TW201004648A - Polymeric systems containing intracellular releasable disulfide linker for the delivery of oligonucleotides - Google Patents

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Hong Zhao
Prasanna Reddy
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Enzon Pharmaceuticals Inc
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Description

201004648 六、發明說明： 交互參照相關申請案 =請案主張纖年5月23日中請之美國臨時專利 ==61/〇55州號、·年5月23日中請之美國臨時 專利申言月案第61/055,869號、2008年1〇月㈡ 國臨時專利申請案第61/1〇6,578號及2_年1〇月二申 =之美國臨時專利申請案第6祕，579冑之優先權的利 見，β亥等參照案中之每一者之内容係以引用的方式併入本 文中。 發明背景 因為治療性基因可選擇性地調節與疾病相關之基因表 ^且將使用其他治療方法可能招致之副作料至最低程 又所以基於基因之療法為治療疾病之有效工具。 已提出基於新一代rNA拮抗劑鎖核酸（lna)反義募 核苦酸的療法。每- LNA單體在核糖之2,_氧與4，_碳之間 合有亞甲基橋。此將LNA殘基固定於有利之類舰構形中 且使得LNA寡核苦酸與其他業内已知之寡核芽酸相比能夠 具有較高親和力、特異性及對降解之抗性。已展示ΜΑ寡 核芽酸在試管内抑制目標基因表現（以亞奈莫耳含量）。 =然LNA寡核努酸與其他業内已知之核酸相比具有改良之 :療活性’但是仍需要進一步改良LNA寡核苦酸之藥物動 學概況及自循環之快速清除及活體内有限活性。對提供 用於傳遞LNA寡核普酸以及其他業内已知之核酸分子之經 改良之系統及方法繼續存在需要。本發明著手解決此需要。 3 201004648 發明摘要 為了克服上述問題且改良傳遞寡核苷酸之技術，本發 明提供含有細胞内可釋放的連結子之新㈣合傳遞系統。 在本發明 物之腫瘤細胞 乳動物投予式 之一態樣中，提供將寡核苷酸傳遞至哺乳動 之方法。該等方法包括向具有腫瘤細胞之哺 (I)化合物： R 丨-{21} 或其醫藥學上可接受之鹽 其中 1為實質上無抗原性之水溶性聚合物； 各Z1相同或不同且係選自：
_(L4)al-Rb ;及 _(L4)a2-Rc， :在每次出現時獨立地為S或0; R2在每次出現時獨立地為NR丨3; L:,兮次出現時為相同或不同寡核苷酸； 自在每-欠出現時為相同或不同雙官能連結子； 201004648
Rb在每次出現時為葉酸；
Rc在每次出現時為相同或不同診斷劑； R3-7各自獨立地選自· 目.虱、Ci 6烷基、 炔基、C3_19支鏈、•其 .6埽基 … 凡土、匚3_8環烧基及cU0境氧笑. R 1 3在每次出規g士扼丄 土’ 母人出現日守獨立地選自：氫、 基、C2.6炔基、c , ^ ·6烷基、C2.6烯 C3'19支鏈烷基及C3—8環烷基； R丨2在每次出現時獨立地選自··氫、羥基 C2-6烯基、C2炔其 n Cl-6貌基、 炔基、C3-19支鏈烷基、c3.8環 氧基； 衣烷基及C丨-6烷 a及（d)各自獨立地為0、1、2或3 (al )及（a2)各自獨立地為〇、！、2或 各（b)獨立地為〇、！、〗或3丨 5 各（Ο獨立地為〇、卜〗或3; 各（e )獨立地為〇或1 ; 各（g)獨立地為〇或1 ;且 (m)為約2至約32之正整數， 限制條件為（a )及（g )不同時為〇，且 件為一或多個含有寡核苷酸。 —步限制條 態樣中，本發明提供抑制具 癌細胞之哺帛# & 則列腺或子宮頸 、商礼動物之基因表現之方法。 只 在具體實例中，本文中所招抒· + 化合物為： 丰文中所把述之方法中所用之式⑴ 201004648
Oligo^ sS' -Λ ο HO、f^ S…Olig。 Ο
PEG Ο Olig〇^S"Si^Y^OH ΗΝγΟ^ Ο
PEG Ο ΎΗ Η X 〜〇/|\| ι_ R/N>^0〜a^
人T S』、Oligo 或 Ο ,Ss
HO 丫 S，s〇ligo 丫 NH O
PEG
或其醫藥學上可接受之鹽， 其中 PEG為聚乙二醇且該化合物之聚合部分具有約5,000 至約25,000道爾頓（dalton)或約20,000至約45,000道爾 頓之總數量平均分子量；
Rb為
Oligo為約8至30個核苷酸之寡核苷酸。 在本發明之另一態樣中，提供抑制哺乳動物之基因表 現以治療各種疾病（亦即前列腺或子宮頸癌）之方法。 本發明亦提供製備本文中描述之化合物之方法。 6 201004648 本文中描述之聚合傳輸系統之一優勢為可釋放的PEG- 連結子技術提供活體内投予包括LNA之治療性寡核苷酸之 方法。此選擇性傳遞技術使得可增強LNA之治療功效且降 低毒性。 另一優勢為本文中描述之可釋放的傳遞系統允許調節 寡核苷酸之藥物動力學性質。經由EpR效應及靶向基團（諸 如葉I )可選擇性地乾向治療性寡核苷酸自聚合接合物釋 放之部位。可使與本文♦描述之聚合物連接之寡核苷酸（諸 如LN A )在目標區域（諸如癌細胞）釋放，由此使得熟習 此項技術者可纟目標區域達成治療性募核苦酸之所需生物 可用性。另外，可修飾募核苷酸之釋放部位，亦即在細胞 之不同隔室中釋放寡核*酸，，本文中描述之聚合傳 遞t ^允$足夠里之治療性寡核#酸（包# LNA )在所需 巧寺丁區域（例如細胞質、微胞飲小體及内體）處選擇性地 得以利用。空間修飾可有利於治療疾病。纟文中描述之方 純供傳遞寡核苦酸及改良寡核皆酸（例如遍寡核苷 酸、S1RNA)活體内功效之方法。 本：明之另一優勢為本文中描述之接合物允許癌細胞 =存在轉染劑的情況τ發生細胞吸收及特定调八下 ^ 周幸此^優於先前技術之顯著優勢且由此顯著地簡化治療 治療性寡：：Γ酸藥物之活體内投藥。此技術可應用於 席Γ暴核苷酸之活體内投藥。 治療Ϊ = Ϊ物在缓衝條件下為穩定的且募核苦酸或其他 縻別不過早地自身體排出。 7 201004648 其他優勢將由以下描述及圖式而顯而易見。 出於本發明之目的，術語“殘基，，應理解為意謂並所 指之化合物之部分，料PEG、寡核普酸等，其在經歷血 另一化合物之取代反應後仍留存。 出於本發明之目的，術語“聚合殘基，，或“pEG殘基” 各自應理解為意謂聚合物或PEG之部分’其在經歷與：他 化合物、部分等之反應後仍留存。 出於本發明之目的，如本文中所用之術語“烷基，，係 指飽和脂族烴，包括直鏈、支鏈及環狀烷基。術語“烷基” 亦包括烷基-硫基-烷基、烷氧基烷基、環烷基烷基、雜環烷 基、烴基。較佳地，烷基具有1至I:個碳。更佳地， 其為約1至7個碳之低碳烷基，仍更佳地為約1至4個碳 之低碳烷基。烷基可經取代或未經取代。當經取代時，經 取代之基團較佳包括鹵基、氧基、疊氮基、硝基、氰基、 烧基、烧氧基、烷基-硫基、烷基-硫基-烷基、烷氡基烷基、 烧基胺基、二_曱基、經基、疏基、經基、氰基、烧基石夕 炫1基烧基、壤烧基烧基、雜環烧基、雜芳基、稀基、 块基、C,-6烴基、芳基及胺基。 出於本發明之目的，如本文中所用之術語“經取代” 係指添加來自以下群之部分中之一者，或以來自以下群之 部分中之一者置換官能基或化合物中所含之一或多個原 子：i基、氧基'疊氮基、硝基、氰基、烷基、烷氧基' 烷基-硫基、烷基_硫基_烷基、烷氧基烷基、烷基胺基、三 鹵甲基'羥基、巯基、羥基、氰基、烷基矽烷基、環烷基、 201004648 環烷基烷基、雜環烷基、雜芳基、烯基、炔基、Cm烴基、 方基及胺基。 如本文中所用之術語“烯基”係指含有至少一個碳-碳 •雙鍵之基團，包括直鏈、支鏈及環狀基團。較佳地，烯基 具有約2至12個碳。更佳地’其為約2至7個碳之低碳烯 基，仍更佳地為約2至4個碳之低碳烯基。稀基可經取代 或未經=。當經取代時，經取代之基團較佳包括函基、 氧基a：氮基、硝基、氰基、院基、院氧基、烧基_硫基、 烷基-硫基-烷基、烷氧基烷基、烷基胺基、三自甲基、羥基、 疏基#工基It基、燒基石夕烧基、環烧基、環烧基燒基、 雜ί衣院基雜芳基、稀基、块基、Ci6煙基、芳基及胺基。 士本文中所用之術語“炔基”係指含有至少—個碳-碳 參鍵之基團，包括直鏈、支鏈及環狀基團。較佳地，快基 具有約2至U個碳。更佳地，其為約2至7個碳之低碳炔 基，仍更佳地為約2至4個碳之低碳块基。炔基可經取代 或未經取代。當經取代時’經取代之基團較佳包括齒基、 乳基、疊氮基、確基、氰基、燒基、燒氧基、院基_硫基、 =基-硫基-烷基、烷氧基烷基、烷基胺基、三卣曱基、羥基、 ㈣、經基、氰基、燒基石夕烧基 '環規基、環烧基院基、 雜每烧基、雜芳基、烯基、快基、C,.6烴基、芳基及胺基。 炔基之實例包括炔丙基、丙炔基及3_己炔基。 —本文中所用之術言吾“芳基”係指含有至少一個芳族 *之方族烴環系統。芳族環可視情況稠合或以其他方式連 接至其他芳族烴環或非芳族烴環。芳基的實例包括（例如） 201004648 苯基、萘基、1,2,3,4-四氫萘及聯苯。芳基之較佳實例包括 苯基及萘基。 如本文中所用之術語“環烷基”係指c3 8環烴。環烷 基的實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基 及環辛基。 如本文中所用之術語“環烯基”係指含有至少一個礙_ 碳雙鍵之C3·8環烴。環烯基之實例包括環戊烯基、環戊二 烯基、環己烯基、1,3-環己二烯基、環庚烯基、環庚三烯基 及環辛烯基。 如本文中所用之術語“環烷基烷基”係指經C3_8環烷 基取代之院基。環烧基烧基之實例包括環丙基甲基及環戊 基乙基。 如本文中所用之術語“烷氧基”係指經由氧橋與母體 分子部分連接之具有指定數目碳原子之烧基。烧氧基之實 例包括（例如）甲氧基、乙氧基' 丙氧基及異丙氧基。 如本文中所用之烧基^•基係指經烧基取代之芳 基。 如本文中所用之“芳烷基”係指經芳基取代之烧基。 如本文中所用之術語‘烧氧基燒基”係指經烷氧基取 代之炫基。 如本文中所用之術語“烧基-硫基_烷基，，係指烷基_s_ 烷基硫醚，例如甲基硫基甲基或甲基硫基乙基。 如本文中所用之術語“胺基”係指如在此項技術中已 知藉由以有機基團置換一或多個氫基而自氨衍生之含氮基 201004648 烷基胺基”係指 之有機基團。 係指經烧基取代 分 之 團。舉例而言，術語“醯基胺基”及“ 別具有醯基及烷基取代基之特定N-取代^ 如本文中所用之術語“烷基幾基，， 羰基》 或鹵基”係指氟、 如本文中所用之術語“ _素” 氯、溴及埃。 如本文中所用之術語“雜環烷基” 签係指含有至少一個 選自t、氧及硫之雜原子之非芳族環系統。雜環烷基環可 視情況稠合或以其他方式連接至其他雜環烷基環及/或非芳 族烴環。較佳雜環烷基具有3至7個成g ^ ^ ^ 丨口取貝。雜環烷基之實 例包括（例如）哌啡、嗎啉、哌啶、 鸟 疋四虱呋喃、吡咯啶及 吡唑。較佳雜環烷基包括哌啶基 σ定基。 哌哄基、嗎啉基及吡咯 如本文中所用之術語“ 自氮、氧及硫之雜原子之芳 稠合或以其他方式連接至一 族烴環或雜環烷基環。雜芳 呋喃、噻吩、5,6,7,8-四氫異 例包括噻吩基、苯并噻吩基 嘧啶基、咪唑基、苯并味唑 唑基、苯并α塞唾基、異噁唑 并異噻唑基、三唑基、四唑 及苯并吡唑基。 如本文中所用之術語“ 雜芳基’’係指含有至少一個選 族環系絲*。雜#基環可視情泥 或多個雜芳基環、芳族或非芳 基的實例包括（例如）吡啶、 喹啉及嘧啶。雜芳基之較佳實 、吡啶基、喹啉基、吡畊基、 基、呋喃基、苯并呋喃基、噻 基、噁二唑基、異噻唑基、笨 基、吡咯基、吲哚基、吡唑基 雜原子’’係指氮、氧及硫。 11 201004648 在一些具體實例中’經取代烷基包括羧基烷基、胺基 烷基、二烷基胺基'羥基烷基及酼基烷基；經取代烯基包 括羧基烯基、胺基烯基、二烯基胺基、羥基烯基及毓基烯 基，經取代块基包括叛基快基、胺基快基、二炔基胺基、 羥基炔基及毓基炔基；經取代環烷基包括諸如4_氯環己基 之部分；芳基包括諸如萘基之部分；經取代芳基包括諸如 3-溴苯基之部分；芳烷基包括諸如曱苯基之部分；雜烷基包 括諸如乙基噻吩之部分；經取代雜烷基包括諸如3_曱氧基_ 噻吩之部分；烷氧基包括諸如甲氧基之部分；且苯氧基包 括諸如3_石肖基苯氧基之部分。鹵基應理解為包括氟 '氯、 碘及溴。 理解為包括等於或 在普通技術者判定 1至約10，更佳為 出於本發明之目的，“正整數，，應 大於1之整數且如一般技術者所瞭解， 乾圍内，亦即在-些具體實例中較佳為 1或2 〇 於脫二之目的，“核酸”或“核應用 非另=糖核“DNA”）及核糖核酸（“庸，）（除 出 又奴）及其任何化學修飾形式。 出於本發明之目的‘ 團與另一美〇〇連°應理解為包括一基 學反應之結果。 非/、價連接，亦即作為化 出 士田 、土 5月達成 瞭解。 於本發明之目的，術語 所需效應或治療效應之 有效量”及 量’該效應如 “足夠量”意 —般技術者所 12 201004648 出於本發明之目的，術語“治療性寡核苷酸” 作醫藥或診斷劑之寡核苷酸。 、曰 出於本發明之目的，“基因表現之調節，，應理解為廣 泛地包括在不考慮投藥途徑的情況下，與在不存在本文中 描述之化合物之治療的情況下所觀察到之基因表現相比， 較佳與癌症及發炎相關之任何類型之基因之下調或上調。 出於本發明之目的，目標基因之“基因表現之 二理解為意謂當與在不存在本文中描述之化合物之治療的 月況下所觀察到之mRNA表現或蛋白質轉譯相比，减μ 蛋白質轉譯降低或減弱。適合檢定包括（例如）使 无、習此項技術者已知之技術檢驗蛋白質或mRNA含旦， 印跡法、北方印跡法（nGnhembi()ts)、原位雜交、 、免疫沈澱、酶功能以及熟習此項技術者已知之表型 經治療之病狀可由（例如）細胞、較佳癌細胞或組 織中之mRNA含量降低證實。 治療廣二::二當獲得所需反應時，視為出現成功抑制或 “ 5，成功抑制或治療可由獲得（例如）盥腫 瘤生長抑制相關之基因之1〇0/戈 同(亦即 2〇%、3〇%、40%) 述之化^ 功治療可由當與在不存在本文中描
:化“，之治療的情況下所觀察到之彼含量相比 传癌細胞或組織中致癌基因mRNA 術者預期之其他萨庆俨处铷、s , 括…S此項技 4 ™床^物）至少20%或較佳3〇%、更佳 次更回（亦即50%或80%)降低來定義。 13 201004648 另外，在描述中為方便起見使用單數術語決不意 限於此。因此舉例而言，提及包含一酶之組合物係指彳^ a 之一或多個分子。亦應瞭解本發明不侷限於本文中揭^示酶 特定組態、方法步驟及物質，此係因為該等組態、方去， 驟及物質可在某種程度上變化。 亦應瞭解，因為本發明之範疇係由隨附申請專利範圍 及其等效物限制，所以本文中使用之術語僅用於描述特定 具體實例之目的且不欲具有限制性。 【圖式簡單說明】 圖1示意地說明實施例7中描述之化合物1之合成。 圖2示意地說明實施例8 -13中描述之化合物1 〇之人 成。 圖3示意地說明實施例14-18中描述之化合物18之合 成。 圖4示意地說明實施例1 9-23中描述之化合物25之合 成。 圖5示意地說明實施例25_27中描述之化合物3 0之合 成。 圖6示意地說明實施例2 8_29中描述之化合物3 5之合 成。 圖7展示實施例32中描述之PEG-LNA接合物之細胞 吸收。 圖8展示實施例32中描述之PEG-LNA接合物之受體 特異性細胞吸收。 14 201004648 圖9展示實施例33中描述之peG-LNA接合物之試管 内功效。 圖10展示實施例34中描述之葉酸—PEG-LNA接合物之 活體内功效及生物分布。 圖11展示實施例3 5中描述之peG-LNA接合物之生物 分布。 圖12展示實施例36中描述之PEG-LNA接合物之活體 内功效。 圖13展示實施例37中描述之peG-LNA接合物之活體 内功效。 為便於描述且不加限制，多臂PEG (例如四臂pEG ) 在圖中描述為“PEG” 。 發明之詳細述敘 A.概述
明之一態樣中，提供將寡核苷酸傳遞至 之哺乳動物之腫瘤細胞之方法。該方法包括向具 Z 肥^南礼動物投予式（][)化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽， 其中
Rl為實質上無抗原性之水溶性聚合物； 各Z1相同或不同且係選自： 15 V. 201004648
R12 S”S~Ra _(L4)ai-Rb ;及 _(L4)a2-Rc， 現時獨立地為8或〇,較佳為〇，· —人出現時獨立地為NRu ’較佳為nh ; 母次出現時為相同或不同寡核苷酸； 1 ·4各自在每次出現時為相同或不同雙官能連結子；
Rb在每次出現時為葉酸； 1在每次出現時為相同或不同診斷劑； 、3·7各自獨立地選自：氫、Cu烷基、C2-6烯基、C2_6 、、基C3·19支鏈烷基、C3_8環烷基及Ci·6烷氧基； 13在每人出現時獨立地選自：氫、C卜6烧基、C2-6烯 土 C2-6炔基、支鏈烷基及Cw環烷基；
Ri2在每-人出現時獨立地選自··氫、羥基、cu烷基、 C2-6烯基、Cw炔基、Cm支鏈烷 8環烷基及Cw烷 氧基；
a)及U)各自獨立地為〇、i、2或3 ’且較佳為〇 ; al)及Ca2)各自獨立地為〇、1、2或3，且較佳為 16 201004648 32 各（b)獨立地為Ο、！、2或3 么（、 'a'較佳為0 “）獨立地為〇、卜2或3 各⑴獨立地為0或卜且較佳為〇;為Jj 各（g)獨立地為〇或】，且較佳為i . ㈤為约2至約32之正整數（二 多 限制條件為（a )及（g )不同時為〇且限 個Z!含有寡核苷酸。 在另一態樣中，提供式（I)化合物：Rl *{Z1}m 制條件為 16、 一或 或其醫藥學上可接受之鹽， 其中 R!為實質上無抗原性之水溶性聚合物； 各Zi相同或不同且係選自： V-.
