95

Ser Ala Ala Tyr Tyr ser Tyr Tyr Asn Tyr Asp Gly Phe Ala Tvr Tro 100 105 110 H

Gly Gin Gly Thr Leu val Thr val ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 112 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>工程化抗體序列 <400> 27

Asp val val Met Thr Gin ser Pro Leu Ser Leu Pro val Thr Leu Glv 15 10 15 y

Gin Pro Ala ser lie Ser Cys Lys Ser ser Gin ser Leu Leu Tyr Thr 20 25 30 y Tnr -10- 152708·序列表.doc 201136606

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Arg Pro Gly Gin ser 35 40 45

Pro Arg Arg Leu lie Tyr Leu val Ser Lys Leu Asp Ser Gly val Pro

Asp Arg Phe ser Gly Ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr cys Leu Gin Ser 85 90 95

Thr His Phe pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Glu lie Lys 100 105 no <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213?►人造序列 <220> <223>連接子 <400> 28

Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15 <210> 29 <211> 25 <212> prt <213>人造序列 <220> <223> 連接子 <400> 29

Ser ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala 15 10 15

Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Gly 20 25 <210> 30 <211> 21 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223>連接子 <400> 30

Ser Pro Asn Gly Ala ser His ser Ser ser Ala Ser Gin Thr Gly ser 1 5 10 15 • 11 - l527〇8_ 序'列表.doc 201136606

Ala Ser Gly ser Gin 20 <210> 31 <211> 18 <212> prt <213> 人造序列 <220> <223> 連接子 <400> 31

Gly Ser Thr ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly ser Thr 15 10 15

Lys Gly <210> 32 <211> 251 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> scFv <400> 32

Met Ala Asp val val Met Thr Gin ser Pro Leu Ser Leu Pro val Thr 15 10 15

Leu Gly Gin pro Ala Ser lie Ser cys Lys Ser ser Gin Ser Leu Leu 20 25 30

Tyr Thr Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tvr Trp Phe Leu Gin Arg Pro Gly 35 40 45

Gin Ser Pro Arg Arg Leu lie Tyr Leu val Ser Lys Leu Asp ser Gly 50 55 60 val Pro Asp Arg Phe Ser Gly ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 75 80

Lys lie ser Arg val Glu Ala Glu Asp val Gly val Tyr Tyr cys Leu 85 90 95

Gin ser Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Glu 100 105 110 ne Lys Gl? Gly Gly Gly Ser gy Gly cly Cly Ser cly Gly Gly Gly

Ser Gin val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 130 135 140 152708·序列表.doc -12- 201136606

Glu Thr Leu ser Leu Thr Cys Tfir val ser Gly Phe Ser Leu Thr ser 145 150 155 160

Tyr lie val Asp Trp lie Arg Gin Pro pro Gly Lys Gly Leu Glu TrD 165 170 175 ne Gly val xle xrp Ala cly cly Ser Thr Gly Tyr Asn Ser Ala Leu

Arg ser Arg val ser lie Thr Lys Asp Thr ser Lys Asn Gin phe ser 195 200 20S

Leu Lys Leu ser ser val Thr Ala Ala Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys

Ala Ser Ala Ala Tyr T^r Ser Tyr Tyr Asn T^r Asp Gly Phe Ala Tyr

Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr val ser ser 245 250 <210> 33 <211> 251 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> scFv2 <400> 33 Met Ala Gin val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro ser Glu Thr Leu ser Leu Thr cys Thr val ser Gly phe Ser Leu Thr

Ser Tyr lie val Asp .Trp lie Arg Gin Pro pro 35 40

Gly Lys Gly Leu Glu 45

Trp lie Gly val lie Trp Ala Gly Gly Ser Thr 50 55

Gly Tyr Asn Ser Ala

Leu Arg ser Arg val ser He Thr Lys Asp Thr ser Lys Asn Gin Phe 55 70 75 go ser Leu Lys Leu ser ser val Thr Ala Ala Asp Thr Ala val Tvr tvr 8S 90 95 y Cys Ala Ser Ala Ala Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Asn Tyr Asp Gly Phe Ala 100 105 X10 Tyr Trp j技 Gin Gly Thr Leu Thr val Ser ser Gly Gly Gly cly 152708-序列表.doc -13· 201136606

