TW202002990A - 用於反義遞送之嵌合肽 - Google Patents

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科林 Ｍ 菲德森
蕾貝卡 Ｌ 霍登
賈斯汀 Ｍ 沃夫
志寧 朱
莫妮卡 姚
甘納 J 韓森
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美商薩羅塔治療公司
美國麻省理工學院
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Abstract

本發明提供寡核苷酸、嵌合肽及肽-寡核苷酸共軛物。本文亦提供治療有需要個體之肌肉疾病、病毒感染或細菌感染之方法，其包含向該個體投與本文所描述之寡核苷酸、嵌合肽及肽-寡核苷酸共軛物。

Description

用於反義遞送之嵌合肽
反義技術提供用於調變一或多種特定基因產物(包括替代剪接產物)之表現之方式，且該方式唯一地適用於許多治療性、診斷性及研究應用。反義技術隱含之原理為：與靶標核酸雜交之反義化合物(例如，寡核苷酸)經由許多反義機制中之任一者調變基因表現活性，諸如轉錄、剪接或轉譯。反義化合物之序列特異性使得其作為用於靶標驗證及基因官能化以及選擇性地調變與疾病有關之基因表現之療法的有吸引力的工具。
儘管已在反義技術領域中取得顯著進展，但在此項技術中仍需要具有經改良反義或反基因效能之寡核苷酸及肽-寡核苷酸共軛物。
本文提供包含共價鍵結至嵌合肽(CP)之寡核苷酸的嵌合肽-寡核苷酸共軛物。本文亦提供治療有需要之個體之疾病的方法，其包含向個體投與本文所描述之嵌合肽-寡核苷酸共軛物。
因此，在一個態樣中，本文提供一種式I之嵌合肽-寡核苷酸共軛物：
Figure 02_image003
或其醫藥學上可接受之鹽， 其中： A'選自-NHCH2 C(O)NH2 、-N(C1-6 -烷基)CH2 C(O)NH2 、
Figure 02_image005
，其中 R5 為-C(O)(O-烷基)x -OH，其中x為3-10，且各烷基在每次出現時獨立地為C2-6 -烷基， 或R5 選自-C(O)C1-6 -烷基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、-(C1-6 -烷基)-R6 、-(C1-6 -雜烷基)-R6 、芳基-R6 、雜芳基-R6 、-C(O)O-(C1-6 -烷基)-R6 、-C(O)O-芳基-R6 、-C(O)O-雜芳基-R6 ，以及
Figure 02_image007
； 其中R6 選自OH、SH及NH2 ，或R6 為O、S或NH，其中之每一者共價連接至固體擔體； 各R1 獨立地選自OH及-N(R3 )(R4 )，其中各R3 及R4 在每次出現時獨立地為-C1-6 -烷基； 各R2 獨立地選自H、核鹼基及經化學保護基團官能化之核鹼基，其中核鹼基在每次出現時獨立地包含選自吡啶、嘧啶、三嗪、嘌呤及去氮-嘌呤之C3-6 -雜環； z為8-40；及 E'選自H、-C1-6 -烷基、-C(O)C1-6 -烷基、苯甲醯基、硬脂醯基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、
Figure 02_image009
； 其中 Q為-C(O)(CH2 )6 C(O)-或-C(O)(CH2 )2 S2 (CH2 )2 C(O)-； R7 為-(CH2 )2 OC(O)N(R8 )2 ，其中R8 為-(CH2 )6 NHC(=NH)NH2 ； L為-C(O)(CH2 )1-6 -C1-6 -雜芳基-(CH2 )1-6 C(O)，其中L藉由醯胺鍵共價連接至J之胺基末端； J為2、3、4或5個共價連接之細胞穿透肽； G選自H、-C(O)C1-6 -烷基、苯甲醯基及硬脂醯基，其中G藉由醯胺鍵共價連接至J之羧基末端；以及 其中以下條件中之至少一者為真實的： 1) A'為
Figure 02_image011
；或2)E'為
Figure 02_image013
。
在一個實施例中，L為-C(O)(CH2 )1-6 -三唑-(CH2 )1-6 C(O)。
在一些實施例中，該等細胞穿透肽中之至少一者為兩親媒性肽，且該等細胞穿透肽中之至少一者為寡精胺酸肽。
在某些實施例中，該等細胞穿透肽中之一者為兩親媒性肽，且該等細胞穿透肽中之一者為寡精胺酸肽。
在一個實施例中，J為兩個共價連接之細胞穿透肽，且其中該等細胞穿透肽中之一者為兩親媒性肽，且該等細胞穿透肽中之一者為寡精胺酸肽。
在一個實施例中，式I之嵌合肽-寡核苷酸共軛物為式Ia之嵌合肽-寡核苷酸共軛物：
Figure 02_image015
或其醫藥學上可接受之鹽， 其中J如上文所定義。
在一些實施例中，該等細胞穿透肽中之至少一者為兩親媒性肽，且該等細胞穿透肽中之至少一者為寡精胺酸肽。
在某些實施例中，該等細胞穿透肽中之一者為兩親媒性肽，且該等細胞穿透肽中之一者為寡精胺酸肽。
在某些實施例中，J為如上文所定義之兩個共價連接之細胞穿透肽。
在另一實施例中，式I之嵌合肽-寡核苷酸共軛物為式Ib之嵌合肽-寡核苷酸共軛物：
Figure 02_image017
或其醫藥學上可接受之鹽， 其中J如上文所定義。
在一些實施例中，該等細胞穿透肽中之至少一者為兩親媒性肽，且該等細胞穿透肽中之至少一者為寡精胺酸肽。
在某些實施例中，該等細胞穿透肽中之一者為兩親媒性肽，且該等細胞穿透肽中之一者為寡精胺酸肽。
在某些實施例中，兩個共價連接之細胞穿透肽如上文所定義。
在再一態樣中，本文提供一種治療有需要之個體之肌肉疾病、病毒感染、神經肌肉疾病或細菌感染的方法，其包含向該個體投與本發明之嵌合肽-寡核苷酸共軛物。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2018年3月16日申請之美國臨時專利申請案第62/644,202號之優先權，該申請案以全文引用之方式併入本文中。
二胺基磷酸酯嗎啉基寡核苷酸(PMO)為用於基因疾病之有吸引力的治療性分子。經設計以藉由Watson-Crick鹼基配對識別靶標，PMO針對其互補核苷酸序列展現高水準之特異性。視靶標序列之類型而定，PMO可介導各種效應，包括阻斷蛋白轉譯或修飾基因剪接。伊特普森(Eteplirsen) (經FDA有條件地審批通過以治療杜興氏肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy)之PMO)使針對肌縮蛋白編碼之前體mRNA中之含突變外顯子自最終蛋白轉錄物中排除，從而恢復蛋白官能性。
就結構而言，PMO為中性寡核苷酸類似物，其中核糖基環經嗎啉基環置換，且帶負電荷磷酸二酯主鏈經不帶電荷二胺基磷酸酯置換。所更改之主鏈結構防止在血清中及藉由胞內核酸酶降解。然而，PMO之相對較大大小及中性電荷可引起至細胞溶質及胞核之低效遞送。
細胞穿透肽(CPP)為用以改良PMO向胞核中之遞送的有前景的策略。CPP為5-40個胺基酸之相對較短序列，理想地進入細胞溶質，且可促進負載(cargo)之胞內遞送。可基於CPP之物理化學特性將CPP分為不同基團。一種共用CPP類別由諸如R12 之重複的基於精胺酸之肽及Bpep (RXRRβRRXRRβR，其中X為胺基己酸且β為β-丙胺酸)組成。此等寡精胺酸肽通常為無規螺旋。當與PMO共軛時，寡精胺酸肽已為促進PMO遞送之最有效的肽中之一些。諸如穿膜肽、pVEC及蜂毒肽之其他CPP在本質上更加兩親媒性。在此等序列確實含有陽離子殘基時，帶電荷疏水性殘基之明確分離可促進兩親媒性螺旋線形成。然而，兩親媒性CPP尚未證實可顯著改良PMO功效。
對於CPP或CPP-PMO共軛物不存在通用細胞進入機制。機制通常與處理濃度及所附負載之類型高度相關。在高於某一臨限值濃度(通常較低微莫耳)的情況下，可觀測到與能量無關的細胞溶質攝取比內吞作用及細胞表面再循環之時間標度更快。快速攝取速率為類似於針對小分子觀測到之直接易位機制提供了證據。然而，在較低生理上相關濃度下，攝取主要為內吞的。即使在內吞作用之類別內，CPP及CPP-PMO共軛物可使用一或多種內吞機制進入細胞。此等內吞機制包括微胞飲、網格蛋白介導之內吞作用、胞膜窖介導之內吞作用，及與網格蛋白/胞膜窖無關的內吞作用。CPP-PMO共軛物主要在低濃度下內吞，且PMO遞送不良之CPP很可能在核內體中經捕獲或自核區室中排除。
本文提供用於改良PMO遞送之嵌合肽-PMO共軛物。此等嵌合肽-PMO共軛物包含彼此共價連接且與PMO共軛的兩個或更多個CPP。尤其在與未共軛PMO及單一CPP-PMO共軛物相比時，本文中描述寡核苷酸之細胞攝取升高。
定義 下文列舉用於描述本發明之各種術語之定義。此等定義應用於術語，因為除非在特定情況下以其他方式加以限制，否則其單獨地或作為較大群組的部分用於整個本說明書及申請專利範圍中。
術語「約(about)」應為一般熟習此項技術者理解，且將在其使用之上下文中在一定程度上變化。如本文中所使用，當提及可量測值，諸如量、持續時間及類似者時，術語「約」意謂涵蓋自指定值之±20%或±10% (包括±5%、±1%及±0.1%)之變化，因此變化適於執行所揭示之方法。
術語「烷基(alkyl)」係指在某些實施例中分別地含有一個至六個碳原子或一個至八個碳原子之飽和烴部分、直鏈烴部分或分支鏈烴部分。C1-6 烷基部分之實例包括(但不限於)甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、第三丁基、新戊基、正己基部分；且C1-8 烷基部分之實例包括(但不限於)甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、第三丁基、新戊基、正己基、庚基及辛基部分。
烷基取代基中之碳原子數目可由前綴「Cx-y 」指示，其中x為取代基中碳原子之最小數目且y為最大數目。同樣，Cx 鏈意謂含有x個碳原子之烷基鏈。
除非另外說明，否則術語「雜烷基」本身或與另一術語組合時意謂由所陳述數目之碳原子及選自由O、N及S組成之群之一個或兩個雜原子組成的穩定直鏈或分支鏈烷基，且其中氮及硫原子可視情況經氧化且氮雜原子可視情況經四級銨化。雜原子可置放於雜烷基之任何位置處，包括在雜烷基之其餘部分與其所附接至之片段之間，以及附接至雜烷基中之最遠端碳原子。實例包括：-O-CH2 -CH2 -CH3 、-CH2 -CH2 -CH2 -OH、-CH2 -CH2 -NH-CH3 、-CH2 -S-CH2 -CH3 及-CH2 -CH2 -S(=O)-CH3 。至多兩個雜原子可為連續的，諸如(例如) -CH2 -NH-OCH3 或-CH2 -CH2 -S-S-CH3 。
除非另外陳述，否則單獨或與其他術語組合使用之術語「芳基」意謂含有一或多個環(通常一個、兩個或三個環)之碳環芳族系統，其中此類環可以側接方式附接在一起(諸如聯苯)或可經稠合(諸如萘)。芳基之實例包括苯基、蒽基及萘基。在各種實施例中，芳基之實例可包括苯基(例如，C6 -芳基)及聯苯基(例如，C12 -芳基)。在一些實施例中，芳基具有六個至十六個碳原子。在一些實施例中，芳基具有六個至十二個碳原子(例如，C6-12 -芳基)。在一些實施例中，芳基具有六個碳原子(例如，C6 -芳基)。
如本文中所使用，術語「雜芳基(heteroaryl或heteroaromatic)」係指具有芳族特徵之雜環。雜芳基取代基可由碳原子數定義，例如，C1-9 -雜芳基指示雜芳基中所含有的碳原子數，而不包括雜原子數。舉例而言，C1-9 -雜芳基將包括額外之一個至四個雜原子。多環雜芳基可包括部分飽和之一或多個環。雜芳基之非限制性實例包括：吡啶基、吡嗪基、嘧啶基(包括例如2-嘧啶基及4-嘧啶基)、噠嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基(包括例如2-吡咯基)、咪唑基、噻唑基、噁唑基、吡唑基(包括例如3-吡唑基及5-吡唑基)、異噻唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,3,4-三唑基、四唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,3,4-噻二唑基及1,3,4-噁二唑基。
