TW200844227A - Recombinant viral proteins and particles - Google Patents

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200844227 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明揭示編碼融合多肽的核酸，該等融合多肽含有竹 彼紋病毒（万mosa/c v/rw)勒蛋白之序列或其區段； 及與載體片段融合之免疫原性異源片段。本發明亦揭示相 關之嵌合竹嵌紋病毒顆粒、相關之表現載體、相關之宿主 細胞及相關之組合物。本發明亦揭示製造及使用融合多肽 或欲合竹嵌紋病毒顆粒之方法。 【先前技術】 病毒感染對家畜業造成嚴重損害，譬如口蹄疫病毒 (FMDV)經常性的威脅全世界的家畜健康。FMDV屬於小核 糖核酸病毒科之口蹄疫病毒屬。各FMDV顆粒在由四種蛋 白質（VP1、VP2、VP3及VP4)各60個複本組成之二十面體 顆粒内含有單股RNA基因組。VP1、VP2及VP3形成病毒顆 粒之殼，而VP4位於顆粒内（參見Acharya等人，1989 Nature 337(6209): 709-716)。疫苗能保護家畜免於FMDV 感染。目前的FMDV疫苗以去活化病毒為主，其安全性不 令人滿意。實際上，FMDV因不當去活化病毒而爆發感 染。因此，需要製造安全FMDV疫苗之替代方法。 【發明内容】 本發明係關於應用竹欲紋病毒（eamho mosaz’c Wrw， BaMV)顆粒或蛋白質為生產免疫原性組合物（諸如，疫苗） 之載體的用途。下文所列為全長竹嵌紋病毒鞘蛋白之胺基 酸（amino acid)序列（BaMV CP ; SEQ ID NO: 1)及編碼其之 124378.doc 200844227 核苷酸（nt)序列（SEQ ID NO: 2): SEQ ID N〇：1：

MSGAGTGTGRGTGTGVGGTGGTGGTGGGGTGRGQQAAAQPWEAIFTKDDLAAIEPKPAS ANVPNTKQWIGIQAGLIKAGATDANFMKVLLGLSLEAFDRGSSEATTWDGITEGVEHRA > AANAIKEANPIHKVTYYLAKPTFAIRQSKNLPPANFAKKNVPSQYKWCAFDAFDGLYDP

TCLASELPYDAPSEIDRMAYATFKTIQIKIANDQKGFNLNYNPNVTQARLPNAPLPALP . EPTSD SEQ ID NO: 2

atgtctggagctggaacgggaactgggcgagggaccgggaccggagtaggaggcactgg gggcacaggtggcacaggcggcggaggaacaggtagagggcaacaagctgcagcccagc cctgggaggaatttttactaaggacgacctggccgcaatcgagccaaaacctgcttcgg caaatgttccaaacactaagcagtggatcggcattcaagctggactcatcaaggccgga gccacggacgcaaacttctgaaagtactgctcggcctcagtctcgaagctttcgacagg ggctcatcagaagccaccacttgggatggaattactgagggcgtggagcaccgtgcagc agccaacgccatcaaggaggcgaactgccaatacacaaggtcacctactacctagccaa accgacgttcgccattagacaatcgaaaaacctccccccagcgaacttcgcaaagaaga atgtgccatcacaatataaatggtgtgcgttcgatgctttgatggcctgtacgatccta cctgccttgcctcagaactaccctacgacgccccctcagaaatagaccgaatggcgtac gctaccttcaaaactatacagatcaagatcgccaatgaccagaaaggttcaacctcaac tacaaccctaacgtcacccaggctcgactccccaacgcgcccctaccagctcttcccga accaacatcagactaa 本發明特徵為經分離之融合多肽，其含有（i)含有BaMV CP或其區段之載體片段；及（ii)與載體片段融合且長度至 少為3胺基酸（例如，具有至少5、10、20、30或37胺基 酸）之免疫原性異源片段。除SEQ ID NO: 1以外，SEQ ID NO: 1之各種片段亦可用作載體片段。 實例包括缺乏SEQ ID NO: 1胺基末端35胺基酸之BaMV CP突變體（SEQ ID NO: 7 ;上文加底線者）。較佳者，載體 片段之胺基末端與異源片段融合。π異源f’核酸、基因或蛋 白質為起源自外來品種者，或若其源自相同品種，則係由 124378.doc 200844227 其原始形式經實質修飾者。 上述免疫原性異源片段可含有FMDV VP1蛋白質之序列 或其免疫原性區段。下文所示為全長FMDV VP1蛋白質之 胺基酸序列（SEQ ID NO: 3)及編碼其之核苷酸序列（SEQ ID NO: 4)： SEQ 工D N〇：3

TTSAGESADPVTATVENYGGETQVQRRQHTDSAFILDRFVKVKPKEQVNVLDLMQIPAH TLVGALLRTATYYFSDLELAVKHEGDLTWVPNGAPETALDNTTNPTAYHKEPLTRLALP f YTAPHRVLATVYNGS S KYGDTS TNNVRGDLQVLAQKAERTLPTS FNFGAIKATRVTELL

< YRMKRAETYCPRPLLAIQPSDARHKQRIVAPAKQLL SEQ ID NO: 4

Accacctctgcgggtgagtctgcggaccccgtgactgccaccgtcgagaactacggtgg tgagacacaagtccagaggcgccagcacacggacagtgcgttcatactggacaggttcg tgaaagtcaagccaaaggaacaagttaatgtgttggacctgatgcagatccctgcccac accttggtaggggcgctcctgcgaacggccacctactacttctctgacctggagctggc cgtcaagcacgagggcgatctcacctgggtcccaaacggcgcccctgagacagcactgg acaacactaccaacccaacagcttaccacaaggaacccctcacacggctggcgctgcct tacacggctccacaccgtgtcttagcgaccgtctacaacgggagcagtaagtacggtga caccagcactaacaacgtgagaggtgaccttcaagtgttagctcagaaggcagaaagaa ctctgcctacctccttcaacttcggtgccatcaaggcaactcgtgttactgaactactc tacagaatgaagagagccgagacatactgtcccaggccccttctcgccattcaaccgag tgacgctagacacaagcagaggattgtggcacccgcaaaacagcttctg 以FMDV VP1片段為免疫原性異源片段之實例包含含有序

