TW200902544A

TW200902544A - Peptide-complement conjugates

Info

Publication number: TW200902544A
Application number: TW097108371A
Authority: TW
Inventors: Hartmut Duefel; Roberto Falkenstein; Iris Lein; Rainer Schmuck; Wilhelm Tischer
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2007-03-13
Filing date: 2008-03-10
Publication date: 2009-01-16
Also published as: IL199718A0; ATE530564T1; PE20090163A1; WO2008110332A1; AR065688A1; KR20090115867A; AU2008226051A1; CN101616929A; CN101616929B; CA2679647A1; MX2009009370A; ES2374962T3; EP2118125B1; JP2010520868A; AU2008226051B2; BRPI0808732A2; CL2008000707A1; US20090143288A1; JP5081931B2; KR101182951B1

Description

200902544 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明報導抗融合肽與補體因子Clq球狀頭部衍生多肽的結合物。【先前技術】 HI V病f感染細胞由待感染之細胞之膜與病毒臈融合之過程實現。現提供此過程之一般流程：病毒包膜畴蛋白複合物（gp 1 20/gp4 1)與位於待感染之細胞之膜上之細胞表面 ' 受體相互作用。gP12〇與例如CD4受體以及諸如ccR_5或 CXCR-4之協同受體之結合導致印12〇/卯41複合物之構形之變化。由於此構形變化，gp41蛋白質能夠插入標靶細胞之膜中。此插入為膜融合過程之開始。已知由於自然產生之多態性，所以gp41蛋白質之胺基酸序列在不同HIV病毒株之間為不同的。但可辨識同一域架構’準確而言，為融合信號、兩個七胺基酸重複域（hr ^、 HR2)及跨膜域（在n末端至C末端方向上）。提出融合（或致、融合（fusogenic))域參與插入細胞膜中及細胞膜之崩解。 HR區域由各自包含7個胺基酸之多個伸展區（，，七胺基酸序歹J )構成。（參見例如 Shu, W.4 人 ’ Biochemistry 38 (1999) 53 78-53 85)。除七胺基酸序列之外，存在一或多個白胺酸拉鏈狀基元。此組成導致形成gp41蛋白質之捲曲螺旋結構且與由此等域衍生之肽完全一樣。捲曲螺旋一般為由兩個或兩個以上相互作用之螺旋組成之募聚物。具有自gp41之HR1或HR2域演繹而得之胺基酸序列的肽 129250.doc 200902544 為HIV吸收至細胞中之有效活體外及活體内抑制劑（例如，

參見例如 US 5,464,933、US 5,656,480、US 6,258,782、US 6,348,568或US 6,656,906之肽）。舉例而言，T20(亦稱為 DP178，Fuzeon®，一種 HR2 肽）及 T651(US 6,479,055)為 HI V感染之極有效抑制劑。已試圖藉由例如胺基酸取代或化學交聯來增強HR2衍生肽之功效（Sia，S.K.等人，Pr〇c

Natl. Acad· Sci. USA 99 (2002) 14664-14669 ; Otaka，A.等人，Angew. Chem. Int. Ed. 41 (2002) 2937-2940)。人類之先天免疫力包含補體途徑。此途徑藉由體因子之辨識次單元）與免疫標靶之結合來活化。完全Clq 分子為包含三個單體建構基塊（表示為ci qA、Cl qB及 Cl qC)中之每一者之六個複本的異質分子。單體單元中之每一者包含N末端區域（具有3至9個殘基）、膠原狀域（跨越約81個殘基）及球狀域（球狀頭部；跨越約ι35個殘基）（Sellar，G.C.等人 ’ Biochem. J, 274 (1991) 481-490) 〇

Moir等人報導經由活化補體途徑而導致HIV_ i感染b細胞（Moir, S.等人，J. Exp. Med_ 192 (2000) 637-646)。人類補體途徑之活化係自gP41之主要免疫決定區域（gpl60之位置 590-620 ;根據Ratner，L.等人，Nature 313 (1985) 277- 2 84編號）與補體因子〇19之結合而出現（处6111^111以，（：1?, J. Exp. Med, 174 (1991) 1417-1424)。Thielens 等人報導人類Cl之Clq亞成分與HIV-1之跨膜包膜醣蛋白gp4i在gpi60 之胺基酸位置590-6 1 3之區域中相互作用。此相互作用可由包含具有連接Cys 605與Cys 6 11之雙硫鍵的gp 160之胺基 129250.doc 200902544

Immunol. 酸601-613之肽來抑制（Thielens, NM等人 151 (1993) 6583-6592)。【發明内容】包含選自包含SEQ ID 多狀’及選自抗融合肽本發明包含一種多肽結合物，其 NO: 01之多肽及其片段之群的第一之群的第二多肽。

在-實施例中，根據本發明之結合物包含處於選自以下順序之群的順序中的該第—多肽及該第二多肽： N末端-第一多肽·第二多肽_c末端， ^末&-第一多肽·第一多肽_c末端。在另一實施例中，根據本發明之結合物包含介於該第一夕肽與δ亥第一多肽之間的連接子多肽。本發明另外報導一種多肽結合物，其包含： a) 第—多肽（第一 PP)’其選自包含SEQiDn〇:〇i之多肽及其片段之群， b) 第二多肽（第二pp)，其選自抗融合肽之群， c) 選擇性第三多肽（第三pp)，其選自抗原結合性抗 CCR5抗體鏈、抗原結合性抗CD4抗體鏈、中和性抗 HIV-1抗體鏈及其片段之群， d) 選擇性連接子多肽（連接pp)，其連接該第一多肽、該第二多肽及/或該第三多肽。在此多肽結合物中，該等構成多肽具有如下之N末端至 C末端順序： PP]a [連接 pp]m-[第—PP]b_[連接 pp]n-[第三 pp]e-[連 129250.doc 200902544 接叩]。_[第—pp]d-[連接PP]p-[第二PP]e-[連接pp]q-[第三 pp]f-[連接 pp]r_[第一 pp]g，其中 a、b、C、d ' e 之整數，且其中： a + d + g = 1， p、q、r莜此獨立地為〇或 in ' 11

〇之值表不在該多肽結合物中之相應位置處不存在相應多肽，且1之值表示在相應位置處存在相應多肽。在一實施财，《擇性第三多肽麵自抗原結合 CCR5抗體鏈及其片段之群。几 /另-實施例中，該選擇性第三多肽係選自抗原抗CD4抗體鍵及其片段。在另一實施例中，該選摆μ笙-々η," $擇陡弟二多肽係選自抗原結合性抗HI V-1抗體鏈及其片段。注在一實施例中，該連接子多肽伤丁夕肽係選自包含SEQ m 20至SEQ ID NO: 48之多肽之群。、υ· 在另一實施例中’該第二多觖你、α 多狀係選自包含SEQ ίο 〇8至SEQ ID NO: 19之抗融合肽之群。 Νυ: 本發明之另一態樣為一種編碼板 1很據本發明之多肽結入之核酸及一種包含根據本發明夕& α 〇物月之核酸之真核細胞。本發明另外包含一種產生根摅士 a 根據本發明之多肽結合物之古法，其包含下列步驟：】夂方 129250.doc 200902544 a) 將包含編碼根據太路a日+々尿尽毛月之多肽結合物之核酸的細胞在適合於表現該多肽結合物之條件下培養，及 b) 自該細胞或該培養基回收該多肽結合物。本發明亦包含一種醫藥έ日人& 裡诗樂組合物’其含有根據本發明之多肽結合物或其醫藥學上可粮為夕碰 ^ 子丄』接又之鹽以及醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。本發明亦涵蓋-種根據本發明之多肽結合物的用途，其

係用於製造供治療病毒感染、較佳咖感染用之藥物。【實施方式】

本發明包含一種多肽結合物，其包含選自包含sEQ NO: 01之多肽及其片段之群的第—多肽，及選自抗融合狀之群的第二多1。本發明另外包含_種多肽結合物，其包含選自包含SEQ ID NO: 01之多肽及其片段之群的第一多肽（第一 ρρ)，及選自抗融合肽之群的第二多肽（第二叩），及選自包含抗CCR5抗體之抗原結合片段、抗mv_丨抗體之中和片段及抗CD4抗體之抗原結合片段之群的選擇性第三夕肽（第二pp)’及連接該第一多肽、該第二多肽及/或該第二多肽之選擇性連接子多肽（連接pp)，藉以使得在此多肽結合物中’該等個別多肽具有如下之N末端至c末端順序： [第一 PP]a-[連接 PP]m-[第二 pp]b-[連接 pp]n_[第三 pp]e_[連接 PP]。-[第一 PP]d-[連接 PP]p-[第二 PP]e-[連接 pp]q·[第三 pp]f-[連接 pp]r-[第一 pp]g，其中a、b、c、d、e、f、g、m、n、o、p、q、r皆為0至1 129250.doc -10- 200902544 之正數，且其限制條件為： a + d + g = 1， b + e = 1， c + f = 0或 1， n 0、卩、<:1、1'彼此獨立地為〇或1，中〇之值表不在該多肽結合物中之相應位置處不存在相應夕肽且1之值表示在相應位置處存在相應多肽。適用於執订本發明之方法及技術為熟習此項技術者所已知且描述於例如™elens，N.M.等人，j. Immun〇1. ι51 (1993) 6583-6592 ； Ausubel, F.M.^ . Current Protocols in M〇leCUlar Bi〇1〇gy，第1至⑴卷（1997)，及 Sambrook等人，

Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 2版，Cold

Spnng Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)中。如熟習此項技術者所已知’使用重組dna技術月匕夠產生核酸及/或多肽之眾多衍生物。該等衍生物例如可在一個別或若干位置中藉由取代、變化、交換、缺失或插入來修飾。修飾或衍生作用例如可藉助於定位突變誘發來執行。該等修飾可容易地由熟習此項技術者來執行（參見例如 Sambrook，J.等人，Molecular cl〇ning: A lab〇rat〇w manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York，USA)。使用重組技術使熟習此項技術者能夠以—或多種異源核酸來轉型各種宿主細胞。雖然不同細胞之轉錄及轉譯（亦即表現）機構使用相同元件，但是屬於不同物種之細胞可尤其具有不同的所謂密碼子選擇。由此，相同多 129250.doc 200902544 肽（關於胺基酸序列）可由不同核酸來編碼。另外，歸因於遺傳密碼之簡幷’不同核酸可編碼同—多狀。如本文中所用之"核酸"係指由個別核苦酸組成之聚核芽酸分子，例如係指DNA、RNA或其修飾。此聚核苦酸分子可為自然m聚核芽酸分子或合成聚核普酸分子或一或多種自然產生之聚核苷酸分子與一或多種個合成聚核苷酸分子之組合。此定義亦涵蓋其中—或多個核*酸例如藉由突變誘發、缺失或添加而改變之自然產生之聚核苦酸分

子。核酸可經分離，哎螫入5 s ,. ^. L 刀雕次正口至另一核酸中，例如在表現卡 E、質體或宿主細胞之基因組中。核酸由其由個別核普酸組成之核酸序列來表徵。熟習此項技術者熟知將例如多肽之胺基序列轉化成編碼此胺基酸序列之相應核酸序列的私序及方法。因此’核酸由其由個別核苦酸組成之核酸序列來表徵且同樣由藉其編碼之多肽之胺基酸序列來表徵。如本文中所用之”核酸”係指編碼可以重組方式產生之多 ί- 肽的自然產生之柏酿& 人斗、λ 核^或部分或完全非自然產生之核酸。核酸可由經分離或由昝興士飞由化子方法合成之DNA片段構成。核酸可整合至另一核酸φ，+ ± 中例如在表現質體或真核宿主細胞之基因組/染色體中。皙鲈台紅貝體匕括牙梭及表現質體。通常，質體

亦包含原核繁殖罝士 . ^ A 早凡’其包含分別用於質體在原核生物中之複製及選擇的&制4 / 是製起點（例如ColE 1複製起點）及選擇性擇標記（例如安士而士士, " 西林（amPlciUin)或四環素抗性基因）。 "表現卡S”係指含有至少為所含有之結構基因在細胞中表現及分泌所必需之元件的核酸。 I29250.doc 12 200902544 '因”表示例如染色體上或質體上之為表現肽、多肽或貝所必高之區段。除編石馬區域之外，基因包含其他功月b 7L件，包括啟動子、内含子及終止子。 ”構基si表示基因之沒有信號序列之編碼區域。 ' ”選擇性擇標記”為—種基因，其允許在相應'，選擇劑'，之纟在下對於帶有4基因之細胞進行針對性或對抗性之特異性選擇。適用之正性選擇性擇標記為抗生素抗性基因。此广 $擇性擇標記允許以該基因轉型之宿主細胞在相應抗生素 '' (例如選擇劑）之存在下受到正性針對性選擇；未經轉型之宿主細胞在存在選擇劑之選擇培養條件下不能夠生長或存活。選擇性擇標記可為正性、負性或雙功能的。正性選擇 - 性擇標記允許針對性選擇帶有該標記之細胞，而負性選擇欧擇& δ己允岭選擇性地消除帶有該標記之細胞。通常，選擇性擇標記將賦予對於藥物之抗性或彌補宿主細胞中之代謝或異化缺陷。適用於真核細胞之選擇性擇標記包括（例 r 如）胺基糖苷磷酸轉移酶（ΑΡΗ)，諸如針對潮黴素 (hygromycin)鱗酸轉移酶（hyg)、新徽素（neoinycin)及 G4 1 8 ΑΡΗ、一氫葉酸還原酶（DHFR)、胸普激酶（tk)、麵胺醯胺合成酶（GS)、天冬醯胺酸合成酶、色胺酸合成酶（叫丨嗓）、組胺醇脫氫酶（組胺醇D)之基因及提供對於嘌吟黴素 (puromycin)、博來黴素（bleomycin)、腐草黴素 (phleomycin)、氯黴素（chloramphenicol)、芥森（Zeocin)及徽紛酸（mycophenolic acid)之抗性的基因。其他選擇性擇標記基因描述於WO 92/08796及WO 94/28143中。 129250.doc •13- 200902544 如本文中所用之"調控元件”传丁诉知為轉錄及/.韓包含編碼所關注之多肽之核酸的基次轉〜、.爲叮义而之以順式形式存在之核苷i序列。轉錄調控元件通 μ β θ Μ ϋ 匕3待表現之結構基因之 ..^ ^點，及聚腺苷酸信號序歹J。術b轉錄起始位點"係指盥 /、1汗入初級轉錄物（亦即

mRNA前驅體)中之第一（I ^ . 7屬之基因中之核苷酸（或更確切而言核酸鹼）；轉錄起田巧始位點可與啟動子序列重豐。術語”轉錄終止位點"係指 ?曰逋吊存在於所關注之待轉錄基因之3端之核苦酸序列’並墓絲〇 χτ Λ η ，、導致RNA聚合酶終止轉錄。聚腺苷酸信號核苷酸序列，式㈣《一·Α添加信號提供在真核爪麗之3,端之特異性位點處進行裂解及物〇_細個腺嗓吟核苦酸（_ A尾）之序列之核在轉錄後添加於經裂解之 3’端之信號。聚腺苷酸信號序列可包括位於自裂解位點起之上游約1 0-30個核普酸處之一致序列aataaa。為產生所分泌之多肽，所關注之結構基因包括編碼”信號序列"或"引導肽"之DNA區段。信號序列將新合成之多肽引導至並穿過内質網（ER)之膜，該多肽可於其中經投送用於分泌。在蛋白f穿過E R膜期間，信號序列由信號:酶裂解。至於信號序列之功能，由宿主細胞之分泌機構進行辨識為必不可少的。因此所使用之信號序列必須由宿主細胞之分泌機構之蛋白質及酶來辨識。轉譯調控元件包括轉譯起始（AUG)及轉譯終止密碼子 (TAA、TAG或TGA)。内部核糖體入口位點（IRES)可包括於一些構築體中。 129250.doc -14- 200902544 ’’啟動子’’係指控制與其可運作地連接之基因/結構基因或核酸序列之轉錄的聚核苷酸序列。啟動子包括聚合酶結合及轉錄起始之信號。所使用之啟動子將在預期表現所選擇之核酸序列的細胞類型之宿主細胞中起作用。來自多種不同來源之包括原構性、誘導性及可抑性啟動子之大量啟動子在此項技術中熟知（且在諸如GenBank之資料庫中識別）且可原樣或於經選殖之聚核苷酸内獲得（來自例如諸如 ATCC之保存處以及其他商業或個人來源）。”啟動子"包含 ' 引導結構基因之轉錄之核苷酸序列。通常，啟動子位於鄰近結構基因之轉錄開始位點的基因之5,非編碼或未經轉譯區域。在起始轉錄中起作用之啟動子内之序列元件常常由 - 一致核苷酸序列來表徵。此等啟動子元件包括RNA聚合酶結合位點、TATA序列、CAAT序列、分化特異性元件 (DSE，McGehee，R.E.等人，Mol, Endocrinol, 7 (1993) 55 1-560)、環狀AMP反應元件（CRE)、血清反應元件 (SRE ; Treisman，R.，Seminars in Cancer Biol. 1 (1990) 47- 5 8)、糖皮質激素反應元件（GRE)及其他轉錄因子之結合位點，該等轉錄因子諸如CRE/ATF(0’Reilly，M.A.等人，J. Biol. Chem. 267 (1992) 19938-19943)、AP2(Ye，J.等人，】· Biol. Chem. 269 (1994) 25728)、SP1、cAMP反應元件結合蛋白（CREB ; Loeken，M.R·，Gene Expr. 3 (1993) 253-264) 及八聚物因子（一般地，參見Watson等人編，Molecular Biology of the Gene，第 4 版（The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987)及 Lemaigre，F.P.及 -15· 129250.doc 200902544

Rousseau，G.G.，Biochem. J. 303 (1994) 1-14)。若啟動子為誘導性啟動子，則轉錄速率回應於誘導劑而增加。與此對比，若啟動子為原構性啟動子，則轉錄速率並不由誘導劑來調控。可抑性啟動子亦為已知的。舉例而言，在生長激素與其受體在細胞表面上結合之後，c_f〇s啟動子經特異性活化。經四環素（tet)調控之表現可藉由由例如啟動子繼之以兩個Tet操縱位點所組成之人工雜合啟動子來達成。Tet抑制子與兩個Tet操縱位點結合且阻斷轉錄。在添加誘導劑四環素之後，Tet抑制子自Tet操縱位點釋放且轉錄開始進行（Gossen，M·及 Bujard，H. PNAS 89 (1992) 5547- 乃51)。關於包括金屬硫蛋白及熱休克啟動子之其他誘導性啟動子，參見例如Sambr〇〇k等人（同上）&G〇ssen，Μ等人，Cun·，〇pin· Biotech 5 (1994) 5 16 52〇。在已識別為高水平表現之強啟動子的真核啟動子中，存在SV4〇早期啟: 子、腺病毒主要晚期啟動子、小鼠金屬硫蛋白^啟動子、 Rous肉瘤病毒長末端重複序列、中國倉鼠延伸因子比 (CHEF-1，參見例如us 5,888,809)、人類EF_ia、泛素及人類巨細胞病毒即刻早期啟動子（CMV IE)。”啟動子，，可為原構性或誘導性的。可能需要增強子（亦即作用於啟動子以増加轉錄之順式作用DNA元件）以協同啟動子來起作用以〜加由單獨啟動子所獲得之表現水平，且可作為轉錄調控兀件而包括在内。通常，含有啟動子之聚核苷酸區段將亦包括增強子序列（例如CMV或SV40)。如本文中所用之"增強子"係指增強與其可運作地連接之 129250.doc 16- 200902544 基因或編碼序列之轉錄的令妨过缺十的t核分酸序列。不同於啟動子， i曰強子與定向及位詈4料 #對…關且已發現於轉錄單元之5,或 3’處（Lusky，M.等人，M〇i Γρ1, R.