-(L4)al_Rb，及 -(L4)a2-Rc ’ 17 201004648 Y2在每次出現時獨立地為NRn，較佳為nh;
Ra在每次出現時為相同或不同募核苦酸；
Ll.4各自在每次出現時為相同或不同雙官能連結子. Rb在母次出現時為葉酸；
Rc在每次出現時為相同或不同診斷劑； R3.7各自獨立地選自：氫、c “燒基、c2_6烯基、c 炔基、C3.19支鏈燒基、c3 8jt烧基及c】6院氧美；2-6 R13在每次出現時獨立地選自：氫、k^ 基、c2.6炔基、c3_19支鏈燒基及C3 8環燒基； 2-6烯
Ru在每次出現時獨立地選自：氫、 =烯基、一、一二 ⑺及⑷各自獨立地為〇、卜2或3 U1)及（a2)各自獨立地為〇、 佳為〇; 1 ； 2或3,且較佳為 各（b)獨立地為0、1、2或3,且較佳為〇. 各（C)獨立地為0、1、2或3,且較佳為^ 各（e)獨立地為〇或丨，且較佳為 各（g)獨立地為〇或丨，且較佳 (m)為約2至約32之正整數例如’ 32)， 數（例如 2、4、6、8、16、 限制條件為（a)及（g)不同時為〇， 有寡核苷酸，且一或多個Ζι含有葉酸。，一或多個 在一具體實例中，一個z含 3有暴核苦酸且其餘Ζι含有 18 201004648 葉酸。 出於本發明之目的，（m 聚合物臂包括線性聚合物，諸如聚？二合物。臂… 等於約2至約32。舉例而言，： 較佳地’（m) 臂時，（《Ο為32。當（m)為^ 有32個線性聚合物 化合物令使用雙PEG。因 ^夺’在本文中描述之聚合 32個聚人物辟^ 此t合化合物可較佳包括至多 4。物臂，亦即4、8、i 。枯主夕 聚合化合物可勹紅 飞32個。在一具體實中， 口物可包括四至八個聚合 8(例如4、6弋8、 ± #其中（m)可為4至 4 6或8)。較佳地 其中（m)為4。 久口邛刀包括四個聚合物臂， a)等於或大於2時，Ll相同 d )等於或大於2時，l2相同 出於本發明之目的，當 或不同。 出於本發明之目的，當 或不同。 當（al 或（a2)等於或大於2 出於本發明之目的 時’乙4相同或不同。 當（b)等於或大於2時，C(R4)(R5) 當（C)等於或大於2時，C(R6)(r7) 出於本發明之目的 相同或不同。 出於本發明之目的 相同或不同。 在 具體實例中，腫瘤細胞為前列腺或子宮頸癌細胞。 在另一態樣中，本發明提供抑制哺乳動物細胞或組織 之基因表現之方法。該方法包括向有需要之哺乳動物投予 有效量之式（I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。 19 201004648 在-具體實例中，本文中描述之 化合物來執行： 味係使用式（Γ
Rb~(U>st' 其中
Y2"C
m2
'S-S-i Ra -Jmi (ml)為約 l 至的 〇 -r i4. Α 土 π 8之正整數（ 6、7、8 )； 例如1、2、3、 4、 5、 ⑽為0或約！至約7之正整數( 4、5、6、7 且 例如〇、 、2、 (ml )與（m2)之4认 和為約2至約8之整數（办 6、8 )。 數（例如 2、4、 在一特定具體實你丨Λ 態樣令，（m2 )為〇 所有（Zl )合有寡核芽酸。在此 相同或不同 ml)為4或8。或者，所有（Zl)
20 201004648 另特定具體實例中，一或多個Z!含有葉酸。或者， 一或多個7 & ,τ、 1為-(L4)al-Rb。在此態樣中，當（m)大於2時， 個ζι包括募核苷酸且其餘Ζι中之每一者包括葉酸。 另具體實例中，本文中描述之化合物包括可選診 斷劑。 在另—具體實例中’各Rl2為選自h、nh2、〇h、co2h、 Cl-6烷氧基、Ci-6烷基之相同或不同基團 在另-具體實例中，一為選自氣、甲基為乙基及 異丙基之相同或不同基團。較佳地，R3·7全部為氫。 在一較佳具體實例中，、（彳 ’、、虱 為1。 Cd)及（Ο為0且（C) 在-較佳具體實例中’本文中描述 (〇化合物包括具有下式之Ζι : 方法中所用之式
’(Li)a-N
R12 S-S. R2
Ra 其中， (a )為〇或l ; 、c“ 烷基、C2—6 氧基；且
Rl2在每次出現時獨立地選自：羚Λ 婦基、C2.6炔基、C3.l9支鏈貌基及c = 所有其他變數與以上定義相同。π 21 201004648 或者，本文中描述之化合物具有下式 -Rr
Rj2 mi 其中（a)為〇或l。 在此態樣中，f m& π。 C m2)為〇且所有Ζι為 ο ’(L1)a--Ν
R21 S-S-Ra 或 mi)為1 ’或一個Zi為 Ο ^isj.
R12 S，S〜Ra 其中其餘Zl中之每一者包括葉酸。 在另具體實例中，—個&包括診斷劑。 ‘癌樣中’ Ri包括聚伸烷基氧化物。較佳地，Ri 具有約5,〇0〇至 王约25,〇〇〇道爾頓或約2〇,000至約45 〇〇〇憎 爾頓之總數量平均分… 〇道 在本發8月> ±J_ 月之—較佳態樣中，本文中描述之古、+ 下式之化合物進行： 〈方法以具有 22 201004648 Z'
Z-(OCH2CH2)n-0 2-(0CH2CH2)n~0 Z-{OCH2CH2}n-0 Z-(OCH2CH2)n-0
Z-(〇0H2CH2)n-O Z-(OCH2CH2)n、〇 Z-(OCH2CH2}〆 Z-(OCH2CH2)丨
.0-(CH2CH20)n-Z ,0-{CH2CH20)n-Z
〇-(CH2CH2〇)n-Z 〇-(CH2CH20)n-Z ,或 g.{CH2CH20)n-Z 〇"{CH2CH20)„-2 \(CH2CH20)n-Z 0-(CH2CH2〇)n-2 其中 各z獨立地為
-(L4)ai -Rb ;或 _(L4)a2_Rc ’ 其中 (a)為0或1。 23 201004648 -、叫W ”㈣么吧3¾目.羥巷、6 基、C2·6炔基、支鏈烷基及〇16烷氧基； K!2在母次出現 稀 - -_ I \i <J〇 ϊ η)為正整數且該化合物之聚合部分具有約5〇 轉〇〇道爾頓或約20,，至約45,〇〇〇道爾數 均分子量；且 “默里十 所有其他變數與以上定義相同。 在此態樣中，所有Ζ基團包括寡核苦酸。 包括寡核普酸且其餘-或多個Ζ基團（例如卜2、3、4,Ζ 6或7個Ζ基團）包括靶向劑，諸如葉酸。在另 ： 中，一個Ζ包括寡核苷酸，另— ”旦列 戋多個f #丨^ 1 Z包括移斷劑，且其餘一 ^ &個）Z包括葉酸。 在本發明之另一態樣中，提 杈仏式（la)化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽， 其中 R，為實質上無抗原性之水溶性聚合物； 各Z1相同或不同且係選自： (Ll)a^
24 201004648 -(L4)al-Rb ;及 -(L4)a2-Rc， 1在每-人出現時獨立地為s或ο ; • 2在每-人出現時獨立地為NR13 ;
Ra在每次出現技 時為相同或不同春核苦酸； U4各自在每次出現時為相同或不同雙官能連結子； h在每次出現時為葉酸；
Rc在每次出現時為相同或不同診斷劑； R3-7各自獨立地選自：氫、ci 6烷基、c2 6烯基、C2_6 炔基、C3_丨9支鏈烷基、C3 8環烷基及Cw烷氧基；
Rl3在每次出現時獨立地選自：氫、Cj_6烷基、c2_6烯 基、Cw块基、C3·丨9支鏈烷基及環烷基；
Rl2在每次出現時獨立地選自：氫、羥基、¢:,-6烷基、 C2-6稀基、C2_6炔基、C319支鏈烷基、c38環烷基及Cl_6烷 氧基； (a)及（d)各自獨立地為〇、ι、2或3; w (al)及（a2)各自獨立地為〇、i、2或3; 各（b)獨立地為〇、1、2或3; 各（c )獨立地為〇、1、2或3 ; 各（e)獨立地為〇或1; 各（g)獨立地為0或1;且 (m)為約2至約32之正整數， 限制條件為（a)及（g)不同時為〇，一或多個z!含 有寡核苷酸，且一或多個乙丨含有葉酸。 25 201004648 在某些具體實例中，變數與在式（i)中定義相同。 B·實質上無抗原性之水溶性聚合物 本文中描述之化合物中所用之聚合物較佳為水溶性聚 合物且實質上無抗原性，諸如聚伸烷基氧化物（PAo )。 在本發明之一態樣中，本文中描述之化合物包括線 性、末端分枝或多臂聚伸烷基氧化物。在本發明之一些具 體實例中，聚伸烷基氧化物包括聚乙二醇及聚丙二醇。 聚伸烷基氧化物具有約2,000至約1〇〇,〇〇〇道爾頓、較 佳約5，0 0 〇至約6 0，0 〇 〇道爾頓之總數量平均分子量。聚伸 烷基氧化物可更佳為約5,000至約25,000或約2〇,〇〇〇至約 45，000道爾頓。在一些特定具體實例中，本文中描述之化 合物包括具有約30,000至約45，000道爾頓之總數量平均分 子量之聚伸烷基氧化物。在一特定具體實例中，聚合部分 具有約40,000道爾頓之總數量平均分子量。 聚伸烷基氧化物包括聚乙二醇及聚丙二醇。更佳地， 聚伸烷基氧化物包括聚乙二醇（PEG )。PEG通常由以下結 構代表： -0-(CH2CH20)n. 其中（η)代表聚合物之聚合度’且取決於聚合物之分 子量。或者’本文中描述之化合物之聚乙二醇（peg )殘基 部分可選自： -Y7i-(CH2CH2〇)n.CH2CH2Y7]., -Y7i-(CH2CH2〇)n.cH2C(=Y72)-Y7i-' -Y7i-(CH2CH2〇)n.CH2C( = Y72)Y7i-C(=Y72)-, 26 201004648 -Y71-C(=Y72)-(CH2)a71.Y73.(CH2CH2〇)nCH2CH2_Y73_(c H2)a71-C(=Y72)-Y71-，及 -Y71-(CR71R72)a72-Y73_(CH2)b7i_〇_(CH2CH2〇)n(cH2)b7] Ύ73-(CR7 1 R72)a72_ Y7 1 - > 其中： y”及y”獨立地為〇、s、so、s〇2、NR73或一鍵； Y72為ο、s或nr74，較佳為〇 ; 尺7!、R72、R”及R74獨立地選自可用於r3之相同部分； (a7 1 ) ( a72 )及（1 )獨立地為〇或正整數（例 如〇、1、2、3)，且較佳為1;且 (η)為約10至約23〇〇之整數。 在一較佳態樣中，本文中描述之化合物中適用之聚合 物包括多臂PEG-ΟΗ或“星e_pEG，，產物，諸如N〇Fc〇rp 藥物傳遞系統目錄（第8版，2_年4月）中描述者，該 目錄之揭示内容以引用的方式併入本文中。可使用美國專 2第5,122,614號或第5,8〇8,〇90號中描述之活化技術將聚 Q物轉化為經合適地活化之形式。具體言之，該pE(}可I 有下式： 〃 ^〇''CH2CH2-{〇CK2CH2)u^ 卜。
0, oh2ch^{〇CH2CH2)^〇- 〇h2ch2^ 星形 或 27 201004648 ^〇'-CH2CH2-(OCH2CH2)a.· l''°^CH2CH2-(OCH2CHi)u.·^
.O - (CH2CH20)U.-CH2CH2- 〇-'•(CHzCH20)u.~CH2CH2--〇" 多臂 其中： (為約4至約455之整數。 在一較佳具體實例中，聚合物之聚合度（V)為約28 至約341以提供具有約5,000 Da至約60,000 Da之總數量平 均分子量之聚合物，且較佳為約Π4至約239以提供具有 約20,000 Da至約42,000 Da之總數量平均分子量之聚合 物。（u1 )代表聚合物鏈中重複單元之數目且取決於聚合物 之分子量。在本發明之一特定具體實例中，（V )為約227 以提供具有約40,000 Da之總數量平均分子量之聚合部分。 在一些較佳具體實例中，所有4個PEG臂轉化為適合 活化基團，以有助於連接至寡核苷酸或葉酸。轉化前之該 等化合物包括： 'CH2CH2''{OCH2CH2)u-'v 0.