歹U 5的免疫原性異源性片段 （TVYNGSSKYGDTSTN NVRGDLQVLAQKAERTLPTSFN (SEQ ID NO: 5))，序列 5相對應於SEQ ID NO: 3之胺基酸序列為編碼128-164。下 文展示例示性融合多肽，即SEQ ID NO: 5及7之序列。

MDTVYNGS S KYGDTS TNNVRGDLQVLAQKAERTLPTS FNAAAQPWEAIFTKDDLAAIE P KPASANVPNTKQWIGIQAGLIKAGATDANFMKVLLGLSLEAFDRGSSEATTWDGITEGV EHRAAANAIEANCPIHKVTYYLAKPTFAIRQSKNLPPANFAKKNVPSQYKWCAFDAFDG 124378.doc 200844227 LYDPTCLASELPYDAPSEIDRMAYATFKTIQIKIANDQKGFNLNYNPNVTQARLPNAPL PALPEPTSD (SEQ ID NO: 9) 經分離之多肽係指實質上不含天然相關分子之多肽，亦 即以乾重計，純度至少為75%(亦即，介於75%與100%之間 的任何數字，包括端點）。可藉由任何適當標準方法量測 純度，例如藉由管柱層析法、聚丙烯酸胺凝膠電泳法或 HPLC分析法。本發明之經分離之多肽可由天然來源純 化，藉由重組DNA技術或藉由化學方法製造。 本發明特徵亦為經分離之核酸，其含有編碼上述融合多 肽中之一者的序列。核酸之實例包括分別編碼SEQ ID NO: 1、3、5、7及 9的 SEQ ID NO: 2、4、6、8及 10。SEQ ID NO: 6、8及10之序列如下所示： accgtctacaacgggagcagtaagtacggtgacaccagcactaacaacgtgagaggtga ccttcaagtgttagctcagaaggcagaaagaactctgcctacctccttcaac (SEQ 工D NO: 6) gcggccgcacagccctgggaggcaatttttactaaggacgacctggccgcaatcgagcc aaaacctgcttcggcaaatgttccaaacactaagcagtggatcggcattcaagctggac tcatcaaggcggagccacggacgcaaacttcatgaaagtactgctcggcctcagtctcg aagctttcgacaggggctcatcagaagccaccacttgggatggaattactgagggcgtg gagcaccgtgcagcagccacgccatcaaggaggcgaactgcccaatacacaaggtcacc tactacctagccaaaccgacgttcgccattagacaatcgaaaaacctccccccagcgaa cttcgcaaagaagaatgtgccatcacatataaatggtgtgcgttcgatgcctttgatgg cctgtacgatcctacctgccttgcctcagaactaccctacgacgccccctcagaaatag accgaatggcgtacgctaccttcaaaactatacagacaagatcgccaatgaccagaaag ggttcaacctcaactacaaccctaacgtcacccaggctcgactccccaacgcgccccta ccagctcttcccgaaccaacatcagactaa (SEQ 工D N〇：8) atggacaccgtctacaacgggagcagtaagtacggtgacaccagcactaacaacgtgag aggtgaccttcaagtgttagctcagaaggcagaaagaactctgcctacctccttcaacg cggccgcacgccctgggaggcaatttttactaaggacgacctggccgcaatcgagccaa aacctgcttcggcaaatgttccaaacactaagcagtggatcggcattcaagctggactc atcaaggccggagccacgacgcaaacttcatgaaagtactgctcggcctcagtctcgaa gctttcgacaggggctcatcagaagccaccacttgggatggaattactgagggcgtgga 124378.doc 200844227 gcaccgtgcagcagccaacgccatcaagaggcgaactgcccaatacacaaggtcaccta ctacctagccaaaccgacgttcgccattagacaatcgaaaaacctccccccagcgaact tcgcaaagaagaatgtgccatcacaatataaatggttgcgttcgatgcctttgatggcc tgtacgatcctacctgccttgcctcagaactaccctacgacgccccctcagaaatagac cgaatggcgtacgctaccttcaaaactatacagatcaagatcgccatgaccagaaaggg ttcaacctcaactacaaccctaacgtcacccaggctcgactccccaacgcgcccctacc agctcttcccgaaccaacatcagactaa (SEQ ID N〇：10) 核酸可進一步含有BaMV開放閱讀框架1-4之序列（ORFs 1-4，例如GenBank編號D26017等其他序列）。 核酸係指DNA分子（例如，cDNA或基因組DNA)、RNA 分子（例如，mRNA)或DNA或RNA類似物。可由核苦酸類 似物合成DNA或RNA類似物。核酸分子可為單股或雙股， 但較佳為雙股DNA。”經分離之核酸”為結構不同於任何天 然存在核酸或不同於天然存在基因組核酸之任何片段的核 酸。其包含（a)具有天然存在基因組DNA分子之部分序列但 不側接編碼序列之DN A，該等編碼序列側接於其所存在之 個體基因組的部分分子；（b)以使所得分子不同於任何天然 存在之載體或基因組DNA之方式，併入原核生物或真核生 物之載體或基因組DNA中之核酸分子；（c)單獨分子，諸如 cDNA、基因組片段、由聚合酶鏈反應（PCR)產生之片段， 或限制酶片段；及（d)為雜交基因（亦即，編碼融合蛋白質 之基因）之部分的重組核苷酸序列。上文所述之核酸可用 於表現本發明之多肽。為此，可將核酸與合適調節序列操 作性連接以產生表現載體。 載體係指能夠轉運所連接之另一核酸的核酸分子。載體 能夠自主複製或併入宿主DNA中。載體之實例包括質體、 黏質體或病毒載體。本發明之載體包括適於在宿主細胞中 124378.doc •10- 200844227 表現核酸之形式的核酸。較佳地，載體包括與待表現核酸 序列操作性連接之一或多種調節序列。，，調節序列，，包括啟 $子、強化子及其他表現㈣元件（例如，花挪菜嵌紋病 毒 35S(caiilifl〇wer mosaic virus 35S)啟動子序列或聚腺苷 酸化信號）。調節序列包括直接組成性表現核苷酸序列之 彼等，以及組織特異性調節性及/或誘導性序列。表現載 體之設計可視諸如待轉形宿主細胞之選擇、所要蛋白質之 表現程度及其他類似因素而定。可將表現載體引入宿主細 胞中以產生本發明之多肽或病毒顆粒。 含有上述核酸之宿主細胞亦在本發明範疇内。實例包括 植物細胞、大腸桿菌細胞（五· co"cells)、昆蟲細胞（例如， 使用桿狀病毒表現載體）、酵母細胞或哺乳動物細胞。例 如參見 Goeddel，（1990) Gene Expressi〇n Techn〇1〇gy:

Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA。較佳地，宿主細胞為植物細胞，諸如白蓼 (Chenopodium quinoa)氙煙草（mc〇tiana bemhamiana)之葉 細胞。 為產生本發明之多肽，可在允許表現由本發明之核酸編 碼之多肽的條件下在培養基中培養宿主細胞，且自經培養 細胞或細胞培養基純化多肽。或者，本發明之核酸可使用 (例如）T7啟動子調節序列及T7聚合酶活體外轉錄及轉譯。 在另一態樣中，本發明特徵為含有上述融合多肽中之一 者的嵌合竹嵌紋病毒顆粒。為製造此嵌合竹嵌紋病毒顆 粒，可使伯主植物之葉片與含有竹嵌紋病毒開放閱讀框架 124378.doc -11 - 200844227 1-4之序列的上述核酸接觸，將葉片保持在允許形成含有 由祆-义、扁馬之多肽之病毒顆粒的條件下，且自葉片純化病 毒顆粒。 本發明之㉟合多狀或後合竹錢病毒顆粒亦可用於產生 特/、f±、、O a至所關注多肽（例如，FMdv vpi)之特異性抗 體口此，包括融合多肽或嵌合竹嵌紋病毒顆粒之免疫原 性組合物在本發明範疇内。為在個體内引發免疫反應，可 向有需要之個體投與有效量之融合多肽或嵌合竹嵌紋病毒 顆粒。個體可為人類或非人類動物，諸如豬、牛、馬、綿 羊或山羊。 下文所附之說明書中闡述本發明之一或多個實施例之細 節。本發明之其他優勢、特徵及目標將由實施方式及申請 專利範圍而變得顯而易見。 【實施方式】 本發明係至少部分基於以下發現：BaMV CP或BaMV顆 粒可用作在個體内對所關注多肽產生免疫反應之載體。

BaMV為馬龄薯病毒群（potexvirus gr〇llp)之絲狀型植物 病毒之一員’其感染單子葉植物及雙子葉植物（Lin等人，

Phytopathology 1992;82:73 1-4)。其基因組由具有 5’帽結構 及3’聚（A)尾之單股正義rnA分子組成。其含有5個主要開 放閱讀框架（ORFs)，編碼用於病毒複製、移動及包被之不 同蛋白質（Lin等人，j，Gen. Virol· 1994;75··2513-2518)。其 中’ 0RF5編碼鞘蛋白質（CP)，其涉及於病毒包裝及細胞 間（cell-to-cell)及長距離移動（Lin 等人，Phytopathology 124378.doc -12- 200844227 1992;82··731-4及Lin等人，J· Gen. Virol. 1994;75:2513-8)。 如下之融合多肽在本發明範疇内，其具有與含SEQ ID NO: 1或其功能等效物（諸如來自其他BaMV病毒株之CP蛋 白質的對應序列）之載體融合的所欲免疫原性多肽。 SEQ ID NO: 1之功能等效物係指衍生自SEQ ID NO: 1之 多肽，例如具有一或多個點突變、插入、缺失、截斷或其 組合之融合多肽或多肽。所有功能等效物實質上具有 BaMV殼體化之活性且不影響病毒複製。此活性可藉由與 /· 以下實例中所述之彼等相似的標準檢定來測定。 詳言之，該等功能等效物包括序列與SEQ ID NO: 1之區 別在於一或多個保守胺基酸經取代或一或多個非保守胺基 酸經取代、缺失或插入之多肽。下表列出合適之胺基酸取 代： 表Μ呆守胺基酸置換 胺基酸 編碼 與以下任一者置換 丙胺酸 A Gly、Ala、Cys 精胺酸 R Lys、Met、lie， 天冬醯胺酸 N Asp、Glu、Gln， 天冬胺酸 D Asn、Glu、Gin 半胱胺酸 C Met、Thr 麩胺醯胺 Q Asn、Glu、Asp 麩胺酸 E Asp、Asn、Gin 甘胺酸 G Ala、Pro 異白胺酸 I Val、Leu、Met 白胺酸 L Val、Leu、Met 離胺酸 K Arg、Met、lie 甲硫胺酸 Μ lie、Leu、Val 苯丙胺酸 F Tyr、His、Trp 脯胺酸 P 絲胺酸 S Thr、Met、Cys 蘇胺酸 T Ser、Met、Val 酪胺酸 Y Phe、His 纈胺酸 V Leu、lie、Met 124378.doc -13- 200844227 一般而言，SEQ ID NO: 1之功能等效物與SEQ ID ΝΟ:1 至少50%相同，例如至少60%、70%、80%、90%或95°/〇相 同。兩個胺基酸序列或兩個核酸之’’相同性％”係使用 Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993 中所修正之Karlin and Altschul iVa"· dead· Sc/· USA 87:2264-68，1990演算法測定。該演算法係併入 Altschul 等人·丄 Mo/·万沁/· 215:403-10，1990之 NBLAST及 XBLAST程式（2·0版）中。可由NBLAST程式，記分=100， 字長-12進行BLAST核苷酸研究以獲得與本發明核酸分子 同源之核苷酸序列。可由XBLAST程式，記分=50，字長 =3進行BLAST蛋白質研究以獲得與本發明蛋白質分子同源 之胺基酸序列。當兩個序列之間存在間隙時，可如 Altschul等人，TVwc/以.c dc/心 25(17):3389-3402，1997 所述利用 Gapped BLAST。當利用 BLAST 及 Gapped BLAST 程式時，可使用各別程式（例如，XBLAST及NBLAST)之默 認參數。 本發明的融合多肽可由合成多肽或重組多肽之形式獲 得。為製備重組多肽，可將編碼其之核酸與編碼融合搭配 物之另一核酸（例如，麩胱甘肽-S-轉移酶（GST)、6x-His抗 原決定基標籤或Ml3 Gene 3蛋白質）連接。所得融合核酸 於合適宿主細胞中表現融合蛋白質，該融合蛋白質即可藉 由此項技術中已知之方法分離。經分離的融合蛋白質可藉 由（例如）酶切割進一步處理以移除融合搭配物而獲得本發 明之重組多肽。 124378.doc •14- 200844227 含有上述融合多肽之重組嵌合竹嵌紋病毒顆粒亦在本發 明範疇内。該顆粒含有或不含野生型BaMV CP。為製備該 顆粒，可將編碼上述融合多肽中之一者的核酸及竹嵌紋病 毒ORFs 1-4序列與5’及3’ UTR引入合適宿主植物細胞中， 且以下文實例所述之方式產生病毒顆粒。在一實施例中， 融合多肽含有SEQ ID NO: 1或7序列。 可使用本發明之融合多肽或嵌合竹嵌紋病毒顆粒在動物 (用於產生抗體或治療疾病）或人類（用於治療疾病）體内產 生抗體。在動物體内製造單株及多株抗體及其片段之方法 為此項技術中已知的。例如參見Harlow及Lane，（1988) Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York。術語n抗體n包括完整分子以及其片 段，諸如Fab、F(ab’）2、Fv、scFv(單鏈抗體）及dAb(域抗 體；Ward等人.（1989) Nature，341，544)。 一般而言，為製造針對所欲蛋白質之抗體，可產生包括 蛋白質之免疫原性片段的融合多肽或帶有融合多肽之嵌合 竹嵌紋病毒顆粒。接著將融合多肽或嵌合竹嵌紋病毒顆粒 與佐劑混合，再將混合物注射入宿主動物體内。接著可藉 由肽親和層析法純化動物體内產生之抗體。通常採用之宿 主動物包括家兔、小鼠、天竺鼠及大鼠。可用於增加免疫 反應之各種佐劑視宿主種類而定，其包括MONTANIDE IS A 20 6佐劑、弗洛伊德佐劑（Freund’s adjuvant，完全及不 完全）、無機凝膠（諸如氫氧化鋁）、CpGODN、表面活性物 質（諸如溶血卵鱗脂）、普朗尼克多元醇（pluronic 124378.doc -15- 200844227 polyols)、聚陰離子、肽、油乳液、透孔螺血藍蛋白質及 二硝基酚。適用人類之佐劑包括BCG(卡介苗）及棒狀桿菌 孢子蟲。 多株抗體（抗體分子之異質群體）係存在於經免疫個體之 血π中。單株抗體（結合至本發明多肽之抗體的同質群體） 可使用標準融合瘤技術（例如參見，K〇hler等人（1975)

