JP5721937B2 - 破骨細胞形成の抑制、破骨細胞機能の抑制および/または骨芽細胞の活性化に使用できるキンセノシド含有医薬組成物および抽出液 - Google Patents
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Description
台湾金線連(Anoectochilus formosanus Hayata)は有容農場(台湾の埔里)が育成した植物を購入した。この植物サンプルはすでに中国医薬大学薬学院に寄託し(受託番号:CMU AF 0609)、当院の鑑定を受けた。
(1)まず10kgの新鮮な金線連を100Lの水で攪拌して汁にし、濾過して汁液を取る(AFEで表す)。このステップは水で金線連の乾燥品を煎じて、その煎じ液を取る方式で代替してもよい。次に毎回酢酸エチル25Lで分配を行い、上層の酢酸エチル層を除去してから、さらに酢酸エチル25Lで分配を行い、これを3回続け、酢酸エチル層を合わせた酢酸エチル部分(AFEEで表す)と下層の水溶性部分(AFEWで表す)を得る。
炎症反応は複雑なプロセスであり、フリーラジカル分子(一酸化窒素、過酸化水素など)、サイトカイン(プロスタグランジン2(PGE2)、TNF−α、インターフェロン−γ(IFN−γ)、インターロイキン−2(IL−2)およびインターロイキン−1β(IL−1β)など)などの産生が含まれる。したがって、体内の炎症反応と関係のあるフリーラジカル分子およびサイトカインを測定することによって、炎症反応の程度を知ることができる。
腹腔注射により異なる濃度のキンセノシド(100mg/kgと300mg/kg)をICRマウスに投与した。30分後さらに腹腔注射によりリポ多糖(40mg/kg)をICRマウスに投与した。1時間後にICRマウスの眼の縁から採血し、酵素免疫測定(ELISA)試薬(eBioscience、Boston、MAより購入)でTNF−αおよびIL−1βの濃度を測定した。結果は表2に示すとおりである。
抑制群との比較、#P<0.05、##P<0.01。LPS+水群との比較、*P<0.05、**P<0.01。
腹腔注射により異なる濃度のキンセノシド(100mg/kgと300mg/kg)をICRマウスに投与した。30分後さらに腹腔注射によりリポ多糖(80mg/kg)をICRマウスに投与し、72時間内のマウスの死亡率を観察した。結果は図4に示すように、キンセノシドはマウスの死亡率を減少させることができる。
リウマチ様関節炎の初期は、マクロファージが活性化し、サイトカインを放出して炎症を引き起こし、末期はマクロファージが分化して破骨細胞となり、骨を損傷させる。したがって、マクロファージの活性化を抑制し、マクロファージの破骨細胞への分化を抑制することにより、リウマチ様関節炎を治療することができる。
BALB/cマウスは国家実験動物センターより購入した。マウスの尾部に200μgのII型コラーゲンタンパク質(Sigmaより購入)を皮下注射して、BALB/cマウスにリウマチ様関節炎を発生させた。II型コラーゲンタンパク質は先に補剤フロイント完全アジュバント(Sigmaより購入)で乳化させる。21日目にさらに200μgのII型コラーゲンタンパク質をマウスに皮下注射する。このときのII型コラーゲンタンパク質は先に補剤フロイント不完全アジュバント(Sigmaより購入)で乳化させる。2回目にコラーゲンタンパク質を注射した日から、毎日キンセノシド(100または300mg/kg)を経口投与し、期間は21日間とする。投与期間の満了後、マウスを屠殺し、採血するとともに鼠蹊部リンパ節と関節付き足裏を取り出し、測定する。
抑制群との比較、#P<0.05。コラーゲンタンパク質+水群との比較、*P<0.05。
抑制群との比較、###P<0.001。コラーゲンタンパク質+水群との比較、*P<0.05、***P<0.001。
抑制群との比較、#P<0.05。コラーゲンタンパク質+水群との比較、*P<0.05、***P<0.001。
抑制群との比較、##P<0.01、###P<0.001。コラーゲンタンパク質+水群との比較、**P<0.01、***P<0.001。
実験D:キンセノシドによるラット骨髄細胞の破骨細胞形成の抑制
まず骨髄細胞を用意する。体重250gから300gのウィスター雄ラットを使用して骨髄細胞を用意する。麻酔下でラットの大腿骨を取り出し、リン酸緩衝液で骨髄細胞を洗い出す。骨髄細胞を培養皿(成分はα−最少必須培地、熱で活性を除去した10%の胎牛血清、100活性単位/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシン)の中で培養し、さらに破骨細胞形成を誘発する分化剤細胞核因子κB受容体活性化リガンド(RANKL)(50ng/ml、PeproTech EC、London、UKより購入)とマクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)(20ng/ml、PeproTech ECより購入)を加えた。9日培養して骨髄の単球を破骨細胞に分化させる。抗酒石酸酸性ホスファターゼ(TRAP)染色試薬(Sigma、Louis、MO、USAより購入)で破骨細胞を染色し、破骨細胞の数を計数する。