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp val val Met Thr

Gin ser pro Leu ser Leu Pro val Thr Leu Gly Gin Pro Ala ser lie 145 150 155 160

Ser Cys Lys Ser Ser Gin ser Leu Leu Tyr Thr Asp Gly Lys Thr Tyr 165 170 175

Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser Pro Arg Arg Leu lie 180 185

Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp ser Gly val Pro Asp Arg Phe ser Gly 195 200 205

Ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala 215 220

Glu Asp val Gly val Tyr Tyr Cys Leu Gin Ser Thr His Phe Pro His 225 230 235 240

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Glu lie Lys 245 250 <210> 34 <211> 452 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> IgG】重鏈 <400> 34

Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu val Lys Pro Ser Glu IS 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr val ser Gly Phe ser Leu Thr ser Tyr 20 25 30 lie val Asp Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Val lie Trp Ala Gly Gly ser Thr Gly Tyr Asn Ser A"!a Leu Arg 50 55 60

Ser Arg Val Ser lie Thr Lys Asp Th「 Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80

Lvs Leu ser Ser val Thr Ala Ala Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 152708-序列表.doc -14 - 201136606

ser Ala Ala Tyr Tyr ser Tyr Tyr Asn Tyr Asp 6ly Phe Ala Tyr Tro 100 105 110 K

Gly Gin Gly Thr Leu val Thr val ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly pro 115 120 125 ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser ser Lys ser Thr ser Gly Gly Thr 130 135 140

Ala Ala Leu Gly cys Leu val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu pro val Thr 14S 150 155 160 val ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr ser Gly val His Thr Phe pro 165 170 175

Ala val Leu Gin Ser ser Gly Leu Tyr Ser Leu ser ser val val Thr 180 185 190 val Pro Ser ser ser Leu 6ly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn 195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys val Glu Pro Lys ser 210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr* Cys Pro Pro cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255

Met lie Ser Arg Thr Pro Glu val Thr cys val val val Asp val ser 260 265 270

His Glu Asp Pro Glu val Lys Phe Asn Trp Tyr val Asp Gly val Glu 275 280 285 val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 290 295 B00

Tyr Arg val val ser Val Leu Thr val Leu His Gin asd Trp Leu Asn 305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys val ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 B35 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin pro Arg Glu Pro Gin 340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val 355 360 B65 -15· 152708-序列表.doc 201136606 ser Leu Thr Cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala val 370 375 380

Glu rrp du Ser Asn Gly Gin Pro 6lu Asn Asn TVr Lys Thr Thr Pro

Pro val Leu Asp Ser Asp Gly ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr 405 410 415 val asp Lys Ser Arg Trp cln cln ^ Asn val Phe ser gs ser val

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu ser Leu 435 440 445

Ser Pro Gly Lys 450 <210> 35 <211> 219 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> IgGl 輕鏈 <400> 35

Asp val val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro val Thr Leu Gly 15 10 15

Gin pro Ala Ser lie ser cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Thr 2〇 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Arg Pro Gly Gin ser 35 40 45

Pro Arg Arg Leu Πβ Tyr Leu val Ser Lys Leu Asp ser Gly val Pro 5〇 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg val Glu Ala Glu Asp val Gly val Tyr Tyr cys Leu Gin ser 85 90 95

Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Glu He Lys 100 105 110

Arg Thr val Ala Ala Pro ser val Phe lie Phe Pro pro ser Asp Glu 115 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly rhr Ala Ser val val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 152708·序列表.doc •16· 201136606

Tvr Pro Arg Glu Ala Lys val Gin Trp Lys val Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gin Glu ser val Thr 6lu Gin Asp Ser Lys Asp ser 165 170 175

Thr Tyr ser Leu Ser ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lys His Lys val Tyr Ala Cys flu Val Thr His cln Leu sen Ser

