TW200836762A - Polymeric short interfering RNA conjugates - Google Patents

Description

200836762 九、發明說明： 相關申請案之交又參考 本申請案主張來自2006年11月27曰提出申請之美國 臨時專利申請案序號60/861，382及2〇〇7年4月13日提出 申請之美國臨時專利申請案序號6〇/91 1,739之優先權利 盈。每一個前揭申請案的内容均以引用方式納入本文中。 【發明所屬之技術領域】

本發明係關於聚合性siRNA共軛物，及使用共軛物在 活體内與試管内向下調節基因表現及用於抑制癌細胞生長 之方法。 【先前技術】 小型干擾性RNA或短型干擾性RNA ( sh〇rt interfering RNA，siRNA)為雙股RNA分子。siRNA干擾基因表現及 誘發自該基因表現之mRNA的降解。因此，以siRNA介導 之RNA干擾在過去幾年突顯為潛在有力的抗癌治療劑。 然而，短型干擾性RNA ( siRNA )作為治療劑的發展由於 其之無效輸送、欠佳的穩定性及差強人意的藥物動力學 (pharmacokinetic，PK)特徵而受到限制。 宫有一些提議被提出來克服使用siRNA作為治療劑的 P早礙。用於改進siRNA的輸送及增強其細胞攝取的該等膏 試之一導向利用脂質體及奈米顆粒。參見Yan〇等人之

Clinical Cancer Research, 10:7721-7726; Bartlett 等人之 Bioconjugate Chem.，18:456-468。其他的嘗試包括聚合物 的使用，如玻尿酸奈米凝膠。參見Lee等人於2007年印 5 200836762 製中的 Journal 〇f Conir〇lled Release，“

Intracellular delivery of siRNA Using Degradable Hyaluronic Acid Nanogels”。或者，企圖改進siRNA輸送的其他嘗試 中，轉染劑被用於改進siRNA輸送的嘗試中。參見Wang 等人於 2007 年印製中的 J〇urnal 〇f m〇chemical and

Biophysical Methods», ^An Intracellular Delivery Method

For siRNA By An Arginine-rich Peptide”。然而，在活體内 使用治療性siRNA時不希望使用轉染。目前，直接的腔内 注射仍為主要的投藥途徑。雖然有嘗試及進步，但是對提 供改良之siRNA輸送系統仍有持續的需求。本發明滿足該 需求。 【發明内容】 發明概要 為了克服上述問題及改進siRNA輸送的技術，故提供 新穎聚合性siRNA輸送系統。

在本發明的一個觀點中，其係提供式（1)之siRNA共軛 物·· $ A^l^(R2)e-R3 其中： A包括封蓋基團或R，3-(R，2)e，-;

Ri包括實質上非抗原水溶性聚合物； R2及R’2為獨立地選擇之可釋放或持久性連接基或其組合 物；及 反3及R’3為相同或不同的含siRNA之部分·，及 6 200836762 ^ (:)及(〇為相同或不同的正整數，較佳為1或2， 中I及R 2與含siRNA之部分的意義股連接。 在本發明的一個較佳的觀點中，含siRNA之部分與本 文所述之化合物的聚合性部分經由可釋放性連接基連接。 或者可釋放性連接基較佳為細胞内不穩定之連接基及/ 或對酸不穩定之連接基。 在本發明的另一較佳的觀點中，其係提供抑制基因表 現之方法，如用於BCL2。該方法包括使人類細胞，如癌 細胞或組織與本文所述之pEG_siRNA共輛物接觸。該共輕 物"V在人類細胞及組織中被治療之細胞中的mRNA 或蛋白質向下調節。 在另一較佳的觀點令，使用本文所述之PEG_siRNA共 扼物的冶療允許BCL2 mRNA向下調節及與惡性疾病治療 有關的附加利益，如抑制癌細胞生長。該等治療法可以呈 單一治療或呈有-或多種有用及/或經許可之治療的組合 _ 治療法的一部分而進行。 本發明的一個優勢在於定製化可釋放性pEG-連接基技 術提供一種於活體内投予siRNA分子之方法。該輸送技術 与強siRNA之生物穩定性及治療效力。 本文所述之siRNA共軛物穩定在生物流體中的 siRNA。無意受到理論的限制，咸信共軛物增強siRNA之 穩定性，至少部分係經由增加對核酸酶的抗性。聚合性 siRNA共軛物在緩衝條件下也具有穩定性。此外，因為 siRNA為共軛物的一部分，所以不會過早自身體排泄。 7 200836762

另一優勢在於本文所述之共輛物允許調節siRNA的藥 物動力學性質。siRNA自聚合性共軛物的釋放速度/位置 可被修改。與本文所述之聚合物連接的siRNA可以預定且 可預測的速度釋放，因此允許技術人員達成所欲的治療性 SlRNA的生物利用率。帶負電荷之治療性siRNA的釋放位 置也可被修改，即在不同的細胞室釋放。因此，本文所述 之聚合物輸送系統允許選擇性地在所欲之標靶區域，即細 胞質’獲得足夠量的治療性siRNA。特別地，因為siRNA 與聚合物經由意義股共輒，所以siRNA分子的反義股可在 細胞質的酸性環境下自siRNA雙股解離並誘發所欲之RNA 干擾。反義股完全不受聚合物共軛拖累。單獨修改時間與 空間或與治療劑釋放組合有利於疾病的治療。 本發明進一步的優勢在於本文所述之共輛物允許在沒