Nature 256, 495 ; Kohler 等人（1976) Eur· j· Immun〇1 6, 511，Kohler 等人（1976) Eur· J. Immun〇i· 6，292 ;及 Hammerling 等人（1981) M〇n〇cl〇nal Antibodies and T Cell

Hybridomas，Elsevier，Ν·γ·)製備。詳言之，可使用諸如

Kohler 等人.（1975) Nature 256, 495及美國專利第 4,376，11〇 號所述之藉由所培養之連續細胞系（c〇ntinu〇us ceil Unes) 製造抗體分子的任何技術；人類6細胞融合瘤技術（K〇sb〇r 等人.（1983) Immun〇i Today 4，72; c〇le 等人（1983) pr〇c

Natl· Acad· Sci· USA 80，2026)及 EBV 融合瘤技術（Cole 等 人.（1983) M〇nocl〇nal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R· Liss，Inc·，第77-96頁）獲得單株抗體。該等抗體可為任 何免疫球蛋白種類，包括IgG、igM、IgE、IgA、IgD及其 任何子類。可將產生本發明單株抗體之融合瘤於活體外或 活體内培養。活體内產生高效價單株抗體之能力使其成為 尤其適用之製造方法。 本發明之融合多肽或嵌合竹嵌紋病毒顆粒亦可用於製備 免疫原性組合物（例如，疫苗），該組合物係用於在易受病 毒感染之個體内產生針對病毒（例如，FMDV)之抗體。可 124378.doc -16- 200844227

(例如）根據下文實例所述之方法或藉由此項技術中已知之 任何#效方法製備該等組合物。組合物含有有效量之本發 明融合多肽或嵌合竹嵌紋病毒顆粒，及諸如磷酸鹽緩衝生 理食鹽水或碳酸氫鹽溶液之醫藥學上可接受之載劑。載劑 係基於投藥模式及途徑及標準醫藥常規進行選擇。合適醫 藥載劑及稀釋劑以及醫藥辅料描述於Remingt〇n，s Pharmaceutical Sciences中。若必要，則本發明組合物中亦 可包括例如霍亂毒素（cholera toxin)、大腸桿菌不耐熱腸毒 素（五CO" heat-labile enterotoxin，LT)、脂質 體、免疫刺激複合物（ISCOM)或免疫刺激序列寡脫氧核苷 酸（ISS-ODN)之佐劑。融合多肽、其片段或類似物或嵌合 竹嵌紋病毒顆粒可為對抗多種疾病之疫苗之多價組合物的 成分。 製備疫苗之方法一般為此項技術中所熟知，如美國專利 1 4,601,903 ^ ； ^ 4,599,231 ^ ; ^ 4,599,230 ^ ; 4,596,792號所例示。纟苗可製備為可注射液體溶液或乳 液。本發明之融合多肽或嵌合竹嵌紋病毒顆粒可與生理學 上可接受且與賦形劑相容之物混合。賦形劑可包括水、生 理食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其組合。疫苗可進一步 含有微量助劑物質，諸如濕潤劑或乳化劑、pH緩衝劑或增 強疫苗效用之佐劑。達成疫苗之佐劑作用的方法包括使用 諸如氯氧化銘或鱗酸紹（礬）之藥劑，通常以〇〇5至〇 ^填 酸鹽緩衝生理食鹽水溶液形式使用。疫苗可藉由非經腸^ 與、皮下注射或肌肉注射。或者，包括栓劑及口服調配物 124378.doc -17- 200844227 之其他投藥模式可為所要的。對於拴 仅釗而s，黏合劑及載 劑可包括（例如）聚烧二醇或甘油：r gt： 田一酉日。口服調配物可包括 通常採用之初始劑（incipient)，諸如較溢4 碎如w樂級之醣類、纖維 素、碳酸鎂及其類似物。此等組合铷炎w > 物為溶液、懸浮液、錠 劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或 μ 3放劑形式且含有]L0- 95%融合多肽或嵌合竹嵌紋病毒顆粒。 疫苗係以與劑量調配物相容之方々 乃式投與，且以治療有 效、保護及免疫原性之量投與。投盥旦 仅Η之里視待治療之個體 而定，包括（例如）個體免疫系統合成抗體之能力及（若需 要)製造細胞介導之免疫反應之能力。需要投與之活性： 份的精確量視從業者之判斷而定。然而，由熟習此項技術 者可容易地判定本發明多肽之合適劑量範圍，且其可 克級。初始投藥及輔助給藥的合適方案亦可變，但可包括 $始投藥，接著後續投藥。疫苗之劑量亦可視投藥途徑而 定’且其可視宿主體型而變。 下文貝例所述，上述融合多肽或嵌合竹嵌紋病毒顆粒 可在個體内引發針對病毒感染（諸如，fmdv感染）之免疫 反應。易受FMDV感染之個體經鏗別後可投與本發明組合 物。誠如熟習此項技術者可判定者，組合物之劑量可視 (例如）特疋多肽/病毒顆粒、是否與佐劑共投與、共投與之 佐劑的類型、投藥模式及頻率而定。誠如熟習此項技術者 所能判定者，在必要時可重複投藥。舉例而言，可以每週 間隔初认免疫給藥（priming d〇se)，隨後三次輔助給藥。可 在第人免疫後4至8週給與辅助注射，且在8至12週使用 124378.doc -18* 200844227 相同調配物給與第二次輔助。可自受檢者取樣血清或丁細