Pro val Thr Lys Ser Phe Asn Arg GTy Glu cys 210 215 <210> 36 <211> 225 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> Fab Fd <400> 36

Gin val Gin Leu Gin Glu ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro ser Glu 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr cys Thr val Ser Gly Phe Ser Leu Thr ser Tyr 20 25 30 lie val Asp Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He 35 40 45

Gly val lie Trp Ala Gly Gly ser Thr Gly Tyr Asn Ser Ala Leu Arq 50 55 60

Ser Arg Val Ser lie Thr Lys Asp Thr ser Lys Asn Gin Phe ser lgu 65 70 75 80

Lys ueu ser ser val Thr Ala Ala Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys Ala 85 90 95

Ser Ala Ala Tyr Tyr ser Tyr Tvr Asn Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Tro 100 105 110 μ

Gly Gin Gly Thr Leu val Thr val Ser ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 -17- 152708-序列表.doc 201136606

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro val Thr 145 ISO 155 160 val Ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr ser Gly val His Thr Phe Pro 165 170 175

Ala val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr ser Leu Ser Ser val val Thr 180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn val Asn 195 200 205

His Lys pro Ser Asn Thr Lys val Asp Lys Lys val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 225 <210> 37 <211> 219 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> Fab 輕鏈 <400> 37

Asp val val Met Thr Gin Ser pro Leu ser Leu Pro val Thr Leu Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser He Ser cys Lys Ser Ser Gin ser Leu Leu Tyr Thr 20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Arg Arg Leu lie Tyr Leu val Ser Lys Leu Asp Ser Gly val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe ser Gly ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg val Glu Ala Glu Asp val Gly val Tyr Tyr cys Leu Gin Ser 85 90 95

Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Glu lie Lys 100 105 110

Arg Thr val Ala Ala Pro Ser val Phe lie Phe Pro Pro ser Asp Glu 115 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser val val cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 -18 - 152708-序列表.doc 201136606

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160

Ser Gly Asn ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr ser Leu ser ser Thr Leu Thr Leu ser Lys Ala A|g Tyr Glu 180 185

Lys His Lys va! Tyr Ala Cys Glu Val Thr His dn cly Leu Ser Ser

Pro Val Thr Lys Ser phe Asn Arg Gly Glu cys 210 215 <210> 38 <211> 226 <212> prt <213>人造序列 <220> <223> FabFd 片段 <400> 38

Ala Gin Val Gin Leu Gin Glu ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 15 10 15

Glu Thr Leu ser Leu Thr cys Thr val Ser Gly Phe Ser Leu Thr ser 20 25 30

Tyr lie vaT Asp Trp lie Arg Gin pro pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 ϊΐβ Gly Val lie Trp Ala Gly Gly ser Thr Gly Tyr Asn Ser Ala Leu

Arg ser Arg val ser lie Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe ser 65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala ser Ala Tyr Tyr ser Tyr Tyr Asn Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val ilir val ser ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125

Pro Ser val Phe Pro Leu Ala Pro ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 IB 5 140 -19- 1_52708-序列表.doc 201136606

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro val 145 150 155 160

Thr val ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr ser Gly val His Thr Phe

Pro Ala val Leu Gin ser ser Gly Leu Tyr Ser Leu ser ser val val 180 185 190

Thr val Pro Ser ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn val 195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys val Glu Pro Lys 210 215 220

Ser Cys 225 <210> 39 <211> 220 <212> PRT <213s►人造序列 <220> <223> Fab 輕鍵 <400> 39

Ala Asp val val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro val Thr Leu 1 5 10 15

Gly Gin Pro Ala Ser He ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr 2〇 25 30

Thr Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Arg Pro Gly Gin 35 40 45 ser Pro Arg Arg Leu He τ^γ Leu val Ser Lys Leu Asp Ser Gly val

Pro Asp Arg Phe Ser Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp val Gly val Tyr Tyr cys Leu Gin 85 90 95 ser Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Glu lie 100 105 110

Lys Arg Thr val Ala Ala Pro ser val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125

Glu Gin Leu Lys Ser Gly rhr Ala Ser val val Cys Leu Leu Asn Asn -20· 152708-序列表.doc 201136606

