CN115044496B

CN115044496B - 一种生防菌株及其在缓解植物干旱中的应用

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Publication number: CN115044496B
Application number: CN202210517592.9A
Authority: CN
Inventors: 黄思杰; 张孝飞; 韩笑; 王超; 李妍; 田伟; 刘明庆; 张纪兵; 席运官
Original assignee: Nanjing Institute of Environmental Sciences MEE
Current assignee: Nanjing Institute of Environmental Sciences MEE
Priority date: 2022-05-12
Filing date: 2022-05-12
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2042-05-12
Also published as: CN115044496A

Abstract

本发明涉及一种生防菌株及其在缓解植物干旱中的应用，所述生防菌株为8141，其保藏编号为GDMCC No:62291。上述菌株8141经鉴定为成团泛菌Pantoea agglomerans。温室试验结果显示，由上述菌株8141制成的微生物菌剂能有效提高植物对干旱环境的适应性，表现在可以通过增加脯氨酸(Pro)的含量来清除细胞内积累的丙二醛(MDA)，从而增强植物抵御干旱胁迫的能力；可以缩小气孔开度、降低蒸腾作用来减少水分蒸发；可以调控抗旱基因NCED1和RD29B的表达来调节植物抗旱能力；同时促进植物幼苗的生长，有助于缓解干旱胁迫对植物生长的影响。采用上述菌剂灌根处理可以有效提高植物在干旱环境中的耐受性，其具有很好的抗旱促生效果，有较大的潜力开发成商业化的活菌生防制剂。

Description

一种生防菌株及其在缓解植物干旱中的应用

技术领域

本发明涉及植物抗旱技术领域，尤其涉及一种生防菌株及其在缓解植物干旱中的应用。

背景技术

在非生物胁迫中，干旱胁迫是制约植物生长的重要原因之一。干旱胁迫会引起植物产生负效应，如产生对植株有害的活性氧(reactive oxygen species，ROS)等。研究表明，植物会与根际微生物建立有益的关系从而抵御非生物胁迫。植物在长期的进化过程中，根际土壤微生物可能与周围的环境协同进化，从而对植物的生长发育和抵抗逆境具有重要作用，如活化营养帮助养分循环、诱导植物产生抗病性、产生拮抗作用抑制土壤中的有害病原菌和帮助植物抵御非生物胁迫等。但是能提高植物抗旱能力的微生物菌株目前较少，目前需要更多更有效地微生物菌株的开发利用。

拟南芥基因组小，由五对染色体组成。其基因组序列已于2000年由国际拟南芥基因组合作联盟联合完成。拟南芥基因组约为12,500万碱基对，包含约2.6万个基因，编码约2.5万种蛋白质。通过物理(如辐射处理)、化学(如EMS诱变)及生物(如利用植物内源转座子或者根瘤农杆菌将DNA片段转入拟南芥基因组)的手段，已获得大量的发生在不同基因位点的突变体。研究人员建立了若干种质资源中心，方便了突变体的获取和交流。如今拟南芥已成为全球应用最广泛的模式植物，故而在拟南芥上开展抗旱研究具有一定的代表性。

根际土壤中存在着大量的植物根际促生菌，能够产生植物生长调节因子，如合成植物生长发育所需的生长素、赤霉素和细胞分裂素等，或降低植物内源乙烯的含量，从而缓解逆境胁迫对植物生长的影响，目前投入应用的微生物菌株较少，因此，寻找一种微生物菌株并在拟南芥上开展抗旱研究是一种有前途的提高植物抗旱能力的方法。

发明内容

为了克服现有技术中的至少一个问题，本发明分离并筛选了一种生防菌株8141，其为成团泛菌Pantoea agglomerans，该菌株制备成的微生物菌剂可有效提高植物抗旱能力，并促进植物生长，且将上述微生物菌剂和农业栽培措施结合起来使用，可使其能尽量发挥其本身的潜能。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种生防菌株，所述生防菌株为8141(成团泛菌)，其分类命名为Pantoea agglomerans，其保藏编号为GDMCC No:62291，保藏日期为2022年3月14日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。

进一步地，所述生防菌株为8141的16S rRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个方面是提供一种微生物菌剂，其包括上述生防菌株8141或由上述生防菌株8141发酵培养制备。