有轉染劑的存在下於癌細胞中的細胞攝取及特異性mRNA 向下調節。這是超越先前技藝技術的重大優勢，並因此明 頒地簡化治療攝生法。本技術可適用於活體内投予治療性 siRNA 〇 其他及更多優勢將從下列敘述中顯而易見。 就本發明的目的而言，術語、、殘基〃應理解為意指在 以其他化合物進行取代反應之後繼續存在的化合物（其所 指者，即PEG、募聚核苷酸等）部分。 就本發明的目的而言，術語、、聚合性殘基或、、PEG 歹成基應分別理解為意指在與其他化合物、部分等進行反 應之後繼續存在的聚合物或PEG部分。 8 200836762 就本發明的目的而言，術語、、烷基〃應理解為包括直 鏈、支鏈、經取代，例如，鹵基·、烷氧基-、硝基_，（^.12 烧基’但是較佳為C1_4烷基、c3_8環烷基或經取代之環烷 基等。 就本發明的目的而言，術語、、經取代〃應理解為包括 以或夕個不同的原子加入或置換在官能基或化合物内所 包括的一或多個原子。

就本發明的目的而言，經取代之烷基包括羧烷基、胺 烷基、二烷胺基、羥烷基及巯烷基；經取代之烯基包括羧 烯基、胺烯基、二烯胺基、羥烯基及巯烯基；經取代之炔 基匕括羧炔基、胺炔基、二炔胺基、羥炔基及巯炔基；經 取代之環烷基包括如4'氯基環己基之部分;芳基包括如萘 土之卩刀，#工取代之芳基包括如 >演苯基之部分；芳燒基 包括如甲笨基之部分；雜烷基包括如乙基噻吩之部分；經 取：之雜烷基包括^ 3_甲氡基噻吩之部分；烷氧基包括如 甲乳基之部分；及苯氧基包括如3·石肖基苯氧基之部分。南 基應理解為包括氟基、氯基、碘基及漠基。 、本餐日月的目的而言，、、正整數/應理解為包括等於 或大於1之整數，並如那些具有通常知識者所瞭解在具有 通常知識之技術者認為合理的領域内，即較佳地從1 ^約 10 ’在一些具體實例中，更佳為1或2。 就本發明的目的而言，術語、、有效量"及、、足夠量" 應“達成所欲效果或治療效果的量，該等效果為那 所屬技術領域+具有通常知識者所暸解。 二 9 200836762 【實施方式】 發明之洋細欽述 A ·綜述 在本發明的一個觀點中，其係提供式⑴之siRNA共軛 物： A_Rr(R2)e_R3 其中： A包括封蓋基團或R，3-(R，2)e，_ ;

Ri包括實質上非抗原水溶性聚合物； I及R’2為獨立地選擇之可釋放或持久性連接基或其組合 物；及 I及R’3為相同或不同的含siRNA之部分；及 ()()為相同或不同的正整數，較佳為1或2， 其中R2及R’2與含siRNA之部分的意義股連接。 I月的個觀點中，本文所述之共軛物包括封蓋 土 H NH2、〇H、C〇2H、C"烷氡基及 CV6 烷基。 在-個較佳的觀點中，封蓋基團包括叫或啊。 在本發明的另一觀點中，共軛物具有下式： 觸該1^所涵蓋之聚合物可因此包括直鏈服、雙-PEG、U-PEG及多臂式pEG。 又 在一個較佳的具體實例中，本 下式： +又所述之共軛物可具有 200836762 Ατ—z Z—CCHeCH^—z 眺 Ό Ζ f m,

Ο

-i〇CH胸心 2 〜(OC^CI^、〆 及 叫、〇 聊 CHaCH^ Z^OCH2C%),

，◎—(CH2pH2〇k^—Ζ 侧 ^{CHaCHgOk^

x(CH2CH2〇)irZ

x(CH2CT2〇W

^fOCHgCHakO Ο^ΟΗ2〇Η2〇)η-Ζ (He) 其中： (n)為從約10至約2300之整數，其中聚合性部分的總分子 量係從約2,000至約100,000道耳頓； A!包括封蓋基團，如Η、NH2、OH、C02H、CV6烷氧基、 CV6烷基及經Cw烷基取代之胺，較佳為CH3或CH30 ; 一或多個Z可為-(R2)e-R3 ;及 所有的其他變化如先前所定義。在供選擇的觀點中，一或 11 200836762 ' 夕個Z基團可為除了 -(R2)e-R3之外的基團，如封蓋基團， 即Η、OH、CH3、OCH3或經C〗·6烧基取代之胺，如正丁胺。 較佳地，在使用多臂式聚合物，如八臂;式聚合物，的共概 物中，一個Ζ基團包括及其他的ζ基團包括封蓋 基團或官能基。 1 在本發明的一個較佳的觀點中，其係提供使用可釋放 性PEG(rPEG)連接基技術之聚合性siRNA共軛物。該含有 siRNA之部分經由至雙股之意義股的可釋放性連接基與本 文所述之化合物的聚合性部分連接。其中，可釋放性連接 基可為基於消除苯甲基之連接基（benzyl eliminati〇n_based

