CZ20033402A3 - Použití fragmentů HMG jako protizánětlivých činidel - Google Patents

Použití fragmentů HMG jako protizánětlivých činidel Download PDF

Info

Publication number
CZ20033402A3
CZ20033402A3 CZ20033402A CZ20033402A CZ20033402A3 CZ 20033402 A3 CZ20033402 A3 CZ 20033402A3 CZ 20033402 A CZ20033402 A CZ 20033402A CZ 20033402 A CZ20033402 A CZ 20033402A CZ 20033402 A3 CZ20033402 A3 CZ 20033402A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
hmg
box
cell
release
vertebrate
Prior art date
Application number
CZ20033402A
Other languages
English (en)
Inventor
Traceyákevináj
Yangáhuan
Warrenáhowlandáshawájr
Finkámitchelláp
Original Assignee
Northáshore@Longáislandájewisháresearcháinstitute
Theágeneraláhospitalácorporation
Universityáofápittsburghá@Ofátheácommonwealthásyst
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northáshore@Longáislandájewisháresearcháinstitute, Theágeneraláhospitalácorporation, Universityáofápittsburghá@Ofátheácommonwealthásyst filed Critical Northáshore@Longáislandájewisháresearcháinstitute
Publication of CZ20033402A3 publication Critical patent/CZ20033402A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/02—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for disorders of the vagina
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)

Description

zasahujících gastrointestinální trakt a přilehlé tkáně (jako jsou apendícitída, peptické, žaludeční a dvanácterníkové vředy, perítonítida, pankreatítída, ulceratívní, pseudomembránové, akutní a ischemické kolítidy, divertíkulitída, epiglotítida, achalasie, cholangitida, coeliacká choroba, hepatidída, Crohnova choroba,enteritida a whipplova choroba); systémové nebo lokální zánětlivé nemoci nebo stavy (jako je astma, alergie, anafylaktický šok, choroby imunitního komplexu, orgánová ischemie, reperfusní poranění, orgánová nekrosa, senná rýma, sepse, septicemie, endotoxický šok, kachexie, hyperpyrexie, eosinofilní granulom, granulomatosa a sarkoidosa); choroby zasahující urogenitální systém a přilehlé tkáně (jako je septický abortus, epididymitida, vaginitida, prostatitida a zánět močovodu); choroby zasahující dýchací systém a přilehlé tkáně (jako je bronchitida, rozedma, rhinitida, cystická fibrosa, pneumotida, syndrom zástavy dýchání dospělých, ultramikroskopická pneumosilikovolkanokoniosa, alvealitida, bronchiolitida, faryngitida, pleurisie a sinusitida); onemocnění vznikající z infekce různými viry (jako jsou virus chřipky, respiratorní syncytiální virus, HIV, virus hepatitidy B, virus hepatitidy C a herpes), bakteriemi (jako je rozšířená bakteremie, horečka Dengue) houbami ( jako je kandidiatida) a protozoálními a mnohobuněčnými parasity (jako je malárie, filariasie, amebiasie, a hydatická cysta), dermatologických onemocnění a poruch kůže (jako jsou popáleniny, dermatitida, dermatomyositida, spálení sluncem, kopřivka a bradavice); choroby zasahující kardiovaskulární systém a přilehlé tkáně (jako jsou vasulitida, angitida, endokartditida, arteritida, atherosklerosa, tromboflembitida, perikarditida, městnavé selhání srdce, myokaditida, ischemie myokardu, periarteritis nodosa a revmatická horečka); choroby zasahující centrální nebo periferní nervový systém a přilehlé tkáně (jako je Alzheimerova nemoc, meningitida, encefalitida, roztroušená sklerosa, mozkový infarkt, mozková embolie, syndrom GuillamaBarrea, neuritida, neuralgie, poranění míchy, obrna a uveitida); choroby kostí, kloubů, svalů a vazivové tkáně (jakou jsou různé arthritidy a arthralgie, osteomyelitida, záněty svalů, Pagetova nemoc, dna, periodontální onemocnění, reumatoidní arthritida a synovi tida); jiné autoimunní a zánětlivé poruchy (jako jsou myasthenia gravis, thyroitida, systémový lupus erythematosus, Goodpastureův syndrom, Behcetsův syndrom, odmítnutí alloštěpu, onemocnění transplantát-versus-hostitel, diabetes typu I, spondylitida, Bergerova choroba, a Retierův syndrom); jakož i různé rakoviny, nádory a proliferativní poruchy (jako je Hodgkinova choroba) a jakékoli případy hostitelské imunitní odezvy na jakoukoli primární nemoc.
Ranné zánět podporující cytokiny (například TNF, IL-1, atd.) zprostředkovávají zánět a vyvolávají pozdní uvolňování skupiny 1 o vysoké mobilitě (HMGl) (známé rovněž jako HMG-1 a HMGBl), bílkoviny, jež se akumuluje v séru a zprostředkovává oddálenou létal i tu a další indukci ranných zánět podporujících cytokinů.
HMGl byly poprvé identifikovány jako základní člen rodiny DNA-vážících proteinů nazývaných skupinou o vysoké mobilitě (HMG), na němž kriticky závisí struktura stabilita DNA. Identifikován byl téměř před 40 roky jako všudypřítomně exprimovaný jaderný protein, jenž se váže na dvouvláknovou DNA bez sekvenční spécifi ty.
Vazba HMGl ohýbá DNA, což podporuje tvorbu a stabiltu nukleoproteinových komplexů, jež umožňují genovou transkripci glukokortikoidových receptorů a RAG rekombinasy. Molekula HMGl má tři domény: Dva DNA vážící motivy nazývané HMG A a HMG B boxy, a kyselý karboxylový konec. Dvěma HMG boxy jsou doména tvaru L o konservovaných 80 aminokyselinách. HMG boxy jsou exprimovány rovněž v jiných transkripčních faktorech včetně transkripčního faktoru RNA polymerasy I, lidského faktoru vážícího se shora proti proudu a lymfoidně specifického faktoru.
Nedávné důkazy implikovaly HMGl jako cytokinový mediátor oddálené létal i ty v endotoxemii. Tato práce dokázal, že bakteriální endotoxin (lipopolysacharid, LPS) aktivuje monocyty/makrofágy k uvolňování HMGl jako pozdní odezvu k aktivaci, což vede ke zvýšeným sérovým hladinám HMGl, jež jsou toxické. Protilátky proti HMGl poskytují prevenci proti «
• · · létal i tě endotoxinu dokonce i když je podávání protilátky oddáleno až do doby po časné cytokinové odezvě. Podobně jako jiné cytokiny podporující zánět je HMGl mocným aktivátorem monocytů. intratracheální podání HMGl způsobuje akutní poškození plic a protilátky proti HMGl chrání proti endotoxinem indukovanému plicnímu edému. U kriticky nemocných pacientů se sepsí nebo hemorrhagickým šokem jsou sérové hladiny HMGl zvýšené a hladiny jsou významně vyšší u nepřežívajících ve srovnání s přežívajícími.
HMGl byl implikován rovněž jako ligand RAGE, multiligandového receptorů z imunoglobulinové super-rodiny. RAGE je exprimován na endothelových buňkách, buňkách hladkého svalu, monocytech a nervech, a interakce ligandu transdukuje signály přes MAP kinasu, P21 ras a NF-kB. Oddálená kinetika výskytu HMGl při endotoxikemii jej činí dobrým terapeutickým cílem, ale málo se ví o molekulárních základech signalizace HMGl a toxicity.
Proto by mohlo být užitečné identifikovat charakteristiky aktivity HMGl podporující zánět, obzvláště aktivní doménu(y) odpovědné za tuto aktivitu a inhibiční účinky jiných domén.
Podstata vynálezu
Tento vynález je založen na objevech, že 1) A box HMG slouží jako kompetitivní inhibitor působení HMG v podpoře zánětu; a 2) B box HMG má převážnou aktivitu HMG podporující zánět.
v souladu s tím je vynález zaměřen na polypeptid obsahující A box obrátí ovčího HMG nebo jeho biologicky aktivní fragment nebo A box přirozeně se nevyskytujícího HMG nebo jeho biologicky aktivní fragment. A box HMBG nebo tato provedení mohou inhibovat uvolňování cytokinu podporujícího zánět z obratlovčích buněk, na něž je působeno HMG. A box HMG je s výhodou savčí A box HMG, výhodněji A box savčího HMGl a nejvýhodněji A box HMGl sestávající z nebo obsahující SEKV. ID. Č. 4 nebo SEKV. ID. č. 22. ve výhodných provedeních je obratlovčí buňkou savčí makrofág. vynález zahrnuje rovněž vektory kódující tyto pólypeptidy.
v jiných provedeních se vynález zaměřuje na prostředek obsahující polypeptid A boxu HMG nebo jeho biologicky aktivní fragment popsaný shora ve farmaceuticky přijatelném excipientu. V těchto provedeních může prostředek inhibovat stav charakterizovaný aktivací kaskády zánětlivých cytokinů. Prostředek může dále obsahovat antagonistu časného mediátoru sepse. Antagonista časného mediátoru sepse je s výhodou antagonista cytokinů vybraného ze skupiny sestávající z TNF, IL-Ia, IL-Ιβ, MIF a IL-6, výhodněji je protilátkou k TNF nebo MIF, nebo antagonistou IL-1 receptorů.
V těchto provedeních je stav s výhodou vybrán ze skupiny, v níž jsou obsaženy apendicitida, peptické, žaludeční a dvanácterníkové vředy, peritonitida, pankreatitida, ulcerativní, pseudomembránové, akutní a ischemické kol i tidy, divertikuli tida, epigloti tida, achalasie, cholangitida, hepatidida, Crohnova choroba, enteritida a Whipplova choroba, astma, alergie, anafylaktický šok, orgánová ischemie, reperfusní poranění, orgánová nekrosa, senná rýma, sepse, septicemie, endotoxický šok, kachexie, hyperpyrexie, eosinofilní granulom, granulomatosa, sarkoidosa, septický abortus, epididymitida, vaginitida, prostátítida, zánět rhinitida, cystická fibrosa, pneumosi1 i kovolkanokoniosa, faryngitida, pleurisie, spálení” angitida, močovodu, bronchitida, rozedma, pneumotida, ultrami kroskopi cká alveali ti da, bronchi oli ti da, sinusitida, infekce respiratorním syncytiálním virem, infekce
HIV, infekce virem hepatitidy B, infekce virem hepatitidy c, infekce herpetickým virem, rozšířená bakteremie, horečka Dengue, kandidiatida malárie, filariasie, amebiasie, hydatická cysta, popáleniny, dermatitida, dermatomyositida, sluncem, kopřivka, bradavice, vasulitida, endokartditida, arteritida, atherosklerosa, tromboflembitida, perikarditida, myokaditida, ischemie myokardu, periarteritis nodosa, revmatická horečka, Alzheimerova nemoc, coeliacká choroba, městnavé selhání srdce, syndrom zástavy dýchání dospělých, meningitida, encefalitida, roztroušená sklerosa, mozkový infarkt, mozková embolie, syndrom Guillama-Barrea, • · • · • · • · • · · · • · · nemoc, dna, synovitida, neuritida, neuralgie, poranění míchy, obrna, uveitida, arthritidy, arthralgie, osteomyelitida, záněty svalů, Pagetova periodontální onemocnění, reumatoidní arthritida a myasthenia gravis, thyroitida, systémový lupus erythematosus, Goodpastureův syndrom, Behcetsův syndrom, odmítnutí alloštěpu, onemocnění transplantát-versus-hostitel, diabetes typu I, spondylitida, Bergerova choroba, Retierův syndrom a Hodgkinova choroba. Výhodněji je stav vybrán ze skupiny v níž jsou obsaženy apendicitida, peptické, žaludeční a dvanácterníkové vředy, peřítonitida, pankreatitida, akutní a ischemické kol i tidy, astma, alergie, anafylaktický ischemie, reperfusní poranění, orgánová rýma, sepse, septicemie, endotoxický šok, ulcerativní, pseudomembránové, hepatitida, Crohnova choroba, šok, orgánová nekrosa, senná obsahovat alloštěpu, kachexie, septický abortus, rozšířená bakteremie, popáleniny, Alzheimerova nemoc, coeliacká choroba, městnavé selhání srdce, syndrom zástavy dýchání dospělých, meningitida, encefalitida, roztroušená sklerosa, mozkový infarkt, mozková embolie, poranění míchy, obrna, odmítnutí alloštěpu a onemocnění transplantát-versus-hostitel; nejvýhodněji je stavem endotoxický šok a odmítnutí alloštěpu. Když je stavem odmítnutí alloštěpu, prostředek může dále imunosupresant používaný k inhibici odmítnutí s výhodou cyklosporin.
V dalších provedeních je vynález zaměřen na vyčištěný preparát protilátek, jež se specificky vážou na B box obratlovčího proteinu o vysoké mobilitě (HMG), jež se ale specificky nevážou na epitopy mimo B box HMG. U těchtoprovedení mohou protilátky inhibovat biologickou aktivitu B boxu HMG polypetidu, například uvolňování cytokinů podporujích zánět z obratlovčích buněk na něž je působeno HMG. U výhodných provedení je B box HMG savčí B box HMG, například lidský B box HMG, výhodněji B box HMGl, nej výhodněj i B box HMGl s aminokyselinovou sekvencí sekv. id. č. 5 nebo SEKV. ID. Č. 20. V jiném provedení se protilátky vážou k specifické polypeptidové sekvenci B boxu HMGl, obsahující aminokyseliny 1-20 SEKV. ID. Č. 20 (SEKV. ID. Č. 16) nebo obsahující aminokyseliny 1-20 SEKV. ID. Č. 5 (SEKV. ID. Č. 23).
Obratlovčí buňkou je s výhodou rovněž savčí makrofág. V některých provedeních jsou protilátky s výhodou humanizovány.
v dalších provedeních je vynález zaměřen na prostředek obsahující jakýkoli preparát protilátky popsaný shora ve farmaceuticky přijatelném excipientu. U těchto provedení může prostředek inhibovat stav charakterizovaný aktivací kaskády zánětlivých cytokinů. Tyto prostředky mohou rovněž užitečně obsahovat antagonistu časného mediátoru sepse, jak bylo popsáno dříve, výhodnými stavy užitečnými pro léčbu těmito prostředky jsou stavy zprostředkované nebo charakterizované kaskádou zánětlivých cytokinů, například stavy z výčtu pro prostředky A boxu popsané dříve.
Navíc je vynález zaměřen na polypeptid obsahující B box obrátí ovčího HMG nebo jeho biologicky aktivní fragment nebo B box přirozeně se nevyskytujícího HMG nebo jeho biologicky aktivní fragment, ale neobsahující HMG protein plné délky. U těchto provedení může polypeptid způsobovat uvolňování cytokinů podporujícího zánět z obratlovčích buněk. Polypeptidem těchto provedení je s výhodou B box HMG, výhodněji B box HMGl a nej výhodněji B box HMGl s aminokyselinovou sekvencí udávanou jako SEKV. ID. Č. 5 nebo SEKV. ID. Č. 20. v jiných provedeních obsahuje B box HMG sekvenci SEKV. ID. Č. 16 nebo SEKV. ID. Č. 23 nebo sestává ze sekvence SEKV. ID. č. 16 nebo SEKV. ID. č. 23. Ve výhodných provedeních je obrátí ovčí buňkou savčí makrofág. Vynález zahrnuje rovněž vektory kódující tyto polypeptidy.
vynález je rovněž zaměřen na způsob inhibice uvolňování cytokinů podporujícího zánět ze savčí buňky. Způsob zahrnuje působení na buňku buď shora popsaným prostředkem polypeptidu A boxu nebo biologicky aktivního fragmentu A boxu nebo shora popsaným prostředkem protilátky k B boxu nebo k biologicky aktivnímu fragmentu B boxu, v množství postačujícím k inhibici uvolňování cytokinů podporujícího zánět z buňky. V těchto provedeních je buňkou s výhodou makrofág. Navíc, cytokin podporující zánět je s výhodou vybrán ze skupiny sestávající z TNF, IL-Ia, IL-Ιβ, MIF a IL-6. výhodněji je buňkou makrofág a cytokin podporující zánět je s výhodou vybrán ze skupiny « · sestávající z TNF, IL-Itx, IL-Ιβ, MIF a IL-6. způsob s výhodou působí na buňku na pacienta trpícího nebo ohroženého stavem charakterizovaným aktivací kaskády zánětlivých cytokinů. Výhodné stavy byly uvedeny již v dřívějším výčtu.
v příbuzných provedeních je vynález zaměřen na způsob léčby pacienta ve stavu charakterizovaném aktivací kaskády zánětlivých cytokinů. Způsob zahrnuje podáváni kteréhokoli z prostředků polypeptidu A boxu nebo biologicky aktivního fragmentu A boxu nebo shora popsaných prostředků protilátky k B boxu nebo k biologicky aktivnímu fragmentu B boxu pacientovi v množství postačujícím k inhibici kaskády zánětlivých cytokinů. výhodné stavy byly uvedeny již v dřívějším výčtu.
Další provedení jsou zaměřena na způsob stimulace uvolňování cytokinů podporujícího zánět z buňky, způsob zahrnuje působení na buňku buď shora popsaným prostředkem polypeptidu B boxu nebo biologicky aktivního fragmentu B boxu nebo vektorem B boxu nebo biologicky aktivního fragmentu B boxu v množství postačujícím k inhibici uvolňování cytokinů podporujícího zánět z buňky, v příbuzných provedeních je vynález zaměřen na ovlivnění snižování tělesné hmotnosti pacienta nebo léčbu obesity pacienta, způsob zahrnuje podávání účinného množství polypeptidu B boxu HMG nebo jeho biologicky aktivního fragmentu pacientovi. V jednom provedení je polypeptid B boxu HMG nebo jeho biologicky aktivní fragment ve farmaceuticky přijatelném excipientu.
Vynález je zaměřen rovněž na způsob stanovení zda sloučenina inhibuje zánět. způsob zahrnuje kombinaci sloučeniny s a) buňkou, jež uvolňuje cytokin podporující zánět při vystavení B boxu obratlovčího HMG nebo jeho biologicky aktivního fragmentu, a b) B boxem obratlovčího HMG nebo jeho biologicky aktivního fragmentu, s následným stanovením, zda sloučenina inhibuje uvolňování cytokinů podporujícího zánět z buňky. S výhodou je B box HMG B box savčího HMG, například B box HMGl. Výhodné cytokiny podporující zánět jsou jak byly již dříve popsány.
• · • · ► · · » · ♦ · · • · ·
Stručný popis obrázků
OBR. 1 je schématická representace mutant HMGl a jejich aktivity v uvolňování TNF (pg/ml).
OBR. 2a je histogram ukazující účinek 0 pg/ml, 0,01 pg/ml, 0,1 pg/ml, 1 pg/ml a 10 pg/ml B boxu na uvolňování TNF (pg/ml) v buňkách RAW 264.7.
OBR. 2b je histogram ukazující účinek 0 pg/ml, 0,01 pg/ml, 0,1 pg/ml, 1 pg/ml a 10 pg/ml B boxu na uvolňování IL-Ιβ (pg/ml) v buňkách RAW 264.7.
OBR. 2c je histogram ukazující účinek 0 pg/ml, 0,01 pg/ml, 0,1 pg/ml, 1 pg/ml a 10 pg/ml B boxu na uvolňování IL-6 (pg/ml) v buňkách RAW 264.7.
OBR. 2d. Skenovaný obraz přeneseného testu ochrany před RNasou ukazující účinek B boxu (po 0 hodin, 4 hodinách, 8 hodinách a 24 hodinách) nebo samotného vektoru (ve 4 hodinách po podání) na expresi TNF mRNA v buňkách RAW 264.7.
OBR. 2E je histogram účinku B boxu HMGl na uvolňování TNF proteinu (pg/ml) z buněk RAW 264.7 v 0 hodin, 4 hodinách, 8 hodinách, 24 hodinách 32 hodinách nebo 48 hodinách po podání.
OBR. 2E je histogram účinku vektoru na uvolňování TNF proteinu (pg/ml) z buněk RAW 264.7 v 0 hodin, 4 hodinách, 8 hodinách, 24 hodinách 32 hodinách nebo 48 hodinách po podání.
OBR. 3 je schématická representace mutant B boxu HMGl a jejich aktivity v uvolňování TNF (pg/ml).