进一步地，所述微生物菌剂采用湿菌与菌体保藏液按1：20～60g/mL进行配制。其中，所述湿菌为所制备的生防菌株8141的培养菌液；所述菌体保藏液包括玉米面、豆饼粉、豆粕粉中的一种或多种，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖中的一种或多种，鱼粉，矿质营养元素。具体地，所述菌体保藏液的配方为玉米面、豆饼粉、豆粕粉中的一种或多种5～10g，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖中的一种或多种3～6g，鱼粉2～8g，磷酸二氢钾0.1～0.5g，硫酸亚铁0.1～0.5g，硫酸镁1～5g，硫酸锰0.1～0.5g，碳酸钙0.1～0.5g，配平至1L。可理解的是，上述菌体保藏液可为本领域常规使用的保藏液。更进一步地，所述湿菌与菌体保藏液的配制浓度为1：40g/mL。

进一步地，所述微生物菌剂中活菌总浓度为5×10⁹～1×10¹⁰CFU/mL；例如可为5×10⁹CFU/mL、8×10⁹CFU/mL、1×10¹⁰CFU/mL等。

进一步地，所述微生物菌剂可室温保存2～3年。

进一步地，所述微生物菌剂还包括农药学上可接受的助剂，包括但不限于：分散剂、稳定剂、载体等。上述微生物菌剂的剂型包括但不限于：液体制剂、固体制剂(如粉剂)等。

进一步地，所述微生物菌剂在稀释后进行应用，稀释倍数为50～1000倍，稀释后的浓度为1×10⁷～9×10⁷CFU/mL；优选微生物菌剂中活菌总浓度为5×10⁹CFU/mL，将其稀释至5×10⁷CFU/mL后使用。

本发明的第三个方面是提供一种生防菌株的培养方法，其包括步骤：将上述生防菌株8141接种到培养基中培养，待长出单菌落后，挑取单菌落接入培养液中，摇床培养，制成种子液；将种子液接种于培养液中摇床培养，获得生防菌株8141的培养菌液。

进一步地，所述培养基或培养液的配方包括：氯氯化钠10g，酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，用1mol·L^-1的NaOH调pH至7.0-7.2，加超纯水定容至1L。具体地，所述配方为LB配方。

进一步地，所述培养方法具体步骤包括：将生防菌株8141接种到LB培养基中，平板上划线，25～32℃生化培养箱中培养12-18h，待长出单菌落后，挑取单菌落接入LB培养液中，置于25～32℃，150～250r/min的摇床中培养20～30h，制成种子液；将种子液接种于LB培养液里，置于25～32℃，150～250r/min的摇床中培养36～60h，获得生防菌株8141的培养菌液。更进一步地，将培养14～16h后的单菌落接种于含有5mL的LB培养液的试管中，置于28℃，200r/min的摇床中培养25h，制成种子液；以1wt％的接种量将种子液接种于装有500mL的LB培养液的三角瓶里，置于28℃，200r/min的摇床中培养48h，获得生防菌株8141的培养菌液。

进一步地，采用所述培养菌液和菌体保藏液按1：20～60g/mL制备微生物菌剂，所述微生物制剂的活菌总浓度为5×10⁹～1×10¹⁰CFU/mL。更进一步地，所述微生物菌剂在稀释至1×10⁷～9×10⁷CFU/mL后进行应用。在一具体实施方案中，采用所述培养菌液和菌体保藏液按1：40g/mL制备微生物菌剂，所述微生物制剂的活菌总浓度为5×10⁹CFU/mL，所述微生物菌剂在稀释至5×10⁷CFU/mL后进行应用。

本发明的第四个方面是提供一种生防菌株8141、包括上述生防菌株8141或由上述生防菌株8141发酵培养制备的微生物菌剂在提高植物抗旱能力中的应用。

进一步地，所述应用包括将所述生防菌株8141或所述微生物菌剂用于制备产品，所述产品具有下述功能中的至少一种：提高植物在干旱环境中的存活率；降低植物丙二醛含量；增加植物脯氨酸含量；抑制植物气孔开度；以及，提高植物抗旱基因NCED1和/或RD29B表达水平。

