ITMI20131929A1 - Coniugato dell'acido folico e dell'indolo-3-carbinolo per uso medico - Google Patents

Coniugato dell'acido folico e dell'indolo-3-carbinolo per uso medico

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ITMI20131929A1
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Domenico Terenzio
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Description

“Coniugato dell’acido folico e dell’indolo-3-carbinolo per uso medico”
Descrizione
La presente invenzione riguarda un coniugato dell’indolo-3-carbinolo per uso medico e, in particolare, per la prevenzione e il trattamento di patologie neoplastiche, patologie infiammatorie, patologie cardiovascolari ed altre patologie, in particolare quelle riconducibili alla sindrome metabolica.
Tecnica nota
I farmaci anti-tumorali oggi impiegati nella terapia sono un gruppo eterogeneo di composti che inibiscono la crescita della neoplasia aventi struttura e meccanismi di azioni molto diversi. Un elemento comune, tuttavia, può essere riscontrato nell’elevata citotossicità, specialmente a carico dei tessuti caratterizzati da un’elevata proliferazione cellulare. Il limitato successo di una terapia farmacologica che impiega i composti tradizionali è anche dovuto ad una scarsa selettività nei confronti delle cellule cancerose, che riduce significativamente l’effetto curativo e produce effetti collaterali indesiderati su altri tessuti. Un altro problema è rappresentato dalla ridotta emivita dei composti, a causa di una rapida clearance renale e da una veloce inattivazione e degradazione enzimatica.
E’ pertanto nota l’esigenza di sviluppare nuovi farmaci ad attività anti-tumorale, che siano più selettivi, meno tossici e che siano caratterizzati da migliori proprietà farmacologiche.
Indolo-3-carbinolo
L’indolo-3-carbinolo (abbreviato I3C) è una sostanza naturale contenuta negli ortaggi della famiglia delle Cruciferae, soprattutto broccoli, cavolo bianco, cavolini di Bruxelles e cavolfiore. Nel 1997 è stato dimostrata la sua capacità di arrestare lo sviluppo del tumore al seno agendo positivamente sul metabolismo degli estrogeni ed interrompendo, come il tamoxifen, il ciclo cellulare.
L’indolo-3-carbinolo è inoltre in grado di regolare la dipendenza di molti tumori dagli ormoni, in quanto lega il recettore nucleare per estrogeni prevenendo la proliferazione cellulare indotta da questi ultimi.
In numerosi studi in vitro ed in vivo è stato possibile dimostrare che questo composto inibisce fino al 90% lo sviluppo delle cellule tumorali positive al recettore estrogeno. Anche nei carcinomi della mammella negativi al recettore estrogeno, la somministrazione di indolo-3-carbinolo inibisce la crescita delle cellule. In questo tipo di tumori il tamoxifen, però, non ha alcuna efficacia. In altri studi l’indolo-3-carbinolo ha dimostrato di poter sopprimere la crescita di varie cellule tumorali comprese le cellule tumorali del colon arrestando il ciclo cellulare in G1/S e inducendo apoptosi in vitro.
L’I3C svolge un ruolo di antagonista del recettore androgeno ed è in grado di inibire la proliferazione delle cellule tumorali nei casi di tumore della prostata. Inoltre, è un potente induttore del citocromo P450 ed interviene nel metabolismo degli estrogeni. Questi sembrano intervenire anche nella patogenesi della Papillomatosi Respiratoria Ricorrente.
Sono stati condotti studi clinici mediante l’utilizzo dell’I3C puro, come integratore dietetico, con buoni risultati per questa patologia.
In altri studi è stata valutata l’attività antiinfiammatoria in vivo e in vitro di I3C. L’indolo-3-carbinolo ha mostrato inibire l'espressione e l'attività della sintetasi inducibile dell'ossido nitrico (iNos) in cellule stimolate da LPS, valutando la produzione di nitriti e l’inibizione del rilascio di NO. La persistente produzione di ossido nitrico è infatti collegata al processo di infiammazione e conseguentemente a quello di cancerogenesi.
I3C attenua la produzione di altri mediatori proinfiammatori come IL-6 e IL-1β suggerendo che possa fornire una strategia terapeutica utile nel trattamento di varie malattie infiammatorie.
Il trattamento con I3C produce riduzione del peso corporeo e di accumulo di grasso e di macrofagi infiltrati nel tessuto adiposo dell'epididimo di topi obesi alimentati con dieta ricca in grassi. Queste riduzioni sono state associati ad una migliore tolleranza al glucosio.
É stato testato, inoltre, l’effetto antiaggregante piastrinico dell’I3C valutando l’inibizione dell’aggregazione indotta da ADP, collagene, adrenalina, acido arachidonico su campioni di sangue umano. I3C ha mostrato inibire in maniera dose dipendente l’aggregazione piastrinica indotta da collagene. In vivo l’I3C sopprime la morte di ratti con trombosi polmonare indotta da iniezione intravenosa di collagene e adrenalina.
Carrier
Il poli-(etilenglicole) (PEG) è un polimero sintetico lineare a bassa polidispersività costituito dalla ripetizione di unità ossietileniche.
Data la sua biocompatibilità ed atossicità trova largo impiego nel settore alimentare, cosmetico e farmaceutico.
Recettore dell’acido folico
Il recettore per la vitamina acido folico (FR), altrimenti conosciuto come proteina di membrana ad alta affinità per il folato, è una glicoproteina con un peso molecolare di circa 38 kDa. Nell’uomo sono state identificate tre isoforme, denominate α, β, γ/ γ’. Mentre un’elevata espressione di FR è stata frequentemente osservata in vari tipi di cancro umano, il recettore è generalmente assente nella maggior parte dei tessuti normali, con l’eccezione dei plessi corioidei, della placenta e a livelli più bassi in polmone, tiroide e reni. FR è frequentemente sovraespresso in cellule tumorali in coltura e in tumori epiteliali, in particolare nel carcinoma ovarico (90% dei casi), di cui costituisce anche un utile marker. Altri tipi di tumore sovraesprimono questo recettore, in particolare quello all’endometrio, al cervello, al polmone, al seno e al rene. L’isoforma FR-α è sovraespressa nei tumori maligni epiteliali, mentre quella FR-β in sarcomi e leucemie mieloidi, permettendo così il targeting ad un vasto numero di neoplasie. La FR-β è inoltre sovraespressa in monociti e macrofagi attivati rendendo il targeting molto utile anche nei processi infiammatori.
