TW200900077A - Therapeutic agent for interstitial pulmonary disease comprising anti-HMGB-1 antibody - Google Patents

Description

200900077 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於-種用於治療或預防間質性肺炎之製 劑’含有對抗高移動性群£蛋白f 1(HMGB_n之抗體 有效成分。 ' 【先前技術】 f乳動物的肺’為由以億單位所構成之直徑數微米之 ^包構成之非常細微海綿狀組織，吸人的空氣，通過支氣 管通達到各肺泡。在肺泡周圍非常薄壁之部分，稱為間 質’吸收對於全身細胞供給之氧的毛細血管，以網目狀地 刀布在此肺泡之壁間質部分產纟發炎之疾病，總稱為「間 質改肺火」。其中’容易產生纖維化之疾㉟，總稱為「間 貝性肺炎」。間質性肺炎之中，#生原因不明的特發性間 質性肺炎’由國家指定為難治疾病（特定疾病），發病率據 稱為-般而言，10萬人中有5人左右。間質性肺炎中，隨 症狀進行，肺料變厚，肺泡形狀成^規則，同時肺全 體亦稍微變硬。因，匕，妨礙肺之膨脹，使肺活量下降，同 時氧吸收效率降低’通常主要認為會有呼吸困難、咳嗽等 症狀，此外’有食您不振、體重降低、疲#、虛弱、不明 確的胸部痛等。若進-步進行，則肺會成為纖維性成分之 結塊，已纖維化之部分喪失作為肺之功能。 間貝性肺炎在組織學上，分類為：j)通常型間質性肺 炎⑽說 INTERSTITIALPNEU_IA; υιρ)、2)剝離性間 質性肺炎⑽SQUAMATIVE INTERSTmAL pNEu_ 2125-9414-PF 5 200900077 DIP) 、3)無法分類之間質性肺炎（N〇N_SpEciFIC INTERSTITIAL PNEUMONIA; NSIP)，及 4)急性間質性肺炎 (ACUTE INTERSTITIAL PNEUMONIA; AIP)。再者，被認為 與DIP相關連之已知與吸煙具強相關性的呼吸細支氣管關 連間質性肺炎（RESPIRATORY BRONCHIOLITIS-ASSOCIATED INTERSTITIAL LUNG DISEASE; RB-ILD)，亦分類於間質性 肺炎中。又’已知為就原因不明之纖維化肺泡炎而言的特 發性肺纖維症（IDE0PATHIC PULMONARY FIBROSIS; IPF), Ο 屬於間質性肺炎之慢性纖維化間質性肺炎，在組織學上與 UIP相關連。IPF目前，常以皮質類固醇、環磷醯胺，及 硫唾嘌呤（AZATHI0PRINE)等消炎劑，及秋水仙素 (COLCHICINES)、盤尼西胺（PENICILLAMINE)、吡非尼綱 (PIRFENID0NE)、及干擾素Γ等抗纖維化劑加以處置，但 實情為’該任一者均非改善IPF患者生存率及疾病進行 者，除肺移植以外並無特別有效的治療方法。（非專利文 獻1) I ^

高移動性群匣蛋白質（HIGH MOBILITY GROUP BOX PROTEIN; HMGB 或 HIGH MOBILITY GROUP PROTEIN; HMG) 於1 964年被發現為在染色質構造中所含大量之非組蛋白 蛋白質。HMGB為所有高等動植物中普遍含有之蛋白質，在 種族間初級構造之保守性極高。本案發明人等使用遺傳資 訊處理軟體「GENETYX」（SOFTWARE DEVELOPMENT 公司） 解析胺基酸序列之相同性，結果發現：牛HMGB_1相對於 人類HMGB-1，相同性為98. 6%，豬HMGB-1相對於人 2125-9414-PF 6 200900077 HMGB-l ’ 相同性為 99. 1%。又，Λ * HMPR 1 ia r=i ^ ^ 人類1相對於人類 編-1 ’相同性為81 相對於人類刪小 相同性為叫豬跡2相對於人 為 79. 4%。 i 祁 ij f玍 又，已知HMGB-1不僅存在於 旦幽〜HurD 仕於核内，在細胞質内亦存 里豐画。HMGB之正確生理作用尚 j π % ,但由於與结合 時，會鬆開DNA之雙螺旋構造，因 ^ U此破認為在轉錄反應 广、有彳A之高次構造變化為最適構造而提高轉錄活 =之作為極廣範圍之轉錄促進因子及核小體（則⑽_) 鬆他因子的功能。 對於存在哪些種類之_為明確的。例如，已知有 馬移動性群匣蛋白質哎 _ 4 ilMG-Ι)、咼移動性群匣 蛋白質-2⑽GB-2《齡2)、高移動性群蛋白質 -3(娜-3)、高移動性群蛋白f，HMG —8)、高移動性群蛋 白質-17(HMG-17)、高移動性群蛋白f _ι(ΗΜ(μ)、高移動 性群蛋白質-Υ⑽G-Y)、高移動性群蛋白質 '⑼⑽―1⑺）、高移動性群蛋白f W卜C) 等。 HMGB-1幫助H0X及p〇u等核激素受器家族等蛋白質與 DM之結合，並據報告促進一些基因表現（非專利文獻2)/'。 又，HMGB-1之C末端結構域及A匣，據報告為透過p53 之轉錄活化，及P53依存性之細胞凋零放大所必需（非專 利文獻3)。再者’除了以往所考量之類似轉錄因子蛋白質 的功能，HMGB-1亦被認為有作為類似細胞介素分子之功 7

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能。HMGB-1存在於所有的哺乳動物細胞之核中，除了由壞 死細胞釋出以外’亦由經活化之巨噬細胞、樹狀細胞、及 自然殺手細胞活潑地分泌（非專利文獻4)。HMGB_i受器 中，包含後期糖化反應產物受器（RECEPT〇r F〇r ADVANCED GLYCATION PRODUCTS; RAGE)、類似 TOLL 受器 2(T0LL-LIKE RECEPTOR 2 ; TLR2)及 TLR4(非專利文獻 5)。因此，hmgB-1， 參與包含各種細胞及組織中之感染、組織傷害、發炎、細 胞凋零、及免疫反應的多數反應（非專利文獻4)。 ξ" ' HMGB-1已知扮演在小鼠中之敗血症伴隨肺損傷之進 展，及敗血症患者中重要作用（非專利文獻6)。更詳言之，

Wang等人於1 999年，藉由使用了以HMGB—丨本身作為免疫 原所製備之多株抗體的西方點墨法，首次對於血清中（血 液中）之HMGB-1實施定量測定，並且顯示可成為 敗血症之標記。並且，於敗血症患者中，可藉由精密地測 定血液中之HMGB-1 ’而判別出生存下來之患者及最後會死 / 亡之患者。亦即’不僅確認血液中HMGB-1之存在，且明 瞭了對其量精密定量的有用性。χ，其中，藉由大鼠之模 型動物實驗，藉由將HMGB-1以抗體捕捉，而改善發生敗 血症之大鼠的生存率等，啟示HMGB-1不僅為敗血症標記， 亦可能與中介者亦即原因物質有關為非常重要（非專利 文獻6)。 結合於對應HMGB-1之受器時，係將上皮細胞活化， 將接著分子放大，並且活化巨噬細胞而釋出腫瘤壞死因子 α (TNFa )及介白素(IL-1/3 )，接著放大發炎。與發炎 2125-9414-PF 8 200900077 之初期中；1者TNFa及IL〜不同，hmgb-1為伴隨敗 血症之肺損傷的後期中介者，與患者預後相關連(非專利 文獻7)。 、升寻利 如以上，HMGB-1儘管在急性肺損傷之病理中被認為是 重要分子，但其在慢性肺疾病，尤其肺纖維症進展中之作 用，幾乎為未知的。 另方面，Tracey等人提出將對抗之N末端 寡胜肽的多株抗體，用在敗血症等以活化發炎性細胞介素 ★串級為特徵之疾病的治療（專利文獻i及2)。但是 等人提申之專利文獻中，雖顯示一些關於敗血症之資料， 但對於其他列舉之疾病，未確認是否在活體内會出現 HMGB-卜而且對於投予對抗删]之抗體是否與疾病改 善相關連，亦完全不明瞭。之後，HMGB」使用模型實驗（動 物、細胞培養）及人類檢體顯示在風溼病、ARDS等活體中 可能會出現，但是並不明瞭是否為原因物質。 此外多數專利文獻中提出，將抗HMGB-1抗體用於 抑制發炎反應等免疫反應（專利文獻3〜6)，亦有文獻提出 檢驗對於敗血症之投予效果，但除此以外列舉之疾病，未 確認是否在活體中出現HMGB-；l，而且對於投予對抗服⑶」 之抗體是否與疾病改善相關連，亦完全不明瞭。 就製作對抗HMGB-1之抗體時之非常大的特徵而言， 例如.製作作為治療劑為有用之高親和性抗體不容易。通 吊，製#對抗目的抗原之抗體時’係將目的抗原對於容易 飼育的動物（豬、兔、山羊、羊、小鼠、大鼠等）進行免疫。 2125-9414-PF 9 200900077 ’會使用佐劑等實施

免疫％，為了誘導親和性良好之抗體 許多工夫。然而， 之動物產生壓力， 足到免疫的動物，會

當將人類HMGB-1對於此等動物進行免疫時，在動物體内 所誘導之高親和性抗體，會被該動物之HMGB_i所吸收， 作，會對於動物帶來非常大的壓力， 誘導出發炎反應。依此方式，若誘導 誘導受到免疫之動物體内，誘導出本 而可能發生實際得到之抗體，成為親和性低、品質差的抗 體的現象。 【專利文獻1】美國專利第6,468, 5 33號公報 【專利文獻2】美國專利第6, 448, 223號公報 【專利文獻3】日本特表2005-51 2507號公報 【專利文獻4】日本特表2005-5089 1 3號公報 【專利文獻5】國際專利公開第2004/044001號小冊 【專利文獻6】國際專利公開第2005/026209號小冊 【非專利文獻 1】ABDELAZIZ 匪 ETAL.，RESPIROLOGY (2005) 10： 284-9 【非專利文獻 2】LOTZE MT AND TRACEY KJ，NAT REV IMMUNOL (2005) 5: 331-42

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【非專利文獻 3】BANERJEE S AND KUNDU TK，NUCLEIC ACIDS RES (2003) 31: 3236-47 【非專利文獻 4】AMERICAN THORACIC SOCIETY AND EUROPEAN RESPIRATORY SOCIETY, AM J RESPIR CRIT CARE MED (2000) 1 6 1 : 646-64 【非專利文獻 5】PAM JS ET AL.，J BIOL CHEM (2004) 279: 7370-7

【非專利文獻 6】WANG Η ET AL·，SCIENCE ( 1 999) 285(9)： 248-51 【非專利文獻 7】ABRAHAMEJETAL., J IMMUNOL (2000) 165: 2950-4 【發明内容】 【發明欲解決之問題】 關於特發性肺纖維症（IPF)，目前雖多以消炎劑或抗 纖維化劑4置’但是均非改善IPF患者之生存率及疾病進 订者，實際上除了肺移植以外無特別有效之治療方法。ip? 患者之生存期間中央値（生存率曲線中，累積生存率成為 50%之時間)，為從呼吸器系症狀發生起3〜4年，為短 專利文獻4)。如上，IpF之預後不佳，其病因仍然不明， 期待開發有相治療法。在此，本發明之目的在 或預防包含1PF等間質性肺炎之間質性肺炎為有效 解決問題之方法 之 本案發明人等首先為了確認在何種疾病、於活體 2125-9414-PF 11 200900077 種部位會釋放或分泌HMGB-1 ’開發了三明治酵素免疫測定 法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay; ELISA)法 (Yamada et al. (2003) Clin Chem 9: 1 535-7)。依此方 法，對於各種疾病之人類檢體測定HMGB-1表現，並且製 作對抗HMGB-1之抗體（日本特開200 3-96099號公報）。 本發明中’檢驗肺纖維症病因中之HMGB-1之作用。 間質性肺炎及控制組之間，在血清HMGB-1水平未見到顯 著差異，但是IPF及過敏性肺炎（hypersensitivity pneumonitis; HP)之支氣管肺泡洗滌液（bl〇nch〇aivelar lavage fluid; BALF)，HMGB-1水平顯著上升。然而，所 有的IPF患者中’病狀穩定’未有疾病急劇惡化之事例， 因此，未見到BALF中之HMGB-1水平非常高之ipf患者。 關於NS IP患者，雖統計上不顯著，但是相較於控制組， 有幾例在BALF中之HMGB-1水平高。 HMGB-1 ’當初係在ipf及NSIP之患部中之浸潤發炎 細胞、肺泡巨噬細胞、及上皮細胞之核中被發現，稍弱之 細胞質染色在此等細胞之一些被見到。此等結果暗示， HMGB-1表現在此等細胞中受到向上調控（up regulation)，其一部分HMGBq可在細胞質中見到。第一， 從HMGB-1之經支氣管投予會誘導況—丨冷、TNF α及巨噬 細胞發炎蛋白質2(ΜΙΡ2)等前發炎性細胞介素在肺組織中 之增加來考量，HMGB-1可能在間質性肺炎中之前作為前發 炎性細胞介素之功能（非專利文獻7)。第二，核中之 HMGB-1 ’可能作為間質性肺炎中之轉錄因子的功能。本案 2125-9414-PF 12 200900077 發明人等以前曾證明DNA損傷及細胞凋零雖與在IPF之肥 厚上皮細胞中之P53及P21蛋白質之向上調控相關，但是 於正常肺實質中不認為有DNA損傷、p21、p53之向上調控 (Kuwano K et al., Am J Respir Crit Care Med (1996) 154(2 Pt l): 477-83)。又，Banerjee 等人，顯示 p53 媒介轉錄活化及p53依存性細胞凋零放大，必需要 HMGB-1 (非專利文獻3)。因此，本案發明人等認為hmgbh 就IPF之病因而言，可能通過以p53作為媒介之機構而發 ξ 揮重要作用。 本案發明人等發現在小鼠之正常氣管上皮細胞之一 也核檢測到HMGB-1。博來黴素（b 1 e〇myc丨η)點滴注射後， 於細支氣管上皮細胞之核及細胞質兩者的HMGB_1表現上 升。肺泡上皮細胞及巨噬細胞中之HMGBd表現，在5日 後緩慢地增加。博來黴素點滴注射後第14天，ΗΜΒ — 〗表 現主要在纖維化區域中之浸潤性發炎細胞及上皮細胞之 核及細胞質中中檢測到。上皮細胞及巨仙胞之細胞質中 之HMGB-1，可能貢獻纖維化之進展。關於肺疾病以外之疾 =’亦見到同樣結果。又，有報導關於腿㈠之強陽性 L號在大⑼關即炎模型及慢性風滿性關節炎患者之發炎 性滑膜細胞之單核細胞及軟骨細胞之核及細胞質中檢測 iJCTamguchi N et al., Arthritis Rheum (2003) 48： 971_81;㈣Qi小tal.，ArthritisRhe⑽（測）4δ: 2052-8)。 為了徹底瞭解肺纖維症中之