Phe Tyr Pro Arg 145

Glu Ala Lys val Gin Trp Lys val Asp Asn Ala Leu 150 155 160

Gin Ser Gly Asn ser Gin Glu Ser val Thr Glu Gin Asp ser Lys Asp 165 170 175

Ser Thr Tyr ser 180

Leu ser ser Thr Leu Thr Leu ser Lys Ala Asp Tyr 185 190

Glu Lys His Lys 195

Val Tyr Ala Cys Glu val Thr His Gin Gly Leu Ser 200 205

Ser Pro val Thr 210

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu cys 215 220 <210> 40 <211> 452 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> IgGl 重鏈 <4〇〇> 40

Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu val Lys Pro sep Glu 5 10 15

Gin Val Gin Leu 1

Thr Leu Ser Leu 20

Thr cys Thr val ser Gly Phe Ser Leu Thr ser Tyr 25 BO lie val Asp Trp 35 lie Arg Gin pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 40 45

Gly val lie Trp 50

Ala Gly Gly ser Thr Gly Tyr Asn Ser Ala Leu Arg

Ser Arg Val Ser 65 lie Thr Lys Asp Thr ser Lys Asn Gin Phe ser Leu 70 75 80

Lys Leu Ser Ser val Thr Ala Ala Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys Ala

Ser Ala Ala Tyr 100

Tyr Ser Tyr Tyr Asn Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp 105 HO

Gly G1n HiThr

Leu val Thr val Ser Ser Ala ser Thr Lys Gly Pro 120 125 ser val Phe Pro 130

Leu Ala Pro ser ser Lys Ser Thr ser Gly Gly Thr 135 140 152708-序列表.doc -21 201136606

Ala Ala Leu Gly Cys Leu val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro val Thr 145 150 155 160

val Ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly val His Thr Phe Pro 165 170 17S

Ala Val Leu Gin ser Ser Gly L.eu Tyr Ser Leu Ser ser val val Thr 180 185 190 val Pro Ser ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn val Asn 195 200 205

His Lys Pro ser Asn Thr Lys val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 225 230 235 240

Gly Gly Pro ser val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255

Met lie Ser Arg Thr Pro Glu val Thr Cys Val val val Asp val Ser 260 265 270

His Glu Asp Pro Glu val Lys Phe Asn Trp Tyr val Asp Glv val 61u 275 280 285 val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 290 295 300

Tyr Arg val Val ser val Leu Thr val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 B35 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 6ln Pro Arg Glu Pro Gin 340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin val 355 360 365 ser Leu Thr cys Leu val Lys dy Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala val

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400

Pro val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr 405 410 415 -22- 152708-序列表.doc 201136606 val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn val Phe ser cys Ser val 420 425 430

Met His GTu ATa Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 ser Pro Gly Lys 450 -23- 152708-序列表.doc

Claims (1)