Mol. Cell Bio.，3 (1983) 1 108- U22)、内含子内（6_小，等人，CeU，33 (1983) 729_ 74〇)以及編碼序列本身内（⑽⑽e，T.F.等人，M〇1㈣出〇” 4 (1984) 1293-13〇5)。因此，雖然在實務上增強子可在實體上及功能上與啟動子重疊，但是增強子可置於自轉錄起始位點起之上游式丁,姑+ + μ 游或下游或處於距啟動子相當遠之距離處。來自多種不同來源之大量增強子在此項技術中熟知 (且在諸―之資料庫中識別)且可原樣或於經選殖之聚《酸序列内獲得（來自例如諸如Α取之保存處以及其他商業或個人來源）。多種包含啟動子序列（諸如通常使用之CMV啟動子）之聚核*酸亦包含增強子序列。舉例而言，所有上列之強啟動子亦可含有強增強子(參見例如

Bendig, M.M., Genetic Engineering, 7 (Academic Press, 1988) 91-127)。 ’’内部核糖體入口位點"或"刪"描述在功能上與刪之 5’處之基S無關地促輯譯起始且允許自動物細胞中之單一轉錄物轉譯兩個順反子（開放閱讀框架）的序列。以以提供用於其下游（在本文中下游與3,可互換使用）緊鄰之開放閱讀框架之轉譯的獨立核糖體入口位點。不同於可具有多順反子（亦即編碼自mRNA依序轉譯之若干不同多肽）的細菌性mRNA，動物細胞之大多數mRNA具有單順反子且僅針對一種多肽或蛋白質之合成而編碼。對於真核細胞中之 129250.doc -17- 200902544 多順反子轉錄物，轉譯大多數自5,轉譯起始位點處起始，在第一終止密碼子處終止，且轉錄物將自核糖體釋放，導致mRNAt僅第一經編碼多肽之轉譯。在真核細胞中，具有與轉錄物中之第二或後續開放閱讀框架可運作地連接之 IRES的多順反子轉錄物允許該下游開放閱讀框架順次轉譯以產生由同一轉錄物編碼之兩個或兩個以上多肽。爪以元件在載體構築中之用途先前已描述，參見例如PeUetier，厂等人，Nature 334 (1988) 32〇.325 ; Jang，s k 等人j

Virol. 63 (1989) 1651-1660 ; Davies, M.V.等人，j. Vir〇1 66 (1992) 1924-1932 ; Adam，M.A.等人 ’ j. Vir〇1 65 (1991) 4985-4990 ; Morgan, R.A.等人，Nucl Acids Res 20 (1992)1293-1299 ’ Sugimot。，Y等人，Bi〇techn〇】〇gy 12 (1994) 694-698 ; Ramesh，N.等人，Nucl. Acids Res. 24

BioTechniques (1996) 2697-2700 ;及 Mosser，D.D·等人 22 (1997) 150-161)。可運作地連接”係指兩個或兩個以上組份之並置，其中所述之組份處於允許彼等輯欲方式作用之關係中。舉例而言’若啟動子及/或增強子以順式作用以控制或調節所連接序列之轉錄’則其與編碼序列可運作地連接。通常，但並不-I，’可運作地連接”之該等隱序列為鄰接的，當需要接合兩個蛋白質編碼區域(諸如分泌引導子斑多肽，或兩個多肽）時，彼等為鄰接的且於閱讀框架中。然而，雖然可運作地連接之啟動子通常位於編碼序列之上游，但並不-定與其鄰接。增強子不必為鄰接的。若增強 I29250.doc 200902544 子增加編碼序列之轉錄，則增強子與編碼序列可運作地連接。可運作地連接之增強子可位於編碼序列之上游、内部或下游且距啟動子相當遠之距離。^_個聚腺㈣位點位於編碼序列之下游端（3ι端）以致轉錄自編碼序列進行至該聚腺苦k序$ I則s亥聚腺穿gt位點與編碼序列可運作地連接連接係藉由此項技術中已知之重組方法（例如使用方法)及/或藉由在便利限制位點連結來實現。若便利限制位』不存纟，則根據習知實務使用合成寡核普酸接附子 (adaptors)或連接子。本文中所用之術語"表現，，係指在細胞（例如產生重組多肽之伟主，、.田胞）内！务生之轉錄及/或轉言學。所欲產物在宿主細胞中之轉錄知度可基於細胞中存在之相應之量測定。舉例而言，一個序列轉錄之mRNA可藉由pcR或藉由北方雜交（N〇rthern hybridizati〇n)定量（參見 Sambr〇〇k 等人 Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring

Harbor Lab〇ratory Press (1989))。一種核酸或結構基因編碼之蛋白質可藉由各種方法定量，例如藉由eusa，藉由檢疋蛋白質之生物活性，或藉由採用與該活性無關而使用辨識且結合於該蛋白質之抗體的檢定，諸如西方墨點 (Western blotting)或放射免疫檢定（參見Sambr〇〇k等人， 1 9 8 9，如上述）。 ”侣主細胞”係指待表現或待擴增之核酸引入其中之細胞。術语”宿主細胞"包括用於繁殖質體之原核細胞及用於表現核酸之真核細胞。較佳地，原核細胞為大腸桿菌細胞 129250.doc •19· 200902544