IiMGB-Ι作用，本案發明 2125-9414-PF 13 200900077 人等嘗試在模型動物中，使用中和抗體阻止HMGB-l信號 傳遞。Kim等人報告：抗HMGB-1抗體阻止nf- /c B活化、前 發炎性細胞介素產生，及出血後之急性肺損傷中之肺透過 性（Kim JY et al·，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol (2005) 288·· L958-65)。本案發明人等在博來黴素點滴注 射起第5天，添加抗HMGB-1抗體。抗HMGB-1抗體，顯著 地抑制：第14天之體重減少 '組織學的評價（病理學的階 段）、透過TdT之dUTP缺口末端標識法（TdT-mediated dUTP Nick End Labeling; TUNEL)陽性細胞數、肺膠原蛋白濃 度，及BALF中之總細胞數及嗜中性球數。此等結果顯示 HMGB-1涉及作為小鼠之博來黴素誘導肺纖維症的病因。 再者’嘗試使用丙酮酸乙酯抑制從巨噬細胞釋出 HMGB-1。Ulloa等人徹底瞭解丙酮酸乙酯藉由干涉p38有 絲分裂促進劑（mit〇gen)活化蛋白質激酶（Mit〇gen -Activated Protein Kinase; MAPK)及 NF-/cB 兩者之信 號傳遞途徑’而妨礙TNFa及HMGB-1從巨噬細胞釋出。 U1 loa等人並且報告丙酮酸乙酯處置能挽救致命的敗血症 (Ulloa L et al., Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99· 12351-6)。本案發明人等’為了確認丙酮酸乙酯對於本說 明書中所記載之模型中症狀進展之效果，利用博來黴素點 滴注射從第3日起至第13日添加丙酮酸乙酯。丙酮酸乙 醋處理’於第14天，使BALF中之HMGB-1水平、總細胞 數 '淋巴球數、及嗜中性球數顯著減少。最終丙酮酸乙醋 處理’顯著抑制本模型動物中之體重減少及組織學的評價 2125-9414-PF 14 200900077 (病理學的階段）。此抑制效果，雖然是由於妨礙從巨嗟細 胞釋出HMGB-1所致或是由於直接妨礙ρ38ΜΑρκ及b 信號傳遞途徑所致尚不明$，然此匕等結果暗#，丙西同酸乙 醋不僅是致命敗血症之體内模型之有效抑制劑，而且亦為 肺損傷及纖維症之有效抑制劑。 本案發明人等考慮抗MGB-1抗體治療，可能阻止肺 扣傷及纖維症進展。第一，Palumb〇等人認為細胞外服⑶-丄 及其受器RAGE，會誘導血管關連幹細胞之遊走及增殖兩 者，因此可能發揮肌肉組織再生作用（Palumb〇 r et al.， J Cell Biol (2004) 164: 441-9)。平滑肌細胞之增殖， 為肺纖維症中之特徵之一。第二，HMGB-1已知會活化產生 巨嗟細胞之血管新生因子（例如血管内皮細胞增殖因子 (Vascular Endothelial Growth Factor; VEGF) ' TNF a ' 介白素 8(IL-8)等）（〇no M et al.，Chemother Pharmacol (1999) 43: S69-71； Andersson U et al., J Leukoc Biol (2002) 72: 1084-91)〇Schlueter 等人，證明外因性 HMGB-1 用ϊ依存地在體外誘導上皮細胞之遊走及萌芽 (Schlueter C et al., Am J Pathol (2005) 1 66: 1 259-63)。血管新生亦據報告與小鼠之博來黴素誘導肺纖 維症中之病理相關連（Hamada Metal.，J Immunol (2005) 1 75: 1 224-31; Burdick MD et al. , Am J Respir Crit Care Med (2005) 171: 261-8)。第三，Dumitriu 等人報告：樹 狀細胞由於活化而活潑地釋出本身的HMGB-1，並且誘導本 身成熟。樹狀細胞之成熟，為T細胞之生存及増殖所必須

2125-9414-PF 15 200900077 (Dumitriu LE et al., J Immunol (2005) 174: 7506-15) ° 肺損傷及纖維化之進展中，關於T細胞仍有議論之餘地， 但是本案發明人等考量抗HMGB-1治療藉由妨礙τ細胞活 化可此減弱由於博來黴素所致肺纖維症進展。 結果，本案發明人等證明相較於控制組，IpF及Ηρ 中之BALF中之HMGB-1水平顯著增加。jjmgB-1在IPF患者 之肺組織中，主要表現於肺泡巨嗟細胞、浸潤性發炎細胞 f 及上皮細胞。抗HMGB-1抗體或丙酮酸乙酯，藉由抑制發 X細胞祠零及纖維化，而保護小鼠免受博來徽素誘導性 肺，害。肺纖維症中，聽一！之詳細作用雖有確認必要， 但是本發明證明嶋」機能之妨礙在肺纖維症之預防及 治療為有效果的。 故本發明具體而言，關於以下發明。 ⑴-種用於治療或預防„性肺炎之治療劑，包含抗高 移動性群匣蛋白質l(HMGB-l)抗體。 ((2)如⑴之冶療劑，其中’間質性肺炎為間質性肺炎。 (3)如⑵之冶療劑’其中，抑制由於間質性肺炎而起之體 重減少。 ⑷如⑵之治療劑’其巾，抑制由於間質性肺炎而起之纖 (5) 如（1)~(4)其中任一項之治療劑，其中 體與HMGB-1之結合強於與HMGB_2之結合 (6) 如（1)〜（4)其中任一項之治療劑，其中 體不結合於HMGB-2。 2125-9414—PF 16 200900077 ’其中，抗HMGB-1 的部分胜肽。 (7)如（1)〜（6)其中任一項之治療劑， 體認識具序列編號：1之胺基酸序列έ 【實施方式】

化指標之諸多症狀。 本發明使用之抗HMGB-1抗體只要是結合於關讣”， 且對於間質性肺炎具治療效果即不特別限定，不限其來源 (人類、小鼠、大鼠、兔、雞等）、種類（多株抗體、單株 抗體）、形狀（改變抗體、修飾抗體、抗體片段、低分子化 抗體等）、同種型（isotype)(IgG、IgM等）等。 本發明使用之抗體之較佳態樣之一，例如：相較於奸 合於HMGB-2更強力結合於HMGB-1之抗體。尤佳抗體，^ 如：相較於結合於人類HMGB-2更強力結合於人類HMgb^ 之抗體。本發明中，相較於結合於HMGB-2更強力結人於 HMGB-1，係指抗體對於HMGB-1之結合活性大於對於 HMGB-2之結合活性。對於HMGB-1之結合活性只要大於對 於HMGB-2之結合活性，則結合活性之差異不特別限定， 較佳為對於HMGB-1之結合活性大於對於HMGB-2之結合、、舌 性的2倍以上’更佳為對於HMGB-1之結合活性大於對於

2125-9414-PF 17 200900077 HMGB-2之結合活性5倍以上，再者較佳為對於hmgb — 〗之 結合活性大於對於HMGB-2之結合活性1 0倍以上。 抗體對於HMGB-1或HMGB-2之結合，可利用該技術領 域之人士所公知之方法，例如EUSA、BIAC〇RE、西方點墨、 流動細胞計數法等檢測。又，抗體之結合活性可利用 EL ISA ' BIAC0RE等該技術領域之人士公知的方法測定。 又，本發明使用抗體之較佳態樣之一，例如：與 結合但不與HMGB-2結合之抗體。較佳之抗體，例如與人 類HMGB-1結合但不與人類HMGB_2結合之抗體。本發明 中，不與HMGB-2結合，係指抗抗體與HMGB_2之 結合實質上檢測不到。抗抗體是否與HMGB_2結 合，可以利用西方點墨、ELISA等通常方法確認. 再者，本發明使用抗體之較佳態樣之一，例如對於 HMGB-1具中和活性之抗體。對於HMGB —丨具中和活性之抗 體，可能妨礙HMGB-1與其受器之結合。抗體之中和活性 可利用該技術領域之人士公知之方法確認，例如可以 ELISA、BIAC0RE 等確認。 本發明使用之抗HMGB-1抗體，可使用公知方法以多 株抗體或單株抗體形式得到。例如，藉由將抗原對於動物 免疫可製備。 ' 作為免疫原之HMGB-1無特別限定，可使用構成 HMGB 1之蛋白質全體，或該蛋白質之部分胜肽等。又，可 使HMGB-1蛋白質或其部分胜肽與其他分子結合亦可使 HMGB-1之部分序列（胜肽）結合於適當擔體而作為免疫 2125-9414-pp 18 200900077 原。又，視需要，可將該抗原表現於細胞表面上之細胞作 為免疫原。像此種細胞，可為天然（腫瘤細胞株等）來源之 細胞’或藉由重組技術而表現抗原分子之細胞。 將動物免疫之抗原’例如：具免疫原性之完全抗原， 及不具免疫原性之不完全抗原（包含半抗原），本發明使用 之抗體之取得時可使用任一種。 HMGB-1蛋白質或其部分胜肽可利用公知方法取得，例 如HMGB-1從人類胸腺、豬胸腺、牛胸腺、人類胎盤、嗜 中性球、HL-60細胞株等取得之方法為公知（G〇〇dwin η紂 al., Biochem Biophy Acta (1975) 405: 280-91； Yoshida M et al., J Biochem (1980) 95： 117-24; Adachi Y et al·， J Chromatogr (1992) 530: 39-46)。又，牛 HMGB-1 及牛HMGB-2之混合物由於和光純藥工業公司有販售，因 此，亦可從其中僅將牛HMGB-1精製並取得。 又，編碼為人類、牛、豬、兔、小鼠、大鼠等之 的基因為公知，亦可依據此等之基因資訊，以基因工程的 手法得到成為抗原之HMGB-1。例如，人類之胺基 酸序列，為 GenBank ACCession N〇. Np_〇〇2119，編碼為 此序列之核苷酸序列，公開為GenBank Accessi〇n ν〇. ΝΜ_002128。將依此方式取得之各種動物來源之， 可作為用以得到本發明使用之抗體的抗原（免疫原）。 用以製作本發明使用之抗體之免疫原較佳例，例如： 包含在HMGB-1與HMGB-2之間相同性低之HMGgq來源之 胺基酸序列的胜肽。又，成為免疫原之胜肽，較佳為含高 2125-9414^PF 19 200900077 親水性之胺基酸序列。原因為’親水性愈高，則其胺基酸 序列存在於HMGB-1分子表面之可能性高，因此其作為免 疫原產生之抗體能與HMGB-1結合之可能性亦高。本發明 中，構成免疫原之各胺基酸殘基之親水性高低之推定，可 利用 Hopp 等人之方法（T. P. Hopp et al.，Proc Natl Acad Sc i USA (1981) 78: 3824-8)或 Parker 等人之方法（parker et al.，Biochemistry ( 1 986) 25: 5425_32)等進行。 因此’就可用於製作本發明使用之抗體之免疫原的尤 佳例而言，例如：HMGB-1與HMGB-2之間相同性低且含高親 水性之HMGB-1來源之胺基酸序列的胜肽。hmgB-Ι與 HMGB-2之間相同性低且含高親水性之ημβη來源之胺基 酸序列的胜肽’例如可利用實施例1之方法等決定。 HMGB-1與HMGB-2之間相同性低且含高親水性之 HMGB-1來源之胺基酸序列的胜肽之具體例，例如，人類 HMGB-1之第167號之胺基酸殘基（離胺酸）至第18〇號之胺 基酸殘基（離胺酸）的「Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys」（序列編號：i)。 以感作抗原對動物免疫，可利用公知方法實施。一般 方法，例如：將感作抗原注射到動物腹腔内或皮下。具體 而言，將感作抗原以PBS、生理食鹽水等適當量稀釋、懸 浮後，於其中視需要適量混合通常之佐劑，例如佛洛依德 凡全佐劑並乳化後，每4〜21日對於動物投予數次。又， 感作抗原免疫時，亦可使用適當擔體。依此方式將動物免 疫’並確認血清中所望之上升抗體水平後，當目的為取得 2125-9414-PF 20 200900077 單株抗體時，從該動物採取免疫細胞，並施以細胞融人， 製作成融合瘤。免疫之動物，例如可使用小鼠、 鼠、雞或怪河狼（Macaca mulatta)等。 與HMGB-1結合之多株抗體或單株抗體，例如可利用 以下記載之方法取得。 多株抗體•技.ώτ、:今 對抗HMGB-1之多株抗體或抗血清之取得，可利用以 下操作取得。 首先，以前述免疫原，或前述免疫原與擔體之結合 物，將哺乳動物（小鼠、兔、大鼠、羊、山羊、馬等）或& 類等免疫。HMGB-1之情形，1)將動物免疫本身，會在免疫 動物引發強烈發炎，並於血液中誘導，及2)hmgb —工 之種間同源性非常高，所誘導之抗HMGB-丨抗體會被發炎 而誘導出來的HMGB-1吸收，最終得到之抗血清中與目的 HMGB-1之親和性高的抗體減少，會僅留下親和性弱的抗 體，考慮此等因素，較佳為以雞等鳥類作為免疫動物。雞 HMBG-1由於與人類HMGB-丨的同源性低（胺基酸序列中有 76%之相同性），因此以取得對抗人類之抗體為目 的時，能避免上述現象。 該前述免疫原，或前述免疫原與擔體之結合物的免疫 置，可視免疫動物種類、免疫注射部位等而決定，但小鼠 之情形，約5〜10週齡之小鼠每隻每次注射〇1#g〜數 mg、較佳為5 // g〜Img之前述免疫原，或前述免疫原與擔 體之結合物。又’兔之情形，兔每隻每次注射i〇"g〜數 2125-9414-PF 21 200900077 十mg、雞之情形雞每隻每次注射〇.l//g〜數十mg之前述 免疫原或前述免疫原與擔體之結合物。又，該前述免疫 原’或前述免疫原與擔體之結合物，以添加佐劑並混合後 注射較佳。佐劑可使用佛洛依德完全佐劑、佛洛依德不完 全佐劑、氫氧化鋁佐劑或百日咳菌佐劑等公知物。注射可 以皮下（腹部皮下、背部皮下、腳墊等）、靜脈内、腹腔内 等實施。

初次免疫後，以2〜3週間隔於皮下（腹部皮下、背部 皮下、腳墊等）、靜脈内、腹腔内等，追加注射前述免疫 原或前述免疫原與擔體之結合物。此情形中，亦以將前 述免疫原、或前述免疫原與擔體之結合物與佐劑添加混合 後追加注射較佳。初次免疫之後，以Eu SA法等反複測定 免疫動物於血清中之抗體價，一般而言，於抗體價達到穩 定阿值，則進行全採血，將血清分離而得到含本發明使用 之抗體的抗血清。 從此抗血清，以利用硫酸銨、硫酸鈉等之鹽析法、離 子交換層#、凝膠過濾法或親和性層析等方》，或將此等 方法組合而進行抗體精製，得到多株抗體。 在此得到之多株抗體，係由與HMGW !吉合但不與 HMGB-2結合之多株抗體’及會與耽㈣及薦b_2中任二 者都結合之多株抗體兩方所構成。將此等通過卩職Μ 作為配體而固定化於固相之親和性層析管柱，能將與 _結合但不與嶋-2、结合之多株抗體，及會鱼 觀」及雛B_2中任_者都結合之多株抗體分離。會與 2125-9414-PF 22 200900077 HMGB-1及HMGB-2中任一者都結合之多株抗體，藉由此管 柱之配體（HMGB-2)而結合於固相並被捕捉收集。另一方 面，與HMGB —丨結合但不與HMGB_2結合之多株抗體，不會 與此管柱之配體（HMGB-2)結合而直接通過管柱，因此，藉 由取得直接通過之分部，能得到會與人類腿Η結合但 不與人類HMGB-2結合之多株抗體。 又使用免疫原與擔體之結合物對動物免疫時，由於 得到之抗血清或多株抗體中存在對抗此擔體之抗體，因 此，較佳為實施將此種對抗擔體之抗體除去之處理。除去 處理方法可採用：將擔體添加於所得到多株抗體或抗血清 之/合液中’並將產生之凝集物除去，或將擔體固定於不溶 性固相，以親和性層析除去之方法等。 單株抗艚

單株抗體可利用K〇ehler笙义—A a A r專人之細胞融合法（Koehler G et al., Nature (197^1^ 9c；c ,nr- 5 6 : 4 9 5 - 7 )得到之融合瘤、 灿111如Γ病毒等病毒得到之遽瘤細胞等抗體產生 例如， 操作進行。 利用細胞融 σ 法製備單构 體時，可利用以下 首先’將前述免疫原，七 ., 原或前述免疫原與擔體之結^ 物，對於哺乳動物（小鼠、複 ^裸小鼠、大鼠等，例如近交I 小鼠之BALB/c)或鳥類（雞 、父另 ^ , ^ κ ^ 寻）荨免疫。此前述免疫原、另 ^ .. 之免疫1，可依照免疫動物淘 類、免疫注射部位等適當 ㈣想 '、疋’例如於小鼠之情形，每售

2125-9414-PF 23 200900077 每次注射0. 1 // g〜5mg、雞之情形每隻每次注射〇 數十mg之前述免疫原或前述免疫原與擔體之結合物較 佳。又，該前述免疫原，或前述免疫原與擔體之結合物， 以添加佐劑並混合後注射較佳。佐劑可使用佛洛依德完全 佐劑、佛洛依德不完全佐劑、氫氧化鋁佐劑或百日咳菌佐 劑等公知物》注射可以皮下（腹部皮下、背部皮下、腳墊 等）、靜脈内、腹腔内等實施。 , 初次免疫後，以1〜2週間隔於皮下（腹部皮下、背部 。 皮下、腳墊等）、靜脈内、腹腔内等，追加注射前述免疫 原、或前述免疫原與擔體之結合物。此追加注射之次數一 般為2〜6次。於此情形，亦將前述免疫原，或前述免疫 原與擔體之結合物，添加佐劑混合並追加注射為較佳。 初次免疫之後，以EL ISA法等反複測定免疫動物之血 清中之抗體價，一般而言，於抗體價達到穩定高值，則將 前述免疫原或前述免疫原與擔體之結合物溶解於例如pBs ( 或生理食鹽水（0. 9%氯化鈉水溶液）者注射到靜脈内或腹 腔内’作為最終免疫。此最終免疫之3〜5日後，取得免 疫動物之脾細胞、淋巴節細胞或末梢淋巴球等具抗體產生 能力之細胞。 使由該免疫動物所得具抗體產生能力之細胞與哺乳 動物等（小鼠、裸小鼠、大鼠等）之骨髓瘤細胞（myel〇ma) 細胞融合。前述免疫細胞與骨髓瘤細胞之融合，基本上可 依據公知方法例如Kohler及Mi lstein等人之方法 (Kohler 及 Milstein， Methods Enzymol (1981) 73: 3-46) 2125-9414-ET 24 200900077 等實施。 更:、體而。’例如細胞融合’可使用細胞融合促進劑