Va inoltre precisato come il recettore sia fisiologicamente presente solo nella membrana apicale delle cellule epiteliali, quindi, essendo questa inaccessibile al flusso sanguigno, la cellula è protetta dall’azione di farmaci derivatizzati con acido folico. Dopo la trasformazione maligna la polarità della cellula viene persa e il recettore diventa accessibile al flusso ematico.
Riassunto dell’invenzione
Gli svantaggi dei farmaci antitumorali noti e alcuni limiti di utilizzo dell’indolo-3-carbinolo (basso peso molecolare, instabilità in acqua ed in ambiente acido dello stomaco) sono superati dai composti farmaceutici della presente invenzione, i quali hanno dimostrato di essere particolarmente efficaci nella prevenzione e nel trattamento del cancro, delle patologie infiammatorie e cardiovascolari, e di altre patologie.
Oggetto dell’invenzione
In un primo oggetto, la presente invenzione descrive quindi nuovi composti farmaceutici rappresentati da coniugati dell’indolo-3-carbinolo.
Secondo un ulteriore aspetto, tali composti sono impiegati nel trattamento e nella prevenzione del cancro nell’uomo e nell’animale.
In un aspetto preferito, i coniugati dell’invenzione sono impiegati per il trattamento, e la prevenzione di carcinomi, sarcomi, linfomi, melanomi, mesoteliomi, leucemie, mielomi ed altre patologie neoplastiche.
In particolare, i coniugati dell’invenzione sono impiegati per il trattamento e la prevenzione del cancro al seno, al colon, alla prostata, al polmone, al naso, alla gola, al cervello e all’ovaio.
In un ulteriore aspetto, i coniugati dell’invenzione trovano impiego nel trattamento di malattie infiammatorie, grazie alla soppressione esercitata sull’attività dei macrofagi attivati.
In un altro aspetto, i coniugati dell’invenzione, stabilizzando l'I3C possono trovare impiego sia in ambito di prevenzione primaria che secondaria di patologie cardiovascolari.
In un ulteriore aspetto, i coniugati dell’invenzione trovano impiego come antiossidanti in grado di prevenire diverse patologie associate allo stress ossidativo.
In un oggetto dell’invenzione è descritto un processo per la preparazione dei coniugati dell’indolo-3-carbinolo o di suoi derivati.
Inoltre, è descritta una composizione farmaceutica o nutraceutica comprendente uno o più dei coniugati dell’invenzione.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
Secondo un primo oggetto dell’invenzione sono descritti coniugati dell’indolo-3-carbinolo, o di un suo derivato, di formula generale:
Bx-(S)y-L-(S’)z–Dn(I)
in cui:
B è la sostanza targettante scelta fra vitamine, peptidi, peptidi tumorali specifici, aptameri specifici delle cellule tumorali, carboidrati specifici delle cellule tumorali, anticorpi monoclonali o policlonali, frammenti di anticorpi, proteine espresse sulle cellule tumorali metastatiche, piccole molecole organiche derivate da librerie combinatoriali. In un aspetto preferito della presente invenzione B è rappresentato da acido folico (F);
x può essere 0 o 1 o 2 e, preferibilmente, 0 o 1; S è rappresentato preferibilmente da lisina (Lys) che può avere funzione di spaziatore quando L è un carrier omobifunzionale oppure S è rappresentato da uno spaziatore bifunzionale comprende due funzioni attivabili o derivatizzabili come l’acido L-2-amminoadipico (AD);
y è 0, oppure è 1 quando L è un carrier omofunzionale;
L è un carrier. In un aspetto preferito, L è una forma derivatizzzata del polietilenglicole (qui a seguito abbreviato PEG o (PEG)n), o di un suo derivato come ad esempio il mono-metossi-polietilenglicole (mPEG). L può essere omobifunzionale (ad esempio, HOOC-(PEG)n-COOH) oppure eterobifunzinale (ad esempio, H2N-(PEG)n-COOH) a seconda del fatto che porti o no alle estremità uno stesso gruppo reattivo (carbossile protetto con estere o no o ammina) eventualmente opportunamente attivato. Il carrier può essere a diverso grado di polimerizzazione e preferibilmente è caratterizzato da un peso molecolare compreso tra 100-200.000 (g/mol) ed ancor più preferibilmente compreso fra 4.800 e 40.000(g/mol);
S’ è uno spaziatore bifunzionale che comprende due funzioni attivabili o derivatizzabili (ad esempio due funzioni carbossiliche); preferibilmente è scelto fra acido L-2-amminoadipico (AD) ed acido β-glutammico (β-Glu);
z è il numero di spaziatori legati al carrier ed è 0 (nel caso in cui D è legato direttamente al carrier) o 1;
D è il principio attivo scelto fra indolo-3-carbinolo (I3C) o un suo derivato. In particolare, derivati preferiti comprendono derivati N-acil comprendenti una catena carbonilica lineare o ramificata C1-C6e preferibilmente rappresentati da derivati N-acetil,; derivati N-alcossi comprendenti una catena carbonilica lineare o ramificata C1-C6e preferibilmente rappresentati da: N-metossi, N-etossi, N-propossi, N-butossi; derivati N-arilici o N-eteroarilici comprendenti uno o più eteroatomi scelti fra azoto, ossigeno e zolfo, o N-benzilici, N-alchilici comprendenti una catena carbonilica lineare o ramificata C1-C6eventualmente comprendente uno o più eteroatomi scelti fra azoto, ossigeno e zolfo, N-alchenilici o N-alchinilici comprendenti una catena carbonilica lineare o ramificata C2-C6comprendente una o più insaturazioni ed eventualmente comprendente inoltre uno o più eteroatomi scelti fra azoto, ossigeno e zolfo;
n è il numero complessivo di molecole di D ed è 1
o 2 (n=1 quando D è legato direttamente ad L; n=2
quando D è legato allo spaziatore bifunzionale S’).