多環雜環及雜芳基之非限制性實例包括吲哚基(包括例如3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基及7-吲哚基)、二氫吲哚基、喹啉基、四氫喹啉基、異喹啉基(包括例如1-異喹啉基及5-異喹啉基)、1,2,3,4-四氫異喹啉基、噌啉基、喹喏啉基(包括例如2-喹喏啉基及5-喹喏啉基)、喹唑啉基、酞嗪基、1,8-萘啶基、1,4-苯并二噁烷基、香豆素(coumarin)、二氫香豆素、1,5-萘啶基、苯并呋喃基(包括例如3-苯并呋喃基、4-苯并呋喃基、5-苯并呋喃基、6-苯并呋喃基及7-苯并呋喃基)、2,3-二氫苯并呋喃基、1,2-苯并異噁唑基、苯并噻吩基(包括例如3-苯并噻吩基、4-苯并噻吩基、5-苯并噻吩基、6-苯并噻吩基及7-苯并噻吩基)、苯并噁唑基、苯并噻唑基(包括例如2-苯并噻唑基及5-苯并噻唑基)、嘌呤基、苯并咪唑基(包括例如2-苯并咪唑基)、苯并三唑基、硫代黃嘌呤基、咔唑基、咔啉基、吖啶基、吡咯聯啶基及喹嗪基。
術語「保護基團」或「化學保護基團」係指阻斷化合物之一些或所有反應性部分且防止此類部分參與化學反應直至移除保護基團的化學部分，例如T.W. Greene, P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 第3版. John Wiley & Sons (1999)中所列舉且描述之彼等部分。其可為有利的(在採用不同保護基團之情況下)，每一(不同)保護基團為藉由不同方式可移除的。在完全不同反應條件下裂解之保護基團允許此類保護基團之差異移除。舉例而言，保護基團可藉由酸、鹼及氫解移除。諸如三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、縮醛及第三丁基二甲基矽烷基之基團為酸不穩定的且可用於在經Cbz基團(其可藉由氫解移除)及Fmoc基團(其為鹼不穩定的)保護之胺基之存在下保護羧基及羥基反應性部分。羧酸部分可用諸如(但不限於)甲基或乙基之鹼不穩定基團來阻斷，且羥基反應性部分可在用酸不穩定基團(諸如胺基甲酸第三丁酯或均為酸及鹼穩定但可水解移除之胺基甲酸酯)阻斷之胺之存在下用諸如乙醯基之鹼不穩定基團來阻斷。
羧酸反應性部分及羥基反應性部分亦可用諸如苯甲基之可水解移除保護基團阻斷，而胺基可用諸如Fmoc之鹼不穩定基團阻斷。用於合成式(I)之化合物之尤其有用的胺保護基團為三氟乙醯胺。羧酸反應性部分可用諸如2,4-二甲氧基苯甲基之氧化可移除保護基團阻斷，而共存胺基可用氟不穩定胺基甲酸矽烷酯阻斷。
烯丙基阻斷基團在酸保護基團及鹼保護基團之存在下適用，此係由於前者為穩定的且隨後可藉由金屬或π-酸(pi-acid)催化劑移除。舉例而言，烯丙基阻斷之羧酸可用鈀(0)催化之反應在酸不穩定之胺基甲酸第三丁酯或鹼不穩定之乙酸酯胺保護基團之存在下去保護。保護基團之又一形式為化合物或中間物可連接至之樹脂。只要殘基連接至樹脂，則官能基經阻斷且無法反應。一旦自樹脂釋放，則官能基可用於反應。
術語「核鹼基」、「鹼基配對部分(base-pairing moiety)」、「核鹼基配對部分(nucleobase-pairing moiety)」或「鹼基」係指核苷、核苷酸及/或嗎啉基亞單位之雜環部分。核鹼基可為天然存在核鹼基或可為經修飾之核鹼基或此等天然存在核鹼基之類似物，例如，核鹼基之一或多個氮原子可在每次出現時獨立地經碳置換。例示性類似物包括：次黃嘌呤(核苷肌苷之鹼基組分)；2,6-二胺基嘌呤；5-甲基胞嘧啶；經C5-丙炔基修飾之嘧啶；10-(9-(胺基乙氧基)啡噁嗪基) (G形夾)及其類似者。
鹼基配對部分之另外實例包括(但不限於)：尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及使其各別胺基藉由醯基保護基團保護之次黃嘌呤、2-氟尿嘧啶、2-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、2,6-二胺基嘌呤、氮雜胞嘧啶、諸如假異胞嘧啶及假尿嘧啶之嘧啶類似物及諸如8位經取代之嘌呤、黃嘌呤或次黃嘌呤(後兩者為天然降解產物)之其他經修飾核鹼基。亦涵蓋揭示於Chiu及Rana, RNA, 2003, 9, 1034-1048, Limbach等人，Nucleic Acids Research, 1994, 22, 2183-2196以及Revankar及Rao, Comprehensive Natural Products Chemistry, 第7卷, 313中之經修飾核鹼基，其內容以引用之方式併入本文中。
鹼基配對部分之其他實例包括(但不限於)其中已添加一或多個苯環的大小經擴增之核鹼基。涵蓋描述於Glen Research catalog (www.glenresearch.com)；Krueger AT等人, Acc. Chem. Res., 2007, 40, 141-150；Kool, ET, Acc. Chem. Res., 2002, 35, 936-943；Benner S.A.等人, Nat. Rev. Genet., 2005, 6, 553-543；Romesberg, F.E.等人, Curr. Opin. Chem. Biol., 2003, 7, 723-733；Hirao, I., Curr. Opin. Chem. Biol., 2006, 10, 622-627 (其內容以引用之方式併入本文中)中之核鹼基替代作為適用於合成本文所描述之寡聚物。大小經擴增之核鹼基之實例展示如下：
Figure 02_image019
術語「寡核苷酸」或「寡聚物」意指包含複數個經連接核苷、核苷酸或核苷及核苷酸兩者之組合的化合物。在本文中所提供之特定實施例中，寡核苷酸為嗎啉基寡核苷酸。
片語「嗎啉基寡核苷酸」或「PMO」係指藉由胺基磷酸酯鍵或二胺基磷酸酯鍵使嗎啉基亞單位連接在一起、一個亞單位之嗎啉基氮接合至鄰近亞單位之5'-環外碳的經修飾寡核苷酸。各嗎啉基亞單位包含藉由核鹼基特異性氫鍵有效地與靶標中之核鹼基結合的核鹼基配對部分。
術語「反義寡聚物」、「反義化合物」及「反義寡核苷酸」可交換使用，且意指一種各自帶有藉由亞單位之間鏈結連接之鹼基配對部分之亞單位的序列，其可以讓鹼基配對部分與核酸(通常RNA)中之靶標序列藉由Watson-Crick鹼基配對雜交，在靶標序列內形成核酸：寡聚物雜雙螺旋。寡聚物可具有與靶標序列準確(完美的)互補序列或幾乎(充分)互補序列，靠近寡聚物末端之序列變化一般比內部中之變化更佳。
此反義寡聚物可經設計以阻斷或抑制mRNA之轉譯或抑制/改變天然或異常前體mRNA剪接過程，且可稱為「針對於」或「靶向於」與其雜交之靶標序列。靶標序列通常為一個包括mRNA之AUG起始密碼子、轉譯抑制寡聚物或經預處理之mRNA之剪接位點、剪接抑制寡聚物(SSO)的區域。剪接位點之靶標序列可包括經預處理之mRNA中正常剪接接受體接合點之下游5'端1至約25個鹼基對的mRNA序列。在各種實施例中，靶標序列可為經預處理之mRNA之任何區域，包括剪接位點或完全含於外顯子編碼序列內或跨越剪接接受體位點或供體位點。當寡聚物以上述方式靶向靶標之核酸時，其更一般地稱為「靶向」生物相關靶標，諸如蛋白、病毒或細菌。
當各分子中足夠數目對應位置係由彼此可經氫鍵結之核苷酸佔據時，反義寡核苷酸及靶標RNA彼此互補，使得穩定且特異性結合發生在寡核苷酸與靶標之間。因此，「可特異性雜交」及「互補」為用於指示充分程度之互補性或精確配對使得穩定且特異性結合發生在寡核苷酸與靶標之間的術語。在此項技術中應理解，寡核苷酸之序列不需要與其可特異性雜交之靶標序列100%互補。當寡核苷酸與靶標分子之結合干擾靶標RNA之正常功能時，寡核苷酸可特異性雜交，且有充分程度之互補性以避免反義寡核苷酸與非靶標序列之非特異性結合在需要特異性結合之條件下，亦即在生理學條件下，在活體內分析或治療性處理之情況下，及在活體外分析之情況下，在進行該分析之條件下。
寡核苷酸亦可包括核鹼基(此項技術中通常簡稱為「鹼基」)修飾或取代。含有經修飾或經取代之鹼基之寡核苷酸包括其中一或多種最常發現於核酸中之嘌呤或嘧啶鹼基經較不常用或非天然鹼基置換之寡核苷酸。在一些實施例中，該核鹼基在嘌呤鹼基之N9原子或在嘧啶鹼基之N1原子共價連接至核苷酸或核苷之嗎啉環。
嘌呤鹼基包含稠合於咪唑環之嘧啶環，如藉由通式所描述：
Figure 02_image021
嘌呤
腺嘌呤及鳥嘌呤為最常發現於核酸中之兩種嘌呤核鹼基。此等可經其他天然存在之嘌呤(包括但不限於，N6-甲基腺嘌呤、N2-甲基鳥嘌呤、次黃嘌呤及7-甲基鳥嘌呤)取代。
嘧啶鹼基包含六員嘧啶環，如藉由通式所描述：
Figure 02_image023
嘧啶
胞嘧啶、尿嘧啶及胸腺嘧啶為最常發現於核酸中之嘧啶鹼基。此等可經其他天然存在之嘧啶(包括但不限於，5-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、假尿嘧啶及4-硫尿嘧啶)取代。在一個實施例中，本文所描述之寡核苷酸含有代替尿嘧啶之胸腺嘧啶鹼基。
其他經修飾或經取代之鹼基包括(但不限於) 2,6-二胺基嘌呤、乳清酸(orotic acid)、阿格嗎特啶(agmatidine)、賴西啶(lysidine)、2-硫代嘧啶(例如，2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶)、G形夾及其衍生物、5位經取代之嘧啶(例如，5-鹵代尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-胺基甲基尿嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶、5-胺基甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、Super T)、7-去氮鳥嘌呤、7-去氮腺嘌呤、7-氮雜-2,6-二胺基嘌呤、8-氮雜-7-去氮鳥嘌呤、8-氮雜-7-去氮腺嘌呤、8-氮雜-7-去氮-2,6-二胺基嘌呤、Super G、Super A及N4-乙基胞嘧啶或其衍生物；N2-環戊基鳥嘌呤(cPent-G)、N2-環戊基-2-胺基嘌呤(cPent-AP)及N2-丙基-2-胺基嘌呤(Pr-AP)、假尿嘧啶或其衍生物；以及簡併或通用鹼基，如2,6-二氟甲苯或不存在鹼，如鹼基位點(例如，1-去氧核苷、1,2-二去氧核糖、l-去氧-2-O-甲基核糖；或其中環氧經氮置換的吡咯啶衍生物(氮雜核糖))。假尿嘧啶為尿嘧啶之天然存在之異構化型式，其在尿苷中具有C-糖苷而非常規N-糖苷。
某些經修飾或經取代核鹼基特別適用於增加本發明之反義寡核苷酸之結合親和性。此等核鹼基包括在5位經取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及在N-2、N-6及0-6位經取代之嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶。在各種實施例中，核鹼基可包括5-甲基胞嘧啶取代，已展示該等取代使核酸雙螺旋穩定性增加0.6-1.2℃。
在一些實施例中，經修飾或經取代核鹼基適用於便於反義寡核苷酸之純化。舉例而言，在某些實施例中，反義寡核苷酸可含有三個或更多個(例如，3、4、5、6或更多個)連續鳥嘌呤鹼基。在某些反義寡核苷酸中，一串三個或更多個連續鳥嘌呤鹼基可引起寡核苷酸之凝聚、併發純化。在此類反義寡核苷酸中，連續鳥嘌呤中之一或多者可經次黃嘌呤取代。用於一串三個或更多個連續鳥嘌呤鹼基中之一或多個鳥嘌呤之次黃嘌呤之取代可降低反義寡核苷酸之凝聚，由此便於純化。