實施。融合促進劑，你丨、7 I J例如可使用聚乙二醇（PEG)、仙台 毒（HVJ)等，再者，視所 α里為&间融合效率，亦可添加二 甲基亞砜等辅助劑#知 〜 一 克疫細胞與骨髓瘤細胞之使用比例， 可以任意地設定。例如，—如二‘ 般而s，對於骨髓瘤細胞將免 t κ 疫細胞定於1〜1G倍較佳。使用於此等細胞之培養液，例 ，適於#髓瘤細胞株增殖之贿164G培養液、_培養液 等此外可適②使用此種細胞培養通常使用之培養液。 再者，亦可將胎牛血清（FCS)等血液補液加至培養液中。 將免疫細胞與既定量骨髓瘤細胞充分混合，將預先加溫至 37 C左右之PEG溶液（例如平均分子量約1〇〇〇_6〇〇〇)以通 常30-60%(w/v)之濃度添加並混合以實施細胞融合，使形 成目的融合細胞（融合瘤）^接著，將逐次添加適當培養液 並離心除去上清之操作反複實施，以將對於融合瘤生長不 利之細胞融合劑等除去。所形成之融合瘤，藉由以通常之 選擇培養液例如HAT培養液（含次黃嘌呤、胺基喋呤和胸 腺嘧啶之培養液）培養並選擇。以上述HAT培養液之培養， 為了使目的融合瘤以外之細胞（非融合細胞）死滅，需持續 足夠時間（通常數日至數週間）。接著，實施通常之極限稀 釋法或使用含甲基纖維素之半流動培養基的群落法等，進 行產生目的抗體之融合瘤篩選及單一選殖。 用於細胞融合之較佳免疫細胞，尤其例如脾臟細胞。 另一方面，與免疫細胞融合之母細胞，通常可使用哺乳動

2125-9414-PF 25 200900077 物之骨髓瘤細胞。各種骨髓瘤細胞株可使用公知任一者。 例如可使用 P3(P3x63Ag8.653)(J Immunol (1979) 123: 1 548-50) ' P3x63Ag8U.l(Curr Topics Microbiol Immunol (1978) 81: 1-7) 、 NS_l(Kohler 及 Milstein， Eur J Immunol (1 976) 6: 51 1-9) ' MPC-11(Margulies et al., Cell ( 1 976) 8: 405-1 5) ' SP2/0(Shulman et al., Nature (1 978) 276: 269-70)、F0(deSt.Groth et a 1.，J Immunol

Methods (1980) 35: 1-21) ^ SI94(Trowbridge, J Exp Med

(1978) 148： 313-23)>R210(GaIfre etal., Nature (1 979) 277: 131-3)等。 將以此方式得到之融合瘤之培養上清，使用前述免疫 原、前述免疫原與擔體之結合物、或人類等，以 EL ISA法或西方點墨法等免疫學測定法予以分析，可以選 擇產生與人類HMGB-1等結合之抗體的融合瘤。又，將前 述融合瘤之培養上清使用人類HMGB_2等利用EUSA法或 西方點墨法等免疫學測定法予以分析，可以選擇產生相較 於結合於人類HMGB-2,更強結合於人類ηεβη之抗體， 或者產生與人類HMGB-1結合但不與人類HMGB_2等結合之 抗體的融合瘤。此2種融合瘤選擇方法舆極限稀釋法或使 用含甲基纖維素之半流動培養基之料法等公知選瘦法 方法組合實施’能將本發明使用之尤佳抗體（單株抗體）， 亦即與人類HMGB-1結合作不盥人相uu_ 不與人類HMGB-2結合之抗體 (單株抗體）的產生細胞株單離。依此方式所製作之產生單 株抗體的融合瘤，可於通常培養以繼代培養，且能於液 2125-9414-PF 26 200900077 體氮中長期保存。 為了從融合瘤取得單株抗體，例如有將該融合瘤依照 通常方法培養，並以培養上清之形式得到單株抗體之方 法。或，在與融合瘤具適合性之動物腹腔内，投予融合瘤 並使增殖，從該動物產生之腹水得到單株抗體之方法亦可 採用。此時，可在動物之腹腔内預先投予降植烷 (pristane) ’預先刺激。前者方法，適於得到高純度抗體， 後者適於將抗體簡易大量生產。 * 培養早株抗體產生細胞株而得抗體之情形，可將無血 清培養基、低濃度血清培養基、或含經施以抗體除去處理 之血清的培養基等作為培養基使用。可理想地使用抗體之 精製較容易之DMEM、RPMI 1 640培養基或ASF培養基103 等培養基。 又，亦可取代如上所述人類以外之動物以抗原免疫得 到融合瘤，而將人類淋巴球於體外以抗原感作，並使感作 f 淋巴球與人類來源之具永久分裂能力之骨髓瘤細胞融 合，而得產生所望人類抗體之融合瘤（參照日本特公平 1-59878號公報）。再者，亦可對於具有人類抗體基因之全 部或一部分曲目（repertory)的基因轉殖動物投予抗原並 取得抗體產生細胞’使其不死化，並取得產生所望人類抗 體之融合瘤（參照 W094/25585號；W093/12227號； W092/0391 8 號；W094/02602 號等）。 抗體片段 本發明使用之抗HMGB-1抗體，只要是與HMGB-1結合 27

2125-9414-PF 200900077 並且對於間質性肺炎具治療效果者，則抗體片段或抗體修 飾物均可。抗體片段’包含：Fv、Fab、Fab’ 、F(ab，）2、 雙功能抗體（diabody ; Db)、線狀抗體、單鏈鏈抗體（以下 亦記載為scFv)分子等。「Fv」片段為最小的抗體片段， 包含元全的抗原認識部位與結合部位。r Fv」片段為1個 重（H)鏈可變區域（Vh)及輕（l)鏈可變區域（yL)以非共價鍵 強力連結之二聚體（VH-vL二聚體）。各可變區域之3個互補 性決定區域（complementari1;y de1;ermining regi〇n ; CDR) 彼此相互作用，並於V„-vL二聚體表面形成抗原結合部位。 利用6個CDR，形成抗體之抗原結合部位。然而，即使工 個了變區域（或為僅含對抗原為專一性之3個CDR之一半 Fv)較全結合部位的親和性低，但仍認識抗原並具結合能 力。因此，僅含像這種j個可變區域或CDR之片段、僅含 3個CDR之一半Fv，只要與hmgbi結合並對於間質性肺 炎具治療效果，即能使用在本發明中。 又，Fab片段（亦稱為F(ab))尚包含[鏈之不變區域 及Η鏈之不變區域（CH1)cFab，片段（亦稱F(ab，））與 片段之不同點在於：加成了來自包含抗體之鉸鏈區域之五 個以上半胱胺酸之Η鏈CH1區域的羧基末端來源的數個殘 基。Fab’-SH片段（亦稱為F(ab，）_SH)代表不變區域之 個以上半胱胺酸殘基具游離硫醇基之形態的Fab，片段。 FUb’）2片段為2分子Fab，一邡片段經雙硫鍵結之抗體片 段。此等抗體片段之製作方法，具體而言，例如.將完全 分子之抗體以酵素例如木瓜酵素、胰蛋白酶處理並產生抗 2125-9414-PF 28 200900077 體片段之方法，或構建編碼為抗體片段之基因，將其導入 表現載體後’以適當寄主細胞表現之方法（例如，㈤w al.，J Immunol (1994)152: 2968_76)。其他抗體 為該技術領域之人士已知者尚有含化學鍵之抗體片段，此 等抗體亦能使用在本發明中。 雙功能抗體係指利用基因重組手法所構建之二價 (bivalent)抗體片段（H〇lliger p et al. ( 1 993) pr〇c

Natl Acad Sci USA 1993’ 90: 6444-8; EP404,097 號； W〇93/11161號等）。雙功能抗體為2條多胜肽鏈所構成^ 二聚體，多胜肽鏈分別、於同鏈中，抗體來源之L鏈可變 區域（Vl)及Η鏈可變區域（vH)利用彼此無法結合程度之短 的例如5個殘基左右的連結子結合。被編碼在同一多胜肽 鏈上之Vl及Vh ’其之間由於連結子短，不能形成單鏈可變 區域片段，而形成二量體，因而雙功能抗體具2個抗原結 合部位。 單鏈鏈抗體或scFv抗體片段包含抗體之Vh及Vl區 域’此等區域存在於單一多胜肽鏈中。一般而言，Fv多胜 肽更於Vh及Vl區域之間包含多胜肽連結子，藉此可使scFv 形成用於抗原結合所必要的構造（Huston JS et a 1.，Proc

Natl Acad Sci USA (1 988) 85: 5879-83;關於 scFv 之 總論’參照 Pluckthun『The Pharmacology of Monoclonal Antibodiesj Vol. 113(R〇senburg and Moore ed (Springer Ver lag，New York) pp. 269-315，1994))。本發明中之連 結子，只要是完全不妨礙其兩端連結之抗體可變區域之表 29

2125-9414-PF 200900077 現及活性，即不特別限定。 編石馬S C F V之d Μ A，也I i -τ … 顺例如可以下列方式得到。 (1) 以編碼前述抗體之H 鍵或，V區域之嶋作為鑄模鏈 為所望之胺基酸序列的職邱八：將此4序列之中編碼 對’利用PCR法予以放大。 …丨子 (2) 接著，將編碼胜肽連結^ ^ ^ ^ ti |刀< UNA及其兩端與引子 對組合放大，該引早併在# ^ /与丨子對係使該各胜肽連結子之兩端盥 鏈、L鏈連結。 、 又，一旦製作編碼SCFV之DNA,則能以常法得到含此 等之表現載體’及經該表現載體予以轉形（transf〇rm)之 寄主，又，藉由使用此寄主依照常法可得SCFV。 再者，視需要本發明使用之抗體亦可為雙專一性抗 體。IgG型雙專一性抗體可由將2種產生IgG抗體之融合 瘤予以融合所生的雜交融合瘤（hybrid hybrid⑽a，又稱 quadroma)分泌（Milstein C et al. ( 1 983) Nature 305: 537-40)。又，可藉由將分別構成二種IgG之L鏈及h鏈 基因’合計4種基因導入細胞並使共表現而使分泌。此時， 藉由對於Η鏈之CH3區域施以適當胺基酸取代，能優先分 泌關於Η鏈為異質組合之igG(Ridgway JB el al. (1996) Protein Engineering 9: 617-21; Merchant AM et al. (1998) Nat Biotech 16: 677-81)。 藉由將Fab’予以化學交聯，亦能製作雙專一性抗 體。例如’將從其中之一抗體製備之Fab’以o-PDM(鄰-

2125-9414-PF 30 200900077 伸苯二馬來醯亞胺 ’ ortho-phenylenedi-maleimide)予以 馬來醯亞胺化，將其與從另一抗體製備之Fab，反應，使 不同抗體來源之Fab’彼此交聯，能製作雙專一性 F(ab，MKeler T et al. (1 997) Cancer Res 57: 4008-14)。又’已知有將Fab’ -硫硝基苯甲酸（TNB)衍生 物與Fab’ -硫酵（SH)等抗體片段予以化學鍵結之方法 (Brennan M et al. (1985) Science 229: 81-3)。 化學交聯之外’亦可使用Fos、Jun等來源之白胺酸 拉鍊結構（Leucine zipper) °Fos、Jun亦會形成同二聚 體，但是利用優先形成異二聚體者。表現製備加成有F〇s 白胺酸拉鍊結構之Fab’及加成有jun白胺酸拉鍊結構之 另一 Fab’ 。藉由使於溫和條件還原之單體Fab，-Fos、 Fab’ -Jun 混合並反應，可形成雙專一性 F(ab，MKostelny SA et al. (1 992) J Immunol 148: 1547-53)。此方法不限於Fab，，亦可應用於將scfv、 pv 等連結時。 雙功能抗體亦能製作成具雙專一性。雙專一性雙功能 抗體’為2個交又（cross-over) scFv片段之異二聚體。 亦即’可藉由將2種抗體A、B來源之Vh與VL以5個殘基 左右之較短連結子連接而製作的Vh(a)_Vl(b)、Vh(b)_Vja) 構成異一聚體之形式，而製作（H〇iiigerPetal. (1993)

Proc Natl Acad Sci USA 90: 6444-8)。 此時’亦可將2種scFv以15個殘基左右之柔軟、較 長連結子連結，（單鏈雙功能抗體：KiPriyanov別et al. 2125-9414-PF 31 200900077 (1999) J Mol Biol 293: 41-56)、施以適當胺基酸取代 (knobs-into-holes: Zhu Z et al. (1997) Protein Sci 6: 781-8)’而促進目的構成。可藉將2種scFv以15個 殘基左右之柔軟、較長連結子連結而製作的sc(Fv)2，亦 可能為雙專一性抗體（Mallend er WD et al. (1994) J Biol Chem 269: 199-206)。 重組抗體 將抗體基因從融合瘤選殖，並且利用基因重組技術， f 併入到適當載體，並將所製作之表現載體導入寄主，能將 本發明使用之抗體製作成重組型抗體（例如參照Vandamme et al.，Eur J Biochem ( 1 990) 192: 767-75)。具體而 言，最初從產生所望抗體之融合'瘤製備mRNA。利用公知方 法，例如胍（guanidine)超離心法（Chirgwin et al.,

Biochemistry ( 1 979) 18: 5294-9)、AGPC 法（Chomczynski et al·，Anal Biochem ( 1 987) 162: 1 56-9)等，從產生抗 體之脾臟細胞製備全RNA後，使用mRNA Purification Kit ' (Pharmacia)等’可製備 mRNA。又，藉由使用 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia)，可不製備全 rnA， 而僅直接製備mRNA。其次’從得到之mRNA使用反轉錄酵 素合成抗體V區域之cDNA。cDNA之合成，可利用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化學工業）等實施。又，cDNA之合成及放大，可利

用 5 —Ampl i FINDER RACE Ki t (Clontech)、利用 PCR 之 5 -RACE 法（Frohman et al.，Proc Nat 1 Acad Sci USA