In accordo con un aspetto preferito, il coniugato
della presente invenzione è un composto avente
formula:
PEG–I3C
PEG-AD-(I3C)2
PEG-βGLU-(I3C)2
B-Lys-PEG-I3C
B-Lys-PEG-AD-(I3C)2
B-Lys-PEG-βGLU-(I3C)2
F-PEG–I3C
F-PEG-AD-(I3C)2
F-PEG-βGLU-(I3C)2
F-Lys-PEG-I3C
F-Lys-PEG-AD-(I3C)2
F-Lys-PEG-βGLU-(I3C)2
F2-AD-PEG-I3C
F2-AD-PEG-βGLU-(I3C)2
F2-AD-PEG-AD-(I3C)2
in cui F è acido folico; Lys è la lisina; PEG è come
sopra definito e quindi è polietilenglicole o un suo
derivato come ad esempio il mono-metossi-
polietilenglicole (mPEG), oppure è PEG omobifunzionale
(ad esempio, HOOC-(PEG)n-COOH) oppure eterobifunzinale (ad esempio, H2N-(PEG)n-COOH); in cui AD è l’acido L-2-amminoadipico e β-Glu è l’acido β-glutammico e in cui I3C è indolo-3-carbinolo (I3C) o un suo derivato come sopra descritto.
In accordo con un secondo oggetto dell’invenzione è descritto un processo per la preparazione dei coniugati dell’invenzione.
La preparazione di tali coniugati comprende una prima fase I) di attivazione del carrier, che comprende a sua volta le fasi di:
Ia) introduzione nel carrier di un opportuno gruppo reattivo (gr) attivabile:
L Æ L-gr;
Ib) attivazione del carrier tramite attivazione del gruppo reattivo:
L-gr Æ L-gr*
In una seconda fase II) è condotta invece l’attivazione del ligando B:
B Æ B*.
Nella terza fase III) della preparazione dei coniugati dell’invenzione il ligando attivato è coniugato al carrier:
B* L-gr* Æ B-L-gr*
Nell’ultima fase IV) si ha la coniugazione con il principio attivo:
B-L-gr* D Æ B-L-D.
In un aspetto preferito dell’invenzione, l’attivazione del carrier (fase Ia) comprende inizialmente il suo trattamento con una base opportuna come il terbutilato di potassio in un opportuno solvente, seguito da trattamento con tbutilbromoacetato così da ottenere l’introduzione di un gruppo reattivo attivabile, come ad esempio
–CH2COOH sul carrier.
La fase Ia) può essere evitata impiegando un carrier che già comprenda un opportuno gruppo reattivo attivabile oppure anche la fase Ib) può essere evitata partendo da un carrier che comprende un opportuno gruppo reattivo attivato.
Successivamente (fase Ib), il gruppo carbossilico è derivatizzato per trattamento con N-idrossisuccinimmide (NHS) in presenza di N,N’-dicicloesilcarbodiimmide (DCC).
Per quanto concerne, invece, l’attivazione del ligando (fase II), questa è ottenuta attraverso l’esterificazione con N-idrossicuccinimmide (NHS) in presenza di N,N’-dicicloesilcarbodiimmide (DCC).
In un aspetto preferito dell’invenzione, la fase III) di coniugazione del ligando al carrier è ottenuta mediante formazione di un legame ammidico fra l’estere succinimmidico del ligando ed il gruppo amminico del carrier (ad esempio, il carrier può essere PEG eterofunzionale).
In un aspetto preferito della presente invenzione, nella fase III) è impiegato un rapporto molare carrier:ligando di 1:4.
La fase di preparazione IV) del coniugato dell’invenzione comprende la successiva formazione del legame estereo fra il gruppo reattivo attivato del carrier ed il gruppo reattivo del principio attivo (ad esempio, il gruppo –OH dell’indolo-3-carbinolo).
Secondo un aspetto preferito dell’invenzione, nella fase IV) è impiegato un rapporto molare carrier:principio attivo compreso fra circa 1:1 e 1:5 e preferibilmente di circa 1:3.
Nel caso in cui il legame fra carrier e principio attivo avvenga tramite uno spaziatore S’, il processo per la preparazione dei coniugati dell’invenzione prevede l’impiego di un carrier eterobifunzionale (portante due gruppi reattivi: gr e gr’, diversi fra loro) ed il processo comprende le fasi di:
Ia’) protezione di uno dei gruppi reattivi del carrier:
gr-L-gr’ Æ #L-gr’
seguita dalla fase Ib’) di attivazione del gruppo reattivo libero (gr’):
#L-gr’ Æ #L-gr’* Successivamente, è prevista una fase Ic’) di coniugazione con uno spaziatore S’:
#L-gr’* S’ Æ #L-S’
ed una fase Id’) di deprotezione del gruppo reattivo protetto del carrier:
#L-S’ Æ gr-L-S’.
Nella fase successiva Ie’) si procede con la coniugazione con il ligando tramite il gr disponibile:
gr-L-S’ B Æ B-L-S’ Successivamente, si procede con la fase If’) di attivazione del gruppo reattivo dello spaziatore:
B-L-S’ Æ B-L-S’*
e poi con la fase Ig’) di coniugazione con il principio attivo:
B-L-S’* D Æ B-L-S’-D.
In un aspetto preferito dell’invenzione, il carrier eterobifunzionale è rappresentato da H2N-(PEG)n-COOH che può essere opportunamente bloccato all’estremità amminica con t-butilossicarbonil (Boc). Per quanto concerne l’altro gruppo reattivo (carbossile), questo può essere preferibilmente attivato con N-idrossisuccinimmide.
In un aspetto preferito dell’invenzione gli spaziatori S’ impiegati sono scelti fra acido (L)-2-amminoadipico e acido β-glutammico.
Per quanto concerne la deprotezione del carrier, questa è ottenuta nel caso del gruppo protettivo Boc preferibilmente con acido trifluoroacetico.
L’attivazione dei gruppi carbossilici degli spaziatori S’ sono ottenuti per reazione con N-idrossisuccinimmide in presenza di DCC.