(E.coli)。較佳地，真核細胞為哺乳動物細胞。較佳地，哺乳動物細胞係選自包含CHO細胞（例如ch〇 Kl、CHO DG44)、BHK 細胞、NS0 細胞、SP2/0 細胞、HEK 293 細胞、HEK 293 EBNA細胞、PER.C6®細胞及c〇S細胞之哺乳動物細胞之群。如本文中所用，表現，，細胞”包括受檢細胞及其子代。因此，措詞”轉型體”、”轉型細胞”、”轉染體" 及"轉染細胞”包括初級受檢細胞及與傳繼數目無關之由其衍生之培養物。亦應瞭解歸因於故意或無意突變，所有子代可此並不在DNA内容方面精確地一致。具有與在最初轉型細胞中所篩選者相同之功能或生物活性的變異子代包括在内。多肽”為自然地或合成地產生之由肽鍵接合之胺基酸殘基之聚合物。少於約20個胺基酸殘基之多肽可稱作，，肽,，。 ’’蛋白質’’為包含一或多個多肽鏈之多肽，其中至少一鏈具有100個或100個以上之胺基酸之長度。蛋白質亦可包含非肽組份，諸如碳水化合物基團。碳水化合物及其他非肽取代基可由其中產生蛋白質之細胞添加至蛋白質，且可隨細胞之類型巾變化。纟本文中依據蛋白質之胺基酸主鏈結構來定義蛋白質；諸如碳水化合物基團之添加通常並不予以指定’但仍然可存在。 ”異源DNA”或”異源多肽”係指並非自然地存在於給定宿主細胞内之DNA分子或多肽，或DNA分子之群體或^肽: 群體。特定宿主細胞之異源DNA分子可含有由宿主細胞物種衍生之DNA(亦即内源性DNA)，只要彼宿主dna與非宿 129250.doc -20- 200902544 主DNA(亦即外源性DNA)組合即可。舉例而言，含有與包含啟動子之宿主DNA區段可運作地連接的編碼多肽之非^ 主DNA區段的DNA分子視為異源DNA分子。相反地，異源驅分子可包含與外源性啟動子可運作地連接之内源性= 構基因。由非宿主DNA分子編碼之多肽為，，異源”多肽。 ”選殖質體”為具有在宿主細胞中自主複製之能力之核酸’諸如質體、黏粒、嗤菌粒或細菌人工染色體(BA。。 r 選殖質體通常含有允許以不損失質體之必需生物功能的可確定方式插入核酸的-個或少量限制性内切核酸酶辨識位點，以及編石馬適用於識別及選擇以選殖質體轉型之細胞的 ^㈣擇標記的核《序列。抗性基因通常包括提供㈣素、安比西林或新黴素抗性之基因。通1 表現編碼待表現於宿主細胞中之多狀的核酸。 (H复製1體包含例如大腸桿菌之原核質體繁殖單元复製起點，及選擇標記）、真核選擇標記，及一或多個表現所關注之結構基因之表現 5 動子、結構基因及包括聚腺㈣每-者包含啟因表現通常置於啟動子/轉錄終止子)。基動子，，可運作地連接”。類=若::結構基:稱為與啟子之活性，則調控元件與核心啟動子可郎核心啟動 ”經分離多肽"為基本上不含有乍地連接。聯之污染細胞組份(諸如碳水化人狀態中與多肽相關雜請多肽。通常，經：製：質或其他蛋白質式之多狀，亦即至少約80%純至之製劑含有高度純淨形芏少約90%純、至少約 129250.doc 200902544 95%純、大於95%純，《大於99%純。展示特定蛋白質製劑含有經分離多月太的一#方法為藉由在*白質製劑之十二烷基硫酸鈉（SDS)-聚丙烯醯胺凝膠電泳及凝膠之考馬斯亮藍（c〇〇massie BriUiant Blue)染色之後顯現單一區帶。然而，術語”經分離”不排除同一多肽以替代實體形式（諸如2 聚體或者糖基化或衍生形式）存在。術語”免疫球蛋白”係指由一或多個大體上由免疫球蛋白基因編碼之多肽組成之蛋白質。組成免疫球蛋白之不同多肽視其重量而稱為輕多肽鏈及重多肽鏈。所辨識之免疫球蛋白基因包括不同恆定區基因以及大量免疫球蛋白可變區基因。免疫球蛋白可以多種形式存在，包括例如單一重鏈及輕鍵、Fv、Fab及F(ab)2以及單鏈（scFv)(例如Hust〇n，】s 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883 ; Bird，R.E.等人，Science 242 (1988) 423-426 ;及一般地， Hood 等人，Immunology, Benjamin Ν.Υ·，第 2版（1984)及 Hunkapiller，τ.及 Hood，l.，Nature 323 (1986) 15-16)。免疫球蛋白一般包含兩個輕多肽鏈及兩個重多肽鏈。重多狀鏈及輕多肽鏈中之每一者含有可變區（多肽鏈之胺基末端部分），其含有能與抗原相互作用之結合域。重多肽鏈及輕多肽鏈中之每一者包含恆定區（多肽鏈之羧基末端部分）。重鏈之恆定區介導抗體i)與諸如巨噬細胞之攜有 Fey受體（FCYR)之細胞或⑴與攜有亦稱為Brainbell受體之新生兒Fc受體（FcRn)的細胞之結合。免疫球蛋白之輕鏈或重鏈之可變域又包含不同區段’亦即四個構架區（FR)及三個 129250.doc -22- 200902544 局變區（CDR)。 ▲免疫求蛋白片段"表示保留與完整免疫球蛋白所結合之杬原相同之抗原結合的能力之完整免疫球蛋白之片段。”完整免疫球蛋白”為由兩個輕多肽鏈及兩個重多肽鏈(其每一者包含可變區及怪定區）組成之免疫球蛋白。，，免疫球蛋白、〇〇物表不免疫球蛋白與另一非免疫球蛋白多肽之έ士 A 物。抗原之結合並未由與另一多肽之結合而削弱。— 如此申請案内所表示之”轉錄終止子，，為50·750個鹼基對之長度之DNA相，其向腿聚合酶提供終止抓财合成之信號。可採取表現卡g之3,端之極高效(強)終止子以尤其在使用強啟動子時防止RNA聚合酶通讀。低效轉錄終止子可導致形成操縱子狀爪讓，其可為不當(例如經質體編碼）基因表現之原因。士用於此申明案内之術語"連接子多肽”表示自然及/或合成來源之肽連接子多肽。其包含㈣種自然產生之胺基酸作為單體建構基塊之線性胺基酸鏈。該鏈具有1至個胺基酸之長度，較佳介於3與25個胺基酸之間。連接子多肽可3有重複胺基酸序列或自然產生之多肽之序列，諸如具有鉸鏈功此之多肽。連接子多肽具有藉由允許肽正確地摺 3!且適當地呈現來確保與另一多肽結合之多肽可保留其結 a丨生貝的功能。較佳地，連接子多肽為經指明富含甘胺酸、榖胺醯胺及/或絲胺酸殘基之多肽。此等殘基排列成例如具有至多五個胺基酸之較小重複單元，諸如 GGGGS、QQQQG或SSSSG。此較小重複單元可重複二至 129250.doc -23- 200902544 五次以形成多聚體單位。在多聚體單位之胺基及/或羧基末端處，可添加至多六個其他任意的自然產生之胺基酸。其他合成肽連接子包含重複10至20次之間的單一胺基酸，諸如連接子SSSSSSSSSSSSSSS中之絲胺酸。在胺基及/或羧基末端中之每一者處，可存在至多六個其他任意的自然產生之胺基酸。如用於此申請案内之術語，，胺基酸”表示包含以下各者之可由核酸編碼之羧基α_胺基酸之群：丙胺酸（三字母代碼· ala ’ 一子母代碼：Α)、精胺酸（arg，R)、天冬醯胺酸 (asn，N)、天冬胺酸（asp , D)、半胱胺酸（cys，c)、穀胺醯胺（gin，Q)、麩胺酸（glu，E)、甘胺酸（gly，G)、組胺酸 (his，Η)、異白胺酸（ue，j)、白胺酸（丨eu，L)、離胺酸 (lys ’ K)、曱硫胺酸（met，μ)、苯丙胺酸（phe，F)、脯胺酸（pro ’ P)、絲胺酸（ser，s)、蘇胺酸（thr，丁）、色胺酸 (trp，W)、酪胺酸（tyr，Y)及纈胺酸（val，V)。 π抗融合肽”為抑制與膜融合相關之事件或膜融合事件本身、尤其包括抑制歸因於膜融合而導致之病毒感染未受感染之細胞的肽。此等抗融合肽較佳為線性肽。舉例而言，其可由gp41胞外域（例如DPI 07或DPI 78)衍生。該等肽之實例可見於 US 5,464,933、US 5,656,480、US 6,013,263、US 6,017,536 > US 6,020,459 > US 6,093,794 ' US 6,060,065 ' US 6,258,782、US 6,348,568 ' US 6,479,055、US 6,656,906、W0 1996/19495、WO 1996/40191 ' WO 1999/59615、WO 2000/69902 及 WO 2005/067960 中。舉例 129250.doc -24· 200902544 而言，該等肽之胺基酸序列包含US 5,464,933之SEQ ID NO: 1 至 10 ; US 5,656,480 之 SEQ ID NO: 1 至 15 ; US 6,013,263 之 SEQ ID NO: 1 至 1 0及 1 6至 83 ; US 6,0 1 7,536之 SEQ ID NO: 1 至 10、20至 83及 139至 149 ; US 6,093,794之 SEQ ID NO: 1 至 10、17至 83及 2 10至 214 ; US 6,060,065之 SEQ ID NO: 1 至 10、16至 83及 210至 211 ; US 6,258,782之

SEQ ID NO: 1286 及 1310 ; US 6,348,568 之 SEQ ID NO: 1129、1278-1309、1311 及 1433 ; US 6,479,055 之 SEQ ID NO: 1 至 10及 210至 238 ; US 6,656,906之 SEQ ID NO: 1 至 171 ' 173至216、218至219 ' 222至 228、231、233至 366、 372至398 、 400至456 、 458至498 、 500至570 、 572至620 、 622至651 、 653至736 、 739至785 、 787至811 、 813至815 、 816至823 、 825 、 827至863 、 865至875 、 877至883 、 885 、 887 至 890 ' 892 至 981、986 至 999、1001 至 1003 ' 1006 至

1018 、 1022至 1076 > 1078至 1213 、 1218至 1268 ' 1271至 1364 、 1366 、 1024、1026 至 1079 、 1082至 1223、1227 至 1275、1277、 1368 、 1370 、 1028 、 1030至 1117 、 1120至 1237 、 1244至 1345 至 1348、 1372 、 1374至 1032 、 1037至 1176 、 1179至 1245 、 1256至 1350至 1362 、 1376 、 1378至 13 79、1381 至 1385、1412 至 1417、1421 至 1426、1428 至 1430、1432、1439 至 1542、1670 至 1682、1684 至 1709、 1712 至 1719、1721 至 1753、1755 至 1757 ;或 WO 2005/067960之SEQ ID NO: 5至95。抗融合肽具有包含5 至100個胺基酸、較佳1 0至75個胺基酸且更佳1 5至50個胺 129250.doc -25- 200902544 基酸之胺基酸序列。 "CCR5” 意謂如例如〇ppermann，M., Cell Signal. 16 (2004) 1201-1210 及 SwissProt P51681 中所描述之人類 CCR5。術語"抗CCR5抗體"表示與CCR5特異性結合且視情況抑制HI V與標乾細胞之融合的抗體。結合可在基於細胞之活體外ELISA檢定（表現CCR5之CHO細胞）中測試。若抗體在100 ng/ml之抗體濃度下導致5或更大、較佳10或更大之S/N(信號/雜訊）比率，則發現結合。術語"抑制HIV與標靶細胞之融合"係指在包含以下步驟之檢定中量測之對HIV 與標靶細胞融合的抑制：將該標靶細胞（例如PBMC)與病毒在處於有效抑制病毒與該細胞之間的膜融合之濃度之抗體的存在下接觸，及量測例如螢光素酶報導體基因活性或 HIV p24抗原濃度。術語"膜融合"係指共表現CCR5及CD4 多肽之第一細胞與表現HIV env蛋白質之第二細胞或病毒之間的融合。膜融合係由遺傳工程化細胞及/或病毒藉由報導體基因檢定（例如藉由螢光素酶報導體基因檢定）來測定。較佳抗 CCR5 抗體在 US 2004/0043033、US 6,610,834、 US 2003/0228306、US 2003/0195348、US 2003/0166870、 US 2003/0166024、US 2003/0165988、US 2003/0152913 ' US 2003/0100058、US 2003/0099645、US 2003/004925 1、