2125-9414-PF 32 200900077 (1 988) 85: 8998-9002; Belyavsky et al. , Nucleic Acids Res (1989) 1 7: 291 9-32)等實施。例如，利用與可變區 域附近對應之引子，以RT_PCiu# L鏈、H鏈可變區域（Vl、 Vh)之cDNA放大並回收。引子可使用：對應於CDR之引子、 對應於較CDK之多樣性為低之框架的引子，或與信號序列 及CH1或L鏈不變區域（Cl)對應之引子。接著，從得到之 PCR產物精製目的DNA片段，並藉由與載體DNA連結，製 作重組載體。將該重組載體導入大腸菌等寄主細胞，選擇 經轉形之細胞之群落。藉由培養得到之細胞，可製作所望 重組抗體。視需要，將編碼為目的抗體之基因之鹼基序 列’以公知方法例如雙去氧核苷酸（dide〇xynucle〇tide) 法等確認。 又’可將編碼為上述得到之抗體V區域的〇ΝΑ，併入 含有編碼為所欲抗體不變區域（C區域）之DNA的表現載 體。表現載體包含表現控制區域例如增強子（enhancer)及 啟動子’本發明之製劑中使用的抗體之DNA，以受該區域 控制而表現之方式併入。使用表現載體將適當的寄主細胞 轉形，旎使所望分子型之抗體表現並得到。 抗體基因之表現’可將編碼為抗體重鏈（H鏈）或輕鏈 (L鍵）之DNA分別併入表現載體而使寄主細胞同時轉形， 或者藉由併入有編碼為Η鏈及L鏈之DNA的單一表現載體 將寄主細胞轉形（參照W094/1 1523等）。 本發明使用之抗體為雞抗體、小鼠抗體、大鼠抗體 2125-9414-PF 33 200900077 等，其來源不限定，但以對於人類投予為目的時，以人類 化抗體或人類抗體較佳。人類抗體之取得方 7古為已知，例 如可藉由將具人類抗體基因全部或一部分曲目之基因轉 殖動物以目的抗原免疫，取得目的之人類抗體（參照 W093/12227 、 WO92/03918 、 W094/02602 、 W〇94/25585 、 WO96/34096 、 W096/33735)。 本發明使用之重組型抗體，為了使人類中之異種抗原 性降低等目❾’可使用^因工程方法所製作之改變抗 體。改變抗體包含具人類抗體不變區域之嵌合抗體、人類 化抗體等。像此種基因改變抗體’可使用既知方法製造。 具體而言’例如嵌合抗體為自免疫動物之抗體 鍵之可灰區域，與人類抗體之Η鏈及[鏈之不變區域所構 成之抗體。將編碼為免疫動物來源之抗體之可變區域的 DNA，連結於編碼為人類抗體之不變區域的卵a，並且併入 表現載體並導入寄主使產生，可得嵌合抗體。 人類化抗體為亦稱為再構成（reshaped)人類抗體之 改變抗體。人類化抗體，係藉由將免疫動物來源之抗體之 CDR移植到人類抗體之CDR而構建。其一般的基因重組方 法亦為已知。具體而言，首先設計應序列，以將小鼠抗 體之CDR與人類抗體之框架區域（斤&紅w〇rk regi〇n ; FR) 連結。此DNA序列以末端部具重疊部分之方式分成數個。 合成各個的寡核苷酸，並以pcR法組裝成所設計之ma序 列將組裝成的DNA與編碼為人類抗體不變區域之DNA連 、’°接著併入表現載體並導入寄主使生產（參照EP 239400 ; 2125-9414-PF 34 200900077 WO 96/02576)。 透過CDR連結之人類抗體之fr，係選擇結果製作之人 類化抗體之CDR能形成良好抗原結合部位者。視需要，可 將人類化抗體之可變區域中之FR之胺基酸進行取代（Sa1;〇 K et al. ( 1 993) Cancer Res 53: 85卜6)，以使人類化 抗體之CDR形成適切抗原結合部位。又，亦可取代為其他 各樣人類抗體來源之FR(參照W0 99/51743)。 胺基酸改轡杭艚 本發明使用之抗體’包含將如上所述得到之抗體之胺 基酸序列進行取代 '缺失、加成及/或插入等改變者。胺 基酸序列之改變，可利用公知方法實施。胺基酸之取代、 缺失、加成及/或插入等而改變之抗體，較佳為與改變前 之抗體具同樣活性。在此，「同樣活性」意指生物學的或 生化子的活（·生。生物學的或生化學的活性之具體例，例如： 結合活性、中和活性等。 通常，與改變前之抗體具同樣活性之抗體，與改變前 之抗體具高相同性。本發明+，高相同性係指於胺基酸水 平，通常至少冑50%以上之同一性，較佳為？5%以上之同 一性，更佳為85%以上之同一性，又更佳為95%以上之同 一性。為了決定多胜肽之相同性，例如可使用文獻⑺~ A Lipman, Proc Natl Acad Sci USA (1983) 80: 726-30) 等記載之演算法。 本發明使用之抗體，可盔IV ι _ J為以此方式經胺基酸取代、缺 失、加成及/或插入等而經改變之抗體。 2125-9414-PF 35 200900077 抗體修飭物 再者’本發明使用之抗體，包含抗體修飾物。抗體修 飾物’例如：與聚乙二醇（PEG)等各種分子結合之抗體。本 發明之治療劑中使用之抗體修飾物，所結合之物質不限 定。為使抗體安定化，提高其結合能力等，可以各樣目的 進行抗體修飾。為得此種抗體修飾物，可將得到之抗體施 以化學修飾。此等方法在此領域中已經確立。 抗體表現•逄4：

V ./ 使構建之抗體基因依公知方法表現’可取得抗體。哺 乳類細胞之情形，可以以含有常用之有用啟動子/增強 子、使表現之抗體基因、及其3，側下游卯“六信號功能 性結合之DNA的表現載體，表現抗體基因。例如，啟動子 /增強子，例如：人類巨細胞病毒前期啟動子/增強子。又， 除此以外，亦能使用反轉錄病毒 '多瘤病毒、腺病毒、猴 病毒40(SV40)等病毒啟動子/增強子’或人類延長因子 -ία等哺乳類細胞來源之啟動子/增強子。例如，使用 啟動子/增強子時依照Mulling等人之方《（Mu出叩 RC et al.，Nature ( 1 979) 277:丨 on 4)，可以輕易地 表現抗體基因。使用人類延長因+【α _，若依照

Mizushima 之方法（Mizushima，NucieicAcidsRes(i99〇) )可輕易地表現抗體基因。大腸菌之情形，可 利用包含常用有用；__ 、 用之啟動子、用以分泌抗體之信號序列、 將使表現之抗體基因予以功能性結合之MA的表現載體， 可使抗體基因表現。例如’啟動子有LacZ啟動子、㈣ 2125-9414-PF 36 200900077 啟動子。 使用LacZ啟動子時，例如可依照Ward等人之方法

(Ward ES et al.，Nature ( 1 989) 341·· 544-6)。使用 araB 啟動子時。例如可依照Better等人之方法（Bette M紂 al.，Science ( 1 988) 240: 1〇41_3)。用以分泌抗體之信

號序列’於產生在大腸菌之胞質之情形，例如可使用pelB # 號序列（Lei SP et al.，J Bacteriol (1987) 169: 4379-83)。將產生在胞質之抗體分離後，可將抗體之構造 適當改造並使用（W0 96/30394)。 複製起源可使用牛乳突病毒、多瘤病毒、腺病毒、猴 病毒40 (SV40)等來源之複製起源。再者，可包含胺基糖苷 轉移酶基因、胸腺嘧啶激酶基因、大腸菌黃嘌呤鳥嘴呤磷 酸核糖轉移酶（xanthine guaninephosphoribosyl transferase)基因、二氫葉酸還原酵素基因等，此等係為 了將寄主細胞系的基因副本數放大，在表現載體作為選擇 標記使用。 為了製造本發明使用之抗體’可使用任意生產系。用 以製造抗體之生產系’有體外（invitro)及體内（in viv〇) 生產系。體外生產系’例如：使用真核細胞之生產系或使 用原核細胞之生產系。使用真核細胞時，有使用動物細 胞、植物細胞、真菌細胞之生產系。動物細胞已知：（a)哺 乳類細胞例如CH0、COS、 （b)兩生類細胞、例如非洲爪 蟾卵母細胞、（c)昆蟲細胞例如sf9、sf21。植物細胞 已知例如菸草屬（Ni cot i ana)來源之細胞。將其進行癒合 2125-9414-PF 37 200900077 培養即可。真菌細胞已知有（a)酵母例如Sacchar⑽yces 屬、（b)絲狀菌例如Aspergillus屬。使用原核細胞時， 有使用細菌細胞之生產系。細菌細胞已知大腸菌、枯草 菌。將目的抗體基因藉由轉形導入此等細胞中，並將轉形 的細胞於體外培養可得抗體。培養依照公知方法實施。例 如哺乳類細胞之情形，培養液可使用dmem、mem、RPMU64〇 等。此時可以併用胎牛血清等血清補液，亦可無血清培 養。又，將導入有抗體基因之細胞移植到動物細胞之腹腔 等，可於體内生產抗體。體内之生產系，例如：使用動物 之生產系或使用植物之生產系。使用動物時，例如有哺乳 類動物、使用昆蟲之生產系。哺乳類動物可使用山羊、豬、 羊、小鼠、牛。 又，使用哺乳類動物時，可使用基因轉殖動物。例如， 在編碼為山羊0酪蛋白之類的乳汁中固有產生之蛋白質 的基因中途插入抗體基因，而製備融合基因。將含插入有 抗體基因之融合基因的DNA片段注入山羊胚胎，並將此胚 胎注入雌山羊體内。從接受胚胎之山羊產下之基因轉殖山 羊或其子孫產生之乳汁，得到目的抗體。為了使基因轉殖 山羊中含目的抗體之乳汁量增加，可以適時將激素對基因 轉殖山羊施用。又，昆蟲可以使用蠶。使用蠶時，可藉由 使插入有目的抗體基因之桿狀病毒感染蠶，並從此蠶之體 液得到目的抗體。（Maeda S et al., Nature ( 1 985 ) 31 5. 592-4)。再者，將植物用於抗體生產時，例如可使用菸草。 使用於草時，將編碼為目的抗體之聚核苷酸插入於植物表 2125-9414-PF 38 200900077 現用載體例如pMON 530 ’並將此載體導入於如農桿菌 (Agrobacteriuni tumefaciens)的乡田菌。使jt匕系田菌感染於 草例Nicotiana tabacum)，可從菸草葉得到所望抗體（Ma et al.， Eur J Immunol (1994) 24:131-8)。 抗體精贺 如上所述，利用融合瘤培養•增殖或基因重組得到之 抗體，可精製成達均勻之程度。抗體之分離、精製，可使 用通常蛋白質使用之分離、精製方法。例如，適當選擇、 組合親和性層析等層析管柱、過濾、超過濾、利用硫酸銨 或硫酸鈉等之鹽析、透析、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳、等 電點電泳等，能將抗體分離、精製（Antib〇dies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Ub〇ratory，1 988)，但不限於此等。親

和性層析使用之管柱，例如：蛋白質A管柱、蛋白質㈠ 柱、蛋白質L管柱等。 S

本發明提供含有抗抗體作為有效成分 性肺炎治療劑。本發明中 日質 為了間質性疾病預防之預防齊卜本發二： INF之間質性肺炎 僚齊丨尤適於含 療。本發明之治療劑，期待能抑制 2125-9414-PF 39 200900077 ·、 由於間貝险肺炎所致體重減少，並且具缓和肺泡壁肥厚、 肺泡1間崩壞、纖維母細胞之增殖、發生細胞凋零之細胞 增加肺均質物中之膠原蛋白濃度增加、嗜中性球等增加 等肺纖維化之各種症狀的效果。 、本發明之含抗抗體作為有效成分之治療劑， 視需要可以與對其為鈍性之適當藥學上可容許之擔體、媒 體等混合並製劑化。例如，滅菌水或生理食鹽水、安定劑、 (賦形劑k氧化劑（抗壞血酸等）、緩衝劑（填酸、棒檬酸、 /、他有機^等）、防腐劑、界面活性劑（娜、Tween等）、 :。劑(EDTA等)、結合劑等。又，亦可含其他之低分子量 多胜肽、血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白等蛋白質、甘胺 -谷酿胺、天冬醢胺、精胺酸及離胺酸等胺基酸、多糖 及單糖等糖類或碳水化物、甘露醇或山梨醇等糖醇。製作 ::射用水溶液時，例如生理食鹽水、葡萄糖或含 =之等張液例如！甘露糖、D —甘露醇、氯化 C :…亦可與適當溶解輔助劑、例如醇（乙醇等）、多元醇（丙 7:二等)、非離子性界面活性劑(聚山梨醇酯8〇、 HCO-50)等併用。 相妨：發明中之製劑，只要是抗咖-1抗體彼此功能不 相妨礙，可令？接u $ ^ ，視需要本發明中之製劑， 亦可〃、其他間質性肺炎之治療劑組合使用。 又，視需要可將本發明中之製劑封入崎（ 基纖維素、明膠、 「甲甚甲其；咕 工土甲 視烯醆]等微膠囊）。又， 視尚要可將本發明中梦 月之中之氣職作為谬體藥物傳遞系統 2125-9414-PF 40 200900077 (微脂體、白蛋白微球體、微乳劑、奈米粒子及奈米膠囊 等）（參照"Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition"，Oslo Ed· ( 1 980)等）。再者，將藥劑製作為緩 釋性藥劑之方法亦為公知，可應用在本發明之製劑 (Langer et al. (1981) J Biomed Mater Res 15： 267-77 ·

Langer (1982) Chemtech 12: 98-105;美國專利第 3,773,919 號；EP58,481 號；Sidman et al. (1983) Biopolymers 22: 547-56; EP133,988 號）。 本發明之治療劑投予量，可考慮劑型種類、投予方 法、患者年齡或體重、患者症狀、疾病種類或進行程度等， 最終由醫師判斷而適當決定。一般而言，大人每日含有抗 體量，可將0. 1〜1 0000 mg分成i〜數次投予。更佳為5 〜5〇_g/日’最佳為5〇〜2_mg/0。此等投予量視患者 體重或年齡、投予方法等變動，但若是該技術領域之人 士’可適當選擇投予量。投予期間亦因應患者之治癒過程 等適當決定較佳。投予途徑不特別限定，以靜脈内投予、 皮下投予等實施。 又，可考慮將編碼為本發明中之製劑使用之抗體的基 因併入基因治療用載體，來 瓶米進仃基因治療。編碼為抗體之 基因之投予方法，例如 J仰，直接投予稞質體之方法、包裝 微脂體等後投予之太止 ,匕衣杜 、、形成反轉錄病毒載體、腺病毒載 體、痘田病毒載體、痘

^ ^ ^ 应病毋載體、腺病毒關連載體、HVJ 『ν. Γ 戰體之形式並投予之方法（參照Α_

Virus Genome 法 ，CRC Press, Fi〇rid (1996))，或 2125-9414-PF 41 200900077 被覆膠體金粒子等顆粒擔體（w〇93/1 77〇6等）後投予之方 法然而，可採在活體内表現抗體並能發揮其作用之任何 方法投予。較佳為，透過適當之非經口途徑（靜脈内、腹 腔内、皮下、纟内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入或肌 肉内途徑進行注射、注人之方法、或氣體料性粒子衝擊 法（利用電子搶等）、點鼻藥等經黏膜途徑之方法等），投 予足夠量。於活體外（ex vivo)，利用微脂體轉染、粒子 衝擊法（美國專利第4,945，㈣號）或病毒感染，對於血液 細胞及骨趙來源細胞等導人編碼為抗體之基因，再將該細 胞注入於患者即可。 又，本發明提供用於治療間質性肺炎之方法，包含 予本發明製劑之步驟 γ 々 ΙΌ 或其製劑之投予，例如可依前 " 施。又，本發明尚關於抗HMGB-1抗體用於製造 本毛月之療劑之用途。再者，本發明提供用於上述方法 之套組’至少包含本發明之治療劑。該套組中，另可包裝、 注射筒、注射針、藥墨μ六& 、 樂學上谷許之媒體、醇綿布 '絆創音、 或記載使用方法之指示書等。 又，本說明書中所引用之所有先前技術文獻 發明中作為參考。 本 【實施例】 J對於本發明更具體詳述，但本發明 限於此等實施例。以 但本發明不限於此等實施例 ,^ 下以實施例更具體地詳述本發明 但本發明不限於沐姑由.... ^ 2125-9414-PF 42 200900077 ~~^^AJJaj〇_mgb-i之胺基酸序列中之μ水性高、盥 之間相同性低之胺基酸序列之選琿 從人類HMGB-1之胺基酸序列選擇親水性高、與人類 HMGB-2之間相同性低之胺基酸序列。 (1) 人類HMGB-1之胺基酸序列（序列編號：6)，如前述Wen 專人之資料（Wen et al.，Nucleic Acids Res (1989) 17: 1197-214)。 (2) 此人類HMGB-1之胺基酸序列之各胺基酸殘基之親水性 局低的推定，係依照前述Hopp等人之方法（T.P Hopp et al.，Proc Natl Acad Sci USA (1981 ) 78: 3824-8)實施。 (3) 其次’將此人類龍GB-1之胺基酸序列之中親水性高的 序列，與人類HMGB-2之胺基酸序列（M. Yoshida et al.， J Biol Chem ( 1992) 267: 664 卜 5)比較。並且，從該高 親水性之胺基酸序列中，選擇人類HMGB-1與人類HMGB-2 之間相同性低之人類HMGB-1之胺基酸序列。 (4) 在此，本案發明人等所選擇胺基酸序列之第1號，為 從人類HMGB-1之第167號之胺基酸殘基（離胺酸）至第180 號之胺基酸殘基（離胺酸）的「Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys」（序列編號：1)。又，此 人類 HMGB-1 之胺基酸序列「Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys」（序列編號：1)，與相當 的人類HMGB-2之胺基酸序列「Lys Ser Glu Ala Gly Lys Lys Gly Pro Gly Arg Pro Thr Gly」（序列編號：2)有 9 個之胺基酸殘基不同。

2125-9414-PF 43 200900077 「實施例2 ]胜肽之合成 分別合成在實施例1所選擇胺基酸序列之各N末端， 結合有用以使擔體結合之半胱胺酸的胺基酸序列「Cys Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lysj (序列編號：3)之胜肽。 首先’利用Appl ied Biosystems公司之型號430A胜 肽自動合成裝置（Model 430A peptide synthesizer)，依 照操作説明書，以第三丁氧基羰基胺基酸固相法合成胺基 酸序列「Cys Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val