进一步地，所述植物为拟南芥。

本发明的第五个方面是提供一种用于提高植物抗旱能力的方法，其采用生防菌株8141、包括上述生防菌株8141或由上述生防菌株8141发酵培养制备的微生物菌剂于植物苗根部浇灌施用。

进一步地，所述微生物菌剂的稀释步骤为：采用的微生物菌剂的组成为生防菌株8141的培养菌液与菌体保藏液，其还可包括农药学上可接受的助剂，包括但不限于：分散剂、稳定剂、载体等；上述微生物菌剂采用清水进行稀释并混匀，稀释至1×10⁷～9×10⁷CFU/mL(优选5×10⁷CFU/mL)。

进一步地，所述施用的频率及用量为：将微生物菌剂稀释100倍制备成施用菌液，20mL根部灌根处理。

本发明的第六个方面是提供一种生防菌株8141的分离筛选方法，其包括步骤：取100μL稀释菌液依次涂布在LB培养基上，每个梯度3个重复，于30℃培养24～48h，观察挑取形态特征不同的单菌落，纯化后保存在4℃冰箱中备用。

与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：

本发明筛选的生防菌株8141是针对提高植物抗旱能力的菌株，因其属于生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，利于植物的无公害生产，可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可以减少种植成本，而且有利于植物的种业发展。经过实验可知，由生防菌株8141制备的微生物菌剂通过土壤处理-植物苗根部浇灌施用，可以提高植物对干旱环境的适应性，具体地，8141菌剂对植物抗旱能力的提高表现在，8141处理后，幼苗存活率提高60％以上，脯氨酸(Pro)的含量增加40％左右，丙二醛(MDA)的含量降低20％左右，气孔开度降低，基因NCED1和RD29B表达水平上调，这表明8141菌剂具有很好的提高植物抗旱能力作用，有较大的潜力开发成商业化的活菌生防制剂。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明仅用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明一实施例中生防菌株8141的菌落形态图。

图2是本发明一实施例中温室试验中菌剂8141对植物抗旱能力的提高效果的结果示意图；其中，A为空白对照，B为采用菌剂8141处理。

图3是本发明一实施例中菌剂8141对植物叶片具有降低气孔开度的作用的结果示意图；其中，A为空白对照，B为采用菌剂8141处理，C为数据分析结果。

图4是本发明一实施例中菌剂8141对植物抗旱基因NCED1和RD29B具有提高其表达水平的作用的结果示意图。

上述生防菌株-成团泛菌8141已进行保藏，其分类命名为Pantoea agglomerans，其保藏编号为GDMCC No:62291，保藏日期为2022年3月14日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料，均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为质量百分比。除非另有定义或说明，本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。

下述实施例中，LB培养基/LB培养液的配方为：氯化钠(北京奥博星生物技术有限公司，批号20190702)10g；酵母提取物(北京奥博星生物技术有限公司，批号20190702)5g；胰蛋白胨(北京奥博星生物技术有限公司，批号20190702)10g；用1mol·L^-1的NaOH(北京奥博星生物技术有限公司，批号20190702)调pH至7.0-7.2，加超纯水定容至1L。

实施例1-生防菌株8141的分离及鉴定

本实施例为生防菌株8141(成团泛菌Pantoea agglomerans)的筛选及鉴定过程，其具体包括步骤：

(1)生防菌株8141的分离

菌株来源：8141从土壤中分离得到；

菌株分离方法：采用平板稀释法：将分别盛有9mL水的6支试管灭菌，并按10到10⁶的顺序进行编号，移液试管吸取1mL培养的菌液，注入10倍稀释的试管中，用手指轻压移液管上的橡皮，吹吸三次，使菌液与水充分混匀，从10倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入10²倍稀释的试管中，重复第二步的混匀操作。以此类推，直到完成最后一支试管的稀释。

将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中，取少量稀释菌液(不超过0.1mL，具体可为100μL)滴加到LB培养基表面，将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s。用涂布器将菌液均匀地涂布在LB培养基表面，涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。每个梯度3个重复，于30℃培养24～48h，观察挑取形态特征不同的单菌落，纯化后保存在4℃冰箱中备用。