US 2003/004441 1、US 2003/0003440、US 6,528,625、US 2002/0147147、US 2002/0146415、US 2002/0106374、US

2002/0061834 、 US 2002/0048786 、 US 2001/0000241 、 EP 129250.doc • 26· 200902544 1 322 332、EP 1 263 791、EP 1 207 202、EP 1 161 456、 EP 1 144 006、WO 2003/072766、WO 2003/066830、WO 2003/033666、WO 2002/083172、WO 02/22077、WO 01/58916、WO 01/58915、WO 01/43779、WO 01/42308及 WO 2006/103100中提及。尤其較佳抗CCR5抗體描述於WO 2006/103100中。 "CD4” 意謂如例如 Brady, R.L.及 Barclay，A.N., Curr. Top. Microbiol. Immunol.’ 205 (1996) 1-18 及 SwissProt P0 173 0中所描述之人類CD4。術語"抗CD4抗體"表示與 CD4特異性結合且較佳抑制HIV與標靶細胞之融合的抗體。結合可在基於細胞之活體外ELIS A檢定（表現CD4之 CH◦細胞）中測試。若所討論抗體在1〇〇 ng/ml之抗體濃度下導致5或更大、較佳1〇或更大之S/N(信號/雜訊）比率，則發現結合。術語”抑制HIV與標靶細胞之融合"係指在包含以下步驟之檢定中量測之對HIV與標靶細胞融合的抑制：將該標靶細胞（例如PBMC)與病毒在處於有效抑制病毒與該細胞之間的膜融合之濃度之所討論抗體的存在下接觸，及量測例如螢光素酶報導體基因活性或HIV p24抗原濃度。術語"膜融合”係指表現CD4多肽之第一細胞與表現 HIV env蛋白質之第二細胞或病毒之間的融合。膜融合係由遺傳工程化細胞及/或病毒藉由報導體基因檢定（例如藉由螢光素酶報導體基因檢定）來測定。

較佳抗CD4抗體在例如Reimann，K.A.等人，Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943、EP 0 512 112、US 129250.doc -27- 200902544 5,871,732、EP 0 840 618、EP 0 854 885、EP 1 266 965、 US 2006/0051346、WO 97/46697、WO 01/43779、US 6，13 6,310、\\^〇 91/009966中提及。尤其較佳抗€04抗體在 US 5,871，732 及 Reimann，K.A.等人 ’ Aids Res. Human Retrovir. 13 (1997) 933-943 及 WO 91/009966 中描述。尤其較佳抗CD4抗體之特徵在於在將其投與人類時其為非免疫抑制性或非耗盡抗體且亦不阻斷HIV gpl20與人類CD4之結合。 "HIV-1 ”表示人類免疫缺陷性病毒1型gp 120。術語”中和性抗HIV-1抗體”表示在一個以上構形抗原決定基處與出乂-1 gp 1 20特異性結合且中和gp 120結合能力以及視情況抑制 HIV與細胞融合的抗體。例示性''中和性抗HIV-1抗體”為 B12及4KG5。此等單株抗體係針對位於HIV gpl20中之構形抗原決定基。B 12抗體抗原決定基例如經預測由位於 CD4結合位點之周邊之gpl20之四個肽區段（殘基V254-T257、D368-F376、E38 1-Y384 及 1420-1424)組成（Bublil, E.M·等人，FASEB J. 20 (2006) 1762-1774 ; Zwick，Μ.B.等人，J. Virol. 77 (2003) 6965-6978)。Β12抗體可重新設計以避免存在於正常組織中之抗原決定基辨識。本發明報導一種多肽結合物，其中該結合物包含 a) 第一多肽，其選自包含SEQ ID NO: 01之多肽及其片段之群， b) 第二多肽，其選自抗融合肽之群。包含於根據本發明之多肽結合物中之第一多肽係選自包 129250.doc -28· 200902544 含SEQ IDNO:01之多肽及其片段之群。第一多肽為人類補體因子Clq之A次單元或其片段。人類補體因子Clq之A次單元（在下文中表示為ClqA)之胺基酸序列提供於SEQ ID NO: 01中。ClqA之片段表示SEQ ID NO: 01之至少12個連續胺基酸殘基、SEQ ID NO: 01之至少15個連續胺基酸殘基或SEQ ID NO: 01之至少18個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。SEQ ID NO: 01之例示性片段包含 KGSPGNIKDQ PRPAFSA (SEQ ID NO: 02)， KGSPGNIKDQ PRPAFSAI (SEQ ID NO: 03)， GARGIPGIKG TKGSPGNIKD QPRPAFSAIR R (SEQ ID NO: 04)， GARGIPGIKG TKGSPGNIKD QPRPAFSAIR RNPPMGGNVV IFDTVITNQE EPYQNHSGRF VCTVPGYYYF TFQVLSQWEI CLSIVSSSRG QVRRSLGFCD TTNKGLFQVV SGGMVLQLQQ GDQVWVEKDP KKGHIYQGSE ADSVFSGFLI FPSA(SEQ ID NO: 05) > 或

KGDQGEPGPS GNPGKVGYPG PSGPLGARGI PGIKGTKGSP

GNIKDQPRPA FSAIRRNPPM GGNVVIFDTV ITNQEEPYQN

HSGRFVCTVP GYYYFTFQVL SQWEICLSIV SSSRGQVRRS

LGFCDTTNKG LFQVVSGGMV LQLQQGDQVW VEKDPKKGHI YQGSEADSVF SGFLIFPSA (SEQ ID NO: 06) 在一實施例中，第一多肽係選自包含SEQ ID NO: 06之多肽及其片段之群。SEQ ID NO: 06表示ClqA之球狀頭部。ClqA之球狀頭部之片段表示SEQ ID NO: 06之至少12 個連續胺基酸殘基、SEQ ID NO: 06之至少15個連續胺基 129250.doc -29· 200902544 酸殘基或SEQ ID NO: 06之至少18個連續胺基酸殘基之胺基酸序列。第二多肽係選自抗融合肽之群。舉例而言，抗融合肽由 HIV-1 gp41蛋白質（SEQ ID NO: 07)衍生。此等抗融合肽較佳為線性肽。例示性抗融合肽為DPI 07、DPI 78、C-34、 N-36、T-20、T-651、T-1249、T-1357、T-1357 變異體、 Τ-2635、HIV-1 gp41胞外域變異體單一突變體：Ι568Ρ，及HIV-1 gp41胞外域變異體四重突變體：I568P、L550E、 L5 66E、I5 80E。一些抗融合肽之胺基酸序列提供於表1 中〇表1 :抗融合肽之胺基酸序列抗融合肽胺基酸序列 SEQ ID NO: DP-107 NNLLRAIEAQ QHLLQLTVWG IKQLQARILA VERYLKDQ 08 DP-178 QQEKNEQDLL ALDKWASLWT WFDISHWLWY IKIFIMIV 09 C-34 WMEWDREINN YTSLIHSLIE ESQNQQEKNE QELL 10 N-36 SGIVQQQNNL LRAIEAQQHL LQLTVWGIKQ LQARIL 11 T-20 YTSLIHSLIE ESQNQQEKNE QELLELDKWA SLWNWF 12 T-651 MTWMEWDREI NNYTSLIHSL IEESQNQQEK NEQELL 13 129250.doc -30- 200902544

抗融合狀胺基酸序列 SEQ ID NO: T-1249 WQEWEQKITA LLEQAQIQQE KNEYELQKLD KWASLWEWF 14 T-1357 WQEWEQKITA LLEQAQIQQE KNEYELQKLD KWASLWEWF 15 T-1357變異體 MRGSHHHHHH AIDVIEGRWQ EWEQKITALL EQAQIQQEKN EYELQKLDKW ASLWEWFG 16 T-2635 TTWEAWDRAIAEYAARIEAL IRAAQEQQEK NEAALREL 17 HIV-1 gp41胞外域變異體單一突變體： I568P VQARQLLSGI VQQQNNLLRA IEGQQHLLQL TVWGPKQLQA RILAVERYLK DQQLLGIWGC SGKLICTTAV PWNASWSNKS LEQIWNNMTW MEWDREINNY TSLIHSLIEE SQNQQEKNEQ ELL 18 HIV-1 gp41胞外域變異體四重突變體： I568P、L550E、 L566E、I580E MGAASMTLTV QARQLLSGIV QQQNNELRAI EGQQHLEQLT VWGPKQLQAR ELAVERYLKD QQLLGIWGCS GKLICTTAVP WNASWSNKSL EQIWNNMTWM EWDREINNYT SLIHSLIEES QNQQEKNEQE LL 19