〇、 (ΟΗ2ΟΗ2〇), ΌΗ 及 HO- H0—CH2CH2-{〇ch2CH2)/°
〇.(CH2CH2〇),.CH2CH^〇H 、ch2ch2、
HO-CHzCHz-^CHzCH^y.—Ο H0-CH2CH2-(0CH2CH2)u.-
o~(ch2ch2o)u.-ch2ch2—OH ^(0Η20Η20}ι1·-〇Η2〇Η2-0Η 本文中包括之聚合物較佳在室溫下可溶於水。該等聚 合物之非限制性清單包括聚伸烷基氧化物均聚物，諸如聚 乙二醇（PEG )或聚丙二醇，聚氧乙烯化多元醇，其共聚物 28 201004648 及其肷段共聚物，限制條件為保持嵌段共聚物之水溶性。 出於本發明之目的，“實質上或實際上無抗原性，，意 明在此項技術中所有物質應理解為在哺乳動物中無毒且不 引起明顯免疫原性反應。 在一些態樣中，具有末端羧酸基團之聚合物可用於本 文中描述之聚合傳遞系統中。製備高純度之具有末端羧酸 之聚合物之方法描述於美國專利申請公開案第 2007/0173615號中，其内容以引用的方式併入本文中。方 法包括首先製備聚伸烷基氧化物之第三烷基酯，接著轉化 為其羧酸衍生物。該方法之製備pA〇羧酸之第一步驟包括 形成中間物，諸如聚伸烷基氧化物羧酸之第三丁基酯。此 中間物藉由在鹼（諸如第三丁醇鉀）存在下使pA〇與鹵乙 酸第二丁酯反應來形成。形成第三丁基酯中間物後，可易 於以超過92%、較佳超過97%、更佳超過99%之純度且最 佳超過99.5%之純度提供聚伸烷基氧化物之羧酸衍生物。 在替代態樣中，具有末端胺基之聚合物可用於製備本 文中拖述之化合物。製備高純度之含有末端胺之聚合物之 方法描述於美國專利申請公開案第2〇〇8/〇24926〇號及第 2007/0078219號中，其每一者之内容以引用的方式併入本 文中。舉例而言，使具有疊氮基之聚合物與基於膦之還原 劑（諸如三苯膦）或鹼金屬氫硼化物還原劑（諸如NaBi^ ) 反應。或者，使包括離去基之聚合物與受保護之胺鹽（諸 如亞胺二碳酸甲酯第三丁酯之鉀鹽（KNMeB〇c )或亞胺二 碳酸二第三丁醋之鉀鹽（KNB〇C2))反應’接著將受保護 29 201004648 之胺基去保護。藉由此等方法形成之含有末端胺之聚合物 之純度大於約95%且較佳大於99%。 C.雙官能連結子 雙官能連結子包括胺基酸、胺基酸衍生物及肽。胺基 酸可為天然存在及非天然存在胺基酸中者。 亦預期疏水性或非疏水性的天然存在胺基酸之衍生物 及類似物以及各種業内已知之非天然存在胺基酸（D或l) 在本發明之範疇内。非天然存在胺基酸之適合非限制性清 單包括2-胺基己二酸、3 -胺基己二酸、点-丙胺酸、点-胺基 丙酸、2-胺基丁酸、4-胺基丁酸、略啶酸、6-胺基己酸、2-胺基庚酸、2-胺基異丁酸、3-胺基異丁酸、2-胺基庚二酸、 2,4-胺基丁酸、鎖鏈素（desmosine) 、2,2-二胺基庚二酸、 2,3 -二胺基丙酸、N-乙基甘胺酸、N-乙基天冬酿胺、3 -經基 脯胺酸、4-經基脯胺酸、異鎖鏈素（is〇desmosine )、別異 白胺酸、N-甲基甘胺酸、肌胺酸、N-甲基-異白胺酸、6-N-甲基離胺酸、N-甲基绳胺酸 '正顯胺酸、正白胺酸及鳥胺 酸。一些胺基酸殘基係選自甘胺酸、丙胺酸、曱硫胺酸或 肌胺酸，且更佳為甘胺酸。 在本發明之一替代態樣中，L i_4為選自以下各基團之相 同或不同基團·· -[C(=〇)]v(CR22R23)t[C(=0)v -、 -[C(=0)]v(CR22R23)t-0[C(=0)]v … -[C(=0)]v(CR22R23)t-NR26[C(-0)]v，_、 -[C(=0)]v0(CR22R23)t[C(0)]v.-、 30 201004648 _[C(=0)]v0(CR22R23)t0[C(=0)]v.-、 -[C(=0)]v0(CR22R23)tNR26[C(=〇)]v·-、 -[C(=0)]vNR21(CR22R23)t[C(-0)]v·-、 -[C(=0)]vNR21(CR22R23)t0[C(=0)]v -、 -[C(=0)]vNR21(CR22R23)tNR26[C(=0)]v·- > -[C(=0)]v(CR22R23)t0-(CR28R29)t-[C(=0)]v -、 -[C(=0)]v(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t-[C(=0)]v，-、 -[C(=0)]v(CR22R23)tS-(CR28R29)t-[C(=0)]v，-、 -[C(=0)]v0(CR22R23)t0-(CR28R29)t-[C(=0)]v·-、 -[C(=0)]v0(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t-[C(=0)]v·-、 -[C(=0)]v0(CR22R23)tS-(CR28R29)t-[C=0)]v，-、 -[C(=0)]vNR21(CR22R23)t0-(CR28R29)t-[C(=0)]v，-、 -[C(=0)]vNR21(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t-[C(=0)]v.-、 -[C(=0)]vNR21(CR22R23)tS-(CR28R29)t-[C(=0)]v，-、 -[C(=0]v(CR22R23CR28R29 0)tNR26[C(=0)]v - ' [C(-0)]v(CR22R23CR28R290)t[C(=0)]v.-、 -[C(=0)]v0(CR22R23CR2sR290)tNR26[C(=0)]v. 、 -[C(=0)]v0(CR22R23CR28R290)t[C(=0)]v. 、 _[C(=0)]vNR21(CR22R23CR28R29 0)tNR26[C(=0)]v'-、 [C(=0)]vNR21(CR22R23CR28R290)t[C(=0)]v，-、 -[C(=0)]v(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t-[C(=0)]v·-、 -[C(=0)]v0(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t-[C(=0)]v’ -、 "[C(—〇)]vNR2i(CR22R23CR28R29〇)t(CR24R25)t*[C(=0)]v'- ' -[C(=〇)]v(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t-〇[C(=0)]v - ' 31 201004648 -[C(=0)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t-[C(=0)]v，-、 -[C(=0)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R29 0)t-NR26[C(=0)]v -、 -[C(=0)]v0(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t-0[C(=0)]v - ' -[C(=0)]v0(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t-[C(=0)]v -、 -[C(=0)]v0(CR22R23)t(CR24CR25CR28R290)t-NR26[C(=〇)]v -、 -[C(=0)]vNR21(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t-0[C(=0)]v.-、 -[C(=0)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t-[C(=0)]v -、 -[C(=0)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t-NR26[C(=0)]v -〇
(CR24R25VNR2fc[C；(=〇)]v'- {CR24R25),0[C(-0)]v -[0(=0)],NR21(CR22R23) -[C(=0)]vNR2i(CR2,R23>
(CR24R25)t.NR26[C(=〇)], (CR24R2s)(O[C(-〇)]vi- 及 其中： R21-29為選自以下各基團之相同或不同基團·氮、Ci-6 烧基、C3-I2支鍵烧基、C3-8環烧基、C1-6經取代烧基、C3-8 經取代環烷基、芳基、經取代芳基、芳烷基、C!_6雜烷基、 經取代Ck雜烷基、CN6烷氧基、苯氧基及Cu雜烷氧基； 32 201004648 (t)及（〇獨立地為0或正整數，較佳為0或約1 至約12之整數，更佳為約1至約8之整數，且最佳為1或 • 2 ;且 . (ν)及（ν')獨立地為0或1。 在一些較佳具體實例中，式（I)及式（la)之Lm (更 佳地，式（la)之L4)包括選自以下各基團之相同或不同 基團： -[C(=0)]rNH(CH2)2CH=N-NHC(=0)-(CH2)2-、 -[C(=0)]rNH(CH2)2(CH2CH20)2(CH2)2NH[C(=0)]r -、 -[C(=0)]rNH(CH2CH2)(CH2CH20)2NH[C(=0)]r -、 -[C(=0)]rNH(CH2CH2)2NH(CH2CH2)s [C(=0)]r - > -[C(=0)]rNH(CH2CH2)2S(CH2CH2)s. [C(=0)]r.-、 -[C(=0)]rNH(CH2CH2)(CH2CH20)[C(=0)]r -、 -[C(=0)]rNH(CH2CH2)20(CH2CH2)s [C(=0)]r -、 -[C(=0)]rNH(CH2CH20)(CH2)NH[C(=0)]r - > -[C(=0)]rNH(CH2CH20)2(CH2)[C(=0)]r·-" -[C(=0)]rNH(CH2CH20)s(CH2)s- [C(=0)]r·- > -[C(=0)]rNHCH2CH2NH[C(=0)]r.-、 -[C(=0)]rNH(CH2CH2)20[C(=0)]r -、 -[C(=0)]rNH(CH2CH20)[C(=0)]r -、 -[C(=0)]rNH(CH2CH20)2[C(=0)]r -、 -[C(=0)]rNH(CH2)3[C(=0)]r - ^ -[C(=0)]r0(CH2CH20)2(CH2)[C(=0)]r，·、 -[C(=0)]rO(CH2)2NH(CH2)2[C=0)]r，-、 33 201004648 -[C(=〇)]r〇(CH2CH20)2NH[C(=0)]r·--[C(-0)]r0(CH2)20(CH2)2[C(=0)]r’ -、 [C(=0)]r0(CH2)2S(CH2)2[C(=0)]r、、 -[C(=0)]r0(CH2CH2)NH[C(=0)]r、、 -[C(=0)]r0(CH2CH2)0[C(=0)]r -、 -[C(=0)]r0(CH2)3NH[C(=0)]r -、 -[C(=0)]r0(CH2)30[C(=0)]r,-、 -[C(=0)]r0(CH2)3[C(=0)]r·-、 -[C(=0)]rCH2NHCH2[C(=0)]r -、 -[C(=0)]rCH2OCH2[C(K))]r -、 -[C(=0)]rCH3SCH2[C(=0)]r -、 -[C(=0)]rS(CH2)3[C(=0)]r -、 -[C(=0)]r(CH2)3[C(=0)]r -、 -NH(CH2CH20)2(CH2)2NH[C(=0)]r. -NH(CH2)3-、 偶0ch2O-ch_c(，_. ~[C(=O))rQCH2-H^j>~CH2〇[C(=0)]r·- fC(=〇)3rNHCH2 CH2NH[C(=0)^- 及 CH2〇[C(=0)]r- -l〇{=0)]rNHCH2 其中（r)及（r’）獨立地為0或1 ;且（s)及（s’）獨 立地為1、2或3。（r)及（r1)不同時為0。 出於本發明之目的，當雙官能連結子之值為等於或大 於2之正整數時，可使用相同或不同雙官能連結子。在含 34 201004648 具體實例中，其中 雙官能連結子可相 有兩個或兩個以上雙官能連結子之一 (a) 、U1)及U2)等於或大於2， 同或不同。 D ·診斷劑 有診斷標籤與 其中該標籤經 本發明之另一態樣提供視情況經製備具 本文中4田述之聚合傳遞系統連結之化合物， 選擇用於診斷或成像目的。 本文中描述之化合物可經標記，諸如經生物 化合物、榮光化合物（例如FAM)、經放射性標記：：合 物、。適合標籤係藉由使任何適合部分（例如胺基酸殘基） 與以下各者連結來製備：任何業内標準發射同位素、不透 射線之己物、磁共振標記物或適合於磁共振成像之其他 非放射性同位素標記物、螢光型標記物、展現可見顏色且/ 或此夠在紫外線、紅外線或電化學刺激下發螢光以允許在 手術程序期間使腫瘤組織成像之標記物等等。視情況，將 β斷標籤併入且/或連結於接合治療性部分，從而允許監控 〜療性生物活性物質在動物或人類患者體内之分布。 經標記化合物易於藉由業内已知之方法以任何適合標 °己物（包括（例如）放射性同位素標記物）來製備。僅舉 例而言，其包括丨η碘、m碘、鍀及/或η丨銦用以製 備供活體内選擇性吸收至腫瘤細胞中之放射免疫閃爍造影 Μ °舉例而言’存在將肽連結至Tc-99m之許多業内已知之 方法’包括（僅舉例而言）美國專利第5,328,679號、第 5,888,474號、第5,997,844號及第5,997,845號所展示之彼 35 201004648 等方法，t亥等專利係以引用的方式併入本 E.寡核苷酸 τ ::中描述之化合物可用於將核酸（寡 至細胞或組織令。 )傳遞 為了更充分瞭解本發明之範疇，定義以下術 此項技術者應瞭解術語“核酸、戈“核苦酸” 脫: 核糖核酸（“舰”）、核糖核酸（“rna”）（除：; 有說明’否則為單股或雙股）及其任何化學修飾形式。 核苷酸”通常為（例如）去,+ & 1 、Μ "歹B )大小在約2至約2〇〇個核苷酸範 圍内’或更佳長度為約8至約3〇個核苷酸之相對短的聚核 苷酸。除非另有說明’否則本發明之寡核苷酸通常為合成 核酸且為單股。在本文中，術語“聚核苷酸，，及“聚核酸” 亦可同義使用。 募核苷酸（類似物）不限於單一種類之寡核苷酸，而 實際上經設計可用於多種此類部分，應瞭解連結子可連接 於3’或5,末端中之一或多者，通常核苷酸之ρ〇4或s〇4基 團。所涵蓋之核酸分子可包括硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修 飾、糖修飾、核酸鹼基修飾及/或填酸酯骨架修飾。