TW201119567A - Method for incubating fruiting bodies of Antrodia cinnamomea - Google Patents

Description

201119567 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本案係關於一種培養牛樟芝子實體之方法， 於段木切4句芝子f社紐。 種 【先前技術】 牛樟芝為台灣特有的菌種，僅生長於台灣特有種牛樟 籲樹的中空樹洞中，且生長緩慢。民間盛傳牛掉芝具有治療 癌症緩解農藥中毒等功效，故被大量使用為保健食品。 目刖牛樟芝之來源有野生子實體及液態發酵培養之菌絲 體’近年也有嘗試利用固態發酵培養牛樟芝之方式，以得 到含有二萜類、多醣體、抗氧化物質之牛樟芝榖類發酵 物，惟其效能仍不及野生牛樟芝。 分析牛樟芝子實體產業仍有以下問題亟待解決。首 先，野生牛樟芝子實體供不應求，導致價格連續多年翻 •漲，且市售子實體大多是單薄之一年生菌體，肥厚之多年 生子實體已非常難得且售價高昂，中級品市售價就高達每 台斤9萬元以上’致假貨充斥市場，民眾購買不易，且尚 衍生牛樟树遭非法盜伐及民眾入山竊取森林副產物等林 政問題❶ 此外’民間業者尚有未接種之牛樟樹段木總量達2千 噸以上’而目前接種代工技術之價格每噸段木約以8至1〇 萬元β十算不但4貝格南印且接種技術不成熟。另一方面， 由於野生牛樟芝在感染段木時具有明顯的宿主專一性，而 201119567 僅能感染牛樟樹，若能開發於非牛樟樹材料同段木基質 士 ’以人王栽培生產牛樟芝子龍之技術，預估將具有每 年1.5億元之產品市場潛力。 因此’為了解決上述問題，本案發明人致力於研究牛 樟芝段木接種肋’缝以I栽培方歧量培養牛掉芝 子膏體。 ^ 【發明内容】 、本案之主要目的在於提供一種培養牛樟芝子實體之方 =，其係可自野生牛樟芝順利分離出牛樟芝菌種並接種至 段木上，且透過再次接種混合單孢菌落，增進牛樟芝菌種 之出菇率，以培養出牛樟芝子實體。 為達上述目的，本案之一較廣義實施態樣為提供一種 培養牛樟芝子實體之方法，其包含步驟：（a)自一牛樟芝子 實體取得一子實層切片；（b)將該子實層切片置於一選擇性 _ CT養基中進行培養’俾得到—純化菌種；⑷將該純化菌種 置於庶渣培養基中進行培養，俾形成一增殖菌種；（d) 將該增殖菌種進行液態或固態之增殖培養，俾得到大量液 態或固態菌種；（e)將該液態或固態菌種接種至一段木上進 订培養；以及(f)再次於該段木上接種混合單孢菌落，並培 養至子實體出現。 根據本案之構想，該選擇性培養基包含抗生素及樟腦 油’其中該樟腦油之濃度為0.15-0.30% (vol/vol)。 根據本案之構想，該蔗渣培養基包含1-3% (wt/νοΐχ 201119567 麥芽抽出物、5-20% (wt/vol)之蔗渣、0.25-0.70% (vol/vol) 之掉腦油。 根據本案之構想，該液態增殖培養係將該增殖菌種置 於液態培養基中逐步放大培養，其中該液態培養基包含 1-3% (wt/vol)之麥芽抽出物及0.5-1.0% (wt/vol)之檸檬 酸，且於該液態增殖培養時，更設有一打氣裝置將空氣打 入培養容器中。 根據本案之構想，該固態增殖培養係將該增殖菌種接 種至一太空包進行培養。 根據本案之構想，該段木包括樟科植物、殼斗科植物 及杉科植物，該樟科植物包括牛樟樹及香樟。 根據本案之構想，該段木於接種前須經一前置處理， 其係將該段木表面腐朽之老舊材質進行一刨除處理。 根據本案之構想，該單孢菌落係以該選擇性培養基分 離而得。 根據本案之構想’步驟(f)更包含步驟：（fl)將該單抱 菌落之菌絲體刮下，並進行一增殖培養，俾得到大量單抱 菌落混合菌種；以及（f2)以一喷搶或刷子沾染該單抱菌落 混合菌種並喷施或刷在步驟（e)已接種該液態菌種或固態 菌種並已培養7-30天之該段木表面。 【實施方式】 體現本案特徵與優點的一些典型實施例將在後段的 說明中詳細敘述。