TW201023862A - Pharmaceutical compositions and extracts containing kinsenoside for inhibiting activation of macrophage, inhibiting formation of osteoclasts, inhibiting function of osteoclasts, and/or activating osteoblasts and uses of the same - Google Patents

Description

201023862 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於金線連糖發（kinsenoside)於抑制巨嗟細胞 (macrophage )活化、抑制破骨細胞（osteodast)形成、抑制破 骨細胞功能及/或活化造骨細胞（〇steoblast)之應用。 【先前技術】 骨骼主要係由有機成分（如膠原纖維及黏多醣）、無機成分（如 鈣鹽及磷鹽）及水等所組成，係一種動態平衡的組織，會不停地 進行骨骼生成作用（bone formation )與骨骼溶姓作用（bone resorption)，兩者統稱為骨務重塑（bone remodeling)，除了能修 補微小創傷之外，尚能提高骨骼的耐壓性》其中，骨骼生成作用 係包括新骨質（new bone matrix )之形成及骨絡之礦質化 (mineralization)。 骨絡重塑須依賴二種不同細胞的合作來進行，分別為負責生成 作用之造骨細胞（oste〇biast )及負責溶餘作用之破骨細胞 (osteoclast)。若此二細胞間之協調發生錯誤，會導致骨骼重塑之 失衡。舉例言之，當溶蝕作用大於生成作用，則會出現臨床上常 見之骨質疏鬆症’特別發生於停經後的婦女；反之的情況則較為 罕見，會造成骨質的異常增加β 目前，全球約有2憶女性罹患骨質疏鬆症，2003年骨質疏鬆及 賀爾蒙補充療法之全球市場為83億美元，估計年可達179 億美兀°其中’依藥物作用機制，可將治療骨質疏鬆症之藥物概 分為四類：、抑制骨路溶㈣用，例如：雙填酸鹽類；二、促 201023862 進骨骼生成作用，例如：副甲狀腺素；三、抑制骨骼釋出鈣質， 例如：雌激素；及四、促進小腸吸收鈣質，例如：維他命D。然 而，雙磷酸鹽類藥物會產生較強的副作用，例如：頭痛、噁心、 嘔吐、腹瀉、發燒、腎衰竭、食道炎或下顎骨壞死等；服用副甲 狀腺素則會有如頭痛及噁心的不適感；雌激素則有致癌之風險。 '另外，利用維他命D以增加鈣質吸收於改善骨質疏鬆症的效果則 •相當有限。是故，對於可有效治療骨質疏鬆症且副作用低之物質 或醫藥組合物之需求仍持續存在。 〇 巨噬細胞在不同的組織中會以不同分化形式的細胞呈現，如在 肝臟中之庫否細胞（Kupffer cells )，或是在腦部之微膠細胞 (microglial )。在骨組織中，巨嗤細胞則係以破骨細胞之分化形式 呈現，同時其係與造骨細胞維持一動態平衡。 在人體的免疫防禦機制中，血液中的巨噬細胞係第一道防線， 故其於發炎反應中扮演非常重要的角色。具體言之，巨噬細胞接 觸病原體時會被活化，以啟動殲滅病原體的能力，同時也會分泌 出促進發炎反應的細胞激素（cytokine)，例如腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α ’ TNF-α )及介白素-6( Interleukin-6 ’ IL-6 ) 等。因此，若病原體之刺激過強，亦或巨噬細胞於短時間内釋放 過多的細胞激素，便會使患者發生敗血性休克。 在發炎過程中，巨噬細胞除釋出細胞激素外，亦具有呈現抗原 之作用。具體言之，巨噬細胞之呈現抗原作用會影響T細胞之分 化，進而影響B細胞及抗體之產生，而B細胞及抗體亦可提供殲 滅病原體之效果。因此，巨噬細胞除具有第一線的免疫反應功能 201023862 外’亦具有免疫調節的角色，此可參考Fuijwara N. Kobayashi Κ. Macrophage and inflammation. Curr Drug Targets 4, 281-286。 目前的研究顯示’幾乎所有的慢性疾病都與發炎反應有關，例 如癌症及風溼性關節炎等。換言之，巨噬細胞係參與該些疾病的 致病機轉’此可參考 Naito M. 2008, Macrophage differentiation and function in health and disease, Pathol Int 58, 143-156 ° 以風濕性關節炎為例，巨噬細胞於其病理上扮演重要的角色。 概言之，風濕性關節炎會活化巨噬細胞，使其釋出細胞激素，促 進慢性發炎的發生。另外，於關節滑液中充滿各種發炎細胞，其 所分泌出來的細胞激素和生長因子會使巨噬細胞分化成破骨細 胞，因而損害關節骨頭。目前治療風濕性關節炎的主要藥物為類 固醇。然而，類固醇藥物有諸多副作用，例如水腫及骨質疏鬆等。 因此’仍有提供可有效治療風濕性關節炎且具低副作用之物質或 醫藥組合物的高度需求。 金線連（dwoeciocAi/wsspp.)屬於蘭科（Orchidaceae)植物，其 中，據傳台灣金線連Hayata)具有降 血壓、降血糖、保護肝臟、抗發炎、以及調節免疫力等廣泛效果， 因此具有F藥王』、Γ藥虎』之別名。此外，業經文獻確認，台灣 金線連之粗萃取物具有抗骨質疏鬆之藥理功效（請參考Shih ΖΖ, Wu YW, Lin WC. 2001. Ameliorative effects of Anoectochilus formosanus extract on osteopenia in overiectomized rats. J Ethnopharmacol 77，233-228 及 Masuda K, Ikeuchi M, koyama T， Yamaguchi K, Woo JT, Nishimura T, Yazawa K. 2008. Suppressive 201023862 effects of Anoectochilus formosanus extract on osteoclast formation in vitro and bone resorption in vivo. J Bone Miner Metab 26, 123-129)。 然而’有關台灣金線連具有抗發炎及抗骨質疏鬆之效果，其有 效成分迄今仍屬不明，故藥效之最佳化及藥理之研究因而受限。 再者，由於傳統分株繁殖方法十分緩慢，加上無約束採集之消耗， •已使得台灣金線連於天然產地之含量嚴重損耗。業界雖已積極研 發金線連之栽培方法，例如使用組織培養台灣金線連之營養繁殖 β 法（請參考 Shiau YJ，Sagare AP，Chen UC，Yang SR，Tsay HS, 2002.

Conservation of Anoectochilus formosanus HAYATA by artificial cross-pollination and in vitro culture of seeds. Bot Bull Acad Sin 43: 123 - 130.)或JP 10-056875 A揭示之改良苗根培養等，但所可提 供之金線連數量仍受限於繁殖/培養之速度。因&，若能知悉金線 連中可提供抗發炎及抗骨質疏鬆效益之活性成分，將可於日後透 過人工合成方式，量產製造並提供製劑。 參 本發明係針對上述需求所為之研究，本案發明人經由活體内⑼ ―)及活體外⑽）之相關實驗’確認出台灣金線連中抗發 炎及抗骨質疏鬆之主要活性化合物，其具有促進㈣生成作用^ 抑制骨胳雜作用之功能，且發現該化合物亦具有抑制巨仙胞 活化之功效》 【發明内容】 本發明之-目的在於提供-種用於抑制巨嚷細胞活化、抑制破 骨細胞形成、抑制破骨細胞功能及/或活化造骨細胞之醫藥組合 201023862 物，其係包含有效量之式（1)化合物：

或其醫藥可接受鹽或酯。其中，該式（丨）化合物係金線連糖苷 (kinsenoside) ° 本發明之另一目的係在於提供一種用於抑制巨噬細胞活化、抑 制破骨細胞形成、抑制破骨細胞功能及/或漆化造骨細胞之金線連 萃取液’其包含上述式（I)化合物。 本發明之又一目的在於提供一種使用上述式（T)化合物或其醫 藥可接受鹽或酯或上述金線連萃取液於製造藥劑之應用，其中該 藥劑係用於抑制巨噬細胞活化、抑制破骨細胞形成、抑制破骨細 胞功能及/或活化造骨細胞。 本發明之詳細技術及較佳實施態樣，將描述於以下内容中’以 供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。 【實施方式】 如上述，已知台灣金線連之粗萃取物具有抗發炎及抗骨質疏鬆 之藥效，惟其有效成分不明。本案發明人在進行無數次活體外之 細胞實驗及活體内之動物實驗後發現，下式Ci)化合物乃台灣金 線連中之具有抑制巨噬細胞活化、抑制破骨細跑 〇风、抑制破_霄 細胞功能及/或活化造骨細胞之主要活性成分： (I)， 201023862