In un aspetto preferito dell’invenzione, nel caso in cui il legame fra principio attivo e carrier è ottenuto mediante uno spaziatore S’, è impiegato un rapporto molare carrier:principio attivo compreso fra circa 1:1 e 1:5 e preferibilmente di circa 1:3.
Nel caso in cui lo spaziatore S sia uno spaziatore bifunzionale, ad esempio l’acido L-2-amminoadipico (AD), e quindi x=2, più unità del ligando B saranno coniugate al carrier.
Tale coniugazione potrà avvenire con opportune derivatizzazioni e/o attivazione di gruppi reattivi dello spaziatore S e/o del ligando B e/o del carrier, secondo metodi noti al tecnico del settore.
Come sopra descritto, i coniugati dell’invenzione trovano impiego come medicamento.
In particolare, possono essere impiegati per il trattamento e la prevenzione del cancro.
Con il termine “trattamento” si intende la possibilità di somministrare una quantità farmaceuticamente efficace ad un paziente affetto da cancro allo scopo di ottenere la guarigione o un miglioramento delle condizioni del paziente.
D’altra parte, è anche possibile impiegare i coniugati dell’invenzione per la “prevenzione”, allo scopo di impedire lo sviluppo di un tumore in un paziente, specialmente se predisposto da fattori ereditari, genetici o ambientali.
Nell’ambito della presente invenzione, con “prevenzione primaria” si intende il trattamento preventivo su di un soggetto sano, mentre per “prevenzione secondaria” si intende il trattamento su di un soggetto ammalato o che è stato ammalato, al fine di prevenire una nuova ricorrenza della patologia.
Le forme tumorali sulle quali i composti dell’invenzione sono attivi comprendono preferibilmente il tumore seno, al colon, alla prostata, all’ovaio, all’endometrio, al cervello, al polmone, al rene, al naso, alla gola, tumori maligni epiteliali, sarcomi, linfomi come il linfoma di Burkitt, il morbo di Hodgkin, mesoteliomi, melanomi, leucemie e mielomi.
In un altro aspetto dell’invenzione, i composti descritti hanno attività antiinfiammatoria e, quindi, possono esser impiegati per il trattamento e la prevenzione delle patologie caratterizzate da o causate dall’infiammazione, come ad esempio, l’artrite reumatoide, la colite ulcerosa, il morbo di Crohn, la psoriasi, l’osteomielite, la sclerosi multipla, l’aterosclerosi, la fibrosi polmonare, la sarcoidosi, la sclerosi sistemica, il rigetto di trapianto e le infiammazioni croniche.
In un aspetto aggiuntivo, i composti dell’invenzione hanno dimostrato di possedere notevoli proprietà antiossidanti e sono in grado quindi di ridurre la produzione di radicali liberi. Tale proprietà è particolarmente utile in quei soggetti, come anziani, fumatori, soggetti con patologie in corso o in recupero da patologie, in cui la generazione di specie radicaliche è notevolmente incrementata. Pertanto, i coniugati dell’invenzione possono essere utilmente impiegati per il trattamento, la cura e la prevenzione di patologie croniche quali la malattia ischemica o la malattia trombotica infiammatoria.
In un altro aspetto, i coniugati descritti hanno una notevole attività antiaggregante piastrinica.
In un ulteriore aspetto, i coniugati dell’invenzione possono essere impiegati per il trattamento, la prevenzione e la cura della sindrome metabolica, dell’obesità, del diabete, per ridurre il peso corporeo e l’accumulo di grasso e di macrofagi infiltrati nel tessuto adiposo, grazie alla migliore tolleranza al glucosio indotta.
Secondo un altro aspetto, i coniugati dell’invenzione possono essere impiegati per il trattamento e la prevenzione primaria e secondaria (come sopra definito) di patologie cardiovascolari.
In un ulteriore oggetto, i composti descritti nella presente domanda di brevetto sono impiegati come integratori alimentari.
Per gli scopi della presente domanda di brevetto, l’impiego dei composti descritti è sia per uso umano sia per uso veterinario e, preferibilmente, è per uso umano.
Uno o più dei composti coniugati dell’invenzione, in un’opportuna dose efficace, possono essere formulati in opportune preparazioni farmaceutiche e, preferibilmente, tali composti sono formulati per la somministrazione orale o parentale.
Dette preparazioni farmaceutiche possono, in un aspetto particolare dell’invenzione, comprendere anche uno o più principi attivi farmaceutici.
In particolare, possono essere realizzate capsule, compresse, pastiglie, confetti ed altre formulazioni farmacologiche simili sia a rilascio immediato sia a rilascio prolungato grazie all’impiego di opportuni eccipienti.
Per somministrazione parentale, invece, si intende che i composti della presente invenzione possono essere somministrati per via intradermica, sottocutanea, intramuscolare, intraperitoneale, endovenosa o intratecale.
A tale scopo, può essere preparata ad esempio un’opportuna soluzione acquosa iniettabile come una soluzione isotonica al 5% di glucosio; alternativamente, possono essere impiegati altri veicoli liquidi farmaceuticamente accettabili.
In un aspetto particolare, può essere preparato un liofilizzato ricostituibile al momento dell’uso mediante un opportuno veicolo.
Uno o più dei coniugati dell’invenzione possono inoltre essere formulati opportunamente per ottenere un prodotto da utilizzare come integratore alimentare e nutraceutico per uno o più degli scopi preventivi o terapeutici sopra indicati, grazie alla capacità di rilasciare I3C ed acido folico, composti utili per la tutela della salute umana e animale.