應理解的是本案能夠在不同的態樣上暑 201119567 有各種的變化，其皆不脫離本案的範圍，且其中的說明及 圖示在本質上係當作說明之用，而非用以限制本案。 本案係提供一種培養牛樟芝子實體之方法，如第一圖 之流程圖所示，其主要包含步驟：自一牛樟芝子實體取得 一子實層切片（步驟si);將該子實層切片置於一選擇性 培養基中進行培養，俾得到一純化菌種（步驟S2);將該 純化菌種置於一蔗渣培養基中進行培養，俾形成一增殖菌 種（步驟S3);將該增殖菌種進行液態或固態之增殖培養， 俾得到大量液態或固態菌種（步驟S4);將該液態或固態 菌種接種至-段木上進行培養（步驟S5);以及再次於該 段木上接種混合單孢菌落，並培養至子實體出現（步驟 S6)。以下將進一步詳細說明各步驟。 步驟S1 :自一牛樟芝子實體取得一子實層切片 首先，本案係以牛樟樹段木上之野生牛樟芝作為菌種 來源，利用刀片沿著段木上牛樟芝子實體表面以橫切菌孔 的方式薄切下約0.5-1.0 X 0.1-0.5公分（長X寬）大小之子 實層。 步驟S2 :將子實層切片置於一選擇性培卷基中進行培卷， 俾得到一純化菌種 接著進行牛樟芝菌種之分離與純化，將步驟S1取得 之子實層切片置於選擇性培養基之培養皿中央，在20-25 °C中培養10-20天，即可見中央子實層周遭有橘紅色雙轉r 201119567 菌絲長出，而外圍則是由子實層中擔孢子發散後落在選擇 性培養基上所形成的不同呈色之橘紅色單孢菌落，其間亦 會有白色系之單孢菌落出現。 在一實施例中，選擇性培養基係首先以洋菜粉、麥芽 抽出物及水進行調配，其中洋菜粉及麥芽抽出物之濃度分 別為1.5-2.0% (wt/v〇l)及1-3% (wt/vol)。前述溶液經高壓 滅菌後冷卻至40-50 °C時，再加入適量之抗生素及樟腦 油’充分攪拌均勻後倒入培養孤内，待冷卻凝固後即完成 選擇性培養基之製備。其中，抗生素係用以抑制快速生長 之細菌（ Bacteria)類，且所適用之抗生素可包含青黴素類 抗生素’例如安比西林（ampicillin )及盤尼西林G (penicillin G)，但不以此為限’而樟腦油則可用以抑制水 黴菌（water.mold)類、木黴菌Spp)及青 黴菌（尸⑼icz7/h//wspp)等真菌之快速生長，且不阻礙牛掉 芝菌絲體之生長。 舉例而言’選擇性培養基可包含1〇〇_2〇〇 ppm之 ampicillin、100-200 ppm 之 penicillin 〇 及 0.15-0.30〇/〇 (vol/vol)之樟腦油，但不以此為限。 為進一步純化菌種，可再挑選中央子實層周遭新長出 之橘紅色菌絲塊’重複在選擇性培養基上培養以達到純化 之目的’且在此所得之純化雙核菌絲係易於生存，且生長 迅速，適於用做後續之段木初次接種源。 另一方面’亦可挑選外圍不同呈色之橘紅色單孢菌落 或白色系之單孢菌落’對峙培養以達到菌種遺傳多樣性之 r 201119567 目的，如從橘紅色牛樟芝子實體獲得白色系之菌種。 步驟將純化繭後^二蔗渣培卷篡中推扞換 成-增殖菌葙 將步驟S2所得之純化牛樟芝洋菜_置於經滅菌處 理之蔗渣培養基中，於室溫下培養2〇_4〇天後即可當增 菌種使用。 在實把例中，薦〉査培養基包含1-3% (wt/vol)之麥芽 抽出物、5-20〇/〇 (wt/vol)2蔗渣及 〇 25 〇 7〇0/〇 (v〇1/v〇l)之产 腦油。 早 根據本案之構想，使用增殖菌種之目的是為了去除木 黴菌（7>K^〇i/er7waspp)，因為木黴菌在蔗渣培養基極易產 孢而顯不出深綠色菌落，故可藉由肉眼觀察而去除污染木 黴菌之培養瓶，以達到篩選之目的。