HO

OH ο

R 式（I)化合物即俗稱的金線連糖苷，下文將以『金線連糖苷』代 表式（I)化合物。

咸信骨質疏鬆症係由於骨骼中之生成作用與溶蝕作用間的失調 而導致；其中，骨骼中之造骨細胞具有該生成作用而破骨細胞具 有該溶蝕作用。具體言之，發生骨質疏鬆症的原因之一係骨骼内 的破骨細胞過多或由破骨細胞所產生之溶蝕作用的速率過高，使 得骨骼内的鈣質過度流失而導致骨密度降低。因此，若可以抑制 破骨細胞之功能（即進行溶蝕作用）及/或抑制破骨細胞的形成（可 由巨噬細胞分化而來）時，即可控制骨骼之溶蝕作用，進而預防、 改善骨質疏鬆症。再者，發生骨質疏鬆症的另一個原因為骨骼中 之造骨細胞的生成作用不足。是以，若可以活化造骨細胞以促進 骨骼之生成作用，即可增加骨骼内之鈣質，進而預防或改善骨質 疏鬆現象。 如下文中實施例所示，本案發明人發現，金線連糖苷具有抑制 破骨細胞之功能及抑制其形成的功效，故可減緩/抑制骨骼的溶蝕 作用。此外，本案發明人更發現金線連糖苷同時具有活化造骨細 胞的功效，故可促進骨骼的生成作用。令人驚奇地，金線連糖苷 同時兼具（1)抑制破骨細胞功能、（2)抑制破骨細胞形成及（3) 活化造骨細胞之功效，顯然可於骨質疏鬆的預防與治療上提供令 人滿意的效果。 ’ 9 201023862 因此，本發明含有金線連糖苷或其醫藥可接受鹽或酯之醫藥組 合物可用於抑制破骨細胞功能、抑制破骨細胞形成及/或活化造骨 細胞，尤其有用於抗骨質疏鬆。於本文中，『抗骨質疏鬆』乙詞係 涵蓋預防骨質疏鬆、改善骨質疏鬆及治療骨質疏鬆。 此外，如上所述，由於金線連糖苷具有活化造骨細胞之功效， 故亦有助於骨骼的生成作用。 另一方面，本案發明人發現金線連糖苷除具有抑制破骨細胞功 能/形成及活化造骨細胞之功效外，亦具有抑制巨噬細胞活化之功 效。其中，相關研究發現，脂多聽（lipopolysaccharide，LPS )會 引發巨噬細胞的活性，其係革蘭陰性菌之細胞壁的成分（請參考 Cavaillon JM. Adib-Conquy Μ. 2005. Monocytes/macrophages and sepsis. Crit Care Med 33, S506-S509.)。如下文實施例所示，金線 連糖苷具有可抑制脂多醣活化巨噬細胞之作用。 如上所述，巨嗟細胞於纖滅病原體之同時亦會分泌出促進發炎 反應之細胞激素，因此其於發炎反應中扮演非常重要的角色，由 於金線連糖苷具有可抑制巨噬細胞活化之功效，亦即可抑制巨噬 細胞釋出會促進發炎反應之細胞激素，進而達到抗發炎的作用。 因此，本發明含有金線連糖苷或其醫藥可接受鹽或醋之醫藥組合 物可用於抑制巨噬細胞活化’尤其可用於抗發炎。於本文中，『抗 發炎』乙詞係涵蓋預防發炎、改善發炎及治療發炎。 於本發明之一具體實施態樣中’本發明含有金線連糖苷之醫藥 組合物係特別適用於治療關節炎之發炎反應。具體言之，由於在 關節炎初期’關郎之滑膜液中聚積很多巨噪細胞，其釋出之細胞 201023862 激素會促進發炎反應，造成軟骨損傷，且於關節炎後期亦會活化 巨噬細胞，使其分化成破骨細胞，因而產生骨骼溶蝕作用，對關 節骨頭造成損傷。換言之，在關節炎的治療中，抑制巨噬細胞之 活化係一關鍵步驟。因此，金線連糖苷可用於預防或治療各種關 節炎症狀，例如類風濕性關節炎、痛風性關節炎、細菌性關節炎、 退化性關節炎、僵直性關節炎及骨關節炎等。 從而，本發明一方面係提供一種用於抑制巨噬細胞活化、抑制 破骨細胞形成、抑制破骨細胞功能及/或活化造骨細胞之醫藥組合 ® 物，其包含有效量之金線連糖苷或其醫藥可接受鹽或酯。於本發 明之醫藥組合物中，金線連糖苷或其醫藥可接受鹽或酯之含量並 非絕對關鍵所在，只要可提供所欲之抑制巨噬細胞活化、抑制破 骨細胞形成、抑制破骨細胞功能及/或活化造骨細胞的效益即可。 於此，可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同投藥頻率以 施用本發明之醫藥組合物，端視投予標的之需求而異。以用於抗 骨質疏鬆為例，本發明組合物之金線連糖苷或其醫藥可接受鹽或 酯含量，以金線連糖苷計，為組合物總重之約4重量％至約8重量 ❿ %，較佳為約5重量％至約7重量％。而當用於抗發炎之情況時， 本發明組合物之金線連糖苷或其醫藥可接受鹽或酯含量，以金線 連糖苷計，為組合物總重之約7重量％至約13重量％，較佳為約9 重量％至約11重量％。 在實際投藥時，以抗骨質疏鬆為例，金線連糖苷或其醫藥可接 受鹽或酯之用量，以金線連糖苷計，通常每人（以體重60公斤之 成年人為例）每天之平均用量為約20毫克至約200毫克，較佳為 11 201023862 每人每天約40毫克至約15〇毫± 霉九尤其以每人每天約60毫克至 約1〇0毫克為佳。若用於抗發炎時，以金線連糖普計，通常每人 每天之平均用量為約30毫克至約3〇〇毫克，較佳為每人每天約％ 毫克至約_毫克，尤其以每人每天約7〇毫克至約⑽毫克為佳。 惟，對於急性病患（如急性關節炎病患或骨㈣重流失者）而言， 其用量可視實際需要而酌增至數倍或數十件。 根據本發明之醫藥組合物可以任何合宜之方式施用，舉例纟 之，但不以此為限，可以口服、皮下或靜脈内等投藥方式施用之。 金線連糖料其醫藥可接受鹽或_可單獨或與醫藥佐劑—起使❹ 用’且實際上可使用於獸醫與人類醫藥上。 因此，本發明另一方面包含使用金線連糖苷或其醫藥可接受鹽 或酯在製造藥劑之應用，其可用以製備具任何合宜形式之用以抑 制巨噬細胞活化、抑制破骨細胞功能、抑制破骨細胞形成及/或活 化造骨細胞之藥劑，特別是用於抗骨質疏鬆及抗發炎（例如抗關 節炎）。其中，於製備具適於口服投藥之藥劑而言，可經由將金線 連糖苷或其醫藥可接受鹽或酯與適合此項目且不會不利影響金線 連糖苷活性之佐劑混合，例如：溶劑、油性溶劑、稀釋劑、安定 〇 劑、吸收延遲劑、崩散劑、乳化劑、黏合劑、潤滑劑、吸濕劑等。 舉例而言’溶劑可選自水及蔗糖溶液，稀釋劑可選自乳糖、澱粉 及微晶纖維素’吸收延遲劑可選自幾丁聚醣及葡萄胺基聚醣，润 滑劑可選自碳酸鎂’油性溶劑可選自植物或動物油類，如撖欖油、 葵花油及魚肝油等。於此’可利用習知方法製成合宜的口服投藥 形式’例如：錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、 12 201023862 糖漿劑、懸液劑、乳劑、及酊劑等等。 至於具適於皮下或靜脈内投藥形式之藥劑而言，係將金線連糖 苷或其醫藥可接受鹽或酯與視需要之習用於此項目的之材料，如 增溶劑、乳化劑、或其他佐劑等加以混合，以製成如靜脈輸注液、 乳劑靜脈輸注液、注射劑、乾粉注射劑、懸液注射劑、及乾粉懸 液注射劑等等。可能採用之溶劑例如：水、生理食鹽溶液、醇類 (例如：乙醇、丙醇、或甘油等）、糖溶液（例如：葡萄糖或甘露 醇溶液）、或前述之組合。 © 視需要地，除上述可用的醫藥製劑的佐劑成份外，另可加入調 味劑、調色劑、著色劑等添加劑，以提高所得藥劑服用時的口適 感及視覺感受；另可添加合理用量之保存劑、防腐劑、抗菌劑、 抗真菌劑等，以改善所得藥劑的儲存性。 另一方面，可視需要於本發明之醫藥組合物中併含一或多種其 他活性成分，進一步加強本發明醫藥組合物之功效或增加藥劑配 方的運用靈活性與調配度。舉例言之，可與本發明醫藥組合物倂 用的其他活性成分包含如阿舍構酸鹽（alendronate)、副曱狀腺素、 ❿ 雌激素、鈣化合物或維他命D等之治療骨質疏鬆症的藥物，如軟 骨素（chondroitin )或葡萄糖胺（glucosamine )等之抗關節發炎藥， 以及其他活性成分等；只要該其他活性成分對金線連糖苷之效益 沒有不利的影響即可。 可以任何天然或人工合成來源提供本發明之醫藥組合物所含之 金線連糖苷。較佳地，金線連糖苷係來自金線連，尤其是台灣金 線連。於此，可採用任何合宜之萃取手段配合單離操作，以自金 13 201023862 線連取得金線連糖苷。此等分離方法可參見如Ito A, Kasai R， Yamasaki K, Sugimoto H, 1993, Aliphatic and aromatic glucosides fromPhytochemistry 33: 1133 - 1137 以 及 Du XM，Yoshizawa T，Shoyama Y. 1998, Butanolic acid glucoside composition of whole body and in vitro plantlets of Anoectochilus /ormosanM·?, Phytochemistry 49: 1925 - 1928 所揭露者，該文獻全文 併於此處以供參考。此外，亦可經由如Zhang X，Lin ZY，Huang HH, Chen QH, 2004, Novel total synthesis of kinsenoside, Chinese .Journal of Synthetic Chemistry 12，317-318 所揭露之全合 成方式得到金線連糖苷，該文獻全文併於此處以供參考。 緣此，本發明另關於一包含金線連糖苷之金線連萃取液，同樣 可用於抑制巨噬細胞活化、抑制破骨細胞功能、抑制破骨細胞形 成及/或活化造骨細胞。較佳地，於本發明金線連萃取液中，其實 質上不含親乙酸乙酯之成分。於本文中，『親乙酸乙酯之成分』係 指當該成分溶於水中時’可以乙酸乙酯分配移除之成份。經發現， 金線連萃取液中之親乙酸乙酯之成分會惡化肝細胞之傷害。經由 實質上排除金線連萃取液中親乙酸乙酯之成分，將可有效減緩使 用金線連萃取液於醫藥用途上所導致對投藥者之潛在傷害。 較佳地，本發明之金線連萃取液係一水性萃取液，不含親乙酸 乙酯之成分。其可經由如下操作取得：將金線連置於水中打成漿 液—過濾取得水性萃取液—添加乙酸乙酯於該萃取液中—移除乙 酸乙酯分配液。可視需要重複該乙酸乙酯分配操作，以儘可能降 低萃取液中可溶於乙酸乙酯之成分。 201023862 於一具體實施態樣中，可以如下方式得到本發明之含金線連糖 苷之萃取液：首先，將金線連鮮品"似介㈣仍⑽似 Hayata) ( 10公斤）以水100公升進行打汁，經過濾取汁液（亦可 以水烈煮金線連乾品，取烈煮液）。之後，每次以乙酸乙酯25公 升進行分配’上層的乙酸乙酯層移除後，再以乙酸乙酯25公升進 行分配，連續分配3次，合併乙酸乙酯層得一乙酸乙酯部分及下 層之一水溶性部分。該水溶性部分即為本發明之含金線連糖苷之 萃取液’其不含親乙酸乙酯之成分。此外，該水溶性部分亦可視 • 需要再經醇類（例如10%的甲醇）進行溶析，可提高金線連糖苷 的含量。 本發明另關於使用該金線連萃取液於藥劑上之應用，其可用以 製備具任何合宜形式之用以抑制巨噬細胞活化、抑制破骨細胞功 能、抑制破骨細胞形成及/或活化造骨細胞之藥劑，特別是用於抗 骨質疏鬆及抗發炎（例如抗關節炎）。 茲以下列具體實施態樣以進一步例示說明本發明。其中該些實 ©施態樣僅提供作為說明，而非用以限制本發明之範疇《 〔材料〕 台灣金線連（/omosawMS Hayata )係購自有容 (Yu-Jung)農場（台灣，埔里）培養之植物。此植物之植物樣本 已寄存於中國醫藥大學藥學院（寄存編號：CMUAF 0609)，並經 該院鐘定 金線連糖苷之萃取及單離 (1)首先，將10公斤之金線連鮮品以100公升之水進行打汁，並 15 201023862 以過濾取其汁液（以afe表示）。此步驟亦可以水煎煮金線連乾品， 並取其煎煮液之方式取代。之後，每次以25公升之乙酸乙酯進行 分配，移除上層的乙酸乙酯層後，再以25公升之乙酸乙酯進行分 配，連續分配3次後’合併乙酸乙酯層得一乙酸乙酯部分（以AFEE 表示）及下層之一水溶性部分（以AFEW表示）。 (2) 於減壓下蒸發AFEE部分及AFEW部分，分別產生47.4公克之 綠色油狀殘留物及218.4公克之紅色殘留物。將由AFEW部分所得 之紅色殘留物（210公克）置於Diaion HP-20管柱（購自Nippon Rensui Co. ’ Japan)，並以水、10%甲醇（溶於水中）、20%甲醇（溶 ❹ 於水中）、50%甲醇（溶於水中）、以及1〇〇%甲醇進行溶析，分別 得到五個分劃，以AFEW-1至AFEW-5表示。AFEW-1至AFEW-5之 乾重分別為141.38公克、22.06公克、8.16公克、9.21公克及3.78公 克。上述操作係如第1圖所示。 (3) 繼續純化AFEW-2 ( 10公克），其係使用矽膠管柱（Si 60 F245， 購自Merck，Germany)，並以氣仿/乙醇（以8 : 3至15:8之濃度勾 配）為移動相，可得到四個分劃，以分劃1-4表示。取分劃4 (4.5 Q 公克），利用製備型高效能液相層析儀（HPLC)純化所得到之主 要成分（4.1公克），經確認其為金線連糖苷（即式(I)化合物）。 製備型HPLC所用之條件如下：幫浦係Shimadzu LC-8A (購自 Kyoto，Japan);移動相係水；管柱係Mightysil ODS RP-18 Aqua 管柱（内徑為20毫米，長為250毫米，顆粒大小為5微米，購自Kanto Chemical Co·，Tokyo，Japan) 0 16 201023862 分劃4之主要成分含量達77.6%，以質譜儀（購自JeolGCmate， Tokyo ’ Japan)及核磁共振儀（NMR，4、13C、DEPT、COSY、 HMQC及HMBC ; Jeol 400 MHz，Tokyo，Japan)分析，確認該主 要成分為金線連糖苷（3-(R)-3-P-D-"比喃葡萄糖基氧基丁内酯 (3-(R)-3-P-D- glucopyranosyloxy-butanolide)，即式（I)化合物）。表 1 為經單離之金線連糖苷的NMR數據。