抑制群と同様の分化剤(RANKL、M−CSF)を培養皿中に添加するとともに、それぞれ異なる濃度のキンセノシド(0、5、25、50と100μモル濃度)または10ナノモル濃度(nM)のエストラジオール(Wako、日本より購入)を添加する。次に、ラットの骨髄細胞を9日間培養し、骨髄単球の破骨細胞への変化状況を観察し、さらに下の公式でキンセノシドとエストラジオールの破骨細胞形成抑制のパーセンテージを計算した。得られた結果は表7に示すとおりである。
抑制パーセント(%)=(抑制群の破骨細胞の数−実験群の破骨細胞の数)/抑制群の破骨細胞の数×100%
上記の分化剤RANKLとキンセノシドおよび/またはエストラジオールを培養皿中に添加するとともに、エストラジオール抑制剤フルベストラント(Sigma、Louis、MO、USAより購入)(1nモル濃度)を添加した。次に、ラットの骨髄細胞を9日間培養し、骨髄単球の破骨細胞への分化状況を観察し、さらにキンセノシドの破骨細胞形成抑制のパーセンテージを計算した。得られた結果は表7に示すとおりである。
抑制群との比較、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
t−test検査によるエストラジオール群との比較、#P<0.05。
実験群C:キンセノシドのRAW 264.7マクロファージ生存率への影響
それぞれ異なる濃度のキンセノシド(0、10、25と50μモル濃度)をRAW 264.7マクロファージ(財団法人食品工業発展研究所より購入)含有の培養皿(成分はα−最少必須培地、熱で活性を除去した10%の胎牛血清、100活性単位/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシン)の中に添加して3日間培養した後、MTS(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−5−(3−カルボキシメトキシフェニル)−2−(4−スルホフェニル)−2H−テトラゾリウム、Promega、Madison、WI、USAより購入)でその生存率を測定した。その結果を表8に示す。
上記の各種濃度のキンセノシド(0、10、25と50μモル濃度)をそれぞれ添加するとともに、分化剤RANKL(50ng/ml)を添加し、3日間培養した後、MTSによりその生存率を測定した。結果を表8に示した。
生存率=実験群の吸光値/抑制群の吸光値×100%
RAW 264.7マクロファージを分化剤RANKL(50ng/ml)を含む培養皿で培養した場合、RAW 264.7マクロファージは通常5日後に分化して破骨細胞になる。実験Fでは、各種濃度のキンセノシド(0、10と50μモル濃度)またはエストラジオール(10nモル濃度)をそれぞれRAW 264.7マクロファージ含有培養皿に加え、5日間培養した後、TRAP染色試薬で破骨細胞を染色し、顕微鏡でその分化の状況を観察した。結果は図4に示すとおりである。破骨細胞の数を計数し、下記の公式で破骨細胞形成のパーセンテージを計算した。結果は表9に示すとおりである。
抑制%=(抑制群の破骨細胞の数−実験群の破骨細胞の数)/抑制群の破骨細胞の数×100%
抑制群との比較、*P<0.05、**P<0.01。
実験G:RANKL刺激時間と反応との関係
電気泳動度移動アッセイ(EMSA)を利用してキンセノシドの破骨細胞形成抑制のメカニズムを観察した。現在知られているように、分化剤RANKLはRAW264.7マクロファージを活性化させ、NF−κBを細胞核中に入らせ、RAW264.7マクロファージの破骨細胞への分化を促進させる(Wada T、Nakashima T、Hiroshi N、Penninger JM.2006.RANKL−RANK signaling in osteoclastogenesis and bone disease.Trends Mol.Med.12、17−25を参照)。
cy5-5'-TCGATGTTCCCAAAGGGAGAGTCCCCAGTTGG-3'。
分化剤RANKL(50ng/ml)をRAW 264.7マクロファージ含有培養皿に添加し、さらに異なる濃度のキンセノシド(0、10、25、50μモル濃度)をそれぞれ添加して試験を行った。RAW 264.7マクロファージを60分間培養した後、細胞核中のタンパク質をそれぞれ取り出し、EMSA分析を行った。結果は図5Bと図5Cに示すとおりである。ここで使用したDNA配列は上記のDNA配列と同じである。図5Bと図5Cから分かるように、キンセノシドはNF−κBの細胞核への進入量を低減させることができる。