胺基酸序列及位置編號係如BH8參考病毒株中一般（基因座 HIVH3BH8 ;來自 France 之 HIV-1 分離株 LAI/IIIB 純系 BH8 ; Ratner，L.等人，Nature 313 (1985) 277-284)。該等抗融合肽之其他實例可見於US 5,464,933、US 5,656,480、 US 6,013,263 > US 6,017,536、US 6,020,459、US 6,093,794 ' US 6,060,065 ' US 6,258,782 ' US 6,348,568 > US 6,479,055、US 6,656,906、WO 1996/19495、WO 129250.doc -31 - 200902544 1996/40191、WO 1999/59615、WO 2000/69902 及 WO 2005/067960中。抗融合肽具有包含5至100個胺基酸、10 至75個胺基酸、較佳15至50個胺基酸之胺基酸序列。尤其較佳抗融合肽為 C-34、T-20、T-1249、T-1357、T-651、 T-2635、N-36、（R0〇t，M.J.等人，Curr. Pharm. Des. 10 (2004) 1805-1825)、DP-107(Wild，C.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 12676-12680)、DP-178、HIV-1

gp41胞外域變異體單一突變體：i568p及/或出^丨即41胞外域變異體四重突變體：I568P、L55〇E、L566E、I580E。根據本發明之結合物包含一個以上多肽。因此，一個多肽形成結合物之N末端且一個多肽形成結合物之c末端。此等多肽之N末端至C末端順序為任意的。此舉允許結合多肽中之任一者處於N末端及結合多肽中之任一者處於c 末端’其限制條件為多肽中之每—者僅存在於結合物中一次。在a施例中，根據本發明之結合物包含處於選自以下順序之順序中的第一多肽及第二多肽： N末端-第一多肽·第二多肽_c末端，或 N末¼ •第—多肽-第一多肽末端。根據本發明之結合物可包含另—額外多肽，即連接 :二：此，在一實施例中’根據本發明之結合物包含介於 ^义肽與第二多肽之間的連接子多肽。較展示於表2中。恢卞夕狀 129250.doc -32- 200902544 表2 :連接子多肽連接子多肽編號連接子多肽胺基酸序列 SEQ ID NO: 1 LSLSPGK 20 2 LSPNRGEC 21 3 Γ〇〇4ΐ3 22 4 [gq4i3g 23 5 『gq4i3gnn 24 6 GGG[SG412SGG 25 7 GGG『SG412SGN 26 8 rSG4l3 27 9 『SG413G 28 10 G[SG413T 29 11 [SG413GG 30 12 rSG4]3GGT 31 13 『SG413GGN 32 14 [SG413GAS 33 15 [SG415 34 16 [SG415G 35 17 [SG415GG 36 18 [SG415GAS 37 19 G(S)I5G 38 20 g(s)15gas 39 21 G . 22 N _ 23 GST 24 [(G)4S13GAS 40 25 『(G)4S13G 41 26 [(G)4si5g 42 27 [(G)4S13GG 43 28 f(G)4Sl5GG 44 29 LSLSGG 45 30 LSLSPGG 46 31 [G3SI5 47 32 [G3SI5GGG 48 129250.doc -33- 200902544 尤其較佳為連接子多肽[GQ4]3GNN(SEQ ID NO: 24)、 LSLSPGK(SEQ ID NO: 20)、LSPNRGEC(SEQ ID NO: 21)、LSLSGG(SEQ ID NO: 45)、LSLSPGG(SEQ ID NO: 46)、[G3S]5(SEQ ID NO: 47)，及[G3S]5GGG(SEQ ID NO: 48)。所有連接子多肽可由核酸分子編碼，因此可以重組表現。因為連接子多肽本身為肽，所以與多肽連接子連接之多肽係經由一個形成於兩個胺基酸之間的肽鍵來連接。因此，根據本發明之多肽結合物可由蛋白質表現而重組產生。在另一個實施例中，本發明包含一種除第一多肽及第二多肽之外結合另外第三多肽的多肽結合物。如上所述，第一多肽為人類補體因子Clq之A次單元或其片段。如上所述，第二多肽為選自抗融合肽之群的多肽。第三多肽為抗CCR5抗體或抗CD4抗體或抗HIV-1抗體之抗原結合片段。如用於此申請案内之術語”抗原結合”表示與其抗原結合之抗體或其片段。在抗CCR5抗體之情況下，結合係針對 CCR5受體，在抗CD4抗體之情況下，結合係針對CD4受體，且在抗HIV-1抗體之情況下，結合係針對HIV gp 120。以KD值給出之結合親和力為10_5 mol/1或更低（例如 HT8 mol/1)，具有10_7 mol/1或更低之KD值，或具有1〇_9 mol/1或更低之KD值。結合親和力係以諸如表面電聚共振技術（BIAcore®)之標準結合檢定來測定。此結合親和力值不必須處理成精確值；其僅為參考點。其用以測定及/或 129250.doc -34- 200902544 選擇例如展示免疫球蛋白典型的對於CCR5受體抗原之特異性標靶結合且因此具有治療活性的抗CCR5抗體或其片段。此情況同樣亦適用於抗CD4抗體及抗HIV-1抗體。如用於此申請案内之術語”抗CCR5抗體之抗原結合片段之群”表示保留抗原結合能力之抗CCR5抗體之任何片段。該等片段通常包含抗CCR5抗體輕鏈或重鏈之可變域之至少一部分。該等片段可例如為單一重鏈或輕鏈、Fv-片段、Fab-片段、及F(ab)2-片段以及單鏈抗體（scFv)。其片段適用於根據本發明之結合物之較佳抗CCR5抗體報導於 WO 2006/103 100 中。其片段適用於根據本發明之結合物之較佳抗HIV-1抗體為 B12及 4KG5。較佳抗CD4抗體描述於US 5,871,732、Reimann，K.A.等人，Aids Res. Human Retrovir· 13 (1997) 933-943 及 WO 91/009966中。在包含第一多肽、第二多肽及第三多肽之多肽結合物中，六種不同N末端（N末端表示為NH2)至C末端（C末端表示為COOH)順序為可能的。此順序之群包含： (1) NH2-第一多肽-第二多肽-第三多肽-COOH， (2) NH2 -第一多肽-第三多肽-第二多肽-COOH， (3) NH2 -第二多肽-第一多肽-第三多肽-COOH， (4) NH2 -第二多肽-第三多肽-第一多肽-COOH， (5) NH2 -第三多肽-第一多肽-第二多肽-COOH， (6) NH2 -第三多肽-第二多肽-第一多肽-COOH。 129250.doc -35 - 200902544 視情況可將連接早夕夕狀包括於結合多肽中之每一者之間。在此情況下，4丨

13另外包括一連接子多肽之順序（1)包含四種不同順序：、汁I (1)(la) NH2 -第 NH2 -第 COOH，多肽·第二多肽-第三多肽-C〇〇H，多狀-連接子多肽-第二多肽-第三多肽_ (lb) NH2 -篦—夕口丄夕肽-第二多肽-連接子多肽-第三多肽_ COOH，

(lc) NH2 -第 _ 之、土肽-連接子多肽-第二多肽_連接子多肽_ 第三多肽-COOH。因此’在所有選擇性連接子多肽之存在下，24種不同順序為可能的。根據本發明之多肽結合物包含每—多肽最多—次，但連接子多肽除外’其可包含至多三次。因此’本發明包含—種多肽結合物，其包含： a) 第—多狀（第一pp)，其選自包含SEQ m No: 〇1之多肽及其片段之群， b) 第一多狀（第二pp)，其選自抗融合肽之群， C)選擇性第三多肽（第三PP)，其選自抗CCR5抗體之抗原結合片段之群或抗CD4抗體之抗原結合片段之群， d)選擇性連接子多肽（連接PP),其連接該第一多肽' β亥第二多肽及/或該第三多肽，藉以使得该等多肽具有如下之Ν末端至C末端順序： 129250.doc -36· 200902544 [第一 PP]a-[連接 PP]m_[第二 PP]b_[連接 ΡΡ]η·[第三 pp]c-[連接 PP]。-[第一 pp]d-[連接 PP]p-[第二 PP]e-[連接 pp]q-[第三 pp]f-[連接 pp]r-[第一 pp]g，其中狂、1)、。'(1、6、5、§、111、11、〇、卩、9、1'皆為0或1 之值之整數，其中 a + d + g= l， b + e = 1， c + f = 0或 1， m、η、ο、ρ、q、r彼此獨立地為〇或1，其中0表示該結合物之指定位置處不存在相應多肽且1表示其存在。在一較佳實施例中，該多肽具有如下之Ν末端至C末端順序： [第三 PP]C-[連接 ΡΡ]。-[第一pp]d-[連接 ρρ]ρ-[第二 pp]e_[連接 PP]q-[第一 PP]g，其中c、d、e、g、o、p、q皆為o或1之值之整數，其中 c = 1 d + g = 1， e = 1，〇、p、q彼此獨立地為〇或1，其中〇表示該結合物之相應位置處不存在相應多肽且丨表示其存在。本發明亦包含一種編碼根據本發明之多肽結合物之核酸。本發明之另一悲樣為一種包含編碼根據本發明之多肽 129250.doc -37- 200902544 結合物之核酸的細胞株。之多肽結合物之方本發明亦包含一種產生根據本發明法，其包含下列步驟： a; 肘巴 _ “ w、找暇的宿3 細胞在適合於表現該多肽結合物之條件下培養，及 b)自該細胞或該培養基回枚該多肽結合物。