Hnkers)、基於鎖三烷基之連接基（trialkyl l〇ck_based Hikers)、基於二羥乙甘胺酸之連接基、二硫化物鍵、含 月宗之連接基及含硫代丙酸酯之連接基。或者，可釋放性連 接基可為分子内不穩定之連接基、分子外連接基或對酸不 穩定之連接基。更佳地，可釋放性連接基為分子内不穩定 • 之連接基或對酸不穩定之連接基。 在本發明的另一較佳的觀點中，具有可釋放性連接基 的聚合性siRNA共輛物使用BCL2 siRNA。BCL2蛋白質在 許多類型的腫瘤中過度表現。或者，具有通常知識者將認 知具有類似於抗癌症或其他疾病之生物活性的供選擇之適 合的致癌基因可被用在聚合siRNA共扼物中。 在本發明更佳的觀點中，其係提供可釋放性PEG-siRNA共軛物，其中該siRNA雙股的意義股之5，_末端與 C6-胺基尾端連接，供與PEG連接基共軛。 12 200836762 Β·實質上非抗原性聚合物 在本文所述之化合物中所使用的聚合物較佳為水溶性 聚合物且實質上非抗原性，如聚環氧烧（polyalkylene oxides，P AO ) 〇 在本發明的一個觀點中，本文所述之化合物可包括直 鏈，末端支鏈或多臂式聚環氧烷。在本發明的一些較佳的 具體實例中，聚環氧烷包括聚乙二醇及聚丙二醇。

在本發明的大部分觀點中，聚環氧烷具有從約2,000 至約100,000道耳頓之平均分子量。較佳地，聚合物可從 約 5,000至約 60,000道耳頓，更佳為從約20,000至約 45,000。還更佳地，該聚合物具有約30,000道耳頓之重量 平均分子量。其他的分子量也被涵蓋，以符合技術人員的 需求。 聚環氧烷包括聚乙二醇及聚丙二醇。更佳地，聚環氧 烷包括聚乙.二醇（PEG) 。PEG通常以下列結構表示： -0-(CH2CH20)n- 其中（η)為從約10至約2,300之整數，並取決於在使用多 臂式聚合物時的聚合物臂數量而定。或者，本發明的PEG 殘基部分可以下列結構表示： 13 200836762 如(eR^k^r(Cifc)祕 其中： Y71及γ73獨立地為ο、s、so、S〇2、nr”或鍵； Y72 為 Ο、S 或 NR74 ;

Rm係獨立地選擇自氫、Cl-6烷基、c2 6烯基、Ch炔基、 C3·!9支鏈烷基、Cs·8環烷基、經取代Ci·6之烷基、經取代 q_6之烯基、經取代Cw之炔基、經取代q·8之環烷基、 芳基、經取代之芳基、雜芳基、經取代之雜芳基、Cl 6雜 少兀基、、工取代之Cu雜烧基、c1-0烧氧基、芳氧基、^ 雜烷氡基、雜芳氧基、C26烷醯基、芳羰基、Cm烷氧= 奴基、芳氧基羰基、C2·6烷醯氧基、芳基羰氧基、經取代 q·6之烷醯基、經取代之芳羰基、經取代Cw之烷醯氧基、 經取代之芳氧基羰基、經取代C2·6之烷醯氧基及經取代之 芳基羰氧基之中者； (a2)及（b2)獨立地為〇或正整數，較佳為〇或從約i至約6 之整數’而更佳為1;及 (η)為從約1〇至約2300之整數。 支鏈或U-PEG衍生物被敘述在美國專利第5,643,575 號、第 5,919,455 號、第 6，1 13,906 號及第 6,566 5〇6 號， 每一個該等揭示内容以引用方式納入本文中。該等聚合物 的非限制性名單對應於具有下列結構的聚合物系統（i)_ (vii)： 200836762 ο _Ε(3-τΟ— 1* 〇μ2 Ο^ II mPE©—"Ο—6、

Cff

Yet I -Ο—C、 Ϊ62 ϊ 雜

m-PB

ΟII ψ m-ΡΕΘ—Κ- pH—(Yg^y^cco)， 輒 15 200836762 . οII Η II ο β»~fYeaCHaWi妒0 卜 -w 雜 Ο ^ΡΕΘ-Ο^ -ΝΗ <CH2^2 I Ν- r8fer(eH—〇)—