OBR. 4a je graf účinku 0 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml nebo 25 pg/ml bílkoviny A boxu HMGl na uvolňování TNF (jako procento uvolňování TNF zprostředkovaného samotným HMGl) v buňkách RAW 264.7.
OBR. 4B je histogram účinku HMGl (0 nebo 1,5 pg/ml), A boxu HMGl (0 nebo 10 pg/ml) nebo vektoru (0 nebo 10 pg/ml) samotných nebo v kombinaci na uvolňování TNF (jako procento uvolňování TNF zprostředkovaného samotným HMGl) v buňkách RAW 264.7.
OBR. 5 je graf vazby 125l-HNGBl na buňky RAW 264.7 (CPM/jamku) v čase (minuty).
- 10 OBR. 5A je graf vazby 125l-HNGBl na buňky RAW 264.7 (CPM/jamku) v čase (minuty).
OBR. 5B je histogram vazby 125l-HNGBl v nepřítomnosti neznačeného HMGlB nebo A boxu HMGlmpo 2 hodinách při 4°C (celková) nebo za přítomnosti 5 000 násobného molárního přebytku neznačeného HMGlBl (HMGlBl) nebo A boxu (A box), měřeno jako procento celkových CPM/jamku.
OBR. 6 je histogram účinku HMG-1 (0 nebo 1 pg/ml) nebo B boxu HMGl (0 nebo 10 pg/ml) samotných nebo v kombinaci s protilátkou k B boxu na (25 pg/ml nebo 100 pg/ml) nebo igG (25 pg/ml nebo 100 pg/ml) na uvolňování TNF z buněk RAW 264.7 (vyjádřeno jako procento uvolňování TNF zprostředkovaného samotným HMGl).
OBR. 7A je skenovaný obraz hematoxylinem a eosinem
barvených řezů ledviny získané z myši bez jakého působení.
OBR. 7B je skenovaný obraz hematoxylinem a eosi nem
barvených řezů ledviny získané z myši s podaným B boxem HMGl.
OBR. 7c je skenovaný obraz hematoxyli nem a eosinem
barvených řezů myokardu získaného z myši bez jakého působení.
OBR. 7D je skenovaný obraz hematoxylinem a eosi nem
barvených řezů myokardu získaného z myši s podaným B boxem
HMGl.
OBR. 7E je skenovaný obraz hematoxyli nem a eosi nem
barvených řezů plic získaných z myši bez jakého působení.
OBR. 7F je skenovaný obraz hematoxylinem a eosinem
barvených řezů plic získaných z myši s podaným B boxem l HMGl.
OBR. 7G je skenovaný obraz hematoxyli nem a eosi nem
barvených řezů jater získaných z myši bez jakého působení.
OBR. 7H je skenovaný obraz hematoxylinem a eosinem
barvených řezů jater získaných z myši s podaným B boxem HMGl.
OBR. 71 je skenovaný obraz hematoxyli nem a eosi nem
barvených řezů jater (velké zvětšení) získaných z myši bez
jakého působení -
OBR. 73 je skenovaný obraz hematoxylinem a eosi nem
barvených řezů jater (velké zvětšení) získaných z myši s podaným B boxem HMGl.
OBR. 8 je graf hladiny hmgbI (ng/ml) v čase (hodiny) u myši podrobené podvázání a punkci (CLP).
OBR. 9 je graf účinku A boxu (60 pg/myš nebo 600 pg/myš) nebo žádného působení na přežití myší v čase (dny) po podvázání a punkci (CLP).
OBR. 10A je graf účinku protilátky proti HMGl (tmavé kroužky) nebo žádného působení (světlé kroužky) na přežití myší v čase (dny) po podvázání a punkci (CLP).
OBR. 10B je graf účinku antiséra proti B boxu HMGl () nebo žádného působení (*) na přežití myší v čase (dny) u myší s podaným lipopolysacharidem (LPS).
OBR. 11A je histogram účinku protilátky proti RAGE nebo neimunních IgG na uvolňování TNF z buněk raw 264.7 na něž se působilo HMGl (HMGl), lipopolysacharidem (LPS) nebo B boxem HMGl (B box).
OBR. 11B je histogram účinku stimulace HMGl nebo polypeptidem B boxu HMGl na aktivaci NFkB-závislého ELÁM promotoru (měřené luciferasovou aktivitou) u buněk RAW 264.7 kotransfekovaných murinním MyD 88- dominantním negativním (+MyD 88 DN) mutantem (odpovídajícím aminokyselinám 146 - 296) nebo prázdným vektorem (-MyD 88 DN). Data jsou vyjádřena jako poměr (násobek aktivace) průměrných 1uciterasových hodnot z nestimulovaných a stimulovaných buněk (s odečtením pozadí) + SD.
OBR. 11C je histogram účinku stimulace CHO reportérových buněčných linií, jež konstitutivně exprimují lidský TLR (prázdné sloupce) nebo TLR4 (plné sloupce), s IL-1, HMGl nebo B boxem HMGl na expresi CD25. Data jsou vyjádřena jako poměr (násobek aktivace) procenta CD25+ buněk v nestimulované a stimulované populaci, jež vždy byla omezena k vyloučení nejnižších 5 % buněk podle střední FLl fluorescence.
OBR. llD je histogram účinku podání protilátky proti RAGE, protilátky proti tlr2, společně protilátky proti RAGE a protilátky proti TLR2, nebo IgG na uvolňování TNF zprostředkované HMGl (měřeno jako procento uvolňování TNF bez přítomnosti protilátky) u buněk RAW 264.7.
OBR. 12A je aminokyselinová sekvence polypeptidu lidského HMGl (SEKV. ID. Č. 1).
OBR. 12B je aminokyselinová sekvence potkaního a myšího HMGl (SEKV. ID. Č. 2).
- 12 12C je aminokyselinová sekvence lidského HMG2 (SEKV.
12D je aminokyselinová sekvence polypeptidu lidského, potkaního a myšího A boxu HMGl (SEKV. ID. č. 4).
obr. 12e je aminokyselinová sekvence polypeptidu lidského, potkaního a myšího B boxu HMGl (SEKV. ID.
OBR. 12f je sekvence nukleové kyseliny přímého pro lidský HMGl (SEKV. ID. Č. 6)
OBR. 12G je sekvence nukleové kyseliny zpětného pro lidský HMGl (sekv. id. č. 7)
OBR. 12H je sekvence nukleové kyseliny přímého pro karboxylový konec lidského HMGl (SEKV. ID,
OBR. 121 je sekvence nukleové kyseliny zpětného pro karboxylový konec lidského HMGl (sekv. id.
OBR. 121 je sekvence nukleové kyseliny přímého pro amino-konec lidského HMGl (SEKV. ID. Č.
OBR. 12K je sekvence nukleové kyseliny zpětného pro amino-konec lidského HMGl (SEKV. ID. Č.
OBR. 12L je sekvence nukleové kyseliny přímého pro B box mutantního lidského HMGl (SEKV. ID. Č. 12).
OBR. 12M je sekvence nukleové kyseliny zpětného pro B box mutantního lidského HMGl (SEKV. ID,
OBR. 12N je sekvence nukleové kyseliny přímého pro amino-konec A boxu mutantního lidského HMGl (SEKV.
Č. 14).
OBR. 120 je sekvence nukleové pro amino-konec A boxu mutantního Č. 15).
OBR. 13 je sekvence z potkana člověka (SEKV. ID,
ID.
OBR.
Č. 3)
OBR.
kysel i ny 1idského
'. ID. Č. přímého 5). primeru
zpětného primeru
přímého č. 8). primeru
zpětného Č. 9) . primeru
přímého ). primeru
zpětného ). primeru
přímého Č. 12). primeru
zpětného Č. 13). primeru
přímého primeru
ID.
zpětného primeru HMGl (SEKV. ID.
přirovnání sekvencí HMGl polypeptidové (sekv. id. č. 2), myši (sekv. id. č. 2) a Č. 18).
Podrobný popis vynálezu
Praxe tohoto vynálezu bude používat, pokud není vyznačeno jinak, konvenční techniky buněčných kultur, molekulární biologie, mikrobiologie, buněčné biologie a imunologie, jež • · • · ·
- 13 jsou v rámci zběhlosti v oboru. Takovéto techniky jsou plně vysvětleny v literatuře, viz např. Sambrook et al., 1989,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al. (1995), Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons; Methods in Enzymology (několik svazků); Methods in cell Biology (několik svazků); a Methods in Molecular Biology (několik svazků).
vynález je založen na sérii objevů, jež dále objasňují různé charakteristiky schopnosti HMGl indukovat produkci cytokinů podporujících zánět a kaskády zánětlivých cytokinů. Konkrétně bylo objeveno, že zánět podporující aktivní doména HMGl je B box (a konkrétněji prvních 20 aminokyselin B boxu) a že protilátky proti B boxu budou inhibovat uvolňování cytokinů podporujících zánět a kaskády zánětlivých cytokinů, s důsledkem, jenž může zmírňovat škol dl ivé symptomy způsobované kaskádami zánětlivých cytokinů. Rovněž bylo objeveno, že A box je slabým agonistou uvolňování cytokinů podporujících zánět a že kompetitivně inhibuje zánět podporující aktivitu B boxu HMGl.
Jak se zde používá, HMG polypeptid či hmg protein je v podstatě čistý nebo v podstatě čistý a isolovaný polypeptid, jenž byl separován od složek, jež jej přirozeně provázejí, nebo rekombinantně produkovaný polypeptid mající stejnou aminokyselinovou sekvenci, a jenž zvyšuje zánět nebo zvyšuje uvolňování cytokinů podporujících zánět z buňky nebo zvyšuje aktivitu kaskády zánětlivých cytokinů. v jednom provedení má HMG polypeptid jednu ze shora uvedených biologických aktivit. V jiném provedení má HMG polypeptid dvě ze shora uvedených biologických aktivit. Ve třetím provedení má HMG polypeptid tři ze shora uvedených biologických aktivit.
HMG polypeptidem je s výhodou savčí HMG polypeptid, například lidský HMGl polypeptid. S výhodou má HMG polypeptid alespoň 60 %, výhodněji alespoň 70 %, 75 %, 80 %, 85 % nebo 90 %, a nejvýhodněj alespoň 95 % sekvenční identity k sekvenci vybrané z sekv. id. č. 1, sekv. id. č. 2, sekv. id. č. 3 nebo SEKV. ID. č. 18, jak se stanoví s použitím programu BLAST a parametrů v něm popsaných. Příklady hmg polypeptidu zahrnují polypeptid obsahující nebo sestávající ze SEKV. ID. Č. 1, • · · • · • ·
- 14 SEKV. id. č. 2, SEKV. ID. č. 3 nebo sekv. ID. č. 18. S výhodou HMG polypeptid obsahuje DNA vazebnou domény B boxu nebo DNA vazebnou domény A boxu nebo kyselý karboxylový konec zde popsaný, Jiné příklady HMG polypeptidů jsou popsány v GenBank přístupových čísel AAA64970, AAB08987, PO7155, AAA20508,
S29857, P09429, NP_002119, CAA3110, jejichž veškeré poznatky jsou zde zahrnuty odkazem. Další příklady HMG polypeptidů zahrnují, ale bez omezení, savčí HMGl, HMG2, HMG-2A, HMG14, HMG17, HMG I a HMG Y, ne-savčí HMG Tl a HMG T2 (duhový pstruh), HMG-X (xenopus), HMG D/Z (Drosophila), kvasinkové polypeptidy NHPlO protein (homolog HMG proteinu NHP 1) a nehistonový chromosomální protein; protein podobný HMG 1/2 (pšenice, kukuřice, sója); proti proudu vážící se faktor (UBF-1), protein rozeznávající jednovláknové úseky (SSRP) nebo strukturně specifický rekogniční protein, HMG homolog TDP-1, savčí protein oblasti Y určující pohlaví (SRY, faktor určující testes); proteiny hub mat-1, ste 11 a Mc 1; SOX 14 (jakož i SOX 1-3, 6, 8, 10, 12 a 21; lymfoidní specifický faktor (LEF-1); specifický transkripční faktor T-buněk (TVF-1) a jaderný autoantigen SP100-HMG.
lak se zde používá, HMG A box, na nějž se zde odkazuje rovněž jako na A box je v podstatě čistý nebo v podstatě čistý a isolovaný polypeptid, jenž byl separován od složek, jež jej přirozeně provázejí, jenž sestává z aminokyselinové sekvence kratší než HMG polypeptid plné délky, a jenž má jednu nebo více z následujících biologických aktivit: inhibuje zánět nebo inhibuje uvolňování cytokinů podporujících zánět z buňky nebo snižuje aktivitu kaskády zánětlivých cytokinů. V jednom provedení má polypeptid HMG A boxu jednu ze shora uvedených biologických aktivit. V jiném provedení má polypeptid HMG A boxu dvě ze shora uvedených biologických aktivit. Ve třetím provedení má polypeptid HMG A boxu tři ze shora uvedených biologických aktivit. S výhodou HMG A box nemá víc než 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % nebo 90 % biologické aktivity HMG plné délky. V jednom provedení sestává HMG A box ze sekvence SEKV. ID. Č. 4 nebo SEKV. ID. č. 22 nebo z aminokyselinové sekvence v odpovídající oblasti HMG proteinu savce. HMG A box je rovněž rekombinantně produkovaný • · • · ·
- 15 - ......
polypeptid mající stejnou aminokyselinovou sekvenci jako sekvence A boxu popsané shora. S výhodou je HMG A box savčí HMG A box, například A box lidského HMGl. Polypeptid HMG A boxu podle vynálezu s výhodou obsahuje nebo sestává ze sekvence SEKV. ID. Č. 4 nebo SEKV. ID. č. 22 nebo z aminokyselinové sekvence v odpovídající oblasti HMG proteinu savce. HMG A box má často ne víc než asi 85 aminokyselin a ne méně než asi 4 aminokyseliny, příklady polypeptidů, jež mají v sobě sekvence A boxu zahrnují, ale bez omezení, HMGl, HMG2, HMG4; strukturně specifický rekogniční protein (SSRP); PMSl proteinový homolog 1; proteiny SOX-1, SOX-2 a SOX-14; a MTTl. Sekvence A boxů v takovýchto polypeptidech mohou být stanoveny a isolovány metodami zde popsanými například porovnáním sekvencí k A boxům zde popsaným a testováním na biologickou aktivitu.
Prvkem vynálezu jsou rovněž HMG A boxy přirozeně se nevyskytující. S výhodou má přirozeně se nevyskytující HMG A box alespoň 60 %, výhodněji alespoň 70 %, 75 %, 80 %, 85 % nebo 90 %, a nejvýhodněj alespoň 95 % sekvenční identity k sekvenci SEKV. ID. Č. 4 nebo SEKV. ID. Č. 22, jak se stanoví s použitím programu BLAST a parametrů v něm popsaných, a jednu nebo více aktivit HMG A boxu.
Prvkem vynálezu jsou rovněž biologicky aktivní fragmenty A boxu. Výrazem fragment A boxu, jenž má biologickou aktivitu nebo biologicky aktivní fragment A boxu se míní fragment HMG A boxu, jenž má aktivitu HMG A boxu zde popisovanou. Například: Fragment A boxu může snižovat uvolňování cytokinů podporujících zánět z obratlovčí buňky, zmenšovat zánět nebo snižovat aktivitu kaskády zánětlivých cytokinů. Fragmenty A boxu mohou být generovány s použitím standardních technik molekulární biologie a testováním funkce fragmentu stanovením, zda fragment podaný buňce inhibuje uvolňování cytokinů podporujících zánět z buňky, například s použitím metod zde popsaných. Biologicky aktivní fragmenty A boxu mohou být používány ve způsobech zde popsaných, v nichž se používají polypeptidy A boxu plné délky, například k inhibici uvolňování cytokinů podporujících zánět z buňky
- 16 nebo k léčbě pacienta majícího stav charakterizovaný aktivací kaskády zánětlivých cytokinů.
lak se zde používá, HMG B box, na nějž se zde odkazuje rovněž jako na B box je v podstatě čistý nebo v podstatě čistý a isolovaný polypeptid, jenž byl separován od složek, jež jej přirozeně provázejí, jenž sestává z aminokyselinové sekvence kratší než hmg polypeptid plné délky, a jenž má jednu nebo více z následujících biologických aktivit: zvyšuje zánět nebo zvyšuje uvolňování cytokinů podporujících zánět z buňky nebo zvyšuje aktivitu kaskády zánětlivých cytokinů. v jednom provedení má polypeptid HMG B boxu jednu ze shora uvedených biologických aktivit, v jiném provedení má polypeptid HMG B boxu dvě ze shora uvedených biologických aktivit. Ve třetím provedení má polypeptid HMG B boxu tři ze shora uvedených biologických aktivit. S výhodou má HMG B box přinejmenším 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % nebo 90 % biologické aktivity HMG plné délky. V jiném provedení HMG B box neobsahuje HMG A box. v jiném provedení je hmg b box polypeptid, jenž je v délce asi 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 % nebo 20 % délky HMGl polypeptidu plné délky. V jiném provedení HMG box sestává z nebo obsahuje sekvenci sekv. id. č. 5 nebo sekv. id. č. 20 nebo aminokyselinovou sekvenci v odpovídající oblasti HMG proteinu savce, ale pořád méně než HMG polypeptid plné délky. Polypeptid HMG B boxu je rovněž rekombinantně produkovaný polypeptid mající stejnou aminokyselinovou sekvenci jako sekvence B boxu popsané shora. S výhodou je HMG B box savčí HMG B box, například B box lidského HMGl. hmg b box má často ne víc než asi 85 aminokyselin a ne méně než asi 4 aminokyseliny. Příklady polypeptidů, jež mají v sobě sekvence Β boxu zahrnují, ale bez omezení, protein rozeznávající jednovláknové úseky (SSRP) a strukturně specifický rekogniční protein; HMG homolog TDP-1; protein oblasti Y určující pohlaví (faktor určující testes); SOX 14 (jakož i SOX 1-3, 6, 8, 10, 12 a 21); lymfoidní specifický faktor (LEF-1); specifický transkripční faktor T-buněk (TCF-1). Sekvence B boxů v takovýchto polypeptidech mohou být stanoveny a isolovány • fc * ♦
metodami zde popsanými například porovnáním sekvencí k B boxům zde popsaným a testováním na biologickou aktivitu.
vynález zahrnuje rovněž polypeptidy hmg b boxů přirozeně se nevyskytujících. S výhodou má přirozeně se nevyskytující HMG B box alespoň 60 %, výhodněji alespoň 70 %, 75 %, 80 %>, 85 % nebo 90 %, a nej výhodněj alespoň 95 % sekvenční identity k sekvenci SEKV. ID. Č. 5 nebo SEKV. ID. Č. 20, jak se stanoví s použitím programu BLAST a parametrů v něm popsaných, a jednu nebo více aktivit HMG A boxu. S výhodou HMG B box sestává z nebo obsahuje sekvenci SEKV. ID. Č. 5 nebo SEKV. ID. Č. 20 nebo aminokyselinovou sekvenci odpovídající oblasti HMG proteinu savce.
v jiném provedení je vynález zaměřen na polypeptid obsahující obratlovčí HMG B box nebo jeho fragment, jenž má biologickou aktivitu B boxu nebo přirozeně se nevyskytující HMG B box, jenž ale neobsahuje HMG plné délky. Výrazem fragment B boxu, jenž má biologickou aktivitu nebo biologicky aktivní fragment B boxu se míní fragment HMG B boxu, jenž má aktivitu HMG B boxu. Například: Fragment B boxu může indukovat uvolňování cytokinů podporujících zánět z obratlovčí buňky, nebo indukovat aktivitu kaskádu zánětlivých cytokinů. Příkladem takovéhot fragmentu B boxu je fragment obsahující prvních 20 aminokyselin HMGl B boxu (sekv. ID. Č. 16 nebo SEKV. ID. Č. 23), jak je zde popsáno. Fragmenty B boxu mohou být generovány s použitím standardních technik molekulární biologie a testováním funkce fragmentu stanovením, zda fragment podaný buňce zvyšuje uvolňování cytokinů podporujících zánět z buňky, ve srovnání s vhodnou kontrolou, například s použitím metod zde popsaných.