1. 201136606 七、申請專利範圍： 1. 一種抗體分子，其能夠中和抗凝血劑之活性。 2. 如請求項1之抗體分子，其中該抗體分子針對抗凝血劑 具有結合特異性。 3. 如請求項1或2之抗體分子，其中該抗凝血劑係直接凝血 酶抑制劑、Xa因子抑制劑、或維生素K拮抗劑。 4. 如請求項1或2之抗體分子，其中該抗凝血劑係達比加群 (dabigatran)、阿加曲班（argatroban)、美拉加群 (melagatran)、希美加群（ximelagatran)、水虫至素（hirudin)、 比伐盧定（bivalirudin)、來匹盧定（lepirudin)、地西盧定 (desirudin)、阿0辰沙班（apixaban)、奥米沙班（otamixaban)、 利伐沙班（rivaroxaban)、去纖維蛋白多核苷酸（defibrotide)、 雷馬曲班（ramatroban)、抗凝血酶III、或地克精-a(drotrecogin alpha)。 5. 如請求項1或2之抗體分子，其中該抗凝血劑係具有通式 (I)之經二取代二環系雜環，其互變異構體、立體異構體 及鹽 Ra - A - Het - B - Ar - E ,(1) 其中 * A表示羰基或磺醯基，該羰基或磺醯基連接至該Het基 之苯并部分、吡啶并部分或噻吩并部分， B表示伸乙基，其中連接至該Ar基之亞曱基可經氧或 硫原子或經-NRr基置換，其中 Rl表示氫原子或Ci_4"•烧基， 152708.doc 201136606 E表示RbNH-C(=NH)-基，其中 Rb表示氫原子、羥基、c〗.9•烷氧基羰基、環己氧 基羰基、苯基-Cw-烷氧基羰基、苯曱醯基、對-Ch-烧基-苯甲醢基或吡啶醯基，同時上述(^9—烷氧基羰 基2-位置處之乙氧基可額外地經Ci3_烷基磺醯基或 2-(Ci.3·烧氧基）-乙基取代， Ar表示視情況經氣原子或經甲基、乙基或甲氧基取代 之1，4-伸苯基，或其表示2,5-伸噻吩基， Het表示烷基）_2,5_伸苯并咪唑基、1-環丙基- 2.5- 伸苯并咪唑基、2,5·伸苯并噻唑基、烷基）- 2.5- 伸吲哚基、l-(Ci.3-烷基）-2,5-伸咪唑并[4,5-b]吡啶 基、3-(Ci-3-烷基）-2,7-伸咪唑并[l，2-a]。比啶基或1-(C丨-3-烷基）-2,5-伸噻吩并[2,3-d]咪唑基，及 Ra表不R2NR3-基，其中 R2係q.4-烷基，其可經羧基、Cl 6_烷氧基羰基、 >氧基Ik基、Ci.3-烧基續醯胺基幾基或1只-四*»坐-5-基取代， 〇2·4·烷基’其可經羥基、苄氧基、羧基_Cl 3_烷基 胺基、Cw-烷氧基羰基-Cy烷基胺基、义⑹.3-烷 基）-羧基烷基胺基或烷基烷氧基 羰基-Cb”烷基胺基取代，同時在上述基團中，與氮 原子相鄰α-位置處之碳原子未經取代， R·3表示C3_7-環烷基、炔丙基（其中該不飽和部分可 不直接連接至該R2NR3基之氮原子）、視情況經氟或 152708.doc 201136606 氣原子、或經曱基或甲氧基取代之苯基、視情況經 甲基取代之吡唑基、嗒唑基或吡啶基，或 R2及R3與介於其間之氮原子一起表示5_或7-員伸 環貌基亞胺基（其視情況經羧基或Cl 4_烷氧基羰基取 代），其可額外地與苯基環稠合。 6.如請求項5之抗體分子，其中該抗凝血劑係選自以下之 化合物： (a) 2-[N-(4-甲脒苯基）-胺基甲基]-苯并嘆唾_5_叛酸_n_ 苯基-N-(2-叛乙基）-酿胺、 (b) 2-[N-(4-甲脒苯基）-N-甲基-胺基甲基]-苯并噻唑_5_ 基缓酸-N-苯基-N-(2-經基幾基乙基）-酿胺、 (c) 1 -甲基- 2-[N-(4-甲肺苯基）-胺基甲基]-苯并咪β坐_5_ 基-羧酸·Ν·苯基-N-(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (d) 1-甲基-2·[Ν-(4-甲脒苯基）-胺基曱基]-苯并味唑_5_ 基-羧酸-Ν-苯基-Ν-(3-羥基羰基丙基）-醯胺、 (e) 1-甲基-2-[Ν-(4-曱脒苯基）-胺基曱基]-苯并咪唾_5_ 基-羧酸-Ν-(2-吡啶基）-Ν-(羥基羰基甲基）-醯胺、 (f) 1-甲基-2-[2-(2-曱脉基°塞吩-5-基）乙基]-笨并„米0坐_ 