πΐτΡΒΜ>—ΟΙ! x(CH2)w63 Ο ιϊι-ΡΕΘηΟ-C- 履 C<pH2)w621 HC~^(VesCHzWtq 脅

m-PEG^O—CII O o ·〆 iOHaUs 桃 及 n^EG- ψώ^ι m-ΡΕΘ—Cm HC--CVesCl^^CHS)- o 16 200836762 其中： ΥόΙ-62獨立地為0、S或NH61 ·， Y63 為 Ο、nr62、s、so 或 s〇2; ㈣2)、（w63)及（w64)獨立㈣G或正整數，較佳為〇或從 約1至約3之整數； (w61)為 0 或 1 ; mPEG為甲氧基PEG ; 其中PEG如先丽所定義，而聚合物部分的總分子量係從約 2,000至約1〇〇,〇〇〇道耳頓；及 R01及R62獨立地為可用於r?3的相同部分。 在還有的另一觀點中，該聚合物包括多臂式pEG_〇H 或、、星式-PEG，，產物，如那些N〇F公司於2〇〇6年4月的 第8版之Drug Delivery System目錄中所述者，其揭示内 容以引用方式納入本文中。也參見Shearwater C()rp()ratiQn 的 2001 年目錄”P〇lyethylene Glycol and 以❿心⑵ f〇r Biomedical Application”，其揭示内容以引用方式納入本文 中。ό亥夕臂式I合物共辆物包括四或多個聚合物臂，而較 佳為4或8個聚合物臂。 以說明而非以限制為目的，多臂式聚乙二醇 (polyethylene glycol，PEG)殘基可為： 17 200836762 關_〇— Ί / ..

Ο—《OH2CI%C%H

HC--0~{CHaCH2〇kH

HsC 一 O Hf~ o^mu^ms

O—(CH2C^〇kH

其中： (X)為0及正整數，即從約0至約28 ;及 (η)為聚合度。 在本發明的一個特定的具體實例中，多臂式PEG具有 下列結構： h2c^ο—^η^ι^ο_

I HC—O—(CH^CHaO^M 1 *

其中（η)為正整數。在本發明的一個較佳的具體實例中，該 聚合物具有從約5,000道耳頓至約60,000道耳頓之總分子 18 200836762 , 量，而較佳為從20,000道耳頓至45,000道耳頓。 在還有的另一個特定的具體實例中，該多臂式PEG具 有下列結構：

其中（η)為正整數。在本發明的一個較佳的具體實例中，多 臂式聚合物的聚合度（η)係從約28至約350，以提供具有 從約5,000道耳頓至約60,000道耳頓之總分子量的聚合 物，而較佳為從12,000道耳頓至45,000道耳頓。這代表 在聚合物鏈中的重複單元數量，並取決於該聚合物的分子 量〇 聚合物可轉化成適當地活化之聚合物，該轉化係使用 在美國專利第5，122,614號或第5,808,096號中所述之活化 技術。該等PEG尤其可具有下式： 200836762 ^CKCH2CH^ XOOHaCH^ ^CHaCHr-iOCH^pH^/

或 養、 星式

o—(CH2CH2〇)^m2mf0^ 卜 0〜OHaCH2-《OCH^H^0" '°^CH2CH20)u.-CH2CH2-〇^ 多臂式， - 、‘- 其中（u，）為從約4至約455之整數；而殘基的達3個末端 部分被甲基或其他低碳烷基封蓋。 在一些較佳的具體實例中，所有四個PEG臂可轉化成 適合的活化基團，以加速與芳香族基團的連接。該等化合 物在轉化之前包括： 20

，(〇〇¥^0^0、—C_，a·

^〇^i〇mt^^i -GHgC9 ^V^CHak

^p\2〇h^m2〇^〇B 0、(她眺•〜她CW2、〇H 2〇〇836762

HP- H〇—ch2ch2 'C^CH2^(〇gH2CH2}u^ 、<〇Η2α^ο>Μ、 h3o(oc^C 略一〇 HaiHOO^GH^

<〇Η2〇Η2〇)^ΟΗ2〇%~ΟΗ (CHaCHaOk-CHs

HaC-COCHaCH^— HaCiOOHsCHaV^

〇-(CH2GH2〇)u^CH3

^{QH^OHaOV-CHaCHs—OH

HaCi〇CH2CH2)^0 h3ch〇c_h^-

〇—(CH2〇Ha〇V-CH2CH2—〇H

(eHaO^OXy—CH2CH2—OH HO-CHaCHa-COCHaCHa^

ICHaCI^O^—CH3

0—^CHaO^CHaOHi—OH H〇-CH2042-C〇CH2C 鳴

HgC-COGHaCH^

(CHaCHaO^-CHa α-(ΟΗ2Οΐ4〇^〇Η2〇Η2~ΟΗ H30(OCH2CH2)^a

0^H2CH2〇^-CH2Ct^〇H HO-CHgCHa-COCHaCHa)^ 22 200836762 HO-CH^CIViOa^CI^—Ο H3C-(OCH2CH2^

及 1〇»2〇«2€%-0^0^—0» HO-CH2CH2-(OCH2CH2)u^

^(0Η20Η2Ο^0Η2ΟΗ2~ΟΗ ΗΟΟΗ2〇Η2-{ΟΟΗ^Η2)^

^CHaCHaOV-CHaCHa-OH

在本文所包括的聚合性物質較佳地在室溫下具有水溶 性。該等聚合物的非限制性名單包括聚環氧烷均聚物，如 聚乙二醇（peg )或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、其共 聚物及其嵌段共聚物，其先決條件為維持嵌段共聚物的水 溶解度。