ESEMPIO 1
1a - funzionalizzazione di mPEG-OH La reazione di derivatizzazione è stata condotta partendo da monometossi-poli-(etilenglicole) lineare mPEG-OH di peso molecolare 5 e 20 kDa. Nella reazione con mPEG20000-OH, 2,5 g (0,125 mmoli, PM 20 Da) di polimero vengono anidrificati mediante distillazione dell’acqua in presenza di circa 40 ml di toluene, posti a distillare fino all’evaporazione di circa 30-32 ml di solvente. Si aggiungono sotto continua agitazione 250 µl (0,25 mmoli) di una soluzione 1M di terbutilato di potassio in terbutanolo. Si lascia reagire per 1 ora a 50°C a riflusso e si aggiungono 37 µl (0,25 mmoli, PM 195,06 Da, d = 1,321 g/ml) di tertbutilbromoacetato. Si lascia reagire per 1 ora a 50°C a riflusso e 18 ore a temperatura ambiente; si filtra su gooch a porosità 4 con celite® per eliminare il KBr formatosi, aggiungendo prima nel pallone di reazione alcuni ml di CH2Cl2per facilitare la filtrazione. Si riduce a piccolo volume all’evaporatore rotante, si aggiungono sotto agitazione 15 ml di una miscela di TFA (45,4%), CH2Cl2(54,5%) e acqua (0,1%) e si lascia reagire per 3 ore. Si elimina il TFA all’evaporatore rotante, riprendendo il residuo con CH2Cl2per 6-7 volte, fino a completa scomparsa di TFA, e si fa precipitare goccia a goccia in circa 250 ml di etanolo: si ottiene un precipitato, costituito da mPEG-COOH, che si lascia riposare a -20°C per 4-5 ore, in seguito si filtra su gooch a porosità 3 e si pone in essiccatore. Lo stesso procedimento si segue per mPEG5000-OH.
1b – derivatizzazione di mPEG20000-COOH
La derivatizzazione ad estere attivo è ottenuta mediante reazione con N-idrossisuccinimmide (NHS), in presenza di N,N’-dicicloesilcarbodiimmide (DCC). 800 mg (0,04 mmoli, PM 20058 Da) di mPEG20000-COOH vengono sciolti in 5-6 ml di CH2Cl2anidro sotto agitazione e addizionati di 9,21 mg (0,08 mmoli, PM 115,09 Da) di N-idrossisuccinimmide (NHS). A solubilizzazione ultimata si aggiungono 16,51 mg (0,08 mmoli, PM
206,33 Da) di N,N’-dicicloesilcarbodiimmide (DCC) e si lascia reagire per 18 ore. Si filtra su gooch a porosità 4 per eliminare la dicicloesilurea formatasi e la soluzione viene aggiunta goccia a goccia a circa 250 ml di etere etilico e posta a precipitare a -20°C per 4-5 ore. Il precipitato di mPEG-NHS che si forma viene filtrato su gooch e posto in essiccatore.
I polimeri mPEG5000-COOH e mPEG220000-COOH vengono attivati ad estere succinimidico con lo stesso procedimento.
1c - sintesi e purificazione dei coniugati mPEG-I3C. I coniugati mPEG-I3C, a diverso peso molecolare e a diversa struttura, si ottengono mediante legame estereo fra il gruppo carbossilico attivato del mPEG e il gruppo ossidrilico di I3C.
I prodotti ottenuti vengono caratterizzati mediante spettrofotometria UV-Vis, spettroscopia<1>H-NMR in DMSO-d6, cromatografia liquida ad alte prestazioni su fase inversa (RP-HPLC).
1d - sintesi dei coniugati folato-PEG-COOH Il derivato folato-NHS è preparato per esterificazione del carbossile in γ dell’acido folico con N-idrossisuccinimmide (NHS) in dimetilsolfossido anidro, in presenza di N,N’ dicicloesilcarbodiimmide (DCC) e trietilamina.
A 500 mg (1,133 mmoli, PM 441,40 Da) di acido folico, sciolti in 10 ml di DMSO anidro, vengono aggiunti 240 μl (1,699 mmoli, PM 101,19 Da, d=0,726 g/ml) di trietilammina, poi 260,79 mg (2,266 mmoli, PM 115,09 Da) di NHS e 467,54 mg (2,266 mmoli, PM 206,33 Da) di DCC e si lascia reagire sotto agitazione al riparo dalla luce tutta la notte. Si filtra su gooch a porosità 4 per eliminare la dicicloesilurea formatasi e la soluzione viene aggiunta goccia a goccia a 200 ml di etere etilico e posta a precipitare a -20°C per 4 ore. Il precipitato di folato-NHS viene filtrato su gooch a porosità 3, lavato più volte con etere etilico per eliminare il DMSO residuo e posto in essiccatore. Il prodotto folato-PEG-COOH si ottiene mediante la formazione di un legame ammidico fra il gruppo carbossilico in γ dell’acido folico, attivato ad estere succinimmidico, e il gruppo amminico del PEG eterobifunzionale. 359,7 mg (0,668 mmoli, PM 538,47 Da) di folato-NHS, sciolti in 6 ml di DMSO anidro, vengono aggiunti goccia a goccia a 800 mg (0,167 mmoli, PM 4800 Da) di NH2-PEG-COOH, precedentemente solubilizzati in 6 ml di DMSO anidro. Si aggiusta il pH della reazione a 9 e silascia reagire una notte a temperatura ambiente e sotto agitazione. Alla miscela di reazione si aggiungono 5 ml di acqua, si porta il pH a un valore di circa 7,5, si aggiungono poi 5 ml di DMF e 2-3 ml di soluzione satura di NaCl per facilitare la separazione di fase, e si purifica il prodotto folato-PEG-COOH da acido folico in eccesso mediante estrazioni dalla fase acquosa con CHCl3(8 x 80 ml). La fase organica raccolta viene anidrificata con Na2SO4, filtrata su gooch per eliminare il sale, e aggiunta goccia a goccia a 200 ml di etere etilico sotto agitazione. Dopo 4 ore a -20°C, il precipitato di folato-PEG-COOH viene raccolto per filtrazione su gooch a porosità 4 e posto in essiccatore.
1e - Sintesi e purificazione di folato-PEG-I3C Il coniugato folato-PEG-I3C si ottiene per formazione di un legame estereo fra il gruppo carbossilico attivato del PEG e il gruppo ossidrilico dell’I3C come riportato in precedenza
ESEMPIO 2
Sintesi dei coniugati folato-PEG4800-(I3C)22a - sintesi e purificazione di NH2-PEG-AD-(COOH)2e NH2-PEG-βGlu- (COOH)2
Per la reazione di coniugazione dell’acido L-2-amminoadipico (AD) o β-glutammico (β-Glu) si utilizza un PEG eterobifunzionale, Boc-PEG4800-NHS, avente il gruppo amminico protetto ad una estremità ed il gruppo carbossilico attivato all’altra estremità. La coniugazione avviene per formazione di un legame ammidico fra il gruppo carbossilico attivato del PEG e il gruppo amminico dell’amminoacido.