寡核苦 酸可含有天然磷酸二酯骨架或硫代磷酸酯骨架或任何其他 經修飾骨架類似物’諸如LNA (鎖核酸）' PNA (具有肽 骨架之核酸）、CpG寡聚物及其類似物，諸如在以下參照 案中所揭示者：Tides 2002，Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences, 2002 年 5 月 6-8 日，Las Vegas, NV 及 Oligonucleotide & Peptide Technologies, 2003 年 11 月 18 36 201004648 日及 19 日 ’ Hamburg, Germany，靖 β 用的方式併入本文中。 μ寻參照案之内容係以弓丨 本發明所涵蓋之寡核苷酸之修 寡核苷酸與所需聚a物丘價鍵^ ^ 如）以允許 取代所選核㈣，及，或添加或取 ：：加至或 氫鍵、靜電相互作用及官能度併寡^Γ玉化性、 呤笙你綠a 1 汗入暴核苷酸之官能部分。 飾包括（但不限於）2、位糖修飾、5-位喷❹飾 票呤修飾、對環外胺之修飾、4_硫代料之取代^淳 尿錢或5-蛾尿㈣之取代、骨架修飾、甲基化、驗基配 對組合（諸如異驗基異胞皆及異脈）及類似組合= 本發明範田壽内之寡核皆酸亦可包括3,及/或5.帽結構。於 —出於本發明之目的，“帽結構，，應理解為意謂已併入 純苦酸之任—末端之化學修飾。帽可存在於5，_末端（5,_ 帽）或3，-末端（3·_帽）或可存在於兩個末端上。帽之非 限制性實例包括倒轉無鹼基殘基（部分）、4|,5、亞子基核 苷鲛，1-(；S -D-赤咬鳴聽基）核苷酸、4，_硫基核苷酸、碳環 核苷駄，1，5-無水己糖醇核苷酸；^核苷酸；“ _核苷酸； 經修飾鹼基核苷酸；二硫代磷酸酯鍵；蘇_戊呋喃醣基核苷 酸；無環3，，4，-閉聯核芽酸；無環3,4_二經基丁基核苦酸； 無％ 3,5-二經基戍基核苷酸；3,_3_倒轉核苷酸部分；3，_3,_ 倒轉無驗基部分；3,-2’-倒轉核普酸部分；3,_2，_倒轉無鹼基 邛分，1，4-丁二醇磷酸酯；3,_胺基磷酸酯；己基磷酸酯；胺 基己基麟酸酯；3'-磷酸酯；3，_硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯； 或橋接或非橋接F基膦駿酯部分。細節描述於W〇 97/26270 37 201004648 中’其以引用的方式併入本文中。3，-帽可包括（例如）4，，5，-亞甲基核苷酸；1-(/3 -D-赤呋喃醣基）核苷酸；4，-硫基核苦 酸、碳環核苷酸；51-胺基-烷基磷酸酯；1,3-二胺基-2-丙基 磷酸酯，3-胺基丙基磷酸酯；6-胺基己基磷酸酯；1,2-胺基 十二烷基磷酸酯；羥基丙基磷酸酯；1，5-無水己糖醇核苦 酸；L-核苷酸；α -核苷酸；經修飾鹼基核苷酸；二硫代碟 酸酯；蘇-戊呋喃醣基核苷酸；無環3’，4'-閉聯核苷酸；3,4_ 二羥基丁基核苷酸；3,5-二羥基戊基核苷酸’ 5^5’-倒轉核苦 酸部分；5，-5，-倒轉無鹼基部分；5·-胺基磷酸酯；5’-硫代磷 酸酯；1,4·丁二醇磷酸酯；5'-胺基；橋接及/或非橋接5，-胺 基磷酸酯，硫代磷酸酯及/或二硫代磷酸酯’橋接或非橋接 甲基膦酸酯及5’-魏基部分。亦參見Beaucage及Iyer, 1993, 49，1925，其内容以引用的方式併入本文中。 核苷類似物之非限制性清單具有以下結構： 38 201004648
ο=ρ-σ 硫代磷酸酯 2.-0-甲基 Β
cr 。货o=p-o* 2Γ-氟 *? η
ΗΝΑ CeNA Β
Η ΡΝΑ
參見以下參照案中描述之核苷類似物之更多實例： Freier A Altmann; Nucl Acid Res., 1997，25, 4429-4443 及 39 201004648
Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 200,, 293-213，其每一者之内容以引用的方式併入本文中。 如本文中所用之術語“反義，’係指與編碼基因產物或 編碼控制序列之特定DNA或RNA序列互補之核苷酸序 列。術語“反義股”關於與“有義”股互補之核酸股而使 用。在細胞代謝之正常操作中，DNA分子之有義股為編碼 多肽及/或其他基因產物之股。有義股充當合成信使rna (“mRNA”）轉錄物（反義股）之模板，該轉錄物轉而指 導任何所編碼基因產物之合成。反義核酸分子可藉由任何 業内已知之方法製備，包括藉由使所關注之基因以顛倒方 向接合至允許合成互補股之病毒啟動子來合成。引入細胞 中後，此轉錄股與細胞產生之天然序列組合形成雙股體。 此等雙股體隨後阻斷進一步轉錄或轉譯。以此方式，可產 生突變表型。業内亦已知標號“負，、戈㈠係指反義股， 且業内亦已知“正”或（+ )係指有義股。 出於本發明之目的，：&社”也 互補應理解為意謂核酸序列 與另一核酸序列形成氫鍵。互補性百分比指示核酸分子中 可與第二核酸序列形成备‘ 汁』办成風鍵（亦即華特生_克里克 (Watson-Crick )鹼基配對）連續 〜疋碩殘基之百分比，亦即相 對於 10 中有 5、6、7、8、9、1(Wgl、目 & 10 個視為 50%、60%、70%、 80%、90%及丨00%互補。“ 互補意謂核酸序列之所 有連、.只殘基與第二核酸序列中 鍵。 〗中相同數目之連續殘基形成氫 在一具體實例中，接合之撰遮 — 之選擇為养核苷酸（或“聚核 40 201004648 苷酸”），且在接合之後，目標稱為寡核苷酸之殘基。募 核苷酸可選自具有磷酸二酯骨架或硫代磷酸酯骨架之任何 已知寡核苷酸及寡脫氧核苷酸。 適用於本文中描述之化合物之寡核苷酸或寡核苷酸衍 生物可包括約8至約1〇〇〇種核酸，且較佳為相對短的聚核 皆酸’例如大小較佳在約8至約30個核苷酸長度之範圍内 (例如約 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、2卜 22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個）。 在本文中描述之方法中所用之適用核酸之一態樣中， 具有天然磷酸二酯骨架或硫代磷酸酯骨架或任何其他經修 飾骨架類似物之募核苷酸及寡脫氧核苷酸包括： LNA (鎖核酸）； PNA (具有肽骨架之核酸）； 短干擾 RNA ( siRNA)； 微 RNA ( miRNA)； 具有肽骨架之核酸（PNA ); 二胺基磷酸酯嗎啉基寡核苷酸（PMO ); 三環-DNA ; 誘餌ODN (雙股寡核苷酸）； 催化RNA序列（RNAi)； 核糖酶； 適體； 斯皮格體（spiegelmer) (L-構形募核苷酸）；
CpG寡聚物及其類似物，諸如在以下參照案中揭示者. 201004648
Tides 2002, Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences, 2002 年 5 月 6-8 日，Las Vegas, NV 及 Oligonucleotide & Peptide Technologies, 2003 年 1 1 月 18 日 及19日，Hamburg, Germany，其内容以引用的方式併入本 文中。 在本文中描述之方法中所用之核酸之另一態樣中，寡 核苷酸可包括任何適合的業内已知之核苷酸類似物及衍生 物，包括由如下表1列出者： 表1.代表性核苷酸類似物及衍生物 4-乙醯基胞苷 5-曱氧基胺基甲基-2-硫代尿苷 5-(叛基羥基曱基)尿苷 召，D-甘露糖基Q核苷 2'-0-曱基胞苷 5-曱氧基羰基曱基-2-硫代尿苷 5-曱氧基羰基曱基尿苷 5-羧基曱基胺基曱基-2-硫代尿苷 5-甲氧基尿苷 5-羧基曱基胺基曱基尿苷 二氫尿苷 2-曱基硫基-N6-異戊烯基腺苷 2Ά-甲基假尿苷 N-[(9-(8-D-呋喃核糖基-2-甲基硫嘌呤-6-基)胺甲醯 基1蘇胺酸 D-半乳糖基Q核苷 N-[(9妥D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-曱基胺甲醯基] 蘇胺酸 2’-0-甲基鳥苷 尿苷-5-氧基乙酸-曱酯 2、鹵表-腺会 2，-鹵基-胞苷 2*- _基-爲普 2'-鹵基-胸腺嘧啶 2’-鹵基-尿苷 2’-鹵基-曱基胞苷 2'-胺基-腺苷 2’-胺基-胞苷 2’-胺基-<4苦 2'-胺基-胸腺嘧啶 2^胺基-尿普 2’-胺基-曱基胞苷 肌苷 尿苷-5-氧基乙酸 N6-異戊烯基腺苷 osyw 1-曱基腺苷 假尿苷 1-甲基作又尿苷 0核苷 1-甲基鳥苷 2-硫代胞苷 1-甲基肌苷 5-甲基-2-硫代尿苷 2,2-二曱基鳥苷 2-硫代尿苷 2-曱基腺苷 4-硫代尿苷 2-甲基鳥苷 5-甲基尿苷 3-甲基胞苷 N-「(9-i8-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)-胺甲醯基1蘇胺酸 5-曱基胞苷 2’-0-甲基-5-曱基尿苷 N6-甲基腺苷 2'-0-甲基尿芩 7-曱基鳥苷 yw 5-曱基胺基曱基尿苷 3-(3-胺基-3-羧基-丙基)尿苷 鎖腺苷 鎖胞苷 鎖烏苷 鎖胸腺嘧啶 鎖尿苷 鎖曱基胞苷 42 201004648 較佳地，募核皆酸包括於所向之腫瘤細胞中或參盘 下调與腫瘤、細胞對於抗癌、;台療劑之抗性有_葬之蛋白質。 舉例而言’任何㈣已知之用於由反義寡核普酸下調以便 治療癌症之細胞蛋白質（諸如BCL_2)可用於本發明。參見 2004年4月9日申請之美國專利中請案帛mm，如號， 其内容以弓丨用的方式併入本文中。治療性寡核苷酸之非限 制性清單包括反義HIF_la寡核皆酸、反義寡核皆 酸、反義存活素（survivin )寡核苷酸及点_索烴素（召 _catenine )寡核苷酸。 較佳地，適用於本文中描述之方法之寡核苷酸包括硫 代填酸酯骨架及LNA。 在一具體實例中，適用於本文中描述之方法之寡核苷 酸包括反義bcl-2寡核苷酸、反義HIF_la寡核苷酸、反義 存活素寡核苷酸及反義Erb冷3募核苷酸。 在一較佳具體實例中，寡核苷酸可為（例如）具有與 根納三思（Genasense ) ( a/k/a奥利默森鈉（〇Mimersen S〇dlUm)，由 Genta Inc.，Berkeley Heights，NJ 製造）相同 或實質上類似之核苷酸序列之募核苷酸。根納三思為與人 類bcl-2 mRNA (人類bcl-2 mRNA為業内已知的，且（例 如）在美國專利第6,414,134號中描述為SEQ ID N〇 : 19， 該專利案以引用的方式併入本文中）之啟動序列之前六個 密碼子互補之18聚體硫代磷酸酯反義募核苷酸 TCTCCCAGCGTGCGCCAT ( SEQ ID NO : 4)。美國食品及 為物 ^理局（U.S· Food and Drug Administration，FDA )在 43 201004648 2 0 0 0年8月、.’δ予根納二思孤兒藥物地位。較佳具體實例包 括： 所涵蓋之較佳具體實例包括： (1 )反義存活素LNA募核苷酸（SEQ ID NO: 1 )
Cs-Ts-mCs-As-as-ts-cs-cs-as-ts-gs-gs-mCs-As-Gs-c ； 其中大寫字母代表LNA ’ “ s”代表硫代磷酸酯骨架； (ii )反義 Bcl2 siRNA : 有義 S'-gcaugcggccucuguuugadTdT-S' ( SEQ ID NO: 2) 反義 3 -dTdTcguacgccggagacaaacu-5' ( SEQ ID NO: 3 ) 其中dT代表〇na ; ()根納三思（硫代磷酸酯反義募核苷酸）：（sEQ ID NO: 4) ts-cs-ts-cs-cs-cs-as-gs-cs-gs-ts-gs-cs-gs-cs-cs-cs-as-t 其中小寫字母代表DNA且“ s”代表硫代磷酸酯骨架； (iv)反義 HIF1 a LNA 寡核苷酸（SEQ ID NO: 5 ) 5 _TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3， 其中大寫字母代表LNA且“ s”代表硫代磷酸酯骨架。 (v )反義 ErbB3 LNA 寡核苷酸（SEQ ID NO: 6 ) 5 -TsAsGscscstsgstscsascststsCsTsCs-3’ 其中大寫字母代表LNA且‘‘ s”代表硫代磷酸醋骨架。 LNA包括如下所示之2i_〇 4，_C亞甲基雙瓖核苷酸：
44 0 201004648 LNA單體 /3 -D構形 參見美國專利申請公開案第2006/0154888號及第 2005/0014712號中所揭示之存活素LNA之詳細描述，該等 參照案之每一者之内容係以引用的方式併入本文中。參見 美國專利申請公開案第2〇〇4/〇〇96848號及第2〇〇6/〇252721 號中所揭示之HIF-1 α LNA之詳細描述，該等參照案之每 一者之内容全部係以引用的方式併入本文中。亦參見 WO2008/1 13 832，其内容全部以引用的方式併入本文中。 在一特定具體實例中，寡核苷酸包含SEq ID NO: 1、
SEQ ID NO 2 及 3、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5 及 SEQ ID NO: 6。 在與本文中描述之聚合系統接合之前的寡核苷酸在寡 核苷酸之5,或3'末端包括（CH2)w_硫氫基連結子（硫基寡核 苷酸），其中此態樣中之（w )為約i至約丨〇之正整數（丄、 2、3、4、5、6、7、8、9、10，且較佳為 4、5、6或7)。 硫基寡核苷酸具有結構SH-(CH2)W募核苷酸。本文中描述之 化合物可包括經含有位阻醋之（CH2)w硫氫基連結子修倚之 寡核苷酸。在連接之前，寡核苷酸具有以下結構： —^ 募㈣酸 JI Ο—Ο丨igonucleoti 券核皆酸 其中（w)為約1至約10之正整數，（例如 45 201004648 6) ° 參見WO 2008/0341 19，其内容以引用的方式併入本文 中。聚合化合物可釋放不具有硫醇尾之寡核苷酸。 在一特定具體實例中，siRNA之有義股之V末端經修 飾。舉例而言，聚合接合物中所用之siRNA經5'-C6-SH修 飾。本發明之一特定具體實例採用具有以下序列之 Bcl2-siRNA ： 有義 5’-SH-C6-GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT-3' 反義 S’-dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU-S1。 經修飾之寡核苷酸之實例包括： (i )經C6-SH尾修飾之根納三思： 5 -HS-C6-stscstscscscs3.sgscsgstsgscsgscscs3.st-3
S
