CN113040005A - 牛樟芝yzz-09-xz-01的母种培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了牛樟芝YZZ‑09‑XZ‑01的母种培养基，所述母种培养基包括以下质量百分含量组分：60～80％香樟木屑、5～10％米粉、5～10％大豆粉、2～8％蛋白胨、1～5％葡萄糖、0.1～0.5％磷酸二氢钾、0.1～0.5％硫酸镁、0.1～0.5％硝酸钙、0.1～0.5％硫酸亚铁、0.1～0.5％VB1、1～2％琼脂；所述牛樟芝(Taiwanofungus camphoratus)YZZ‑09‑XZ‑01，于2020年08月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC No.20234，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明的优点是：母种培养基高效、无毒、安全、简便，通过液体发酵培养，可实现高效的生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别涉及牛樟芝YZZ-09-XZ-01的母种培养基及其应用。
背景技术
牛樟芝(Taiwanofungus camphoratus(M.Zang&C.H.Su)Sheng H.Wu,Z.H.Yu,Y.C.Dai&C.H.Su)隶属于担子菌门(Basidiomycota)、层菌纲(Hymenomycetes)、多孔菌目(Polyporales)、多孔菌科(Polyporaceae)、台芝属(Taiwanofungus)，具有马蹄形或不规则状的子实体，多年生，菌肉浅黄色，菌管棕红色至红褐色，孔口圆形；担孢子长椭圆形至圆柱形；菌落棕黄色或至红色。
牛樟芝主要寄生于中国台湾的牛樟树(Cinnamomum kanehirai(Hayata) Hayata)腐朽心材内壁，或枯死倒地的牛樟木材潮湿表面，具有极大的药用价值且野生数量极少，是一种原产于中国台湾的珍稀食药用真菌，也是中国中国台湾的地道药材，因此中国中国台湾人民赋予了牛樟芝“中国台湾森林红宝石和中国台湾瑰宝”之称。
牛樟芝所含生理活性物质种类丰富，其主要的活性成分为三萜类物质、樟芝多糖和腺苷，还含有SOD、有机锗、微量元素、蛋白质、麦角固醇、维生素、烟碱酸、核酸凝集素、几丁质和木质素等药用价值极高的物质，主要药理功效有抗肿瘤、保肝、解毒、解酒、抗肝病，提高免疫力、抗氧化、消炎、抗过敏、降血糖、降血脂和降血压等。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种高效的牛樟芝 YZZ-09-XZ-01的母种培养基。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：牛樟芝 YZZ-09-XZ-01的母种培养基，所述母种培养基包括以下质量百分含量组分：60～80％香樟木屑、5～10％米粉、5～10％大豆粉、2～8％蛋白胨、1～ 5％葡萄糖、0.1～0.5％磷酸二氢钾、0.1～0.5％硫酸镁、0.1～0.5％硝酸钙、0.1～0.5％硫酸亚铁、0.1～0.5％VB1和1～2％琼脂；所述牛樟芝(Taiwanofungus camphoratus)YZZ-09-XZ-01，于2020年08月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC No.20234，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明提供的牛樟芝母种培养基包括香樟木屑。所述香樟木屑指香樟树种的木材加工得到的木屑。按质量百分含量计，所述香樟木屑优选为60～80％，更优选为70％。所述香樟树种隶属于樟科树种的一种。牛樟芝菌种能够在快速吸收利用所述香樟木材提供的营养物质，并且使菌丝长势快速。
本发明提供的牛樟芝母种培养基包括米粉。按质量百分含量计，所述米粉优选为5～10％，更优选为10％。所述米粉为菌种提供碳源。所述米粉的来源不做特殊限制，采用本领域所熟知的大米米粉即可。
本发明提供的牛樟芝母种培养基包括大豆粉。按质量百分含量计，所述大豆粉优选为5～10％，更优选为10％。所述大豆粉为菌种的生长提供氮源。所述大豆粉的来源不做特殊限制，采用本领域所熟知的大豆粉即可。