Si sciolgono 100,56 mg (0,624 mmoli, PM 161,16 Da) di acido L-2-amminoadipico in circa 10 ml di H2O/ACN (3:2 v/v) e si aggiungono 87,21 μl (0,624 mmoli, PM 101,19 Da, d=0,726 g/ml) di trietilammina (TEA), in modo che il pH della reazione sia di 8-9. Si aggiunge poi 1 g (0,208 mmoli, PM 4800 Da) di Boc-PEG-NHS e si lascia reagire sotto agitazione per 3 ore, controllando che il pH si mantenga a un valore di circa 8. Dopodiché si acidifica la reazione fino a pH 4.0 con HCl 1N, si elimina l’acetonitrile mediante evaporatore rotante e si purifica il prodotto Boc-PEG-AD-(COOH)2dall’eccesso di acido amminoadipico mediante estrazioni con CHCl3(8 x 80 ml). La fase organica raccolta viene anidrificata con Na2SO4, filtrata su gooch a porosità 3 per eliminare il sale, concentrata a piccolo volume in evaporatore rotante e fatta gocciolare in circa 300 ml di etere etilico sotto forte agitazione. Dopo 4 ore a -20°C il precipitato di Boc-PEG-AD-(COOH)2viene raccolto per filtrazione su gooch a porosità 4 e posto in essiccatore.
Lo stesso procedimento viene impiegato nella sintesi di Boc-PEG-βGlu-(COOH)2. La quantità di amminoacido legata alla catena di PEG si determina mediante titolazione dei gruppi carbossilici con NaOH 0,01N e mediante caratterizzazione spettroscopica 1H-NMR. Successivamente il gruppo protettore Boc viene eliminato mediante idrolisi acida con TFA.
2b - attivazione dei gruppi carbossilici di folato-PEG-AD-(COOH)2e folato-PEG-βGlu-(COOH)2con DCC e NHS I gruppi carbossilici del derivato folato-PEG-AD-(COOH)2e folato-PEG-βGlu-(COOH)2vengono attivati ad estere succinimmidico con NHS e DCC, come riportato precedentemente.
2c - sintesi e purificazione di folato-PEG-AD-(I3C)2e folato-PEG-βGlu-(I3C)2
La coniugazione di I3C alla catena polimerica avviene per formazione di un legame estereo fra i gruppi carbossilici attivati dell’amminoacido legato al PEG e il gruppo ossidrilico di I3C, con un procedimento analogo a quello seguito per la sintesi di folato-PEG-I3C, riportato precedentemente.
Studi di attività biologica su F-PEG-I3C coniugati
ESEMPIO 3
Attività citotossica e capacità di direzionamento dei folato coniugati
Gli studi di attività citotossica sono stati condotti su tre linee cellulari umane: HT-29 (adenocarcinoma del colon umano), MCF-7 (adenocarcinoma del seno umano) e KB-3-1 (carcinoma orofaringeo umano), cellule caratterizzate dalla sovraespressione dei recettori per l’acido folico (FR+) [17-18]. Sono stati testati I3C, coniugati privi di acido folico (PEG-I3C) e i folato coniugati F-PEG-I3C, F-PEG-AD-(I3C)2e F-PEG-βGlu-(I3C)2. I dati, espressi con IC50, ossia la concentrazione (µM) che inibisce la crescita cellulare del 50% rispetto a colture di controllo, sono riportati in Tabella 1.
Tabella 1. Valori di IC50 di I3C e coniugati
COMPOSTO HT-29 MCF-7 KB-3-1
IC50 (µM) IC50 (µM) IC50 (µM)<I3C>45,1±1,7 30,0±0,7 93,0±2,1<PEG-I3C>62,5±2,1 54,1±1,1 99,1±2,0<F-PEG-I3C>51,3±1,5 48,5±0,9 62,2±1,8<F-PEG-AD-(I3C)>2 51,8±1,1 39,7±1,0 49,5±1,4<F-PEG-βGlu-(I3C)>52,3±1,2 41,2±1,8 53,3±1,3
n=4 numero di prove ripetute per analisi statistica e calcolo deviazione standard.
Come si può vedere dai valori di IC50 riportati, in tutte e tre le linee cellulari l'attività di I3C libero è paragonabile a tutti i coniugati considerati. Invece l’attività citotossica dei coniugati F-PEG-I3C, aumenta passando da cellule FR<->a cellule FR<+>, indicando perciò un reale effetto di targeting della molecola di acido folico. I coniugati risultano quindi essere potenti inibitori delle cellule FR<+>e tale attività è correlata ad una maggiore selettività.
Confrontando poi i diversi coniugati fra loro, si nota che F-PEG-AD-(I3C)2e F-PEG-βGlu-(I3C)2hanno attività paragonabili, segno che il diverso spaziatore amminoacidico utilizzato non influenza l’attività citotossica. Molto significativa risulta infine la differenza di attività di questi derivati rispetto al coniugato folato-PEG-I3C, con una sola molecola di farmaco legata, soprattutto considerando i valori di IC50 espressi come concentrazione di coniugato.
ESEMPIO 4
Attività antinfiammatoria
I3C, derivati coniugati privi di acido folico (PEG-I3C) e folato coniugati F-PEG-I3C, F-PEG-AD-(I3C)2e F-PEG-βGlu-(I3C)2sono stati testati per la loro attività antiinfiammatoria sull’attività della sintetasi inducibile dell'ossido nitrico (iNos) in cellule J774A.1 di macrofagi stimolate da LPS e valutando la produzione di nitriti ed il rilascio di NO.