合成本文中所提供之寡核苷酸且該等寡核苷酸不包括生物學來源之反義組合物。本發明之分子亦可與其他分子、分子結構或化合物之混合物(例如，脂質體、受體靶標分子、經口調配物、直腸調配物、局部調配物或其他調配物)混合、囊封、共軛或以其他方式聯合使用，用於輔助攝取、分佈或吸收，或其一組合。
術語「互補(complementary及complementarity)」係指鹼基配對法則相關之寡核苷酸(亦即，核苷酸序列)。舉例而言，序列「T-G-A (5'-3')」與序列「T-C-A (5'-3')」互補。互補可為「不完全的」，其中僅一些核酸之鹼基根據鹼基配對法則匹配。或，在核酸之間可存在「完全」、「總體」或「完美」 (100%)的互補。核酸股之間的互補程度對核酸股之間的雜交之效率及強度具有顯著影響。同時通常需要完美的互補，一些實施例可包括關於靶標RNA之一或多個但較佳地6、5、4、3、2或1個錯配。此類雜交可同與靶標序列之反義寡聚物「幾乎」或「實質上」互補以及準確互補發生。在一些實施例中，寡聚物可與靶標序列以約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%互補來雜交。包括在寡聚物內之任何位置處之變化。在某些實施例中，靠近寡聚物之末端之序列中之變化通常比在內部中之變化更佳，且若存在通常在5'末端、3'末端或兩末端之約6、5、4、3、2或1個核苷酸內。
術語「肽」係指包含複數個經連接胺基酸之化合物。可將本文中所提供之肽視為細胞穿透肽。
術語「細胞穿透肽」及「CPP」可交換使用，且係指陽離子型細胞穿透肽，亦稱為轉運肽、載體肽或肽轉導結構域。本文中所提供之肽具有在指定細胞培養群體之100%細胞內誘導細胞穿透性之能力且可以讓大分子在全身投與後在活體內之多個組織內位移。在各種實施例中，本發明之CPP實施例可包括如下文進一步描述之富含精胺酸的肽。
如本文中所使用，術語「嵌合肽」係指包含為第一肽或其片段之第一部分，與為不同肽或其片段之第二部分稠合，與第三部分稠合的多肽，依此類推。嵌合肽可包括2、3、4、5或更多個共價連接肽。肽可經由胺基酸側鏈、N末端、C末端或其任何組合共價連接。在某些實施例中，肽經由一個肽之N末端共價連接至另一個肽之C末端。在某些實施例中，共價連接子為醯胺鍵。
如本文中所使用，術語「兩親媒性肽」係指具有基本上帶電荷胺基酸及基本上不帶電荷胺基酸之分離區域的肽。此等區域分別被稱為親水性肽基片段及疏水性肽基片段。
如本文中所使用，術語「寡精胺酸肽」係指其中肽係全由精胺酸或主要由精胺酸胺基酸殘基構成之肽。在某些實施例中，肽係全由精胺酸胺基酸殘基構成。在某些實施例中，肽係由50-99%精胺酸胺基酸殘基且間雜胺基酸連接子(例如但不限於胺基己酸或β-丙胺酸)構成。在某些實施例中，肽係由75%精胺酸胺基酸殘基且間雜有胺基酸連接子(例如但不限於胺基己酸或β-丙胺酸)構成。
術語「治療」係指用於改善疾病之一或多個特定過程應用。在某些實施例中，該特定過程為投與一或多種醫藥劑。個體(例如，哺乳動物，諸如人類)或細胞之「治療」為用於試圖改變個體或細胞之天然病程的任何類型之干預。治療包括(但不限於)投與醫藥組合物，且可以預防性執行或在開始出現病理性事件或接觸病原體之後執行。治療包括對疾病或病況之症狀或病變之任何所需效應，且可包括例如所治療疾病或病況之一或多個可量測標記中之最小變化或改善。亦包括「預防性」治療，其可針對降低所治療疾病或病況之惡化速率、延緩疾病或病況之發作、或降低其發作之嚴重程度。
「有效量」或「治療有效量」係指作為單次劑量或作為一系列劑量之部分投與至哺乳動物個體的治療性化合物(諸如反義寡聚物)之量，該量有效地產生所需治療性效應。
術語「改善」意謂減輕至少一個病況或疾病指標之嚴重程度。在某些實施例中，改善包括延遲或遲緩一或多個病況或疾病指標之惡化。指標之嚴重程度可藉由熟習此項技術者已知之主觀量測或客觀量測來測定。
如本文所使用，「醫藥學上可接受之鹽」係指所揭示寡核苷酸之衍生物，其中母體寡核苷酸藉由將現有酸或鹼部分轉換為其鹽形式而經修飾。適合鹽之清單可見於Remington's Pharmaceutical Sciences, 第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, 第1418頁及Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977)，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。
嵌合肽 - 寡核苷酸共軛物 本文提供以化學方式連接至嵌合細胞穿透肽之寡核苷酸。嵌合細胞穿透肽增強寡核苷酸之活性、細胞分佈或細胞攝取。具體而言，嵌合細胞穿透肽包含兩親媒性肽及寡精胺酸肽。寡核苷酸另外可以化學方式連接至進一步增強寡核苷酸之活性、細胞分佈或細胞攝取的一或多個雜烷基部分(例如，聚乙二醇)。在一個例示性實施例中，嵌合細胞穿透肽在其N末端或C末端殘基處共價偶合至寡核苷酸之任一端或兩端。
因此，在一個態樣中，本文提供一種式I之嵌合肽-寡核苷酸共軛物：
Figure 02_image025
或其醫藥學上可接受之鹽， 其中： A'選自-NHCH2 C(O)NH2 、-N(C1-6 -烷基)CH2 C(O)NH2 、
Figure 02_image027
，其中 R5 為-C(O)(O-烷基)x -OH，其中x為3-10，且各烷基在每次出現時獨立地為C2-6 -烷基， 或R5 選自-C(O)C1-6 -烷基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、-(C1-6 -烷基)-R6 、-(C1-6 -雜烷基)-R6 、芳基-R6 、雜芳基-R6 、-C(O)O-(C1-6 -烷基)-R6 、-C(O)O-芳基-R6 、-C(O)O-雜芳基-R6 ，以及
Figure 02_image029
； 其中R6 選自OH、SH及NH2 ，或R6 為O、S或NH，其中之每一者共價連接至固體擔體； 各R1 獨立地選自OH及-N(R3 )(R4 )，其中各R3 及R4 在每次出現時獨立地為-C1-6 -烷基； 各R2 獨立地選自H、核鹼基及經化學保護基團官能化之核鹼基，其中核鹼基在每次出現時獨立地包含選自吡啶、嘧啶、三嗪、嘌呤及去氮-嘌呤之C3-6 -雜環； z為8-40；及 E'選自H、-C1-6 -烷基、-C(O)C1-6 -烷基、苯甲醯基、硬脂醯基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、
Figure 02_image031
； 其中 Q為-C(O)(CH2 )6 C(O)-或-C(O)(CH2 )2 S2 (CH2 )2 C(O)-； R7 為-(CH2 )2 OC(O)N(R8 )2 ，其中R8 為-(CH2 )6 NHC(=NH)NH2 ； L為-C(O)(CH2 )1-6 -C1-6 -雜芳基-(CH2 )1-6 C(O)，其中L藉由醯胺鍵共價連接至J之胺基末端； J為2、3、4或5個共價連接之細胞穿透肽； G選自H、-C(O)C1-6 -烷基、苯甲醯基及硬脂醯基，其中G藉由醯胺鍵共價連接至J之羧基末端；以及 其中以下條件中之至少一者為真實的： 1) A'為
Figure 02_image011
；或2)E'為
Figure 02_image013
。
在一個實施例中，J為2、3、4或5個共價連接之細胞穿透肽，且該等細胞穿透肽獨立地為兩親媒性肽或寡精胺酸肽。
在一些實施例中，該等細胞穿透肽中之至少一者為兩親媒性肽，且該等細胞穿透肽中之至少一者為寡精胺酸肽。
在某些實施例中，該等細胞穿透肽中之一者為兩親媒性肽，且該等細胞穿透肽中之一者為寡精胺酸肽。
在又一實施例中，J為兩個共價連接之細胞穿透肽。
在另一實施例中，J為兩個共價連接之細胞穿透肽，其中該兩個細胞穿透肽獨立地為兩親媒性肽或寡精胺酸肽。
在再一實施例中，J為兩個共價連接之細胞穿透肽，其中該等細胞穿透肽中之一者為兩親媒性肽，且該等細胞穿透肽中之一者為寡精胺酸肽。
在又一實施例中，J為兩個共價連接之細胞穿透肽，其中該兩個細胞穿透肽包含一個兩親媒性肽及一個寡精胺酸肽，且其中該寡精胺酸肽為J之C末端，且該兩親媒性肽為J之N末端。
在另一實施例中，J為藉由醯胺鍵共價連接之兩個共價連接之細胞穿透肽。
在一實施例中，寡精胺酸肽包含序列[(RYz R)x ]，其中R為精胺酸，Y獨立地選自胺基己酸(X)或B-丙胺酸(B)，z為1，且x為1、2、3、4或5。
在再一實施例中，寡精胺酸包含序列[(RXR)(RBR)]x 或[(RBR)(RXR)]x ，其中R為精胺酸，X為胺基己酸，B為B-丙胺酸，且x為1或2。
在另一實施例中，寡精胺酸肽為[(RXR)(RBR)]2 (Bpep)。
在一實施例中，兩親媒性肽包含疏水性肽基片段及親水性肽基片段，其中該疏水性肽基片段包含獨立地選自甘胺酸、異白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之2至10個胺基酸序列，且其中該親水性肽基片段包含獨立地選自帶電荷胺基酸、不帶電荷極性胺基酸或疏水性胺基酸之2-20個胺基酸序列，其中親水性肽基片段包含至少一個非疏水性胺基酸。
在另一實施例中，疏水性片段包含獨立地選自甘胺酸、異白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、苯丙胺酸或色胺酸之2至10個胺基酸序列。
在一實施例中，親水性(hydrophophilic)片段包含獨立地選自精胺酸、離胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸或甘胺酸之2至20個胺基酸序列，其中親水性肽基片段包含至少一個非疏水性胺基酸。
在另一實施例中，其中兩親媒性肽為pVEC、穿膜肽或蜂毒肽。
在另一實施例中，兩親媒性肽為穿膜肽。
在另一實施例中，J為穿膜肽-Bpep (RQIKIWFQNR RMKWKKRXRR BRRXRRBR)、pVEC-Bpep(LLIILRRRIR KQAHAHSKRX RRBRRXRRBR)、蜂毒肽-Bpep (GIGAVLKVLT TGLPALISWI KRKRQQRXRR BRRXRRBR)或Bpep-Bpep (RXRRBRRXRR BRRXRRBRRX RRBR)，其中X為胺基己酸，且B為β-丙胺酸。
在再一實施例中，J為穿膜肽-Bpep (RQIKIWFQNR RMKWKKRXRR BRRXRRBR)、pVEC-Bpep (LLIILRRRIR KQAHAHSKRX RRBRRXRRBR)或蜂毒肽-Bpep (GIGAVLKVLT TGLPALISWI KRKRQQRXRR BRRXRRBR)，其中X為胺基己酸，且B為β-丙胺酸。
在又一實施例中，J為穿膜肽-Bpep (RQIKIWFQNR RMKWKKRXRR BRRXRRBR)，其中X為胺基己酸，且B為β-丙胺酸。
在一實施例中，E'選自H、-C1-6 -烷基、-C(O)C1-6 -烷基、苯甲醯基、硬脂醯基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基及
Figure 02_image035
。
在另一實施例中，A'選自-N(C1-6 -烷基)CH2 C(O)NH2 、
Figure 02_image037
。
在另一實施例中，E'選自H、-C(O)CH3 、苯甲醯基、硬脂醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基及
Figure 02_image039
。
在一實施例中，A'選自-N(C1-6 -烷基)CH2 C(O)NH2 、
Figure 02_image041