本发明提供的牛樟芝母种培养基包括葡萄糖。按质量百分含量计，所述葡萄糖优选为1～5％，更优选为2％。所述葡萄糖为菌种的生长提供碳源。所述葡萄糖的来源不做特殊限制，采用本领域所熟知的葡萄糖即可。
本发明提供的牛樟芝母种培养基包括蛋白胨。按质量百分含量计，所述蛋白胨优选为2～8％，更优选为4.5％。所述蛋白胨为菌种的生长提供氮源。所述蛋白胨的来源不做特殊限制，采用本领域所熟知的蛋白胨即可。
本发明提供的牛樟芝母种培养基包括磷酸二氢钾。按质量百分含量计，所述磷酸二氢钾优选为0.1～0.5％，更优选为0.5％。所述磷酸二氢钾为菌种的生长提供无机盐。所述磷酸二氢钾的来源不做特殊限制，采用本领域所熟知的磷酸二氢钾即可。
本发明提供的牛樟芝母种培养基包括硫酸镁。按质量百分含量计，所述硫酸镁优选为0.1～0.5％，更优选为0.5％。所述硫酸镁为菌种的生长提供无机盐。所述硫酸镁的来源不做特殊限制，采用本领域所熟知的硫酸镁即可。
本发明提供的牛樟芝母种培养基包括硝酸钙。按质量百分含量计，所述硝酸钙优选为0.1～0.5％，更优选为0.5％。所述硝酸钙为菌种的生长提供无机盐。所述硝酸钙的来源不做特殊限制，采用本领域所熟知的硝酸钙即可。
本发明提供的牛樟芝母种培养基包括硫酸亚铁。按质量百分含量计，所述硫酸亚铁优选为0.1～0.5％，更优选为0.4％。所述硫酸亚铁为菌种的生长提供无机盐。所述硫酸亚铁的来源不做特殊限制，采用本领域所熟知的硫酸亚铁即可。
本发明提供的牛樟芝母种培养基包括VB1。按质量百分含量计，所述VB1优选为0.1～0.5％，更优选为0.1％。所述VB1为菌种的生长提供维生素。所述VB1的来源不做特殊限制，采用本领域所熟知的VB1即可。
本发明提供的牛樟芝母种培养基包括琼脂。按质量百分含量计，所述琼脂优选为1～2％，更优选为1.5％。所述琼脂为母种培养基提供凝固剂。所述琼脂的来源不做特殊限制，采用本领域所熟知的琼脂即可。
本发明提供的牛樟芝母种培养基包括水。所述水优选为蒸馏水。用水调整培养基的含水量。所述牛樟芝母种培养基的含水量优选为65％。
作为优选，所述母种培养基包括以下质量百分含量组分：70％香樟木屑、10％米粉、10％大豆粉、4.5％蛋白胨、2％葡萄糖、0.5％磷酸二氢钾、 0.5％硫酸镁、0.5％硝酸钙、0.4％硫酸亚铁、0.1％VB1和1.5％琼脂。
作为优选，所述母种培养基的pH为5.5。
作为优选，所述母种培养基的含水量为60％～70％。
本发明还提供了一种所述母种培养基在生产牛樟芝菌母种上的应用。
本发明还提供了一种所述牛樟芝菌母种的生产方法，包括以下步骤：
(1)将所述的牛樟芝母种培养基装入三角瓶中，灭菌，倒皿，得到灭菌的牛樟芝母种培养基；
(2)将牛樟芝接种至所述灭菌的牛樟芝母种培养基中，培养，得到牛樟芝母种。
作为优选，所述步骤(1)中灭菌为高压蒸汽灭菌；所述高压蒸汽灭菌的压力为0.11～0.13Mpa；所述高压蒸汽灭菌的时间为30min。
作为优选，所述步骤(2)中接种时牛樟芝的接种量为5～10％。
作为优选，所述步骤(2)中培养条件为：温度为28℃，湿度为60％。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的牛樟芝综合性状较好，生长速度快，性状优良，实用性强，适用于生产。
(2)本发明所述的母种培养基高效、无毒、安全、简便，通过液体发酵培养，可实现高效的生产。
附图说明
图1为牛樟芝菌种接种至母种培养基培养1周后的生长情况，其中图1-A为组织分离培养7天的生长情况；图1-B为培养14天左右生长情况。
图2为牛樟芝菌种转接至液体培养基培养1周后的生长情况；图2-A 为菌种液体培养7天的生长情况；图2-B为液体培养14天的生长情况。
图3为牛樟芝菌种接种至PDA培养基培养1周后的生长情况。
图4为牛樟芝菌种接种至母种培养基培养30d后冷藏保存6个月的母种状态。
图5为系统发育树。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
牛樟芝YZZ-09-XZ-01的母种培养基的制作方法：
按照如下质量百分含量称量各组分：70％香樟木屑、10％米粉、10％大豆粉、4.5％蛋白胨、2％葡萄糖、0.5％磷酸二氢钾、0.5％硫酸镁、0.5％硝酸钙、0.4％硫酸亚铁、0.1％VB1、1.5％琼脂，加水定容，调整培养基的 pH为5.5。装入三角瓶后封口，采用高压蒸汽灭菌，排除冷空气后在 0.110Mpa下保持30min，灭菌完毕，取出置于超净工作台中，经过20min紫外线杀菌后，在超净工作台上倒入培养皿内做成平板，冷却备用。