在另外一個具體實例中，可使用一或多種有效的非抗 原性材料作為基於聚環氧烷之聚合物的替換物，如聚葡萄 糖、聚乙烯醇、基於碳水化合物之聚合物、羥丙基甲基丙 烯胺（hydroxypropylmethacrylamide，HPMA )、聚環氧 烷及/或其共聚物。也參見共同選定之美國專利第 6,1 5 3,655號，其内容以引用方式納入本文中。那些具有通 常知識者應瞭解相同類型的活化作用，如本文所述，被用 作於聚環氧烷，如PEG。那些在所屬技術領域中具有通常 知識者進一步理解上述名單只用於說明而已，並涵蓋具有 本文所述之品質的所有聚合性材料。就本發明的目的而 言，'、實質上或有效的非抗原性〃意指在所屬技術領域中 23 200836762 所瞭解的所有材料在哺乳類中不具有毒性且不會誘發可觀 的免疫性反應。

在一些觀點中，具有末端胺基團的聚合物被用於製造 本文所述之化合物。用於製備具有高純度的含末端胺之聚 合物的方法被敘述在美國專利申請案第π/508,5〇7號及第 1 1/53 7,172號中，每一個該等内容以引用方式納入本文中。 例如’具有疊氮化物之聚合物與基於膦之還原劑，如三苯 膦’或驗金屬硼氫化物還原劑，如NaBH4反應。或者，含 有脫離基的聚合物與經保護之胺鹽，如甲基第三丁基醯亞 胺基二碳酸之鉀鹽（KNMeBoc)或二-第三丁基醯亞胺基 二碳酸之鉀鹽（KNB〇C2)反應，接著將經保護之胺基團去 保護。以該等方法所形成的含末端胺之聚合物的純度大於 約95%，而較佳為大於99%。 在供選擇之觀點中，具有末端羧酸基團的聚合物可被 用於本文所述之聚合物輸送系統中。用於製備具有高純度 的含末端羧酸之聚合物的方法被敘述在美國專利申請案^ 1 1/328,662號中，其揭示内容以引用方式納入本文中。'該 方法包括先製備聚環氧烷之第三烷基酯，接著轉化成其羧 酸何生物。以該方法製備聚環氧烷羧酸的第一個步驟包括 形成中間⑯’如聚環氧絲酸的第三丁 S旨。該中間物係藉 由聚％氧烷與鹵基乙酸第三丁酯在鹼，如第三丁醇鉀的存 在下反應而形成。-旦形成第三丁 S旨中間物時，可輕易地 提供純度超過92%之聚環氧烧的羧酸衍生物，較 97% ^ 99% , 24 200836762 c. r2及r’2基團 在本發明的-個觀點中，siRNA可與本文所述之化人 物的聚合性部分經由不論是單獨或組合使用的持久性連接 基及可釋放性連接基連接。t本文所述之絲物使用二或 多個連接基時’即⑷（或（e，））等於或大於2，則用於& (或R’2)&二或多個連接基可相同或不同。纟關乎所選 擇的連接基（類）’應瞭解彼等係使用那些具有通常知識 者熟知的合成技術與共軛物的其餘部分連接。也參見下列 的實施例1-3。 在本發明的一個較佳的觀點中，在本文所述之共軛物 包括與可釋放性連接基連接的siRNA。本發明的一個優勢 在於siRNA可以被控制方式釋放。 其中，可釋放性連接基可為基於消除苯曱基之連接基、 基於鎖三烷基之連接基（或基於三烷基鎖内酯化）、基於 二羥乙甘胺酸之連接基、對酸不穩定之連接基、溶體上可 裂解之肽及組織蛋白酶B ( capthepsin B )可裂解之肽。其 中，對酸不穩定之連接基可為二硫化物鍵、含腙之連接基 及含硫代丙酸酯之連接基。或者，可釋放性連接基可為分 子内不穩定之連接基、分子外連接基及對酸不穩定之連接 基。較佳地’可釋放性連接基為分子内不穩定之連接基及 /或對酸不穩定之連接基，並且可加速在細胞質中siRNA 自式（I)之共軛物釋放。 可釋放性連接基具有下式： 25 200836762

26 200836762

姻‘a^H^OEfeDOHrCH^H AM»C^CH^OH2SCB^C_、 27 200836762 其中： Y】1-19獨立地為〇、S或Nr48; 、玟5().51及a5i係獨立地選擇自氫、Cw烷基、C312支 鏈烷基、Cw環烷基、經取代c〗·6之烷基、經取代Gy之 環烧基、芳基、經取代 、 叭之方基、方烷基、Cl-6雜烷基、經 取代之雜燒基、Ci 6烧氧基、苯氧基及雜炫氧基 之中者；