；及 E'為
Figure 02_image043
。
在另一實施例中，A'為
Figure 02_image045
，及 E'選自H、-C(O)CH3 、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基及硬脂醯基。
在一實施例中，式I之嵌合肽-寡核苷酸共軛物為式Ia之嵌合肽-寡核苷酸共軛物：
Figure 02_image047
。
在一實施例中，式I之嵌合肽-寡核苷酸共軛物為式Ib之嵌合肽-寡核苷酸共軛物：
Figure 02_image049
其中E'選自H、C1-6 -烷基、-C(O)CH3 、苯甲醯基及硬脂醯基。
在式I、Ia及Ib之再一實施例中，各R1 為N(CH3 )2 。
在式I、Ia及Ib之又一實施例中，各R2 為核鹼基，其中核鹼基在每次出現時獨立地包含選自吡啶、嘧啶、三嗪、嘌呤及去氮-嘌呤之C4-6 -雜環。
在式I、Ia及Ib之另一實施例中，各R2 為核鹼基，其中核鹼基在每次出現時獨立地包含選自嘧啶、嘌呤及去氮嘌呤之C4-6 -雜環。
在式I、Ia及Ib之再一實施例中，各R2 為在每次出現時獨立地選自以下之核鹼基：腺嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、7-去氮腺嘌呤、鳥嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、次黃嘌呤、胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶及次黃嘌呤。
在式I、Ia及Ib之又一實施例中，各R2 為在每次出現時獨立地選自以下之核鹼基：腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶及次黃嘌呤。
在式I、Ia及Ib之另一實施例中，L為-C(O)(CH2 )1-6 -三唑-(CH2 )1-6 C(O)-。
在式I、Ia及Ib之另一實施例中，L為
Figure 02_image051
。
在式I、Ia及Ib之另一實施例中，G選自H、C(O)CH3 、苯甲醯基及硬脂醯基。
在式I、Ia及Ib之再一實施例中，G為H或-C(O)CH3 。
在式I、Ia及Ib之又一實施例中，G為H。
在式I、Ia及Ib之又一實施例中，G為-C(O)CH3 。
在式I、Ia及Ib之又一實施例中，相較於未共軛寡核苷酸，嵌合寡核苷酸-肽共軛物顯示改善攝取至少20倍。
在一實施例中，相較於未嵌合寡核苷酸-肽共軛物，嵌合寡核苷酸-肽共軛物顯示改善攝取至少兩倍。
在另一實施例中，相較於對應未嵌合穿膜肽-肽共軛物，嵌合寡核苷酸-肽共軛物顯示改善攝取。
本發明之代表性肽-寡核苷酸共軛物尤其包括以下結構之嵌合肽-寡核苷酸共軛物：
Figure 02_image053
或其醫藥學上可接受之鹽，其中 G為H或-C(O)CH3 ，其中G共價連接至肽之羧基末端； R2 為在每次出現時獨立地選自以下之核鹼基：腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶及次黃嘌呤； z為8-40；及 CP在每次出現時獨立地選自穿膜肽-Bpep (RQIKIWFQNR RMKWKKRXRR BRRXRRBR)、pVEC-Bpep (LLIILRRRIR KQAHAHSKRX RRBRRXRRBR)、蜂毒肽-Bpep (GIGAVLKVLT TGLPALISWI KRKRQQRXRR BRRXRRBR)或Bpep-Bpep (RXRRBRRXRR BRRXRRBRRX RRBR)，其中X為胺基己酸，且B為β-丙胺酸。
在本發明之嵌合肽-寡核苷酸共軛物之一個實施例中，G為H。
在本發明之嵌合肽-寡核苷酸共軛物之另一實施例中，G為-C(O)CH3 。
在一實施例中，L共價連接至肽之羧基末端，且G共價連結至肽之胺基末端。
如本文中所使用，「G藉由醯胺鍵共價連接至J之羧基末端」指示J之羧基末端(-COOH)經由N(H)基團共價鍵結至不同G，其中J之羧基末端之羥基經N(H)替換。舉例而言，當G為H時，以下結構由J及G形成：
Figure 02_image055
在一些實施例中，本文所描述之嵌合肽-寡核苷酸共軛物為未溶劑化的。在其他實施例中，嵌合肽-寡核苷酸共軛物中之一或多種呈溶劑化形式。如此項技術中已知，溶劑合物可為醫藥學上可接受之溶劑中之任一者，諸如水、乙醇及類似者。
儘管式I、Ia、Ib、II、IIa及IV之嵌合肽-寡核苷酸共軛物以其中性形式描繪，但在一些實施例中，此等肽-寡核苷酸共軛物以醫藥學上可接受之鹽形式使用。
寡核苷酸 基於嗎啉基之亞單位之重要特性包括：1)藉由穩定不帶電荷或帶正電荷之主鏈鍵以寡聚形式連接的能力；2)支撐核苷酸鹼基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸苷、尿嘧啶、5-甲基-胞嘧啶及次黃嘌呤)以使得所形成之聚合物可與互補鹼基靶標核酸(包括靶標RNA，TM 值在相對較短之寡核苷酸(例如10-15個鹼基)中高於約45℃)雜交的能力；3)寡核苷酸主動地或被動地轉運至哺乳動物細胞中的能力；及4)寡核苷酸及寡核苷酸:RNA異雙螺旋分別抵抗RNA酶及RNase H降解的能力。
形成於寡聚物與靶標序列之間的雙螺旋之穩定性為結合TM 與雙螺旋對細胞酶促裂解之易感性的功能。寡聚物關於互補序列RNA之TM 可藉由習知方法來量測，該等方法諸如由Hames等人, Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, 1985, 第107-108頁所描述或如Miyada C. G.及Wallace R. B., 1987, Oligomer Hybridization Techniques, Methods Enzymol, 第154卷, 第94-107頁中所描述之彼等。在某些實施例中，反義寡聚物可具有高於體溫且在一些實施例中高於約45℃或50℃之結合TM (關於互補序列RNA)。亦包括在60-80℃或更高範圍內之TM 。根據公認原理：寡聚物(關於基於互補之RNA雜交)之TM 可藉由增加雙螺旋中之C:G配對鹼基之比率或藉由增加異雙螺旋之長度(鹼基對長度)或兩者而增加。同時，出於最佳化細胞攝取之目的，限制寡聚物之大小可為有利的。出於此原因，本發明之化合物包括在25個鹼基或更小之長度下展示高TM (45-50℃或更高)之化合物。
寡聚物之長度可變化，只要其能夠選擇性地結合至在前體mRNA分子內之意欲位置。此類序列之長度可根據本文所描述之選擇程序來測定。大體而言，寡核苷酸應為約8個核苷酸長度至多約50個核苷酸長度。舉例而言，寡核苷酸(z)之長度可為8-38、8-25、15-25、17-21、20-25、20-30、18-23、19-24、21-26、22-27、23-28、24-29、25-30、26-31或約18。在一些實施例中，長度可為10、11、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31個核苷酸。然而，應瞭解，可在本文所描述之方法中使用此等範圍內的任何長度之核苷酸。
在一些實施例中，反義寡核苷酸含有鹼基修飾或取代。舉例而言，可選擇某些核鹼基以增加本文所描述之反義寡核苷酸之結合親和性。此等核鹼基包括5位經取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及0-6位經取代之嘌呤，其包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶及2,6-二胺基嘌呤。5-甲基胞嘧啶取代經展示將核酸雙螺旋穩定性增加了0.6-1.2℃，且可併入至本文所描述之反義寡核苷酸中。在一個實施例中，寡核苷酸之至少一個嘧啶鹼基包含5位經取代之嘧啶鹼基，其中嘧啶鹼基選自由以下組成之群：胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶。在一個實施例中，5位經取代之嘧啶鹼基為5-甲基胞嘧啶。在另一實施例中，寡核苷酸之至少一個嘌呤鹼基包含N-2、N-6經取代之嘌呤鹼基。在一個實施例中，N-2、N-6經取代之嘌呤鹼基為2,6-二胺基嘌呤。
基於嗎啉基之寡聚物(包括反義寡聚物)及其合成詳見於(例如)美國專利第5,698,685號、第5,217,866號、第5,142,047號、第5,034,506號、第5,166,315號、第5,185,444號、第5,521,063號、第5,506,337號及待審中美國專利申請案第12/271,036號、第12/271,040號；PCT公開案第WO/2009/064471、第WO/2012/043730號、第WO 2017/205513號、第WO 2017205879號、第WO 2017/205880號，及Summerton等人，1997，Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 7, 187-195，其以引用之方式併入本文中。
因此在一個態樣中，本文提供式II之寡核苷酸：
Figure 02_image057
或其醫藥學上可接受之鹽， 其中 A選自由以下組成之群：OH、-NHCH2 C(O)NH2 、-N(C1-6 -烷基)CH2 C(O)NH2 、
Figure 02_image059
； R5 為-C(O)(O-烷基)x OH，其中x為3-10，且各烷基在每次出現時獨立地為-C2-6 -烷基，或R5 選自由以下組成之群：：-C(O)C1-6 -烷基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、-C1-6 -烷基-R6 、-C1-6 -雜烷基-R6 、芳基-R6 、雜芳基-R6 、-C(O)O-C1-6 -烷基-R6 、-C(O)O-芳基-R6 及-C(O)O-雜芳基-R6 ； R6 選自由以下組成之群：OH、SH及NH2 ，或R6 為共價連接至固體擔體之O、S或NH； 各R1 獨立地為OH或-NR3 R4 ； 各R3 及R4 在每次出現時獨立地為-C1-6 -烷基； 各R2 獨立地選自由以下組成之群：H、核鹼基及用化學保護基團官能化之核鹼基，其中核鹼基在每次出現時獨立地包含選自由以下組成之群的C3-6 -雜環：吡啶、嘧啶、三嗪、嘌呤及去氮嘌呤； z為8-40； E選自由以下組成之群：H、-C1-6 -烷基、-C(O)C1-6 -烷基、苯甲醯基、硬脂醯基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基及
Figure 02_image061
； Q為-C(O)(CH2 )6 C(O)-或-C(O)(CH2 )2 S2 (CH2 )2 C(O)-； R7 為-(CH2 )2 OC(O)N(R8 )2 ； R8 為-(CH2 )6 NHC(=NH)NH2 。
在式II之一個實施例中，A為
Figure 02_image063
； E選自由以下組成之群：H、-C(O)CH3 、苯甲醯基及硬脂醯基； R5 為-C(O)(O-烷基)x -OH，其中各烷基在每次出現時獨立地為-C2-6 烷基、三苯甲基及4-甲氧基三苯甲基；及 各R2 獨立地為核鹼基，其中核鹼基在每次出現時獨立地包含選自由以下組成之群的C4-6 雜環：吡啶、嘧啶、嘌呤及去氮嘌呤。
在式II之另一個實施例中，R5 為C(O)(O-CH2 CH2 )3 -OH；及 各R2 獨立地為核鹼基，其中核鹼基在每次出現時獨立地包含嘧啶或嘌呤。
在再一實施例中，式II之寡核苷酸為式IIa之寡核苷酸：
Figure 02_image065
。
在式II及IIa之一實施例中，R2 在每次出現時獨立地為腺嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶及次黃嘌呤；及 各R1 為-N(CH3 )2 。