表1、金線連糖苷的l3C及1HNMR質譜數據(400 MHz，DMSO-(ls) 13c lU 1 175.8 2 2.87 (dd, 17.8. 6.3) 2 34.9 - 2.48 (dd, 17.9.1.3) 3 74.3 3 4.59 (dddd 6.0,3.6,2.2,1.4) 4 74.0 4 4.41 (dd, 10.2. 5.1) 4.38 (dd, 10.3.1.8) G-1 102.1 G-1 4.24 (d, 7.8) G-2 73.1 G-2 2.92 (m) G-3 76.9 G-3 3,94 (m) G-4 69.9 G-4 3.04 (m) G-5 76.5 G-5 3.13 (m) G-6 61,0 G-6 3.44 (m) 3.66 (dd, 11.7. 5.8) OH2 OH2 4.9 (d, 4.8) OH3 OH3 5.0 (d, 5.1) OH4 OH4 4.8 (d, 5.4) 17 201023862 OH6

4.5 (t, 5.8) 〔實施例1〕金線連糖糾制^^細跑之發炎反應 #炎反應係一複雜之過程’其中包含產生自由基分子（例如： 一氧化I及過氧化氫等）及細胞激素（例如 :前列腺素2(PGE2)、 ™F-a、干擾素·γ (IFN1)、介白素-2 (IL-2，Interleukin-2)及介 白素·1β (IL-Ιβ)等）等。因此，藉由測量體内與發炎反應相關之 自由基分子及細胞激素，即可得知發炎反應的程度。 實驗A .金線連糖苷抑制ICR小鼠腹腔巨噬細胞之發炎反應 以腹腔注射之方式’將5重量％之酼乙酸（thi〇glyc〇Uate，購自

Becton Dickinson，Franklin Lakes, m)投予 ICR 小鼠（購自樂斯科 生技公司），3天後，以漢克斯緩衝食鹽溶液（Hank，s Balanced Solutions)(購自 Amresco，Sol〇n，洗出 ICR 小鼠之腹腔巨 噬細胞，並將其培養於培養皿（成分為Dulbecc〇，sm〇difiedeagle，s 111他腿、10%之經熱去活性之胎牛血清、1〇〇活性單位/毫升（1；/1111) 之盤尼西林及100微克/毫升（pg/ml)之鏈黴素）中。接著，添加 金線連糖苷（10、25或50微莫耳濃度（μΜ))至包含該腹腔巨噬 細胞之培養孤中並培養3〇分鐘後，添加脂多醣（購自Sigma) 〇 微克/毫升）以誘發細胞之發炎反應^ 24小時後，收集上清液，並 使用革利士（Griess)試劑（購自Sigma)以測定一氧化氮之含量， 結果如表2所示。 201023862 表2 組別 金線連糖苷濃度 一氧化氮濃度 (微莫耳濃度） (微莫耳濃度） 控制組 0 0.8 ±0.2 LPS +空白載體 (vehicle ) 0 32.9 ± 5.5## LPS +金線連糖苷 10 26,7 ± 3.2* LPS +金線連糖苷 25 20.2 ± 2.1** LPS +金線連糖苷 50 16.2 ± 1.0** 所有數據皆為平均數±標準偏差（取樣數=3)。 相較於控制組，##P<〇.〇5。相較於 LPS + vehicle 組 ’ *P<0.05 ’ **P< 0.01。 實驗B :金線連糖苷抑制RAW 264.7巨噬細胞之發炎反應 分別添加不同濃度的金線連糖苷（0、10、50及100微莫耳濃度） 至含有RAW 264.7巨嗟細胞之培養皿（成分為Dulbecco’s modified eagle’s medium、10%之經熱去活性之胎牛血清、100活性單位/毫 升之盤尼西林及100微克/毫升之鏈黴素）中，經2小時後再添加 © 1微莫耳濃度之脂多醣。培養24小時後’收集上清液，使用革利 士試劑測定一氧化氮之含量。刹下細胞後’萃取蛋白，並以西方 點墨法分析一氧化氮合成酵素（iNOs)、ρ65及p5〇 (核因子κΒ， nuclear factor kappa Β 或]sfp_KB，為轉錄因子）的表現。 結果係如表3所示，金線連糖苷可抑制脂多醣之誘發巨噬細胞 活性之作用，因而減少一氧化氮之產生。第2A圖及第2B圖顯示 金線連糖苷可抑制脂多畴之誘發作用’因而減少一氧化氮合成酵 19 201023862 素之表現。第3A圖至第3C圖顯示，脂多醣可刺激RAW 264.7巨 嗟細胞’使p5〇及p65進入細胞核内，而此作用可被金線連糖普

抑制°這些結果顯示金線連糖苷可經由NF-kB途徑（NF-kB pathway)來抑制巨噬細胞之發炎作用。 表3 組別 ----- 金線連糖苷濃度 (微莫耳濃度） 一氧化氮濃度 (微莫耳濃度） 控制組 0 1.6 ± 1.5 LPS + 水 0 21,0 ± 4.2### LPS +金線連糖苷 10 15.5 ± 3.7 LPS +金線連糖苷 50 12.0 ± 3.1** LPS +金線連糖苷 100 8.4 ± 1.7*** 所有數據皆為平均數±標準偏差（取樣數=3)。 相較於控制組，料#P<〇 〇〇1。相較於LPS +水組，**ρ<〇.〇ι，***P< 〇 〇〇1 0 〔實施例2〕金線連糖苷抑制脂多醣誘發ICR小鼠之敗血症 實驗C:金線連糖苷抑制脂多醣誘發小鼠血中發炎細胞激素之 ◎ 產生 以腹腔注射之方式，將不同濃度的金線連糖苷（100毫克/公斤 及300毫克/公斤）投予ICR小鼠。30分鐘後，再以腹腔注射之方 式’將脂多醣（40毫克/公斤）投予ICR小鼠。1小時後，自ICR 小鼠之眼眶採血’並以酵素免疫測定（ELISA，enzyme linked immunosorbent assay)試劑（購自 eBioscience，Boston，MA)測 定TNF-α及IL-Ιβ之濃度，結果係如表4所示。 20 201023862