实施例2
牛樟芝YZZ-09-XZ-01的母种培养基的制作方法：
按照如下质量百分含量称量各组分：80％香樟木屑(煮汁过滤)、5％米粉、5％大豆粉、2％葡萄糖、6％蛋白胨、0.1％磷酸二氢钾、0.1％硫酸镁、 0.1％硝酸钙、0.1％硫酸亚铁、0.1％VB1、1.5％琼脂混合，加水定容，调整培养基的pH为5.5，装入三角瓶后封口，采用高压蒸汽灭菌，排除冷空气后在0.13Mpa下保持30min，灭菌完毕，取出置于超净工作台中，经过20min紫外线杀菌后，在超净工作台上倒入培养皿内做成平板，冷却备用。
实施例3
牛樟芝YZZ-09-XZ-01的母种培养基的制作方法：
按照如下质量百分含量称量各组分：70％香樟木屑、10％米粉、10％大豆粉、4.5％蛋白胨、2％葡萄糖、0.5％磷酸二氢钾、0.5％硫酸镁、0.5％硝酸钙、0.4％硫酸亚铁、0.1％VB1和1.5％琼脂，加水定容，调整培养基的pH为5.5。装入三角瓶后封口，采用高压蒸汽灭菌，排除冷空气后在 0.110Mpa下保持30min，灭菌完毕，取出后在超净工作台上倒入培养皿中做成平板，冷却备用。
将实施例1-3制备的母种培养基将牛樟芝子实体经酒精消毒外表面后进行接种，将菌种切取2mm×2mm×2mm立方块接种至母种培养基中，接种量为5％。每种培养基重复接种3个。接种后在28℃的培养箱中培养，每天观察菌丝生长情况，将污染的或未萌发的平板剔除。统计接种成功率并拍照记录菌丝生长情况。
对比例1
按照实施例1的方法将牛樟芝菌种接种至PDA培养基上，每种培养基重复接种3个。接种后在28℃的培养箱中培养，每天观察菌丝生长情况，将污染的或未萌发的平板剔除。统计接种成功率并拍照记录菌丝生长情况。
图1为牛樟芝菌种接种至母种培养基培养1周后的生长情况，由图 1可知，菌种生长速度较快，菌落整体呈橘红色，菌丝粗壮、长满整个培养皿。
图3为牛樟芝菌种接种至PDA培养基培养1周后的生长情况，由图 3可知，在PDA培养基上培养一周后的菌丝生长较慢，菌落整体呈黄色，且菌丝生长势较弱。
实施例4
将实施例1-3制备的母种培养基在接种菌种后培养30d后置于4℃的冷藏柜中保存6个月，观察菌种状态并拍照记录。
图4为牛樟芝菌种接种至母种培养基培养30d后冷藏保存6个月的母种状态。试管内菌丝少量变黄色外，培养基内菌丝仍然无萎缩现象，培养基未软化、淌黄水现象，这说明采用本发明提供的母种培养基制备的牛樟芝母种质量较好。
实施例5
将实施例4中冷藏保存6个月后的母种按照实施例1的方法转接入新的实施例1制备的母种培养基中，接种过程中发现，菌丝并未从培养基中脱落下来，接种后的平板在28℃条件下培养20d，每天观察并记录菌种的生长情况。
转接48h后菌丝萌发迅速、并且表现出强劲的生长态势。
由上述实施例结果表明，本发明提供的培养基用于培养牛樟芝母种，可以解决牛樟芝母种菌丝纤弱、生长缓慢、易老化、活化时菌丝萌发难的问题，为后续保存菌种提供新方法。
牛樟芝YZZ-09-XZ-01的基因测序结果：
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATTGTATTTGAAAGGGGTTGTAGCTGAC CTCCTCTTGAAAAGGGGGGAGGTATGTGCACACCTCTGTTCATTCATATTCTCTCACACCT GTGCATGCTTTGTAGGTTGGTTTTGAATGGTTGTCTTCTCTGATGGAGACAGCTGTTTTGA CCTTCCTATGTTTTTTAAATTGACTCCGTATCAGTTACAGAATGTATGTTGCGTGTAACGC ATATTGTATAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACACGGCGAA ATGTGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTG CGCTCCTTGGTATTCTGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGGAATTATCAACCCTTCTG ACTTTTTGTTGAATGGGCTTGGATTTGGAGGGTTAAATTGCTGGCTCTTCTTTTTGATTCA GCTCCTCTTGAATGCATTAGCTTGAACCCTTGTGGATTGACCTTATCGGTGTGATAGTCAT CTATGCCGTGGTTGTCTGAGGTGGGATCGGCTTCTAATGGTGCAAGTCCCTTCAGGGGGAT GATTTTCTAATGACCTTCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA
本发明所述方法全过程均在室内人为控制温湿度条件下完成，所使用的材料均经过消毒灭菌，且每个操作程序均保证在超净工作环境中进行，可以提高生产效益，大大缩短培养时间，同时避免培养过程中的污染问题。
本发明所述牛樟芝YZZ-09-XZ-01的培养特性：
牛樟芝菌落初期橘黄色、圆形，厚度中等，绒毛状，后期颜色变深，为橘红色至鲜红色；菌丝较密，15-20天长满皿，平均萌发率100％。
本发明提供的所述培养基中，牛樟芝菌丝对香樟木屑具有较高的利用性能，可持续为菌丝生长提供营养，配合在短期内大豆粉和蛋白胨提供氮源，大米和葡萄糖提供碳源，以及硝酸钙、磷酸二氢钾、硫酸镁和硫酸亚铁提供无机盐，使菌丝快速适应新环境的营养，保证了菌丝旺盛、快速的生长。采用本发明提供的牛樟芝母种培养基制备母种，牛樟芝菌种长满培养皿，生长速度具有明显优势，同时菌丝粗壮，活力强，而在相同的培养条件下，采用常规母种培养基PDA培养基制备牛樟芝母种，菌丝细弱，且菌丝生长速度缓慢，且未充满培养皿，而且菌丝有老化、萎蔫现象出现，这表明本发明提供的牛樟芝母种培养基比常规PDA培养基在牛樟芝母种制备中具有无可比拟的优势，克服了牛樟芝母种制备的障碍。
同时，由于现有技术中采用PDA培养基培养牛樟芝母种还存在培养 20天后气生菌丝开始变白，在扩繁时萌发较慢等问题，采用本发明提供的母种培养基，由于组分中包含木屑成分，使菌种在短时间利用蛋白胨、葡萄糖等易于吸收利用的营养物质快速生长，在后期长势健壮的菌种适应新环境后，可充分利用木屑、大米、大豆的营养物质，不仅保证菌丝后续营养供应充足，还保持了菌丝健壮长势，从而提高萌发效率。
本发明所述牛樟芝YZZ-09-XZ-01的分子鉴定试验
(1)材料：
高温灭菌器、离心机、离心管、移液枪、移液枪头、剪刀、锥形瓶、微波炉、蒸馏水、ITS4引物、ITS5引物、实验服、口罩、橡胶手套、琼脂糖、BM2000+DNAMaker试剂、荧光染料、溴酚蓝染料溶液、TAE电泳缓冲液、mix、无菌水、无水乙醇、液氮、研钵、研磨棒、手术刀、消毒酒精、脱脂棉、电子秤、PCR仪、D3195-01HP Fungal DNA Mini Kit(50) 试剂盒。
(2)DNA提取
CTAB法提取DNA步骤。
a.将样品放入研钵中加入适量的液氮进行研磨破壁处理。放入相应编号的2.0ml离心管中。
b.分别加入600μl BufferCP试剂和10μl的β-巯基乙醇(在通风橱中操作)。
c.65℃金属浴30min，每隔10min摇匀一次。
d.加入600μl(氯仿：异戊醇24：1)混合溶液，并且上下翻转5～10 秒；10000转离心5min。
e.取上清液移入装有150μl BufferCXD与300μl无水乙醇混合溶液的离心管中，并且利用移液枪混合。
f.吸取600μl的混合液至HiBind DNA吸附柱上；10000转离心 1min。
g.摒弃收集管中的液体，加入650μl SPW Wash Buffer试剂离心 10000转1min处理，此步骤重复两次。
h.12000转离心干燥处理5min。
i.加入50μlElution Buffer试剂静置5min后12000转离心2min；此步骤重复两次。
j.开盖静置5min以挥发其中的无水乙醇。
k样品-20℃进行保存。
(3)PCR扩增和电泳检测
PCR扩增反应体系选用25μl反应体系，其中包括10x扩增缓冲液含mix试剂12.5μl，引物正向与反向各0.5μl，DNA样品1.0μl，用 ddH2O10.5μl定容至25μl。
将上述提取和扩增出的DNA取3.0μl与0.3μl溴酚蓝溶液(40％蔗糖，0.25％溴酚蓝)混匀，在含5‰Super GelRed核酸染料的1％琼脂糖凝胶于1.0×TAE缓冲液中电泳，电泳电压90V，电泳30min后停止，将凝胶取出后在凝胶成像系统观察所得PCR的分子量，记录并保存结果。
(4)测序
将PCR成功获得的ITS扩增片段样品送至北京擎科生物技术有限公司进行测序，最终得到样品的双向ITS序列片段文件。
(5)数据分析