上述生防菌株8141菌落形态如图1所示：乳白色圆形菌落，表明光滑，边缘均匀，半透明。

(2)生防菌株8141的鉴定-分子生物学鉴定

利用原核生物16S rRNA编码基因片段序列测序方法鉴定，16S rRNA编码基因扩增和序列分析具体如下：菌株在LB培养基中28℃培养至对数期，以12000r/min离心5min收集菌体，采用上海赛百盛基因技术有限公司的基因组DNA快速提取试剂盒，提取细菌的基因组DNA，以提取的DNA产物为模板，采用下述细菌16S rRNA编码基因扩增通用引物：

Farword：U8-27(5’-AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3’)；

Reserve：L1494-1514(5’-CTACGG(AG)TACCTTGTTACGAC-3’)。

以基因组DNA为模板，进行16S rRNA编码基因片段的扩增。纯化PCR产物后，送样至上海生工生物工程有限公司进行测序。所测序列如下SEQ ID NO.1所示：AGGGTATGTTACTGGCTCAGGGTAATAACAGTGTCGTTGCCGGACAGCTCAGCAATGACGGTGAGATCAGTGGCAGCAGCCTGAACATTCAAAGTGGGGCAATCAATAACGGGGGCAAGCTGTTAAGCCGCGGCGATGCGCTGATCACTGCAGACAGCATGCAGCAGCGCGGCACCCTTTCAGCCAGCAAAACTAACCAGCTTAACGTTACCGGCACGCTGAACAACAGCGGTGAAGTGAGCGGGGGCAGTCTGAATATTTACAGTGGATCGCTGCTTAACAGCGGGAATCTGCTGGGCAGTCAGCAGACAGATATTACCTCTGGCATCCTGCAGCAGGATGGAACGCTCTCATCCCAGGGCAAACTGCAGCTGAAAGTTGCCGATCGGTTAAGTAATAGCGGTGAACTGAGCGGAAACAGCCTGGATATAACCAGCGGCACGCTCGACAACAGCGGAAAAATGATCAGCAGCGGCGATGCCCTGCTCACCGCTAATCGTCTGAATCAGGACGGCACGCTCTCCGCGCAGGGGAATGCAGCGTTTAATATCGCTGACACCTTCAGCAACAGCGGCAATATGGTCAGTCAGCGTCTGCAAATTGATGCCCCGACACTGATTAACAGCGGCGAGATGGTGAGTCATGGCGATGCTGTGATGAACGCCGATACGCTGCAGCAAAACGGCTCGCTCACGGCCCGGGGTGACGCGCAGCTGACCGCCCGTGGCTGGCTGGAAAATCAGGGCGCCATCAGCAGTCAGAACGCTCTCATCCTGAACAGCGCGCAGCTGCGCAATACAGGTTCATTAACTGCACCTAATCTGACTCTCAACGCCGGGCAAATCACTAATAGCGGCCTGCTGCAGGGCACTCAGCTGCTCTCCTTCCATACCGGTCAGATGGATAACCTGGCTGCGGGTACGATCAGCTCTGACAACGACTTTGCCCTTGCGCTGCCACAGCTCAATAACAGCGGATTGATCACCAGCGGCAAAACACTGACTGTCACAGGCGACCAGCTGAACAACAGCGGAGAGATCAACGCTGCCAGCCTGAGCACCACACTCAAAAACTTACATAATCAGCAGGGCGGTAAATTGCTGGCAGATGAGCAGCTCCGGTTGCAGGGCGATGCGCTGATCAATCAGGGAACGATGGCTGCCGGCACGCTGAACAGTGATGTTAGTCAGATCACTAATAGCGGGACGGTCCAGGGCGACAAGGCATTGTCGTTGCAGGGCAGCGCGTTAACCAACAACGGCACGCTGCTGAGCGCAGGCCAGCTGAATGTGCAACAGCAGACGCTGGATAACAGCGGACTGATGCAGGGTAAACAGCTGACAGTGAAGGCTGACCGCTGGCAGAACAGCGGCAATGCCCTGAGTGAGACTGACGCCGATCTGCAGAGCGATACCTTGGTCAATAGTGGCAAAATTCTGGGGCAGCAAGGCATCGCACTGAAATCTGACCACACCGATAACAGCGGCTGGCTGATTGCACAGGCGCTGACGCTGCGCGGCGATATGATCAACAGCGGCCTGATCCAGGGAAATCAGCAGATTACGCTGCAGGGCAACCAGCTGGACAATCAGCAGGGCGGCCAGTTGCTCAGTGACGGCACGCTGGACGGTGACTTTGTTGCTTTAAATAACCATGGTGCAATGCAGGCCGGGGAGATGACATTTAACGCGGGGACGTTGCAGAACGACGGTACCGTTCTTAGCGAAAAAGCATTCACCGCTGTGATTAACGGTGCGCTGACCAACAGCGGCAGTCTGCTCAGCCAGCAGCAGATGAATCTGCAGGCAGCGGAGATTGATAATCAGGGCACACTGGCGGCGGATAACTTCAGCCTGCATGCGCCAGTGCTCAGCAATGCCGGTCTGCTTCAGGGCAACAGCACCTTAACGCTGGATAATCAGCAGCTGCATAACCTCAATGGCGGGCAGTTGATCGCCGGAGGACCGCTGACGCTGACCTTAGATCAGCTGGATAACGACGGGCTGCTGCAGGTTAACGGTAAGCTTGCGGTCAACGGCAACCGTCTCAACAACAGCGGACGTTTGTCGAGTGACAACCTCACTCTTCAGATTGGCGATACGCTGACGAACAGCGGGACGGGTCAGATCGTAACCGGTCAGCAGGCCGATCTGCACGCACATACACTCAGTAACAGCGGTCAGATTGCGGCACAGCAGGTCAGCGCCAGCGGCAATACGCTGGAAAACGGCGGGCTGCTGCAGGGCAACGCGCTGCTGGATCTCGGATTTGCTCAGACCCTCAATCACAACAATGGGCAACTGCTGAGCGGCGATCGGCTGATCGTCAGCGGTGGCAGCGCGACCAATGATGGCAGCTGGCAGGGTCAGCAACTCGACGTCACGCTGGATTCGCTTACCAATCGCGACAGCATCAATGGCATCAGCGGCTTGCGCGCTGACATCACCAGCGATCTGATCAACAGTGGCTCGCTGGTCAGTCTGGGAGAAAGCGACCTGAATGCCAGCACGCTGAGCAACAGCGGCAAAGTGATGGCGAACCGGCTGGGGCTTCAGACCACCAGCCTGAACAACGACGGTCTGTTACAGGGCAATACGGCGCTGACTGCTCAGGCCGATAACATCACGCAATCTGCTGGTGGCAAAACGCTGAGCGGCGGAACACTGACGCTCAATGCAGGCCAGATCAACACTCAGGGGCTGCTGCAGGGCGAGCAGGCAACGGTTATTGCGGATAACTGGCTGCATCAGGGATCGCTGCTGGGCAGCAAAGATCTGAACGTCAGCATCAGCAATGAGCTGCATAACACCGGCTCTCTGCTGAGCCAGGACAAAGCCCA(SEQ ID NO.1)。