Come riportato in Tabella 2 l'attività dei coniugati è paragonabile o di poco superiore a quella di I3C libero. I coniugati PEG-I3C, privi di acido folico, mostrano minore attività indicando perciò un reale effetto di targeting della molecola di acido folico sulle cellule di macrofagi attivate. Anche in questo caso F-PEG-AD-(I3C)2e F-PEG-βGlu-(I3C)2hanno attività comparabile evidenziando che il diverso spaziatore amminoacidico utilizzato non è in grado di influenzare l’attività. I dati sono espressi come percentuale di inibizione ±s.e.m. vs la produzione di nitriti nelle 24 h da parte di cellule J774A.1 di macrofagi trattate con LPS da solo.
Tabella 2. Effetto di I3C e dei coniugati sulla produzione di nitriti ed il rilascio di NO in cellule J774A.1 di macrofagi stimolati con LPS di E. coli.
COMPOSTO inibizione rilascio nitriti (% vs LPS)
100 µg/mL 1 µg/mL 1 µg/mL<I3C>70,1±1,2<***>20,0±0,9<**>10,0±1,1<PEG-I3C>42,5±2,4<***>4,1±0,8 2,1±0,7<F-PEG-I3C>71,3±3,2<***>24,5±1,5<**>11,2±0,8<F-PEG-AD-(I3C) *** **>
2 73,8±3,1 22,7±1,8 9,5±1,0<F-PEG-βGlu-(I3C)>72,3±2,2<***>21,2±1,3<**>12,3±1,1n=5 numero di prove ripetute per analisi statistica e calcolo deviazione standard; *** e ** rappresentano P<0.001 e P<0.01 vs LPS macrofagi trattati.
ESEMPIO 5
Attività antiaggregante piastrinica
É stato testato l’effetto anti aggregante piastrinico indotto da una serie di mediatori su campioni di plasma arricchito in piastrine. I3C ed il folato coniugato F-PEG-I3C hanno mostrato di inibire in maniera potente e dose dipendente l’aggregazione piastrinica indotta da collagene. Testati a concentrazioni di 3, 6, 12, 25 µM hanno prodotto inibizione dell'aggregazione piastrinica del 70, 73, 78 e 79 % e del 71, 75, 77, 80% rispettivamente.
ESEMPIO 6
Attività antiossidante
Il saggio di decolorazione del radicale libero cationico ABTS+° valuta l’abilità scavenger di un antiossidante verso un radicale cationico preformato (ABTS<+>°) in relazione al Trolox, un analogo idrosolubile della vitamina E. TEAC è definita come la concentrazione di Trolox con la stessa capacità antiossidante del composto testato alla concentrazione di 1 mM. I folati coniugati F-PEG-I3C hanno mostrato un’attività antiossidante maggiore di quella del I3C e di numerosi composti polifenolici confermando la maggiore stabilizzazione di I3C. F-PEG-AD-(I3C)2e F-PEG-βGlu-(I3C)2hanno attività superiore e comparabile evidenziando che il diverso spaziatore amminoacidico utilizzato non è in grado di influenzare l’attività.
Classe Composto ABTS assay (TEAC)
<I3C>I3C 3,8 ±0,12
F-PEG-I3C 4,5 ±0,21 F-PEG-AD-(I3C)25,3 ±0,21 F-PEG-βGlu-(I3C)25,2 ±0,18<PPG>Verbascoside 5,3 ±0,22 Flavonoidi Rutina 2,1 ±0,09
Esperidina 0,5 ±0,09 Naringina 0,5 ±0,01 Narigenina 1,4 ±0,03 Apigenina 0,2 ±0,01 Epicatechina 4,8 ±0,08 Luteolina 2,8 ±0,09 Acidi cinnamici Acido caffeico 5,8 ±0,12
Acido clorogenico 4,3 ±0,13 acido ferulico 3,6 ±0,11 Acido 3,4- 4,6 ±0,18 diidrossibenzoico
Vitamine tocoferolo 2,1 ±0,07
Dalla descrizione sopra riportata sono evidenti i numerosi vantaggi offerti dalla presente invenzione.
I coniugati descritti superano infatti alcuni limiti dell’indolo-3-carbinolo, riguardanti il suo basso peso molecolare e la sua instabilità in acqua ed in un ambiente acido come quello rappresentato dallo stomaco.
Nei coniugati dell’invenzione l’I3C è legato covalentemente ad un polimero con funzione di carrier e tale coniugazione permette di migliorarne il profilo farmacocinetico.
Di conseguenza, la solubilità è vantaggiosamente aumentata e la degradazione enzimatica e chimica è notevolmente ridotta o del tutto evitata.
Inoltre, i composti messi a disposizione dalla presente invenzione sono dotati di elevata selettività grazie all’impiego di molecole direzionanti.
Tale molecola target è riconosciuta da recettori specifici sovraespressi in alcuni tessuti e cellule, come ad esempio particolari cellule tumorali e infiammatorie.
Di conseguenza, l’effetto tossico e citotossico a carico dei tessuti non interessati da patologia tumorale o infiammatoria è vantaggiosamente prevenuto.
Le proprietà antiossidanti dei composti sopra descritti indirizza verso il loro impiego come integratori alimentari.
Infatti, l’assunzione di antiossidanti esogeni contribuisce a ripristinare l’equilibrio tra produzione di radicali liberi ed il consumo di antiossidanti endogeni, oltre che a prevenire lo squilibrio causa del cosiddetto “stress ossidativo cellulare”, legato sia al processo fisiologico dell’invecchiamento che ad insulti ambientali.
La persona esperta nel settore sarà in grado di apportare modifiche o adattamenti alla presente invenzione, senza tuttavia uscire dall’ambito delle rivendicazioni di seguito riportate.

Claims (20)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Un composto di formula generale: Bx-(S)y-L-(S’)z–Dn(I) in cui: B è una sostanza scelta fra vitamine, peptidi, peptidi tumorali specifici, aptameri specifici delle cellule tumorali, carboidrati specifici delle cellule tumorali, anticorpi monoclonali o policlonali, frammenti di anticorpi, proteine espresse sulle cellule tumorali metastatiche; x è 0, 1 o 2; S è lisina o è uno spaziatore bifunzionale come acido L-2-amminoadipico (AD); y è 0 o 1; L è un carrier scelto fra polietilenglicole o un suo derivato, omobifunzionale oppure eterobifunzionale; S’ è uno spaziatore bifunzionale scelto fra acido L-2-amminoadipico (AD) ed acido β-glutammico (β-Glu); z è 0 o 1; D è un principio attivo scelto fra indolo-3-carbinolo (I3C) o un suo derivato; n è 1 o 2.