得到测序文件后首先通过BioEdit软件打开观察峰值，每个峰值对应一个碱基，筛选其中没有杂峰污染的序列进行复制；通过利用NCBI 网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)BLAST来估计其遗传距离，下载并保存NCBI中用到的比对基因库数值，将每个物种的序列与研究物种的所有其他序列进行比对。
结果表明，该菌与其他牛樟芝相似度均在99％以下；用这株牛樟芝 YZZ-09-XZ-01(M-9)的分子数据构建系统发育树，其中该菌株与牛樟芝亲缘关系最近，如图5所示；结果表明，该牛樟芝与其他牛樟芝在同一支系，但亲缘关系较远。
以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 张颖
郑元
杨宇明
<120> 牛樟芝YZZ-09-XZ-01的母种培养基及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 681
<212> DNA
<213> 牛樟芝(Taiwanofungus camphoratus)
<400> 2
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta ttgtatttga aaggggttgt agctgacctc 60
ctcttgaaaa ggggggaggt atgtgcacac ctctgttcat tcatattctc tcacacctgt 120
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ggggatgatt ttctaatgac cttctgacct caaatcaggt aggactaccc gctgaactta 660
agcatatcaa taagcggagg a 681
Claims (8)
1.牛樟芝YZZ-09-XZ-01的母种培养基，其特征在于：所述母种培养基包括以下质量百分含量组分：60～80％香樟木屑、5～10％米粉、5～10％大豆粉、2～8％蛋白胨、1～5％葡萄糖、0.1～0.5％磷酸二氢钾、0.1～0.5％硫酸镁、0.1～0.5％硝酸钙、0.1～0.5％硫酸亚铁、0.1～0.5％VB1和1～2％琼脂；所述牛樟芝(Taiwanofungus camphoratus)YZZ-09-XZ-01，于2020年08月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC No.20234，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的母种培养基，其特征在于：所述母种培养基包括以下质量百分含量组分：70％香樟木屑、10％米粉、10％大豆粉、4.5％蛋白胨、2％葡萄糖、0.5％磷酸二氢钾、0.5％硫酸镁、0.5％硝酸钙、0.4％硫酸亚铁、0.1％VB1和1.5％琼脂。
3.根据权利要求1所述的母种培养基，其特征在于：所述母种培养基的pH为5.5。
4.一种如权利要求1-3任一项所述母种培养基在生产牛樟芝菌母种上的应用。
5.根据权利要求4所述牛樟芝菌母种的生产方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将所述的牛樟芝母种培养基装入三角瓶中，灭菌，倒皿，得到灭菌的牛樟芝母种培养基；
(2)将牛樟芝接种至所述灭菌的牛樟芝母种培养基中，培养，得到牛樟芝母种。
6.根据权利要求5所述牛樟芝菌母种的生产方法，其特征在于：所述步骤(1)中灭菌为高压蒸汽灭菌；所述高压蒸汽灭菌的压力为0.11～0.13Mpa；所述高压蒸汽灭菌的时间为30min。
7.根据权利要求5所述牛樟芝菌母种的生产方法，其特征在于：所述步骤(2)中接种时牛樟芝的接种量为5～10％。
8.根据权利要求5所述牛樟芝菌母种的生产方法，其特征在于：所述步骤(2)中培养条件为：温度为28℃，湿度为60％。
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2021
- 2021-01-15 CN CN202110058066.6A patent/CN113040005A/zh active Pending
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