Jak se zde používá, cytokin je rozpustný protein nebo peptid, jenž je přirozeně produkován savčí buňkou a jenž in vivo působí jako humorální regulátor v mi kro- až pikomolárních koncentracích. Cytokiny mohou, buď za normálních nebo patologických podmínek, modulovat funkční aktivity jednotlivých buněk nebo tkání, cytokin podporující zánět je cytokin, jenž má schopnost způsobovat ktroukoli z následujících fyziologických reakcí spojených se zánětem: Vasodilataci, hyperemii, zvýšenou permeabilitu cév spojenou • v * » · · · β · · • φ» ··
- 18 s edémy, akumulaci granulocytů a mononukleárních fagocytů, nebo ukládání fibrinu. v některých případech může cytokin podporující zánět způsobovat rovněž apoptosu, jako je u chronického selhávání srdce, kde bylo pro TNF prokázáno, že stimuluje apoptosu (Pulkki, Ann. Med. 29: 339-343, 1997; a
TsUtsui et al . Immunol. Rev. 174: 192-209, 2000).
Neomezujícími příklady cytokinů podporujících zánět jsou faktor nekrosy tumorů (tnf), interleukin (IL)-1«, IL-Ιβ, il-6, IL-8, IL-16, interferon γ, HMG-1, faktor aktivující destičky (PAF) a faktor inhibující migraci makrofágů (MIF).
Cytokiny podporující zánět je potřebné rozlišovat od proti zánět!ivých cytokinů, jako jsou IL-4, IL-10 a IL-13, jež nejsou mediátory zánětu.
V mnoha případech jsou cytokiny podporující zánět produkovány v kaskádě zánětlivých cytokinů, jež je zde definována jako in vivo uvolňování přinejmenším jednoho cytokinů podporujícího zánět u savce, přičemž daný cytokin ovlivňuje fyziologický stav savce. Kaskáda zánětlivých cytokinů je tedy inhibována v provedeních vynálezu, kde uvolňování cytokinů podporujících zánět způsobuje škodlivý fyziologický stav.
HMG A boxy a HMG B boxy, ať už se vyskytující přirozeně nebo ne, zahrnují polypeptidy, jež mají sekvenční identitu nebo homiologii s HMG A boxy a HMG B boxy popsanými shora. Jak se zde používá, dva polypeptidy (nebo oblasti polypetidů) jsou v podstatě homologní nebo identické, když dané aminokyselinové sekvence jsou přinejmenším z 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % nebo 95 % nebo více homologní nebo identické, procento identity dvou aminokyselinových sekvencí (nebo dvou nukleotidových sekvencí) lze stanovit přikládáním sekvencí k sobě za optimálních srovnávacích podmínek (např. mohou být vkládány mezery do sekvence první sekvence). Pak se porovnávají aminokyseliny nebo nukleotidy v odpovídajících posicích, a procento identity mezi dvěma sekvencemi je funkcí počtu identických posicí sdílených danými sekvencemi (tj. % identity = počet identických posic/celkový počet posic x 100). v určitých provedeních délak polypeptidu HMG A boxu nebo polypeptidu HMG B boxu přiloženého k srovnávacímu účelu • · představuje přinejmenším 30 %, s výhodou přinejmenším 40 %, výhodněji přinejmenším 60 %, a ještě výhodněji přinejmenším 70 %, 80 %, 90 %, nebo 100 % délky referenční sekvence, nepříklad sekvence poskytnuté v Obr. 12A-12E, a SEKV. ID. Č. 18, 20 a 22. Faktické porovnání dvou sekvencí lze provést dobře známými metodami, například použitím matematického algoritmu. výhodný neomezující příklad takovéhoto matematického algoritmu je popsán Karlínem et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993). Takovýto algoritmus je zahrnut do programů BLASTN a BLASTX (verse 2.2) a je popsán v Schaffer et al. , Nucleic Acids Res., 29: 2994-3005 (2001). Při používání programů blast a Gapped blast lze používat default parametry příslušných programů (např. BLASTN). Viz http://www.nebi.nim.nih.gov, jak byla dostupná 10. dubna 2002. V jednom provedení je prohledávaná databáze neredundantní databáze (NR), a parametry pro porovnávání sekvencí mohou být nastaveny na: Žádné filtry; hodnota očekávání 10; velikost slova 3; matice je BLOSUM62; a cena mezery má existenci 11 a rozšíření 1.
líným výhodným neomezujícím příkladem matematického algoritmu k porovnání sekvencí je algoritmus Meyerse a Millera, CABIOS (1989). Takovýto algoritmus je zařazen do programu ALIGN (verse 2.0), jenž je součástí balíku software porovnávání sekvencí GCG (Accelrys). Při používání programu ALIGN pro porovnání aminokyselinových sekvencí lze použít tabulku váhy zbytků PAM 120, pokutu délky mezery 12 a pokutu mezery 4. Další algoritmy pro analýzy sekvencí jsou v oboru známé a zahrnují ADVANCE a ADAM, jak jsou popsány v Torellis a Robotti, Comput. Appl. Biosci. 10: 1-3 (1994); a FASTA popsaný v Pearson a Lipman, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83: 2444-8 (1988) .
V jiném provedení lze procento identity mezi dvěma aminokyselinovými sekvencemi určit s použitím GAP programu v GCG balíku software (dostupném na http://www.accelrys.com, jak je dostupná 31. srpna 2001) buď s použitím matice Blossom 63 nebo PAM25O, váhou mezery 12, 10, 8, 6, nebo 4 a váhou délky 2, 3 nebo 4. V ještě jiném provedení lze procento identity mezi dvěma aminokyselinovými sekvencemi určit s • ♦ · použitím GAP programu v GCG balíku software (dostupném na http://www.cgc.com), s použitím váhy mezery 50 a váhy délky 3.
Polypeptid A boxu a jeho biologicky aktivní fragmenty
Jak je popsáno shora, tento vynález je zaměřen na polypeptidové prostředky obsahující savčí HMGA box, nebo jeho biologicky aktivní fragmenty, jež mohou inhibovat uvolňování cytokinů podporujících zánět ze savčích buněk, na něž se působí HMG, nebo jež lze použít k léčbě stavů charakterizovaných aktivací kaskády zánětlivých cytokinů.
Při odkazech na účinek jakéhokoli prostředku nebo způsobu podle vynálezu na uvolňování cytokinů podporujících zánět, zahrnuje použití výrazů inhibovat nebo snižovat alespoň malou, ale měřitelnou redukci uvolňování cytokinů podporujících zánět. Ve výhodných provedeních je uvolňování cytokinů podporujících zánět inhibováno alespoň o 20 % kontroly bez působení, ve výhodnějších provedeních je inhibice alespoň 50 %, výhodnějších provedeních je inhibice alespoň 50 %, v ještě výhodnějších provedeních je inhibice alespoň 70 %, a v nejvýhodnějších provedeních je alespoň 80 %. Takovéto redukce uvolňování cytokinů podporujících zánět mají schopnost redukce škodlivých účinků kaskády zánětlivých cytokinů u in vivo provedení.
Protože všechny obrat!ovčí HMG A boxy vykazují vysoký stupeň sekvenční konservace (viz například Obr. 13 k porovnání aminokyselinové sekvence potkaních, myších a lidských hmg polypeptidů), má se za to, že jakýkoli obrátí ovčí HMG A box může inhibovat uvolňování cytokinů podporujících zánět z obratlovčí buňky, na niž se působí hmg. Jakýkoli obratlovčí HMG A box proto spadá do rozsahu vynálezu. S výhodou je HMG A box savčí HMG A box, například savčí HMGl A box, jako je savčí HMGl A box poskytnutý zde jako sekv. id. Č. 4 nebo SEKV. ID. Č. 22. Do vynálezu jsou rovněž zahrnuty fragmenty HMGl A boxu mající biologickou aktivitu, jak jsou zde popsány.
osobou zběhlou v oboru bude rovněž rozpoznáno, že přirozeně se nevyskytující HMG A boxy (nebo jejich biologicky • * · · • · • 0 · • · ·
- 21 aktivní fragmenty), jež by inhibovaly uvolňování cytokinů podporujících zánět z obratlovci buňky, na niž se působí HMG, mohou být vytvořeny bez zbytečného experimentování. Tyto přirozeně se nevyskytující funkční A boxy mohou být vytvořeny porovnáním aminokyselinových sekvencí HMG A boxů z různých zdrojů a provedením jedné nebo více substitucí v jedné ze sekvencí v aminokyselinových posicích, kde se A boxy liší. Substituce se s výhodou provedou s použitím stejných aminokyselinových zbytků, jaké se nacházejí v porovnávaném A boxu. Alternativně se provede konservativní substituce kteréhokoli ze zbytků.
Konservativní substituce odkazují na vzájemnou zaměnitelnost zbytků majících podobné boční řetězce. Konservativně substituované aminokyseliny mohou být seskupeny podle chemických vlastností bočních řetězců. Například: Jedno seskupení aminokyselin zahrnuje ty aminokyseliny, jež mají neutrální a hydrfobní boční řetězce (a, v, 1, i, p, w, f a m); jiné seskupení je z aminokyselin majících neutrální a polární boční řetězce Cg, s, t, y, c, n, a q); jiné seskupení je z aminokyselin majících bazické boční řetězce (k, r a h); jiné seskupení je z aminokyselin majících kyselé boční řetězce (d a
e); jiné seskupení je z aminokyselin majících alifatické boční řetězce Cg, a, v, 1 a i); jiné seskupení je z aminokyselin majících alifatické-hydroxylové boční řetězce (s a t); jiné seskupení je z aminokyselin majících boční řetězce obsahující amin (n, q, k, r a h); a jiné seskupení je z aminokyselin majících boční řetězce obsahující síru (c a m). Výhodné skupiny konservativních substitucí aminokyselin jsou: r-k; e-d, y-f, 1-m; v-i a q-h).
Když u konservativních aminokyselinových substitucí lze předpokládat zachování biologické aktivity polypeptidu HMG A boxu, následující je příkladem jak lze vytvořit přirozeně se nevyskytující polypeptidy A boxu porovnáním lidského HMGl A boxu (SEKV. ID. Č. 4) se zbytky 32 až 85 sekv. id. č. lidského HMG2 a boxu (SEKV. ID. Č. 17).
HMGl pdasvnfsef skkcserwkt msakekgkfe dmakadkary eremktyipp kget HMG2 pdassnfaef skkcserwkt msakekskfe dmaksdkary dremknyvpp kgdk
- 22 Přirozeně se nevyskytující HMG A box může být vytvořen například substitucí zbytku alaninu (a) ve třetí posici HMGl A boxu zbytkem šeřinu (s), jenž se nachází ve třetí posici HMG2 A boxu. Osoba zběhlá v oboru bude vědět, že tato substituce poskytne funkční, přirozeně se nevyskytující A box, protože zbytek s funguje v této posici v HMG2 A boxu. Alternativně může být třetí posice HMGl A boxu substituována kteroukoli aminokyselinou, jež je konservativní k alaninu nebo šeřinu, jako je glycin (g), threonin (t), valin (v) nebo leucin (1). Osoba zběhlá v oboru uzná, že u těchto konservativních substitucí lze očekávat, že povedou k funkčnímu A boxu, protože A boxy nejsou invariantní ve třetí posici, takže konservativní substituce může poskytovat adekvátní strukturní náhradu aminokyseliny, jež se v této posici vyskytuje přirozeně.
Touto metodou lze vytvořit bez zbytečného experimentování velmi mnoho přirozeně se nevyskytujících HMG A boxů s očekávanou funkčností, a funkčnost každého konkrétního přirozeně se nevyskytujícího HMG A boxu lze předpovědět s adekvátní přesností. V každém případě lze funkčnost přirozeně se nevyskytujícího HMG A boxu stanovit bez zbytečného experimentování jednoduchým přidáním k buňkám spolu HMG, a stanovením, zda A box inhibuje uvolňování cytokinů podporujících zánět buňkou, s použitím např. způsobů zde popsaných.
Buňkou, u níž bude A box nebo biologicky aktivní fragment A boxu inhibovat uvolňovaní HMG-indukovaných cytokinů podporujících zánět, může být jakákoli buňka, jež může být indukována k produkci cytokinů podporujících zánět, ve výhodných provedeních je touto buňkou imunitní buňka, například makrofág, monocyt nebo neutrofil. V nejvýhodnějších provedeních je touto buňkou makrofág.
v rozsahu vynálezu jsou polypeptidy obsahující A box nebo biologicky aktivní fragment A box, jež mohou inhibovat produkci každého jednotlivého cytokinů podporujícího zánět, známého nyní nebo objeveného později. S výhodou budou protilátky inhibovat produkci TNF, IL-Ιβ nebo IL-6.
- 23 Nejvýhodněji budou protilátky inhibovat produkci každého cytokinů podporujícího zánět produkovaného obratlovci buňkou.
Vynález je zaměřen rovněž na prostředky obsahující kterýkoli ze shora popsaných polypeptidu ve farmaceuticky přijatelném excipientu. V těchto provedeních může prostředek inhibovat stav charakterizovaný aktivací kaskády zánětlivých cytokinů. Stavem může být stav, kde kaskáda zánětlivých cytokinů způsobuje systémovou reakci, jako je u endotoxického šoku. Alternativně může být stav zprostředkován lokalizovanou kaskádou zánětlivých cytokinů, jako u revmatické artritidy. Neomezující příklady stavů, jež lze užitečně léčit s použitím tohoto vynálezu byly uvedeny v této specifikaci v sekci o dosavadním stavu techniky. S výhodou je tímto stavem peptické, žaludeční a dvanácterníkové vředy, pankreatitida, ulcerativní, pseudomembránové, akutní a ischemické kol i tidy, divertikulitida, epiglotitida, achal asie, cholangitida, hepatidida, Crohnova choroba, enteritida, Whipplova choroba, astma, alergie, anafylaktický šok, onemocnění imunitního komplexu, orgánová ischemie, reperfusní poranění, orgánová nekrosa, senná rýma, sepse, septicemie, endotoxický šok, kachexie, hyperpyrexie, eosinofilní granulom, granulomatosa, sarkoidosa, septický abortus, epididymitida, vaginitida, prostátítida, zánět močovodu, bronchitida, rozedma, rhinitida, cystická fibrosa, pneumotida, ultramikroskopická pneumosilikovolkanokoniosa, bronchiolitida, faryngitida, pleurisie, infekce respiratorním syncytiálním virem, herpetická infekce, infekce HIV, infekce virem hepatitidy B, infekce virem hepatitidy C, rozšířená bakteremie, horečka Dengue, kandidiatida, malárie, filariasie, amebiasie, hydatická cysta, popáleniny, dermatitida, dermatomyositida, spálení sluncem, kopřivka, bradavice, vasulitida, angitida, endokartditida, arteritida, atherosklerosa, tromboflembitida, perikarditida, myokaditida, ischemie myokardu, periarteritis nodosa, revmatická horečka, Alzheimerova nemoc, coeliacká choroba, městnavé selhání srdce, syndrom zástavy dýchání dospělých, meningitida, encefalitida, roztroušená sklerosa, mozkový infarkt, mozková embolie, syndrom Guillama-Barrea, apendicitida, peritonitida, alvealitida, sinusitida,
- 24 • ·
neuritida, neuralgie, poranění míchy, obrna, uveitida, arthritidy, arthralgie, osteomyelitida, záněty svalů, Pagetova nemoc, dna, periodontální onemocnění, reumatoidní arthritida, synovi tida, myasthenia gravis, thyroitida, systémový lupus erythematosus, Goodpastureův syndrom, Behcetsův syndrom, odmítnutí alloštěpu, onemocnění transplantát-versus-hostitel, diabetes typu I, spondylitida, Bergerova choroba, Retierův syndrom a Hodgkinova choroba. Ve výhodnějších provedeních je stavem apendicitida, peptické, žaludeční a dvanácterníkové vředy, peritonitida, pankreatitida, ulcerativní, pseudomembránové, akutní a ischemické kolitidy, hepatitida, Crohnova choroba, astma, alergie, anafylaktický šok, orgánová ischemie, reperfusní poranění, orgánová nekrosa, senná rýma, sepse, septicemie, endotoxický šok, kachexie, septický abortus, rozšířená bakteremie, popáleniny, Alzheiměrová nemoc, coeliacká choroba, městnavé selhání srdce, syndrom zástavy dýchání dospělých, mozkový infarkt, mozková embolie, poranění míchy, obrna, odmítnutí alloštěpu a onemocnění transplantátversus-hostitel. v nejvýhodnějších provedeních je stavem endotoxický šok a odmítnutí alloštěpu. Když je stavem odmítnutí alloštěpu, prostředek může dále s výhodou obsahovat imunosupresant používaný k inhibici odmítnutí alloštěpu, jako je cyklosporin.
Excipient zařazený s polypeptidem do těchto prostředků je vybrán na základě očekávané cesty podávání prostředku při léčebných aplikacích. Cesta podávání prostředku závisí na stavu, jenž má být léčen. Například: Intravenosní injekce může být výhodná pro léčbu systémových poruch, jako je endotoxický šok, a orální podávání může být výhodné pro léčbu gastrointestinálnich poruch, jako je žaludeční vřed. Cesta podávání prostředku, jenž má být podáván, může být určena bez zbytečného experimentování osobou zběhlou v oboru v souvislosti se standardními studiemi dávka-odezva. Relevantní okolnosti zvažované při takovýchto určeních zahrnují stav, jenž má být léčen, věk, hmotnost a odezva jednotlivého pacienta a závažnost pacientových příznaků. V závislosti na stavu tedy může být proti látkový prostředek podáván pacientovi orálně, parenterálně, intranasálně, • · · vaginálně, rektálně, na jazyka, pod jazyk, do líce, intrabukálně a transdermálně.
V souladu s tím mohou být prostředky určené pro podávání orálně, na jazyk, pod jazyk, do líce a intrabukálně připraveny bez zbytečného experimentování způsoby dobře známými v oboru, například s inertním rozpouštědlem nebo jedlým nosičem. Prostředky mohou být uzavřeny do jedlých kapslí nebo stlačeny do tablet. Pro účely orálního léčebného podávání mohou být farmaceutické prostředky podle vynálezu spojeny s excipienty a používány ve formě tablet, pastilek, kapslí, elixírů, suspensí, sirupů, oplatek, žvýkacích gum a podobně.
Tablety, pilulky, kapsle, pastilky a podobně mohou obsahovat rovněž vázací látky, recipienty, desintegrační látky, lubrikanty, sladidla, příchutě. Příklady některých vazebných látek zahrnují mikrokrystalickou celulosu, gumu tragakant nebo želatinu. Příklady excipientů zahrnují škrob nebo laktosu. Příklady některých desintegračních látek zahrnují kyselinu alginovou, kukuřičný škrob a podobně. Příklady lubrikantů zahrnují stearát hořečnatý nebo draselný. Příkladem glidantu je silikondioxid. Příklady některých sladidel zahrnují sacharosu, sacharin a podobně. Příklady příchutí zahrnují mátu, methylsalicylát, pomerančovou příchuť a podobně. Materiály používané k preparaci těchto různých prostředků musí být farmaceuticky čisté a netoxické v používaných množstvích.
Prostředky podle vynálezu lze snadno podávat parenterálně, jako například intravenosní, nitrosvalovou, intratekální nebo podkožní injekcí. Parenterální podávání může být provedeno převedením proti látkového prostředku podle vynálezu do roztoku nebo suspense. Takovéto roztoky nebo suspense mohou rovněž obsahovat sterilní rozpouštědla, jako je voda pro injekce, solný roztok, fixované oleje, polyethylenglykoly, glycerin, propylenglykol a jiná syntetická rozpouštědla. Parenterální formulace mohou rovněž zahrnovat antibakteriální činidla, jako jsou například benzylalkohol nebo methylparabeny, antioxidanty, jako jsou například kyselina askorbová nebo bisul fit sodný a chelatační činidla, jako je EDTA. Přidány mohou být rovněž pufry, jako jsou • · ·
- 26 acetáty, citráty a fosfáty, a činidla k nastavení tonicity, jako je chlorid sodný nebo glukosa. Parenterální prostředky mohou být uzavřeny v ampulích, jednorázových stříkačkách nebo v lahvičkách pro více dávek vyrobených ze skla nebo plastu.
Rektální podávání zahrnuje podávání farmaceutického prostředku do rekta nebo tlustého střeva. Toto je provedeno použitím čípků nebo klystýru. Formulace čípků lze provést snadno způsoby v oboru známými. Například: Formulace čípků lze provést zahřátím glycerinu na asi 120 °C, rozpuštěním proti látkového prostředku v glycerinu, mícháním zahřátého glycerinu, po čemž lze přidat čištěnou vodu, a nalitím horké směsi do čípkové formy.