Ar為芳基或雜芳基部分；

Ln-u係獨立地選擇自二官能性間隔基； J及J’係獨立地選自主動輸送至標把細胞中的部分、疏水 性部分、二官能性連接部分及其組合物之中者；

Gil)、（hii)、（ku)、（111)、（mll)及（1111)係獨立地選擇自 正整數，較佳為1 ; (a11)、(e11)、（g11)、（j11)、（oil)及（qll)係獨立地為 〇 或 正整數，較佳為1 ;及 (bll)、（xll)、（x’u)、（m)、（iu)及（pll)係獨立地為 〇 或1。 該主動輸送至標靶細胞中的部分可具有下列結構：

28 200836762 ' 其中Ls為二官能性連接基及¥4為O、S或NRU，其中Ru 可廷自氫、Cw烷基、Cm支鏈烷基、Cw環烷基、經取 代G·6之烷基、經取代c3 8之環烷基、芳基、經取代之芳 基、芳烷基、Cw雜烷基、經取代之6雜烷基、c1-6烷 氧基、笨氧基及雜烷氧基。 各種可釋放性連接基、基於消除苯曱基之連接基或基 於鎖三烧基之連接基被敘述在共同選定之美國專利第 參 6，180,095 號、第 6,720,306 號、第 5,965，119 號、第 6,624，142 唬及第6,303，569號中，每一個該等内容以引用方式納入 本文中。基於二經乙甘胺酸之連接基也被敘述在共同選定 之美國專利第7，122，189號及第7,087,229號與美國專利申 明案第 10/557,522 號、第 1 1/502，1〇8 號及第 11/〇11，818•號， 每一個該等内容以引用方式納入本文中。 在一些較佳的具體實例中，siRNA與本文所述之共軛 物的聚合性部分經由對酸不穩定之連接基連接。無意受到 ^ · 任何理論的限制，對酸不穩定之連接基加速募聚核苷酸自 細胞内，也自溶體、吞噬小體或巨胞飲體中的母體聚合性 化合物釋放。 I及R’2可包括二官能性連接基，如胺基酸或胺基酸 衍生物。胺基酸可為天然生成及非天然生成之胺基酸。天 然生成之胺基酸與各種所屬技術領域已知的非天然生成之 胺基酸（D或L )的疏水性或非疏水性衍生物及類似物也 被涵蓋於本發明的範圍内。非天然生成之胺基酸之適合的 非限制性名單包括2-胺基己二酸、3_胺基己二酸、丙胺 29 200836762 , 酸、胺基兩酸、2-胺基丁酸、4-胺基丁酸、六氫吡啶酸、 胺基己酸、2-胺基庚酸、2-胺基異丁酸、3-胺基異丁酸、 2-胺基庚二酸、2,4-胺基丁酸、鎖鏈酸、2,2-二胺基庚二酸、 2,3 _二胺基丙酸、Ν-乙基甘胺酸、Ν-乙基天冬醯胺酸、3-羥基脯胺酸、4-羥基脯胺酸、異鎖鏈酸、別-異白胺酸、Ν-甲基甘胺酸、肌胺酸、Ν-甲基異白胺酸、6-Ν-曱基賴胺酸、

Ν-曱基、顯胺酸、降顯胺酸、降白胺酸及鳥胺酸。一些較佳 的胺基酸殘基包括甘胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸及肌胺酸。 該等二官能性連接基也被用於Ln.15基團。 接基： 或者’ r2* R，2基團可為選自下列之中的二官能性連 30 200836762 -[CC=〇)M〇t22R23MC(=0)3v-, fC_^〇P^E23)l^_v、 -[C ㈣ |^O^Rdfe3)^[C_v、

併0)】識卿^3)|(：(哪#， 4ce〇)W〇R22i23^He^g^PH>)k·， ，_1^2^3)_^购在*闕，】广， [C^lvOCCRdK^MOW^OH^、 修规OP^Rss^NlariCidMd^C^、 -[CH^CORdR^CCR^^^H)», 4〇H>>]獅 iCCR^s)則C^ag[C ㈣】广， 价 〇)]典 iCCR^sPl^Cla^rpH^， -[CH^W^CCKdRa^NCRagRasMCH^，

-[eH^CO^aO^gR^C^H^， -[C^mOCO^RasCRagE^PH^CH^、 ，[c^q» 鄰 R^CE^QMCeOMy、 31 200836762 [CeOPfRWCR—CR—C^NR^q：，]^， -0^_〇_Λ^8Κ29〇Μ^^[€Η^、 jc^pu^co^jcm^oMa^iR^tc^oWv- ? ^CH^MC^Ra^MGR^RasCR^OMCC-O^、

iCW^Md^MOR^sC^sR^rNl^CH^、 4CH>>]挪 i^sC^R^MpR^fe^CH^、 -[CH^oCCSdMi^^sa^s關 e[CH%^ 4CH5)胸 i(a^2Ra〇Rd^〇)iP^ila5)r〇[CC-.， -fCHW^CCR^MC^RasC^R^OHq^O^、 4€；Η%Μ^ι(€ΚΛ3Μ€ΚΛ5€ΕΛ9〇)τΜ^Η»】ν，、