金線連糖苷劑 量 TNF- IL-Ιβ 控制組 LPS +水 LPS +金線連糖苷 LPS +金線連糖苷 斤）^奈克/毫升）(奈克/毫升） 0 0 100 300 226.9 ± 55.2 406.7 ± 69.4 1457.7 1 334.0^ 638.6 ± 163.0# 680.5 ± 160.2* 371.1 ± 127.8* 513.4 ± 155.0** 272.6 ± 102.6** 所有數據皆為平均數±榡準偏差（取樣數：⑹。 相較於控制組’ #P<〇.〇5,料p<〇 01。 相較於 LPS + 水組’邛<0.05，**P< 0 〇1。 實驗D : 死亡 金線連糖脊抑制高#丨量脂多料發小鼠之敗血性休克 〇 以腹腔注射之方式，將不同遭度的金線連㈣（100毫克/公斤 及3〇0毫克/公斤）投予1CR小鼠。3。分鐘後，再以腹腔注射之方 式將月曰多酷（80毫克/公斤）投予icr小鼠，觀察u、時内之 小鼠死亡[結果係如第4 _示，金線連料可減少小鼠的死 亡率。 自表2至表4及第2A圖至第4圖可看出’金線連糖苷可抑制脂多醣 誘發小鼠之腹腔巨噬細胞及RAW264 7巨噬細胞釋出一氧化氮，並 可減少脂多醣誘發小鼠血中之TNF_a及IL-Ιβ的量，因而可有效抑 21 201023862 制高劑量脂多醣所引起的小鼠死亡率》這些結果顯示金線連糖苷 可有效抑制脂多醣誘發小鼠的發炎反應。 〔實施例3〕金線連糖苷抑制膠原蛋白誘發BALB/c小鼠之風濕性 關節炎 風濕性關節炎之初期’因巨噬細胞受活化釋出細胞激素而引起 發炎，末期則因巨嗟細胞分化成破骨細胞而損害骨頭。因此，可 藉由抑制巨噬細胞之活化及抑制巨噬細胞分化成破骨細胞來治療 風溼性關節炎。 實驗E : BALB/c小鼠係購自國家實驗動物中心，在其尾部以皮下注射2〇〇 微克之/第二型膠原蛋白（購自Sigma)以誘發BALB/c小鼠發生風 濕性關知炎，其中’第一型膠原蛋白係先以佐劑Freund’s complete adjuvant (購自Sigma)乳化。於第21天，再度以200微克之第二型 膠原蛋白皮下注射小鼠，此時，第二型膠原蛋白係先以佐劑 Freund’s incomplete adjuvant ( 自 Sigma) 。自第二二欠注射膠 原蛋白之日起，每日經口投予金線連糖苷（100或300毫克/公 斤），為期21天。待投藥期滿，犧牲小鼠，採血並取出腹股溝淋巴 節及腳掌含關節，以供測定。 金清中TNF-a及抗體lgE、IgGl的濃度係以酵素免疫測定法測 定。抗體IgE及lgG 1的試劑係購自Bethy卜Montgomery，TX。其結 果如表5及表6所示。 22 201023862 表5 組別 金線連糖苷劑量 (毫克/公斤） TNF-a (1〇_12公克/毫升） 控制組 0 788.3 ± 160.0 膠原蛋白+水 0 1281.4 ± 165.4# 膠原蛋白+金線連糖苦 100 825.9 ± 155.4* 膠原蛋白+金線連糖普 300 790.0 ± 194.1* 所有數據皆為平均數±標準偏差（取樣數=7)。 相較於控制組，#P<〇.〇5。相較於膠原蛋白+水組，*P<0.05。 參 表6 組別 金線連糖苷劑量 IgE IgGl (毫克/公斤） (吸光值） (吸光值） 控制組 0 0.06 ± 0.02 2.17 ± 0.08 膠原蛋白+ 水 0 0.31 ±0.09### 2.55 ± 0.07### 膠原蛋白+ 金線連糖苷 100 0.1510.03*** 2.44 ± 0.05 膠原蛋白+ 300 0.13±0.04*** 2.41 ± 0.10* 所有數據皆為平均數土標準偏差（取樣數=7)。 相較於控制組，###Ρ<〇.〇〇1。相較於膠原蛋白+水組，*P<〇.〇5, ***P< 0.001。 如表5所示，膠原蛋白可誘發關節炎而引起小鼠血中TNF-α之濃 度上升，金線連糖苷可抑制此作用。如表6所示，膠原蛋白可誘發 關節炎而引起小鼠血中抗體IgE和IgGl的量上升，金線連糖苷亦可 抑制此作用。 23 201023862 自小鼠兩側腹股溝取出淋巴節，將其過篩以製備成單一懸浮細 胞，以流式細胞儀測定淋巴細胞數目。另外，以抗體CD19/45及 CD4/278 (購自eBioscience)染B細胞及Th2細胞，以求出其所佔的 比率，其結果顯示於表7及表8。 表7 組別 金線連糖苷劑量 (毫克/公斤） 淋巴細胞數目 (105/毫升） 控制組 0 3.3 ± 0.5 膠原蛋白+水 0 4.4 ± 〇,9# 膠原蛋白+金線連糖苷 100 3·3 ± 0.6* 膠原蛋白+金線連糖著 300 2.8 ± 1.0*** 所有數據皆為平均數±標準偏差（取樣數=7)。 相較於控制組’ #p<〇.〇5。相較於膠原蛋白+水組，*P<005, >Μ=*ρ<〇(κη。 表8 組別 金線連糖苷劑量 (毫克/公斤） CD 19/45 (%) CD4/278 (%) 控制組 0 19.2 ±3.8 5.1 ±0.7 膠原蛋白+ 水 0 27.0 ± 3.5## 9.1 ± 0.6爾 膠原蛋白+ 金線連糖苷 100 19.3 ±2.1** 8.0 ± 0.6** 膠原蛋白+ 金線連糖苷 300 ---- 18.6 ±3.6*** 7.6 ± 0.6** 所有數據皆為平均數±標準偏差（取樣數=7)。 ’料Ρ<〇·01，卿Ρ<0·001。相較於膠原蛋白+水組’ **ρ<0.01， ❹ 24 201023862 如表7所示，膠原蛋白可誘發關節炎使小鼠腹股溝淋巴節的淋巴 細胞數目增加，金線連糖苷可抑制此作用。如表8所示，膠原蛋白 可誘發關節炎使小鼠腹股溝淋巴節中B細胞及Th2細胞所佔之比率 上升，金線連糖苷可抑制此作用。 自小鼠右腳掌及關節萃取mRNA，並以反轉錄聚合酶鏈反應 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction 5 RT-PCR)分 析TNF-α之mRNA的表現，其結果顯示於第5A圖及第5B圖。 由第5A圖及第5B圖可知，膠原蛋白可誘發關節炎而引起小鼠右 腳掌的TNF-α之mRNA表現上升，金線連糖苷可降低TNF-α之 mRNA的表現。 對於膠原蛋白誘發小鼠之風濕性關節炎，金線連糖:g：可抑 炎細胞激素之釋出，亦可抑制淋巴細胞申Th2細胞及b細胞的比 率’並減少抗體IgE和IgG2的產生。這些結果說明了金線連糖苦能 減緩膠原蛋白所引起的關節炎，而其抗發炎作用與抑制巨喔細胞 活化及減弱巨噬細胞之呈現抗原作用有關。 〔實施例4〕金線連糖苷抑制破骨細胞之形成 實驗F:金線連糖苷抑制大鼠骨髓細胞形成破骨細胞 首先製備骨髓細胞。使用體重250公克至3〇〇公克的 (Wistar)雄性大鼠來製備骨髓細胞。於麻醉情況下取出大 骨，並以磷酸緩衝液沖洗出骨髓細胞。骨髓細胞係培養於#養 (成分為 α-minimum essential medium、10%之經熱去活，掩 /性之胎牛血 25 201023862 清、100活性單位/毫升之盤尼西林及100微克/毫升之鏈黴素）中’ 並加入可誘發破骨細胞形成的分化劑細胞核因子κΒ受體活化之 配位體（RANKL，receptor for activation of nuclear factor kappa Β ligand ) ( 50 奈克/毫升，講自 PeproTech EC ’ London ’ UK )及巨噬 細胞株刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF) (20奈克/毫升，購自PeproTech EC)。培養9天，使骨髓的單核 球細胞分化成破骨細胞。以抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP， tartrate-resistant acid phosphatase)染色試劑（購自 Sigma，Louis， MO，USA)染破骨細胞，並計算破骨細胞之數目。 Ο 實驗組甲：添加金線連糖苷及雌二醇 除添加與控制組相同之分化劑至培養皿中外，並分別添加不同 濃度的金線連糖苷（〇、5、25、50及100微莫耳濃度）或10奈莫 耳濃度（nM)的雌二醇（estradio卜購自Wako ’ Japan)。接著’ 將大鼠骨髓細胞培養9天，觀察骨髓單球細胞轉成破骨細胞的情 況，並以下列公式計算金線連糖苷及雌二醇抑制破骨細胞形成的 百分率，所得結果係如表9所示。 〇 抑制百分率（％)=(控制組之破骨細胞數目-實驗組之破骨細胞 數目）/控制組之破骨細胞數目x 100% 實驗組乙：添加雌二醇拮抗劑 除添加上述之分化劑RANKL與金線連糖苷及/或雌二醇外，並 添加雌二醇之抑制劑一法洛德（Fulvestrant ’購自Sigma，Louis，MO， USA) (1奈莫耳濃度）。接著，將大鼠骨髓細胞培養9天，觀察骨 26 201023862 髓的單核球細胞分化成破骨細胞的情況，並計算金線連糖苷抑制 破骨細胞形成的百分率，所得結果係如表9中所示。 表9 金線連糖苷 抑制百分率 (%) 組別 濃度 (微莫耳濃度） 實驗組曱 實驗組乙 控制組 0 0 0 金線連糖苷 5 15.3 ± 7·2* 12.0 ± 7.5 金線連糖苷 25 25.0 ± 2.0** 16,3 ± 6.7 金線連糖苷 50 50·3 ± 4.2" 65.7 ± 3.8 金線連糖苷 100 78.1 ± 2.8*** 76.0 ± 3,6 雌二醇 10 (奈莫耳濃度） 45.7 ± 10.5** 24.0 ± 13.5# 所有數據皆為平均數士標準偏差（取樣數=3)。 與控制組相較，*P<〇.〇5，**P<0.01，***P<0.001。 以t-test檢驗，相較於雌二醇組，#P<0.05。 自表9可看出，金線連糖苷與雌二醇皆對破骨細胞之形成具有 抑制效果。已知，雌激素不足會導致骨骼疏鬆症，因此已有使用 雌激素雌二醇治療骨質疏鬆症；同時，乳癌已被證實與分泌過盛 之雌激素有關，故乳癌患者通常須服用法洛德藥物，以抑制雌激 素分泌過盛。因此，若同時患有乳癌及骨質疏鬆症之病患，即使 其骨質疏鬆症非因雌激素不足所引起，由於法洛德藥物對雌二醇 的拮抗性，故無法以雌二醇來治療骨質疏鬆症。然而，如表9所 27 201023862 示，法洛德對金線連糖苷並無抑制效果’故可將金線連糖苷運用 於罹患骨質疏鬆之乳癌患者，且仍可同時服用法洛德藥物。 實驗G : RAW 264.7巨噬細胞之存活率試驗 實驗組丙：金線連糖苷對RAW 264.7巨噬細胞存活率之影響 分別添加不同濃度的金線連糖苷（0、10、25及50微莫耳濃度） 至含有RAW 264·7巨噬細胞（購自材團法人食品工業發展研究所） 之培養孤（成分為α-minimum essential medium、10%之經熱去活 性之胎牛血清、100活性單位/毫升之盤尼西林及1〇〇微克/毫升之 〇 鏈徽素）中並培養 3 天後，以 MTS (3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4- sulfophenyl)-2H-tetrazolium，購自 Promega，Madison，WI，USA)測 量其存活率，其結果列於表10。 實驗組丁 ：分化劑存在下金線連糖苷對RAW 264.7巨噬細胞存 活率之影響 除刀別添加上述之各種濃度的金線連糖苷（〇、1〇、25及5〇微 ❹ 莫耳濃度）外，並添加分化劑RANKL(5〇奈克/毫升），培養3天 後’以MTS測量其存活率，其結果列於表1〇。 MTS的作用原理為：由於活細胞具脫氫酶之活性