>^v^^^ss^^\^j^O"'P*-,T~sG-sT~sC*sCws0-sA-sG~sC*sC3_s*T"*-sG-sC-,sG-sC-s0-sA'-sT HS 0- . ♦ (ii )經C6-SH尾修飾之反義HIF1 α LNA : 5'-HS-C6-sTsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3'； (iii )經C6-SH尾修飾之反義存活素LNA 5'-HS-C6-s CsTsmCsAsastscscsastsgsgs CsAsGsc-3' > (iv)經C6-SH尾修飾之反義ErbB3 LNA : 5’-HS-C6-TsAsGscscstsgstscsascststsCsTsCs-3’ ： (v )經位阻酯尾修飾之根納三思 46 201004648
F·聚合傳遞系統之合成 通#製備本文中描述之化合物之方法包括使經活化 聚合物與經SH基團修飾之寡核苦酸反應。適用於本文中描 迷之方法之經活化聚合物包括在遠端含有吼α定基雙硫基之 聚合物。該等方法提供聚合接合物，纟中生物活性部分經 由'S-S-鍵與聚合物鍵結。 製備本文中描述之聚合化合物 在本發明之一態樣中 之方法包括： 使式（III )聚合化合物：
Ri-{ZhU 丨丨 之寡核苷酸在足以形成式 與經含有硫氫基之部分修飾 4匕合物的條件下反應： 其中 1為實質上無抗原性之水溶性聚合物； 各zn相同或不同且係選自：
47 201004648 ’諸如 *(L4)a1
' (^4)a 1 ~Rv NH, · 及 _(L4)a2_Rc，
Yi在每次出現 現時獨立地為s或Ο，較佳為〇 ; Υ1 2 3在母次出現 D , ^ 矛獨立地為NR13，較佳為NH ; Κι 〇〇在母次出士 ^ ^ 兄日可相同或不同且係選自：H、離去基 活化基團，及
48 1 _4各自在每次出現時為相同或不同雙官能連結子； Rb在每次出現時為葉酸； 2
Rc在每次出現時為相同或不同診斷劑； 3 1-7各自獨立地選自：氫、Ci 6烷基、Gy烯基、C2丨 炔基、C3]9支鏈烷基、^3 8環烷基及ci 6烷氧基； 4
Rs-1 1各自為吸電子基團’諸如經取代之醯胺基、醯基、 疊氮基、羧基、烷基氧基羰基、氰基及硝基，且較佳h為 硝基，且R9、Rl。及Rll為氫； 201004648
Rl3在每次出現時係獨立地選自由以… 群：氫、cN6烷基、c 、自由以下各基團組成之 C3_S環烷基； 土 2·6炔基、C3-丨9支鏈烷基及 心在每次线時係獨立地選自由 群：氫、羥基、Cl_6院基 各基團、，且成之 烷基、Cs_s環烷基及Ci·6烷氧基，· 2-6炔基、c^9支鏈 (a)及（d)各自獨立地為〇、卜 或3’且較佳為0; (al)及（a2)各自獨立地為 1 ; 2或3，且較佳為 各（b)獨立地為 ^ / N . —，且較佳為0 ; 各（C)獨立地為0、i、2 交/ 、 2或3，且較佳為i ; (〇獨立地為0或1 ’且較佳為0; 各（g)獨立地為0或1，且較佳為1;且 6 16 ' 32 /mll)為約2至約32之正整數（例如2、4 ί ， 限制條件為（a )及f cr、η + )及（g)不同時為0且限制條件為一戍 多個Z丨丨含有 彳你什兩：¾
較佳地， 或其混合物） 啶（DMAP) 反應在惰性溶齊U諸如二氯甲貌、氯仿、dmf 中執行。反應可較佳在鹼（諸如二曱胺基吡 、二異丙基乙胺、吡啶、x乙胺等）存在下進 49 201004648 行以中和所產生之任何酸。反應可在約0°C至約22°C (室 溫）之溫度下執行。參見WO/2009/025669中之詳細描述， 其内容以引用的方式併入本文中。 G.式（I)化合物 由本文中描述之方法製備之一些特定具體實例具有以 下結構： 0
、S …Oligo
Oligo’S'S
OH HO〆 ：Γ
S，S、〇lig〇 AH 丫、〇, Ο o PEG^ ΗΝ 人·-^〇、 OligOvg^Ss^A^OH 0 、〇Ύ
PEG O
NH
HO 'Y^^S^g.Oligo
O 50 201004648
Ο Otigo'"S"S，^V^vOH HW印' ο
PEG" ^ Υ Ο Ο ΗΟ人广S，S、Oligo ΝΗ )ν^ /S' HCT 丫、S …Oiigo
〇 PEG' pEG^^^0N^NH ONgo，S、S，丫、OH ΗΝγ〇ν^ Ο ϊ
PEG Ο …H〇V S’v、Oligo ^,ΝΗ
O Ο
Oligo^S'vS/^Y^v"OH HNV^O^^peg' ΗΝ 人
Oligo、s〆 S ^^γΟΗ 'S、, 0 ο HCT 丫、S，S、Oligo ΡΕ6、^〇，γΝΗ
k^Sv 及 Λγ^ HCT 丫、S〆、Olig〇 ΝΗ Ο ΡΕ(Τ
‘PEG 葉酸 _(L4)a1- ,0、 ,0 、L<0a1—葉酸 其中：
Oligo為寡核苷酸，較佳為經C3.C6烷基（C6烷基）修 51 201004648 飾之寡核普酸； PEG為聚乙二醇且該化合物之聚合部分具有約5,000 至約25,000道爾頓或約20,000至約45,000道爾頓之總數量 平均分子量； (al )為 1 ; L4 為-NH(CH2CH20)2(CH2)2NH[C(=0)]r .-或 -NH(CH2)3-，其中（r’）為 0 或 1;且 所有其他變數與以上定義相同。 舉例而言，由本文中描述之方法製備之化合物包括
〇 COOH
H2N N N
52 201004648
其中
Oligo為寡核苷酸；
Rh為 h2n
OH
且 PEG為聚乙二醇且該化合物之聚合部分具有約5,000 至約25,000道爾頓或約20,000至約45,000道爾頓之總數量 平均分子量。 在另一具體實例中，由本文中描述之方法製備之化合 物包括：
53 201004648
54 201004648 其中
Oligo為寡核苷酸，較佳為經C3-C6烷基（例如C6烷基） 修飾之募核苷酸；且 PEG為聚乙二醇且該化合物之聚合部分具有約5,000 至約25,000道爾頓或約20,000至約45,000道爾頓之總數量 平均分子量。為便於描述且不加限制，多臂PEG以“ PEG” 形式展示。八臂PEG之一臂、至多七臂（或四臂peg之至 多三臂）可與葉酸接合。 較佳地，化合物包括治療性募核苷酸，諸如反義ErbB3 募核苷酸及反義存活素寡核苷酸。舉例而言，化合物包括 如下經Ce尾修飾之反義LNA : -5 -(CH2)6-TsAsGsCsCsTsGsTsCsAsCsTsTsCsTsCs-3·或 -5 -(CH2)6-GsCsTsGsCsCsAsTsGsGsAsTsTsGsAsG-3,， 其中“s”代表硫代磷酸酯鍵且5,及3,末端中之 核苷酸為LNA。 較佳地，聚合部分之平均分子量為約4〇,〇〇〇道爾頓 Η·治療方法 不赞月之-悲樣提供將寡核芽酸引入或傳遞 物細胞中之方法。本發明之方法 礼動 之式⑴化合物接觸。 H與本文中描述 本：明適用於將寡核*酸引入具有腫瘤細胞之哺乳動 中描述之化合物可投予哺乳動物，較佳人類 根據本發明，本發明較佳提供抑 較佳人類。 哺乳動物細胞或組織中之基因表現的 °(或調節） / 。基因表現之下 55 201004648 調或抑制可在活體内及/或試管内達成。該等方法包括使人 類細胞或組織與本文中描述之式⑴化合物接觸。—旦發 生接觸，#當在活體内或試管内量測時，當與在不存在本 耕田述之化5物之治療的情況下所觀察到之mRNA或蛋 白。質含量相比時’若實現至少約10%、較佳至少約20%或 2〇%以上mRNA或蛋白質含量降低，則應認為發生對基因表 現（諸如mRNA或蛋白質含量）之成功抑制或下調。 田出於本發明之目的，‘‘抑制”或“下調，’應理解為意 謂々目標基因之表現，或編碼一或多個蛋白質次單元之 或等效RNA之含量，或-或多個蛋白質次單元(諸如ErbB3 ) 之活性降低至在不存在本文中描述之接合物之治療的情況 下所觀察到者以下。 ' 較佳地，在前列腺或子宮頸癌細胞或組織（例如前列 腺或子宮頸癌細胞）中目標基因之基因表現受到抑制。 在另一具體實例中，癌細胞或組織可來自以下中之一 或多者：實體腫瘤、淋巴瘤、小細胞肺癌、急性淋巴細胞 性白血病（ALL )、胰腺癌、神經膠母細胞瘤、卵巢癌、胃 癌乳癌、結腸直腸癌、卵巢癌及腦腫瘤等。 在一特定具體實例中，本文中描述之方法之化合物包 括（例如）反義bcl-2寡核苷酸、反義ΗΙΙΜ α寡核苷酸、 反義存活素寡核苷酸及反義Erb沒3募核普酸。 較佳地’投藥步驟係經由哺乳動物之血流。 本發明之另一態樣提供治療哺乳動物之各種醫學病狀 的方法。該等方法包括向需要該治療之哺乳動物投予有效 56 201004648 1之含有式（i)化合物之醫藥組合物。聚合接合化合物尤 其適用於治療包括（但不限於）癌症、發炎性疾病及自體 免疫疾病之疾病。 在此態樣中，適用目標基因包括（但不限於）致癌基 因、促血官生成路徑基因、促細胞增生路徑基因、病毒傳 染媒介物基因及促發炎路徑基因。 在另態樣中，亦提供治療患有惡性腫瘤或癌症之患 者之方法，其包含向有需要之患者投予有效量之含有式 化合物之醫藥組合物。在替代態樣中，所治療之癌症可為 、下中之或多者·實體腫瘤、淋巴瘤、小細胞肺癌、急 )生淋巴細胞性白血病（ALL)、胰腺癌、神經膠母細胞瘤、 卵巢癌、胃癌、結腸直腸癌等。組合物適用於藉由下調目 標基因之基因表現來在哺乳動物中治療贅生性疾病、降低 腫瘤負荷預防贅瘤轉移及預防腫瘤/贅生性生長之復發。 在非接合狀態下具有治療作用之任何募核苷酸等可以 如本文中描述而製得之其接合形式來使用。 在一特定具體實例中，本文中描述之方法包括向哺乳 動物細胞投予聚核普酸（寡核芽酸），較佳反義寡核芽酸。 該等方法包括視聚核苷酸對於所治療之病狀之功效而定， 向該等病狀傳遞有效量之如本文中描述製備之接合物。 舉例而5，若非接合寡核苷酸（例如反義ErbB3寡核 苷酸、反義存活素寡核苷酸）具有針對某些癌症或贅生性 、”田胞之功& ’則該方法包括向對原生寡核苷酸具有感受性 之細胞傳遞含有該等寡核苷酸之聚合接合物。傳遞可在活 57 201004648
體内作為適合醫藥組合物之一部分進行或在活體外環境中 直接傳遞至細胞。在一特定治療中，可使用包括募核㈣ (SEQIDNO:1、SEQlDN〇m、SEQiDN〇:4 sEQ IDNO:5、SEQIDN0:6)之聚合接合物。 在另一態樣中，本發明提供活體内或試管内抑制癌細 胞之生長或增殖之方法。該等方法包括使癌細胞與本文中 描述之化合物接觸。或者，本發明提供藉由向有需要之哺 乳動物投予本文中描述之化合物來調節癌細胞之細胞祠亡 的方法。 在另-態樣中，亦提供活體内或試管内增加癌細胞或 組織對化療劑之敏感性之方法。在一特定態樣中，該等方 法包括將本文中描述之募核普酸（反義lna)接合物引入 癌細胞以降低癌細胞或組織中之存活素表現，其中反義寡 核《與自存活素基因表現之mRNA結合且降低存 因表現。 在另-態樣中，提供活體内或試管内殺死腫瘤細胞之 方法。該等方法包括將本文中扣；+，— λ 尽文中描述之化合物引入腫瘤細胞 以降低基因表現（諸如ErbB3)及使腫瘤細胞與足以殺死一 部分腫瘤細胞之量的至少一種化療劑接觸。因此，所殺死 之腫瘤細胞之部分可大於在不存在本文中描述之化合物的 情況下由相同量之該化療劑殺死之部分。 在本發明之另一態樣中’化療劑可與採用本文中描述 之化合物之方法同時或依序組合使用。本文中描述之化合 物可與化療劑同時、在投予化療劑之前或之後投予。因此， 58 201004648 本文中描述之化合物可在化療劑治療期間或之後投予。 I.醫藥組合物/調配物 包括本文中描述之化合物之醫藥組合物可結合一或多 種生理上可接受之載劑（包含賦形劑及助劑）來調配，該 等載劑有_將活性化合物加1為可It Μ學上使用之= 劑。適當調配物視所選投藥途徑而定，亦即是否治療局部 〆系、.先〖生/α療。在本發明之許多態樣中，非經腸路徑較佳。 ^ 予3有本文中描述之式（1)化合物之醫藥組合物可 、、、'二肺、表面（包括表皮、經皮、經眼）及至黏膜（包 括陰道及直腸傳遞）或非經腸（包括靜脈内、動脈内、皮 下、腹膜内或肌肉内注射或輸液）。在-具體實例中，含 有治療性募核苷酴$ _ 馱之化&物係1V、w或以快速注射方式投 注射^於!!射（包括（但不限於）靜脈内、肌肉内及皮下 於而吕’本文中描述之化合物可調配於水溶液中、較 溶二：上相容之緩衝液（諸如生理鹽水緩衝液）或極性 j (包括（但不限於）。叫。定酮或二曱亞碾）中。 射或經調配用於非經腸投藥（例如藉由快速注 供（例二 肖於注射之調配物可以單位劑型形式提 不2 瓶或多劑量容器中）。適用組合物包括（但 含有佐Γ水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液，且可 投藥之醫藥二懸洋劑、穩定劑及/或分散劑。用於非經腸 不限於）鹽（較佳）u ㈣式（诸如（但 之水溶液。另外，活性化合物之懸 59 201004648 浮液可在親錢媒财製備。適合親脂㈣劑包括脂肪油 (諸如芝麻油）、合成脂肪酸酯（諸如油酸乙酯及甘油三 醋）或物f (諸如脂質體）。水性注射懸浮液可含有增加 懸浮液之黏度之物質’諸如幾甲基纖維素納、山梨糖醇或 聚葡萄糖。視情況’懸浮液亦可含有適合穩定劑及/或增加 口物，合解性以允許製備咼濃度溶液之藥劑。或者，活性 成份可呈用於在使用之前與合適媒劑（例如無菌無熱原質 水）組合的散劑形式。 對於經口投藥而言，化合物可藉由將活性化合物與在 此項技術中熟知之醫藥學上可接受之載劑組合來調配。該 等載劑使得本發明化合物能夠調酉己為用於在患者之飲用水 中稀釋之錠劑 '丸劑、口含劑、糖衣藥丸、膠囊、液體、 凝膠、糖襞、糊劑、装液、溶液、懸浮液、濃溶液及懸浮 :、用於在患者之飲食中稀釋之預混物及其類似物以便由 者經口攝入。可藉由使用固體賦形齊卜視情況研磨所得 混合=且必要時在添加其他合適助劑後加卫顆粒之混合物 以獲得鍊劑或糖衣藥丸核心來製備經口使用的醫藥製^。 適用賦形劑（尤其）為填充劑，諸如糖，包括乳糖、二 2糖醇或山梨糖醇；、纖維素製劑，例如玉米搬粉、 米澱粉及馬铃箸澱粉；'其他物質，諸如明膠、 辛鈉及甲基纖維素、羧丙基甲基纖維素、幾曱基纖維 ^'^1； ^7°""(PVP) -D人聯聚乙烯吡咯啶_、瓊脂或褐藻酸。亦 鹽’諸如海藻酸鈉。 60 201004648 對於吸入机— 包裝或霧化哭言’本發明化合物可便利地使用加壓 人D°及適合推進劑以氣溶膠喷霧形式傳遞。 或其==了使用（例如）習知栓劑基質（諸如可可脂 劑）。s 5周配為直腸組合物（諸如栓劑或保留灌腸 劑。=描述之調配物外，化合物亦可調配為儲存物製 藉由=效調配物可藉由植入（例如皮下或肌肉内）或 性物質（m主射投予。本發明化合物可用適合聚合或疏水 1=:::具:藥理學上可接受之油之乳液形式）、 微溶性或以微溶性衍生物（諸如（但不限於） 庇·形式調配用於此投藥途徑。 亦可使用其他傳遞系統，諸如脂質體及乳液。 另外’接合物可使用持續釋放系 =二體疏水性聚合物之半渗透性基質。各種持= 物質已經確立且為熟習此項技術者所熟知。 J.劑量 、冶療有效量之確定穿令_尤勒羽 ^ , ^ ，，、、S此項技術者之能力範圍 尤其根據本文中之揭示内容。 