表1中提供如本文所描述之核苷酸部分之各種實施例。表 1 ： 核苷酸部分之各種實施例。
Figure 02_image067
在一些實施例中，本文所描述之寡核苷酸為未溶劑化的。在其他實施例中，寡核苷酸中之一或多者呈溶劑化形式。如此項技術中已知，溶劑合物可為醫藥學上可接受之溶劑中之任一者，諸如水、乙醇及類似者。
儘管式II及IIa之寡核苷酸以其中性形式描繪，但在一些實施例中，此等寡核苷酸以醫藥學上可接受之鹽形式使用。
嵌合肽 本文中所提供之寡核苷酸包括與嵌合肽共軛之寡核苷酸部分。具體而言，嵌合肽為兩個共價連接之細胞穿透肽，且其中該兩個細胞穿透肽獨立地為兩親媒性肽或寡精胺酸肽。
在一些實施例中，兩個細胞穿透肽包含一個兩親媒性肽及一個寡精胺酸肽，且其中寡精胺酸肽為嵌合肽之C末端，且兩親媒性肽為嵌合肽之N末端。
在一些實施例中，該等細胞穿透肽中之至少一者為兩親媒性肽，且該等細胞穿透肽中之至少一者為寡精胺酸肽。
在某些實施例中，該等細胞穿透肽中之一者為兩親媒性肽，且該等細胞穿透肽中之一者為寡精胺酸肽。
以下展示此類嵌合肽之表示：
Figure 02_image069
其中N末端共價連接至寡核苷酸。
在特定實施例中，兩個共價連接之細胞穿透肽藉由醯胺鍵共價連接。
在一些實施例中，嵌合肽可有效促進將化合物轉運至細胞中。轉運部分在一些實施例中連接至寡聚物之末端。肽具有誘導細胞穿透在給出細胞培養群體之30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100% (包括其間之所有整數)細胞內之的性能，且允許在全身投與後在活體內之多個組織內的大分子移位。
相對於在不存在經附接轉運部分之情況下的寡聚物之攝取，已展示如上文所描述之轉運部分極大地增強經附接寡聚物之細胞進入。相對於未共軛化合物，可增強攝取至少三倍，且在一些實施例中增強50倍。在一些實施例中，相對於未嵌合寡核苷酸-肽共軛物，可增強攝取，且在一些實施例中增強三倍。
嵌合肽之使用特別適用於實踐本發明。已展示某些嵌合肽轉運體對將反義化合物遞送至包括肌肉細胞之初級細胞中為高度有效的。此外，本文中所描述之嵌合肽轉運體在與反義PMO共軛時顯示增強的更改數個基因轉錄物之剪接的能力。
因此，在一個態樣中，本文提供為2、3、4或5個共價連接之細胞穿透肽之嵌合肽，或其醫藥學上可接受之鹽。
在一實施例中，各嵌合肽為2、3、4或5個共價連接之細胞穿透肽，其中該等細胞穿透肽獨立地為兩親媒性肽或寡精胺酸肽。
在另一實施例中，各嵌合肽為兩個共價連接之細胞穿透肽。
在另一實施例中，各嵌合肽為兩個共價連接之細胞穿透肽，其中該兩個細胞穿透肽獨立地為兩親媒性肽或寡精胺酸肽。
在另一實施例中，各嵌合肽為兩個共價連接之細胞穿透肽，其中該等細胞穿透肽中之一者為兩親媒性肽，且該等細胞穿透肽中之一者為寡精胺酸肽。
在再一實施例中，各嵌合肽為兩個共價連接之細胞穿透肽，其中該兩個細胞穿透肽包含一個兩親媒性肽及一個寡精胺酸肽，且其中該寡精胺酸肽為J之C末端，且該兩親媒性肽為J之N末端。
在又一實施例中，各嵌合肽為藉由醯胺鍵共價連接之兩個共價連接之細胞穿透肽。
在另一實施例中，寡精胺酸肽包含序列[(RYz R)x ]，其中R為精胺酸，Y獨立地選自胺基己酸(X)或B-丙胺酸(B)，z為1，且x為1、2、3、4或5。
在又一實施例中，嵌合肽之寡精胺酸肽包含序列[(RXR)(RBR)]x 或[(RBR)(RXR)]x ，其中R為精胺酸，X為胺基己酸，B為B-丙胺酸，且x為1或2。
在再一實施例中，嵌合肽之寡精胺酸肽為[(RXR)(RBR)]2 (Bpep)。
在另一實施例中，嵌合肽之兩親媒性肽包含疏水性肽基片段及親水性肽基片段，其中該疏水性肽基片段包含獨立地選自甘胺酸、異白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之2至10個胺基酸序列，且其中該親水性肽基片段包含獨立地選自帶電荷胺基酸、不帶電荷極性胺基酸或疏水性胺基酸之2-20個胺基酸序列，其中該親水性肽基片段包含至少一個非疏水性胺基酸。
在一特定實施例中，疏水性片段包含獨立地選自甘胺酸、異白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、苯丙胺酸或色胺酸之2至10個胺基酸序列。
在一特定實施例中，親水性片段包含獨立地選自精胺酸、離胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸或甘胺酸之2至20個胺基酸序列，其中親水性肽基片段包含至少一個非疏水性胺基酸。
在一實施例中，嵌合肽之兩親媒性肽為pVEC、穿膜肽或蜂毒肽。
在一實施例中，嵌合肽之兩親媒性肽為穿膜肽。
在一實施例中，嵌合肽為穿膜肽-Bpep (RQIKIWFQNR RMKWKKRXRR BRRXRRBR)、pVEC-Bpep (LLIILRRRIR KQAHAHSKRX RRBRRXRRBR)、蜂毒肽-Bpep (GIGAVLKVLT TGLPALISWI KRKRQQRXRR BRRXRRBR)或Bpep-Bpep (RXRRBRRXRR BRRXRRBRRX RRBR)。
在一實施例中，嵌合肽為穿膜肽-Bpep (RQIKIWFQNR RMKWKKRXRR BRRXRRBR)、pVEC-Bpep (LLIILRRRIR KQAHAHSKRX RRBRRXRRBR)或蜂毒肽-Bpep (GIGAVLKVLT TGLPALISWI KRKRQQRXRR BRRXRRBR)。
在一實施例中，嵌合肽為穿膜肽-Bpep (RQIKIWFQNR RMKWKKRXRR BRRXRRBR)。
在一些實施例中，本文所描述之嵌合肽為未溶劑化的。在其他實施例中，嵌合肽中之一或多者呈溶劑化形式。如此項技術中已知，溶劑合物可為醫藥學上可接受之溶劑中之任一者，諸如水、乙醇及類似者。
儘管嵌合肽以其中性形式描繪，但在一些實施例中，此等寡核苷酸以醫藥學上可接受之鹽形式使用。
方法 本文提供治療有需要之個體之神經肌肉疾病、肌肉疾病、病毒感染或細菌感染的方法，其包含向該個體投與式I、Ia或Ib之肽-寡核苷酸共軛物。
因此，在一個態樣中，本文提供治療有需要之個體之肌肉疾病、病毒感染、神經肌肉疾病或細菌感染的方法，其包含向該個體投與本發明之嵌合肽-寡核苷酸共軛物。
在一個實施例中，肌肉疾病為杜興氏肌肉萎縮症。
在另一實施例中，病毒感染由選自由以下組成之群的病毒引起：馬堡病毒(marburg virus)、埃博拉病毒(ebola virus)、流感病毒及登革熱病毒(dengue virus)。
在另一實施例中，細菌感染由結核分枝桿菌引起。
本文中所考慮的個體通常為人類。然而，個體可為需要治療之任何哺乳動物。因此，本文所描述之方法可應用於人類應用及獸醫應用兩者。
投與 / 劑量 治療性組合物之調配物及其隨後投與(給藥)係在此項技術中之彼等之技能內。給藥視待治療之疾病病況之嚴重程度及回應而定，其中治療之病程持續數天至數月或直至實現疾病病況之充分減弱。最佳給藥時程可由患者體內之藥物堆積之量測值來計算。
一般熟習此項技術者可容易地判定最佳劑量、給藥方法及重複率。最佳劑量可視個體寡聚物之相對濃度而變化，且可大體上基於EC50 s (被認為係在活體外及活體內動物模式中有效)來評估。大體而言，劑量為0.01 μg/kg體重至100 g/kg體重，且可以每天一次或更多次、每週一次或更多次、每月一次或更多次或每年一次或更多次或甚至每2年至20年一次給出。基於所量測駐留時間及體液或組織中之藥物之濃度，一般熟習此項技術者可容易地評估給藥之重複率。在成功治療之後，可能需要使患者進行維持治療以防止疾病病況復發，其中以維持劑量(介於0.01 μg/kg體重至100 g/kg體重之範圍內，每天一次或更多次至每20年一次)投與寡聚物。
在一些實施例中，寡核苷酸(式II或IIa之寡核苷酸)經單獨投與。
在一些實施例中，以治療有效量或治療劑量投與寡核苷酸。「治療有效量」為式II或IIa之寡核苷酸本身在投與患者時有效治療肌肉疾病、病毒感染或細菌感染的量。在指定案例中，證明對特定患者之「治療有效量」的量可能不會對在類似背景下接受治療疾病或病況之患者為100%有效，儘管此類劑量被熟習從業者認為係「治療有效量」。對應於治療有效量的寡核苷酸之量很大程度上視所治療疾病類型、疾病階段、患者之年齡及其他事實而定。
在不同實施例中，視式II或IIa之寡核苷酸及所使用之有效量而定，寡核苷酸可調節涉及肌肉疾病、病毒感染或細菌感染的基因之表現。
雖然式II或IIa之寡核苷酸之量應可以有效治療肌肉疾病、病毒感染或細菌感染，但該等量較佳不會對患者為過度毒性(亦即，該等量較佳為在醫學指導原則已確立之毒性限值內)。在一些實施例中，為預防毒性過量或提供更有效治療肌肉疾病、病毒感染或細菌感染，或兩者，提供總投藥劑量之限值。通常，本文中考慮之量為每天用量；然而，本文中亦考慮半天及兩天或三天之循環量。
可採用不同給藥方案來治療肌肉疾病、病毒感染或細菌感染。在一些實施例中，以日劑量(諸如，上文所述任一例示性劑量)投與一日一次、兩次、三次或四次，持續三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天或十天。視所治療之疾病之階段及嚴重程度而定，可伴隨較高劑量而採用較短治療時間(例如，至多五天)，或可伴隨較低劑量而採用較長治療時間(例如，十天或更多天、或數週、或一個月、或更長時間)。在一些實施例中，每隔一天投與一次或兩次日劑量。
呈純形式或適當醫藥組合物形式的式II及IIa之寡核苷酸或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物形式可經由此項技術中已知之任何公認投藥模式或藥劑投與。寡核苷酸可例如經口、經鼻、非經腸(靜脈內、肌肉內或皮下)、局部、經皮、陰道內、膀胱內、腦池內(intracistemally)或經直腸投與。劑型可例如為固體、半固體、凍乾粉末或液體劑型，諸如(例如)錠劑、丸劑、軟彈性膠囊或硬明膠膠囊、粉末、溶液、懸浮液、栓劑、噴霧劑或類似者，例如呈適合容易投與精確劑量之單位劑型。特定投與途徑為經口，尤其其中可根據待治療之疾病之嚴重程度調整便利的日劑量療程之途徑。
助劑及佐劑可包括(例如)保持劑、潤濕劑、懸浮劑、甜味劑、調味劑、芳香劑、乳化劑及調劑。防止微生物之作用大體上可藉由各種抗細菌藥劑或抗真菌藥劑(諸如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸及其類似者)來提供。亦可包括等滲劑(Isotonic agent)，諸如糖、氯化鈉及其類似者。可注射醫藥形式之延長吸收可藉由使用延緩吸收之藥劑(例如，單硬脂酸鋁及明膠)來實現。助劑亦可包括潤濕劑、乳化劑、pH緩衝劑及抗氧化劑，諸如(例如)檸檬酸、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羥基甲苯及其類似者。
可用溶衣及殼層(諸如，腸溶衣及此項技術中熟知之其他者)來製備固體劑型。其可含有鈍化藥劑且可具有其以經延緩方式在腸道之某一部分中釋放一或多種活性寡核苷酸的此類組合物。可使用之包埋組合物之實例為聚合物質及蠟。適當時，活性寡核苷酸亦可呈具有以上提及之賦形劑中之一或多者的微囊封形式。
用於經口投與之液體劑型包括醫藥學上可接受之乳化液、溶液、懸浮液、糊漿及酏劑。藉由將本文所描述之共軛物或其醫藥學上可接受之鹽及視情況選用之醫藥學上之佐劑溶解、分散等在載劑(諸如(例如)水、鹽水、水性右旋糖、甘油、乙醇及其類似者)、增溶劑及乳化劑(例如，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺)、油(特定言之，棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄欖油、蓖麻油及芝麻油、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇及脫水山梨糖醇之脂肪酸酯)或此等物質之混合物及其類似者中從而形成溶液或懸浮液來製備此類劑型。