Lys Ala Glu Lys」（序列編號：3)之胜肽合成。為了抑制 副反應’就清除劑（scavenger)而言，於二甲基硫、對硫 曱本盼、間曱苯紛及苯甲謎存在下以氟化氫法實施從樹脂 將合成之胜肽脫離。之後，以二甲醚萃取清除劑，並且以 2N乙酸萃取合成之胜肽。以陰離子交換樹脂D〇WEX卜以 實施陰離子交換管柱層析並精製，以〇1)3管柱實施高速液 體層析（HPLC)，確認主峰之圖樣。並且，以蒸發器進行冷 凍乾燥及濃縮後，以HPLC進行精製並分取。又，該HpLc 精製時之裝置及條件，係使用山村化學研究所公司之逆相 0DS管柱YMC-D-0DS-5(20nrnX3〇〇mm)，以日本分光工業公 司之TWINCLE泵浦及日本分光工業公司之Gp_A4〇型梯产 器於〇.1%三敗乙酸（TFA)中從乙腈之〇%至7〇%的梯度^ 速分實施’以日本分光工業公司製uvidec__ 型檢測器（210nm，1. 28AUFS)進行檢測。 將此處精製分取之合成胜肽，v 狀以洛發器冷凍乾燥並濃

2125-9414-PF 200900077 縮。將得到之合成胜肽純度以HPLC分析。裝置及條件 使用山村化學研究所公司之逆相 〇ds您 ^桂 YMC-R-0DS-5(4. 9mmx300mm) ’ 日本分光工業公 1 之 TWINCLE泵浦及日本分光工業公司之GP-A40型梯度器於 0. 1%三氟乙酸（TFA)中從乙腈之0%至70%的梯度以流速 1. OmL/分實施25分鐘，以日本分光工業公司製 UVIDEC-100V型檢測器（21〇nm，1. 28AUFS)進行檢測。得知 以此所得之合成胜肽純度約1 〇 〇%。 [實施例31免癌原之镅借 將為擔體之透貝之血青素（KLIOCCalbiochem公司製） 或牛血清白蛋白（BSA)(生化學工業公司製）1〇mg溶解於 10mM磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩衝液（pH7, 〇)，並於其中加 入溶解在N，N-二曱基曱醯胺之2.5%馬來醯亞胺苯甲醯基 -N-羥基琥珀醯亞胺酯（MBS)(Pierce公司製）溶液 150//L,於室溫一面攪拌一面使反應分鐘。將其於4它 下通過以10mM填酸二氫卸-鱗酸氫二卸緩衝液（ρΗ7·〇)平 衡化之凝膠過濾管柱（SephadexG-25(Sephadex G-25)管柱 (Pharmacia LKB公司製）），監控於28〇nm中之吸光度’並 分取MBS-擔體結合成分。將此MBS-擔體結合成分以磷酸 三鈉調整為pH7. 0，於其中添加混合於實施例2所合成之 胜肽「Cys Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys A1 a G1 u Lys」（序列編號：3) ’使反應i 5 〇分鐘。反應後， 對於水進行3次透析後，進行冷凍乾燥得到與前述胜肽結 2125-9414-PF 45 200900077 合之擔體所構成之免疫原。 —[實施例鱼HMGB-2之f锯 從豬胸腺，依照Sanders等人之方法（c· Sanders Μ al.，BBRC (1977) 78: 1034-42)，製備豬 HMGB-IC序列編 號：4)及豬HMGB-2(序列編號：5)。 (1) 將豬胸腺500g，於含i4〇mM氯化鈉及〇. 5mM PMSF之 60 0mL緩衝液中進行破碎。 (2) 其次’將該破碎物以離心分離機進行離心分離，將上 清液除去。 (3) 於其中’加入含14〇mM之氣化鈉及〇· 5mM之pMSF的 緩衝液並攪拌後，以離心分儺機進行離心分離，將上清液 除去。反複操作2次此洗滌操作。 (4) 其次，於得到之沉澱物中，加入〇75m過氯酸3〇0mL。 並且’以離心分離機進行離心分離後，分取上清液。於殘 留之沉澱物中加入0.75M過氣酸400mL。將其以離心分離 機離心分離後’分取上清液。將此上清液與先前分取之上 清液合併。又，將沉澱物廢棄。 (5) 於前述合併之上清液中加入ο.?5M過氣酸，使全體容 量成為1，0 0OmL。其次，以離心分離機進行離心分離後， 將上清液以玻璃過濾器（等級4)過濾。 (6) 前述過濾之濾液中’加入3, 5〇〇mL丙酮與21mL濃鹽酸 之混合液。由於發生混濁，因此以離心分離機離心分離， 分取上清液。於此上清液中加入丙酮2,500mL。並且，由 2125-9414-PF 46 200900077 4 於再度混濁，因此將其以離心分離機離心分離，將上清液 分離’並收集殘留的沉澱物。 (7) 將收集的沉澱物於室溫使自然乾燥。 由以上操作，得到含HMGB-1及HMGB-2之蛋白質分部 約 2 0mg。 (8) 將前述含HMGB-1及HMGB-2之蛋白質分部，溶解於含 2 0 0mM氣化鈉之7· 5mM硼酸鈉緩衝液（pH9. 0)l〇mL後，以 含200mM氣化鈉之7_ 5mM硼酸鈉緩衝液（ρΗ9· 〇)充分進行 透析。 (9) 透析之後’添加到預先以7· 5mM删酸納緩衝液（pH9. 〇)

平衡化之CM-SephadexC25管柱。並且之後，使由含200mM 氣化鈉之7.5mM硼酸鈉緩衝液（ρΗ9·0)洗提，進行陽離子 交換層析。 (10) 並且，15%SDS-聚丙烯醯胺電泳之結果，由移動度， 確認圖1中，「A」表示之洗提分部及「B」表示之洗提分 部為含豬HMGB-1之分部，再者’ 「c」表示之洗提分部及 ' 「D」表示之洗提分部為含豬HMGB-2之分部。 (11) 因此’將圖1中以「A」表示之洗提分部及「B」表示 之洗提分部混合並收集，再將以「C」表示之洗提分部及 以「D」表示之洗提分部混合並收集。 HMGB-ΐ 邀 HMGB-2 之製備 將人類HMGB-1(序列編號：6)及HMGB-2(序列編號：7) 依照文獻（P. Cabart et al. Cell Biochemistry and 2125-9414-PF 47 200900077

Function 13; 125-133: 1 995) ’ 從 HL60 細胞精製。 (1) 將HL60細胞於300mL之含10%之非動化FCS(胎牛血 清：Gibco)的 RPMI 1 640(Gibco)，培養約一週。 (2) 將培養之HL60細胞回收，以RPMI 1 640洗蘇後，於3L 之 PFHM-II(Invitrogen)培養約二週。 (3) 其次，將培養上清通過以 PBS 平衡化之 Heparin-Sepharose(Sigma 公司）。 (4) 以PBS充分洗務後’以含〇. 5 Μ之氯化納之PBS進行 洗提。對洗提物監控於28Onm之吸收，將有吸收之部分合 併。將合併物以5mM硼酸緩衝液（pH9.0) 0.2M氣化鈉充 分透析。 將該經透析之合併物添加於經7· 5mM硼酸緩衝液 (ρΗ9· 0)平衡化之 CM-SehadexC25(Pharmacia)。之後，以 含20 0mM氣化鈉7. 5mM硼酸鈉緩衝液（PH9. 0)洗提。結果 與實施例4所示者相同。 施例6 ]多株抗體之臂锯 使用實施例4製備之免疫原豬HMGB-1，依下述方式製 備多株抗體。 [1 ]對動物免疫 (1)將前述實施例4得到之免疫原豬— i溶解於生理食 鹽水（0. 9%氯化鈉水溶液），使成g/mL，並且與佛洛 依德完全佐劑等量混合成乳劑，並注射〇. 5mL到雞（旭 Technoglass)之羽毛根部。 2125-9414-PF 48 200900077 (2) 初次免疫起2週後，將前述免疫原以生理食鹽水溶解， 使成100 // g/mL，且將其與佛洛依德不完全佐劑等量混合 成乳劑’並追加注射〇· 5mL。此追加注射每隔2週實施。 (3) 將為免疫動物之雞之血清中及蛋黃中之抗體價，利用 酵素免疫測定法（ELISA、EIA)，於初次免疫第6週起每週 測定。EL ISA法之操作如以下所示。 (3-1)將豬HMGB-1溶解於生理食鹽水使成1" g/此，將其 對於96井-微平盤（Nunc公司製）中每1井逐一加入 100" L，於37°C靜置2小時，實施豬HMGB-1之固相化。 (3-2)將此微平盤以含洗蘇液（〇. 〇5%Tween20)之鱗酸緩衝 生理食鹽水（含5. 59mM磷酸氫二鈉、1· 47mM磷酸二氫鉀、 137mM氯化鈉及2.68mM氯化鉀之水溶液（pH7.2)))洗滌 後’將含1%BSA之10mM磷酸二氳鉀-磷酸氫二鉀緩衝液 (PH7. 2)對每1井逐一加入300 " L，於37°C靜置2小時， 進行阻斷（b 1 ock i ng)，之後再次以洗滌液洗滌。 (3-3)將待檢查抗體產生之前述雞蛋黃i〇〇/zL溶於生理食 鹽水900 # L中，再將其以生理食鹽水稀釋成1〇〇〇倍、 1 0000倍，及1 00000倍，將此等於微平盤之井各加入 1叫L，於37°C靜置2小時使反應。之後以洗滌液洗滌。 (3-4)又，作為對照組，於前述（3-2)之微平盤之井中，各 加入含1%BSA之0.1M磷酸緩衝生理食鹽水l〇〇"L，於37。(： 靜置2小時，之後以洗滌液洗滌。 (3-5)將過氧化酶（p〇D)標識抗雞IgY抗體（up-Data公司 製）以含3%BSA之磷酸緩衝生理食鹽水稀釋成5000倍後， 2125-9414-PF 49 200900077 « 在（3-3)及（3-4)之微平盤中每j井逐一加入1〇〇#l，於 3 7 C靜置2小時，使反應進行。 (3-6)將該等以洗滌液洗滌後。在每丨井各加入過氧化酶 反應液（對於含3mM 2,2，-連氮基—雙（3_乙基苯并噻唑啉 -6-¾酸）（ABTS)之50mM磷酸氫二鈉_24mM檸檬酸緩衝液 lmL在即將使用前添加2/z L之1. 7%過氧化氫者）100# 於室溫使反應。15分鐘後在每！井加入15〇# L的⑽硫酸 使反應停止。 (3-6)將此等以EIA平盤讀取儀（Bi〇 Rad公司製）測定於 415nm之吸光度。 (4) 從初次免疫起第12週以後，認為抗體價已達穩定高 值，因此，從此免疫動物雞之蛋黃得到抗體（丨gY)。 (5) 於蛋黃 l〇mL 加入 TBS(〇. 14M NaCl、〇. 01M Tris/HCl、 pH7. 4、0. 01%NaN3)40mL，充分攪拌後，進行離心分離得上 清。 (6) 其次於此上清中加入7· 5mL CaCh、3此葡聚糖硫酸 (10%(W/V)葡聚糖硫酸於TBS)，攪拌約30分鐘後，進行離

心分離，得上清與沉澱。將上清回收，將沉澱再度以TBS 再萃取。離心分離後再度得到之上清與前次上清合併，以 TBS加至成lOOmL。 (Ό於其中添加無水硫酸鈉2〇g，攪拌3〇分鐘後，進行離 心分離’除去上清後’將沉澱溶解於1 〇mL TBS，加入pBS ’ 再以P B S透析，得球蛋白分部。 (8)其次將其通過固定化有實施例4中製備之豬腿⑶-丨的 2125-9414-PF 50 200900077 管柱’進行親和性層析。操作如以下所示β (8-1)對於實施例4所製備之豬HMGB-14mg，使2g的 CNBr-Sepharose(Pharmacia Biotech 公司製）依照操作説 明書反應，製備成固定化有前述胜肽之親和性層析用管 柱。 (8-2)將此管柱以磷酸緩衝生理食鹽水預先平衡化，之後 通過於前述（7)濃縮之成分（多株抗體）。 (8-3)於其中使磷酸緩衝生理食鹽水充分通過並洗滌後， 通過0. 1M乙酸緩衝液（pH3 〇)。 (8-4)收集因此而洗提之分部，以磷酸緩衝生理食鹽水進 行透析，之後實施濃縮。 利用以上之親和性層析操作，分取與豬hmgb_丨結合 之多株抗體。 …口 (9)以上操作所得到之雞之抗豬_-ι多株抗體，為能與 類HMGB 1，2結合者。此次之情形係製借經親和性精製 之抗體，但亦可不進行親和性精製。 與人類高銘叙 移動性 2結合之技.^ 體之職4結合但不與人類職^2結合之多株抗 體之製備依下述方式實施。 將實施例6所製備之多 之琺HMrR 9 ^ 夕株抗體通過固疋化有實施例4製備 之豬HMGB-2的官柱隹并组⑽ 進仃與HMGB-2反應之抗體之吸收。 其刼作如以下所示。 2125-9414-PF 51 200900077 (1) 對於實施例4所製備之豬HMGB_24mg，使^的 CNBr-Sephar〇se(Phannacia Bi〇tech 公司製）依照操作説 明書反應，製備經固定化有前述HMGB_2之HMGB_2吸收用 管柱。 (2) 將此管柱以磷酸緩衝生理食鹽水預先平衡化，之後通 過於實施例6濃縮之成分（多株抗體）。 (3) 收集直接通過的分部，以磷酸緩衝生理食鹽水進行透 析’之後實施濃縮。 利用以上親和性層析之操作，分取與豬MGB_ 1結合 但不與豬HMGB-2結合之多株抗體。利用以上操作所得之 雞之抗豬HMGB-1多株抗體，係與人類結合但不與 人類HMGB-2結合者。 實施例8 ]抗HMGB-1多株抗體對於胜肽之反應性 確認於實施例6所製備之抗豬HMGB-1多株抗體對於 實施例3所製備胜肽抗原之反應性。 (1) 將實施例3得到之胜肽抗原溶解於生理食鹽水，使成 1 // g/mL ’並將其於96井-微平盤（Nunc公司製）中每1井 逐一加入100 // L ’於37°C靜置2小時，進行此胜肽抗原 之固相化。 (2) 將此微平盤以含洗滌液（〇· 〇5%Tweeb2〇)之磷酸緩衝生 理食鹽水（含5.59mM磷酸氫二鈉、1.47mM磷酸二氫鉀、 137mM氯化鈉及2.68πιΜ氣化鉀之水溶液（pH7.2)))洗滌 後’將含1%BSA之l〇mM碟酸二氳鉀-填酸氫二斜緩衝液 2125-9414-PF 52 200900077 (PH7.2)於每1井各加入300 #l，於37°C靜置2小時，進 行阻斷，之後再次以洗滌液洗滌。 (3) 將待檢查抗體產生之前述雞蛋黃[溶於生理食鹽 水90 0//L中’再將其以生理食鹽水稀釋成ι〇〇〇倍、ι〇〇〇〇 倍’及1 00000倍，將此等於微平盤之井中各加入i〇〇//L, 於37°C靜置2小時使反應進行，之後以洗滌液洗滌。 (4) 又，就對照組而言，於前述（？）之微平盤之井中，各加 ， 入含1 %BSA之0. 1Μ磷酸緩衝生理食鹽水1 〇〇以l，於3 7X： 靜置2小時’之後以洗滌液洗滌。 (5) 將過氧化酶（p〇D)標識抗雞IgY抗體（Up_Data公司製） 以含3%BSA之磷酸緩衝生理食鹽水稀釋為5〇〇〇倍後，於 (3)及（4)之微平盤中每1井逐一加入1〇〇"L，於37乞靜 置2小時以實施反應。

(6) 將其以洗滌液洗滌後，將過氧化酶反應液（對於含3mM 2’2’-連氮基-雙（3-乙基苯并噻唑啉_6_磺酸）(^81^)之 1 5〇mM磷酸氫二鈉_24mM檸檬酸緩衝液lmL·，於即將使用前 添加2#L之1.7%過氧化氫者）於每i井各加入 於至溫使反應。15分鐘後，於每i井加人5〇 # L的6N硫 酸，使反應停止。 (7) 將其於EIA平盤s賣取儀（Bi〇 Rad公司製）測定415nm 之吸光度。 結果如圖2所示，稀釋倍率愈高則信號愈高。從此可 知，於HMGB]得到之多株抗體之中包含對抗胜肽抗原之 抗體。 2125—9414-PF 53 200900077 [實施例91多抶括.耱！ 使用實施例3所製備之免疫原胜肽抗原製備多株抗 體，係依下述方式進行。 [1 ]對動物進行免疫 (1) 於使刖述實施例2得到之免疫原（r CyS Lys Pro Asp Ala

Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys」（序列編號：3) 表示之胜狀結合BSA者，以生理食鹽水（q. 9%氯化鈉水溶 液）溶解，使成1 00 y g/mL，並將其與佛洛依德完全佐劑各 等量混合成乳劑，注射〇· 5mL至雞（旭Technoglass公司） 羽毛根部。 (2) 從初次免疫起2週後，將前述免疫原以生理食鹽水溶 解’使成10 0 # g/mL，並與佛洛依德不完全佐劑等量混合 成乳劑’以0. 5mL追加免疫注射。此追加免疫注射隔2週 進行。 (3) 免疫動物雞於血清中及蛋黃中之抗體價，以酵素免疫 測定法（ELISA、EIA)，從初次免疫第6週起每1週測定。 該EL ISA法之操作如以下所示。 (3-1)將實施例3得到之胜肽結合KLH者，溶解於生理食 鹽水’使成1 // g/mL，並於96井-微平盤（Nunc公司製）中 每1井逐一加入100 "L，於37°C靜置2小時進行此胜肽 -KLH之固相化。 (3-2)將此微平盤以含洗蘇液（〇· 〇5%Tween20)之碟酸緩衝 生理食鹽水（含5. 59mM磷酸氫二鈉、1. 47mM磷酸二氫卸、 137mM氯化鈉及2.68mM氯化鉀之水溶液（pH7.2)))洗滌

2125-9414-PF 54 200900077 後，將含1%BSA之l〇mM磷酸二氫鉀—磷酸氫二鉀緩衝液 (PH7.2)在每1井各加入3〇〇#l，於37。(：靜置2小時進行 阻斷，之後再次以洗滌液洗滌。 (3-3)將待檢查抗體產生之前述雞蛋黃i〇〇#l溶於生理食 鹽水900 //L中，再將其以生理食鹽水稀釋成1〇〇〇倍、 1 0000倍，及1 00000倍，將此等在微平盤之井各加入 1 〇〇 # L ’於37°C靜置2小時使反應進行，之後以洗滌液洗 務。 (3-4)又，就對照組而言，於前述（3_2)之微平盤之井，各 加入含1%BSA之0.1M磷酸缓衝生理食鹽水，於3rc靜置 2小時’之後以洗滌液洗滌。 (3-5)將過氧化酶（P0D)標識抗雞igY抗體（如_肫饨公司 製）以含3%BSA之磷酸緩衝生理食鹽水稀釋成5〇〇〇倍後， 在（3-3)及（3-4)之微平盤中每！井逐一加入1〇〇#L，於 37°C靜置2小時，進行反應。

(3-6)將該等以洗滌液洗滌後，將過氧化酶反應液（對於含 3mM 2,2 -連氮基-雙（3_乙基苯并噻唑啉磺酸）（abts) 之5〇mM磷酸氫二鈉_24mM檸檬酸緩衝液lmL在使用前添加 2//L之1.7%過氧化氫者）於每！井各加入1〇〇#l，於室溫 使反應。15分鐘後每！井加入15〇#L的6N硫酸使反應停 止。 (3 7)將其以EIA平盤讀取儀（Bio Rad公司製）測定415nm 之吸光度。 (4)從初次免疫起第12週後，因為認為抗體價已達穩定高 2125-9414-PF 55 200900077 值’從免疫動物雞之蛋黃得到抗體（IgY)。 (5) 於蛋黃 10mL 中加入 TBS(0_ 14M NaCl，0· 01M Tris/HCl， PH7.4’ 0.01%NaN3) 40mL’充分攪拌後，進行離心分離得 到上清。

(6) 其次於此上清中加入7· 5mL CaCh、3mL葡聚糖硫酸 (10%(W/V)葡聚糖硫酸於TBS)，攪拌約3〇分鐘後，進行離 心分離，得到上清及沉澱。將上清回收，將沉澱再度以TBS 再萃取。離心分離後，再度將得到之上清與前次上清合 併，以TBS加成lOOmL。 (7) 於其中添加無水硫酸納2〇g’擾拌30分鐘後，進行離 心分離，除去上清後，將沉澱溶解於】〇mL TBS，加入pBS， 再以PBS透析，得球蛋白分部。 (8) 其次，將其通過固定化有實施例2所製備之胜肽的管 柱，進行親和性層析。該操作如以下所示。 (8-1)對於實施例2所製備之胜肽i〇mg，使2g之 CNBr-Sepharose(Pharmacia Biotech 公司製）依照操作説 明書反應，製備成固定化有前述胜肽之親和性層析用管 柱。 (8-2)將此管柱以磷酸緩衝生理食鹽水預先平衡化之後 使於前述（7)濃縮之成分（多株抗體）通過。 (8-3)於其中通過足夠磷酸緩衝生理食鹽水並洗蘇後，通 過0. 1M乙酸緩衝液（ρΗ3· 0)。 (8-4)收集因此而洗提之分部，以磷酸緩衝生理食鹽水進 行透析，之後實施濃縮。

2125-9414-PF 56 200900077 體 親和性層析操作，分取與胜肽結合之多株抗 (9)以上操作所得到之 結合者。又，為能與人類刪] 結合者。 ，、人類咖―1相同性高之人類脇" 此人之It形係製備經親和 和性精製之抗體只要使用二锖Ϊ 是未經親 使用適5量，亦能期待同樣的效果。 實施例9所製備之抗胜肽多株抗體對於人類 HMGB]、2之反應性，利用西方點墨法確認。 1,西方點墨法 實施例9所製備之抗胜肽多株抗體之反應性 ⑴將實施例5得到之人類HMGB_1(ling/mL)& HMGB-2(lmg/inL)以1:1混合，再者與樣本緩衝液以η混 合。 (2) 將此樣本使用15% SDS-聚丙烯醯胺凝膠進行電泳。 並且，電泳緩衝液使用巴比妥緩衝液（ρΗ88)，以電流2〇mA 通電180分鐘進行電泳。 (3) 前述（2)之電泳後之轉印，使用N〇va · βΙ〇ΐ ·

Electrophoretic· Transfer. kit(Phannacia LKB 公司 製），依照其使用説明書’以乾方式進行。首先，將前述 (2 )經電泳之凝膠$置在轉印用裝置上。其次，於此凝朦

2125-9414-PF 57 200900077 上’重疊9cmx9cm之硝基纖維素膜（Bio Rad公司製），使 用48mM參（經基甲基）胺基甲烷、39mM甘胺酸、 〇· 〇357%(W/V)十：燒基硫酸納（SDS)及2G%(V/V)甲醇所構 成之轉印用緩衝液，以電流60mA進行2小時轉印。 (4) 將經過轉印之硝基纖維素膜，於含1%BSA之磷酸緩衝 生理食孤水（含5. 59mM磷酸氫二鈉、ι·47ιηΜ構酸二氫鉀、 137mM氣化鈉及2.68mM氣化鉀之水溶液（pH72))2〇mL中 於4°C浸泡1晚，進行阻斷。 (5) 其次，將其於含洗滌液（〇.〇5%Tween20)之磷酸緩衝生 理食鹽水）2GmL中進行1G分鐘振盈洗務。此操作進行3 次。 (6) 將實施例9所製備之多株抗體· g溶解於2GmL之含 =BSA之磷酸緩衝生理食鹽水，於此溶液中於室溫浸泡經 刚述（5)之操作的硝基纖維素膜2小時使反應。 ⑺將經前述⑻之操作㈣基纖維素旗，^之洗務 液中進行1G分鐘振m条。該等操作進行3次。 (8)其次，將過氧化酶標識抗小鼠UG抗體（Dako公司製） 以^ 3%BSA之碌酸緩衝生理食鹽水稀釋5〇〇倍，製備跑 之溶液，並於其中’於室溫將前述⑺之硝基纖維素膜浸 泡2小時使反應。 ⑻將此石肖基纖維素膜於2QmL之洗㈣中進行W分鐘振 盪洗縣：。此操作進行3次。 (M)於含0.025%之3,3，-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽及〇_〇1% 過乳化氫的璘酸緩衝生理食鹽水2·中，將前述（9)之硝 2125-9414-PF 58 200900077 維於室溫浸泡1 5分鐘使發色。 依以上操作，得到實施例9所製備多株抗體之西方點 墨法結果。 2 ·實驗結果 〇)西方點墨法之結果 前述多株抗體之西方點墨法之結果如圖3所示。又， 該圖中’ 「1」為多株抗體（實施例9製備之多株抗體）中 、，’。果並且2」僅使過氧化酶標識抗雞！gY抗體（ 公司製）反應之結果。「3」顯示藉使實施例6得到之抗豬 HMGB-1多株抗體反應，而明確化人類肋⑶—卜2之位置。 從圖3’於未使「2」之多株抗體作用之僅使過氧化酶標識 抗雞IgY抗體作用的對照（控制組）中，於出現人類膙⑶」 站▼之位置及出現人類HMGB-2譜帶之位置任一者，均未 呈現任何發色。由此，可確認前述各西方點墨法中，未發 生非專一性發色。可知，「！」之實施例9所製備的多株 抗體，雖於人類電泳之位置觀察到發色，但是於 人類HMGB-2電泳之位置未觀察到發色。由此可明白，實 施例9所製備之抗胜肽多株抗體，會與人類HMGB-1反應， 但不與人類HMGB-2反應。 —L實施例UJJ·株抗艚夕事j偌 本發明中可使用之單株抗體，可由以下操作取得。使 用實施例5所製備之免疫原人類ημβη製作單株抗體， 係依如下方式實施。 2125-9414-PF 59 200900077 1.對於動物進杆勞.瘛 將前述實施例5所得到之免疫原人類hmgbh以生理 食鹽水（0.9%氣化鈉水溶液）溶解，使成為i⑽#g/mL，並 將其與佛洛依德完全佐劑等量混合成為乳劑，對於8週齡 雌BALB/c小鼠（日本Charles River公司）之腹部皮下注 射〇.5mL。從初次免疫起2週後，將前述免疫原以生理食 鹽水溶解使成為1〇〇"g/mL，並將其與佛洛依德不完全佐 , 劑等量混合成乳劑，以〇.5mL進行追加注射。此追加注射 隔2週進行。此等免疫動物小鼠之抗體價，以酵素免疫測 定法（ELISA、EIA)，從初次免疫起第6週，每i週測定。 ELISA法之具體操作，於以下（1)詳述。從初次免疫起第 18週後，由於已認為抗體價達穩定高值，因此，對於此等 免疫動物小鼠之腹部皮下’注射以生理食鹽水稀釋成 80 0 /z g/mL之實施例5得到之人類hmgb—! 〇 5mL。之後第 3曰’從此等小鼠取出脾臟。 ( (l)ELISA 法 將人類HMGB-1溶解於生理食鹽水，使成】# g/mL，將 其於96井-微平盤（Nunc公司製）中每1井逐一加入 100/z L，於37〇C靜置2小時，進行該人類.(^-丨之固相 化。將該微平盤以含洗滌液（〇· 〇5%Tween2〇)之磷酸緩衝生 理食鹽水（含5.59mM磷酸氫二鈉、iUmM磷酸二氳鉀、 137mM氯化鈉及2.68mM氣化鉀之水溶液（pH7.2)))洗滌 後，將含1%BSA之l〇mM填酸二氫鉀—填酸氫二鉀緩衝液 (ρΗ7· 2)對每1井各加入300 " L ,於37。〇靜置2小時，進 2125-9414-PF 60 200900077 行阻斷’《後再次以洗滌液洗/條。以待檢查抗體產生之前 述】既血’月l〇〇eL作為試樣，溶於生理食鹽水900/zL· 中，再將其以生理食鹽水稀釋成1〇〇〇倍、1〇〇〇〇倍，及 1 00000倍，將此等於微平盤之井中各加入1〇〇“於抓 靜置2小時使反應進行，之後以洗滌液洗滌…作為對 …組於微平盤之井中，取小鼠血清而代之以加入含1 %㈣ 之〇 1M磷酸緩衝生理食鹽水各1〇〇#L，於3rc靜置2小 時之後以洗滌液洗滌。將過氧化酶（p〇D )標識抗小鼠^ ^ 抗體（Amersham公司製）以含3%BSA之磷酸緩衝生理食鹽 水稀釋成5000倍後，於各微平盤中每1井逐一加入 1 00 " L力37 C靜置2小時使反應進行。將其以洗務液洗 滌後，將含過氧化酶反應液（對於3mM 2,2，—連氮基-雙 (3-乙基苯并噻唑啉_6〜磺酸）（ABTs)i 5〇mM磷酸氫二鈉 24mM檸檬酸緩衝液的lmL，在即將使用前添加之 1.7%過氧化氫者）於每i井各加入1〇〇"[，於室溫使反 應15刀鐘後於每1井加入15〇eL之6N硫酸使反應停 止。將其以EIA平盤讀取儀（Bi〇 Rad公司製）測定415nm 中之吸光度。 公.骨髓瘤細胞之増豬 將BALB/c小取來源之次黃嘌呤•鳥嘌呤•構酸核糖 •轉移酶缺損之骨髓瘤細胞株— 株（癌研究

Research Source Bank 9〇85),於含胎生牛血清1〇%且補 充有谷醯胺、盤尼西林及鏈黴素之RpMn64〇組織培養培 養基Cell公司製）進行增殖。更詳言之，將該骨髓瘤 2125-9414-PF 61 200900077 細胞於細胞培養用中型瓶（Nunc公司製、容量20 OmL)内， 增殖至細胞占瓶底面約8成為止。又，細胞數以錐蟲藍 (Trypan blue)染料排除法及血球計計數。 3.細胞融合 如前述1 ·由免疫動物小鼠取得之脾臟，使用不錢鋼篩 網#2 00充分解碎，一面以不含血清之rpmii 640培養基洗 蘇一面過濾。之後’以200g進行離心分離，將脾臟細胞 分離。再者’再度將不含血清之P3-X63-Ag8-Ul株骨髓瘤 細胞以5 :1之比例混合後’進行離心分離。將經混合之細 胞，和緩地懸浮於含聚乙二醇15〇〇(pEG15〇()、R〇che

Diagnostics公司製）50%之RPMI164〇培養基中。並且， 將其以RPMI 1 640培養基緩慢稀釋至最終聚乙二醇濃度達 到5%。從其中，將細胞以離心分離分離’之後緩慢地分散 於含有5%融合瘤選殖因子（0rigen公司製）之s選殖體培 養基（三光純藥公司製）所構成之增殖培養基。並且，於平 底之96孔微平盤（Nunc公司製）之井中，每1井接種ι〇6 個/iOML細胞數之細胞，於5%二氧化碳令於3代培養。 於細胞融合後W日’在各井加入】叫L之組培養基（前 述增殖培養基補充使為UlmM次黃嘻呤]·_胸腺鳴 咬及〇·_Μ胺基蝶吟，均為東京化成公司製）。之後3 曰期間，每日將約一半的HAT Λ * ΗΑΤ培養基與新的HAT培養基交 換’並於之後每隔2〜3日進行同樣的交換。 將細胞以顯微鏡觀察，結果融合瘤（融合細胞）之選殖 體奴1。曰以後出現。細胞融合後14曰以後，為了檢查認 2125-9414-PF 62 200900077 識人類HMGB-1之抗體之產生，將井内培養液以EL丨SA法 篩選。又，此ELISA法操作，係與前述i (1)相同。將利 用篩選判別為生產認識人類之抗體之井的融合 瘤，於24井平盤擴大培養，隨著細胞密度增高，於小型 瓶、中型瓶以大規模培養。融合瘤，以Ητ培養基（不含胺 基蝶呤及融合瘤選殖因子之HAT培養基）培養、保持。將 認識人類HMGB-1之抗體之產生與^丨）以同樣EUSA法檢 查’結果可確認有40個該融合瘤。 4,融合瘤攻撰豬 將各產生對抗人類HMGB-丨之抗體的前述融合瘤，以 極限稀釋法予以次選殖。此等融合瘤之細胞數，以錐蟲藍 染料排除及血球計進行計數。其次，將此等融合瘤，在每 100# L之HT培養基，以0.5個生長細胞數之比例與】個 生長細胞數_之2種比例料，並對於96孔之平底微 平盤每1井各分注1GML。將該等每隔2〜3日交換培養 基’並使融合瘤增殖。2週後，於顯微鏡下檢查各井之群 落數，並且對於產生對抗豬脇Μ之抗體的融合瘤，盘 前述同樣以ELISA法檢查。得到於i井中有4落存在: 並且產生此種抗體之融合瘤（井）2個。 將传到之融合瘤移到24孔之平盤，培養2週直到 胞生長良好為止。里-女，SJ. A — 其人將此專^合瘤所產生抗體與實 例5所製備人類HMGBq之反應 ELISA法檢查。又 孩匕USA法之操作，係將固相化於 开-微平盤之蛋白 2125-9414-PF 63 200900077 改t為實知例5所製備之人類ηκβ]，並將試樣改變為各 融。瘤(各井)之培養上清，除此以外與前述】·⑴以 方式實施。 由、、、σ果可知，前述融合瘤之中，有2〇個融合瘤為產 生與前述人類HMGB-1結合之抗體的細胞株。 其人以EL ISA法檢查此融合瘤產生之抗體與實施例 5所製備之人類HMGB-1、人類HMGB_2分別的反應性。又， 該ELISA法之操作，係將固相化於96井_微平盤之蛋白質 改變為實施例5所製備之人類HMGB-1或人類HMGB-2，並 將試樣改變為該融合瘤（該井之培養上清），除此以外，與 前述1.(1)同樣地進行。 該探討之結果，確認該融合瘤所產生之抗體，為與人 類HMGB-1結合但不與人類HMGB_2結合之選殖體。該融合 瘤命名為 R08G12G2、R0 6G7E10。 5.單株杭體之產生 將前述4.所得各單株抗體產生細胞株（融合瘤），逐— 放入分別的中型瓶（Nunc公司製）中，並於ht培養基中培 養至細胞占底面之約8成為止。之後’收集此等融合瘤， 以20Og、5分鐘之離心分離回收之。其次，將其以不含血 清之RPM1 1640培養液洗蘇 3次後，懸浮於2mL之RPM11 640 培養液。將該融合瘤懸浮液IibL’注射到預先經2，6 i4_ 四甲基十五烷處置之雄性BALB/c小鼠（日本Charles River公司）之腹腔。從注射起2週以内未認為腹部膨脹之