對於本發明之方法中 可最初由試管内檢定來估算。隨後I:物^療有效量 物模型中以獲得包括有效劑 j : J : °周配用於動 可蚌& W里之循環濃度範圍。該等資訊 ""後用以更準確確定適用於患者之劑量。 ^斤投予之組合物（例如用作前藥）之量將取決於其中 匕括之母體分子（亦即非接合寡核㈣之功效）。通常， 61 201004648 么療方法中所用之前藥之量為在哺乳動物中有效達成所 治療結果之量。自然地’各種前藥化合物之劑量在某種程 化合物（寡„酸’諸如lna)、活體内水解 、、'聚合物分子量等而變化。另外，劑量當然可視劑型 及投樂途徑而變化。然而’纟文中描述之寡 通常可…毫克/公斤/週至約丨公克/公斤/週、較佳約物丨 至約5 0 〇晕克/公斤/ v田 兄A斤/週且更佳1至約100毫克/公斤/週（亦 …至約的毫克/公斤/週）範圍内之量投予。以上闊明 之犯圍為說明性的且熟習此項技術者將基於臨床經驗及治 療適應症確定所選前藥之最優給藥。另外，確切調配物、 投樂途徑及劑量可由個別醫師鑒於患者之病狀來選擇。另 外，本文中描述之化合物之毒性及治療功效可在細胞培養 物或實驗動物中使用在此項技術中熟知之方法藉由標準醫 藥程序來測定。 曰或者，每天每公斤體重約0.1 mg至約14〇mg2劑量含 量適用於治療以上指示之病狀（每名受檢者每天約〇5叫 至約7 g)。可與載劑物質組合以製造單—劑型之活性成份 之量視所治療之宿主及特定投藥模式而變化。單位劑型通 常含有約1 mg至約500 mg之間之活性成份。 在-具體實例中，本發明之治療包括向喷乳動物投予 約2至約50毫克/公斤/劑量（諸如約5至約川毫克/公斤/ 劑量）之量的本文中描述之寡核苷酸接合物。 或者，本文中描述之寡核芽酸接合物之傳遞包括在活 體内或試管内使約（M至約1000 nM、較佳約1〇至約1〇〇〇 62 201004648 nM之濃度的寡核苷酸與腫瘤細胞或組織接觸。 組合物可每天投予一次或割分忐客 夕、、Λ达十也 刀成夕次劑量，其可作為 夕^療方案之-部分給予。如—般技術者所瞭解，精確 劑里將視病狀之階段及嚴重程度、腫瘤對於聚合物·前藥组 合物之感受性及所治療患者之個別特徵而定。 在投予$合接合物之本發明之所有態#中，所提及之 劑量係以寡核*酸分子之量而非所投予聚合接合物之量 計。預期將給予治療歷時-或多天直至獲得所需臨床結 果。投予本發明化合物之確切量、頻率及時段當 之性別、年齡及醫學病狀以及如主治臨床醫師所判定:疾 病嚴重程度而變化。 其他態樣包括將本文中描述之本發明化合物與其他抗 癌療法組合以達成協同作用或加成益處。 實施例 以下實施例用來提供對本發明之進一步瞭解但不欲以 任何方式限制本發明之有效範疇。實施例中引用之粗體數 字對應於圖1-6中所展示者。 實施例1. 一般實驗。 所有合成反應在乾燥氮或氬之氣氛下進行。商業試劑 在未經進一步純化的情況下使用。所有PEG化合物在使用 之前在真空中或藉由自甲苯共沸蒸餾來乾燥。除非另有說 明，否則使用Varian Mercury 300 NMR光譜儀及氘化氣仿 作為溶劑，在300 MHz下獲得屯NMR光譜，且在75.46 MHz 下獲得13C NMR光譜。化學遷移（5 )係以自四曱石夕烧（TMS ) 63 201004648 低磁場之百萬分率（ppm )來報導。
在整個實施例中使用縮寫，諸如DCM (二氣曱烷）、 DIEA(N，N-二異丙基乙胺）、LNA(鎖核酸）、MEM (經 改良伊格爾氏培養基（Modified Eagle,s Medium) )、TEAA (乙酸四乙銨）、TFA (三氟乙酸）及RT_qpCR (反轉錄_ 定量聚合酶鏈反應）。 實施例2.—般HPLC方法。 反應混合物及中間物及最終產物之純度係藉由
Beckman Coulter System Gold® ΗΡΐχ 儀器來監測。其採用 使用流動速率為1毫升/分鐘的於0 05% TFA中之10-90% 乙腈梯度或流動速率為1毫升/分鐘的於50 mM TEAA缓衝 液中之2 5 - 3 5 %乙腈梯度的具有1 6 8二極體陣列UV偵測器 之 ZORBAX® 300SB C8 逆相管柱（15〇χ4 6 麵）或 Phenomenex Jupiter® 300AC18 逆相管柱（150x4.6 mm)。 陰離子父換層析係在來自GE healthcare之AKTA探測器 100A(Amersham Biosciences)上、使用封裝於來自 Waters 之AP-Empty玻璃管柱中之來自Applied Biosystems之Poros 50HQ強陰離子交換樹脂來進行。藉由使用來自Amersham Biosciences之HiPrep 26/10脫鹽管柱達成脫鹽。 實施例3.—般mRNA下調程序。 將細胞維持於完全培養基（F-UK或DMEM，補充有 10% FBS )中。在37°C下培育每一孔中含有2.5xl03個細胞 之12孔板隔夜。將細胞以〇pti_MEM®洗滌一次且每一孔添 加400 // L Opti-MEM®。隨後向每一孔中添加含有寡核苷 64 201004648 酸之聚合接合物之溶液。培育細胞4小時，接著每孔添加 600 /z L培養基，且培育24小時。處理24小時之後，藉由 RT-qPCR量化目標基因（諸如人類存活素）及管家基因（諸 如GAPDH )之細胞内mRNA含量。比較相對於GAPDH之 表現含量正規化之mRNA之表現含量。 實施例4. 一般RNA製備程序。 對於試管内mRNA下調研究而言，使用RNAqueous套 組® ( Ambion )、遵循製造商之說明來製備總RNA。RNA 濃度係使用Nanodrop藉由OD26〇來測定。 實施例5.—般RT-qPCR程序。 所有試劑來自Applied Biosystems :高容量cDNA反轉 錄套組 ® ( 4368813 )、20 X PCR 母體混合物（4304437 ) 及用於人類GAPDH及存活素之TaqMan®基因表現檢定套 組。對於最終體積為50 # L之cDNA合成使用2.0 // g總 RNA。反應在PCR溫度循環器中、在25°C下進行10分鐘， 在3 7°C下進行120分鐘，在85t下進行5秒且隨後在4°C 下儲存。即時PCR以50°C -2分鐘、95°C -10分鐘及95°C -15 秒/60°C -1分鐘層進行40個循環。對於每一 qPCR反應，在 30 //L之最終體積中使用1 //LcDNA。 實施例6.寡核苷酸PEG化之一般程序 將經活化PEG ( 0.35 mmol，約10-30 eq)及寡核苷酸 (0.03 mmol’ 約 1 eq)於 PBS 緩衝液（約 5 mL/100 mg PEG， pH 7.4)中之溶液在室溫下攪拌且藉由HPLC監測反應進 程。將反應稀釋於Milli-Q水（25 mL)中且使用HQ/10 Poros 65 201004648
強陰離子交換管柱加以純化（例如在裝載之前以丨〇〇 mM TEAA 平衡之 Source 15RPC 管柱，30 mmx60 mm，床體積 為約6 mL )。將溶離份使用NaCl、水及50% CH3CN溶 離°彙集含有純產物之溶離份且凍乾以產生純peg-〇1 ig〇。 使用MALDI來證實產物之分子量。 實施例7.製備化合物1(葉酸NHS)。 在DCC存在下，使葉酸與NHS偶合以提供NHS酯（化 合物1 )。 實施例8.製備化合物3。 在EDC存在下，使異質雙功能胺基酸PEG (化合物2 ) 與NHS偶合以提供NHS酯（化合物3 )。 實施例9·製備化合物5 將4N HC1於二噁烷（70 mL )中之溶液添加至
BocCys(Npys)-OH (化合物 4，5 g，13.32 mmol)中。在室 溫下授拌懸浮液3小時，且隨後傾入700 mL乙醚中。在不 施加真空的情況下’經由循行燒結漏斗過濾固體直至結 束。將濾餅以乙醚洗滌（3x50 mL )且隨後在真空下、在室 溫下乾燥隔夜。1H NMR (300 MHz, CD3OD): 5 8.93 (1H， dd, J = 1.5,4.7 Hz), 8.66 (1H, dd, J = 1.5, 8.20 Hz), 7.59 (1H, dd, J = 4.7, 8.2 Hz), 4.24 (1H, dd, J = 4.1, 9.4 Hz), 3.58 (1H, dd, J = 4.1, 14.9 Hz), 3.36 (1H, dd, J = 9.4, 15.2 Hz).丨 3C NMR (75.4 MHz, CDC13)： § 169.40, 156.27,154.64. 144.13, 135.246, 123.10, 52.77, 39.27。 實施例10.製備化合物6 » 66 201004648 將化合物3 ( 0·3 5 mmol )添加至化合物5 (相對於待經 取代之每一 NHS，2 當量）於；DMF/DCM ( 25 mL/45 mL ) 中之溶液中，接著添加DIEA (相對於每一化合物5，3當 量）。於室溫下授拌懸浮液5小時。將反應混合物在真空 下蒸發且隨後在〇它下以DCM/Et2〇沈澱。過濾固體且隨後 溶解於80 mL DCM中。添加20mL 0.1N HC1之後，攪拌混 合物5分鐘，隨後轉移至分液漏斗且將有機層分離且再次 以0.1N HC1 ( 20 mL)及食鹽水（2〇 mL)洗滌。將有機層 經MgS〇4乾燥’過渡且在真空下蒸發。在〇亡下，以 DCM/EQO使殘餘物沈澱。過濾固體且在3(^c下、在真空烘 箱中乾燥至少2小時以得到化合物14。 實施例11·製備化合物7。 在〇°C下’向化合物6於DCM ( 10 mL/g化合物6)中 之溶液中添加16 mL TFA ( 2.5 mL/g化合物6)。在〇t至 至溫下攪拌反應混合物1小時。完成反應之後，在真空中 移除溶劑且在o°c下，使殘餘物自20mL/300 mL/g化合物6 之DCM/EhO中沈澱。過濾固體且乾燥以得到化合物7。 實施例12.製備化合物8。 將化合物1於DMSO中之溶液添加至化合物7於dcm 中之溶液中。攪拌反應混合物且粗產物沈澱於Dcm/乙醚 中。過濾固體且在真空十乾燥以得到化合物8。 實施例13.製備化合物1〇。 在實施例6中描述之條件下，使化合物8與寡核普酸 (化合物9 ’ HS-5’-(CH2)6·寡核苷酸）反應以得到化合物1〇。 67 201004648 實施例14.製備化合物12。 將化a物1 1 (雙sc_pEG ’ 〇 35 mm〇1 )添加至化合物$ (相對於待經取代之每一 NHS，2當量）於( 25 mL/45 mL )中之洛液中，接著添加(相對於每一化合 物5，3當量）。於室溫下攪拌懸浮液5小時。在真空下蒸 發反應混合物且隨後在〇它下以DCM/Et2〇沈澱。過濾固體 且後溶解於80 mL DCM中。添加20 mL 0.1N HC1之後’ 攪拌混合物5分鐘’隨後轉移至分液漏斗且將有機層分離 且再次以0_1N HC1 ( 20 mL)及食鹽水（20 mL)洗滌。將 有機層經MgSCU乾燥，過濾且在真空下蒸發。在下， 以DCM/EhO使殘餘物沈澱。過濾固體且在3(rc下、在真 空供箱中乾燥至少2小時以得到化合物1 2。 實施例15_製備化合物14。 在DCM中在作為鹼之DIEA存在下，使化合物13與化 合物1 2反應以得到化合物1 4。 實施例16.製備化合物is。 將化合物14以於DCM中之TFA處理以得到化合物1 5。 實施例17.製備化合物U。 將化合物1於DMSO中之溶液添加至化合物15於DCM 中之溶液中。攪拌反應混合物且粗產物沈澱於DCM/乙醚 中。過濾固體且在真空中乾燥以得到化合物1 6。 實施例18.製備化合物18。 在實施例6中描述之條件下，使化合物1 6與寡核苷酸 (化合物17 ’ HS-5’-(CH2)6_募核芽酸）反應以得到化合物 68 201004648 18 ° 實施例 19.製備化合物 20((SC)3-PEG-Cys-SS-NPyS)。 將化合物19 ( 4臂SC-2GKPEG，0.3 5 mmol)添加至化 合物5 (相對於待經取代之每一 NHS，2當量）於DMF/DCM (25 mL/45 mL)中之溶液中，接著添加DIEA (相對於每 一化合物5，3當量）。於室溫下攪拌懸浮液5小時。在真 空下蒸發反應混合物且隨後在〇°C下以DCM/Et20沈澱。過 濾固體且隨後溶解於80 mL DCM中。添加20 mL 0.1N HC1 之後，攪拌混合物5分鐘，隨後轉移至分液漏斗且將有機 層分離且再次以0.1N HC1 ( 20 mL )及食鹽水（20 mL)洗 滌。將有機層經MgS04乾燥，過濾且在真空下蒸發。在0 °C下，以DCM/Et20使殘餘物沈澱。過濾固體且在30°C下、 在真空烘箱中乾燥至少2小時以得到化合物20。 實施例 20.製備化合物 21 ( (BocNH 延 伸）3-PEG-Cys-SS-NPyS)。 在DCM中在作為鹼之DIEA存在下，使化合物20與化 合物1 3反應以得到化合物2 1。 實施例 21.製備化合物 22 ( (NH 延 伸）3-PEG_Cys-SS-NPyS )。 將化合物21以於DCM中之TFA處理以得到化合物22。 實施例 22.製備化合物 23 ((葉酸-NH 延 伸）3-PEG-Cys_SS-NPyS )。 將化合物1於DMSO中之溶液添加至化合物22於DCM 中之溶液中。攪拌反應混合物且粗產物沈澱於DCM/乙醚 69 201004648 中。過濾固體且在真空中乾燥以得到化合物23。 實施例 23.製備化合物 25 ((葉酸_NH延 伸）3-20KPEG-Cys-SS-C6-Olig〇 ) 〇 將（葉酸）3-2〇KPEG-NPyS (化合物 23，120 mg，5.50 # mol)溶解於pH 6.5磷酸鹽緩衝液（3-4 mL)中，以辖覆蓋 且以氮氣淨化1 〇分鐘。向此溶液中添加募核苷酸（化合物 24 ’ 例如反義 ErbB3 LNA 寡核苷酸，6.0 mg，uo # m〇1) 且在環境溫度下攪拌所得橙黃色混合物約2小時，在此時 間期間溶液顏色變為深黃色。此時間後，使用〇·45 # m注 射過濾器過濾溶液且使其裝载於以20 mM Tris-HCl緩衝液 (pH 7.0)(緩衝液A)預平衡之Poros 強陰離子交換 管柱（10 cmxl.O cm，床體積為約8 mL)上。將管柱以3_4 管柱體積之緩衝液A洗滌以移除過量peg連結子。藉由於 20 mM Tris-HCl 緩衝液（pH 7.0)(緩衝液 B)中之 1M NaC1 之緩慢遞增梯度溶離產物。合併經分離溶離份且經由逆相 層析（Source RPC )使其脫鹽且凍乾所得溶液以產生呈蓬鬆 κ色固體狀之所需PEG-LNA化合物（4.62 mg，以Oligo計， 77.0%)。 實施例24·製備化合物26 ((葉酸-NH延 伸）3-4〇KPEG-Cys-SS-C6-〇lig0_FAM)。 將（葉酸）3-40KPEG-NPyS ( 0.35 g，8.33 // mol)溶解於 pH 6.5磷酸鹽緩衝液（5 mL )中，以箔覆蓋且以氮氣淨化 1 〇分鐘。向此洛液中添加經FAM修飾之寡核苷酸（經FAM 修飾之化合物24，10.0 mg，丨67 # m〇1)且在環境溫度下 70 201004648 攪拌所彳讀黃色混合物㊅3 + 變為深黃色。此時間後，使用G45 ^間期間溶液顏色 液且m β m庄射過濾器過濾溶 …心㈣緩衝液(PH7·。”緩 Γ床體二衡之p嶋s HQ強陰離子交換管柱（1 ，床體積為約8 mL)上。將管柱以3 液A洗條以移除過量 體積之級衝 緩衝液(_ (緩衝罐一 (緩衝液B)中之lMNaCl之緩慢遞增梯 度溶離產物。合併經分離溶離份絲由逆相㈣（So. RPC)使其脫鹽且;東乾所得溶液以產生呈蓬鬆黃色固體狀之 所需PEG-LNA化合物（3·33 mg，以〇Ug。計，μ」％卜 實施例2S.製備化合物28。 使化合物22與化合物TAMRA_c(=〇)_〇Su(化合物27 ) 反應以得到化合物28。 實施例26.製備化合物29。 將化σ物1於DM SO中之溶液添加至化合物29於D cM 中之/谷液中。擾拌反應混合物且粗產物沈澱於乙醚 中。過濾固體且在真空中乾燥以得到化合物29。 實施例27.製備化合物31 (葉 酸)2-TAMRA-2〇KPEG-CyS-SS-C6-01ig〇。 在實施例6中描述之條件下，使化合物29與寡核苷酸 (化合物3 0 )反應以得到化合物3 i。 實施例28.製備化合物33 »