大體而言，視意欲投與模式而定，醫藥學上可接受之組合物將含有約1重量%至約99重量%之本文所描述之寡核苷酸，或其醫藥學上可接受之鹽，及99重量%至1重量%之醫藥學上可接受之賦形劑。在一個實例中，組合物將為在約5重量%及約75重量%之間的本文所描述之寡核苷酸，或其醫藥學上可接受之鹽，且其餘為適合醫藥賦形劑。
製備此類劑型之實際方法為熟習此項技術者已知或將顯而易見的。參照(例如) Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版(Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990)。套組
在其他實施例中，提供套組。根據本發明之套組包括包含寡核苷酸、肽、肽-寡核苷酸共軛物或本發明之組合物的封裝。在一些實施例中，套組包含根據式I、Ia或Ib之肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽。在其他實施例中，套組包含根據式II或IIa之寡核苷酸或其醫藥學上可接受之鹽。在另其他實施例中，套組包含根據式III之肽或其醫藥學上可接受之鹽。
片語「封裝」意謂含有本文中所提出之寡核苷酸或組合物之任何容器。在一些實施例中，封裝可為盒或包裹。用於封裝醫藥產品之封裝材料為熟習此項技術者所熟知的。醫藥封裝材料之實例包括(但不限於)瓶子、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、針筒、瓶子及適用於所選調配物及意欲投與及治療模式之任何封裝材料。
套組亦可含有不含於封裝內但連接至封裝之外部的物件，例如吸液管。
套組可另外含有用於向患者投與本發明之寡核苷酸或組合物的說明書。套組亦可包含由諸如美國食品與藥物管理局(United States Food and Drug Administration)之調控機構審批通過的本文中之寡核苷酸之用途的說明書。套組亦可含有寡核苷酸之標記或產品插頁。封裝或任何產品插頁或兩者可自身由調控機構審批通過。套組可包括封裝中之呈固相或呈液相(諸如所提供之緩衝液)之寡核苷酸。套組亦可包括用於製備用以進行該等方法之溶液的緩衝液及用於將液體自一個容器轉移至另一個容器的吸液管。
實例 下文闡述實例出於說明之目的且描述本發明之某些特定實施例。然而，申請專利範圍之範疇不以任何方式受本文中所闡述之實例限制。所揭示實施例之各種改變及修改對熟習此項技術者將為顯而易見，且此等改變及修改，包括(但不限於)與本發明之化學結構、取代基、衍生物、調配物或方法相關者，可在不脫離本發明之精神及隨附申請專利範圍之範疇的情況下作出。本文流程之結構中變數之定義與本文所提式中對應位置之定義相稱。
由無規螺旋、寡精胺酸CPP與兩親媒性CPP構成之嵌合肽可改良PMO活性。若各CPP利用內吞作用之獨特機制，則嵌合體可能進入多種細胞進入機制。另外，不同CPP可對攝取下游之過程(諸如核內體逸出或核進入)具有有利效應。本文為幾種兩親媒性/寡精胺酸CPP嵌合體，其在生物學分析中展現協同並非累加的PMO功效增加。CPP嵌合體在此分析中對於PMO活性優於有效CPP標準(Bpep)。
在HeLa-654 eGFP分析中評估共軛物以分析嵌合CPP是否將改良PMO功效。在此分析中，HeLa細胞經eGFP序列穩定轉染，該eGFP序列間雜有人類β-血球蛋白基因(IVS2-654)之突變內含子。該突變產生一個隱性剪接位點，導致一個β-血球蛋白片段保留在eGFP mRNA序列中。在轉譯時，eGFP為非螢光的。共軛物中所利用之IVS2-654 PMO與該突變內含子雜交且防止異常基因剪接，產生編碼功能性螢光eGFP之eGFP mRNA序列。因此，所遞送PMO之量與所表現之功能性eGFP之量相關。
在含血清之介質中用5 μM之各共軛物處理HeLa 654 eGFP細胞。22小時之後，藉由流式細胞量測術分析細胞之螢光(圖1C)。所有四個CPP嵌合體效能優於Bpep，對於PMO遞送之一致高效能CPP。相較於未經處理之細胞的背景螢光，高效能嵌合體PMO-穿膜肽-Bpep在eGFP螢光方面具有大約70倍增加。作為參考，相對於未共軛PMO為改善超過20倍，且相對於PMO-Bpep為改善兩倍。
PMO-穿膜肽-Bpep及PMO-pVEC-Bpep兩者顯示協同作用，其中PMO-嵌合CPP之活性大於各PMO-CPP單獨預期活性之總和。舉例而言，在eGFP螢光方面，PMO-穿膜肽顯示7倍增加，且PMO-Bpep顯示35倍增加。對於PMO-穿膜肽-Bpep，累加效應將導致eGFP螢光之42倍增加。然而，PMO-穿膜肽-Bpep嵌合體在eGFP螢光方面具有幾乎70倍增加，意謂其效能約1.5倍大於累加效應。對於PMO-pVEC-Bpep亦觀測到類似協同作用，其中量測之eGFP螢光亦1.5倍大於此等部分之總和。
有趣的是，對於協同嵌合體(PMO-穿膜肽-Bpep及PMO-pVEC-Bpep)兩者，交換肽之順序減少觀測到之平均螢光(圖2A)。此觀測表明使Bpep作為C末端組分以觀測協同作用係至關重要的。
PMO活性之增加可或可不需要待共價連接的嵌合體之雙組分肽。在存在及不存在5 μM Bpep之情況下，用PMO-穿膜肽、PMO-pVEC、PMO-蜂毒肽及PMO-Bpep重複eGFP分析(圖2C)。在所有情況下，PMO-CPP共軛物在存在及不存在Bpep之情況下效能相同。此結果顯示共價連接兩個CPP為觀測活性之改良所必需的。eGFP HeLa細胞提供PMO活性之官能性分析，但許多機制步驟有助於此最終讀出。PMO共軛物中之任一者必須內化至細胞中，若出現內吞，則逸出核內體，定位至胞核，且結合至前體mRNA以產生任何效應。嵌合體之不同部分可輔助此等步驟中之一或多者。雖然考慮到所涉及之生物過程之複雜度來確鑿地顯示準確機制具挑戰性，但選擇一種模型嵌合體進行徹底研究以獲得額外見解。出於此目的選擇PMO-pVEC-Bpep，由於其顯示協同作用且不破壞電漿膜。此外，PMO-pVEC之不良效能使PMO-pVEC-Bpep之強效能成為出人意料且引人興趣之結果。
利用實驗進行機制研究以分析細胞攝取路徑。為檢查是否涉及與能量相關之路徑，在4℃相比於37℃下進行處理之後量測PMO活性。以脈衝-追蹤型式進行實驗，在該脈衝-追蹤型式中，HeLa eGFP細胞與5 mM PMO-pVEC、PMO-Bpep或PMO-pVEC-Bpep在4℃或37℃下一起培育3小時(圖3A)。接著，將處理介質更換為介質，且允許細胞再生長22小時。對於除PMO-Bpep外之所有化合物，當在4℃下處理時，存在eGFP螢光之減少。此結果表明與能量相關之機制與PMO-pVEC-Bpep嵌合體之攝取相關。對於PMO-Bpep結果尤其值得注意的是，在4℃下進行處理期間結合至細胞表面之任何共軛物隨後可經內化，且當在處理後在37℃下將細胞再培育22小時時觸發eGFP表現。
此外，研究多種內吞作用抑制劑對PMO-pVEC、PMO-Bpep及PMO-pVEC-Bpep內化至細胞中的影響(圖3B)。以脈衝-追蹤型式進行實驗，在該脈衝-追蹤型式中，將eGFP HeLa細胞與抑制劑一起預培育。在三十分鐘之預培育之後，添加肽且在三小時之後，用新制介質更換處理介質，且使細胞再生長22小時。大部分抑制劑無效。然而，在高濃度之氯丙嗪下，eGFP螢光在用PMO-pVEC-Bpep嵌合體處理之細胞中減少。在將氯丙嗪視為網格蛋白介導之內吞作用之抑制劑時，其可能亦會影響過程之下游組分。
除嵌合體之攝取中的網格蛋白介導之內吞作用的可能作用之外，由於未觀測到PMO-pVEC或PMO-Bpep之明顯減少，因此此等資料顯示嵌合體正在進入獨特內化機制。
最後，構築體用與eGFP正交之小分子有機染料標記，以允許同時監測化合物之攝取及官能性外顯子跳躍活性。此型式之實驗可幫助根據PMO功效將細胞內化去卷積。為製備此等化合物，pVEC、Bpep及pVEC-Bpep用序列之N末端上之半胱胺酸殘基合成，且如前所述接著用4-戊炔酸將所述末端封端。在藉由RP-HPLC純化之後，肽與等莫耳Sulfo-Cyanine5順丁烯二醯亞胺一起溶解於水中且藉由RP-HPLC再次純化。最後，標記有SulfoCy5之肽均經由銅催化之點擊化學(click chemistry)與PMO-疊氮化物共軛且藉由RP-HPLC純化。
使用經SulfoCy5標記之構築體，用eGFP HeLa細胞進行流式細胞量測術實驗。在含血清之介質中用5 μM之各共軛物處理細胞22小時，且接著藉由流式細胞量測術對其進行分析(圖4A)。對於eGFP螢光，使用488 nm激勵雷射及530 nm發射濾光片，且對於SulfoCy5，使用561 nm激勵雷射及695 nm發射濾光片。同時記錄來自兩個螢光團之溝道致能螢光的間距。未標記PMO-pVEC、PMO-Bpep及PMO-pVEC-Bpep經處理以測定螢光團是否擾亂所給共軛物之效應。在所有情況下，隨著螢光團附著，eGFP螢光略微下降，表明儘管螢光團可影響共軛物之功效，其為均勻的。
就SulfoCy5螢光而言，PMO-SulfoCy5-Bpep展現比PMO-SulfoCy5-pVEC或PMO-SulfoCy5-pVEC-Bpep更少的螢光。然而，PMO-SulfoCy5-Bpep具有用於促進eGFP表現之相對較高的能力。此結果表明儘管PMO-Bpep之整體細胞攝取小於PMO-pVEC，Bpep具有有益的下游效應。可能改良之核內體逸出、核進入、RNA結合或剪接修飾產生PMO-Bpep之相對較高的eGFP螢光。另一方面，PMO-SulfoCy5-pVEC具有高SulfoCy5螢光但不良eGFP表現，此指示化合物具有良好細胞攝取，但在下游之其他位置具有限制。pVEC-Bpep嵌合體展現最高eGFP表現及最高SulfoCy5螢光兩者，雖然SulfoCy5螢光處於與pVEC類似之規模。因此，嵌合體之協同作用之依據的假設為pVEC組分在不干擾Bpep之有益下游效應之情況下改善細胞攝取。
為進一步測試此假設及檢查材料針對核內體所處的位置，對HeLa eGFP細胞進行活細胞共焦顯微鏡成像實驗。除使用Rab5a-RFP融合蛋白質來標記早期核內體之外，使用與流式細胞量測術分析相同之處理條件。在處理後且在成像前十六小時，HeLa eGFP細胞利用桿狀病毒載體經Rab5a-RFP融合構築體瞬時轉染。得出的推論為，若PMO-SulfoCy5-pVEC因核內體截留而在觸發eGFP表現中具有不良功效，則RFP信號將與SulfoCy5信號共同定位。
成像資料與流式細胞量測術資料密切相關(圖4B)。利用PMO-SulfoCy5-pVEC及PMO-SulfoCy5-pVEC-Bpep兩者，明亮SulfoCy5信號聚集在斑點(punctae)中。一些SulfoCy5信號與RFP信號共同定位，從而顯示早期核內體的定位，而其他SulfoCy5斑點很可能為晚期核內體及溶酶體。此等影像提供內化之主要機制為內吞作用且核內體截流可限制某些構築體之PMO活性(不管大量細胞攝取)的其他跡象。
在本文中，機制研究表明，個別CPP可有助於不同元素之大分子遞送。亦表明，由CPP構成之嵌合肽可在PMO遞送及外顯子跳躍效率中展現協同改善。序列之相對定位影響攝取之程度，兩種肽必須為CPP，且其必須共價連接以觀測效應。
實例 1 ：用於肽製備及純化之通用方法 快速流動肽合成 使用自動化流動肽合成器在0.1-mmol規模上合成肽。將ChemMatrix Rink Amide HYR樹脂(200 mg)裝載至維持於90℃之反應器中。所有反應劑在引入至反應器中之前用HPLC泵以80 mL/min流動通過維持於90℃之不鏽鋼環。對於各偶合，將含有0.2 M胺基酸及0.2 M HATU於DMF中之10 mL溶液與200 µL二異丙基乙胺混合且遞送至反應器中。使用10.4 mL 20% (v/v)哌啶實現Fmoc移除。在各步驟之間，使用15 mL DMF洗滌反應器。最終偶合用4-戊炔酸，而非胺基酸但使用相同的條件進行。完成合成之後，用DCM洗滌樹脂3次且在真空下乾燥。