驟S 4 :將增殖固態之增殖培卷， 大量液態或固熊简_ 由於進行段木接種需要大量菌種，因此必須將菌種進 行大量培養’而進行大量培養之方式可採液態增殖培養 固態增殖培養。 在液態增殖培養方面，可將步驟S3之蔗渣培養所得 之增殖菌種置於經滅菌處理之液態培養基中進行培養，以 得到接種段木所用之大量液態菌種。 在一實施例中，液態培養基包含1-3% (wt/vol)之麥芽 201119567 抽出物及0.5-l.0% (wt/v〇l)之檸檬酸，其申加入檸檬酸之 目的疋避免細菌如芽抱桿菌（万此"/“5 Spp )等之污染，且 不阻礙牛樟芝菌絲體之生長。 液態增殖培養可分成兩階段進行，第一階段係先將步 驟S3之嚴渣培養所得之增殖菌種置於裝有50-250毫升液 態培養基之三角瓶中，於室溫下靜置或振盪培養7天。第 二階段則將第一階段培養所得之菌種置於裝有液態培養 φ 基且容積為0.5_5公升不等之血清瓶，且配合打氣裝置以 打氣幫浦經0.2微米空氣過濾匣後將空氣打入血清瓶液態 培養基中，血清瓶蓋設計有雙管通氣管裝置，於室溫下打 氣培養7-14天後即可取出當作液態菌種。由於牛樟芝為好 乳菌’因此打氣培養有助於牛樟芝之生長。 另一方面，此大量培養步驟亦可採用固態增殖培養方 式來進行，亦即將步驟S3之蔗渣培養所得之增殖菌種接 種至太空包進行培養。 φ 在一實施例中，太空包係在開口處以高密度海綿緊密 填塞’外繫橡皮筋、绑紮固定，以作為菌絲體代謝所需空氣 過濾及流通管道。太空包内一半容量置放可供菌絲體生長 之基質，並預留基質與菌種擾拌所需之空間，太空包經高 溫滅菌處理並俟基質溫度冷卻至常溫時，取出高密度海綿 將菌種接種於太空包内之基質表層，放回高密度海綿並外 繫橡皮筋固定。 接著，將太空包内之菌種與基質混合均勻後，置於室 内常溫培養，當太空包内菌種培養至肉眼可見菌絲體朱長 - 1- 2 9 201119567 纏繞基質或基質表面長滿菌絲體時，即可用於後續段木接 種。 步驟S5 :將液態或固態菌種接鞴黾一段太上推行坪声 前述步驟S4所得之大量液態或固態菌種將進一步接 種至段木上，而用於接種之段木種類可包括樟科植物如牛 樟樹及香樟等，亦可包括殼斗科植物及杉科植物。 鲁 用於接種之段木不可浸水且須先經過前置處理，該前 置處理係將段木表面腐朽之老舊材質以電動包彳刀或刷輪 機械進行刨除處理’避免殘存於老舊材質之雜菌不易滅菌 而復萌，並與接種之牛樟芝菌種競爭生長空間。之後將段 木以100 C以上之面溫進行蒸汽滅菌處理2小時，冷卻後 取出段木浸泡於經高溫滅菌處理之常溫水中5_1〇分鐘 後’取出段木並瀝乾後即可進行接種。 接種液體菌種時，其係將前置處理瀝乾後之段木立即 鲁浸泡於步驟S4所得之液態菌種中，俾使液態菌種黏附於 段木表面，再以塑膠袋套住段木後置於室内常溫培養7_3〇 天。 除接種液體菌種外，亦可在段木上接種固態菌種，其 係將步驟S4太空包内長滿菌絲體之基質取出，直接塗抹 於段木表面’亦可取長滿菌絲體之基質150公克加入無菌 水1 A升與f基纖維素15公克授碎成乳膏狀後，以刷子 塗抹在段木表面當作接種，再以塑膠袋套住段木後置於室 内常溫培養7-30天。 201119567 MJA 1 為增進牛樟芝菌種之出兹率，以培養出牛掉芝子實 體，本案方法係於已接種液態菌種或固態菌種並已培養 7-30，之段木表面再次接種混合單抱祕。此處所指:單 孢菌落較佳為從不同地區或不同段木牛樟芝子實體分離 所得之選擇性培養基上的多個單抱菌落，亦可為前述步驟 S2之選雜培養基上相部分由子實層巾擔孢子發散後 落在選擇性培養基上所形成的不同呈色之單孢菌落。 接種時，係將選擇性培養基上多數單孢菌落之菌絲體 别下，進行-增殖培養（例如置於經滅菌處理之液離典養 基中’配合打氣裝置於室溫下打氣培養7_14天，或^步 驟S4所述之液態或固態增殖培養），即可得到單孢菌落混 合菌種’再以喷搶或刷子沾染單孢菌落混合菌種並喷施或 刷在步锁S5已接種液態菌種或固態菌種並已培養7·3〇天 鲁之段木表面，再以塑膠袋套住段木後置於室内常溫培養， 7-14天後打開塑膠袋並置於室内常溫培養至子實體出 現，其中，該子實體係指顯微鏡鏡檢已有擔子體（Ms·) 及擔孢子（basidiospores)出現之兹體。 綜上所述’纟案係提供一種培養牛樟芝子實體之方 法’其首先將取自牛樟芝子實體之子實層切片置於選擇性 培養基中進行培養’由於選擇性培養基中含有掉腦油，可 有效抑制水黴菌、木黴菌及青黴菌等真菌之生長，且不阻 礙牛樟芝菌絲體之生長。