破骨細胞が活性化すると、金属プロテイナーゼ−9(MMP−9)を放出して骨質中のコラーゲンタンパク質を吸収する。RT−PCRによってMMP−9のmRNAの発現を分析すると、キンセノシドが破骨細胞の骨吸収活性を抑制できるか否かを知ることができる。
RAW 264.7マクロファージを分化剤RANKL(50ng/ml)を含む培養皿で培養するとき、同時にキンセノシド(50μモル濃度)を加えて24、48、72時間培養した後、mRNAを抽出し、RT−PCRを用いてMMP−9の発現を分析した。結果は図6Aと図6Bに示すとおりである。キンセノシドは破骨細胞のMMP−9のmRNAの発現を抑制することができる。したがって、キンセノシドは破骨細胞の骨吸収作用を抑制できる。
実験J:キンセノシドのMC3T3−E1骨芽前駆細胞生存率への影響
実験群E:キンセノシドのMC3T3−E1細胞の生存率への影響
MC3T3−E1細胞(American Type Culture Collection、Manassas、VAより購入)は骨芽前駆細胞である。骨芽細胞の後段階の分化過程を観察するために、MC3T3−E1細胞を含む培養皿中に適度の分化剤を添加してもよい。各種濃度のキンセノシド(0、100、1,000nモル濃度)をそれぞれMC3T3−E1細胞を含む培養皿(成分はα−最少必須培地、熱で活性を除去した10%の胎牛血清、100活性単位/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシン)の中に加え、3日間培養した後、MTSにてその生存率を測定した。結果は表10に示した。
上記各種濃度のキンセノシドをそれぞれ添加するとともに、分化剤としてビタミンC(50μg/ml、Sigmaより購入)とβ−グリセロリン酸(10μモル濃度、Sigmaより購入)をMC3T3−E1細胞を含む培養皿に加え、3日間培養した後、MTSでその生存率を測定した。結果は表10に示すとおりである。細胞生存率は以下の公式に換算した。
生存率=実験群の吸光値/抑制群の吸光値×100%
抑制群との比較、*P<0.05、**P<0.01。
アルカリ性ホスファターゼ(ALP)は骨芽前駆細胞の早期活性化の生物指標または分子マーカーであり、その活性を観察すると骨芽前駆細胞の活性化状況を知ることができる。まずビタミンC(50μg/ml)およびβ−グリセロリン酸(10μモル濃度)を骨芽前駆細胞MC3T3−E1を含む培養皿に加え、それぞれ異なる濃度のキンセノシド(0、100、1,000nモル濃度)を加える。この骨芽前駆細胞MC3T3−E1をそれぞれ3、5、10日間培養した後、細胞内のタンパク質を抽出し、p−ニトロフェニルホスフェート液体基質系(Sigmaより購入)の試薬を使用してアルカリ性ホスファターゼの活性を測定した。結果は表11に示すとおりである。
抑制群との比較、*P<0.05。
まずビタミンC(50μg/ml)とβ−グリセロリン酸(10μモル濃度)を骨芽前駆細胞MC3T3−E1を含む培養皿に加え、14日間培養すると、骨芽前駆細胞MC3T3−E1は鉱質化作用を起こし、カルシウム沈積をもたらす。このとき、アリザリンS(Sigmaより購入)染色法を利用してカルシウム含量を測定できる(Gregory CA、Gunn WG、Peister A、Prockop DJ.2004.An Alizarin red−based assay of mineralization by adherent cells in culture:comparison with cetylpyridinium chloride extract.Anal.Biochem.329、77−84参照)。
抑制群との比較、*P<0.05。
上記のように、エストロゲンの分泌不足が骨粗しょう症をもたらすことはすでに知られているので、この実験では、ICRマウスの卵巣を除去し、エストロゲンを分泌できないようにして骨粗しょう症を誘発させた。
Claims (5)
- 破骨細胞形成の抑制、破骨細胞機能の抑制および/または骨芽細胞の活性化に用いられる医薬組成物であって、
有効量の式(I)の化合物
またはその医薬上許容される塩もしくはエステルを含む医薬組成物。 - 前記式(I)の化合物は金線連(Anoectochilus spp.)に由来する、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記金線連は台湾金線連(Anoectochilus formosanus Hayata)である、請求項2に記載の医薬組成物。
- 抗骨粗しょうに用いられる、請求項1から3のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記式(I)の化合物またはその医薬上許容される塩もしくはエステルの含量が、式(I)の化合物に換算して、組成物総量の約4重量%から約8重量%である、請求項4に記載の医薬組成物。
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