將化合物32 ( 4臂SC-2gkpeg，0·35 mmol)添加至化 合物5 (相對於待經取代之每—NHS，2當量）於DMF/DCM 71 201004648 (25 mL/45 mL· )中之溶液’接著添加mEA (相對於每一 化合物5，3當量）。於室溫下攪拌懸浮液5小時。在真空 下蒸發反應混合物且隨後在0°C下以DCM/EhO沈澱。過遽 固體且隨後溶解於80 mL DCM中。添加20 mL 0.1N HC1 之後，攪拌混合物5分鐘，隨後轉移至分液漏斗且將有機 層分離且再次以0.1N HC1 ( 20 mL)及食鹽水（20 mL)洗 滌。將有機層經MgSCh乾燥，過濾且在真空下蒸發θ在〇 °C下，以DCM/EhO使殘餘物沈澱。過濾固體且在3〇ι下、 在真空烘相中乾無至少2小時。13C NMR (75.4 MHz，CDC13): δ 170.90, 156.66, 155.68, 153.86, 142.41, 133.85, 121.24, 72.96-69.30, 64.08, 53.01, 41.82 ° 實施例29.製備化合物35 » 使用不同尺寸的經活化PEG聚合物來製備peG-LNA接 合物。通常’使用實施例6中描述之條件使化合物3 3與寡 核苷酸（化合物3 4 )反應。每一化合物之描述提供於圖6 中。將券核音酸（化合物34’ 400 mg’ 0.074 mmol)添加 至化合物 33 ( 505 mg，0.012 mmol)於 25 mL pH 6_5、100 mM構酸鈉中之溶液中。在氮氣下、於室溫下授拌反應5小 時。以Source 1 5RPC管柱純化反應混合物。以1〇〇 mM TEA A 平衡管柱。隨後裝載反應混合物。以1M NaCl、水及50% CH3CN溶離管柱。收集化合物35且;東乾。產量150mg。 MALDI證實62,5 90之分子量。 實施例30.式（I)化合物 實施例3 1-36證明使用可釋放地連結之具有下式之 72 201004648 ’ PEG分子改良寡核苷酸之腫瘤傳遞以及改良目標腫瘤 mRNA之反義敲除。 . 置換頁
Ο 0 ^!1A〇->eg^〇^peg—°γΝΗ 或
HCT Y \S"^OIigo Η 又
PEG
PEC。又
H 其中 PEG為聚乙二醇；
Rb為 h2n
且
Qligo 統一地為 5，-(CH2)6-抗-存活素 LNA( SEQ ID NO: 1，稱為 “LNA1” ）或 5'-(CH2)6-抗-erbB3 LNA( SEQ ID NO: 6，稱為 “LNA2” )，且 73 201004648 含有PEG之化合物之聚合部分之總分子量為約4〇,〇〇〇 道爾頓、20,000道爾頓、1〇,〇〇〇道爾頓或5,〇〇〇道爾頓。 舉例而言’化合物包括葉酸^此卩^匕以^^丄”人之㈠匕 合物 101)、葉酸-5KPEG-Cys-SS-LNA2(化合物 102)、 0KPEG-Cys-SS-LNAl (化合物 1〇3)、1()KpEG-Cys-SS-LNAl (化合物 4)及 4GKPEG-Cys-SS-LNA2 (化合物 105)。 實施例31.試管内穩定性 本文中描述之 PEG-Cys-SS-LNA 及葉酸 -PEG-Cys-SS-LNA接合物在緩衝液中展示良好穩定性。 置換頁 實施例32.葉酸- PEG-Cys-SS-LNA接合物之試管内細 胞吸收 葉酸-PEG-Cys-SS-LNA接合物之細胞吸收及與葉酸受 體結合之特異性係在KB人類宮頸癌細胞株中評價。在37 °C下塗鋪KB細胞隔夜。在3 7 °C下，在存在或不存在1认 Μ 游離葉酸之情況下，將細胞與 1〇〇 ηΜ 葉酸 -PEG-Cys-SS-LNA2-FAM接合物（經FAM標記之化合物ι〇1 及102 ) —起培育24小時。PEG-Cys-SS-LNA2-FAM接合物 之量係以LNA2之量、而非聚合接合物之量計。洗滌細胞且 在螢光顯微鏡及共焦顯微鏡下觀察樣本。葉酸 -PEG-Cys-SS-LNA接合物之細胞吸收之結果展示於圖7中。 在37°C下、在存在或不存在1〇〇 ηΜ游離葉酸之情況 下，亦使ΚΒ細胞暴露於葉酸-5KPEG-Cys-SS-LNA2-FAM(經 FAM標記之化合物1 〇2 ) 4小時。洗滌細胞且藉由FACS分 74 201004648 析其結合特異性。結果展示於圖8中。 螢光及共焦顯微鏡研究均展示葉酸改良LNA寡核苷酸 之細胞吸收。葉酸-PEG接合物之細胞内傳遞可與經脂質體 轉染試劑（lipofectamine )轉染之彼細胞内傳遞相比。葉酸 增強寡核苷酸之細胞内吸收。 螢光顯微鏡影像（圖7 ( a))及FACS分析（圖8 )展 示葉酸-PEG接合物與葉酸受體之結合及隨後至KB細胞中 之内化作用在游離葉酸之存在下被阻斷。在KB細胞中，葉 酸-PEG接合物與葉酸受體之結合為特異性的。 實施例33·腫瘤細胞中PEG-Cys-SS-LNA接合物之試管 内功效
藉由使用qRT-PCR來執行PEG-Cys-SS-LNA接合物及 裸LNA寡核苷酸之試管内功效。將1 5PC3人類前列腺癌細 胞以0.1 nM至1,000 nM之每一測試化合物、裸LNA2或 40KPEG-Cys-SS-LNA2 (化合物 105 ) 處理。所投予 40KPEG-Cys-SS-LNA2之量係以LNA2之量、而非所投予聚 合接合物之量計。收集細胞且藉由使用qRT-PCR分析其 ErbB3 mRNA下調。將qRT-PCR之結果與在存在或不存在 脂質體轉染試劑之情況下未經處理的1 5PC3細胞相比較。 結果展示於圖9中。結果展示PEG-Cys-SS-LNA2接合物下 調目標基因 ErbB3 mRNA之表現且功效可與裸LNA2相 比。在15PC3細胞中，PEG-Cys-SS-LNA2接合物之ErbB3 mRNA表現之敲除與相等裸LNA2 —樣有效（IC5。分別等於 5 nM及8.5 nM )。與LNA寡核苷酸連接之PEG不干擾LNA 75 201004648 募核苷酸之效能。 實施例34.葉酸-PEG-Cys-SS-LNA接合物在KB異種移 植小鼠模型中之活體内功效 葉酸-PEG-LNA接合物之功效係在KB人類子宮頸癌異 種移植小鼠中評價。將帶有KB腫瘤（表皮樣瘤，人類宮頸 癌細胞株）之無胸腺裸Balb/c小鼠於q3dx4以35 mg/kg劑 量之裸 LNA2 或葉酸-4QKPEG-Cys-SS-LNA2 、 40KPEG-LNA2、葉酸-5KPEG-LNA2 或 5KPEG-LNA2 接合物處 理32天。所投予PEG接合物之量係以LNA2之量、而非所 投予聚合接合物之量計。分離腫瘤及肝臟樣本且藉由使用 qRT-PCR 分析其 ErbB3 mRNA 下調。 結果如圖10(A)及（B)中所示。與裸LNA2相比， 葉酸-PEG接合物顯著抑制腫瘤組織中ErbB3 mRNA之表 現。另外，與5K葉酸-PEG-LNA接合物相比，40K葉酸 -PEG-LNA接合物下調目標mRNA 〇結果展示與裸LNA寡 核苷酸相比，PEG化增加LNA寡核苷酸在腫瘤中之積累且 葉酸-PEG接合物增強mRNA下調。 實施例35. PEG-Cys-SS-LNA在腫瘤及血漿中之生物 分布 PEG-Cys-SS-LNA接合物在血漿中之循環及在腫瘤中 之滯留係在A549人類長腺癌異種移植小鼠中評價。 將A549 (人類肺腺癌上皮細胞株）細胞皮下植入無胸 膝裸小鼠中。當腫瘤達到7 5 mm3之平均體積時，將小鼠隨 機分組且以 10 mg/kg 之單次劑量之裸 LNA1、 76 201004648 40KPEG-Cys-SSLNA1 (化合物 103，10 mg/kg 等效劑量之 LNA 1)或 10KPEG-Cys-SS-LNAl (化合物 104，10 mg/kg 等效劑量之LNA 1 )靜脈内注射。在處理後2小時及4小 時時點收集血漿樣本。在處理後不同時點（2、4、1 2、24、 48及72小時）自處死動物收集腫瘤組織。腫瘤或血漿樣本 中之等效LNA1寡核苷酸之濃度藉由ELISA雜交檢定來量 測。結果展示於圖11 ( A )及（B )中。 結果展示與裸LNA寡核苷酸相比，4()KPEG_Cys-SS-LNA 接合物於血漿中具有顯著較高之循環且於腫瘤中具有顯著 較高之積累。與裸LNA寡核苷酸相比，以PEG-Cys-SS-LNA 接合物處理之小鼠在處理後2小時及4小時在血漿中大於 5 0倍之循環LNA募核苷酸濃度。與裸LNA寡核苷酸相比， PEG-Cys-SS-LNA接合物具有較高血漿濃度及較長循環時 間。與裸LNA寡核苷酸相比，以PEG接合物處理之小鼠在 第24小時在腫瘤中具有高3倍之LNA寡核苷酸積累。結果 亦指示與iqkpeg接合物相比，4GKpEG接合物在第η小時 具有大於3,5倍之腫瘤積累且直至第72小時積累保持$】$ 倍。結果指示較高分子量PEG (4〇KDa)接合物具有比較低 MW PEG ( l〇KDa) PEG接合物高的腫瘤積累。 實施例36· PEG-Cys-SS-LNA接合物在KB異種移植小 鼠模型中之活體内功效 PEG-LNA接合物之功效係在 央貝于宮頸癌異種移 植小鼠中評價。將KB細胞（表皮樣瘤’人類宮頸癌細胞株) 皮下植人裸小鼠中。當腫瘤達到75mm3之平均體積時，將 77 201004648 小鼠隨機分組且於q3dx4以10 mg/kg之單次劑量之裸LNA2 或 4°KPEG-Cys-SS LNA2 (化合物 105，10 mg/kg 等效劑量 之LNA2 )靜脈内注射。最後劑量之後24小時收集腫瘤及 肝臟樣本。藉由使用qRT-PCR量測樣本中之ErbB3 mRNA 下調。結果展示於圖12中。 結果展示與裸LNA寡核苷酸相比，PEG-Cys-SS-LNA 接合物顯著抑制腫瘤中ErbB3 mRNA之表現。以PEG接合 物處理之小鼠相比於以裸LNA處理之小鼠對ErbB3 mRNA 表現之抑制高2倍。另外，與裸LNA寡核苷酸之88%相比， PEG接合物抑制肝臟中92%之ErbB3 mRNA表現。 實施例37. PEG-Cys-SS-LNA接合物在15PC3異種移 植小鼠模型中之活體内功效 PEG-LNA接合物之功效係在15PC3人類前列腺癌異種 移植小鼠中評價。將1 5PC3細胞（人類前列腺癌細胞株） 皮下植入裸小鼠中。當腫瘤達到75 mm3之平均體積時，將 小鼠隨機分組且於q3dx4以1 0 mg/kg之單次劑量之裸LNA2 或 40KPEG-Cys-SS LNA2 (化合物 105，10 mg/kg 等效劑量 之LNA2 )靜脈内注射。最後劑量之後24小時收集腫瘤及 肝臟樣本。藉由使用qRT-PCR量測樣本中之ErbB3 mRNA 下調。結果展示於圖13中。 結果展示與裸LNA寡核苷酸相比，PEG-Cys-SS-LNA 接合物顯著抑制腫瘤中ErbB3 mRNA之表現。以PEG接合 物處理之小鼠相比於以裸LNA處理之小鼠對ErbB3 mRNA 表現之抑制高2倍。另外，與裸LNA寡核苷酸之73%相比， 78 201004648 PEG接合物抑制肝臟中83%之ErbB3 mRNA表現。 鑒於上述内容，本發明有利地提供採用PEG接合物來 將寡核苷酸傳遞至哺乳動物之腫瘤細胞之經改良方法，其 與相應裸反義構築體相比，在活體内極大地增加循環時 間、增強腫瘤中寡核苷酸之積累，同時亦實現腫瘤中致癌 基因mRNA表現之下調增強。 本發明之一具體實例提供將寡核苷酸傳遞至哺乳動物 之腫瘤細胞之經改良方法，其包括以下步驟： (a )提供具有下式之化合物：
或其醫藥學上可接受之鹽， 其中 PEG為聚乙二醇；
Rb為 79 201004648
Oligo為約8至30個核苷酸之寡核苷酸， 其中化合物之聚合部分具有約40,000道爾頓之總數量 平均分子量；及 (b )向具有腫瘤細胞之哺乳動物投予該化合物或其醫 藥學上可接受之鹽。 本發明之相關具體實例提供活體内抑制哺乳動物之腫 瘤基因表現之經改良方法，其包括以下步驟： (a )提供具有下式之化合物：
j Η & Η
或其醫藥學上可接受之鹽， 80 201004648 其中 PEG為聚乙二醇； Rb為
Oligo為約8至3 0個核苷酸之寡核苷酸， 其中化合物之聚合部分具有約40,000道爾頓之總數θ 平均分子量；及 | (b )向具有腫瘤細胞之哺乳動物投予該化合物 鹽， 次其 其中該投藥降低腫瘤細胞對預選基因之表現。 對預選基因表現之抑制可為mRNA分子之反義靶向 結果，由此降低或消除mRNA轉譯為多肽。在以上方法具 體實例中，投藥可經哺乳動物之血流實現，例如藉由靜脈 内（ι·ν·)注射。寡核苷酸可包含LNA。募核苷酸包括_5, •(CH2)6-反義-存活素LNA寡核苷酸或_5，_(cH2)6_反義 -ErbB3 LNA寡核苦酸。 【主要元件符號說明】 無 81 201004648 序列表 <110>趙洪 瑞迪，普沙納 <120>用於寡核有:酸傳遞的包含細胞內可釋放的雙硫連結子之聚合系統
<130> 213.1319-PCT <140> <141> <150> 61/106,578 <151> 2008-10-19 <150> 61/106,579 <151> 2008-10-19 <150> 61/055,950 <151> 2008-05-23 <150> 61/055,869 <151> 2008-05-23 <160> 6 <170> patentln3.3 版