2125-9414-PF 64 200900077 情形，再度反複此操作。採取認為腹部膨脹之小鼠之腹 水。將該腹水施以2〇〇g、5分鐘之離心分離，將含有從融 合瘤所產生單株抗體之上清液，從融合瘤分離取得。 6·單株抗體之騎[ _〇 ) 單株抗體為T j；G之情平· 將前述5.所得、含有從融合瘤產生之單株抗體的上清 r 液各1 OmL中，一面攪拌一面於22t：加入硫酸鈉丨.,並 於硫酸鈉完全溶解起算再持續攪拌丨小時，進行鹽析。將 其於22°C進行離心分離（7〇〇()g、15分鐘），將與上清液分 離得到之沉澱，溶解於含30mM氯化鈉之4〇_磷酸鈉緩= 液（pH8.0)2mL。其次，將其對於含3〇mM氯化鈉之4〇mM磷 酸鈉緩衝液（pH8. 0)充分透析後，以1 000g進行2〇分鐘離 心分離，除去不溶物。將其以流速〇. 4mL/分通過經含3〇_ 氣化鈉之40mM磷酸鈉緩衝液（pH8. 0)預先平衡好之DEae_ 〔 纖維素離子交換管柱（Seiuba公司製）[lxl〇cm]，以每2以 逐一收集洗提液。從280nm之吸光度確認免疫球蛋白 G(IgG)包含於洗提液中直接通過之分部’收集該等並濃縮 為2mL。再者，將其施加到蛋白質a -SepharoseCL-4B親 和性層析（Pharmacia LKB公司製）進行精製，得到經精製 之單株抗體。 -II)單株抗體為I gM之情形 將前述5.所得，含有從融合瘤產生之單株抗體的上清 液各10mL’以20mM磷酸緩衝液（PH7.5) 0.8M硫酸録充 2125-9414-PF 65 200900077 分透析。將透析結束之上清液，施加於經20mM磷酸緩衝 液（pH7. 5) 0. 8M 硫酸銨平衡之 HiTrap IgM purificati⑽ HP lmL(Amersham Bioscience)。以 20mM 磷酸緩衝液 (PH7.5) 0.8M硫酸銨充分洗滌後，以2〇mM磷酸緩衝液 (pH7. 5 )洗提。而得到經精製之I型單株抗體。 —L實施倒12]單迷^體對於人類HMGB-]. 2夕反應性熘气 利用西方點墨法確認單株抗體對於在實施例5所製備 人類HMGB-1，2之反應性。此情形以選殖體R〇6G7E1〇為例 說明。對於其他選殖體亦進行同樣探討。 111於實施例11 之單株抗艚之及應性C西方黜.里、土、 將實施例5所得之人類HMGB_1(lmg/mL)與 HMGB-2(lmg/mL)混合為1:卜再者，與樣本緩衝液以1:1 混合。將該樣本使用15% SDS-聚丙烯醯胺凝膠進行電泳。 並且，使用巴比妥緩衝液（pH8.8)作為電泳緩衝液，以電 流20mA通電180分鐘通電進行電泳。電泳之後之轉印’ 使用 Nova · Blot · Electrophoretic · Transfer ·

Kit(PharniaCiaLKB公司製），並依照其使用説明書，以乾 式進行。具體而言，首先將已實施電泳之凝膠放在轉印用 裝置上。其次，在該凝膠上，重疊9cmx9cm之硝基纖維素 膜（Bio Rad公司製），使用48mM參（羥基甲基）胺基曱 烷、39mM甘胺酸、〇.〇357%(W/v)十二烷基硫酸鈉（SDs)及 2〇%(V/V)甲醇所構成之轉印用緩衝液，以電流⑽^進行2 小時轉印。 將經過轉印之硝基纖維素膜，於含1%BSA之磷酸緩衝 2125-9414-PF 66 200900077 生理食鹽水（含5. 59mM磷酸氫二鈉、丨.47mM磷酸二氳鉀、 137mM氯化鈉及2. 68mM氯化鉀之水溶液（pH7. 2))2〇mL於 4 C浸泡1晚，進行阻斷。其次，將該等於含洗滌液 (0.05%TWeen20)之磷酸緩衡生理食鹽水）2〇α中，進行1〇 分鐘振盥洗滌。此操作進行3次。將實施例工1製備之單 株抗體8〇^zg溶解於20raL之含1%BSA的磷酸緩衝生理食 鹽水中，將前述經洗滌之硝基纖維素膜於室溫浸泡2小時 使反應。接著，將膜於20虮之洗滌液中進行1〇分鐘振盪 洗滌。該等操作進行3次。 其次，將過氧化酶標識抗小鼠IgG抗體（Dak〇公司 製）’以含3%BSA之磷酸緩衝生理食鹽水稀釋5⑽倍，製 備成20mL溶液，並於其中，將前述硝基纖維素膜於室溫 浸泡2小時使反應。將該石肖基纖維素膜於2〇此洗蘇液十 振蘯洗滌10分鐘。此操作進行3次。將前述石肖基纖維素 膜於室溫浸泡於含0.025%之3,3，_二胺基聯苯胺四鹽酸 鹽及0.01%過氧化氫的磷酸緩衝生理食鹽水2〇社中丨5分 鐘使發色。由以上操作，得到實施例u所製備單株抗體 之西方點墨法結果。 前述1之R06G7E10之西方點墨法結果如圖4所示。 又，忒圖之中，「1」係僅使過氧化酶標識抗小鼠抗 體⑽。公司製）反應者，「2」係使__(實施例n 所製備之單株抗體）反應者，「3」係使實施例6得到之抗 豬HMGB-1多株抗體反應者。從圖4，未使「丨」之單株抗 體作用僅使過氧化酶標識抗小鼠IgG抗體作用的對^(二 2125-9414-PF 67 200900077 中，在人類HMGB-1譜帶出現之位置及人類HMGB-2 言’f出現之位置，均未認為有任何發色。從此，確認前述 各西方點墨法中，未發生非專一性發色。「2」之實施例 Η所製備之單株抗體，雖觀察到在人類跗⑶-丨電泳位置 有發色，但是人類HMGB_2電泳位置未觀察到發色。 —]肺纖雒戒中之抗體之治療钕罢 11)材料及方法 L·實驗個體_ 本實驗係經九州大學醫學部之倫理委員會許可後進 行L特發性肺纖維症（IPF)及無法分類之間質性肺炎（Nsip) 之0斷，依據習知分類法（非專利文獻4)實施。胸腔鏡肺 活檢檢體，係從8人的IPF患者及所有的NSIp患者得到。 伴隨膠原病（collagen vascular diseases)之間質性肺炎 (CVDMP)，觀察到n件風濕性關節炎、6件多發肌炎/皮 膚肌炎、2件Sj0gren症候群，及】件進行性全身性硬化 症。HP之診斷，依照習知分類法（Richers〇nHBet

Allergy Clin immunol ( 1 989) 84: 839_44)進行。所有 的控制組’為健康之自願者。對於所有案例，為了不得到 相反診斷結果，取得經支氣管肺活檢。BALF之陰性培養及 生檢檢體，確認所有的患者在該時點未被細菌、分枝桿菌 (Mycobacterium)或真菌感染。診斷時及類固醇治療前， 採取BALF及血清。 2 ·博來黴素誘導肺疾病 本實驗係得到九州大學醫學部之關於動物實驗之倫 2125-9414-PF 68 200900077 理委員會承認，並依照美國生理學學會（Ameri Physiological Society)指導原則實施。所有的實驗，係 使用從（股）KBT Oriental(日本）得到之7至8週齡雄性 C5 7B1/6小鼠。小鼠體重為20〜25g。小鼠藉由腹膜内注 射戊巴比妥納（Schering-Plough,美國）麻醉。對於經麻醉 之小鼠，經支氣管投予滅菌鹽水中含體重每1 kg含博 來黴素50//L之鹽酸博來黴素（日本化藥（股））溶液。多株 雞IgY抗HMGB-1中和抗體為實施例6所製作者。控制址 之雞IgY抗體，係由Shino-Test(股）分讓者。中和抗體之 用量’依據以前之報告決定（Kim JY et al.，Am J Physic)1

Lung Cell Mol Physiol (2005) 288: L958-65)。從博來 黴素投予後5日後’將抗HMGB-1中和抗體（2〇〇y g/隻）咬 控制組雞IgY抗體（200以g/隻），進行腹膜内注射。丙綱 酸乙酯用量，依據以前的報告決定（U1 i〇a l et al.，PrQe

Natl Acad Sci USA (2002) 99: 12351-6)。具體而言， 將丙酮酸乙酯（EP) (40mg/kg)於博來黴素投予後3至j 3日 後期間’每日進行腹腔内注射。從博來黴素點滴注射j 4 日後’使小鼠犠牲死’並採取全血。將右肺組織於緩衝劑 中以1 0 %福馬林固定，將左肺組織於液態氮中急速冷柬， 保存於-8 0 °C至使用時為止。 k支氣管肺泡洗滌（BAU舟驄 於患者中，將BAL依照以前之報告實施（Kuwano κ et al.，Chest (2000) 1 1 8: 45卜8)。具體而言，BAL 使用總 2125-9414-PF 69 200900077 量150mL之滅菌生理食鹽水溶液進行。首先，將已殺死的 小鼠的氣管切開。插入氣管軟管後，將氣管以1 mL容量之 滅菌鹽水於室溫洗滌2次。將回收的液體，以單層的紗布 過濾’除去根黏液。使用血球計數器計算洗滌液中之細胞 數。對於以 Diff-Quick(Baxter Diagnostics)染色過之 200個細胞，區分BAL細胞並計算。洗滌液之上清，保存 在-80°C直到HMGB-1測定為止。 4.HMGB-1之免癌組鐵化學分析 將3片厚度l〇_6m之石蠟切片，放置在經聚L_離胺酸 前處理過之載玻片上。脱石蠟化後’使用he SAB-ΡΟ套組（Nichirei)，利用改變過的鏈黴親合素_生物 素（Streptoavidin-biotin)化過氧化酶技術，進行免疫組 織化學分析。非專一性蛋白質染色，係藉由加入山羊血 清，於室溫溫育30分鐘而阻斷。將切片與抗肋⑼—丨抗體 (Upstate，Lale Placid’ NY)—起在 4〇C 溫育一晚。控制 組，係將專一性抗體取代為使用非免疫血清進行溫育p將 切片以甲基綠染色，放置於鏡檢板上。 ^1、鼠中之組織病理輋 開胸後，將肺循環器系以鹽水流洗，並診查肺。將肺 試樣以10%福馬林花費一晚固定，並包埋於石蠟中。以倍 率40倍評價中央矢狀切片全區域中之發炎及纖維化之病° 理階段，並依據以下分類決定：0、肺無異常；i、肺實質 之不滿25%存在發炎及纖維化；2、病變佔肺之25〜5〇% ; 3、病變佔肺之50%以上。 ° 2ΐ25-9414*-ΡΓ 200900077 6·.ϋ組織上之ΜΑ損傷及細胎. >居雯 TUNEL陽性細胞之數，與本模型動物中之肺損傷及纖 維化有相關（Kuwano K et al.，J Clin Invest ( 1 999) 1 04: 13-9; Maeyama T et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol (2001) 280: L1128-37; Tsuburai T et al., Hum Gene Ther (2002) 13: 1945-60)。關於 DNA 損傷及細胞 /周零’使用 DeadEnd Colorimetric Apoptosis Detection System (Prcmega，MI, USA)依照 TUNEL 法，依照先前之 報告進行評價（Kuwano K et al.，Lab Invest (2002) 82: 1695-706：^於顯微鏡下，以倍率200倍，對於20個隨機 選擇之視野，計算各視野中的TUNEL陽性細胞。

7. 對於 HMGB-1.之 ELISA 依照先前的報告，使用對抗HMGB-1之單株抗體，對 於 HMGB-1 進行 ELISA(Yamada S et al.，Cl in Chem (2003) 49: 1535-7)。HMGB-1之最低檢測極限為2# g/L。 8. 膠原蛋白合_ \... 肺均質物中之膠原蛋白濃度，係使用Sircor

Collagen Assay 套組（Biocolor，Northern Ireland, UK) 依照先前之報告測定（Kitani A et al.，J Exp Med (2003) 198: 1179-88)。 9. 統計 為了比較BALF中之BAL細胞數、TUNEL陽性細胞、體 重及ELISA結果之統計學分析，使用分散分析（anaiySis of variance; AN0VA)及接續的 Scheffe F 檢定。為了比

2125-9414-PF 71 200900077 較病理階段’使用Kruskal-WaUis檢定及接續之 Mann-Whitney U檢定。p値小於〇 〇5，判斷為顯著。統計 分析使用 StatView J-4.5(Abacus Concepts Inc., Berkley, CA)實施。 (2)結果 1二血清中之 JMGB：·丄^平及間皙性肺炎中之RAT p 血清 HMGB-1 水平（平均 ±SEM)，ipF 為 3· 7±1. g、Nsip 為 0_ 1±0. 1、CVD-IP 為 〇· 8±0· 5、HP 為 4. 1±3· 4，及控制 組為0. 5±0. 3ng/mL。血清HMGB-1水平，在間質性肺炎與 控制組之間沒有顯著差異（圖5)。BALF 水平（平均 土SEM) ， IPF 為 3.5±〇.6 、 NSIP 為 4.9±2·4 、 CVD—IP 為 2.2±0.5、肝為9.4±4.2、及控制組為1.6±0.4叫/11^。6八1^ HMGB-1水平’相較於控制組，IpF及Hp患者中顯著較高（各 為 ρ<0·05、ρ<〇·〇ι)(圖 6)。 ?..,_IPF及NSIP患者^源肺組織中之HMGB」砉頦 免疫組織化學分析之結果顯示，HMGB-1表現在一些肺 泡巨噬細胞中檢測到’此外’在通常之肺實質中未檢測 到。NSIP中，肺泡壁之肺泡上皮及發炎細胞、及肺泡巨噬 細胞之核顯示陽性反應。IPF亦在此等細胞之核中，尤其 發炎區域顯示陽性（圖7)。 來黴:纖維症中之HMGB—!裊現 免疫組織化學分析之結果，HMGB-1表現在未處理小鼠 有一些支氣管上皮細胞之核檢測到。HMGBH表現，從博來 徽素點滴注射1日後’在支氣管上皮細胞經向上調控。5 2125-9414-PF 72 200900077 日後’陽性信號除了在支氣管上皮細胞，在肺泡上皮細胞 及發炎細胞亦可觀察到。在第7至第14天，相對於觀察 到經陽性染色之支氣管上皮減少’經陽性染色之肺泡上皮 細胞及發炎細胞增加。第14天，經陽性染色之細胞主要 在纖維化區域檢測到（圖8)。 4.中和坑纖維症之敔 /

體重：第14天之體重’於博來黴素點滴注射後，相 較於經控制組抗體處理之小鼠，經抗HMGB—i抗體處理過 之小鼠體重顯著增加（圖l〇a)。 組織學的觀察：相較於未處理小鼠，從博來徽素點滴 注射起第7日，由於嗜中性球及淋巴球浸潤，肺泡壁開始 肥厚。第14天，於肺間質有多數淋巴球浸潤，觀察到肺 泡間中隔肥厚、肺泡空間崩壞及纖維母細胞增殖。抗 HMGB-1抗體，於第14天，組織病理學所見減輕（圖&及 c)。利用組織學的分析之半定量分析，相較於控制、组，抗 HMGB01抗體顯示第14天中之病理階段顯著減低 10b)。 TUNEL染色：細胞型雖未明確鑑定，但是發炎區域中 之支氣管及肺泡上皮細胞、或發炎細胞，從博來黴素點滴 注射14日後，呈現DNA損傷及細胞凋零之證據（圖9匕）。 抗HMGB-1抗體，於第14天，TUNEL陽性信號數顯著減 少（圖9d及圖10c)。 膠原蛋白濃度：肺均質物中之膠原蛋白濃度，相較於