5-基-羧酸-Ν-(2-吡啶基）-Ν-(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (g) 1-甲基-2-[Ν-(4-曱脒苯基）-胺基甲基]-苯并咪唾_5_ 基-叛酸-Ν-(2-0Λ β定基）-Ν-(2-經基獄基乙基）-酿胺、 (h) 1-甲基-2-[2-(4-甲脉苯基）乙基]••苯并°米唾基-叛 酸-N-(2-°比α定基）-N-(2-經基幾基乙基）-酿胺、 (i) 1-甲基-2-[2-(4-曱脎苯基）乙基]-苯并咪唑·5_基_叛 152708.doc 201136606 酸-N-苯基-N-(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (j) 1-甲基- 2-[2-(4-甲脉苯基）乙基]·苯并咪。坐_5_基_绩 酸-N-苯基_N-[2_(1H-四唑-5-基）乙基]-醯胺、 (k) 1-曱基-2-[Ν-(4·甲脒笨基）·胺基甲基]_苯并咪唾·5_ 基·叛酸-Ν-苯基-Ν-[2-(1Η-四0坐-5-基）乙基]_酿胺、 (l) 1-甲基-2-[Ν-(4-甲脒苯基）-Ν-曱基·胺基曱基]•苯并 咪唑-5-基-羧酸-Ν-(2-吡啶基）-Ν-(2-羥基羰基乙基）_酿 胺、 (m) 1-曱基-2-[Ν-(4-甲脒苯基）-Ν-甲基-胺基甲基]_笨并 咪唑-5-基-羧酸-Ν-(3-吡啶基）-Ν-(2-羥基羰基乙基）·醯 胺、 (η) 1-甲基-2-[Ν-(4-曱脒苯基）-Ν-曱基-胺基甲基]-苯并 味°坐-5-基-叛酸-Ν-苯基-Ν-(2-經基幾基乙基）-醯胺、 (ο) 1-曱基-2-[Ν-(4-甲脒苯基）·胺基甲基]-苯并咪唑_5_ 基-羧酸-Ν-苯基-Ν-[(Ν-羥基羰基乙基-Ν·甲基）-2-胺基乙 基]-醯胺、 (P) 1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基）-胺基甲基]•苯并咪唑-5· 基-缓酸-N-(3 -氟苯基）-N-(2-經基戴基乙基）-酿胺、 (q) 1-甲基-2-[N-(4-甲脒苯基）_胺基甲基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-Ν·(4-氟苯基）-N-(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (r) 1·甲基-2-[N-(4-曱脒基-2-曱氧基-苯基）-胺基甲 基]-苯并咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-(2-羥基羰基乙基）-醯 胺、 (s) 1·曱基-2-[N-(4-甲脒基·2-甲氧基-苯基）-胺基曱 152708.doc -4- 201136606 基]•苯并咪唑-5-基-羧酸-N-(2-。比啶基）-N-(2-羥基羰基乙 基）-醯胺、 ⑴1-甲基-2_[N_(4-曱脒苯基）胺基甲基]-吲哚_5_基-幾 酸-N-苯基-Ν-(2·甲氧基羰基乙基）·醯胺及 (u) 1-甲基-2-[Ν-(4-曱脒苯基）胺基甲基]-噻吩并[2.3_d] 咪唑-5-基-羧酸-N-苯基-N-(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (v) 1-甲基-2-[N-(4-甲脒笨基）_胺基甲基]-苯并咪唑_5_ 基-叛酸-N-苯基-N-(2-經基幾基乙基）-酿胺、 (w) 1-曱基-2-[N-(4-曱脒笨基）-胺基曱基]-苯并咪唑 基-羧酸-N-(2-吡啶基）-N-(2-羥基羰基乙基）-醯胺、 (X) 1-甲基-2-[N-(4_曱脒基-2-甲氧基-苯基）·胺基曱 基]-苯并11 米。坐-5-基-叛酸-N-(2-。比咬基）-N-(2-經基幾基乙 基）_醯胺、 (y) 1-曱基-2-[N-[4-(N-正己氧基羰基甲脒基）苯基卜胺 基曱基卜苯并°米°坐-5-基-叛酸-N-(2- °比°定基）-N-(2-乙氧基 羰基乙基）-醯胺、 其互變異構體、立體異構體及鹽。 7.如請求項2之抗體分子，其中該抗凝血劑係達比加群。 8·如請求項7之抗體分子，其能夠中和達比加群及達比加 群之1-0-醯基葡糖苷酸的活性。 9.