将测序结果通过NCBI BLAST软件进行同源性比较，最终鉴定菌株8141为成团泛菌(Pantoea agglomerans)，对该菌株进行保藏，其保藏编号为：GDMCC No:62291。

实施例2-生防菌株8141的培养及其菌剂的制备

本实施例为实施例1筛选获得的生防菌株8141的一较佳培养方法及其菌剂制备方法，其具体步骤包括：

(1)生防菌株8141的培养

接种生防菌株8141到LB培养基。平板上划线，28℃生化培养箱中培养14-16h，待长出单菌落后，挑取单菌落接入含有5mL的LB培养液的试管中，置于28℃，200r/min的摇床中培养25h，制成种子液；以1％的接种量将种子液接种于装有500mL的LB培养液的三角瓶里，置于28℃，200r/min的摇床中培养48h，即为所制备的生防菌株8141的培养菌液。

(2)微生物菌剂的制备

微生物菌剂采用步骤(1)制备的生防菌株8141的培养菌液与菌体保藏液按1：40(g/mL)配制，可室温保存2～3年，微生物菌剂的活菌总浓度为5×10⁹～1×10¹⁰CFU/mL。上述菌体保藏液的配方为玉米面、豆饼粉、豆粕粉中的一种或多种5～10g，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖中的一种或多种3～6g，鱼粉2～8g，磷酸二氢钾0.1～0.5g，硫酸亚铁0.1～0.5g，硫酸镁1～5g，硫酸锰0.1～0.5g，碳酸钙0.1～0.5g，配平至1L。上述菌剂可稀释50～1000倍(稀释浓度为1×10⁷～9×10⁷CFU/mL)后于植物苗移栽时浇灌施用(即在作物移栽同时进行菌株制剂稀释后灌根使用)。

实施例3-由生防菌株8141制备的微生物菌剂的应用

本实施例3采用实施例2制备的由生防菌株8141制得的微生物菌剂用清水稀释至5×10⁷CFU/mL后摇匀，进行植物(以拟南芥为例)抗旱方面的验证，其具体步骤包括：

(1)温室存活性试验

在光照16小时，黑暗8小时的25度温室中进行试验，土壤为黑土：蛭石2：1混合，移栽后每3天使用20mL稀释后的8141菌液进行根部浇灌，对照使用20ml清水处理，2-3周长至合适大小后停止浇水，使其自然干旱，每个处理3个重复，干旱处理15天后加清水回复2天后统计幼苗存活率。

上述温室存活实验结果如下表1、图2所示：

表1温室实验中8141对干旱处理的植物的存活性统计

注：数值为平均值±标准误，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著。

由上表结果可知，8141菌剂对植物存活的提高达94.91％，结合图2可知上述8141菌剂可促进植物幼苗的生长，有助于缓解干旱胁迫对植物生长的影响，可以很好的提高植物在干旱环境中的适应性。

(2)生理指标丙二醛及脯氨酸含量的改变。

在光照16小时，黑暗8小时的25度温室中进行试验，土壤为黑土：蛭石2：1混合，移栽后每3天使用20mL稀释后的8141菌液进行根部浇灌，对照使用20ml清水处理，2-3周长至合适大小后停止浇水，使其自然干旱，每个处理3个重复，干旱处理15天后加清水回复2天，测定幼苗丙二醛及脯氨酸含量的变化。

上述实验结果如下表2所示：

表2干旱处理后8141对植物生理指标丙二醛及脯氨酸含量的影响

由上表可知，8141菌剂处理会使丙二醛(MDA)的含量降低23.81％左右，脯氨酸(Pro)的含量增加41.08％左右，综上可知8141菌剂可以通过增加脯氨酸的含量来清除细胞内积累的丙二醛，具有良好的提高植物抗旱能力的效果，有较大的潜力开发成商业化的活菌生防制剂。

(3)气孔开度测定试验。

在光照16小时，黑暗8小时的25度温室中进行试验，土壤为黑土：蛭石2：1混合，移栽后每3天使用20mL稀释后的8141菌液进行根部浇灌，对照使用20ml清水处理，2-3周长至合适大小后停止浇水，使其自然干旱，每个处理3个重复，干旱处理15天后，测定拟南芥叶片气孔开度的变化。

上述实验结果如下表3、图3所示：

表3干旱处理后8141菌剂对拟南芥气孔开度的影响

由图3、表3结果分析可知，在干旱胁迫下8141菌剂处理的拟南芥对气孔开度的抑制作用加剧，可以缩小气孔开度、降低蒸腾作用来减少水分蒸发，说明8141菌剂在提高植物的抗旱性方面起到了一定作用。

(4)NCED1和RD29B的表达水平检测

在光照16小时，黑暗8小时的25度温室中进行试验，土壤为黑土：蛭石2：1混合，移栽后每3天使用20ml稀释后的8141菌液进行根部浇灌，对照使用20ml清水处理，2-3周长至合适大小后停止浇水，使其自然干旱，每个处理3个重复，干旱处理11天后，测定拟南芥中基因NCED1和RD29B的表达水平。