(〇4fe)eNEy[CH>)]^

((¾¾ 綱c^OHf

(€R2As)f^26CCC^)]ir R27 -[CH^lv^i^^

CC%4^〇[ce〇)V 7 32 200836762 其中：

R 29、系獨立地透自氫、Gy烷基、支鏈烷基、c"環 土 、、二取代c^6之烷基、經取代CM之環烷基、芳基、 經取代$ $ | 4 土方烷基、Ci_6雜烷基、經取代之Ci-6雜烷 基、Cl·6烷氧基、笨氧基及Cw雜烷氧基之中者； ⑴及（t )獨立地為G或正整數，較佳為〇或從、約i至約12 之正數，更佳為從約1至約8之整數，而最佳為1或2 ; 及

(V)及（ν’）獨立地為〇或b 該等一 s能性連接基也可被用於基團。 較佳地，二官能性連接基可選自下列之中者： 33 200836762 -[cc^^pucofcMaa^cycBb)禪[C(^k、 4CHW®CCKWfiW(C3i2〇92〇)iNH[eH>)l·-， -f〇HW«ICCIfeaB^NHpKi2CI^[#<%r, 收㈣l· NH(C%CH^S0%d%MCH^ jCHJXPH^O^CHyCifeC^ceO)]^ 40^01 禪^OHi%C〇3MCH>^、

{C^P^OfeCll^sOTaMC^OXl 广， - [CHmNBrabaaaNHtqoir， 4C ㈣ ρι^ο^αι^οι^Η^、 -[CHWratPfeCHaW ㈣ If， 彻，师__〇)併〇)]广、 和㈣] -[en^c^ofec% ㈣ tcn^p、 •[C^C%D(CH2P®(CBbMCH%-, -[€ ㈣ μ^α^ΝΗΙΡΗ%、

4CH%o^H2)2〇caBbMcH^、 -[CH^CNP^spa^tq^、 《CHmopBOThPHtCH%.， 34 200836762 -Ich%o 雜 cn^ofc㈣严， -KHmcaecaoMCH^， ，[C ㈣ICH^IMC 农_^SC%[C㈣l·、

—PH>1i〇〇H2~^ ^-ch2mm【ch%~

讲0聊叫乂 JhCHzNHPH^- 及

6_|0 ㈣ — 其中⑴及（r’）獨立地為0或1， 前提為⑴及（r，）二者不同 時為0。 在本發明進一步的供選擇觀點中，二官能性連接基包 括： 35 200836762

該等一官能性基團允許第二劑直接共軛，而因此消除 連接與第二劑共輛之官能基的需求。 在供選擇的具體實例中，二官能性連接基包括對應於 該等於上所示者之結構，並具有如乙烯基、乙烯砜之殘基、 胺基、羧基、黢基、硫代丙酸酯、醯肼、肼基甲酸酯及取 代順丁細二酸醯亞胺基之類似物的基團。 那些具有通常知識者已知的其他持久或可釋放性連接 基也被涵盍於本文所述之共輛物的範圍内。 D·含siRNA之部分 本文所述之共軛物可被用於輸送各種siRNA至細胞或 組織中。 一 為了更完全理解本發明的範圍，故定義下列的術語。 技術人員應理解術語、、核酸〃或、、核苷酸〃應用於去氧相 糖核酸（、、DNA”）、核糖核酸（、、RNA〃），不論是爷 為單股化或雙股化，除非有另外的指明，及其任何化=修 改物。、'寡聚核苷酸〃通常為相對短的聚核苷酸，例2 γ 36 200836762 ， 在從約2至約200個核苷酸長度之尺寸範圍，或更佳為從 約10至約30個核苷酸長度。根據本發明的寡聚核苷酸通 常為合成之核酸，且為單股型，除非有另外的指明。術語 ''聚核苷酸//及、、聚核酸可於本文以同義詞使用。 如本文所使用，術語、、反義〃或、、反義股，，係指與編 碼基因產物或編碼控制序列之特異性DNA或RNA互補的 核苦酸序列。在正常的細胞代謝操作中，Dna分子的意義 _ 股為編碼多肽類及/或其他基因產物之股。反義核酸分子 可藉由任何所屬技術領域已知的方法產生，包括藉由在反 方向上接合所關注的基因（類）與病毒啟動子而合成產生， 其中該病毒啟動子允許合成互補股。一旦引入細胞中，該 轉錄之股與細胞所產生的天然序列組合，形成雙股。該等 雙股接著阻斷進一步轉錄或轉譯。命名、、負，，或㈠也為所 屬技術領域已知的，係指反義股，而、、正〃或（+)也為所屬 技術領域已知的，係指意義股。 _ 就本發明的目的而言，、、互補應被理解為意指核酸 序列與另一 RNA序列形成氫鍵（類）。互補百分比指出 在核酸分子中可與第二個核酸序列形成氫鍵，即華生_克里 克（Watson-Crick)鹼基配對的連續殘基之百分比，即 個之中的 5、6、7、8、9、10 個為 5〇%、6〇%、7〇%、8〇 %、90%及1〇〇%互補。、、完全互補〃意指核酸序列所有 的連續殘基與在第二個核酸序列中相同編號的連續殘基形 成氫鍵。 寡聚核苷酸（類似物）不限於寡聚核苷酸的單一物種， 37 200836762 但是反而被設計與各種廣泛的該等部分起作用，應瞭解連 接基可與一或多個3、或5，_末端，通常為核苷酸的p〇4或 SO*基團連接。所涵蓋的核酸分子可包括硫代磷酸酯核苷 酸間連接修改物、糖修改物、核酸驗基修改物及/或填酸 酉曰主鏈修改物。暴聚核苷酸可包括天然磷酸二酯主鏈或硫 代鱗酸S曰主鏈或任何其他經修改之主鏈類似物，如Lna(鎖 核酸）、PNA (具有肽主鏈的核酸）、CpG寡聚物及類似 物，如該等在内華達州拉斯維加斯於2〇〇2年5月6-8曰之 Tides 20025 Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences 及德國漢堡市於 2003 年 11月之