胞，以測量組合物針對FMDV所引發之免疫反應。分析針 對蛋白質或感染之抗體或細胞毒性T細胞之方法為此項技 術中所热知的。可視需要給與其他輔助劑。藉由改變多狀/ 病毒顆粒之量，組合物劑量及投藥頻率，可使免疫方案最 佳化以引發最大免疫反應。在大範圍投藥前，需要進行效 用測試。在效用測試中，可經由口服或非口服的方式向非 人類受檢者投與本發明組合物。初始投藥後或視情況之輔 助投藥後，可藉由皮下注射（例如）〇·5 x 1〇5 Tcm5 FMDV O/Taiwan/97以挑戰測試受檢者及對照受檢者（接受 模擬投藥）。接著對受檢者監測FMD症狀，歷時14天。 FMD症狀包括連續三天高於4〇〇c之高體溫，跛行、口周圍 水泡性損傷及腿部冠狀帶。 上述BaMV CP多肽可用作載體，並可與所欲之其他抗原 連接以產生對抗抗原之抗體。多肽片段一般可用於製備對 抗病源性細菌（包括囊封細菌）的嵌合分子及共輛組合物。 下文之特定實例應僅解釋為說明性的，而非以任何方式 顯示本揭示案之其餘部分。無需進一步詳細描述，咸信孰 習此項技術者可以本文之說明為美 d ^ &礎以取充分程度利用本 發明。本文引用之所有公間垒 A開案係以引用的方式全部併入本 文中。 實例1 此只例使VP1抗原決定基與BaMV經截斷勒蛋白 之胺基末㈣合產生融合蛋白f。亦產生具有融合蛋白質 124378.doc -19- 200844227 之嵌合BaMV。 以Lin等人丄Gen. Virol. 2004;85:251-9所述之方式將具 有上游花椰菜嵌紋病毒35S啟動子序列之BaMV-S的全長傳 染性cDNA選殖入質體pUC119中。載體pBS-d35CP係源自 上述BaMV cDNA純系，其中編碼CP之N·末端35胺基酸序 列的序列缺失，且藉由基於聚合酶鏈反應（PCR)之方法插 入多個選殖位點。使用質體PVP1/Q15作 為模板，藉由PCR將編碼FMDVVP1(0/ Taiwan/ 97)之胺基 f·'. 酸 128-164 的序列插入至 pBS-d35CP(Wang 等人，Vaccine 2003 ； 21:3721-9.)。所用之弓I 子為 prl28164N(5’- GGgctagcAccatgg-ACACCGTCTACAACGGGAG-3,；該等 序列在有些情況下被視為及位點；識別序列 提供 AUG 起始密碼子）及 prl28164C(5’-TTgcggccgc-GTTGAAGGAGGTAGGC-31 ;該等序歹ij在有些情況下被視 為位點）。PCR反應係在94 °C之起始溫度下進行5分 鐘，隨後在94°C下歷時30秒，在50°C下歷時30秒及在72°C 下延長歷時30秒，循環25次。將對應於VP1抗原決定基之 擴增片段純化且將其選殖入質體PBS-d35CP之TV/^I及iVoil 位點以產生pBVPl質體。此載體編碼嵌合BaMV之基因 組，亦即BVP1。 為檢驗此嵌合病毒對植物之傳染性，以全身性宿主邂草 (N. 謝及局部病斑宿主白暴（C, 進行測 試。 局部病斑宿主白藜及全身性宿主煙草植物係生長於暴露 124378.doc -20- 200844227 在曰光中之溫室中。對於傳染性之檢定而言，將約1吨純 pBVPl DNA溶於10μ1體積之雙蒸餾H2〇中，並接種於在6 片葉階段測試植物之各葉片（Lin等人，j. Gen. virol. 2004 ;85:251-9)。在接種1〇天後進行對局部病斑之觀測。 對於抗原製備而言，將具有8至10片完全擴展之葉片的白 藜植物以來自經BaMV-S或B VP 1感染之白藜植物的葉片萃 取液接種。在接種第10天後採集經接種之葉片。隨後以