，故可將MTS 還原成紅紫色水溶性的產物，而其在49〇奈米之波長下有最高吸 光值因此，由吸光值比率即可判斷細胞之存活率，細胞存活率 係由下列公式計算。 28 201023862 存活率=實驗組之吸光值/控制組之吸光值x 100% 表 10 _ _ 組別 濃度 存活率（％) (微莫耳濃度） 實驗組丙 實驗組丁 控制組 0 100 100 金線連糖苷 10 117.5 ± 8.0 100.3 ± 4.0 金線連糖苷 25 139.9 ± 4.9 105.0 ± 2.4 金線連糖普 50 136.9 ± 4.8 101.0 ± 0.3 所有數據皆為平均數±標準偏差（取樣數=3)。 ❹ 自表10可看出，金線連糖普或其與RANKL之組合皆不影響 RAW264.7巨噬細胞的存活率。 實驗Η :金線連糖苷抑制RAW 264.7巨噬細胞形成破骨細胞 當RAW 264.7巨噬細胞培養於含有分化劑RANKL (50奈克/毫 升）之培養皿中時’ RAW 264.7巨噬細胞通常於5天後會分化成 破骨細胞。於實驗Η中，將各種濃度的金線連糖苷（〇、1〇及5〇 微莫耳濃度）或雌二醇（10奈莫耳濃度）分別加入含有RAW 264.7 巨噬細胞之培養皿中並培養5天後，以TRAP染色試劑染破骨細 胞’以顯微鏡觀察其分化的情況，結果係如第6圖所示^計算破 骨細胞之數目’以下列公式計算抑制破骨細胞形成之百分率，結 果係如表11中所示。 抑制百分率=(控制組之破骨細胞數目_實驗組之破骨細胞數目） /控制組之破骨細胞數目X 100% 29 201023862 表11 組別 控制組 金線連糖苷 金線連糖苷 金線連糖苷 雌二醇

所有數據皆為平均數士標準偏差（取樣數=3) 相較於控制組，*P<0.05，。 抑制百分率（％) 0 19 ± 9* 59 ± 8** 71 ± 3** 61 ± 16**

自表11及第6圖可看出，隨著金線連糖苷濃度之增加，其抑制 RAW 264,7巨嗤細胞分化成破骨細胞的效果愈好（如第6圖中紅 色箭頭所標不之部分）<»此外，如表1〇所示，由於金線連糖苷或 其與RANKL之組合皆不影響RAW 264 7巨噬細胞的存活率故 此抑制作用之機制係針對raw 264.7巨噬細胞之分化，而非起因 於該RAW 264.7巨噬細胞之死亡。 〇 〔實施例5〕以EMSA分析金線連糖苷抑制破骨細胞形成之機制 實驗I : RANKL刺激之時間對反應之關係 利用電泳移動偏移分析（Electrophoresis Mobility Shift Assay， EMSA)來觀察金線連糖苷抑制破骨細胞形成之機制。目前已知分 化劑RANKL可活化RAW264.7巨噬細胞，使NF-κΒ進入細胞核 30 201023862 中促進RAW264.7巨噬細胞分化成破骨細胞（請參考Wada τ， Nakashima T, Hiroshi Ν, Penninger JM. 2006. RANKL-RANK signaling in osteoclastogenesis and bone disease. Trends Mol. Med. 12, 17-25)。 將分化劑RANKL (50奈克/毫升）添加至含有RAW 264.7巨噬 細胞之培養皿中，培養0分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘及120 分鐘後，分別萃取出細胞核中的蛋白質，進行EMSA之分析，結 果係如第7A圖所示。於EMSA之分析中，所使用之DNA序列如 下： cy5-5，-TCGACCAACTGGGGACTCTCCCTTTGGGAACA-3, cy5-5,-TCGATGTTCCCAAAGGGAGAGTCCCCAGTTGG-3,。 自第7A圖可看出，經分化劑RANKL刺激後之RAW264.7巨噬 細胞’其NF-κΒ進入細胞核的量，於60分鐘後達到最大值。因此， 以此為根據’於下組實驗中，以60分鐘作為RANKL刺激反應的 測定時間。 實驗J :金線連糖苷減少NF-kB進入細胞核之量 添加分化劑RANKL (50奈克/毫升）至含有RAW 264.7巨噬細 胞之培養皿中，再分別添加不同濃度的金線連糖苷（0、10、25 及50微莫耳濃度）進行試驗。將RAW 264.7巨噬細胞培養60分 鐘後’分別取出細胞核中的蛋白質，並進行EMSA之分析，結果 係如第7B圖及第7C圖所示。於此，所使用之DNA序列係與上 述之DNA序列相同。自第7B圖及第7C圖可看出，金線連糖苷 31 201023862 可減少NF-κΒ進入細胞核的量。 由上可知，金線連糖苷可減少RAW264.7巨噬細胞之nf_kB進 入其細胞核的量，從而抑制其分化成破骨細胞。藉由此一機制， 本發明包含金線連糖苷之醫藥組合物及萃取液可達到抑制骨路溶 蝕作用的效果。 〔實施例6〕金線連糖苷抑制破骨細胞活性 破骨細胞活化時，會釋放出金屬蛋白酶-9 ( MMP-9， metalloproteinases 9 )以溶钱骨質中的膠原蛋白。以rt-PCR的方 © 法分析MMP-9的mRNA表現，可以瞭解金線連糖苷是否能抑制 破骨細胞的钱骨活性。 實驗K :以金線連糖苷抑制破骨細胞MMP-9之mRNA的表現 當RAW 264.7巨噬細胞培養於含有分化劑RANKL (50奈克/毫 升）之培養m中時，同時加入金線連糖苷（5〇微莫耳濃度）培養 24、48及72小時後’萃取mRNA以利用RT-pcR來分析MMP-9 的表現，結果係如第8A圖及第8B圖所示。金線連糖苷可抑制破 ❹ 骨細胞MMP-9之mRNA的表現。因此’金線連糖并可抑制破骨 細胞的姓骨作用。 〔實施例7〕以金線連糖苷活化造骨細胞 實驗L :金線連糖苷對MC3T3_E1造骨前驅細胞存活率之影響 實驗組戊：金線連糖苷對MC3T3-E1細胞之存活率的影響 MC3T3-E1 細胞（購自 American Type Culture Collection ’ 32 201023862