術語”在適合於表現該多肽結合物之條件下"表示用於培養表現異源多肽之細胞且為熟習此項技術者已知或可容易地確定的條件。熟習此項技術者亦已知此等條件可視所培養之細胞類型及所表現之多肽類型而變化。一般而令，細胞在例如介於20T：與4CTC之間的溫度下，且歷經一段足以允許有效產生多肽結合物之時間（例如4至28日）來培養。在一實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞。本發明另外包含一種醫藥組合物，其含有根據本發明之多肽結合物或其醫藥學上可接受之鹽以及醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。如本文中所用，”醫藥學上可接受之載劑，，包括任何及所有生理上相容之溶劑、分散介質、塗料、抗菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收/再吸收延遲劑及其類似物。較佳地，載劑適合於注射或輸注。醫藥學上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。該等介質及藥劑用於醫藥學上活性物質之用塗在此項技術中為已知的。除水以外，載劑可例如為等滲緩衝鹽水落液。 129250.doc -38· 200902544 與所選擇之投藥途經無關，可以合適水合形式使用之本發明之化合物及/或本發明之醫藥組合物係藉由孰習此：技術者已知之習知方法調配成醫藥學上可接受之劑、本發明之醫藥組合物中之活性成份的實際劑量水準可改 :，以便在對患者無毒性之情況下獲得可有效達成： . 、式所而之治療反應的活性成份之量。所選劑董水準將視多種藥物動力學因素而$，該等

括所採用之本發明之特定組合物之活性、投藥：徑、二時間、所採用特；t化合物之排泄速率、與所採用特定二物組合使用之其他藥物'化合物及/或材料、所治療患：之年齡、性別、體重、病狀、―般健康情況及先前病史及醫學技術中熟知之類似因素。本發明另外包含一種根據本發明之多肽結合物的用途，其係用於製造供治療病毒感染用之藥物。較佳地，病毒感染為HIV感染。本發明亦包含一種根據本發明之多肽结：物的用途，其係用於治療需要抗病毒治療之患者。本^ 亦包含一種根據本發明之多肽結合物的用途其係用於治療罹患諸如AIDS之免疫缺陷症候群之患者。提供以下實例、序列表及圖式以幫助理解本發明，本發明之真實範4閣明於隨附中請專利範圍中。應瞭解所閣明之程序可進行修改而不悖離本發明之精神。實例1 材料及方法關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之—般資 129250.doc -39- 200902544 訊在 Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中給出。抗體鏈之胺基酸根據EU編號來編號（Edelman，G.M.等人，？!·。。· Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85 ; Kabat, E.A.等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，

Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD，（1991))。重組DNA技術使用如Sambrook，J.等人，Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989中所述之標準方法來處理DNA。根據製造商之用法說明書來使用分子生物學試劑。基因合成所需基因區段係自化學合成所製造之寡核苷酸來製備。以單一限制性内切核酸酶裂解位點側接之1 00-600鹼基對 (bp)長基因區段係藉由寡核苷酸之黏接及缚結（包括PCR擴增）組裝，且隨後經由Eco Rl/HindIII限制性位點選殖於 pQE80L載體（Qiagen，Hilden，Germany)中。次選殖基因片段之DNA序列由DNA測序來證實。蛋白質測定結合物之蛋白質濃度係藉由使用基於胺基酸序列所計算之莫耳消光係數而測定280 nm下之光密度（OD)來測定。實例2 129250.doc •40· 200902544 表現質體之構築基於T5 RNA聚合酶之細菌性pQE80表現載體係購自 Qiagen(Hilden，Germany) °

EcoRI及Hindlll限制性位點用於將編碼ciqA(SEQ ID NO: 6)之核酸序列插入以產生表現質體pQE8〇—ciqA(關於 5主解質體圖譜’參見圖1)。EcoRI及Hindi II限制性位點用於將編碼在N末端至C末端方向上包含抗融合肽t-1357及 C1 qA(SEQ ID NO: 49 ’ 50)之結合物的序列插入以產生表現質體PQE80—Rob I(關於註解質體圖譜，參見圖2)。 EcoRI及Hindlll限制性位點用於將編碼在n末端至C末端方向上包含ClqA及T-1357(SEQ ID NO: 51)之結合物的序列插入以產生表現質體pQE80—Rob 2(關於註解質體圖譜，參見圖3)。實例3 多肽結合物之產生及純化以在實例2中獲得之表現質體來使大腸桿菌細胞轉型。藉由安比西林抗性來選擇經轉型之細菌。接種具有〇丄〇D/mL之OD的開始培養物。在37。〇下將培養物生長於補充有0.5 pg/ml安比西林之SB培養基（32 g腺、20 g酵母提取物、5 g NaCl及5 mL 1 M NaOH添加1 L水）中。在達到高於 0.8-1.0之OD600 nm之後結束培養。將培養肉湯離心且在含有 12.11 g/1 TRIS-羥曱基胺基曱烷（TRIS)、1 MgSC>4、 pH值以25%(w/v)HCl調整至7.0之緩衝液中以高壓使小球中之細胞破裂。每100 mg生物質量使用500 ml緩衝液。在細 129250.doc 41 - 200902544 胞破裂之後將懸浮液離心。將小球以含有200 ml/l 30% (w/v) Brij、1,5 M NaCl 及 60 mM EDTA、pH 值調整至 7.0 的溶液來洗滌。在第二離心步驟之後，將IB以100 mM TRIS、20 mM EDTA(pH值6.5)洗滌。在最終離心步驟之後，將IB離心且儲存在-20°C下。試樣之均質性以SDS-PAGE證實。不需要額外純化步驟。藉由在室溫下攪拌30分鐘將IB溶解於pH值為11.5-12.0之 3 0 mM KOH中。在試樣完全溶解之後，進行複性，繼之以在pH值8.5之50 mM硼酸鹽缓衝溶液中脈衝處理溶解化物至0.3 mg/ml之最大濃度。實例4 使用SDS PAGE之表現分析根據 Schagger，Η.及 von Jagow, G., Anal Biochem. 166 (1997) 36 8-379將經複性結合物藉由十二烷基硫酸鈉（SDS) 聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE)來處理。

SDS-PAGE LDS試樣緩衝液，四倍濃縮物（4x) : 4 g甘油、0.682 g TRIS鹼、0.666 g TRIS鹽酸鹽、0.8 g LDS(十二烷基硫酸鋰）、0.006 g EDTA(乙二胺四乙酸（ethylene diamin tetra acid))、Serva Blue G250於水中之 0.75 ml之 1 重量％(w/w) 溶液、0.7 5 ml之1重量°/〇 (w/w)紛紅溶液、添加水以產生10 ml之總體積。將經複性多肽結合物離心以移除碎片。將澄清上清液之等分試樣與1/4體積（v/v)之4xLDS試樣緩衝液及1/10體積 129250.doc -42- 200902544 (v/v)之0.5 Μ 1，4-二硫蘇糖醇（DTT)混合。隨後將試樣在 70°C下培育10分鐘且藉由SDS-PAGE分離蛋白質。根據製造商之用法說明書使用NuPAGE®預鑄凝膠系統（NuPAGE® Pre-Cast gel system，Invitrogen)。詳言之，使用 10% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS 預鑄凝膠（pH 值 6.4)及 NuPAGE® MOPS運作緩衝液。實例5 表現質體之構築基於T5 RNA聚合酶之細菌性pQE80表現載體係購自 Qiagen(Hilden，Germany) °

EcoRI及Hindlll限制性位點用於將編碼抗CCR5抗體輕鏈-C 1 qA-T-1 249結合物之核酸序列插入以產生表現質體 pQE80_Rob 3。實例6 細胞-細胞融合檢定其描述用於評估人類免疫缺陷性病毒1型（HIV-1)中和作用之基於細胞株之檢定。該檢定係基於經轉染以表現HIV-1協同受體CCR5來補充CD4及CXCR4協同受體之内源性表現的CEM.NKR細胞。所得CEM.NKR-CCR5細胞有效地複製R5及X4表型之初級HIV-1分離株。在具有獲自HIV-1感染個體之血清或特異性抗HIV-1單株抗體的中和作用檢定中，CEM.NKR-CCR5細胞與經促細胞分裂劑活化之外周血單核細胞（PBMC)之比較展示HI V-1中和作用之敏感性在兩個細胞類型中相似。 129250.doc -43- 200902544 在第1曰，將表現gp 1 60之HeLa細胞（每孔2χ 1 04個細胞/ 50 μΐ)在補充有 10% FCS及2 pg/ml多西環素（doxycycline) 之DMEM培養基中接種於白色96孔微量滴定盤中。在第2 日，將每孔1 00 μΐ之上清液試樣或抗體對照物添加於清潔 96孔微量滴定盤中。隨後添加100 μΐ含於培養基中之8xl〇4 CEM-NKr-Luc細胞之懸浮液且在37°C下將其培育30分鐘。將HeLa細胞培養基自96孔板吸出，添加200 μΐ抗體/CEM-NKr-Luc混合物中之100 μΐ且在37°C下將其培育隔夜。在第 3曰，添加100微升/孔之Bright-GloTM螢光素酶檢定受質 (1,4-二硫蘇糖醇及連二亞硫酸鈉；Promega Corp.，USA)且在室溫下將其培育最少15分鐘之後量測發光。材料將HeLa-R5-16細胞（在多西環素誘導之後表現HIV gpl6〇之細胞株）培養於含有營養物及具有400 pg/ml G418及200 pg/ml潮黴素B之10% FCS的DMEM培養基中。CEM.NKR-CCR5-Luc(編目號碼：5198，獲自 NIH AIDS Research &