Podávání skrz kůži zahrnuje perkutánní absorpci prostředku skrz kůži. Transdermální formulace zahrnují náplasti, mazání, krémy, gely, řídké masti a podobně.
Tento vynález zahrnuje nosní podávání terapeuticky účinného množství prostředku savci. Jak se zde používá, nosní podávání nebo podávání nosem zahrnuje podávání prostředku na membránu sliznice nosního traktu nebo nosní dutiny pacienta. Jak se zde používá, farmaceutické prostředky pro nosní podávání prostředku obsahují terapeuticky účinné množství agonisty připravené dobře známými způsoby k podávání, například jako nosní sprej, nosní kapky, suspense, gel, mazání, krém nebo pudr. Podávání lze provádět rovněž s použitím nosního tamponu nebo nosní houbičky.
Polypeptidové prostředky zde popsané mohou zahrnovat rovněž antagonistů mediátoru časné sepse. Jak se zde používá, mediátor časné sepse je cytokin podporující zánět, jenž je uvolňován z buňky brzy (t j. během 30 - 60 min.) po indukci kaskády zánětlivých cytokinů (např. vystavení LPS). Neomezujícími příklady těchto cytokinů jsou TNF, IL-Ia, IL-Ιβ, IL-6, PAF a MIF. Zahrnuty jako mediátory časné sepse jsou rovněž receptory pro tyto cytokiny (například receptor faktoru nekrosy tumorů, typu 1) a enzymy potřebné k produkci těchto cytokinů, například enzym konverse interleukinu-ΐβ. Antagonisti mediátoru časné sepse, již známí nebo později objevení, mohou být užiteční pro tato provedení další inhibici kaskády zánětlivých cytokinů.
* · • · 9
- 27 Neomezujícími příklady antagonistů mediátorů časné sepse jsou antisense sloučeniny, jež se váží k mRNA mediátorů časné sepse, přičemž brání její expresi (viz např. ojwang et al., Biochemistry 36: 6003-6045, 1997; Parnpfer et al., Biol. Reprod. 52: 1316 - 1326, 1995; U.S. patent čís. 6 228 642; Yahata et al., Antisense Nuclei Acid Drug Dev. 8: 199 - 205, 1998), ribozymy, jež specificky štěpí mRNA mediátorů časné sepse (viz např. Leavitt et al., Antisense Nuclei Acid Drug Dev. 10: 409 - 414, 2000; Kisich et al. , 1999; a Hendrix wt al., Biochem. 3. 314 (Pt.2): 655 - 661, 1996), a protilátky, jež se vážou k mediátorům časné sepse a inhibují jejich působení (viz např. Kam a Tragan, Expert Opin. Pharmacother. 1: 615 - 622; Nagahira et al., 3. immunol. Methods 222, 83-89, 1999; Lavině et al., 3. Cereb. Blood Flow Metab. 18: 52 - 58, 1998; a Holmes et al., Hybridoma 19: 363 - 367, 2000). Na kteréhokoli antagonistů mediátorů časné sepse, známého nebo objeveného v budoucnosti, se pohlíží jako na patřícího do rozsahu vynálezu. Osoba zběhlá v oboru může určit množství mediátorů časné sepse k použití v těchto prostředcích k inhibici kterékoli konkrétní kaskády zánětlivých cytokinů bez zbytečného experimentování pomocí rutinních studií dávka/odezva.
Polypeptidy B boxu, jejich biologicky aktivní fragmenty a protilátky k nim
3ak je popsáno shora, vynález je zaměřen na polypeptidové prostředky obsahující obratlovci HMG B box, nebo jejich biologicky aktivní fragmenty, jež mohou zvyšovat uvolňování cytokinů podporujících zánět z obrátí ovčí buňky, na niž se působí HMG.
Při odkazech na účinek jakéhokoli prostředku nebo způsobu podle vynálezu na uvolňování cytokinů podporujících zánět, zahrnuje použití výrazů zvyšovat alespoň malý, ale měřitelný nárůst uvolňování cytokinů podporujících zánět. Ve výhodných provedeních je uvolňování cytokinů podporujících zánět zvýšeno alespoň 1,5-krát, alespoň 2-krát, alespoň 5-krát, nebo alespoň « ·
10-krát nad kontroly bez působení. Takováto zvýšení uvolňování cytokinů podporujících zánět mají schopnost zvyšování účinků kaskády zánětlivých cytokinů v in vivo provedeních. Takovéto polypeptidy mohou být použity rovněž k indukci ztráty hmotnosti nebo léčení obesity.
Protože všechny obrátí ovčí HMG B boxy vykazují vysoký stupeň sekvenční konservace (viz například obr. 13 k porovnání aminokyselinové sekvence potkaních, myších a lidských HMG polypeptidů), má se za to, že funkční, přirozeně se nevyskytující HMG B boxy mohou být vytvořeny bez zbytečného experimentování provedením jedné nebo více konservativních aminokyselinových substitucí nebo porovnáním přirozeně se vyskytujících obratlovčích B boxů z různých zdrojů a substitucí analogických aminokyselin, jak bylo rozebráno shora s ohledem na funkční, přirozeně se nevyskytující HMG A boxy. Ve zvláště výhodných provedeních B box obsahuje SEKV. ID. Č. 5 nebo sekv. id. č. 20, což jsou sekvence lidského HMGl B boxu dvou různých délek, nebo je fragmentem HMG B boxu, jenž má biologickou aktivitu B boxu. Například: Sekvence 20-ti aminokyselin obsažená v rámci SEKV. ID. Č. 20 přispívá k funkci B boxu. Tento 20-ti aminokyselinový fragment B boxu má následující aminokyselinovou sekvenci: fkdpnapkrl psafflfcse (SEKV. ID. Č. 16). líný příklad biologicky aktivního fragmentu B boxu sestává z aminokyselin 1-20 SEKV. ID. č. 5 (napkrppsaf flfcseyrpk; SEKV. ID. č. 23).
Vynález je rovněž zaměřen na purifikované preparáty protilátek, jež se specificky váží k B boxu obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG), ale neváží se specificky k non-B boxovým epitopům HMG. v těchto provedeních mohou protilátky inhibovat biologickou aktivitu polypeptidů B boxu, například uvolňování cytokinů podporujících zánět z obratlovčí buňky indukované HMG.
K získání protilátek specifických k HMG B boxu nebo jeho fragmentům, nebo k buňkám exprimujícím B box nebo jeho fragmenty nesoucí epitop, mohou být tyto použity jako imunogen k produkci protilátek imunospecifických k imunogenu. Výraz protilátky jak se zde používá zahrnuje monoklonální a polyklonální protilátky, chimérické, jednovláknové,
- 29 simianizované a humanizované protilátky, jakož i Fab fragmenty, včetně produktů Fab imunoglobulinové expresní knihovny.
Protože všechny obratlovčí HMG B boxy vykazují vysoký stupeň sekvenční konservace, má se za to, že kterýkoli obratlovčí HMG B box může indukovat uvolňování cytokinů podporujících zánět z obratlovčí buňky. Protilátky proti jakémukoli obratlovčímu HMG B boxu jsou proto v rozsahu vynálezu. S výhodou je HMG B boxem savčí HMG b box, výhodněji savčí HMGl B box, nej výhodněji lidský HMGl B box, poskytnutý zde jako SEKV. ID. č. 5 nebo SEKV. ID. Č. 20. Protilátky mohou být cíleny rovněž proti fragmentu HMG B boxu, jenž má biologickou aktivitu.
Protilátky generované proti HMG B boxu mohou být získány ppodávání B boxu, fragmentu B boxu nebo buněk osahujících B box nebo fragment B boxu zvířeti, s výhodu ne-lidskému, s použitím rutinních protokolů. Daný polypeptid, jako je antigenně nebo imunologicky ekvivalentní derivát nebo jeho fúzní protein, je použit jako antigen k imunizaci myši nebo jiného zvířete, jako je potkan nebo kuře, Imunogen B boxu nebo fragmentu může být poskytnut jako fúzní protein k poskytnutí stability nebo zvýšení imunogenicity B boxu nebo fragmentu. Imunogen bůže být spojen, například konjugací, s imunogenním nosičovým proteinem, například bovinním sérumalbuminem (BSA) hemocyaninem šášně lodní (KLH). Alternativně může být antigenní peptid obsahující více kopií B boxu nebo fragmentu dostatečně antigenní pro zvýšení imunogenicity tak, že lze obejít použití nosiče. Bi specifické protilátky mající dvě antigen vážící domény, z nichž každá je cílena k jinému epitopu B boxu, mohou být rovněž produkovány rutinními metodami.
Pro přípravu monoklonálních protilátek lze použít kteroukoli techniku známou v oboru, jež poskytuje protilátky produkované v kontinuálních kulturách buněčné linie. Viz Kohler a Milstein, Nátuře 256: 495-497, 1975; Kozbor et al., immunology Today 4: 72, 1983; a Cole et al. , str. 77-96 v Monoclonal Antibodies and cancer Therapy, Alan R. Liss, lne., 1985.
- 30 Techniky pro produkci jednovláknových protilátek (U.S. patent 4 946 778) lze adaptovat na produkci jednovláknových protilátek k B boxu nebo fragmentům. K expresi humanizovaných protilátek lze použít transgenní myši nebo jiné organizmy, jako jsou jiní savci.
Když se protilátka používá terapeuticky v in vivo aplikacích, je protilátka z výhodou modifikována tak, aby se stala méně imunogenní v daném jednotlivci. Například: Když je jednotlivcem člověk, protilátka je s výhodou humanizována, přičemž oblast(i) určující komplementaritu protilátky je/jsou transplantována/y do lidské protilátky (jak je například popsáno v Jones et al., Nátuře 321: 522-525, 1986; a Tempest et al., Biotechnology 9: 266-273, 1991).
Technologie vystavení na fágu lze rovněž využít k selekci genů protilátek s vazebnou aktivitou proti polypeptidu, a to buď z repertoáru PCR-amplifikovaných v-genů lymfocytů z člověka zachyceného jako nositele protilátek proti B boxu, nebo z naivních knihoven (Mecafferty et al, Nátuře 348: 552554, 1990; a Marks et al., Biotechnology 10: 779-783, 1992). Afinita těchto protilátek může být rovněž zvýšena přehazování řetězců (Clakson et al., Nátuře 352: 624-628, 1991).
Když jsou protilátky, jež se specificky váží k epitopům HMG B boxu získány, mohou být bez zbytečného experimentování hodnoceny na schopnost inhibovat uvolňování cytokinů podporujících zánět.
Protilátky, jež mohou inhibovat produkci kteréhokoli jednotlivého cytokinů podporujícího zánět jsou v rozsahu vynálezu. S výhodou mohou protilátky inhibovat produkci TNF, IL-Ιβ nebo IL-6. Nejvýhodněji mohou protilátky inhibovat produkci všech cytokinů podporujících zánět produkovaných obrátí ovčí buňkou.
Pro způsoby inhibice uvolňování cytokinů podporujících zánět z buňky nebo pro léčbu stavu charakterizovaného aktivací kaskády zánětlivých cytokinů s použitím protilátek k HMG B boxu nebo jeho biologicky aktivnímu fragmentu může být buňkou jakákoli buňka, jež může být indukována k produkci cytokinů podporujících zánět, ve výhodných provedeních je touto buňkou imunitní buňka, například makrofág, monocyt nebo • · ·
- 31 neutrofil. v nejvýhodnějších provedeních je touto buňkou makrofág.
V jiných provedeních je vynález zaměřen na prostředek obsahující preparát protilátky popsané shora ve farmaceuticky přijatelném excipientů. v těchto provedeních může prostředek inhibovat stav charakterizovaný aktivací kaskády zánětlivých cytokinů. Stavy, jež mohou být léčeny těmito prostředky byljiž dány do výčtu shora.
Proti látkové prostředky popsané shora mohou zahrnovat rovněž antagonistu mediátoru časné sepse, jak byl dříve popsán.
Polypeptidy B boxu nebo jeho biologicky aktivní fragmenty popsané v těchto provedeních mohou být použity k indukci zánětlivých cytokinů ve vhodných isolovaných buňkách in vitro, nebo ex vivo, nebo jako léčba in vivo. u každého takovéhoto působení může být polypeptid nebo fragment podáván poskytnutím vektoru DNA nebo RNA kódující B box nebo fragment B boxu, s patřičnou řídící sekvencí funkčně spojenou s kódovaným B boxem nebo fragmentem B boxu, takže B box nebo fragment B boxu je syntetizován v buňce nebo pacientovi, na něž se působí. In vivo aplikace zahrnují použití polypeptidů B boxu nebo polypeptidů fragmentu B boxu nebo vektorů jako činidla působení ke ztrátě hmotnosti. Viz wo 00/47104 (jehož veškeré poznatky jsou zde zahrnuty odkazem), jenž demonstruje, že léčba HMGl indukuje ztrátu hmotnosti. Protože HMG B box má aktivitu HMG proteinu, lze u B boxu očekávat rovněž indukci ztráty hmotnosti. U fragmentů B boxu, jež mají funkci B boxu, lze rovněž očekávat indukci ztráty hmotnosti.
V dalších provedeních je vynález zaměřen rovněž na způsob inhibice uvolňování cytokinů podporujících zánět ze savčí buňky. Způsob zahrnuje působení na buňku kterýmkoli prostředkem HMG A boxu nebo kterýmkoli proti látkovým prostředkem HMG B boxu nebo biologicky aktivního fragmentu B boxu, rozebraných shora.
Má se za to, že tento způsob by měl být užitečný k inhibici uvolňování cytokinů z jakékoli savčí buňky, jež produkuje cytokiny podporující zánět, ve výhodných provedeních je však touto buňkou makrofág, protože makrofágová produkce * · · • ·
- 32 cytokinů podporujících zánět je spojena s několika závažnými onemocněními.
Má se za to, že tento způsob je užitečný k inhibici jakéhokoli cytokinů podporujícího zánět produkovaného savčí buňkou. Ve výhodných provedeních je cytokinem podporujícím zánět TNF, IL-loc, IL-Ιβ, MIF nebo IL-6, protože tyto cytokiny podporující zánět jsou obzvláště důležitými mediátory onemocnění.
způsob těchto provedení je užitečný pro in vitro aplikace, jako je u studií ke stanovení biologických charakteristik produkce cytokinů podporujících zánět v buňce. Výhodnými provedením jsou však in vivo terapeutické aplikace, kde buňky jsou v pacientovi, jenž trpí, nebo je v ohrožení, stavem charakterizovaným aktivací kaskády zánětlivých cytokinů.
U těchto in vivo provedení se má za to, že jsou užitečné u kteréhokoli stavu, jenž je zprostředkován kaskádou zánětlivých cytokinů, včetně těch, jenž byly již dány do výčtu. Mezi výhodné stavy jsou zahrnuty apendicitida, peptické, žaludeční a dvanácterníkové vředy, peritonitida, pankreatitida, ulcerativní, pseudomembránové, akutní a ischemické kolitidy, hepatitida, crohnova choroba, astma, alergie, anafylaktický šok, orgánová ischemie, reperfusní poranění, orgánová nekrosa, senná rýma, sepse, septicemie, endotoxický šok, kachexie, septický abortus, rozšířená bakteremie, popáleniny, Alzheimerova nemoc, mozkový infarkt, mozková embolie, poranění míchy, obrna, odmítnutí alloštěpu a onemocnění transplantát-versus-hostitel. V nejvýhodnějších provedeních je stavem endotoxický šok a odmítnutí alloštěpu. Když je stavem odmítnutí alloštěpu, prostředek může dále s výhodou obsahovat imunosupresant používaný k inhibici odmítnutí alloštěpu, jako je cyklosporin.
Tyto způsoby mohou rovněž z užitkem zahrnout podávání antagonisty mediátoru časné sepse. Povaha těchto antagonistů byla již rozebrána.
V ještě jiných provedeních je vynález zaměřen na způsob léčby stavu chrakterizovného aktivací kaskády zánětlivých cytokinů u pacienta. Způsob zahrnuje podávání kteréhokoli • · • · ·
- 33 prostředku HMG A boxu (včetně přirozeně se nevyskytujících polypeptidů A boxu nebo biologicky aktivních fragmentů A boxu) nebo kteréhokoli proti látkového prostředku HMG B boxu nebo biologicky aktivního fragmentu B boxu (včetně přirozeně se nevyskytujících polypeptidů B boxu nebo jejich biologicky aktivních fragmentů), rozebraných shora, pacientovi, u tohoto způsobu se má za to, že by měl být užitečný u kteréhokoli stavu, jenž je zprostředkován kaskádou zánětlivých cytokinů, včetně těch, jenž byly již dány do výčtu. Jak u dříve popsaných in vivo způsobů, mezi výhodné stavy jsou zahrnuty apendícitída, peptické, žaludeční a dvanácterníkové vředy, perítonítida, pankreatítída, ulceratívní, pseudomembránové, akutní a ischemické kolítidy, hepatitida, Crohnova choroba, astma, alergie, anafylaktický šok, orgánová ischemie, reperfusní poranění, orgánová nekrosa, senná rýma, sepse, septicemie, endotoxický šok, kachexie, septický abortus, rozšířená bakteremie, popáleniny, Alzheimerova nemoc, mozkový infarkt, mozková embolie, poranění míchy, obrna, odmítnutí alloštěpu a onemocnění transplantát-versus-hostitel. v nejvýhodnějších provedeních je stavem endotoxický šok a odmítnutí alloštěpu. Když je stavem odmítnutí alloštěpu, prostředek může dále s výhodou obsahovat imunosupresant používaný k inhibici odmítnutí alloštěpu, jako je cyklosporin.
Tyto způsoby mohou užitečně zahrnovat rovněž podávání antagonisty mediátoru časné sepse, jak byl dříve popsán. Povaha těchto antagonistú byla již rozebrána.
v jiných provedeních je vynález zaměřen na způsoby stimulace uvolňování cytokinů podporujících zánět z buňky. Způsob zahrnuje působení na buňku kterýmkoli z polypeptidů B boxu nebo kterýmkoli z polypeptidů fragmentů B boxu, například o sekvenci SEKV. ID. Č. 5, SEKV. ID. Č. 20, SEKV. ID. Č. 16 nebo SEKV. ID. Č. 23, jak jsou zde popsány (včetně přirozeně se nevyskytujících polypeptidů B boxu a fragmentů). Způsob je užitečný pro in vitro aplikace, např. pro studium účinků produkce cytokinů podporujících zánět na biologii produkční buňky. Způsob je rovněž užitečný pro in vivo aplikace, například v ovlivnění ztráty hmotnosti nebo léčby obesity u pacienta, jak již bylo popsáno.
• ·· ····..· ·..· Ί
- 34 V dalších provedeních tedy je vynález zaměřen na způsob ovlivnění ztráty hmotnosti nebo léčby obesity u pacienta.
Způsob zahrnuje podávání účinného množství kteréhokoli z polypeptidů B boxu nebo polypeptidů fragmentů B boxu (včetně přirozeně se nevyskytujících polypeptidů B boxu a fragmentů) ve farmaceuticky přijatelném excipientu pacientovi.
Vyhledávání modulátorů uvolňování cytokinů podporujících zánět z buňky
Vynález je rovněž zaměřen na způsob stanovení, zda sloučenina (testovaná sloučenina) inhibuje zánět nebo zánětlivou odezvu, způsob zahrnuje sestavení systému ze sloučeniny a z a) buňky, jež uvolňuje cytokiny podporující zánět při vystavení obratlovčímu HMG B boxu nebo jeho biologicky aktivnímu fragmentu a b) HMG B boxu nebo jeho biologicky aktivního fragmentu, a poté stanovení, zda sloučenina inhibuje uvolňování cytokinů podporujících zánět z buňky, v porovnání s vhodnou kontrolou. Sloučenina, jež inhibuje uvolňování cytokinů podporujících zánět v tomto testu může být použita k léčbě zánětu nebo zánětlivé odezvy. HMG B box nebo jeho biologicky aktivní fragment mohou být k buňce endogenní nebo mohou být do buňky zavedeny s použitím standardních technik molekulární biologie.