Manassas，VA)為造骨前驅細胞，可於包含MC3T3-E1細胞之培 養皿中添加適當之分化劑，以觀察造骨細胞之後段分化過程。將 各種濃度的金線連糖苷（〇、1〇〇及1，〇〇〇奈莫耳濃度）分別加入 至含有MC3T3-E1細胞之培養皿（成分為從娜制 medium、10%之經熱去活性之胎牛血清、1〇〇活性單位/毫升之盤尼 • 西林及100微克/毫升之鏈黴素）中並培養3天後，以MTS測量其 •存活率，其結果係列於表12。 實驗組己：於分化劑存4下金線連糖苷對MC3T3-E1細胞之存 ® j舌率的影響 除分別添加上述各種濃度的金線連糖苷外，並將作為分化劑之 維他命C (50微克/毫升，購自sigma)及p甘油磷酸（ι〇微莫耳 濃度，購自Sigma)加入至含有MC3T3_m細胞之培養皿中並培養 3天後’以MTS測量其存活率，其結果係如表12所示。細胞存活 率係以下列公式計算。 ❹ 表12 存活率=實驗組之吸光值/控制組之吸光值乂 1〇〇% 組別 金線連糖苷 存活率（％) 濃度 (奈莫耳滚度） 實驗組戊 實驗組己 控制組 0 100 100 金線連糖苷 10 91.5 ± 3,0* 98,7 ± 7.8 金線連糖苷 100 90.8 ± 2.9* 95,3 ± 3.3 金線連糖苷 1000 89.5 ± 6.0** 95.0 + 4.5 33 201023862 所有數據皆為平均數±標準偏差（取樣數=3)。 相較於控制組，*P<0.05，**P<0.01。 自表12可看出，單獨之金線連糖苷雖輕微降低MC3T3-E1細胞 的存活率，但其與維他命C及β-甘油鱗酸的組合並不影響 MC3T3-E1細胞的存活率。 實驗Μ :金線連糖苷促進MC3T3-E1細胞釋出鹼性磷酸酶 驗性填酸酶（ALP，alkaline phosphatase)為造骨前驅細胞早期 活化的生物指標或標諸分子（molecular marker )，觀察其活性可得 知造骨前驅細胞的活化情形。首先，將維他命C (50微克/毫升） © 及β-甘油磷酸（10微莫耳濃度）加入至含有造骨前驅細胞 MC3T3-E1之培養皿中，並分別添加不同濃度的金線連糖苷（〇、 100及1，000奈莫耳濃度）^分別將該造骨前驅細胞MC3T3-E1培 養3、5及10天後，萃取出細胞内之蛋白質，使用對硝基苯磷酸 液體受質系統（p-nitrophenyl phosphate liquid substrate sytem，講 自Sigma)試劑測定鹼性磷酸酶的活性，其結果係如表13所示。 表13 組別 金線連糖苷 鹼性磷酸酶活性（％) 濃度（nM) 3天 5天 10天 控制組 0 100 100 100 金線連糖苷 10 112±11 120 ±18 125 ±6 金線連糖苷 100 124 ±17 126 ±17 137 ±16 金線連糖苷 1000 130 ±21 132 ± 16* 150土23* 所有數據皆為平均數±標準偏差（取樣數=3)。 相較於控制組，*ρ<〇.〇5。 34 201023862 自表13可看出’隨著時間增加’金線連糖苷可增強驗性碟酸酶 的活性約達25%至50%。亦即’金線連糖苷亦可藉由活化細胞内 之相關酵素（例如：驗性磷酸酶），以促進該造骨前驅細胞 MC3T3-E1細胞進一步分化成造骨細胞。 實驗N :金線連糖苷促進MC3T3-E1細胞產生礦化作用 添加維他命C (50微克/毫升）及β-甘油磷酸（1〇微莫耳濃度） 至包含造骨前驅細胞MC3T3-E1之培養皿中並培養14天後，造骨 前驅細胞MC3T3-E1會發生礦質化作用，而造成鈣沉積。此時， 可利用茜素紅S ( Alizarin red-S，購自Sigma)染色法測量鈣含量 (請參考 Gregory CA，Gunn WG，Peister A, Prockop DJ. 2004. An Alizarin red-based assay of mineralization by adherent cells in culture: comparison with cetylpyridinium chloride extract. Anal. Biochem. 329, 77-84.) 〇 添加維他命C (50微克/毫升）及β-甘油磷酸（10微莫耳濃度） 至含有MC3T3-E1細胞之培養jut中，再分別添加不同濃度的金線 連糖苷（0、100及1，000奈莫耳濃度），將MC3T3-E1細胞培養14 天後，並利用茜素紅S染色法測量鈣含量，其結果係列於表14。 染色後的外觀係如第9圖所示》 35 201023862 表14 組別 控制組 金線連糖苷 金線連糖苷 金線連糖苷濃度 (奈莫耳濃度） 0 10 100 茜素紅S (%) 100 137 ± 29 137 土 27 -金峰查____1〇〇〇_174 ± 42 * 所有數據皆為平均數土標準偏差（取樣數=3)。相較於制組，*p < 0.05。 自表14及第9圖可看出，金線連糖苷可使茜素紅s之吸光值上 升’亦即’可增加MC3T3-E1細胞内之鈣含量，從而促進礦質化 作用。 〔實施例8〕以金線連糖苷改善去卵巢小鼠之骨質疏鬆症 如上述，已知雌激素分泌不足會導致骨質疏鬆症，故於此實驗 中’將ICR小鼠的卵巢去除，使其無法分泌雌激素，從而誘發骨 質疏鬆症。 首先，將ICR小鼠之卵巢去除，3天後，分別以不同用量的金 線連糖苷（〇、100及300毫克/公斤）投予ICR小鼠，其中，該單 位『毫克/公斤』係指每公斤之動物之艎重所須之投藥量。於投藥 滿三週後，犧牲該ICR小鼠。以酵素免疫測定法測定血清中骨鈣 化素（osteocalcin)及 C-terminal cross-lined telopeptides of type I collagen (CTx)之含量。骨約化素及CTx的試劑係構自IDS Nordic A/S，Herlev，Danmarkids，結果係列於表15。取出該經犧牲之ICR 小鼠之股骨，以微型電腦斷層掃描儀（micro computed 36 201023862 tomography ’ SkyScan 1076，Kontizh，Belgium)，拍攝電腦斷層掃 描圖’如第10圖所示，並以分析軟體分析骨體積與組織體積的比 率（bone volume/tissue volume)及骨小樑數目，所得結果記錄於 表16中。接著，將股骨脫鈣後進行冷凍切片，以TRAP染色試劑 染破骨細胞’並計算骨小樑周邊破骨細胞數目，其結果係如第u 圖及表17所示。

表15 組別 金線連糖苷 劑量 (毫克/公斤） CTx (奈克/毫升） 骨鈣化素（奈克/ 毫升） 控制組 0 24.4 ± 3.4 82.2 ± 10.9 OVX+ 水 0 36.9 ± 5.2### 137.5 ± 19.8## OVX+金線連糖苷 100 29.7 ± 6.9* 191.2 ±33.5 OVX+金線連糖苷 300 27.5 ± 3.1** 351.8 ± 80.5*** 所有數據皆為平均數士標準偏差（取樣數=7)»*·OVXj代表去卵巢。相較 於控制組，##P<0.05，’<o.om。相較於 OVX + 水組，*P<0.05，**P< 〇.(M，***p < 0.001。 如表15所示，去卵巢小鼠血中CTx之濃度上升，骨鈣化素濃度 也有上升之趨勢。CTx係骨中膠原蛋白的分解產物，若其於血中之 濃度上升，則表示蝕骨作用增強。骨鈣化素係造骨細胞所產生的小 蛋白質，若其濃度上升，則表示造骨活性增強或骨更新率（turnover) 增強（請參考 Swaminathan R. 2001. Biochemical markers of bone turnover, ClinicaChimica Acta 313, 95-105)。由表 15 可知，金線連 37 201023862 糖苷可降低CTx濃度，且可增加骨鈣化素濃度，顯示其能抑制破骨 細胞及增強造骨細胞活性或骨更新率。 表16 組別 金線連糖苷 劑量 骨體積/組織體積 骨小樑數目 (毫克/公 斤） (%) (個/公厘） 控制組 0 27.6 ± 2.6 12.4 ± 2.2 OVX+ 水 0 17.2 ± 1.8### 9.0 ± 1.8## OVX+金線連糖苷 100 19.9 ± 1.5* 12.2 ± 1.5* OVX+金線連糖苷 300 21.2 ± 2.2* 12.8 ± 1.5* 所有數據皆為平均數±標準偏差（取樣數=7)。『OVX』代表去卵巢。相較 於控制組，##P<〇.〇5，_P<0.001。相較於 OVX+水組，*P<0.05。 自表16可看出，金線連糖苷可增加去卵巢ICR小鼠之骨體積與 組織體積的比率及骨小樑數目，其有效改善去卵巢ICR小鼠之骨 質疏鬆症，並使骨小樑數目回復至正常狀態（相較於未移除卵巢 之ICR小鼠）。另外，自第10圖可看出，相較於未移除卵巢之ICR 小鼠，微型電腦斷層掃描圖顯示金線連糖苷可使ICR小鼠股骨之 骨骼組織回復正常。 38 201023862 表17 組別 金線連糖苷劑量 (毫克/公斤） 破骨細胞數目/ t表面（毫米）