2125-9414-PF 200900077 經以控制組抗體處置之小鼠’於經抗jjMGB-1抗體處理之 小鼠顯著減少（圖l〇d)。 BALF分析：BALF中之總細胞、巨嗟細胞、嗜中性球、 及淋巴球數，於第14天，相較於經鹽水點滴注射之小鼠， 經博來黴素點滴注射之小鼠顯著增加。經投予抗丄 抗體之情形’相較於經控制組抗體處理過之小鼠，於第j 4 天中之BALF中之總細胞及嗜中性球數顯著減少，相對於 此’巨噬細胞及淋巴球數未觀察到顯著的變化（圖丨丨）。 L__丙酮酸乙酯對於博來黴素讀導肺爐維症之啟畢 體重：第14天之小鼠體重，相較於控制組，經以丙 酮酸乙酯處理者顯著增加（圖12c)。 HMGB-1水平：於此模型小鼠’血清中之hmgb-1水平 未因為丙酮酸乙酯投予而變化，但是BALF中之HMGB-1水 平顯著減少（圖12a及b)。 組織學觀察：丙酮酸乙酯投予，於第14天之組織病 理學觀察，相較於控制組減輕。依照組織學分析之半定量 分析’丙嗣酸乙醋投予將第14天中之病理階段顯著降低 (圖 12d)。 BALF分析：EP投予與控制組相比，於bAlf中之第14 天中之總細胞、嗜中性球、及淋巴球數顯著減少相對於 此，巨噬細胞數沒有顯著變化（圖1 3)。 [實施例14 ] HMGB-1之纖維母細胞増殖促進作用 (1)材料及方法 (a) 細胞凋零分析及（c)膠原蛋白產生分才斤 74

2125-9414-PF 200900077 人類肺纖維母細胞，使用 WI-38細胞（DS Pharma Bi omedi cal (Osaka, Japan) )。WI-38 細胞，使用底面積 75-cm2 之組織培養燒瓶（FALCON, Franklin Lakes, NJ)， 於10% FBS MEM培養基中，在37°C (5%二氧化碳）培養。關 於HMGB-1 10或30 ng/mL存在下或非存在下培養24小時 後之WI-38細胞，實施以下評價。 細胞凋零分析：將WI-38細胞利用胰蛋白酶/EDTA處理 從燒瓶底面剝離回收，與培養液中中漂浮的細胞合併，用 於分析。細胞凋零以Annexin-V-FLUOS染色套組 （Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)評價。亦即，將 1 χ 106 細胞以PBS洗滌，並且再懸浮於含Annex in V-FITC及碘 化丙啶（Propidium iodide)之溫育緩衝液（10 mM HEPES/NaOH, pH 7·4，140 mM NaCl, 5 mM CaCh)。於冰 上溫育20分鐘後，以Coulter EPICS XL流動細胞計數 計（Coulter, Miami, FL)測定螢光光強度，解析發生了細 胞凋零的細胞之比例。 膠原蛋白產生分析：將WI -38細胞之培養上清回收，將 保存在- 80°C之樣本用於分析。使用Sircor膠原蛋白分 析套組（Biocolor，Northern Ireland，UK)，測定該培 養上清中之膠原蛋白濃度。 (b) 細胞增殖分析 人類肺纖維母細胞使用WI-38細胞（DS Pharma Biomedical (Osaka, Japan))。將 WI-38 細胞使用 96 孔

2125-9414-PF 75 200900077 組織培養平盤，在10% FBS MEM培養基中，於37°C(5%二 氧化碳）培養。在HMGB-1 10 ^ 30 ng/mL存在下或非存在 下培養24小時後’關於WI-38細胞’使用Tetra color ONE 分析套組（SEIKAGAKU CORPORATION, Tokyo, japan)評價 WI-38細胞之增殖（各HMGB-1濃度為N = 8)。亦即，添加 tetra color ONE，於37°C溫育4小時後，以自動微平盤 讀取儀（Easy Reader EAR 340; SLT-Lab instruments,

Austria )測定540 nm之吸光度。 Γ (2)結果 HMGB-1顯示促進纖維母細胞之增殖（圖丨4)。另—方面， HMGB-1對於纖維母細胞之細胞凋零誘導或從纖維母細胞 產生膠原蛋白產生不造成影響（圖14)。

肺纖維症，已知若發炎進行，則間質會有纖維母細胞 增殖•浸潤而產生纖維化。纖維化若發生，則肺泡隔壁變 得肥厚堅硬，與勞動時呼吸困難或咳嗷等可能有關。本蚌 果顯示，HMGB-1可能涉及於纖維母細胞之增殖.浸潤。實 施例13所抗HMGB-1中和抗體效果之機轉至少一部八，暗 示抗HMGB-1中和抗體可能涉及纖維母細胞増殖抑制β。曰 【產業利用性】 本案發明人等顯示抗HMGB-1抗體有效於因為〗等 間質性肺炎所致體重減少、肺組織纖維化等。: Μ此，本發 曰提供一種利用抗HMGB-1抗體、治療或預防包含pF 間質性肺炎之間質性肺炎的工具。 【圖式簡單説明】

2125-9414-PF 200900077 弟1圖顯示從豬胸腺依照Sanders等人之方法製備 HMGB-1及HMGB-2時所進行的陽離子交換層析中，於28〇⑽ 吸光度監控經洗提之分部之結果。關於經洗提之分部進行 15%SDS —PAGE’確認圖中A及B之分部包含HMGB-1、C & D 之分部包含HMGB-2。 第2圖顯示對於人類uMGBq之第167號胺基酸殘基 (離胺酸）至第180號之胺基酸殘基（離胺酸）之序列，以 ELISA測定與抗豬HMGB-1多株抗體之反應性之結果圖。固 相化抗原，使用在該序列N末端加成半胱胺酸並結合有作 為擔體之透貝之血青素（KLH)或牛血清白蛋白（BSA)之抗 原。橫軸顯示添加在該ELISA系之抗豬HMGB-1多株抗體 之濃度。又，縱軸顯示於該ELISA系中，使用過氧化酶（p〇D) 標識抗雞I gY抗體及過氧化酶反應液，檢測吸光度之値作 為與該抗原結合之抗豬HMGB-1多株抗體量。對於附著在 任一擔體之胜肽抗原’抗豬HMGB-1多株抗體以濃度依存 性反應。方法細節記載於實施例8。 第3圖顯示以西方點墨法’使用在人類HMGB-1之第 167號胺基酸殘基（離胺酸）至第180號胺基酸殘基（離胺 酸）為止之序列N末端加成半胱胺酸並結合作為擔體之透 貝血青素（KLH)或牛血清白蛋白（BSA)之抗原，探討所取得 單株抗體對於人類HMGB-1及人類HMGB-2之反應性結果照 片。「1」為該多株抗體（於實施例9製備之多株抗體）中 之結果。「2」為僅使過氧化酶標識抗小鼠IgG抗體（Dako 公司製）反應者。「3」為使實施例6得到之抗豬HMGB-1

2125-9414-PF 200900077 並使人類HMGB-1，2之位置明確化者。 多株抗體反應 第4圖顯示以西方點墨法探討選殖體r〇6gi〇e7所產 生之單株抗體對於人類及HMGB_2之反應性之結果 照片。為僅使過氧化酶標識抗小鼠IgG抗體（Dak〇 公司製）反應者，「2」為R06G7E10(實施例^所製備之單 株抗體）中之、、Ό果。「3」為使實施例6所得之抗豬龍工 多株抗體反應，使人類1^(^_1，2位置明確化者。 第5圖顯示間質性肺炎患者及正常自願者之血清中 HMGB-1水平。圖中之線，代表各群中之平均ημμη水平。 第6圖顯示間質性肺炎患者及正常自願者於balf中 之HMGB-1水平。圖中之線表示各群中之平均跗⑶一丨水平。 第7圖顯示對於HMGB-1之免疫組織化學分析之代表 結果照片。（a)為正常肺實質；（b)NSIp患者之肺組織； (c)IPF患者之肺組織（低倍率）；（d) IPF患者之肺組織（高 倍率）。勿格b中之箭頭，代表肺泡壁細胞中之被染色核。 分格d中之箭頭，代表上皮細胞中之被染色核。原倍率： a 、 xlOO ; b 及 d 、 χ2〇〇 ; c 、 x40 。 第8圖顯示對於HMGB-1之免疫組織化學分析代表結 果照片。（a)未處理小鼠之肺組織；博來黴素點滴注射後 (b)第1曰之小鼠；（c)第5曰之小鼠、（(〇第7曰之小鼠、 (e)第14天之小鼠、及（〇第14天之小鼠（高倍率）。分格 f中之箭頭’代表巨噬細胞之細胞質中之染色。原倍率： a-e 、xl〇〇， f 、x400。 為病理學觀 第9圖代表抗HMGB-1抗體投予之效果 2125-9414-^ 78 200900077 察及TUNEL染色代表結果之照片。博來黴素點滴注射及控 制組抗體投予起第14天之組織學觀察（a)、及TUNEL染色 之結果（b)。分格b中之箭頭，指了㈣豇陽性細胞。抗 抗體投予後，第14天之組織學觀察（c)、及TUNEL染色之 結果（d)。原倍率：a及c、x40 ; b及d、χ200。 第10圖顯示抗HMGB-1抗體對於博來黴素誘導肺纖維 症小鼠之效果。（a)從博來黴素點滴注射起第14天，經控 制組抗體或抗HMGB-1抗體處理之小鼠體重，各以白棒或 黑棒表示。資料以平均±SE表示。（b)從博來黴素點滴注射 起第14天經控制組抗體或抗HMGB-1抗體處理之小鼠病 理階段，各以白圓圈或黑圓圈表示。各圓圈對應於各小鼠 之結果。（c)從博來黴素點滴注射起第14天經以控制 組抗體或抗HMGB-1抗體處理之小鼠肺組織中之tunel陽 性細胞數’各以白棒或黑棒表示。⑷從博來黴素點滴注 射起第14天，經控制組抗體或抗HMGB-1抗體處理之小鼠 肺均質物中之膠原蛋白濃度，各以白棒或黑棒表示。灰色 之棒，代表未處理小鼠之膠原蛋白濃度。 ▲第11圖顯示抗HMGB-1抗體對於BAL細胞分析之結肩 效果。博來黴素點滴注射起第14天，經控制組抗體或$ HMGB」抗體處理之小鼠之飢細胞數，各以白棒或黑㈣ 不。灰色棒’表示未處理小鼠之結果。資料以平均土 不。 3 第12圖顯示EP對於博來黴素誘導肺纖維症小鼠之效 果（a)及（b) ’為博來黴素點滴注射起第14天，經卯或 2125-9414-PF 79 200900077 林格氏溶液處理之小鼠血清中或balf中 各以白棒哎里煃矣-, B-1水平’ BAL” 所示，未處理小鼠之幻青或 BALF中’檢測不到HMGB-1水平。（c)為補 一 起第i 4 ，"，博來黴素點滴注射 =棒表E:或林格氏溶液處理之小鼠體重，各以白 =:不。貝料以平均±SE表示。⑷為從博來黴素點 天’…林格氏溶液處理之小鼠病理階 各以白圓圈或黑圓圈表示。各圓圈對應於各小鼠之结 果。 、° 第13圖顯示BAL細胞分析之結果中之Ep效果。從博 來黴素點滴注射第14天’經Ep或林格氏溶液處理之小鼠 之BAL細胞數，各以白棒或黑棒表示。灰色棒代表未處理 小鼠之結果。資料以平均±SE表示。 第14圖顯示纖維母細胞中之抗mgb_i抗體對於 細胞凋零誘導、（b)細胞增殖、（c)膠原蛋白產生之影響。 將纖維母細胞於存在下或非存在下培養24小時。 資料以平均士標準誤差表示。統計學上顯著差異，以如 下表示：*Ρ<〇· 01，tp<0. 05。 【主要元件符號說明】 無 2125-9414-PF 80 200900077 序列表 【序列編號】

<110> KYUSHU UNIVERSITY KAGOSHIMA UNIVERSITY SHINO-TEST CORPORATION 〈120〉含有HMGB-1抗體之間質性肺炎治療劑

<130> C1-A0619P <150> JP2007-034293 <151〉 2007-02-15 〈160> 7 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211〉 14 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成之胜肽^列 <400> 1

Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys 1 5 10

2125-9414-PF 1 200900077 ^ <210〉 2 <211〉 14 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 〈223>人工合成之胜肽序列 <400> 2

Lys Ser Glu Ala Gly Lys Lys Gly Pro Gly Arg Pro Thr Gly 1 5 10 <210〉 3 <211> 15 <212> PRT <213〉人工序列 <220> \ <223〉人工合成之胜肽序列 <400> 3

Cys Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys 15 10 15 <210〉 4 <211> 215 <212> PRT

2125-9414-PF 2 200900077 <213〉豬(Sus scrofa) <400> 4

Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 15 10 15

Ala Phe Phe Val Gin Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30

Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45

Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60

Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80

Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95

Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110

Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125

Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys His Pro Tyr 130 135 140

2125-9414-PF 3 200900077

Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160

Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 165 170 175

Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu 180 185 190

Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu 195 200 205

Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu 210 215

<210> 5 <211〉 210 <212〉 PRT <213〉緒(Sus scrofa) <400〉 5

Met Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 15 10 15

Ala Phe Phe Val Gin Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30

2125-9414-PF 4 200900077

Asp Ser Ser Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45

Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Ser Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60

Lys Ser Asp Lys Ala Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro 65 70 75 80

Pro Lys Gly Asp Lys Lys 6ly Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95

Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu His Arg Pro Lys 100 105 110 I le Lys Ser Glu His Pro Gly Leu Ser I le Gly Asp Thr Ala Lys Lys 115 120 125

Leu Gly Glu Met Trp Ser Glu Gin Ser Ala Lys Asp Lys Gin Pro Tyr 130 135 140

Glu Gin Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp lie Ala 145 150 155 160

Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Gly Glu Ala Gly Lys Lys Gly Pro Gly 165 170 175

Arg Pro Thr Gly Ser Lys Lys Lys Asn Glu Pro Glu Asp Glu Glu Glu 180 185 190

2125-9414-PF 5 200900077

Glu Glu Glu Glu Giu Giu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp 195 200 205

Glu Glu 210

<210> 6 <211〉215 <212〉 PRT <213〉人種(Homo sapiens) <400> 6

Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Arg Lys Met Ser Ser Tyr 15 10 15

Ala Phe Phe Val Gin Thr Gys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30

Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45

Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60

Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80

2125-9414-PF 6 200900077

Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95

Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110

Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125

Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gin Pro Tyr 130 135 140

Glu Lys Lys Ala Glu Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160

Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 165 170 175 / \

Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Gly Glu Glu 180 185 190

Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu 195 200 205

Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu 210 215 <210〉 7

2125-9414-PF 7 200900077

〈211〉 209 <212> PRT 〈213> 人種(Homo sapiens) <400> 7

Met Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 15 10 15

Ala Phe Phe Val Gin Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro f 20 25 30

Asp Ser Ser Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45

Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Ser Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60

Lys Ser Asp Lys Ala Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro 65 70 75 80

Pro Lys Gly Asp Lys Lys Gly Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95

Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu His Arg Pro Lys 100 105 110

Ile Lys Ser Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Thr Ala Lys Lys 115 120 125

2125-9414-PF 8 200900077

Leu Gly Glu Met Trp Ser Glu Gin Ser Ala Lys Asp Lys Gin Pro Tyr 130 135 140

Glu Gin Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp lie Ala 145 150 155 160

Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Ser Glu Ala Gly Lys Lys Gly Pro Gly 165 170 175

Arg Pro Thr Gly Ser Lys Lys Lys Asn Glu Pro Glu Asp Glu Glu Glu 180 185 190

Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu 195 200 205

Glu

2125-9414-PF 9

Claims (1)

1. 200900077 十、申請專利範圍： 1. -種間質性肺炎治療劑，包含抗高移動性 質l(HMGB-l)抗體。 比蛋白 2. 如申请專利範圍第j項所述之間質性肺炎治療劑， 其中間質性肺炎為間質性肺炎。 3. 如申請專利範圍第2項所述之間質性肺炎治療 劑，其抑制由於間質性肺炎而起之體重減少。 ^… 4. 如申請專利範圍第2項所述之間質性肺炎治療 劑’其抑制由於間質性肺炎而起之纖維化。 “ 5·如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之間質性 肺炎治療劑，其中抗HMGB-1抗體與HMGB-1之結合強於與 高移動性群匣蛋白質2 (HMGB-2)之結合。 6.如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之間質性 肺炎治療劑，其中抗HMGB-1抗體不結合於HMGB-2。 7，如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之間質性 肺炎治療劑’其中抗HMGB-1抗體認識具序列編號：1之胺 基酸序列的部分胜狀。 2125-9414-PF 1