Očekává se, že užitečnou pro vynález by měla být každá buňka, jež uvolňuje cytokiny podporující zánět při vystavení obratlovčímu HMG B boxu nebo jeho biologicky aktivnímu fragmentu bez přítomnosti testované sloučeniny. Předpokládá se, že buňka, jež bude vybrána, by měla být důležitá v etiologii stavu, jenž má být léčen inhibiční sloučeninou, jež je testována. U mnoha stavů se očekává, že výhodnou buňkou bude lidský makrofág.
Jakýkoli způsob stanovení zda sloučenina inhibuje uvolňování cytokinů podporujících zánět z buňky by měl být užitečný pro tato provedení. Předpokládá se, že výhodnými způsoby jsou přímá měření cytokinů podporujících zánět, například kterýmkoli z řady komerčně dostupných ELISA testů.
• · ·: : ·**· ··· ; : ......
···’..· ·..*·..·
- 35 V některých provedeních však může být výhodné měření zánětlivého účinku uvolňovaných cytokinů, obzvlášť když je testovanou buňkou produkováno několik cytokinů podporujících zánět. Jak je již rozebráno shora, pro mnoho závažných poruch jsou převažujícími cytokiny podporujícími zánět TNF, IL-Ia, IL-Ιβ, MIF nebo il-6, obzvláště TNF.
Vynález rovněž obsahuje způsob stanovení, zda sloučenina zvyšuje zánětlivou odezvu nebo zánět. způsob zahrnuje sestavení systému ze sloučeniny (testované sloučeniny) a z
a) buňky, jež uvolňuje cytokiny podporující zánět při vystavení obrat! ovčímu HMG A boxu nebo jeho biologicky aktivnímu fragmentu a b) HMG A boxu nebo jeho biologicky aktivního fragmentu, a poté stanovení, zda sloučenina zvyšuje uvolňování cytokinů podporujících zánět z buňky, v porovnání s vhodnou kontrolou. sloučenina, jež snižuje uvolňování cytokinů podporujících zánět v tomto testu může být použita ke zvýšení zánětlivé odezvy nebo zánětu. HMG A box nebo biologicky aktivní fragment A boxu mohou být k buňce endogenní nebo mohou být do buňky zavedeny s použitím standardních technik molekulární biologie.
Podobně jako u buněčných typů k identifikaci inhibitorů zánětu, popsaných shora, očekává se, že užitečnou pro vynález by měla být každá buňka, u níž je uvolňování cytokinů podporujících zánět normálně inhibováno v odezvě na vystavení obratlovčímu HMG A boxu nebo jeho biologicky aktivnímu fragmentu bez přítomnosti jakékoli testované sloučeniny. Předpokládá se, že buňka, jež bude vybrána, by měla být důležitá v etiologii stavu, jenž má být léčen inhibiční sloučeninou, jež je testována. U mnoha stavů se očekává, že výhodnou buňkou bude lidský makrofág.
Jakýkoli způsob stanovení zda sloučenina zvyšuje uvolňování cytokinů podporujících zánět z buňky by měl být užitečný pro tato provedení. Předpokládá se, že výhodnými způsoby jsou přímá měření cytokinů podporujících zánět, například kterýmkoli z řady komerčně dostupných ELISA testů, v některých provedeních však může být výhodné měření zánětlivého účinku uvolňovaných cytokinů, obzvlášť když je testovanou buňkou produkováno několik cytokinů podporujících « · • · · • · * · • · · · · • · ·
- 36 zánět. Jak je již rozebráno shora, pro mnoho závažných poruch jsou převažujícími cytokiny podporujícími zánět TNF, IL-Ia, IL-Ιβ, MIF nebo IL-6, obzvláště TNF.
Výhodná provedení vynálezu jsou popsána v následujících příkladech. Osobě zběhlé v oboru budou při uvážení specifikací a praxe vynálezu, jak je zde popsán, zřejmá jiná provedení v rozsahu vynálezu. záměrem je, aby specifikace, spolu s příklady a nároky, byly považovány jen za vybrané příklady.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Materiály a metody
Klonování HMGl a produkce mutantů HMGl
K přípravě klonů a mutantů lidského HMGl byly použity následující metody. Rekombinantní lidský HMGl plné délky (651 párů bází; přístupové číslo GenBank U51677) byl klonován PCR amplifikací z Quick-Clone (Clontech, Palo Alto, CA) preparátu cDNA lidského mozku za použití následujících primerů; přímý primer: 5'gatgggcaaaggagatcctaag 3' (sekv. id. č. 6) a zpětného primerů: 5'gcggccgcttattcatcatcatcttc 3'(sekv. id. Č. 7). Mutanty lidského HMGl byly klonovány a purifikovány jak následuje. Zkrácená forma lidského HMGl byla klonován PCR amplifikací z Quick-Clone (clontech, Palo Alto, CA) preparátu cDNA lidského mozku. Použité primery, přímý resp. zpětný, byly:
Karboxyterminální mutant (557 bp): 5'GATGGGCAAAGGAGATCCT
AAG 3' (SEKV. ID. Č. 8) a 5'GCGGCCGCTCACTTGCTTTTTTCAGCCTGAC 3' (SEKV. ID. Č. 9).
Mutant v N-konci + B boxu (486 bp): 51GAGCATAAGAAGAAGCA
CCCA 3' (SEKV. ID. Č. 10) a 5' GCGGCCGCTCACTTGCTTTTTTCAGCCTTG AC 3' (SEKV. ID. Č. 11).
« ·
- 37 »· ·· » · * • · · 9 · ► » · · » · · · • · · ·
Mutant B boxu (233 bp) : 5' AAGTTCAAGGATCCCAATGCAAG 3' (SEKV. ID. Č. 12) a 5' GCGGCCGCTCAATATGCAGCCTATAATCCTTTTC 3' (SEKV. ID. Č. 13).
Mutant N-konce + A boxu (261 bp): 5' GATGGGCAAAGGAGATCCTA AG 3' (SEKV. ID. Č. 13) a 5' TCACTTTTTTGTCTCCCCTTTGGG 3’ (SEKV. ID. Č. 14).
Ke každému mutantu byl přidán stop kodon k zajštění přesné velikosti bílkovin. PCR produkty byly subklonovány do EcoRi míst pCRH-TOPO vektoru s použitím TA klonovací metody podle instrukcí výrobce (Invitrogen, Carlsbad, CA). Po amplifikaci byl PCR produkt štěpen EcoRl a subklonován do vektoru exprese s přidaným úsekem GST, pGEX (Pharmacia); správná orientace positivních klonů byla potvrzována sekvenací DNA obou vláken. Rekombinantní plasmidy byly transformovány do E. coli kmenů BL21 nebo BL21(DE3)plysS deficientních na proteasu (Novagen, Madison, WI) a exprese fúzního proteinu byla indukována isopropyl-D-thiogalaktopyranosidem (IPTG). Rekombinantní bílkoviny byly získány s použitím afinitní purifikace na koloně s náplní glutathion Sepharosy (Pharmacia).
HMG mutanty generované jak je popsáno shora měly následující aminokyselinové sekvence:
HMGl divokého typu:
MGKGDPKKPTGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEF
SKKCSERWKTMSAKEKGFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKD
PNAPKRLPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQP
YEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEEDEED
EEDEEEEEDEEDEEDEEEDDDDE (SEKV. ID. Č. 18)
Karboxyterminální mutant:
MGKGDPKKPTGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDAS
VNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGET
KKKFKDPNAPKRLPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTA
ADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKS (SEKV. ID. Č. 19) • · · ·
Mutant B boxu:
FKDPNAPKRLPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEM
WNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAY (SEKV. ID. Č. 20)
Mutant N-konce + A boxu:
MGKGDPKKPTGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEF
SKKCSERWKTMSAKEKGFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGET (SEKV. ID. Č. 21), přičemž A box sestává ze sekvence
PTGKMSSYAFF
VQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGFEDMAKADK
ARYEREMKTYIPPKGET (SEKV. ID. Č. 22)
Polypeptid generovaný z GST vektoru bez HMGl proteinu byl zahrnut jako kontrola (obsahující je přidanou GST sekvenci). K inaktivaci bakteriální DNA, jež váže HMGl divokého typu a některých mutantů (karboxyterminálního a B boxu), byla přidána k bakteriálním lysátu DNasa I (Life Technologies) pro karboxyterminální mutant a mutant B boxu nebo benzonasa nukleasa (Novagen, Medison, wi) pro HMGl divokého typu, na asi 20 jedn./ml. Degradace DNA byla ověřována barvením agarosových gelů obsahujících HMGl protein ethidium bromidem před a po působení. Proteinové eluáty byly nechány protéct kolonou polymyxinu D (Pierce, Rockford, IL) k odstranění veškerého kontaminujícího LPS a extensivně dialyzovány proti fosfátovému pufru se solí k odstranění přebytečného glutathionu. Preparáty pak byly lyofilizovány a před použitím znovu rozpuštěny ve sterilní vodě. Hladiny LPS byly nižší než 60 pg/pg bílkoviny u mutantů a 300 pg/pg u HMGl divokého typu, jak bylo změřeno testem lyzátu amebocytů Limulus (Bio Whittaker lne., Wlakersville, MD). integrita proteinu byla ověřována SDS-PAGE. V některých pokusech byl použit rekombinantní potkaní HMGl (Wang. et al . , Science 285: 248-251, 1999), protože nemá degradační fragmenty pozorované u purifi kovaného lidského HMGl.
• · * • ·
• ♦ «
• · ·
Syntéza peptidů
Peptidy byly syntetizovány v Biotechnologickém centru Utah State University (Logan, Utah) s 90 %-ní čistotou. V preparátech syntetický peptidů nebyl detekovatelný endotoxin, jak bylo měřeno Limulus testem.
Buněčné kultury
Murinní makrofágům-podobné buňky RAW 264.7 (American Type Culture Collection, Rockvilee, MD) byly kultivovány v RPMI 1640 médiu (Life Technologies, Grand Island, NY) doplněném 10% fetálního bovinního séra (Gemini, Catabasas, CA), penicilinem a streptomycinem (Life Technologies) a byly používány při 90 % konfluenci v bezsérovím médiu Opti-MEM I (Life Technologies, Grand island, NY). Rutinně byl přidáván polymixin B (Sigma, St. Louis, MO) na 100 - 1000 jedn./ml k neutralizaci jakékoli kontaminace LPS, jak je dříve popsáno; polymixin B samotný neovlivňuje viabilitu buněk stanovenou s trypanovou modří (Wang. et al., shora). Polymixin B nebyl používán v pokusech se syntetickými peptidy.
Měření uvolňování TNF z buněk
Uvolňování TNF bylo měřeno standardním biotestem (Bianchi et al., shora) s murinními fibroblasty L929 (ATCC, American Type Culture Collection, Rockville, MD) s nejnižší detekovatelnou koncentrací 30 pg/ml. Rekombinantní myší TNF byl získán od R&D systém lne., (Minneapolis, MN) . Buňky murinních fibroblastů L929 (ATCC) byly kultivovány v DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY) doplněném 10 % fetálního bovinního séra (Gemini, Catabasas, CA), penicilinem (50 jedn./ml) a streptomycinem (50 jedn./ml) (Life Technologies) v zvlhčovaném inkubátoru s 5 % co2.
- 40 Produkce protilátek
Polyklonální protilátky proti HMGl B boxu byly vytvořeny v králících (Cocalico Biologicals, lne., Reamstown, PA) a testovány na titr imunoblottingem. igG byly purifi kovány z anti-HMGl antiséra s použitím Protein A agarosy podle výrobcova návodu (Pierce, Rockford, IL). Anti-HMGl B box protilátky byly afinitně purifikovány s použitím kyanobromidem aktivovaných zrnek Sepharosy (Cocalico Biologicals, lne.). Neimunní králičí igG byl pořízen od spol. Sigma (St. Louis, MO). Protilátky detekovaly v imunotestech HMGl plné délky a B box, ale nereagovaly křížově s TNF, IL-1 a IL-6.
Značení HMGl pomocí Na-I125 a vazba na buněčný povrch
Purifikovaný protein HMGl (10 pg) byl radioaktivně značen s 0,2 mCi beznosičového 125I (NEN Life Science products lne., Boston, MA) s použitím lodo-beads (Pierce, Rockford, IL) podle výrobcova návodu. 12Sl-HMGl protein byl oddělen od nezreagovaného 125I na koloně pro gel ovou chromatografií (P6 Micro Bio-Spin chromatography columns, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) předem ekvilibrované 300 mM chloridem sodným, 17,5 mM citrátem sodným, pH 7,0 a 0,1 %-ním bovinním sérum albuminem (BSA). Specifická aktivita eluovaného HMGl byla kolem 2,8 x 106 cpm/pg proteinu. Studie vazby k buněčnému povrchu byly provedeny jak je dříve popsáno (Yang et al., Am. J. Physiol. 275 C675-C683, 1998). Buňky RAW 264.7 byly naneseny na 24-jamkové destičky a rozrůstány do konfluence. Buňky byly dvakrát promyty ledově chladným PBS obsahujícím 0,1 % BSA a vazba byla prováděna při 4 °C po 2 hodiny s 0,5 ml vazebného pufru obsahujícího 120 mM chlorid sodný, 1,2 mM síran hořečnatý, 15 mM octan sodný, 5 mM chlorid draselný, mM Tris.HCl, pH 7,4, 0,2 % BSA, 5 mM glukosu a 25 000 cpm 125l-HMGl. Na konci inkubace byly odstraněny supernatanty a buňky promyty třikrát ledově chladným PBS s 0,1 % BSA a lyžovány s 0,5 ml 0,5 N NaOH a 0,1 % SDS po 20 minut při pokojové teplotě. Radioaktivita v lyzátu pak byla měřena s použitím gama počítače. Specifická vazba byla stanovena jako • · · celková vazba mínus radioaktivita získaná v přítomnosti přebytku neznačeného proteinu HMGl nebo A boxu.
Pokusy na zvířatech
TNF knock-out myši byly získány od spol. Amgen (Thousand Oaks, CA) a byly na základě B6xl29. Věkově odpovídající myši divokého typu B6xl29 byly v těchto studiích použity jako kontroly. Myši byly chovány na university of Florida (Gainsville, FL) v domácím zvěřinci pro transgenní myši, prostém specifických patogenů; používány byly ve stáří 6 - 8 týdnů.
Samci 6-8 týdenních myší Balb/c a C3H/Hej byli nakoupeni u Harlan Sprague-Dawly (indianopolis, IN) a necháni aklimatizovat pře použitím v pokusech 7 dnů. všechna zvířata byla umístěna v North Shore university Hospital Animal Facility za standardní teploty a cyklu světla a tmy.
Cékální podvázání a punkce
Cékální podvázání a punkce (CLP) byly prováděny jak je dříve popsáno (Fink a Heard, J. Surg. Res. 49: 186-196, 1990; Wichman et al., Crit. Care Med. 26: 2078-2086, 1998; a Remick et al. Shock 4: 89-95, 1995). Ve stručnosti: Balb/c myši byly anestetizovány intramuskulárně 75 mg/kg ketaminu (Fort Dodge, Fort Dodge, iowa) a 20 mg/kg xylazinu (Boehringer Igelheim, St. Josef, MO). Byla provedena středová incise a cékum bylo isolováno. Podvázáni 6-0 prolenovým šitím bylo umístěno v hladině 5,0 mm od cékálního vrcholu směrem od ileocékální chlopně.
Na podvázaném cékálním výstupku pak byla provedena jedna punkce jehlou měrky 22, bez přímé extruse stolice. Cékum pak bylo umístěno zpět do své normální nitrobřišní polohy. Břicho bylo uzavřeno běžným 6-0 prolenovým šitím ve dvou vrstvách, peritoneum a fascia zvlášť, aby se předešlo prosakování tekutiny, všechna zvířata byla resuscitována normálním solným roztokem podaným subkutánně při 20 ml/kg tělesné hmotnosti. Každé zvíře dostalo 30 minut po operaci subkutánní injekci • · · » « • 1 • · #
- 42 imipenu (0,5 mg/myš) (Primaxin, Merck & Co., lne., West Point, PA). Zvířata pak byla ponechána zotavit se. Mortalita byla zaznamenávána až do 1 týdne po dané proceduře; přežívající zvířata byla sledována po 2 týdny, aby bylo zaručeno, že nedošlo k žádné pozdní mortalitě.
Myši sensitizované D-galaktosaminem publikován již USA, 76: 5939657-663, 1997).
Model sensitizace D-galaktosaminem byl dříve (Galanos et al., Proč. Nati. Acad. Sci 5943, 1997; Lehmann et al., 3. Exp. Med. 165:
Myši byly inji kovány intraperitoneálně 20 mg D-galktosamin-HCl (Sigma)/myš v (200 pl PBS) a 0,1 nebo 1 mg buď HMGl boxu nebo vektorového proteinu v (200 μΐ PBS). Mortalita byla zaznamenávána denně až do 72 hodin po injekci; přežívající zvířata byla sledována po 2 týdny, a nebyla zaznamenána žádná pozdní úmrtí z toxicity B boxu.
Kultura slezinných bakterií
Čtrnáct myší dostalo buď anti-HMGl protilátku (n = 7) nebo kontrolu (n = 7) v 24 nebo 30 hodinách po CLP, jak je zde popsáno, a byly utraceny k nekropsii. slezinné bakterie byly získány jek je popsáno dříve (villa et al., Endotoxin Res. 4: 197-204, 1997). sleziny byly vyňaty a homogenizovány v 2 ml PBS. Po serální diluci PBS byly homogenáty naneseny jsko 0,15 ml alikvóty na sojové tryptické agarové plotny (Difco, Detroit, Ml) a CFU byly spočítány po inkubaci při 37 °C přes noc.
Statistická analýza
Data jsou presentována jako průměr + SEM, pokud není uvedeno jinak. Rozdíly mezi skupinami jsou stanoveny pomocí 2-řetězcového Studentova testu, jednosměrné ANOVA následované testem nemenšího významného rozdílu nebo 2-řetězcového Fisherova exaktního testu.
- 43 Příklad 2
Mapování HMGl domén podle podpory cytokinové aktivity
HMGl má dvě poskládané DNA-vazebné domény (A a B box) a negativně nabitou kyselou karboxylovou koncovou část. K objasnění strukturního základu HMGl cytokinové aktivity a k mapování domény zánětlivé bílkoviny jsme exprimovali HMGl plné délky a zkrácených forem pomocí mutageneze a probrali bílkoviny podle stimulační aktivity v kulturách monocytů (Obr. 1). Byly generovány HMGl plné délky, mutant, jehož C-konec byl deletován, mutant obsahující B box a mutant obsahující jen A box. Tyto mutanty lidského HMGl byly vytvořeny polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) s použitím specifických primerů, jak je zde popsáno, a mutantní bílkoviny byly exprimovány s použitím fúzního genového systému s glutathion S-transferasou (GST) (Pharmacia Biotech, Piscataway, Nl) v souladu s návodem výrobce.Ve stručnosti: dna fragmenty připravené PCR metodou byly spojeny s GST fúzním vektorem a ampl ifi kovány v £. coli. Exprimované bílkoviny HMGl a mutantů HMGl byly pak isolovány s použitím GST afinitní kolony.
Účinek mutantů na uvolňování TNF z murinních makrofágůmpodobných buněk RAW 264.7 (ATCC) byl sledován jak následuje. Buňky RAW 264.7 byly kultivovány v RPMI 1640 médiu (Life Technologies, Grand island, NY) doplněném 10 % fetálního bovinního séra (Gemini, Catabasas, CA), penicilinem a streptomycinem (Life Technologies). Přidáván byl polymixin B (Sigma, St. Louis, MO) na 100 jedn./ml k neutralizaci jakékoli kontaminace LPS. Buňky byly kultivovány s 1 pg/ml proteinu HMGl plné délky (divokého typu) a každého HMGl mutantu v médiu Opti-MEM I po 8 hodin, a byly sebrány kondicionované supernatanty (obsahující TNF, jenž byl uvolněn z buněk) a TNF uvolněný z buněk byl měřen standardním biotestem cytotoxicity s murinními fibroblasty L929 (ATCC) (Bianchi et al., shora) s nejnižší detekovatelnou koncentrací 30 pg/ml. Rekombinantní myší TNF byl získán od R&D systém lne. , (Minneapolis, MN) a používán v těchto ppokusech jako kontrola. Výsledky této studie jsou ukázány v Obr. 1. všechna data v Obr. 1 jsou presentována jako průměr + SEM, pokud není uvedeno jinak. (N =
6-10).