控制組 OVX+ 水 OVX +金線連糠苷 OVX+金線好 0 0 100 300 3.2 ± 0,4 6.6 ± 1.〇## 5,7 ± 0.9* ± 0.8** 第11圖及表17分別為此實驗中去卵巢ICR小鼠之破骨細胞的 顯微鏡圖與統計表，其中，該些破骨細胞係位於該ICR小鼠股骨 之骨小標周圍。如第11圖之黑色箭頭所示，金線連糖苷有效的減 》去印巢ICR小鼠的破骨細胞之數目及密度。 上述實施例僅係用以例示說明本發明之原理及功效，而非用於 Φ 限制本發明。任何熟於此項技藝之人士均可在不違背本發明之技 術原理及精神的情況下，對上述實施例進行修改及變化。因此， 本發明之權利保護範圍應如後述之申請專利範圍所列者。 【圖式簡單說明】 第1圖所示為萃取及單離金線連糖苷的流程圖； 第2A圖所示為將金線連糖苷投予RAW 264,7巨噬細胞後，一 氧化氮合成酵素的蛋白質電泳圖； 39 201023862 第2B圖所示為將金線連糖苷投予RAW 264.7巨噬細胞後，一 氡化t*合成酵素的統計直條圖； 第3A圖所示為將金線連糖苷投予RAW 264.7巨噬細胞後，細 胞核内p65及p5〇蛋白的蛋白質電泳圖； 第3B圖所示為將金線連糖苷投予RAW 264 7巨噬細胞後，細 胞核内P65蛋白的統計直條圖； 胃3C圖所示為將金線連糖苷投予RAW 264.7巨噬細胞後，細 胞核内P50蛋白的統計直條圖； 圖所示為將金線連糖苷投予ICR小鼠後，ICR小鼠死亡率 © 的變化圖； 圖所示為將金線連糖苷投予關節炎ICR小鼠後，TNF-α之 mRNA的電泳圖； 第5B隙私一 mRNA 的統計直條圖；

圖所示為將金線連糖苷投予RAW 264·7巨嗟細胞後， 阐所示為將金線連糖苷投予關節炎ICR小鼠後，TNF-a之 電永移動偏移分析（EMSA)

丨小匈刑无琢逆糖苷投予rAW 264.7巨噬細胞後， 進入細胞核之統計直條圖； 〜圖所示為將金線連糖苷投予RAW 264.7巨噬細胞後’金 40 201023862 屬蛋白酶-9 ( MMP-9 )之mRNA的電泳圖； 第8B圖所示為將金線連糖苷投予RAW 264.7巨噬細胞後，金 屬蛋白酶-9 (MMP-9)之mRNA的統計直條圖； 第9圖所示為將金線連糖苷投予MC3T3-E1細胞後之該細胞培 養孤的染色圖； 第10圖所示為將金線連糖苷投予去卵巢ICR小鼠後之其股骨骨 垢端部位的微型電腦斷層掃描圖；以及 第11圖所示為將金線連糖苷投予去卵巢ICR小鼠後之股骨小樑 © 周圍之破骨細胞的顯微鏡圖。 【主要元件符號說明】 (無）

Claims (1)

1. 201023862 七、申請專利範圍·· 1. 一種用於抑制巨噬細胞活化、抑制破骨細胞形成、抑制破骨 細胞功能及/或活化造骨細胞之醫藥組合物，其係包含有效量 之式（I)化合物：

   或其醫藥可接受鹽或酯。 2. 如請求項1所述之醫藥組合物，其中該式（I)化合物來自金 © 線連(Anoectochilus spp. ) ° 3. 如請求項2所述之醫藥組合物，其中該金線連係台灣金線連 (jwoecioc厶Hayata) 〇 4. 如請求項1至3中任一項所述之醫藥組合物，其係用於抗骨 質疏鬆。 5. 如請求項4所述之醫藥組合物，其中該式（I)化合物或其醫 藥可接受鹽或酯之含量，以式（I)化合物計，為組合物總重 之約4重量％至約8重量％。 ® 6. 如請求項1至3中任一項所述之醫藥組合物，其係用於抗發 炎。 7. 如請求項6所數之醫藥組合物，其係用於抗類風濕性關節炎、 抗痛風性關節炎、抗細菌性關節炎、抗退化性關節炎、抗僵 直性關節炎、或抗骨關節炎。 8. 如請求項6所述之醫藥組合物，其中該式（I)化合物或其醫 42 201023862 藥可接受鹽或酯之含量，以式（I)化合物計，為組合物總重 之約7重量％至約13重量％。 r\

   9. 一種用於抑制巨嗟細胞活化、抑制破骨細胞形成、抑制破骨 細胞功能及/或活化造骨細胞之金線連萃取液，其係包含下式 (I)化合物： (1)〇

   10. 如請求項9所述之萃取液，其係一水性萃取液。 11. 如請求項9所述之萃取液，其實質上不包含親乙酸乙酯之成 分。 12. 如請求項9至11中任一項所述之萃取液，其係用於抗骨質疏 鬆。 13. 如請求項9至η中任一項所述之萃取液，其係用於抗發炎。 14. 如請求項13所述之萃取液，其係用於抗類風濕性關節炎、抗 痛風性關節炎、抗細菌性關節炎、抗退化性關節炎、抗僵直 性關節炎、或抗骨關節炎。 15. —種使用下式（I)化合物或其醫藥可接受鹽或酯在製造藥劑

   其中該藥劑係用於抑制巨噬細胞活化、抑制破骨細胞功能、 43 201023862 抑制破骨細胞形成及/或活化造骨細胞。 16. 如請求項15所述之應用，其中該藥劑係用於抗骨質疏鬆。 17. 如請求項15所述之應用，其中該藥劑係用於抗發炎。 18. 如請求項17所述之應用，其中該藥劑係用於抗類風濕性關節 炎、抗痛風性關節炎、抗細菌性關節炎、抗退化性關節炎、 抗僵直性關節炎、或抗骨關節炎。 19. 一種使用金線連萃取液在製造藥劑之應用，其中該萃取液係 包含下式（I)化合物：

   ❹ ⑴， OH 該藥劑係用於抑制巨嗟細胞活化、抑制破骨細胞功能、抑制 破骨細胞形成及/或活化造骨細胞。 20. 如請求項19所述之應用，其中該萃取液實質上不包含親乙酸 乙酯之成分。 21. 如請求項19所述之應用，其中該萃取液係一水性萃取液。 22. 如請求項19至21中任一項所述之應用，其中該藥劑係用於 ® 抗骨質疏鬆。 23. 如請求項19至21中任一項所述之應用，其中該藥劑係用於 抗發炎。 24. 如請求項23所述之應用，其中該藥劑係用於抗類風濕性關節 炎、抗痛風性關節炎、抗細菌性關節炎、抗退化性關節炎、 抗僵直性關節炎、或抗骨關節炎。 44