上述实验结果如下表4、图4所示：

表4干旱处理后8141菌剂对NCED1和RD29B的表达水平的影响

表4、图4结果显示，在干旱胁迫下8141菌剂处理的植株抗旱基因NCED1和RD29B的表达水平都有明显上调作用，这表明菌株8141有提高植物抗旱能力的作用。

由上述实施例可知，8141菌剂能提高植物在干旱环境中的存活率，增加脯氨酸的含量，降低丙二醛的含量，降低植物气孔开度，上调植物抗旱基因NCED1和RD29B的表达水平，这表明8141菌剂具有很好的提高植物抗旱能力作用，有较大的潜力开发成商业化的活菌生防制剂。

以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围。

序列表

<110> 生态环境部南京环境科学研究所

<120> 一种生防菌株及其在缓解植物干旱中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2839

<212> DNA

<213> 16S rRNA(Artificial Sequence)

<400> 1

agggtatgtt actggctcag ggtaataaca gtgtcgttgc cggacagctc agcaatgacg 60

gtgagatcag tggcagcagc ctgaacattc aaagtggggc aatcaataac gggggcaagc 120

tgttaagccg cggcgatgcg ctgatcactg cagacagcat gcagcagcgc ggcacccttt 180

cagccagcaa aactaaccag cttaacgtta ccggcacgct gaacaacagc ggtgaagtga 240

gcgggggcag tctgaatatt tacagtggat cgctgcttaa cagcgggaat ctgctgggca 300

gtcagcagac agatattacc tctggcatcc tgcagcagga tggaacgctc tcatcccagg 360

gcaaactgca gctgaaagtt gccgatcggt taagtaatag cggtgaactg agcggaaaca 420

gcctggatat aaccagcggc acgctcgaca acagcggaaa aatgatcagc agcggcgatg 480

ccctgctcac cgctaatcgt ctgaatcagg acggcacgct ctccgcgcag gggaatgcag 540

cgtttaatat cgctgacacc ttcagcaaca gcggcaatat ggtcagtcag cgtctgcaaa 600

ttgatgcccc gacactgatt aacagcggcg agatggtgag tcatggcgat gctgtgatga 660

acgccgatac gctgcagcaa aacggctcgc tcacggcccg gggtgacgcg cagctgaccg 720

cccgtggctg gctggaaaat cagggcgcca tcagcagtca gaacgctctc atcctgaaca 780

gcgcgcagct gcgcaataca ggttcattaa ctgcacctaa tctgactctc aacgccgggc 840

aaatcactaa tagcggcctg ctgcagggca ctcagctgct ctccttccat accggtcaga 900

tggataacct ggctgcgggt acgatcagct ctgacaacga ctttgccctt gcgctgccac 960

agctcaataa cagcggattg atcaccagcg gcaaaacact gactgtcaca ggcgaccagc 1020

tgaacaacag cggagagatc aacgctgcca gcctgagcac cacactcaaa aacttacata 1080

atcagcaggg cggtaaattg ctggcagatg agcagctccg gttgcagggc gatgcgctga 1140

tcaatcaggg aacgatggct gccggcacgc tgaacagtga tgttagtcag atcactaata 1200

gcgggacggt ccagggcgac aaggcattgt cgttgcaggg cagcgcgtta accaacaacg 1260

gcacgctgct gagcgcaggc cagctgaatg tgcaacagca gacgctggat aacagcggac 1320

tgatgcaggg taaacagctg acagtgaagg ctgaccgctg gcagaacagc ggcaatgccc 1380

tgagtgagac tgacgccgat ctgcagagcg ataccttggt caatagtggc aaaattctgg 1440

ggcagcaagg catcgcactg aaatctgacc acaccgataa cagcggctgg ctgattgcac 1500

aggcgctgac gctgcgcggc gatatgatca acagcggcct gatccaggga aatcagcaga 1560

ttacgctgca gggcaaccag ctggacaatc agcagggcgg ccagttgctc agtgacggca 1620

cgctggacgg tgactttgtt gctttaaata accatggtgc aatgcaggcc ggggagatga 1680

catttaacgc ggggacgttg cagaacgacg gtaccgttct tagcgaaaaa gcattcaccg 1740

ctgtgattaa cggtgcgctg accaacagcg gcagtctgct cagccagcag cagatgaatc 1800