Jak ukazuje obr. 1, HMGl divokého typu a HMGl zkrácený od karboxylového konce stimulují významně uvolňování TNF monocytovými kulturami (murinními makrofágům-podobnými buňkami RAW 264.7). Box B byl mocným aktivátorem uvolňování TNF monocyty. Tento stimulační účinek byl specifický, protože A box aktivoval uvolňování TNF jen slabě.
Příklad 3
Protein HMGl B boxu podporuje cytokinovu aktivitu způsobem vykazujícím závislost na dávce
K dalšímu zkoumání účinku HMGl B boxu na produkci cytokinů byla různá množství HMGl boxu hodnocena podle účinků na produkci TNF, IL-1B a IL6 v murinních makrofágům-podobných buňkách RAW 264.7. Buňky RAW 264.7 byly stimulovány protein B boxu při 0-10 pg/ml, jak je vyznačeno v Obr. 2A-2C, po 8 hodin. Byla sebrána kondicionovaná média a změřena na hladiny TNF, IL-Ιβ a IL-6. Hladiny TNF byly měřeny jak je zde popsáno, a hladiny IL-Ιβ a IL-6 byly měřeny s použitím souprav na hladiny TNF, IL-Ιβ a IL-6. Hladiny TNF TNF byly měřeny jak je zde popsáno, a hladiny IL-Ιβ a IL-6 byly měřeny s použitím souprav s enzymem spojených imunosorpčních stanovení (elisa) (R&D System lne. , Minneapolis, MN) a s N > 5 u všech pokusů. Výsledky těchto studií jsou ukázány v Obr. 2A-2C.
Jak ukazuje obr. 2A, uvolňování TNF z RAW 264.7 buněk se zvyšoval se zvyšujícím se množstvím B boxu podaného k buňkám. Jak ukazuje Obr. 2B, přidání 1 pg/ml nebo 10 pg/ml B boxu vedlo ke zvýšenému uvolňování Ιί-2β z RAW 264.7 buněk. Navíc, jak ukazuje obr. 2c, uvolňování IL-6 z RAW 264.7 buněk se zvyšoval se zvyšujícím se množstvím B boxu podaného k buňkám.
zkoumána byla rovněž kinetiká uvolňování B boxem indukovaného uvolňování TNF. Uvolňování TNF a exprese TNF mRNA byly měřeny v RAW 264.7 buňkách indukovaných polypeptidem B boxu nebo GST přídatným polypetidem používaným jen jako kontrola (vektor) (10 pg/ml) pro 0 a 48 hodin. Supernatanty • · • · • · ·
- 45 ··· · · · · · · byly analyzovány na hladinu proteinu TNF biotestem L929 cytotoxicity (N = 3 - 5), jak je zde popsán. K měření mRNA byly buňky naneseny na 100 mm misky a opracovány Opti-MEM I médiem obsahujícím polypetid B boxu nebo samotného vektoru pro hodiny 0, 4, 8, nebo 24, jak je vyznačeno v Obr. 2D. Vzorek s vektorem samotným byl testován v časovém bodu 4 hodin. Buňky byly seškrábnuty z misky a pomocí RNAzol B metody podle návodu výrobce (Tel-Test B, lne., Friendswood, TX) byla isolována celková RNA. TNF (287 bp) byl měřen testem ochrany před RNasou (Ambion, Austin, TX). Stejné nanášky a integrita RNA byly ověřovány vybarvením RNA vzorku na agaroso-formaldehydovém gelu ethidium bromidem, výsledky testu ochrany před RNasou jsou ukázány v Obr. 2D. Jak ukazuje Obr. 2D, aktivace monocytů B boxem proběhla na úrovni genové transkripce, protože TNF mRNA byla významně zvýšena v monocytech vystavených proteinu B boxu (Fig. 2B). Exprese TNF mRNA byla nejvyšší ve čtvrté hodině a snižovala se v hodinách 8 a 24. Protein samotného vektoru, kontrola (GST přídatná sekvence), nevykazoval žádný účinek na expresi TNF mRNA. Podobná studie byla provedena s měřením TNF proteinu uvolněného z RAW 264.7 buněk 0, 4, 8, 24, 32 nebo 48 hodin po řidání B boxu nebo proteinu samotného vektoru (GST přídatné sekvence) s použitím biotestu L929 cytotoxicity, jak je zde popsán, v porovnání s kontrolou (jen médium) stimulovalo působení B boxu expresi proteinu TNF (Obr. 2F), ale působení proteinu samotného vektoru ne (Obr. 2E). Data jsou representativní pro tři nezávislé pokusy. Tato data dohromady ukazují, že doména B boxu HMGl má cytokinovou aktivitu a je zodpovědná za cytokin-stimulující aktivitu HMGl plné délky.
v souhrnu: B box HMGl stimuloval závisle na dávce uvolňování TNF, IL-Ιβ a IL-6 z kultur monocytů (Obr. 2A - 2c), v souladu se zánětlivou aktivitou HMGl plné délky (Andersson et al., J. Exp. Med. 192: 565 - 570, 2000). Navíc tyto studie ukazují, že maximum uvolňování TNF nastalo do 8 hodin (Obr. 2F). Tento typ zpožděného uvolňování TNF je podobný uvolňování TNF indukovanému samotný HMGl, a významně pozdější, než kinetiká TNF indukovaného lps (Andersson et al., shora).
- 46 Příklad 4
Prvních 20 aminokyselin HMGl B boxu stimuluje TNF aktivitu
TNF-stimulující aktivita HMGl B boxu byla mapována dále. Tato studie byla provedena jak následuje. Fragmenty B boxu byly generovány s použitím techniky syntézy chráněných peptidů, jak je zde popsána. Generováno bylo pět fragmentů HMGl B boxu (ze SEKV. ID. Č. 20) obsahujících aminokyseliny 1 - 20; 16 - 25, 30 - 49; 45 - 64 nebo 60 - 74, jak je vyznačeno v obr. 3. Na RAW 264.7 buňky se působilo B boxem (1 pg/ml) nebo syntetickými peptidovými fragmenty B boxu (10 pg/ml), jak jsou vyznačeny v Obr. 3, a uvolňování TNF do supernatantu bylo měřeno jak je zde popsáno, ukázaná data jsou průměr + SEM (n = 3 pokusy, každý proveden v duplikátech a ověřován s použitím tří různých šarží syntetických peptidů). lak ukazuje Obr. 3, TNF-stimulující aktivita byla zachována u syntetického peptidu odpovídajícího aminokyselinám 1-20 HMGl B boxu o SEKV. ID. Č. 20 (fkdpnapkrlpsafflfcse SEKV. ID. Č. 16). TNF-stimulační aktivita 1-20-meru byla méně silná než u syntetického B boxu plné délky (1-74-mer), nebo HMG 1 plné délky, ale stimulační účinky byly specifické, protožr syntetické 20-mer aminokyselinových fragmentů obsahující 16 25, 30 - 49; 45 - 64 nebo 60 - 74 aminokyseliny HMGl B boxu neindukovaly uvolňování TNF. Tyto výsledky jsou přímým důkazem, že makrofágy stimulující aktivita HMG B boxu přísluší specificky doméně prvních 20 aminokyselin HMG B boxu o SEKV. ID. Č. 20. Tento fragment B boxu může být použit stejným způsobem jako polypeptid kódovaný B boxem plné délky, např. ke stimulaci cytokinů podporujícího zánět, nebo k léčbě stvů pacienta, charakterizovaných aktivací kaskády zánětlivých cytokinů.
- 47 Příklad 5
Protein HMGl A boxu antagonizuje HMGl-indukovanou cytokinovou aktivitu způsobem vykazujícím koncentrační závi slost
Slabí agonisti jsou z definice antagonisty. Protože HMGl A box pouze slabě indukuje produkci TNF, jak je ukázáno v Obr. 1, byla hodnocena schopnost HMGl A boxu působit jako antagonista HMGl aktivity. Tato studie byla provedena jak následuje. Na sub-konfluentní RAW 264.7 buňky v 24-jamkových destičkách se působilo HMGl (1 pg/ml) a 0, 5, 10, nebo 25 pg/ml A boxu po 16 hodin v Opti-MEM I médiu za přítomnosti polymixinu B (100 jedn./ml). TNF-stimulační aktivita (testovaná s použitím biotestu L.929 cytotoxi ci ty, jak je zde popsán) ve vzorku, jenž nedostal žádný A box, byla vyjádřená jako 100 % a inhibice A boxem byla vyjádřená jako procento se samotným HMGl. Výsledky účinku A boxu na uvolňování TNF z buněk RAW 264.7 jsou ukázány v Obr. 4A. Jak ukazuje Obr. 4A, A box v závislosti na dávce inhiboval HMGl indukované uvolňování TNF se zdánlivou ECS0 přibližně 7,5 pg/ml. Data v Obr. 4A jsou presentována jako průměr + SD (n = 2 - 3 nezávislé pokusy).
Příklad 6
Protein HMGl A boxu inhibuje cytokinovou aktivitu HMGl plné délky a HMGl B boxu
Antagonismus aktivity HMGl plné délky A boxem HMGl nebo GST přídatným proteinem (kontrola, vektor) byl stanoven rovněž měřením TNF uvolňování z RAW 264.7 makrofágových kultur při současném přidání A boxu s HMGl plné délky. RAW 264.7 makrofágové buňky (ATCC) byly naočkovány do 24 jamkových destiček a používány při 90 % konfluence. Na buňky se působilo HMGl nebo A boxem jak je vyznačeno po 16 hodin v Optimum I médiu (Life Technologies, Grand island, NY) v přítomnosti polymixinu B (100 jedn./ml, Sigma, St. Louis, MO) a supernatanty byly sbírány k měření TNF (myší elisa souprava od
- 48 R&D System lne., Minneapolis, MN) . TNF-indukční aktivita byla vyjádřena jako procento aktivity dosažené s HMGl samotným, výsledky těchto studií jsou ukázány v Obr. 4B. Obrázek 4B he histogram účinku HMGl samotného, A boxu samotného, kontroly vektoru samotného, HMGl v kombinaci s A boxem a HMGl v kombinaci s vektorem. Jak ukazuje Obr. 4B, HMGl A box významně zeslaboval TNF-stimulační aktivitu HMGl plné délky.
Příklad 7
HMGl A box protein inhibuje HMGl cytokinovou aktivitu navázáním
K určení, zda HMGl A box působí jako antagonista vytěsněním HMGl z vazby, k makrofágovým kulturám byl přidán 125l-značený HMGl a vazba byla měřena po 2 hodinách při 4 °C. Vazebné testy s RAW 264.7 buňkami byly prováděny jak je zde popsáno. Vazba 125l-HMGl byla měřena s RAW 264.7 buňkami nanesenými na 24-jamkové destičky v časech vyznačených v Obr. 5A. Specifická vazba se rovná celkovému s buňkami asociovanému 125l-HMGl (CPM/jamku) minus s buňkami asociované radioaktivitě CPM/jamku v přítomnosti 5 000 násobného molárního přebytku neznačeného HMGl. Obr. 5A je graf vazby 125l-HMGl v čase. Jak ukazuje Obr. 5A, HMGl vykazoval saturační vazebnou kinetiku prvního řádu. Specifita vazby byla zjišťována jak je popsáno v Příkladu 1.
Navíc: vazba 125l-HMGl byla měřena s RAW 264.7 buňkami nanesenými na 24-jamkové destičky a inkubovanými s 125l-HMGl samotným nebo v přítomnosti neznačeného HMGl A boxu. výsledky tohoto vazebného testu jsou ukázány v Obr. 5B. Data představují průměr + SEM z tří nezávislých pokusů. Obr. 5B je histogram vazby 125I-HMGl k buněčnému povrchu v nepřítomnosti neznačeného HMGBl nebo HMGBl (HMGl) A boxu, nebo v přítomnosti 5 000 násobného molárního přebytku neznačeného HMGBl nebo HMGBl A boxu, měřeno jako procento celkových CPM/jamku. Celková hodnota se rovná impulsům za minutu (CPM/jamku) s buňkami asociovaného 125i-hmg1 v nepřítomnosti neznačeného HMGBl nebo A boxu po 2 hodinách při 4 °c. HMGBl nebo A box
se rovná impulsům CPM/jamku s buňkami asociovaného 125l-HMGl v přítomnosti 5 000 násobného molárního přebytku neznačeného HMGBl nebo A boxu. Data jsou vyjádřena jako procento celkových impulsů získaných v nepřítomnosti neznačených HMGBl bílkovin (2 382 179 CPM/jamku). Tyto výsledky ukazují, že HMGl A box je kompetitivním antagonistou HMGl aktivity in vitro, jenž inhibuje TNF-stimulační aktivitu HMGl.
Příklad 8 inhibice cytokinové aktivity HMGl plné délky a HMGl B boxu polyklonálními protilátkami proti B boxu
Zjištěna byla rovněž schopnost protilátek cílených proti HMGl B boxu modulovat účinek HMGl plné délky nebo HMGl B boxu. Afinitně purifikované protilátky cílené proti HMGl B boxu (protilátky k B boxu) byly generovány jak je zde popsáno a s použitím standardních technik. K testování účinků protilátek na uvolňování TNF z RAW 264.7 buněk indukovaných HMGl nebo HMGl B boxem se na subkonfluentní RAW 264.7 buňky v 24jamkových destičkách působilo HMG-1 (1 pg/ml) nebo HMGl B boxem (10 pg/ml) po 10 hodin s nebo bez protilátek proti B boxu (25 pg/ml nebo 100 pg/ml afinitně purifikovaných s antigenem, Cocalico Biologicals, lne., Reamstown, PA) nebo s přidaným neimunním igG (25 pg/ml nebo 100 pg/ml; Sigma). Uvolňování TNF z buněk RAW 264.7 bylo měřeno s použitím biotestu L929 cytotoxicity, jak je zde popsán. Výsledky této studie jsou ukázány v obr. 6, jenž je histogramem TNF uvolněného z buněk RAW 264.7 bez dalšího podání, s podáním 1 pg/ml HMGl, 1 pg/ml HMGl plus 25 pg/ml protilátek proti B boxu, 1 pg/ml HMGl plus 25 pg/ml igG (kontrola), 10 pg/ml B boxu, 10 pg/ml B boxu plus 100 pg/ml protilátek proti B boxu, nebo 10 pg/ml B boxu plus 100 pg/ml igG (kontrola). Množství TNF uvolněného z buněk indukovaných HMGl samotným (bez přidání protilátek k B boxu) bylo bráno jako 100 %, data ukázaná v Obr. 6 jsou výsledky tří nezávislých pokusů. lak ukazuje Obr. 6, afinitně purifikované protilátky cílené proti HMGl B boxu významně inhibovaly uvolňování TNF indukované buď • · · * to * · to to ·*©· · · ·
HMGl plné délky nebo HMGl B boxem. Tyto výsledky ukazují, že k modulaci funkce HMGl lze použít protilátku.
Příklad 9
Protein B boxu HMGl je toxický pro Balb/c myši sensitizované D-galaktosaminem
Ke zkoumání, zda HMGl B box má cytokinovou aktivitu in vivo jsme podávali protein HMGl B boxu neanestetizovaným Balb/c myším sensitizovaným D-galaktosaminem (D-gal), v modelu, jenž je široce používán ke studiu toxicity cytokinů (Galanos et al., shora), ve stručnosti: Myši (20 - 25 g, samci, Harlan Sprague-Dawly, indianopolis, IN) dostaly intraperitoneální injekci D-gal (20 mg) (Sigma) a B boxu (0,1 mg/ml/myš nebo 1 mg/ml/myš) nebo bílkoviny GST (vektor, 0,1 mg/ml/myš nebo 1 mg/ml/myš), jak je vyznačeno v Tabulce 1. Přežívání myší bylo monitorováno až do 7 dnů pro přesvědčení se, že nedochází k pozdním úmrtím, výsledky této studie jsou ukázány v Tabulce 1.
Tabulka 1: Toxicita B boxu HMGl pro Balb/c myši sensitizované D-galaktosaminem
Působení ži vých/celkových
Kontrola - 10/10
vektor 0,1 mg/myš 2/2
1 mg/myš 3/3
B box 0,1 mg/myš 6/6
1 mg/myš T/Š’
p < 0,01 proti vektoru samotnému, jak je testováno Fisherovým exaktním testem • · • · ·
- 51 výsledky této, studie ukázaly, že HMGl B box je letální pro myši sensitizované D-galaktosaminem způsobem vykazujícím závislost na dávce. Ve všech případech kdy nastalo úmrtí, nastalo v průběhu 12 hodin. Létal i ta nebyla pozorována s porovnatelnými preparáty purifi kovaného vektorového proteinu GST bez B boxu.
Příklad 10
Histologie Balb/c myší sensitizovaných D-galaktosaminem nebo C3H/Hej myší po podání proteinu HMGl B boxu
K dalšímu zjišťování létal i ty proteinu HMGl B boxu in vivo byl HMGl B box znovu podáván Balb/c myším sensitizovaným D-galaktosaminem. Myši (3 na skupinu) dostaly D-gal (20 mg/myš) plus B box nebo vektor (1 mg/myš) intraperitoneálně na 7 hodin a pak byly utraceny dekapitací. Byla odebrána krev a vyňaty a 10 %-ním formaldehydem fixovány orgány (játra, srdce, ledviny a plíce). Tkáňové řezy byly pro histologické hodnocení připraveny hematoxylinovým a eosinovým barvením (Criterion lne., Vancouver, Kanada), výsledky těchto studií jsou ukázány v obr. 7A - 73, což jsou skenované obrazy hematoxylinem a eosinem barvených řezů ledvin (obr. 7A), myokardu (Obr. 7C), plic (Obr. 7E) a jater (Obr. 7G a 71) získaných ze zvířat bez působení a řezů ledvin (Obr. 7B), myokardu (Obr. 7D), plic (Obr. 7F) a jater (Obr. 7H a 73) získaných ze zvířat po působení HMGl B boxu. ve srovnání s kontrolními myšmi, působení B boxu nezpůsobovalo žádné abnormality v játrech (Obr. 7A a 7B) a plicích (obr. 7E a 7F). Tyto myši měly určité ischemické změny a ztrátu křížové striace v srdci ve vláknech myokardu (Obr. 7C a 7D, jak je vyznačeno šipkou v Obr. 7D). 3átra vykazovala většinu poškození B boxem, jak ilustruje aktivní hepatitida (Obr. 7G 73). v obr. 73 je vidět odpadlé hepatocyty obklopené nahromaděnými polymorfojadernými leukocyty. Šipka v Obr. 73 míří na místa polymorfojaderného hromadění (tečkované) a apoptických hepatocytů (plnou čarou). Podávání HMGl B boxu in
- 52 ··· · ···· · · · · • · · ···· '» · ····· ·· · · *· vivo rovněž významně stimulovalo zvýšené sérové hladiny IL-6 (315 + 93 vs. 20+7 pg/ml, B box vs. kontrola p < 0,05).
Podávání proteinu HMGl B boxu myším C3H/Hel (jež nemají odezvu na endotoxin) bylo rovněž letální, což ukazuje, že HMGl B box je letální v nepřítomnosti LPS signální transdukce. Hematoxylinem a eosinem barvené řezy tkání plic a ledvin odebraných 8 hodin po podání B boxu neodhal ují žádné abnormální morfologické změny. Prohlídka řezů ze srdce však odhaluje důkazy ischemie se ztrátou křížové striace spojené s amorfní růžovou cytoplasmou ve vláknech myokardu. Řezy z jater ukázaly mírné akutní zánětlivé odezvy, s trochou odpadlých hepatocytů a apoptosy, a jednotlivými polymorfojadernými leukocyty. Tyto specfické morfologické změny byly srovnatelné se změnami po podání HMGl plné délky a potvrdily, že B box samotný může rekapitulovat letální patologickou odezvu na HMGl in vivo.