<210> 1 <211> 16 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成寡核普酸 适5混雜—特徵 <222> (1) (16) <223>硫代骨架 <2 21>經修飾的驗基 <222> (1) <223>甲基化胞嘧啶 <220> <221>混雜—特徵 <222> (1) <223> LNA <220> <221>混雜—特徵 <222> (2) <22B> LNA <220〉 <221>經修飾的鹼基 <222> (3) <223>甲基化胞嘧啶 1 201004648 <220〉
<221>混雜—特徵 <222> (3) — <223> LNA <220>
<221>混雜_特徵 <222> (4厂 <223> LNA <220> <221> <222> <223>
> > > > 012 3 2 2 2 2 2 2 2 2 V < V V 經修飾的鹼基 (13) 曱基化胞嘧啶 混雜—特徵 (13)
LNA
<221>混雜—特徵 <222> (14) <223> LNA
> > > > 012 3 2222 222 2 V V < V
<400> 1 ctcaatccat ggcagc 16
<210> 2 <211> 21 <212> DMA <213>人工序列 <220> <223>組合DNA/RNA分子之描述：合成寡核苷酸 <220> <223》人工序列之描述：合成寡核搬 <220>
<221>混雜—特徵 <222> ⑴（19) <223> RNA <400> 2 gcaugcggcc ucuguuugat t 21
<210> 3 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 2 <220> 201004648 <223>組合DNA/RNA分子之描述：合成寡核苷酸 <220> 人工序列之描述：合成寡核爷酸 <220> <221>混雜—特徵 <222> (3〕 （21)
<223> RNA <400> 3
ucaaacagag gccgcaugct t <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列 <220> 人工序列之描述：合成寡核辛酸 <220> <221》混雜—特徵 <222> (1)厂(18) <223>硫代骨架 <400> 4
tctcccagcg tgcgccat <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213>人工序列 <220> <22 3>人工序列之描述：合成寡核苷酸 <220> <221>混雜—特徵 <222> (1) 〔16) <223>硫代骨架 <220>
<2 21>混雜一特徵 <222> (1)⑶ <223> LNA <221>混雜」寺徵 <222> (13〕 （15〕
<22B> LNA <400> 5 tggcaagcat cctgta <210> 6 201004648
<211> 16 <212> DNA 人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成寡核甘酸 <2 21>混雜—特徵 <222> (1) (16) <223>硫代骨架 <220>
<221>混雜—特徵 <222> ⑴（3) <223> LNA % <220>
<221>混雜— <222> (14) <223> LNA 16 <400> 6 tagcctgtca cttctc 4

Claims (1)

  1. 201004648 七、申請專利範圍： 1 · 一種將募核苷酸傳遞至哺乳動彳 方味^ ^ . 孔動物之腫瘤細胞之改良 物”包含向具有腫瘤細胞之哺乳動物投予式（1)化合 或其醫藥學上可接受之鹽， 其中 R1為實質上無抗原性之水溶性聚合物； 各A相同或不同且選自由以下各 {Li)a-
    S-S-Ra Y1 叹 < 群： 丨| _(L4)al _Rb ;及 -(L4)a2-Rc， Yl在每★出現時獨立地為s或ο ; γ2在每次出現時獨立地為NRi3; Ra在每次出現0主& 1 A 8寻為相同或不同寡核苷酸； Ll-4各自在每:炎+ 出現叫為相同或不同雙官能递 心在每^料為^結子； Rc在每次出現4 , ^呀為相同或不同診斷劑； R3-7各自獨立；I士、® , 選自由以下各基團組成之群.& 烷基、c2-6烯基、Γ 虱、CK 2-6炔基、Cm支鏈烷基、C3_8環烷基及 201004648 c 1 - 6烧氧基；
    環烷基； 見盼獨立地選自由以下各基團組成之珲·· 2-6烯基、C2-6炔基、C3_19支鏈烷基及
    C3-8環烷基及c 烷氧基； 立地選自由以下各基團組成之群： 6烯基、C2-6块基、匚319支鏈燒基' 及（d)各自獨立地為〇、1、2或3; (al)及（a2)各自獨立地為〇、ι、2或3; 各（b)獨立地為0、1、2或3; 各（c)獨立地為〇、1、2或3; 各（e)獨立地為〇或1 ; 各（g)獨立地為〇或1;且 (m)為約2至約32之正整數， (a)及（g)不同時為〇，且進一步限制條 限制條件為 件為一或多個21含有寡核苷酸。 2.如申請專利範圍第丨項之方法，其中該式（〗）化合 物具有式（Γ ):
    其中 (ml ) 為約1至約8之正整數； 2 201004648 (m2 )為〇或約1至 (ml)與（m2)之和 3.如申請專利範圍第i 寡核苷酸。 4 _如申δ奢專利範圍第I 有葉酸。 5 ·如申5青專利範圍第 6. 如申請專利範圍第 7. 如申請專利範圍第 (e)為 0，且（c)為 1 c 約7之正整數；且 為約2至約8之整數。 項之化合物’其中所有Zl含有 項之方法’其中—或多 1項之方法，其中心2為〇H。 1項之方法，其中R3 7全部為氫。 1項之方法’其中（b) 、（d)及 1項之方法’其中Z!具有下式： 8.如申請專利範圍第 〇 --(Li)a—N-/~R，S I K21 5 其中， 、a j馮〇或j ; R 為至8之整數；且為（2、4、8、16或32); 群· r 每人出現時係獨立地選自纟以下各基團組成之 叶·搜基、〇丨_6烷基 及e 2·6烯基、C2_6炔基、C3.19支鏈烷基 及Ll·6烷氧基；且 如申請專利範圍第 圍第2項之方法， 所有其他變數與 9 ·如申請專利範 物具有下式 1項中所定義相同。 其中該式（I)化合
    201004648 其中（a)為0或1。 10. 如申請專利範圍第9項之方法， 11. 如申請專利範圍第1項之方法， 12. 如申請專利範圍第1項之方法，j 基氧化物。 13. 如申請專利範圍第12項之方法 5,000至約25,000道爾頓（dalton)或約 道爾頓之總數量平均分子量。 14. 如申請專利範圍第1項之化合物 選自由以下各物組成之群： ， .O-(CH2CH20)n-2 2-(OCH2CH2)r,-〇·^/ \z〇-(CH2CH2〇)n-Z Z-(O0H2CH2in-O^ 其中（m2)為0。 其中（ml )為1。 $中R!包含聚伸烷 ，其中Ri具有約 20,000 至約 45,000 ，其中該化合物係 Z-(0CH2CH2)n-0 Z-(0CH2CH2}n-0
    O ,〇、 '(CH2CH20)n-Z Z-COCHsCHA、 Z-(OCH2CH2)n〆 0-(CH2CHj,〇V2 ΌΚ〇Η2ί：Η20)η-2,及 ^{CHzCHzO)^ Z-(OCH2CH2)n (CH2CH20)n-Z O O 一：r。乂峨 其中 各Z獨立地為 4 201004648
    -(L4)al_Rb ;或 -(L4)a2，Rc， 其中
    r12在母-人出現時係獨立地選自由以下各基團組成之 群H CVd基、c2.6稀基、炔基、％支鍵烧基 及C h院乳基； (η)為正整數且該化合物 約25，000道爾頓或約2〇,〇〇〇至 均分子量；且 之聚合部分具有約5 ,〇〇〇至 約45,000道爾頓之總數量平 所有其他變數與如中請專利範圍第丨項中所定義相同。 15·如申請專利範圍帛1項之方法，其中該募核苦酸為 單股或雙股寡核苷酸。 1 6.如申請專利範圍第丨5項之方法，其中該寡核苷酸為 反義寡核苷酸。 1 7.如申請專利範圍第丨5項之方法，其中該募核苷酸係 遥自由以下各物組成之群：脫氧核苷酸、核糖核苷酸、鎖 核酸（LNA )、短干擾 RNA ( siRNA )、微 RNA ( miRNA )、 適體（aptamer )、肽核酸（PNA )、二胺基磷酸酯嗎啉基 募核苷酸（PMO)、三環-DNA、雙股寡核苷酸（誘餌〇dn)、 催化 RNA ( RNAi )、適體、斯皮格體（spiegelmer)、CpG 寡聚物及其組合。 5 201004648 18.如申請專利範圍第15項之方法，其中該寡核苷酸具 有LNA及硫代磷酸酯鍵。 1 9.如申請專利範圍第1 5項之方法，其中該寡核苷酸具 有約8至約30個核苷酸。 20.如申請專利範圍第19項之方法，其中該寡核苷酸係 選自由以下各物組成之群：反義bcl-2寡核苷酸、反義HIF-1 α寡核苷酸、反義存活素（survivin )寡核苷酸及反義Erb /3 3寡核苷酸。 2 1.如申請專利範圍第1 5項之方法，其中該寡核苷酸包 含 SEQ ID NOM、SEQ ID NO 2 及 3、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 5 及 SEQ ID NO: 6。 22.如申請專利範圍第1項之方法，其中該式（I )化合 物係選自由以下各物組成之群：
    〇 Olrg〇-"S''S'^sY^vOH Ο Η.° ο PEG" 、PEG 6 201004648
    Olig〇/S、S’"Y"、〇H IT PEGo Oligo，S、S 八y^OH Ο
    丫 NH o HO 丫、S，'Oligo
    0 'S、, H(T 丫 'S，、Olig〇 〇 peg’ HVC
    0 。丨丨 go，S、S-丫、OH HN、^n，\_^PEG、 O ho人y^s，s、oiig0 NH Pf6 PEG HO人广^入。^。 g^Ynh
    Ollg〇、s/S、/OH o
    S^Sv〇ligo 葉酸-(L4)〆 葉酸-(L4)ar 葉酸
    -PEG 丫〜。^八 PEG ^ρρΓΐ _<U)a1一葉酸o HO^^Y^S'S、OHgo NH 及 PEG 葉酸 其中： Oligo為寡核苷酸； PEG為聚乙二醇且該化合物之聚合部分具有約 5,000 7 201004648 至約25,000道爾頓或約20,000至約45,000道爾頓之總數量 平均分子量； (al )為1 ;且 L4 為-NH(CH2CH20)2(CH2)2NH[C(=0)]r -或 -NH(CH2)3-，其中（r’ ）為 0 或 1。 2 3 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該等腫瘤細胞 為前列腺或子宮頸癌細胞。 24.如申請專利範圍第1項之方法，其中該投藥步驟包 含經由該哺乳動物之血流投藥。 2 5. —種將寡核苦酸傳遞至哺乳動物之腫瘤細胞之經改 良方法，其包含： (a )提供具有下式之化合物：
    或其醫藥學上可接受之鹽， 其中 PEG為聚乙二醇； 201004648
    H2N人N人〆M 0 Oligo為約8至30個核苷酸之寡核苷酸， 其中該化合物之聚合部分具有約4〇,〇〇〇道爾頓之總數 量平均分子量；及 (b )向具有腫瘤細胞之哺乳動物投予該化合物或其醫 藥學上可接受之鹽。 26.如申請專利範圍第25項之方法，其中該寡核苷酸包 含 LNA。 27_如申請專利範圍第25項之方法，其中〇Hg〇為 -5 -(CH2)6-TsAsGsCsCsTsGsTsCsAsCsTsTsCsTsCs-3, 或 -5 -(CH2)6-GsCsTsGsCsCsAsTsGsGsAsTsTsGsAsG-3'，其中 5’及3'末端中之前三個核苷酸為lna且“s”代表硫代磷酸 酯鍵。 28.如申請專利範圍第25項之方法，其中該等腫瘤細胞 為前列腺或子宮頸癌細胞。 2 9 · —種將券核苦酸傳遞至哺乳動物之腫瘤細胞之經改 良方法，其包含： (a )提供具有下式之化合物：
    9 201004648 Η Η 〇-Ϊ1Λ〇^ΡΕ〇 Ο PEG; Ο人〇j tA Oligo 、N 〜〇' Rb 或其醫藥學上可接受之鹽 其中 PEG為聚乙二醇； Rb為
    Oligo為約8至30個核苷酸之寡核苷酸， 40,000道爾頓之總數 其中該化合物之聚合部分具有約 量平均分子量；及 (b )向具有腫瘤細胞之哺乳動物投予該化合物或其 鹽，其中該投藥降低該等腫瘤細胞對預選基因之表現Y ” 30.—種將寡核苷酸引入細胞中之方法，其包含： 使細胞與式（I )化合物接觸。 3 1.—種抑制癌細胞之生長或增殖之方法，其包含： 使癌細胞與式（I )化合物接觸。 32.—種式（ia)化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽， 其中 Ri為實質上無抗原性之水溶性聚合物； 10 201004648 各z 1相同或不同且係選自：
    _(L4)al-Rb，及 -(L4)a2-Rc ; Yi在每次出現時獨立地為S或0 ; Y2在每次出現時獨立地為NR13 ; Ra在每次出現時為相同或不同寡核苷酸； 川_4各自在每次出現時為相同或不同雙官能連結子； Rb在每次出現時為葉酸； Rc在每次出現時為相同或不同診斷劑； R3-7各自獨立地選自：氫、Ci_6烷基、C2-6烯基、C2_6 炔基、C3_19支鏈烷基、C3_8環烷基及Cw烷氧基； R13在每次出現時係獨立地選自：氫、Cu烷基、C2_6 稀基、C2-6快基、C3-19支鍵烧基及C3-8環烧基； R12在每次出現時係獨立地選自由以下各基團組成之 群：氯、輕基、Ci-6烧基、C2-6稀基、C2-6快基、C3-I9支鍵 烧基、C3_8環烧基及Ci-6烧氧基； (a)及（d)各自獨立地為0、1、2或3; (al )及（a2)各自獨立地為0、1、2或3 ; 各（b)獨立地為0、1、2或3; 11 201004648 各（c)獨立地為0、1、2或3; 各（e )獨立地為0或1 ; 0，且進一步限制條 -步限制條件為一或 各（g)獨立地為0或1;且 (m)為約2至約32之正整數， 限制條件為（a)及（g )不同時為 件為一或多個Z!含有寡核普酸，且進 多個Z:含有葉酸。 八、圖式. (如次頁） 12
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