tgcaggcagc ggagattgat aatcagggca cactggcggc ggataacttc agcctgcatg 1860

cgccagtgct cagcaatgcc ggtctgcttc agggcaacag caccttaacg ctggataatc 1920

agcagctgca taacctcaat ggcgggcagt tgatcgccgg aggaccgctg acgctgacct 1980

tagatcagct ggataacgac gggctgctgc aggttaacgg taagcttgcg gtcaacggca 2040

accgtctcaa caacagcgga cgtttgtcga gtgacaacct cactcttcag attggcgata 2100

cgctgacgaa cagcgggacg ggtcagatcg taaccggtca gcaggccgat ctgcacgcac 2160

atacactcag taacagcggt cagattgcgg cacagcaggt cagcgccagc ggcaatacgc 2220

tggaaaacgg cgggctgctg cagggcaacg cgctgctgga tctcggattt gctcagaccc 2280

tcaatcacaa caatgggcaa ctgctgagcg gcgatcggct gatcgtcagc ggtggcagcg 2340

cgaccaatga tggcagctgg cagggtcagc aactcgacgt cacgctggat tcgcttacca 2400

atcgcgacag catcaatggc atcagcggct tgcgcgctga catcaccagc gatctgatca 2460

acagtggctc gctggtcagt ctgggagaaa gcgacctgaa tgccagcacg ctgagcaaca 2520

gcggcaaagt gatggcgaac cggctggggc ttcagaccac cagcctgaac aacgacggtc 2580

tgttacaggg caatacggcg ctgactgctc aggccgataa catcacgcaa tctgctggtg 2640

gcaaaacgct gagcggcgga acactgacgc tcaatgcagg ccagatcaac actcaggggc 2700

tgctgcaggg cgagcaggca acggttattg cggataactg gctgcatcag ggatcgctgc 2760

tgggcagcaa agatctgaac gtcagcatca gcaatgagct gcataacacc ggctctctgc 2820

tgagccagga caaagccca 2839

Claims

1.一种生防菌株，其特征在于，所述生防菌株为8141，其分类命名为Pantoea agglomerans，其保藏编号为GDMCC No: 62291；所述生防菌株8141的16S rRNA的序列如SEQID NO. 1所示。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的生防菌株；或者由如权利要求1所述的生防菌株发酵培养制备；其中，所述微生物菌剂采用湿菌与菌体保藏液按1：20~60 g/mL进行配制。

3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中活菌总浓度为5×10⁹~1×10¹⁰CFU/mL。

4.一种微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：

步骤1、将如权利要求1所述的生防菌株8141接种到培养基中培养，待长出单菌落后，挑取单菌落接入培养液中，摇床培养，制成种子液；将种子液接种于培养液中摇床培养，获得生防菌株8141的培养菌液；

步骤2、采用步骤1获得的培养菌液与菌体保藏液按1：20~60 g/mL进行配制，获得所述微生物菌剂，所述微生物菌剂中活菌总浓度为5×10⁹~1×10¹⁰CFU/mL。

5.根据权利要求4所述的一种微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述培养基或培养液的配方为：氯化钠10 g，酵母提取物 5 g，胰蛋白胨10 g，用1 mol∙L^-1的NaOH调pH至7.0-7.2，加超纯水定容至1 L；所述菌体保藏液的配方为玉米面、豆饼粉、豆粕粉中的一种或多种5~10g，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖中的一种或多种3~6g，鱼粉2~8g，磷酸二氢钾0.1~0.5g，硫酸亚铁0.1~0.5g，硫酸镁1~5g，硫酸锰0.1~0.5g，碳酸钙0.1~0.5g，配平至1L。

6.一种如权利要求1所述的生防菌株或如权利要求2~3中任一项所述的微生物菌剂在提高植物抗旱能力中的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括将所述生防菌株或所述微生物菌剂用于制备产品，所述产品具有下述功能中的至少一种：提高植物在干旱环境中的存活率；降低植物丙二醛含量；增加植物脯氨酸含量；抑制植物气孔开度；以及，提高植物抗旱基因NCED1和/或RD29B表达水平。

8.一种用于提高植物抗旱能力的方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的生防菌株或如权利要求2~3中任一项所述的微生物菌剂于植物根部浇灌施用；其中，所述植物为拟南芥。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述微生物菌剂稀释至1×10⁷~9×10⁷CFU/mL再进行植物根部浇灌施用。