肽裂解及去保護 藉由用6 mL反應劑K (82.5%三氟乙酸、5%苯酚、5%水、5%苯硫基甲烷及2.5% 1,2-乙二硫醇(EDT))處理，使各肽同時進行整體側鏈去保護且自樹脂中裂解。在室溫下保持裂解16小時以確保完成移除Pbf。過濾裂解混合液以移除樹脂且藉由使N2鼓泡通過混合物來蒸發。接著添加約35 mL冷醚且經由離心三分鐘使粗產物粒化。再重複此醚研磨及離心兩次。在第三次洗滌之後，將集結粒再溶解於50%水及50%乙腈中且凍乾。
肽純化 溶劑A：含有0.1% TFA之水 溶劑B：含有0.1% TFA之乙腈
將凍乾肽溶解於最小體積之行動相(95% A，5% B)中。將溶液裝載至連接至基於質量之純化系統的逆相HPLC管柱(Agilent Zorbax SB C18管柱：9.4×250 mm，5 µm或Agilent Zorbax SB C3管柱：9.4×250 mm，5 µm)上。線性梯度以0.5% B/min自5% B運行至55% B。使用關於來自儀器之各溶離份的質量資料，僅合併且凍乾純溶離份。溶離份合併物之純度藉由LC-MS確認。
使用實例1之方案，合成圖1A及表2之肽。表 2 ： 細胞穿透肽
Figure 108108833-A0304-0001
 *X為胺基己酸，且B為β-丙胺酸。
實例 2 ：肽共軛
Figure 02_image071
將 5- 疊氮戊酸偶合至 PMO 之程序 將PMO IVS-654 (R2 = 5'-GCT ATT ACC TTA ACC CAG-3'; z = 18) (200 mg, 32 µmol)溶解於600 µL DMSO中。向溶液中添加含有用HBTU(320 µL含0.4 M HBTU之DMF，128 µmol)及含DIEA (22.3 µL，128 µmol)之244 µL DMF活化之4當量5-疊氮戊酸(13.6 µL，128 µmol)的溶液(最終反應物體積=1.2 mL)。使反應在用1 mL水及2 mL氫氧化銨淬滅之前進行25分鐘。氫氧化銨將水解在反應過程期間形成之任何酯。在1小時之後，溶液稀釋至40 mL且使用逆相HPLC (Agilent Zorbax SB C3管柱：21.2×100 mm，5 µm)及歷經58分鐘(1 % B/min)自2%至60% B (溶劑A：水；溶劑B：乙腈)的線性梯度來純化。使用關於來自儀器之各溶離份的質量資料，僅合併且凍乾純溶離份。溶離份合併物之純度藉由LC-MS確認。冷凍乾燥得到171 mg乾粉(84%產率)。
藉由疊氮化物 / 炔烴胡伊斯根環加成 (Huisgen Cycloaddition) 進行 PMO- 肽共軛的通用程序 使20 mL具有隔墊帽之閃爍瓶填充有肽炔烴(1.1 µmol)、ISV2-654疊氮化物(0.95 µmol)及溴化銅(0.05 mmol)。在經由隔墊添加約1 mL DMF之前用氮氣吹掃小瓶5分鐘以確保移除氧。使反應混合物渦旋1分鐘。在2小時之後，反應混合物用10 mL之50 mM Tris (pH 8)稀釋，且裝載至逆相HPLC管柱(Agilent Zorbax SB C3 9.4×50 mm，5 µm)上。歷經20分鐘使用5-45% B之線性梯度進行層析。溶劑A：5 mM乙酸銨，pH = 8於水中；溶劑B：5 mM乙酸銨(pH =8)於90%乙腈10%水中。使用關於來自儀器之各溶離份的質量資料，僅合併且凍乾純溶離份。溶離份合併物之純度藉由LC-MS確認。
實例 3 ： 螢光團共軛 對於螢光團標記之PMO-肽共軛物，有機染料在共軛之前連接至PMO。等莫耳SulfoCy5順丁烯二醯亞胺在1 mL H2 O中與含半胱胺酸之肽共軛。30分鐘後，反應藉由逆相HPLC使用如下純化：對於pVEC及pVEC-Bpep，歷經80分鐘使用5-45% B之線性梯度，且對於Bpep，歷經60分鐘使用1-31% B之線性梯度。移動相A：具有0.1% TFA之水。移動相B：具有0.1% TFA之乙腈。
實例 4 ： 流式細胞量測術 為測試嵌合肽-寡核苷酸共軛物之庫，進行GFP螢光之流式細胞量測術分析。在37℃及5% CO2 下將HeLa 654細胞維持在補充有10% (v/v)胎牛血清(FBS)及1% (v/v)青黴素-鏈黴素之MEM中。在處理前之十八小時，將細胞以5,000個細胞/孔之密度接種於96孔培養盤中的補充有10% FBS及1%青黴素-鏈黴素之MEM中。實驗當天，在磷酸鹽緩衝血清(PBS)中製備各PMO-肽共軛物之儲備液。儲備液之濃度藉由量測260 nm下之吸光率及使用168,700 L mol-1 cm-1 之消光係數來測定。在37℃及5% CO2 下，使細胞與濃度為5 µM之各各別共軛物在補充有10% FBS及1%青黴素-鏈黴素之MEM中一起培育22小時。接著，抽吸處理介質，將細胞與胰蛋白酶-EDTA 0.25%在37℃及5% CO2 下一起培育15 min，用PBS洗滌1次，且再懸浮於具有2% FBS及2 µg/mL碘化丙錠之PBS中。在BD LSRII流式細胞儀上進行流式細胞量測術分析。將門控應用於資料以確保排除對碘化丙錠為高度陽性或具有與主要細胞群體充分不同之正向/側向散射讀數的細胞。除用PMO-蜂毒肽-Bpep處理細胞之外，各直方圖含有至少3,000個門控事件。
結果展示於圖1C、圖2A、圖2B、圖2C及表3中。表 3 ： 與未共軛PMO及單CPP-PMO共軛物相比之嵌合肽-寡核苷酸共軛物
Figure 108108833-A0304-0002
實例 5 ：抑制劑實驗 為抑制各種內吞機制，進行脈衝-追蹤實驗。簡言之，將HeLa 654細胞以5,000個細胞/孔之密度接種於96孔培養盤中的補充有10% FBS及1%青黴素-鏈黴素之MEM中。第二天，細胞用呈指定濃度之各抑制劑處理。30分鐘後，PMO-肽共軛物以5 µM之濃度添加至各孔中。在37℃及5% CO2 下培育3小時之後，處理介質用新制介質(無抑制劑或PMO-肽)替換且使細胞在37℃及5% CO2 下再生長22小時。對於4℃實驗，在接種後的第二天，將細胞在4℃下預培育30分鐘，隨後將PMO-肽共軛物以5 µM之濃度添加至各孔中。在4℃下培育3小時之後，處理介質用新制介質替換且使細胞在37℃及5% CO2 下再生長22小時。接著如上文所描述進行樣本製備及流式細胞量測術。除用20 µM細胞遲緩素D處理之外，各直方圖含有至少3,000個門控事件。
結果展示於圖3A及圖3B中。
實例 6 ： 活細胞共焦成像 將HeLa 654細胞以5,000個細胞/孔之密度接種於#1.5蓋玻片玻璃下的96孔培養盤中的補充有10% FBS及1%青黴素-鏈黴素之MEM中。二十四小時之後，以5 µM之濃度將PMO-SulfoCy5-肽共軛物添加至各孔。在此後之六小時(成像前之十八小時)，將3 mL之CellLightTM 早期核內體-RFP (BacMam 2.0)添加至各孔(與30粒子/細胞對應)。為準備成像，抽吸處理介質，用PBS洗滌細胞兩次，細胞用2 mg/mL Hoescht之PBS染色10分鐘，隨後再進行兩次PBS洗滌。最後，使細胞在RPI自旋盤共焦顯微鏡上在PBS中成像。
結果展示於圖4A及圖4B中。
以引用方式之併入 貫穿本申請案所引用之所有參考文獻(包括文獻參考、頒予之專利、公開之專利申請案及同在申請中之專利申請案)之全部內容在此以全文引用之方式明確地併入本文中。除非另外定義，否則本文所使用之所有技術術語及科學術語與一般熟悉此項技術者通常已知之含義一致。
等效物 熟習此項技術者將認識到，或能夠僅使用習知實驗來確定本文中所描述之本發明之特定實施例的許多等效物。此類等效物意欲由隨附申請專利範圍涵蓋。
圖 1A) 展示本文所描述之四個細胞穿透肽嵌合體之胺基酸序列。圖 1B) 展示PMO嵌合體共軛物之通式結構。圖 1C) 展示顯示在用5 μM之各PMO肽共軛物連續處理22小時之後經穩定轉染之HeLa 654細胞群體之平均eGFP螢光的繪圖。圖 2A) 展示在eGFP分析量測之PMO肽共軛物之活性以及反相中之各嵌合體之活性。圖 2B) 展示用5 μM PMO、PMO-P15、PMO-Bpep或PMO-P15Bpep處理22小時之細胞的eGFP之平均螢光強度。P15為由15個脯胺酸胺基酸殘基組成之肽。圖 2C) 展示在存在或不存在5 μM Bpep之情況下用5 μM之各鹼基PMO-CPP處理22小時之HeLa 654細胞的eGFP平均螢光強度之比較。圖 3A) 展示在37℃或4℃下經處理細胞的eGFP平均螢光強度之繪圖。圖 3B) 展示用不同濃度之氯丙嗪處理之細胞的eGFP平均螢光強度之繪圖。圖 4A) 展示顯示在37℃下用5 μM PMO-SulfoCy5-pVEC、PMO-SulfoCy5-Bpep或PMO-SulfoCy5-pVEC-Bpep處理22小時之HeLa 654細胞的針對eGFP及SulfoCy5之每一各別通道之平均螢光強度的繪圖。圖 4B) 展示處理後的HeLa 654細胞之活細胞共焦顯微鏡影像。
Figure 108108833-A0101-11-0002-1

Claims (43)

  1. 一種式I之嵌合肽-寡核苷酸共軛物：
    Figure 03_image001
    或其醫藥學上可接受之鹽， 其中： A'選自-NHCH2 C(O)NH2 、-N(C1-6 -烷基)CH2 C(O)NH2 、
    Figure 03_image074
    ，其中 R5 為-C(O)(O-烷基)x -OH，其中x為3-10，且各烷基在每次出現時獨立地為C2-6 -烷基， 或R5 選自-C(O)C1-6 -烷基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、-(C1-6 -烷基)-R6 、-(C1-6 -雜烷基)-R6 、芳基-R6 、雜芳基-R6 、-C(O)O-(C1-6 -烷基)-R6 、-C(O)O-芳基-R6 、-C(O)O-雜芳基-R6 ，以及
    Figure 03_image076
    ； 其中R6 選自OH、SH及NH2 ，或R6 為O、S或NH，各共價連接至固體擔體； 各R1 獨立地選自OH及-N(R3 )(R4 )，其中各R3 及R4 在每次出現時獨立地為-C1-6 -烷基； 各R2 獨立地選自H、核鹼基及經化學保護基團官能化之核鹼基，其中核鹼基在每次出現時獨立地包含選自吡啶、嘧啶、三嗪、嘌呤及去氮-嘌呤之C3-6 -雜環； z為8-40；及 E'選自H、-C1-6 -烷基、-C(O)C1-6 -烷基、苯甲醯基、硬脂醯基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、
    Figure 03_image078
    ； 其中 Q為-C(O)(CH2 )6 C(O)-或-C(O)(CH2 )2 S2 (CH2 )2 C(O)-； R7 為-(CH2 )2 OC(O)N(R8 )2 ，其中R8 為-(CH2 )6 NHC(=NH)NH2 ； L為-C(O)(CH2 )1-6 -C1-6 -雜芳基-(CH2 )1-6 C(O)，其中L藉由醯胺鍵共價連接至J之胺基端； J為2、3、4或5個共價連接之細胞穿透肽； G選自H、-C(O)C1-6 -烷基、苯甲醯基及硬脂醯基，其中G藉由醯胺鍵共價連接至J之羧基端；以及 其中以下條件中之至少一者為真： 1) A'為
    Figure 03_image011
    ；或2)E'為
    Figure 03_image013
    。