Lin等人.Phytopathology，1992; 82:731-4所述之方式自新鮮 葉片純化病毒粒子。藉由紫外線吸收測定經純化病毒之產 率（假定每毫克（mg)病毒吸收率（〇」％，260 nm)為3·0)。 肷合病毋B VP 1中表現之VP 1抗原決定基之量經估算為總病 毒重量的約14.3%。將經純化病毒粒子溶解於be緩衝液（1〇 mM Borate，pH 9.0，1 mM EDTA)中，且接著在_2〇cc 下儲 存以用於免疫豬隻。 結果發現，BVP1感染之煙草之嵌紋症狀比BaMV-S感染 之煙草輕微。在白藜中，由BVP1形成之萎黃局部病斑與 野生型BaMV-S引起之壞死性局部病斑不同。然而，結果 顯示嵌合突變病毒的確具有感染健康煙草或白藜植物的能 力。 實例2 上述喪合病毒BVP 1經檢驗以測定其是否能表現vp 1抗原 決定基。將白藜葉片分別以模擬對照組、野生型BaMV_ S、BS-d35CP及BVP1接種，分離上述白藜葉片之總蛋白質 並進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳。 124378.doc -21 - 200844227 結果發現，來自BVP1之嵌合CP的移動比野生型CP或N-末端截斷之CP的移動慢，而在模擬接種之葉片中未發現 CP。結果顯示野生型與嵌合BVP1之CP之尺寸有明顯差 異，且VP1抗原決定基與BVP1之CP融合。 為進一步確認BVP1之CP含有VP1抗原決定基，使用家 兔抗FMDV VP1血清或來自FMDV感染之豬的血清進行西 方墨點檢定。家兔抗FMDV VP1血清係根據Wang等人， 2003，Vaccine 2003; 21:3721-9所述之方式製備。來自 FMDV 豬之 jk 清係購自 Animal Health Research Institute， COA，R.O.C。總蛋白質係利用1:2(重量/體積）萃取緩衝液 (50 mM Tris-HCl，pH 8.0, 10 mM KC1，10 mM MgCl2, 1 mM EDTA，20%甘油及2% SDS)，由以模擬對照組或病毒接種 之白藜所萃取，且在100°C下加熱5分鐘。接著將蛋白質樣 本藉由12% SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離且在4°C下以200 mA電泳轉移至Immobilon-P膜（Bio-Rad)，歷時1小時。以 脫脂奶粉蛋白填阻（blocking)後，將膜以抗BaMV-S CP或 抗 FMDV VP1抗體探測（Lin等人，Phytopathology 1992; 82:731-4 及 Lin等人，J· Gen. Virol· 2004; 85:25 1-9 )。 發現兩血清均識別出對應於嵌合CP之蛋白質帶，其預期 之大小為31 kDa。相反的，在BaMV-S之野生型CP或BS-d3 5CP之截斷CP中未偵測到VP1蛋白質帶。其他免疫墨點 研究顯示，即使BVP1在白藜經過5個隨後繼代（passage)之 後，自白藜葉片提取之BVP1的CP仍含有相同之主要蛋白 質帶。總之，此等結果顯示嵌合病毒BVP1能在其CP中以 124378.doc -22- 200844227 融合蛋白質形式穩定表現FMDV之VP 1抗原決定基。 實例3 對上述BVP1嵌合病毒測試其在豬體内引發特異性抗體 之能力。 將肷合B VP 1病毒顆粒自b VP 1感染之白藜葉片組織分 離。純化病毒之產率為約〇.2-0.5毫克/公克新鮮葉片組 織。無特定病原體（SPF)雌性或閹割雄性豬（2個月大，體重 約為25 kg)係購自臺灣。藉由肌肉注射，分別以5 mg B VP 1散合病毒製劑免疫兩組SPF豬（每組3隻）。更特定 言之，在除了耳朵以外之頸部肌肉以1〇 mg或5 mg BVP1病 毒粒子（經等體積之Montanide ISA 206佐劑（Seppic，

France)乳化）注射。此外，兩隻豬注射野生型病毒BaMv_ S，另外兩隻豬注射無菌填酸鹽緩衝之生理食鹽水緩衝液 (PBS ； 140 mM NaCl, 2.7 mM KC1, 10 mM Na2HP04i i.8 mM KH2P04, pH 7.3)作為負對照組。 於所有豬之初次免疫（priming)6週後，再對所有豬進行 相同劑量之增幅（boosting)注射。於第〇天、第28天、第42 天、第56天及第63天自經免疫豬收集血清進行分析。輔助

劑注射 3 週後，將 〇·5 mL 1 X 1〇5 TCID5G 之 FMDV O/Taiwan/97注射入豬右前足跟，以感染所有豬隻。接著 監測豬隻FMD症狀，歷時14天。FMD之症狀包括連續3天 高於40°C之高體溫、跛行、口周圍水泡性損傷及腿部冠狀 帶（Wang等人，Vaccine 2003;21:3721-9)。 為檢驗免疫作用，以Shieh等人（Vaccine 2001; 19:4002 124378.doc -23- 200844227 10)所述方法作微小修正後的方式進行ELISA。簡言之，在 形成培養盤結合抗原抗體複合物後，將培養盤以含有0J% Tween-20之PBS(PBST)洗滌3次，且在37t下與經結合生 物素之山羊抗豬IgG抗體反應1小時。隨後洗滌培養盤且添 加抗生蛋白鏈菌素（streptavidin):過氧化酶（1: 3000倍稀 釋）。在室溫下反應1小時後，將培養盤再次洗滌。接著添 加轉受質3,3’，5,5’-四甲基聯苯胺（sigma)，且在室溫下使反 應進行10分鐘。最後，添加等體積N H2S〇4以使反應 停止，且藉由ELISA讀取器量測450 nm下之吸光率。 EUSA顯示於初次免疫4週後，經免疫豬引發顯著抗_ VP1抗體之效價（對5 mg組而言為88〇 土 434且對於1〇瓜心组 而言為2382 士 1098)。且特異性抗_VP1抗體含量增加，並 在2週後達到平穩狀態。相反地，ELISa結果顯示注射野 生型病毒BaMV-S或PBS緩衝液之豬僅產生少量抗_νρι抗 體。此結果顯示嵌合BVP1病毒在豬體内會誘發特異性抗_ VP1抗體。 根據 Shieh 等人（Vaccine 2001;19:4002-10)所述之方法 確認經BVP1免疫之豬血清中中和抗體（NA)之存在。簡言 之，將來自測試動物之血清在56t下去活化3〇分鐘。在％ 孔組織培4盤各列之末端&中添加各血清樣本或對照血清 (50 μΐ)，且接著整個培養盤以2倍連續稀釋率來稀釋。於 各孔中添加5〇μ1100Τ〇：Ι〇5〇病毒懸浮液，且接著使培養盤 震盪1分鐘。在37。(：下在5% C〇2中培育9〇分鐘後，於各孔 中添加100 μΐ懸浮於含有3%胎牛血清（FBs)2Eagieis 124378.doc -24- 200844227 MEM中之ΒΗΚ-21細胞懸浮液（每毫升1 06細胞），且培育48 小時。接著在顯微鏡下觀測細胞。孔中細胞單層的破壞及 細胞由軸形至圓形之變化顯示病毒之細胞病變效應。 在濕度飽和、5% C02及37 °C下培育48小時後測定效 價’且該效價係以50%終點中和病毒之細胞病變效應的血 清最終稀釋率之倒數表示。結果概述於下表2中： 表2經BVP1免疫之豬體内中和抗體（NA)之效價 抗原a -—-—-_ NA效價(個體)b η 4 WPPC 6 WPP 9 WPP BVP1 10 mg 3 57 (6, 91，64) 217 (32, 362, 256) 264 (23, 512, 256) BVP1 5 mg 3 12 (8, 11，16) 227 (64, 364, 256) 210 (11，362, 256) BaMV-S 2 一（一，—） -(-,-) —(一，一） 負對照 2 一（一，一） — (—，—） —(一，—）