Ke zjištění, zda TNF-stimulující aktivta HMGl přispívá ke zprostředkování létal i ty B boxu, jsme měřili létal i tu u myší s TNF knock-out (TNF-KO, Nowak et al., Am. J. Physiol. Reg. Integr. Comp. Physiol. 278: R1202-R1209, 2000) a kontrol divokého typu (kmen B6xl29) sensitizovaných D-galaktosaminem (20 mg/myš) a vystavených B boxu (1 mg/myš, intraperitoneálně). B box byl vysoce letální pro myši divokého typu (6 úmrtí z 9 vystavených), ale lata!i ta nebyla pozorována u TNF-KO myší, na něž se působilo B boxem (0 úmrtí z 9 vystavených, p < 0,05 proti divokému typu). Dohromady s daty zkultur makrofágů RAW 254.7, zde popsanými, tato data pak ukazují, že B boxu HMGl je přiřazena TNF-stimulující cytokinová aktivita.
Příklad 11
Hladina proteinu HMGl je zvýšena u septických myší
Ke zkoumání role HMGl v sepsi jsme ustavili sepsi u myší a měřily sérový HMGl s použitím kvantitativního imunotestu popsaného dříve (Wang et al., shora). Myši byly podrobeny cékálnímu podvázání a punkci (CLP), dobře charakterizovanému
- 53 modelu sepse způsobené perforací a chirurgicky vytvořenému cékálnímu divertikulu, jež vedou k polymikrobiální peritonitidě a sepsi (Fink a Heard, shora; Wichmann et al., shora; a Remick et al., shora). Pak byly měřeny hladiny HMGl v séru (wang et al., shora), obrázek 8 ukazuje výsledky této studie v grafu, jenž ilustruje hladiny HMGl u myší 0 hodin, 8 hodin, 18 hodin, 24 hodin, 48 hodin a 72 hodin po podrobení CLP. Jak ukazuje Obr. 8, sérové hladiny HMGl nebyly významně zvýšeny po prvních osm hodin po cékální perforaci, pak se významně zvýšily po 18 hodinách (Obr. 8). zvýšený sérový HMGl zůstal na hladině zvýšeného plato po přinejmenším 72 hodin po CLP, kinetický profil je dost podobný dříve popsané zpožděné kinetice HMGl u endotoxemie (Wang et al., shora). Tento časový průběh uvolňování HMGl věrně odpovídá vývoji známek sepse v daných myších. V průběhu prvních osmi hodin po cékální perforaci byla zvířata shledána mírně nemocnými, se snížením aktivity a ztrátou vyhledávacího chování. Během následujících 18 hodin se stala zvířata těžce nemocnými, choulila se se zježenou srstí ve skupinách, nevyhledávala vodu nebo potravu a stávala se jen minimálně responsivními k vnějším podnětům nebo k prohlížení ošetřovatelem.
Příklad 12
Léčba septických myší proteinem HMGl A boxu zvyšuje přežití myší κ určení, zda HMGl A box může inhibovat létal i tu HMGl v průběhu sepse, byly myši podrobeny cékální perforaci a léčeny podáváním A boxu počínaje 24 hodinou po nástupu sepse. CLP se provedlo na samcích Balb/c myší jak je zde popsáno. Zvířata byla náhodně dána do skupin o 15 - 25 myších. HMGl A box (pokaždé 60 nebo 600 pg/ myš) nebo vektor (přídatný GST, 600 pg/ myš) samotný byly podávány intraperitoneálně dvakrát za den po tři dny, počínaje 24 hodin po CLP. Přežívání bylo monitorováno dvakrát za den až po 2 týdny, k přesvědčení se, že nedochází k pozdním úmrtím, výsledky této studie jsou ilustrovány v Obr. 9, což je graf účinku vektoru (GST;
• · • · ·
- 54 kontrola) 60 pg/myš nebo 600 pg/myš na přežívání v průběhu času (*P < 0,03 vs. kontrola, jak bylo testováno Fisherovým exaktním testem). Jak ukazuje Obr. 9, podávání HMGl A boxu významně chránilo myši před letálními účinky sepse a zlepšovalo přežívání z 28 % u zvířat, na něž se působilo bílkovinou purifikovanou z vektorové bílkoviny (GST) bez A boxu, na 68 % u zvířat, jež dostala A box (P < 0,03 podle Fisherova exaktního testu). Ochranné účinky HMGl A boxu u této modelové sepse byly závislé na dávce A boxu; u zvířat, na něž se působilo 600 pg/myš A boxu bylo pozorována, že jsou významně čilejší, aktivnější a že se jim více navrací žravé chování ve srovnání jak s kontrolou, na niž se působilo preparáty odvozenými z vektoru, tak se zvířaty, na něž se působilo jen 60 pg/myš A boxu. Posledně zmíněná zvířata zůstávala těžce nemocná, s potlačenou aktivitou a krmením se po několik dní, a většina zemřela.
Příklad 13
Působení anti-HMGl protilátkou na septická zvířata zvyšuje přežívání myší
Pasivní imunizace kriticky nemocných septických myší anti-HMGl protilátkami byla rovněž hodnocena. V této studii byli samci Balb/c myší (20 - 25 gramů) podrobeni CLP, jak je zde popsáno. Afinitně purifi kovaná polyklonální protilátka proti HMGl B boxu nebo králičí igG (jako kontrola) byly podávány v 600 pg/myš počínaje 24 hodin po chirurgickém zákroku a dvakrát denně po 3 dny. Přežívání bylo monitorováno po 2 týdny, výsledky této studie jsou ukázány v Obr. 10A, což je graf přežívání septických myší, na něž se působilo buď kontrolní protilátkou, anebo anti-HMGl protilátkou. Výsledky ukazují, že anti-HMGl protilátky podávané myším 24 hodin po nástupu cékální perforace významně chrání zvířata před úmrtím v porovnání s podáváním neimunních protilátek (p < 0,02 podle Fisherova exaktního testu). V průběhu 12 hodin po podání anti-HMGl protilátek vykazovala zvířata, na něž se působilo, zvýšenou aktivitu a reaktivnost ve srovnání s kontrolami, jež
- 55 ·«· ··· · * · • ··· · ···· · · · dostaly neimunní protilátky, zatímco zvířata, na něž se působilo neimunními protilátkami se dále choulila, špatně udržoval a zůstávala neaktivní, léčená zvířata se významně zlepšila a v průběhu 48 hodin se navrátila k žravému chování, v tomto modelu anti-HMGl protilátky nepotlačovaly bakteriální proliferaci, protože jsme pozorovali srovnatelné počty bakterií (CFU, jednotky tvorby kolonií za aerobních podmínek) ze slezin 31 hodin po CLP u léčených zvířat v porovnání se zvířaty, jež dostala irelevantní protilátky (kontrolní počty bakterií = 3,5 + 0,9 x 104 CFU/g; n = 7). Zvířata byla monitorována po 2 týdny poté, a pozdní úmrtí nebyla pozorována, což ukazuje, že působením anti-HMGl došlo k úplné záchraně před letální sepsí, a ne pouze k oddálení úmrtí.
Pokud víme, žádné specifické, k cytokinům směrované therapeutikum není tak účinné při podávání tak pozdně po nástupu sepse. Pro porovnání: Podávání anti-TNF protilátek ve skutečnosti zvyšovalo u tohoto modelu mortalitu, a anti-MlF protilátky byly neúčinné, když se podávaly víc než 8 hodin po cékální perforaci (Remick et al., shora, a Calandra et al., Nátuře Med. 6: 164-170, 2000). Tato data prokazují, že pro záchranu letálních případů rozvinuté sepse je možné zacílit HMGl tak pozdně, jako je 24 hodin po cékální perforaci.
v jiném příkladu záchrany endotoxemických myší s použitím anti-B box protilátek, byly protilátky proti HMGl B boxu hodnoceny na schopnost zachraňovat LPS-indukované septické myši. Na samce Balb/c myší (20 - 25 gramů, 26 na skupinu) se působilo LD75 dávkou LPS (15 mg/kg) injikovanou intraperitoneálně (IP). Anti-HMGl B box nebo neiumunní králičí sérum (0,3 ml na myš pokaždé, IP) byly podávány v čase 0, +12 hodin a +24 hodin po podání LPS. Bylo hodnoceno přežívání myší v čase. výsledky této studie jsou ukázány v obr. 10B, což je graf přežívání septických myší, jimž se podávaly anti-HMGl B box protilátky nebo neimunní sérum. Jak je ukázáno v Obr. 10b, anti-HMGl B box protilátky zlepšovaly přežití septických myší.
- 56 Příklad 14
Inhibice HMGl signální dráhy s použitím anti-RAGE protilátek
Předchozí data implikovala RAGE jako HMGl receptor, jenž může zprostředkovávat odrůstání neuritů v průběhu vývoje mozku a migraci buněk hladkého svalu u hojení ran (Hoři et al.,
J. Biol. Chem. 270: 25752 - 25761, 1995; Merenmies et al. ,
J. Biol. Chem. 266: 16722 - 16729, 1991; a Degryse et al.,
J. Cell Biol. 152: 1197 - 1206, 2001). Měřili jsme uvolňování TNF v kulturách RAW 264.7 stimulovaných HMGl (1 pg/ml), LPS (0,1 pg/ml), nebo HMGl B boxem (1 pg/ml) v přítomnosti anti-RAGE protilátky (25 pg/ml) nebo neimunních igG (25 pg/ml). ve stručnosti: Buňky byly naočkovány do
24-jamkových destiček a používány při 90 % konfluence. LPS (£. coli 0111 :B4, Sigma st. Louis, MO) byl sonikován 20 min. před použitím. Na buňky se působilo HMGl (1 pg/ml), LPS (0,1 pg/ml), nebo HMGl B boxem (1 pg/ml) v přítomnosti anti-RAGE protilátky (25 pg/ml) nebo neimunních igG (25 pg/ml) jak je vyznačeno v Obr. 11A po 16 hodin v bezsérovém médiu Opti-MEM I (Life Technologies) a supernatanty byly odebrány k měření TNF s použitím biotestu L929 cytotoxicity, jak je zde popsán. igG čištěná polyklonální anti-RAGE protilátka (kat. čís. sc-8230, N-16, Santa Cruz Biotech, lne., Santa Cruz, CA) byla před použitím extensivně dialyzována proti PBS. výsledky této studie jsou ukázány c v Obr. llA.což je histogram účinků HMGl, LPS nebo HMGl B boxu v přítomnosti anti-RAGE protilátek nebo neimunních IgG (kontrola) na uvolňování TNF z buněk RAW 264.7. Jak ukazuje Obr. 11A, ve srovnání s neimunním IgG inhibovala anti-RAGE protilátka významně uvolňování TNF indukované HMGl B boxem.Toto potlačení bylo specifické, protože anti-RAGE neinhibovala významně uvolňování TNF stimulované LPS. Za zaznamenání stojí, že nejvyšší inhibiční účinek anti-RAGE snižoval HMG-1 signalizaci je o 40 %, což napovídá, že v HMGl signalizaci mohou participovat jiné dráhy transdukce signálu.
Ke zkoumání účinků HMGl nebo HMGl B boxu na NF-kB-dependentním ELÁM promotoru byly prováděny následujjící
- 57 pokusy: Makrofágy RAW 264.7 byly transientně kotransekovány plasmidem exprese kódujícím myší MyD 88 dominantně negativní (DN) mutant (jenž odpovídá aminokyselinám 146 - 296) nebo prázdným vektorem, plus luciterasovým reportérovým plasmidem pod kontrolou NF-kB-dependentního ELÁM promotoru, jak je popsáno Meansem et al. , (3. Immunol. 166: 4074 - 4082, 2001). Část buněk byla stimulována po 5 hodin HMGl plné délky (100 ng/ml), nebo purifikovaným HMGl B boxem (10 pg/ml). Buňky pak byly sklizeny a měřena luciferasová aktivita s použitím standardních metod. Všechny transfekce byly prováděny v triplikátech, opakovány alespoň třikrát, a jednotlivý representativní pokus je ukázán v obr. 11B. 3ak ukazuje Obr. llB, HMGl stimuloval luciterasovou aktivitu ve vzorcích, jež nebyly kotransfekovány MyD 88 dominantně negativním, a hladina stimulace byla snížena ve vzorcích, jež byly kotransfekovány MyD 88 dominantně negativním. Tento účinek byl pozorován rovněž ve vzorcích, jimž byl podán HMG B box.
Rovněž zkoumán byl účinek HMGl nebo HMGl B boxu na NF-kB aktivaci. Reportérové buněčné linie CHO, jež konstitutivně exprimovaly lidský Toll-podobný receptor 2 (TLR2) nebo Tollpodobný receptor 4 (TLR4), byly dříve popsány (Means et al. ,
3. Immunology 163: 3920-3927, 1999). Tyto reportérové linie obsahují rovněž stabilně transfekovaný ELAM-CD25 reportérový gen, a exprimují na svůj povrch CD25 jako důsledek NF-kB aktivace. Buňky CHO/TLR2 a CHO/TLR4 byly stimulovány po 18 hodin IL-1 (10 ng/ml), purifikovaným HMG-1 plné délky (100 ng/ml) nebo puntíkovaným B boxem (10 pg/ml). Následně po stimulaci byly buňky barveny PE-značenou anti-CD25 monoklonální protilátkou a exprese CD25 na povrch byla měřena průtokovou cytometrií. výsledky této studie jsou ukázány v obr. llc. Data jsou vyjádřena jako poměr (násobek aktivace) procent CD25+ buněk v nestimulovaných a stimulovaných buněčných populacích, jež prošly za vyloučení nejnižších 5 % buněk na základě střední FLl fluorescence. U buněk CHO/TLR4 stimulace jak HMGl, tak HMGl B boxem vedla ke snížení exprese CD25 ve srovnání se vzorky CHO/TLR2.
Stanoven byl rovněž účinek anti-RAGE protilátek a kombinace anti-RAGE protilátek a anti-TLR2 protilátek nebo igG • · · • · · • · · ·
- 58 na HMG-l-zprostředkované uvolňování TNF z RAW 264.7 buněk. Buňky RAW 264.7 byly naočkovány do 24-jamkových destiček a používány při 90 % konfluence. Buňky byly po 16 hodin inkubovány s HMG-1 a s nebo bez anti-RAGE protilátky (kat. čís. sc-8230, Santa Cruz Biotech, Inc., Santa Cruz, CA), anti-TLR2 protilátky (afinitně purifikované polyklonální protilátky, (kat. čís. sc-12504, D17, Santa Cruz) nebo igG (neimunní igG, Sigma St. Louis, MO) v médiu Optimum I (Life Technologies, Grand island, NY) v přítomnosti polymixinu B (100 jedn./ml, Sigma, St. Louis, MO). Byla sebrána kondicionovaná média a provedena TNF elisa s použitím standardních ELISA metod. Data (n = 3) jsou vyjádřena jako procento aktivity dosažené se samotným HMG-1. Výsledky této studie jsou ukázány v Obr. 11D. lak anti-RAGE, tak anti-TLR-2 protilátky inhibovaly významně (p < 0,05) HMG-1 zprostředkované uvolňování TNF. Kombinace dvou protiláek měla aditivní účinek v inhibici uvolňování TNF, zatímco igG byly i relevantní.
i když tento vynález byl konkrétně předveden a popsán s odkazy na svá výhodná provedení, osoby zběhlé v oboru pochopí, že lze provádět různé změny ve formě a detailech bez vzdálení se rozsahu vynálezu zahrnutého v připojených nárocích.

Claims (24)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Polypeptid obsahující A box obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG) nebo přirozeně se nevyskytující HMG A box, jenž může inhibovat uvolňování cytokinu podporujícího zánět z obratlovčí buňky, na niž se působí proteinem skupiny o vysoké mobilitě (HMG).
  2. 2. Polypeptid, přičemž polypeptidem je biologicky aktivní fragment A boxu obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG) nebo biologicky aktivní fragment přirozeně se nevyskytujícího HMG A boxu, jenž může inhibovat uvolňování cytokinu podporujícího zánět z obratlovčí buňky, na niž se působí proteinem skupiny o vysoké mobilitě (HMG).
  3. 3. Farmaceutický prostředek vyznačující se t i m, že obsahuje polypeptid obsahující A box obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG) nebo přirozeně se nevyskytující HMG A box, jenž může inhibovat uvolňování cytokinu podporujícího zánět z obratlovčí buňky, na niž se působí proteinem skupiny o vysoké mobilitě (HMG) ve farmaceuticky přijatelném excipientů.
  4. 4. Farmaceutický prostředek vyznačující se t i m, že obsahuje polypeptid, přičemž polypeptidem je biologicky aktivní fragment A boxu obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG) nebo biologicky aktivní fragment přirozeně se nevyskytujícího HMG A boxu, jenž může inhibovat uvolňování cytokinu podporujícího zánět z obratlovčí buňky, na niž se působí proteinem skupiny o vysoké mobilitě (HMG) ve farmaceuticky přijatelném excipientů.
    - 60 • · · · · · · • · · · · · • ···· · ·*· • · · «4
  5. 5. Purifikovaný preparát protilátek vyznačujících se t i m, že se specificky vážou k B boxu obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG), ale nevážou se specificky k non-B box epitopům HMG, přičemž tyto protilátky mohou inhibovat uvolňování cytokinů podporujícího zánět z obratlovčí buňky, na niž se působí proteinem skupiny o vysoké mobi1 i tě (HMG).
  6. 6. Farmaceutický prostředek vyznačující se t i m, že obsahuje purifikovaný preparát protilátek, jež se specificky vážou k B boxu obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG), ale nevážou se specificky k non-B box epitopům HMG, ve farmaceuticky přijatelném excipientu, přičemž tyto protilátky mohou inhibovat uvolňování cytokinů podporujícího zánět z obratlovčí buňky, na niž se působí proteinem skupiny o vysoké mobilitě (HMG).
  7. 7. Polypeptid obsahující B box obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG) nebo přirozeně se nevyskytující HMG B box, ale neobsahující HMG plné délky, přičemž tento polypeptid může způsobovat uvolňování cytokinů podporujícího zánět z obratlovčí buňky.
  8. 8. Polypeptid, přičemž polypeptidem je biologicky aktivní fragment B boxu obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG) nebo biologicky aktivní fragment přirozeně se nevyskytujícího HMG B boxu. ,
  9. 9. Vektor vyznačující se tím, že kóduje polypeptid obsahující B box obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG) nebo přirozeně se nevyskytující HMG B box, ale neobsahující HMG plné délky, přičemž tento polypeptid může způsobovat uvolňování cytokinů podporujícího zánět z obratlovčí buňky.
    - 61
  10. 10. Vektor vyznačující se tím, že kóduje polypeptid, přičemž polypeptidem je biologicky aktivní fragment B boxu obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG) nebo biologicky aktivní fragment přirozeně se nevyskytujícího HMG B boxu a tento polypeptid může způsobovat uvolňování cytokinů podporujícího zánět z obratlovčí buňky.
  11. 11. Způsob inhibice uvolňování cytokinů podporujícího zánět ze savčí buňky vyznačující se tím, že zahrnuje působení na buňku určitým množstvím purifikovaného preparátu protilátek, jež se specificky vážou k B boxu obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG), ale nevážou se specificky k non-B box epitopům HMG.
  12. 12. Způsob inhibice uvolňování cytokinů podporujícího zánět ze savčí buňky vyznačující se tím, že zahrnuje působení na buňku polypeptidem obsahujícím A box obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG) nebo přirozeně se nevyskytující HMG A box, jenž může inhibovat uvolňování cytokinů podporujícího zánět z obratlovčí buňky, na niž se působí proteinem skupiny o vysoké mobilitě (HMG), v množství dostatečném k inhibici uvolňování cytokinů podporujícího zánět z buňky.
  13. 13. Způsob inhibice uvolňování cytokinů podporujícího zánět ze savčí buňky vyznačující se tím, že zahrnuje působení na buňku polypeptidem, přičemž tímto polypeptidem je biologicky aktivní fragment A boxu obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG) nebo biologicky aktivní fragment přirozeně se nevyskytujícího hmg A boxu, jenž může inhibovat uvolňování cytokinů podporujícího zánět z obratlovčí buňky, na niž se působí proteinem skupiny o vysoké mobilitě (HMG), v množství dostatečném k inhibici uvolňování cytokinů podporujícího zánět z buňky.
    - 62
  14. 14. Způsob léčby stavu pacienta charakterizovaného aktivací kaskády zánětlivých cytokinů vyznačující se t i m, že zahrnuje podávání purifi kovaného preparátu protilátek, jež se specificky vážou k B boxu obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG), ale nevážou se specificky k non-B box epitopům HMG, pacientovi v množství dostatečném k inhibici kaskády zánětlivých cytokinů.