  2. 2. Il composto secondo la rivendicazione 1, in cui B è acido folico (F).
  3. 3. Il composto secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui D è un derivato N-acil, comprendente una catena carbonilica lineare o ramificata C1-C6e preferibilmente C1; N-alcossi comprendenti una catena carbonilica lineare o ramificata C1-C6e preferibilmente rappresentati da: N-metossi, N-etossi, N-propossi, N-butossi; derivati N-arilici o N-eteroarilici comprendenti uno o più eteroatomi scelti fra azoto, ossigeno e zolfo, derivati N-benzilici; derivati N-alchilici comprendenti una catena carbonilica lineare o ramificata C1-C6eventualmente comprendente uno o più eteroatomi scelti fra azoto, ossigeno e zolfo; derivati N-alchenilici o N-alchinilici comprendenti una catena carbonilica lineare o ramificata C2-C6comprendente una o più insaturazioni ed eventualmente comprendente inoltre uno o più eteroatomi scelti fra azoto, ossigeno e zolfo.
  4. 4. Il composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il carrier è H2N-(PEG)n-COOH oppure HOOC-(PEG)n-COOH.
  5. 5. Il composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il carrier è monometossi-polietilenglicole.
  6. 6. Il composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il carrier ha un peso molecolare compreso fra 100 e 200.000 (g/mol) e preferibilmente fra 4.800 e 40.000 (g/mol).
  7. 7. Il composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, scelto fra: PEG–I3C PEG-AD-(I3C)2 PEG-βGLU-(I3C)2 B-Lys-PEG-I3C B-Lys-PEG-AD-(I3C)2 B-Lys-PEG-βGLU-(I3C)2 F-PEG–I3C F-PEG-AD-(I3C)2 F-PEG-βGLU-(I3C)2 F-Lys-PEG-I3C F-Lys-PEG-AD-(I3C)2 F-Lys-PEG-βGLU-(I3C)2 F2-AD-PEG-I3C F2-AD-PEG-βGLU-(I3C)2 F2-AD-PEG-AD-(I3C)2 in cui in cui F è acido folico; Lys è la lisina; PEG è polietilenglicole o un suo derivato come il mono- metossi-polietilenglicole (mPEG), omobifunzionale oppure eterobifunzinale; in cui AD è l’acido L-2 amminoadipico e β-Glu è l’acido β-glutammico e in cui I3C è indolo-3-carbinolo (I3C) o un suo derivato.
  8. 8. Un processo per la preparazione di un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, comprendente le fasi di: Ia) introdurre nel carrier un opportuno gruppo reattivo (gr): L Æ L-gr; Ib) attivare detto gruppo reattivo del carrier: L-gr Æ L-gr*; II) attivare un ligando B: B Æ B*; III) coniugare il ligando attivato al carrier attivato: B* L-gr* Æ B-L-gr*; IV) coniugare il principio attivo D: B-L-gr* D Æ B-L-D, laddove le fasi Ia) ed Ib) sono opzionali.
  9. 9. Un processo per la preparazione di un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, in cui L è PEG eterobifunzionale portante un primo gr ed un secondo gr’ gruppo reattivo e z è =0, comprendente le fasi di: proteggere un primo gruppo amminico del carrier: gr-L-gr’ Æ #L-gr’ Ib’) attivare il gruppo reattivo libero (gr’): #L-gr’ Æ #L-gr’* Ic’) coniugare uno spaziatore S’: #L-gr* S’ Æ #L-S’ Id’) deproteggere il carrier: #L-S Æ gr-L-S’; Ie’) coniugare il ligando: gr-L-S’ B Æ B-L-S’ If’) attivare il gruppo reattivo dello spaziatore: B-L-S’ Æ B-L-S’* Ig’) coniugare il principio attivo: B-L-S’* D Æ B-L-S’-D.
  10. 10. Il processo secondo la rivendicazione 8, in cui L è H2N-(PEG)n-COOH.
  11. 11. Il processo secondo la rivendicazione 8 o 9, in cui nella fase IV) o Ig’) è impiegato un rapporto molare carrier:principio attivo compreso fra 1:1 e 1:5 e preferibilmente di 1:3.
  12. 12. Il processo secondo la rivendicazione 8 o 9, in cui è impiegato un rapporto molare carrier:ligando di circa 1:4.
  13. 13. Un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 per uso medico.
  14. 14. Un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, per l’uso nel trattamento o nella prevenzione del tumore.
  15. 15. Un composto secondo la rivendicazione precedente, in cui detto tumore è il tumore seno, al colon, alla prostata, all’ovaio, all’endometrio, al cervello, al polmone, al rene, al naso, alla gola, tumori maligni epiteliali, sarcomi, linfomi come il linfoma di Burkitt, il morbo di Hodgkin, mesoteliomi, melanomi, leucemie e mielomi.
  16. 16. Un composto secondo la rivendicazione 13 per l’uso nella prevenzione e nel trattamento di malattie infiammatorie, di patologie cardiovascolari, patologie croniche, della sindrome metabolica, dell’obesità, del diabete, per ridurre il peso corporeo e l’accumulo di grasso e di macrofagi infiltrati nel tessuto adiposo, per l’uso come antiaggregante piastrinico, per l’uso come antiossidante.
  17. 17. Una preparazione farmaceutica o nutraceutica comprendente uno o più dei composti secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7.
  18. 18. La preparazione farmaceutica o nutraceutica secondo la rivendicazione precedente per somministrazione orale o parentale.
  19. 19. La preparazione farmaceutica o nutraceutica secondo la rivendicazione 17 o 18 comprendente uno o più principi attivi farmaceutici.
  20. 20. Un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 per uso come integratore alimentare e nutraceutico in grado di rilasciare I3C e acido folico utili per la salute umana e animale.
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