6週間—隔使用乳化於等量ISA206佐劑中之10 mg或5 mg BVP1或5 mg BaMV-S 子進行兩次肌肉内注射接種。將以PBS緩衝液免疫之豬用作負對照組。 效價如材料及方法中所述，係以造成測試病毒活性減少50%的血清最 =釋率之倒數表示。（·)表示未侧到ΝΑ。 WPP :初次免疫後的週數。 如表2中所示，經野生型BaMV-S病毒或PBS缓衝液免疫 之豬未產生任何針對FMDV之NA。反言之，經5 mg或1 0 mg BVP1免疫的豬在初次免疫4週後產生να。甚至在初次 免疫6週後效價亦增加。然而，在初次免疫6週後以類似量 之B VP 1輔助注射未顯著增加να。此結果顯示將豬以B VP 1 病毒接種一次即足以引起高含量之針對FMDV之ΝΑ。 實例4 在上述豬體内分析外周血單核細胞（PBMC)產生IFN-γ之 124378.doc -25- 200844227 能力以評估BVP1免疫除體液反應外是否能引發細胞性免 疫反應。IFN-γ為在細胞性免疫反應中起關鍵作用之細胞 激素（cytokine)。 特定言之，自測試豬分離PBMC，且在6孔培養盤中以每 孔1 X 1〇7個細胞（於含有10% FBS及1%盤尼西林（penicillin) 及鏈黴素（streptomycin)之2 mL DMEM培養基中）之濃度三 重複接種。隔夜培養後，在37°C下及5% C02中將細胞與5 pg/mL重組VPl(rVPl)或1 pg/mL植物性凝血球素 (phytohemagglutinins，PHA，Sigma)培育 6小時。將以 PHA 培育之細胞用作正對照。培育後，將細胞溶解於TRIzolTM 試劑（Invitrogen)中，且根據製造商說明分離細胞總RNA。 細胞總RNA之濃度係藉由在260 nm下測定光學密度來定 量。接著藉由Superscript IIITM反轉錄酶（Invitrogen)將細 胞總RNA反轉錄為互補DNA(cDNA)。將所得cDNA進行即 時 PCR。 藉由即時PCR定量全部IFN-γ mRNA。即時PCR係利用在 LightCycler 儀器中之 SYBR Green 系統與 FastStart DNA Master SYBR Green I 套組（Roche)建立（RocheApplied Science)，其最終體積為20 μί(其中包括可熱活化之:Γ叫聚 合酶、4 mM MgCl2、濃度各為LijiM之引子（引子序列為 SW-IFN γ (F4) ： 5，-GCT CTG GGA AAC TGA ATG ACT TCG及 SW-IFN γ (R4) ： 5，-GAC TTC TCT TCC GCT TTC TTA GGT TAG)及2 μί以如上文所述方法製備之cDNA)。 聚合酶活化（95°C，10分鐘）後，進行40次循環之95°C下變 124378.doc -26- 200844227 性15秒，60°C下黏合2秒及72°C下延長15秒。所有步驟之 溫度轉移率為每秒20°C。PCR產物之量藉由偵測SYBR Green I與擴增產物之結合所產生的螢光來測量，在每次循 環中在72 °C培育（延長步驟）後立即量測一次。以 Light Cycler 軟體 3.0版（Roche Applied Science)分析發光曲 線。引子係由Invitrogen Life Technology公司合成。對於 各樣本而言，藉由與標準曲線比較且藉由使用/3 -肌動蛋 白作為内源參照標準化來測定IFN-γ之量。所有樣本三重 複處理。 發現經由BVP1免疫之豬產生的PBMC在藉由重組 VPl(rVPl)刺激後，其IFN-γ增力口 3倍。相反的，由經 BaMV-S免疫或注射PBS之豬產生的PBMC，其IFN-γ表現 量在rVP 1刺激後並未增加。作為對照組，來自所有豬之 PBMC在經PHA刺激後產生類似量之IFN-γ。此等結果顯示 經BVP1免疫之豬的免疫細胞能在rVPl刺激時產生IFN-γ。 實例5 為測定BVP1免疫之功效，在輔助注射三週後，以1 X 105 TCID5G 之 FMDV(0/Taiwan/97)挑戰接種或未接種 BVP1 的豬，且接著監測FMD症狀歷時2週。彼等無症狀者判定 為受到保護。結果概述於下表3中： 表3.重組病毒BVP1於豬體内針對FMDV攻毒之保護 組 攻毒編號 保護編號 保護率 BVP1 10 mg 3 3 100% BVP1 5 mg 3 3 100% BaMV-S 2 0 0% 負對照 2 0 0% 124378.doc -27- 200844227 如表3中所示，經5 mg或10 mg BVP1免疫的豬無症狀且 在挑戰後兩週期間完全受保護。相反的，經BaMV-S免疫 或注射PBS(負對照）的豬在FMDV挑戰後第二天出現嚴重 FMD症狀。此結果顯示嵌合病毒BVP1適合用作豬對抗 FMDV的疫苗。 已知以大腸桿菌產生之rVP 1使豬免疫可有效保護豬免於 FMDV挑戰。比較BVP1及類似量之大腸桿菌產生之rVPl之 功效。更特定言之，以Wang等人（Vaccine 2003;21:3721-9)所述之方式，以6週間隔將豬以乳化於等體積ISA206佐 劑中的8 mg或4 mg rVP 1兩次肌肉内注射接種。以上述相 同方式評估rVPl引發中和抗體（NA)之作用及對抗FMDV之 保護。結果概述於下表4中： 表4. rVPl免疫作用 抗原 NA效價(個體)a 保護 N 3 WPP 6 WPP 10 WPP 8 mg rVPl 3 13 (11，11，16) 22(11,11,45) 21(-,64,-) 100% 4 mg rVPl 3 11(1U1，11) 4(11，一，一） 75 (181，45,一） 100% 負對照 2 6(-,11) 一（一，一） — ( —，-) 0% a :將各豬之NA效價如材料及方法中所述，係以造成測試病毒活性減少50%的血清 最終稀釋率之倒數表示。㈠表示NA不存在。 如表4中所示，rVPl使所有經免疫豬受到完全保護。但 是，在一些（而非所有）經免疫豬體内產生NA。同樣，由 rVP 1引發之平均NA不如B VP 1免疫之彼等高（參見表2及 4)。結果顯示表現37-aa VP1片段之BVP1引發體液免疫反 應之效果比大腸桿菌產生之全長rVPl好。 先前，源於大腸桿菌之重組VPl(rVPl)(26kDa多肽）經純 化，其在豬體内可引發保護性免疫性。與上文所述之組合 124378.doc -28- 200844227 物相比，rVPl在一些（而非所有）經免疫豬體内引發中和抗 體。由rVPl引發之平均中和抗體效價不如bvP12彼等高 (參見表2及4)。BVP1(僅含有VP1的37個胺基酸及BaMV CP)產生比rVPl佳之中和抗體反應。缺乏N末端至少35胺 基酸殘基之BVP1 CP突變體仍可形成能感染全身性宿主（煙 草）及局部病斑宿主（白藜）植物之病毒。 上述結果顯示，由於BaMV有容納及有效表現外來肽之 靈活性，本文所述之BaMV表現載體系統及嵌合病毒可有 效產生中和抗體。此外，BaMV具有優於其他植物病毒之 其他優勢。舉例而言，因為未發現BaMV之自然界傳播媒 介，所以BaMV較安全（Lin 等人 phyt〇path〇1〇gy 1992;82: )相反的，卉多植物病毒對於多數作物而言為病原 體。同樣的為載體之BaMV具有容納較長異源多狀之 較大能力。 本說明書中所揭示之所有特徵可以任何組合形式組合。 本呪明書中所揭示之各特徵可用於相同、等效或類似目的 之替代特徵置換。因此，除非另外明確說明，否則所揭示 之各特徵僅為等效或類似特徵之—般系列的實例。 熟習此項技術者自上述說明可容易地確定本發明 特徵，且不㈣其精神及料之狀況下可對本發明作出 1 種改變及修正以使其練各種用途及條件。因此，I他告 施例亦在以下申請專利範圍之範疇内。 -貝 124378.doc -29-