隨後以紐培養基進行培養，由 201119567 於木黴菌在蔗渣培養基中極易產孢而顯示出深綠色菌 落，故可以肉眼進一步篩選。在大量液態或固態增殖培養 後’即可將㊆種接種至段木上’在此步驟中所接種之液態 或固態菌種係為雙核菌絲’由於雙核菌絲易於生存且生長 迅速’故可在段木上生長良好並纏據（c〇l〇njzed)在段木 表面’亦可防止雜菌生長。然而由於牛樟芝性別為四極性 塑（heterothallic-tetrapolar)，為提高單孢配對具親合性之 比例’本案方法係於已接種液態菌種或固態菌種並已培養 7-30天之段木表面再次接種混合單孢菌落，其有助於單核 體菌株近親雜交或單核體菌株自交配對之發生，以利於形 成新的雙核菌絲，進而形成子實體。另外，單核體菌株與 雙核體菌株之間亦具有親合性，其中單核體菌株會被雙核 體菌株雙核化，亦有助於加速出菇。因此，透過本案之方 法，可於段木上以人工栽培生產牛樟芝子實體，具有極大 之卞場潛力。是以’本案之培養牛樟芝子實體之方法極具 產業之仏值，且符合各項專利要件，爰依法提出申請。 本案得由熟知此技術之人士任施匠思而為諸般修飾， 然皆不脫如附宇請專利範圍所欲保護者。 【圖式簡單說明】 第-圖·其麵本案培養牛樟芝子實體之方法流程圖〇 【主要元件符號說明】 S1〜S6 ·本案培養牛樟芝子實體之方法 12

Claims (1)

1. 201119567 七、申請專利範圍： 1·一種培養牛樟芝子實體之方法，其包含步驟： (a) 自一牛樟芝子實體取得一子實層切片； (b) 將該子實層切片置於一選擇性培養基中進行培 養’俾得到一純化菌種； (c) 將該純化菌種置於一蔗渣培養基中進行培養，俾形 成一增殖菌種； φ (d)將該增殖菌種進行液態或固態之增殖培養，俾得到 大量液態或固態菌種； 0)將該液態或固態菌種接種至一段木上進行培養；以 及 (f)再次於該段木上接種混合單孢菌落’並培養至子實 體出現。 2·如申請專利範圍第1項所述之培養牛樟芝子實體之方 法’其中該選擇性培養基包含抗生素及樟腦油。 • 3·如申請專利範圍第2項所述之培養牛樟芝子實體之方 法，其中該樟腦油之濃度為0.15-0.30% (vol/v〇l)。 4. 如申清專利範圍第1項所述之培養牛樟芝子實體之方 法’其中該森’/查培養基包含1_3% (wt/vol)之麥芽抽出物 5_20°/。（wt/vol)之蔗渣及 0.25-0.70% (v〇l/v〇l)之樟腦油。 5. 如申請專利範圍第1項所述之培養牛樟芝子實體之方 法，其中該液態增殖培養係將該增殖菌種置於液態培養義 中逐步放大培養》 A 13 201119567 6·如申請專利範圍第5項所述之培養牛樟芝子實體 法’其中該液態培養基包含1-3% (wt/vol)之麥芽插-方 0.5-1.0% (wt/vol)之擰檬酸。 出物及 7·如申請專利範圍第丨項所述之培養牛樟芝子實體 法’其中於該液態增殖培養時，更設有-打氣I置將= 打入培養容器中。 &氣 實體之方 一太空包 8·如申請專利範圍第1項所述之培養牛樟芝子

   法，其中該固態增殖培養係將該增殖菌種接種至 進行培養。 9·如申請專利範圍第丨項所述之培養牛樟芝子實體之方 法’其中該段木包括樟科植物、殼斗科植物及杉科植物， 該樟科植物包括牛樟樹及香樟。 10.如申請專利範圍帛i項所述之培養牛樟芝子實體之方 ^，其中該段木於接種前須經-前置處理，其係將該段木 表面腐朽之老舊材質進行一刨除處理。 η·如申請專利範11帛1項所述之培養牛樟芝子實體之方 法’其中該物㈣係㈣選擇性培養基分離而得。 :如申：專利範圍第U項所述之培養牛樟芝子實體之方 法’其中步騾⑴更包含步驟： (fi)將該單抱菌落之菌絲體刮下，並進行一增殖土 養，俾得到大量單孢菌落混合菌種；以及 倾或刷子沾染該單抱菌落混合菌種並⑽ ;戈:在步驟(e)已接種該液態菌種或固態菌種並已則 7-30天之該段木表面。