  15. 15. Způsob léčby stavu pacienta charakterizovaného aktivací kaskády zánětlivých cytokinů vyznačující se t i m, že zahrnuje podávání polypeptidu obsahujícího A box obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG) nebo přirozeně se nevyskytující HMG A box, jenž může inhibovat uvolňování cytokinů podporujícího zánět z obratlovčí buňky, na niž se působí proteinem skupiny o vysoké mobilitě (HMG), pacientovi v množství dostatečném k inhibici uvolňování cytokinů podporujícího zánět z buňky.
  16. 16. způsob léčby stavu pacienta charakterizovaného aktivací kaskády zánětlivých cytokinů vyznačující se t i m, že zahrnuje podávání polypeptidu, přičemž tímto polypeptidem je biologicky aktivní fragment A boxu obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG) nebo biologicky aktivní fragment přirozeně se nevyskytujícího HMG A boxu, jenž může inhibovat uvolňování cytokinů podporujícího zánět z obratlovčí buňky, na niž se působí proteinem skupiny o vysoké mobilitě (HMG), pacientovi v množství dostatečném k inhibici uvolňování cytokinů podporujícího zánět z buňky.
    - 63 ····· ·» · · ·· ·
  17. 17. Způsob stimulace uvolňování cytokinu podporujícího zánět z buňky vyznačující se tím, že zahrnuje působení na buňku polypeptidem obsahujícím B box obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG) nebo přirozeně se nevyskytující HMG B box, ale neobsahujícím HMG plné délky, v množství dostatečném ke stimulaci uvolňování cytokinu podporujícího zánět z buňky.
  18. 18. Způsob stimulace uvolňování cytokinu podporujícího zánět z buňky vyznačující se tím, že zahrnuje působení na buňku polypeptidem, přičemž tímto polypeptidem je biologicky aktivní fragment B boxu obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG) nebo biologicky aktivní fragment přirozeně se nevyskytujícího HMG B boxu, v množství dostatečném ke stimulaci uvolňování cytokinu podporujícího zánět z buňky.
  19. 19. způsob stimulace uvolňování cytokinu podporujícího zánět z buňky vyznačující se tím, že zahrnuje působení na buňku vektorem kódujícím polypeptid obsahující B box obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG) nebo přirozeně se nevyskytující HMG B box, ale neobsahující HMG plné délky, v množství dostatečném ke stimulaci uvolňování cytokinu podporujícího zánět z buňky.
  20. 20. Způsob stimulace uvolňování cytokinu podporujícího zánět z buňky vyznačující se tím, že zahrnuje působení na buňku vektorem kódujícím polypeptid, přičemž tímto polypeptidem je biologicky aktivní fragment B boxu obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG) nebo biologicky aktivní fragment přirozeně se nevyskytujícího HMG B boxu, v množství dostatečném ke stimulaci uvolňování cytokinu podporujícího zánět z buňky.
    - 64
  21. 21. Způsob ovlivnění ztráty tělesné hmotnosti nebo léčby obesity pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje podávání účinného množství polypeptidů obsahujícího B box obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG) nebo přirozeně se nevyskytující HMG B box, ale neobsahujícího HMG plné délky, pacientovi v množství dostatečném ke stimulaci uvolňování cytokinů podporujícího zánět z buňky.
  22. 22. způsob ovlivnění ztráty tělesné hmotnosti nebo léčby obesity pacienta vyznačující se tím, že zahrnuje podávání účinného množství polypeptidů, přičemž tímto polypeptidem je biologicky aktivní fragment B boxu obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG) nebo biologicky aktivní fragment přirozeně se nevyskytujícího HMG B boxu, pacientovi v množství dostatečném ke stimulaci uvolňování cytokinů podporujícího zánět z buňky.
  23. 23. způsob stanovení, zda sloučenina inhibuje zánět, vyznačující se tím, že zahrnuje sestavení systému ze sloučeniny a z
    a) buňky, jež uvolňuje cytokin podporující zánět při vystavení B boxu obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (HMG); a
    b) HMG B boxu, a poté stanovení, zda sloučenina inhibuje uvolňování cytokinů podporujícího zánět z buňky.
  24. 24. Způsob stanovení, zda sloučenina inhibuje zánět, vyznačující se t í ni, že zahrnuje sestavení systému ze sloučeniny a z
    a) buňky, jež uvolňuje cytokin podporující zánět při vystavení B boxu obratlovčího proteinu skupiny o vysoké mobilitě (hmg) nebo jeho biologicky aktivního fragmentu; a
    b) hmg B boxu nebo jeho biologicky aktivního fragmentu, a poté stanovení, zda sloučenina inhibuje uvolňování cytokinu podporujícího zánět z buňky.
CZ20033402A 2001-05-15 2002-05-15 Použití fragmentů HMG jako protizánětlivých činidel CZ20033402A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29103401P 2001-05-15 2001-05-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20033402A3 true CZ20033402A3 (cs) 2004-10-13

Family

ID=23118552

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20033402A CZ20033402A3 (cs) 2001-05-15 2002-05-15 Použití fragmentů HMG jako protizánětlivých činidel

Country Status (18)

Country Link
US (2) US20030060410A1 (cs)
EP (1) EP1392844A4 (cs)
JP (1) JP2005512507A (cs)
KR (1) KR20040018370A (cs)
CN (1) CN100447154C (cs)
AU (1) AU2002309829B2 (cs)
BR (1) BR0209689A (cs)
CA (1) CA2447576C (cs)
CZ (1) CZ20033402A3 (cs)
HU (1) HUP0500042A3 (cs)
IL (3) IL158643A0 (cs)
IS (1) IS7037A (cs)
MX (1) MXPA03010449A (cs)
NO (1) NO20035087L (cs)
NZ (1) NZ529423A (cs)
PL (1) PL367132A1 (cs)
SK (1) SK15422003A3 (cs)
WO (1) WO2002092004A2 (cs)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6303321B1 (en) * 1999-02-11 2001-10-16 North Shore-Long Island Jewish Research Institute Methods for diagnosing sepsis
US7151082B2 (en) 1999-02-11 2006-12-19 The Feinstein Institute For Medical Research Antagonists of HMG1 for treating inflammatory conditions
US7754217B2 (en) * 2001-03-16 2010-07-13 Bio3 Research Srl HMGB1 protein inhibitors and/or antagonists for the treatment of vascular diseases
US7304034B2 (en) 2001-05-15 2007-12-04 The Feinstein Institute For Medical Research Use of HMGB fragments as anti-inflammatory agents
US7220723B2 (en) * 2001-05-15 2007-05-22 The Feinstein Institute For Medical Research Inhibitors of the interaction between HMGB polypeptides and toll-like receptor 2 as anti-inflammatory agents
EP1519957B1 (en) * 2002-07-03 2009-03-04 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Use of hmgb1 in the treatment of tissue damage and/or to promote tissue repair
US20040156851A1 (en) * 2002-11-20 2004-08-12 Critical Therapeutics, Inc. HMGB1 combination therapies
US20040141948A1 (en) * 2002-11-20 2004-07-22 Critical Therapeutics, Inc. Use of HMGB fragments as anti-inflammatory agents
EP1567544A4 (en) * 2002-11-20 2009-07-22 Long Island Jewish Res Inst USE OF HMGB POLYPEPTIDES TO INCREASE IMMUNE RESPONSES
PT1949901E (pt) * 2002-12-06 2014-05-23 The Feinstein Inst Medical Res Método para a determinação de um agonista colinérgico selectivo para um receptor nicotínico alfa 7
US20090069227A9 (en) * 2003-04-29 2009-03-12 Capogrossi Maurizio C Use of HMGB1 to promote stem cell migration and/or proliferation
US7696169B2 (en) 2003-06-06 2010-04-13 The Feinstein Institute For Medical Research Inhibitors of the interaction between HMGB polypeptides and toll-like receptor 2 as anti-inflammatory agents
WO2005025604A2 (en) * 2003-09-10 2005-03-24 The General Hospital Corporation Use of hmgb and hmgb fragments to decrease specific immune response
CA2538763C (en) * 2003-09-11 2015-05-05 Critical Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies against hmgb1
WO2006083301A2 (en) 2004-06-17 2006-08-10 Medimmune, Inc. Immunogenic compositions comprising hmgb1 polypeptides
WO2006012415A2 (en) 2004-07-20 2006-02-02 Critical Therapeutics, Inc. Rage protein derivatives
WO2006012373A2 (en) * 2004-07-20 2006-02-02 Critical Therapeutics, Inc. Combination therapies of hmgb and complement inhibitors against inflammation
BRPI0514835A (pt) 2004-09-03 2008-06-24 Creabilis Therapeutics Spa variante de polipetìdeo de box de domìnio de ligação por alta afinidade de hmbg1 humano e/ou não humano ou de fragmento biologicamente ativo de box-a de hmgb1, molécula de ácido nucléico, uso, composição farmacêutica e dispositivo médico
AU2005333602B2 (en) * 2004-10-22 2012-04-12 Medimmune, Llc High affinity antibodies against HMGB1 and methods of use thereof
US8129130B2 (en) 2004-10-22 2012-03-06 The Feinstein Institute For Medical Research High affinity antibodies against HMGB1 and methods of use thereof
EP1899376A2 (en) 2005-06-16 2008-03-19 The Feinstein Institute for Medical Research Antibodies against hmgb1 and fragments thereof
EP1909834A2 (en) * 2005-07-18 2008-04-16 Critical Therapeutics, Inc. Use of hmgb1 antagonists for the treatment of inflammatory skin conditions
US20100172909A1 (en) * 2005-10-24 2010-07-08 Masahiro Nishibori Cerebral edema suppressant
JP3876325B1 (ja) * 2005-10-24 2007-01-31 国立大学法人 岡山大学 脳梗塞抑制剤
AU2006330807A1 (en) * 2005-11-28 2007-07-05 Medimmune, Llc Antagonists of HMBG1 and/or rage and methods of use thereof
US7829097B2 (en) * 2006-02-06 2010-11-09 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Use of HMGB1 for protection against ischemia reperfusion injury
WO2007102410A1 (ja) * 2006-02-24 2007-09-13 National University Corporation Kanazawa University Rageポリペプチドの新規用途
JP3882090B1 (ja) 2006-05-19 2007-02-14 国立大学法人 岡山大学 脳血管攣縮抑制剤
SI2068935T1 (sl) * 2006-09-15 2011-07-29 Creabilis Therapeutics S R L Polimerni konjugati od Box-A od HMGB1 in Box-A variante od HMGB1
EP2068935B8 (en) * 2006-09-15 2011-09-14 Creabilis Therapeutics s.r.l. Polymer conjugates of box-a of hmgb1 and box-a variants of hmgb1
JP5285437B2 (ja) * 2007-02-15 2013-09-11 学校法人福岡大学 抗ｈｍｇｂ−１抗体を含む臓器移植拒絶抑制剤
US8470325B2 (en) * 2007-02-15 2013-06-25 Kagoshima University Method of treating amykloidosis comprising administering an anti-HMGB-1 antibody
TW200900077A (en) * 2007-02-15 2009-01-01 Univ Kyushu Nat Univ Corp Therapeutic agent for interstitial pulmonary disease comprising anti-HMGB-1 antibody
JP5660889B2 (ja) 2008-04-30 2015-01-28 株式会社ジェノミックス 末梢循環への骨髄由来多能性幹細胞動員薬
JP5676253B2 (ja) 2008-04-30 2015-02-25 株式会社ジェノミックス 生体内機能的細胞の高効率採取法
JP5467313B2 (ja) 2009-09-28 2014-04-09 国立大学法人 岡山大学 アテローム動脈硬化抑制剤
RU2599448C2 (ru) 2009-10-28 2016-10-10 Дженомикс Ко., Лтд. Средства для стимуляции регенерации тканей путем привлечения мезенхимных стволовых клеток и/или плюрипотентных стволовых клеток костного мозга в кровь
EA023058B1 (ru) 2010-01-21 2016-04-29 Дзе Борд Оф Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Арканзас Вакцинные векторы и способы усиления иммунных ответов
KR102007132B1 (ko) 2010-06-09 2019-08-05 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 아칸소 캄필로박터 감염을 감소시키기 위한 백신 및 방법
JP6012603B2 (ja) * 2010-09-09 2016-10-25 ユニバーシティー オブ サザン カリフォルニア バイオフィルムを除去するための組成物および方法
CN103687946B (zh) 2011-04-26 2017-05-03 吉诺米克斯股份有限公司 用于诱导组织再生的肽及其应用
WO2012170742A2 (en) 2011-06-07 2012-12-13 University Of Hawaii Treatment and prevention of cancer with hmgb1 antagonists
WO2012170740A2 (en) * 2011-06-07 2012-12-13 University Of Hawaii Biomarker of asbestos exposure and mesothelioma
DK2913059T3 (en) * 2012-10-25 2018-06-25 Genomix Co Ltd Hitherto UNKNOWN PROCEDURE FOR TREATMENT OF SPINE INJURY USING HMGB1 FRAGMENT
SG11201503236RA (en) 2012-10-25 2015-06-29 Genomix Co Ltd Novel method for treating cardiac infarction using hmgb1 fragment
EP3610887B8 (en) 2013-02-14 2024-01-24 The Board of Trustees of the University of Arkansas Compositions and methods of enhancing immune responses to eimeria or limiting eimeria infection
BR112015023024B1 (pt) 2013-03-15 2022-04-19 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Vetor de vacina e composições farmacêuticas compreendendo o mesmo
US11274144B2 (en) 2013-06-13 2022-03-15 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Compositions and methods for the removal of biofilms
US9745366B2 (en) 2013-09-23 2017-08-29 University Of Southern California Compositions and methods for the prevention of microbial infections
US10233234B2 (en) 2014-01-13 2019-03-19 Trellis Bioscience, Llc Binding moieties for biofilm remediation
US11248040B2 (en) 2013-09-26 2022-02-15 Trellis Bioscience, Llc Binding moieties for biofilm remediation
GB201508337D0 (en) 2015-05-15 2015-06-24 Hmgbiotech S R L Novel peptides
US10940204B2 (en) 2015-07-31 2021-03-09 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Peptides and antibodies for the removal of biofilms
SG11201809686SA (en) 2016-05-03 2018-11-29 Univ Arkansas Yeast vaccine vector including immunostimulatory and antigenic polypeptides and methods of using the same
WO2018139562A1 (ja) 2017-01-27 2018-08-02 株式会社ジェノミックス 心筋症、陳旧性心筋梗塞および慢性心不全の治療薬
CA3056088A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Composition and methods for disruption of bacterial biofilms without accompanying inflammation
WO2019107530A1 (ja) 2017-12-01 2019-06-06 株式会社ステムリム 炎症性腸疾患の治療薬
CN113203857B (zh) * 2021-05-06 2021-12-31 上海奕检医学检验实验室有限公司 一种肿瘤诊断试剂盒

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US144201A (en) * 1873-11-04 Improvement in volute springs
US53841A (en) * 1866-04-10 Improvement in measuring-funnels
US60410A (en) * 1866-12-11 newman
JPS62166897A (ja) * 1986-01-20 1987-07-23 Toyo Soda Mfg Co Ltd 核内非ヒストン蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
GB8823869D0 (en) * 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5605690A (en) * 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
US5545806A (en) * 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5656272A (en) * 1991-03-18 1997-08-12 New York University Medical Center Methods of treating TNF-α-mediated Crohn's disease using chimeric anti-TNF antibodies
GB9217316D0 (en) * 1992-08-14 1992-09-30 Ludwig Inst Cancer Res Schwann cell mitogenic factor,its preparation and use
JP3472048B2 (ja) * 1995-10-09 2003-12-02 鐘淵化学工業株式会社 自己免疫疾患の診断薬
US6323329B1 (en) * 1995-12-21 2001-11-27 Jorn Bullerdiek Nucleic acid sequences of genes encoding high mobility group proteins
US6720472B2 (en) * 1996-07-12 2004-04-13 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey HMGI proteins in cancer and obesity
US6171779B1 (en) * 1996-07-12 2001-01-09 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey HMGI proteins in cancer
AU719555B2 (en) * 1996-07-17 2000-05-11 Kaneka Corporation Diagnostic drugs for autoimmune diseases
US20030032090A1 (en) * 1997-05-07 2003-02-13 Schering Corporation, A New Jersey Corporation Human receptor proteins; related reagents and methods
US20030027260A1 (en) * 1997-10-17 2003-02-06 Genentech, Inc. Human Toll homologues
US6228642B1 (en) 1998-10-05 2001-05-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of tumor necrosis factor-(α) (TNF-α) expression
US6303321B1 (en) * 1999-02-11 2001-10-16 North Shore-Long Island Jewish Research Institute Methods for diagnosing sepsis
US7151082B2 (en) * 1999-02-11 2006-12-19 The Feinstein Institute For Medical Research Antagonists of HMG1 for treating inflammatory conditions
US6177077B1 (en) * 1999-02-24 2001-01-23 Edward L. Tobinick TNT inhibitors for the treatment of neurological disorders
AU3395900A (en) * 1999-03-12 2000-10-04 Human Genome Sciences, Inc. Human lung cancer associated gene sequences and polypeptides
US6677321B1 (en) * 1999-12-09 2004-01-13 Bruce Levin Methods and compositions for treatment of inflammatory disease
US6436703B1 (en) * 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
WO2002000677A1 (en) * 2000-06-07 2002-01-03 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
US7754217B2 (en) * 2001-03-16 2010-07-13 Bio3 Research Srl HMGB1 protein inhibitors and/or antagonists for the treatment of vascular diseases
US20030032674A1 (en) * 2001-08-13 2003-02-13 Hwang Daniel H. Use of unsaturated fatty acids to treat severe inflammatory diseases
JP2003052763A (ja) * 2001-08-16 2003-02-25 Paramount Bed Co Ltd ベッドにおける側柵

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002092004A2 (en) 2002-11-21
NO20035087L (no) 2003-12-09
US20030060410A1 (en) 2003-03-27
KR20040018370A (ko) 2004-03-03
EP1392844A2 (en) 2004-03-03
IS7037A (is) 2003-11-14
NZ529423A (en) 2008-10-31
WO2002092004A3 (en) 2003-10-09
CN100447154C (zh) 2008-12-31
HUP0500042A3 (en) 2010-01-28
AU2002309829B2 (en) 2007-08-23
IL158643A0 (en) 2004-05-12
IL208892A0 (en) 2011-07-31
WO2002092004A8 (en) 2003-11-27
HUP0500042A2 (hu) 2005-03-29
PL367132A1 (en) 2005-02-21
CA2447576A1 (en) 2002-11-21
EP1392844A4 (en) 2006-09-06
BR0209689A (pt) 2006-02-07
IL158643A (en) 2010-12-30
US20040005316A1 (en) 2004-01-08
CN1516739A (zh) 2004-07-28
MXPA03010449A (es) 2004-12-06
JP2005512507A (ja) 2005-05-12
SK15422003A3 (sk) 2005-01-03
CA2447576C (en) 2014-04-08
IL208892A (en) 2015-04-30
NO20035087D0 (no) 2003-11-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20033402A3 (cs) Použití fragmentů HMG jako protizánětlivých činidel
US7749959B2 (en) Use of HMGB fragments as anti-inflammatory agents
AU2003294488B2 (en) Use of HMGB fragments as anti-inflammatory agents
AU2002309829A1 (en) Use of HMG fragment as anti-inflammatory agents
US20080124320A1 (en) Use of HMGB fragments as anti-inflammatory agents
JP2005512507A6 (ja) 抗炎症剤としてのｈｍｇフラグメントの使用
US20060111287A1 (en) Acetylated protein
CN105518025B (zh) 人抗IFN-α抗体
Rathore et al. Basigin interacts with Plasmodium vivax tryptophan-rich antigen PvTRAg38 as a second erythrocyte receptor to promote parasite growth
US20040156851A1 (en) HMGB1 combination therapies
EP2364998A1 (en) Antibodies against HMGB1 and fragments thereof
US20090203125A1 (en) Mig-7 as a specific anticancer target
AU2007234583B2 (en) Use of HMG fragment as anti-inflammatory agents
JP2022531371A (ja) 新規な選択的ａｃｋｒ３調節性物質及びその使用
AU2007205777A1 (en) Use of HMGB fragments as anti-inflammatory agents
JP2004173531A (ja) 免疫受容体タンパク質