Claims (1)

1. 200844227 、申請專利範圍： 一種編碼融合多肽之經分離核酸，其中該融合多肽包 括 各有竹甘欠紋病毒（Bamboo mosaic virus)鞘蛋白之序列 或含有其區段之載體片段；及 與邊载體片段融合且長度為至少3個胺基酸之免疫原 性異源片段。 2·如凊求項丨之核酸，其中該免疫原性異源片段含有口蹄 疫病t VP 1蛋白質之序列或含有其免疫原性區段。 ID NO： 4·如請求項3之核酸，其中該免疫原性 NO: 5 〇 3·如請求項2之核酸，其中該免疫原性異源片段含有seq 區段含有SEQ ID 該異源片段係與該載體片段 5·如請求項1之核酸，其中 胺基末端融合。 6’如請求们之核酸’其中該載體片段含有seqidn〇:7。 7, t請求項1之核酸，其中該免疫原性異源片段長度為至 少37個胺基酸。 ID NO: 9之序 8. 如請求項1之核酸，其中該多肽包括SEq 列。 9·如請求項1之核酸，其中該核酸逸 .^ ^ ^ 0a Λ ^ S文進一步包含竹嵌紋病毒 開放閱讀框架1 _4之序列。 1〇· 一種由如請求項1之核酸編碼之經分離多肽。 124378.doc 200844227 11 · 一種包含如請求項1之核酸的表現載體。 12· —種包含如請求項1之核酸的宿主細胞。 长員12之伯主細胞’其中該宿主細胞為植物細胞。 14·如凊求項13之宿主細胞，其中該植物為白藜（CTz⑼opWkm q 〇a、或煙車〈Nicotiana benthamiana)。 士明求項13之宿主細胞，其中該細胞為葉片細胞。 16.種製造融合多肽之方法，其包含在允許表達由核酸編 碼之多狀的條件下將如請求項12之細胞在培養基中培 養’且自經培養細胞或培養基純化該多肽。 17· —種嵌合竹嵌紋病毒顆粒，其包含由如請求項丨之核酸 編碼之融合多肽。 1 8 · —種製造嵌合竹嵌紋病毒顆粒之方法，其包含： 提供如請求項1之核酸，該核酸具有竹嵌紋病毒開放 閱讀框架1-4之序列； 使該核酸與宿主植物之葉片接觸；

   將該葉片保持於允許形成具有由該核酸編碼之多肽的 病毒顆粒之條件下，及 自該葉片純化該病毒顆粒。 其包含如請求項17之嵌合竹嵌紋 19 · 一種免疫原性組合物， 20· —種免疫原性組合物， 病毒顆粒。 其係用於在人體内 21 ·如請求項19或20之免疫原性組合物 引發免疫反應。 124378.doc 200844227 22·如請求項19或20之免疫原性組合物，其係用於在非人類 動物體内引發免疫反應。 23，如請求項22之免疫原性組合物，其中該非人類動物為 豬。 24· —種如請求項1 0之融合多肽之用途，其係用於製造在個 體内引發免疫反應之藥物。 25·如請求項24之用途，其中該個體為人類。 26·如請求項24之用途，其中該個體為非人類動物。 27·如請求項26之用途，其中該非人類動物為豬。 28· —種如請求項17之嵌合竹嵌紋病毒顆粒之用途，其係用 於製造在個體内引發免疫反應之藥物。 29.如請求項28之用途，其中該個體為人類。 30·如請求項28之用途，其中該個體為非人類動物。 3 1 ·如請求項30之用途，其中該非人類動物為豬。 124378.doc 200844227 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：（無） (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無） 124378.doc