  2. 如請求項1之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中J為2、3、4或5個共價連接之細胞穿透肽，且其中該等細胞穿透肽獨立地為兩親媒性肽或寡精胺酸肽。
  3. 如請求項1或2之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該等細胞穿透肽中之一者為兩親媒性肽，且該等細胞穿透肽中之一者為寡精胺酸肽。
  4. 如請求項1或2之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該等細胞穿透肽中之至少一者為兩親媒性肽，且該等細胞穿透肽中之至少一者為寡精胺酸肽。
  5. 如請求項1之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中J為兩個共價連接之細胞穿透肽。
  6. 如請求項1或2之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中J為兩個共價連接之細胞穿透肽，且其中該兩個細胞穿透肽獨立地為兩親媒性肽或寡精胺酸肽。
  7. 2及5中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中J為兩個共價連接之細胞穿透肽，且其中該等細胞穿透肽中之一者為兩親媒性肽，且該等細胞穿透肽中之一者為寡精胺酸肽。
  8. 2及5中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中J為兩個共價連接之細胞穿透肽，其中該兩個細胞穿透肽包含一個兩親媒性肽及一個寡精胺酸肽，且其中該寡精胺酸肽為J之C端，且該兩親媒性肽為J之N端。
  9. 2及5中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中J為藉由醯胺鍵共價連接的兩個共價連接之細胞穿透肽。
  10. 2及5中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該寡精胺酸肽包含序列[(RYz R)x ]，其中R為精胺酸，Y獨立地選自胺基己酸(X)或B-丙胺酸(B)，z為1，且x為1、2、3、4或5。
  11. 2及5中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該寡精胺酸肽包含序列[(RXR)(RBR)]x 或[(RBR) (RXR)]x ，其中R為精胺酸，X為胺基己酸，B為B-丙胺酸，且x為1或2。
  12. 2及5中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該寡精胺酸肽為[(RXR)(RBR)]2 (Bpep)。
  13. 2及5中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該兩親媒性肽包含疏水性肽基片段及親水性肽基片段，其中該疏水性肽基片段包含獨立地選自甘胺酸、異白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸的2至10個胺基酸之序列，且其中該親水性肽基片段包含獨立地選自帶電荷胺基酸、不帶電荷但極性胺基酸、或疏水性胺基酸的2至20個胺基酸之序列，其中該親水性肽基片段包含至少一個非疏水性胺基酸。
  14. 2及5中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該疏水性片段包含獨立地選自甘胺酸、異白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、苯丙胺酸或色胺酸的2至10個胺基酸之序列。
  15. 2及5中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該親水性(hydrophophilic)片段包含獨立地選自精胺酸、離胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸或甘胺酸的2至20個胺基酸之序列，其中該親水性肽基片段包含至少一個非疏水性胺基酸。
  16. 2及5中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該兩親媒性肽為pVEC、穿膜肽(penetratin)或蜂毒肽(mellitin)。
  17. 2及5中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該兩親媒性肽為穿膜肽。
  18. 2及5中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中J為穿膜肽-Bpep (RQIKIWFQNR RMKWKKRXRR BRRXRRBR)、pVEC-Bpep (LLIILRRRIR KQAHAHSKRX RRBRRXRR BR)、蜂毒肽-Bpep (GIGAVLKVLT TGLPALISWI KRKRQQRXRR BRRXRRBR)或Bpep-Bpep (RXRRBRRXRR BRRXRRBRRX RRBR)。
  19. 2及5中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中J為穿膜肽-Bpep (RQIKIWFQNR RMKWKKRXRR BRRXRRBR)、pVEC-Bpep (LLIILRRRIR KQAHAHSKRX RRBRRXRR BR)或蜂毒肽-Bpep (GIGAVLKVLT TGLPALISWI KRKRQQRXRR BRRXRRBR)。
  20. 2及5中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中J為穿膜肽-Bpep (RQIKIWFQNR RMKWKKRXRR BRRXRRBR)。
  21. 如請求項1之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中E'選自H、-C1-6 -烷基、-C(O)C1-6 -烷基、苯甲醯基、硬脂醯基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基，以及
    Figure 03_image082
    。
  22. 如請求項1之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中 A'選自-N(C1-6 -烷基)CH2 C(O)NH2 、
    Figure 03_image084
    。
  23. 如請求項1之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中E'選自H、-C(O)CH3 、苯甲醯基、硬脂醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基，以及
    Figure 03_image086
    。
  24. 如請求項1之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中A'選自-N(C1-6 -烷基)CH2 C(O)NH2 、
    Figure 03_image088
    ；及 E'為
    Figure 03_image090
    。
  25. 如請求項1之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中A'為
    Figure 03_image092
    ，以及 E'選自H、-C(O)CH3 、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基及硬脂醯基。
  26. 如請求項1之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該式I之肽-寡核苷酸共軛物為選自以下之肽-寡核苷酸共軛物：
    Figure 03_image094
    其中E'選自H、C1-6 -烷基、-C(O)CH3 、苯甲醯基及硬脂醯基。
  27. 如請求項1或26之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該肽-寡核苷酸共軛物係如式(Ia)。
  28. 如請求項1或26之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該肽-寡核苷酸共軛物係如式(Ib)。
  29. 2、5及21至26中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中各R1 為N(CH3 )2 。
  30. 2、5及21至26中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中各R2 為核鹼基，在每次出現時獨立地選自腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶及次黃嘌呤。
  31. 2、5及21至26中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L為-C(O)(CH2 )1-6 -三唑-(CH2 )1-6 C(O)-。
  32. 2、5及21至26中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L為
    Figure 03_image096
    。
  33. 2、5及21至26中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中G選自H、C(O)CH3 、苯甲醯基及硬脂醯基。
  34. 2、5及21至26中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中G為H或-C(O)CH3 。
  35. 2、5及21至26中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中G為H。
  36. 2、5及21至26中任一項之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中G為-C(O)CH3 。
  37. 如請求項1之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中相較於未共軛之寡核苷酸，該嵌合寡核苷酸-肽共軛物顯示改善攝取至少20倍。
  38. 如請求項1之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中相較於非嵌合之寡核苷酸-肽共軛物，該嵌合寡核苷酸-肽共軛物顯示改善攝取至少兩倍。
  39. 如請求項1之嵌合肽-寡核苷酸共軛物或其醫藥學上可接受之鹽，其中相較於應非嵌合之穿膜肽-肽共軛物，該嵌合寡核苷酸-肽共軛物顯示改善攝取。
  40. 一種嵌合組合物，其包含如請求項1至39中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，及至少一種醫藥學上可接受之載劑。
  41. 一種如請求項40之嵌合組合物之用途，其用於製造供治療疾病之藥物。
  42. 如請求項41之用途，其中該疾病為神經肌肉疾病。
  43. 如請求項42之用途，其中該神經肌肉疾病為杜興氏肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy)。
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