Reference Reagent Program McKesson BioServices Corporation Germantown，MD 20874，USA之T-細胞株將細胞類型： CEM.NKR-CCR5(編目號碼4376)轉染（電穿孔）以在mv_2 LTR之轉錄控制下表現螢光素酶基因，且在含有1〇%胎牛血清、4 mM麵胺醯胺、青黴素/鏈黴素（ι〇〇 u/mL青黴素、 100 pg/mL鏈黴素）及0.8 mg/ml硫酸古尼黴素（geniticin SUlfate)(G418)之RPMI 164〇中繁殖。生長特徵：圓形淋巴樣細胞，形態無極大改變。細胞以單〜細胞形式（其可形 129250.doc -44 - 200902544 成小凝塊）生長於懸浮液中。每週兩次拆分1 : 1 0。特殊特徵：在HIV-2 LTR轉錄激活之後表現螢光素酶活性。適合於以初級HIV分離株感染’中和作用及藥物敏感性檢定 (Spenlehauer，C.等人，Virology 280 (2001) 292-300 ; Trkola，A.等人 ’ J. Virol. 73 (1999) 8966-8974)。自 John Moore 博士及 Catherine Spenlehauer 博士經由 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, NIAID，NIH獲得細胞株。Bright-GloTM螢光素酶檢定緩衝液（Pr〇mega c〇rp USA，料號E2264B)、Bright-GloTM螢光素酶檢定受質 (Promega Corp. USA，料號EE26B)。實例7 測定多肽之結合親和力基於HIV-1 gp41蛋白質（HR，七胺基酸重複1及2區域）之 HR1-HR2相互作用的多肽之結合親和力係在25χ：下使用 BIAcore® 3000儀器（Pharmacia，uppsala，Sweden)藉由表面電漿共振（SPR)量測。 BIAcore®系統良好地確立用於研究分子相互作用。其允許連續即時監控配位子/分析物結合且因此測定締合速率常數（Μ、離解速率常數⑹及平衡常數（KD)。SPR技術係基於量測接近於金塗佈之生物感應器晶片表面的折射率。折射率之變化指示由經固定配位子與注入溶液中之分析物之相互作用所引起的表面上之質量變化。若分子在表面上結合經固定配位子’則質量增加，在解離之情況下，質量 129250.doc -45- 200902544 結合檢定感應器晶片SA(SA，抗生蛋白鏈菌素（Streptavidin))係藉由二次連續1分鐘注入50 mM NaOH中之1 M NaCl來預洗滌。隨後將生物素標記HR1肽生物素_T_2324(SEQ ID Ν〇: 52)固定於SA塗佈之感應器晶片上。為避免質量傳遞限制，將最低可能值（大約200 RU，共振單位）之溶解於HBS_ P 緩衝液（10 mM HEPES(pH 值 7.4)，150 mM Naa，0.005% (v/v)界面活性劑P20)中之HR1肽載於SA晶片上。在開始量測之前，將晶片以50微升/分鐘之流動速率之〇 5% (w/v)十二烷基硫酸鈉（SDS)進行一分鐘脈衝處理來第一次再生。將待刀析之多肽結合物首先以約1 mg/mL之濃度溶解於 50 mM NaHC〇3(pH值9)中且隨後在HPS_p緩衝液中稀釋至 25 nM至1.95 nM範圍内之各種濃度。試樣接觸時間為5分鐘（締合階段）。其後將晶片表面以HBS-P洗滌5分鐘（解離階段）。所有相互作用確切地在25；3(：(標準溫度）下執行。在量測週期期間，將試樣儲存在12°C下。以每秒一信號之偵測速率來偵測信號。將試樣在50微升/分鐘之流動速率下以漸增之濃度注射於HR1偶合之生物感應器元件上。藉由以50微升/分鐘之流動速率之〇 5% sdS溶液洗滌丨分鐘來使表面再生。疋義為ka/kd之平衡常數（KD)係藉由使用BIAevaluation 4·1套裝軟體分析由若干不同濃度獲得之感應圖譜曲線來測疋。非特異性結合係藉由自HR2-HR1相互作用之值減去有R2之夕狀與游離抗生蛋白鏈菌素表面相互作用之反 129250.doc -46- 200902544 應值來校正型。數據之擬合遵循1:1朗繆爾（Langmuir)結合模表5 : 與區域結合之BIAcore®分;

西方墨點分析將以下試樣（每一者之15 μ] = 1-5 μ§)在還原條件下轉移至 10% Bis-TRIS NuPAGE-Gel。泳道1 -多重標記泳道2-删酸鹽緩衝液泳道 3-T-1249(約 5 kDa) 泳道 4-Rob 1(26 kDa) 泳道 5-Rob 11(25 kDa)

泳道 6-ClqA(28 kDa) 泳道7-空泳道8 -幻標記轉移緩衝液：192 mM甘胺酸，25 mM TRIS，20%曱醇 (v/v)。在SDS-PAGE之後，根據Burnette之”半乾墨點法 (Semidry-Blotting-Method)" (Burnette, W.N., Anal. Biochem. 1 12 (1981) 195-203)將經分離結合物電泳（25 V，1小時）轉 129250.doc -47- 200902544 移至 PVDF渡膜（微孔尺寸：0.45 μηι，Invitrogen Corp.)。在轉潰之後，在室溫下伴以震盪將膜浸沒於TBST(1 1 10 mM TRIS緩衝液，補充有 150 mM NaCl，1 ml Tween® 20 (pH值調整至 7.5))中之 5%膜阻斷劑（Amersham Biosciences) 中約30分鐘且然後在4。〇下隔夜。在阻斷步驟之後，將膜以T B S T反覆洗蘇三次。為進行偵測，使用 5 pg/ml TBST、0.15 mM CaCl2及 12 mM MgCh伴以震盪將經阻斷膜與生物素標記肽HIV_ gp41P2 (5 93-621)-Bi— 起培育 3小時。

在顯影步驟之後’將膜以TBST洗滌且與Lumi-LightPLUS 西方墨點受質一起培育且然後顯影（參見圖4之SDS凝膠及圖5之西方墨點）。【圖式簡單說明】圖1 : PQE80—C lqA之註解質體圖譜。圖2 : pQE80—Rob 1 (融合蛋白質T1357_clqA)之註解質體圖譜。圖3 . pQE80_R〇b 2(融合蛋白質ciqA_T1357)之註解質體圖譜。圖4經純化蛋白質之16% Tricine SDS_pAGE ^)非還原， a2)還原（泳道1 IB-製備R〇b I，泳道2 IB_製備R〇b π，泳道 3洗滌Rob I，泳道4洗滌R〇b π，泳道5生物質量R〇b丨，泳道6生物質量Rob II) ; b)泳道7、8及9 IB_製備clqA還原，泳道10及I2生物質量ClqA還原，泳道13、14及15 IB_製備 ClqA非還原）。 129250.doc •48· 200902544 圖5包含gp41胺基酸位置593-621之肽之西方墨點。圖6在融合抑制檢定中ROB II及T-1249之活性之分析。 129250.doc 49-

Claims

200902544 十、申請專利範圍·· 1. 種肽結合物，甘吐今外；. 、吐 /、特徵在於該結合物包含： a)第一多肽，其谐、、自匕芑SEQ ID NO: 01之多肽及其片 ~弟二多肽，其 2.如請求们之結合^ 合（續鬚_)狀之群。 ^ 物，其特徵在於該第一多肽及該第二、有個選自以下順序之群的順序： C

•第一多肽·第二多肽-C端，或 N端-第二多肽，第—多肽_c端。 3 · 如自奮求項1之纟士 Q σ物，其特徵在於該結合物包含一個連接子夕肽"於該第一多肽與該第二多狀之間。 4. 一種多肽結合物’其特徵在於該結合物包含： a) 第一多肽（第~~ΡΡ)，其選自包含SEQIDN〇:01之多狀及其片段之群， b) 第二多月大（第二卯），其選自抗融合肽之群， C)選擇性第三多^ ^ 1JU 夕狀（苐二pp)，其選自抗體之抗原結合片段之群，或抗HIV-1抗體之抗原結合片段，或抗CD4抗體之抗原結合片段之群， d) 一個選擇性連接子多肽（連接PP)，其連接該第一多狀、該第二多肽及/或該第三多肽，該多肽結合物之該等多肽具有如下之N端至c端順序： [第一 PP]a-[連接pp]m-[第二pp]b_[連接pp]n吖第三[連接PP]。·[第一 PP]d-[連接pp]p_[第二PP]e_[連接刚厂[第三 PP]f-[連接 pp]r-[第一 pp]g， I29250.doc 200902544 之值之整數，其中： a + d + g = 1， b + e = 1， c + f = 〇或 1， m、n、〇、p、q、r彼此獨立地為〇或i，其中〇表示不存在，1表示存在該相應多肽於該結合物之相應位置。如請求項3或4之結合物，其特徵在於該連接子多肽係選 6. 自包含SEQ ID NO: 20至SEQ ID NO: 48之多肽之群。如請求们或2之結合物，其特徵在於該第二多肽係選自 =含SEQ ID NO: G8至SEQ m N〇:19之抗融合肽之群。一種產生如請求項丨或4之多肽結合於該方法包含： &之方去，其特徵在 4 如請求項1或4之多狀結合物之核酸的宿、、、田胞在適合表現該多肽結合物之條 8. 9. b)自該細胞或該培養基回收該多狀結合物。。及一種醫藥組合物’其含有如請求項結合物或其醫藥學上可任—項之多肽賦形劑或載劑。醫藥學上可接受之一種如請求項〗至6中任—項之多 I〇.如請求項9之用途，其特徵在於該病毒感用於製造供治療病毒感染之藥物、，、吉合物的用途，其係染為HIV感染。 129250.doc