如請求項7之抗體分子，其包括具有選自由SEq ID 1 及SEQ ID NO: 2組成之群之CDR1及選自由SEQ iD N0: 3、SEQ id NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、& SEQ id NO: 8組成之群之CDR2、及選自由 152708.doc 201136606 SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 10組成之群之CDR3之重鏈 可變域，及具有選自由SEQ ID NO: 11 ' SEQ ID NO: 12、及 SEQ ID NO: 13 組成之群之 CDR1、SEQ ID NO: 14 之CDR2、及SEQ ID NO: 15之CDR3之輕鏈可變域。 10. 如請求項9之抗體分子，其包括具有SEQ ID NO: 1之 CDR1、選自由 SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、及 SEQ ID NO: 8 組成之群之 CDR2、SEQ ID NO: 10 之 CDR3 之重 鏈可變域，及具有SEQ ID NO: 13之CDR1、SEQ ID NO: 14之CDR2、SEQ ID NO: 15之CDR3之輕鏈可變域。 11. 如請求項9之抗體分子，其包括選自由SEQ ID NO: 16、 18、20、22、24、及26組成之群之重鏈可變域，及選自 由 SEQ ID No: 17、19、21、23、25、及 27組成之群之輕 鏈可變域。 12. 如請求項11之抗體分子，其包括SEQ ID NO: 16之重鏈可 變域，及SEQ ID No: 17之輕鏈可變域；或SEQ ID No: 18之重鏈可變域，及SEQ ID No: 19之輕鏈可變域；或 SEQ ID No: 20之重鏈可變域，及SEQ ID No: 21之輕鏈 可變域；或SEQ ID No: 22之重鏈可變域，及SEQ ID No: 23之輕鏈可變域；或SEQ ID No: 24之重鏈可變域，及 SEQ ID No: 25之輕鏈可變域；SEQ ID No: 24之重鏈可 變域，及SEQ ID No: 27之輕鏈可變域；SEQ ID No: 26 之重鏈可變域，及SEQ ID No: 27之輕鏈可變域。 13. 如請求項1或2之抗體分子，其係多株抗體、單株抗體、 人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、抗體之片段（特定言 152708.doc 201136606 之Fab、Fab·、或F(ab')2片段）、單鏈抗體（特定言之單鏈 可變片段（scFv))、小模組化免疫藥劑（SMIP)、域抗體、 奈米抗體、雙功能抗體、或設計錨蛋白重複蛋白 (DARPin)。 14. 如請求項13之抗體分子，其係scFv，其中該重鏈可變域 及輕鏈可變域經由選自由SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、及SEQ ID NO: 31組成之群之連接 肽連接。 15. 如請求項14之抗體分子，其包括SEQ ID NO: 32、或SEQ ID NO: 33。 16. 如請求項13之抗體分子’其具有包括seq ID NO: 34或 SEQ ID NO: 40之重鏈及包括SEQ ID NO: 35之輕鏈。 17. 如請求項π之抗體，其係具有包括SEq ID N〇: 36或SEq ID NO: 3 8之 Fd 片段，及包括 SEQ ID NO: 37 或 SEQ ID NO: 39之輕鏈之Fab分子。 18·如請求項之抗體分子，其用於醫藥中。 19.如請求項丨或2之抗體分子，其用於治療抗凝血劑療法之 副作用。 2〇.如請求項19之抗體分子，其中該副作用係出血。 21. —種如請求項1至20中任—項之抗體分子之用途，其用 於製造用於治療抗凝血劑療法之副作用之藥物。 22. —種製造如請求項丨至“中任一項之抗體分子之方法， 其包括 a.提供—包括-或多個可編碼該抗體分子之核酸之宿 152708.doc 201136606 主細胞，該核酸與一表現控制序列係以功能性之方 式聯合， b. 培養該宿主細胞，及 c. 自該細胞培養物回收該抗體分子。 152708.doc