Oligonucleotide & Peptide Technologies，18th & 19th 中所 揭示者，該等内容以引用方式納入本文中。 根據本發明的募聚核苷酸也可視需要包括所屬技術領 域已知的任何適合的核苷酸類似物及衍生物，包括該等以 下列表1中所列者。

38 200836762 表1 代表性核苦酸類似物及衍生物 4-乙醯基胞苷 ---, 5 -曱氧基胺基甲基-2 -硫代尿苦 5 -(魏基經甲基)尿皆 沒，D-甘露糖基Q核苷 2’-0-甲基胞苷 5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷 5-羧甲基胺基甲基-2- 硫代尿苷 5-甲氧基羰基甲基尿苷 5 -魏甲基胺基甲基尿苷 5 -甲氧基尿苦 二羥基尿苷 2-曱硫基-N6-異戊烯基腺苷 2’-0-甲基假尿苷 N-((9- /3 -D-核呋喃糖基-2-甲基 硫代嗓吟-6 -基）胺甲酿基）鍊胺 酸 D-半乳糖基Q核普 -----—— N-((9- yS -D-核呋喃糖基嘌呤-6-基）甲基胺甲醯基）蘇胺酸 2’-〇-甲基鳥苷 尿苦-5 -氧基乙酸曱酉旨 肌苷 尿普-5 -氧基乙酸 N6-異丙稀基腺苦 Wybutoxosine 1-甲基腺苷 假尿苷 1 -甲基假尿苷 Q核苷 1-曱基鳥i 1 -甲基肌^ 2,2··ι£ι 甲苷 2 -甲基腺苦 2-硫代胞苷 5 -曱基-2 -硫代尿蒼 2-硫代尿普 4-硫代尿苷 39 200836762 2 -甲基鳥替 ---— 3-曱基胞苦 5-甲基胞苷 甲基尿苷 Ν-((9-β-核呋喃糖基嘌吟 胺甲醯基）蘇胺酸 N6-曱基 7-甲基鳥苦 5-甲胺基尿苷

鎖腺苷 鎖鳥苷 鎖尿苷 心0-甲基苷 2’ 甲基尿苦 Wybutosine t(3-胺基

鎖胞苷 鎖胸喊p定 鎖曱基胞苷 針對由本發明所涵蓋之寡聚核苷酸的 吕月b基或允許寡聚核苷酸與所欲的聚合物共價連接之部八 加成或取代所選擇之核苷酸，及/或額外的電荷、極化性: 氫鍵結、靜電交互作用及官能度併入寡聚核苷酸中的官能 基部分之加成或取代。該等修改包括（但不限於此）2，_位 置之糖修改、5-位置之嘧啶修改、8-位置之嘌呤修改、在 外環狀胺上的修改、4-硫代尿苷之取代、5_溴基或5_碘基 尿嘧啶之取代、主鏈修改、甲基化、鹼基配對組合，如等 驗性異胞苷和異胍，及類似組合。在本發明的範圍内所涵 蓋之春聚核苦酸也可包括3’及/或5’-封蓋結構。參見在Freier & Altmann; Nucl. Acid Res·，1997, 25，4429-4443 及

Uhlmann; Curr· Opinion in Drug Development，2000，3(2)， 293-213中所述之核苷酸類似物的實例，每一個該等内容 以引用方式納入本文中。 200836762

就本發明的目的而言，、、封蓋結構〃應被理解為意指 已併入在寡聚核苷酸的任一末端上的化學修改。封蓋可以 存在於末端（5、封蓋）或3，-末端（3，-封蓋）上或可存 在於兩個末端上。5，_封蓋的非限制性實例包括反置之鹼基 殘基（部分），4，，5、亞甲基核苷酸、1-(/3 -D-赤呋喃糖基） 核普酸、硫代核苷酸、碳環核苷酸、1，5_脫水己糖醇核 苷酸、L-核苷酸、α _核苷酸、經修改之鹼基核苷酸、二硫 代破酸醋連接、蘇_五呋喃糖基核苷酸、非環3，，4，_sec〇核 普酸、非環3,4-二經丁基核苷酸、非環3,5_二羥戊基核苷 酸、3’，3、反置之核苷酸部分、3，，3，·反置之鹼基部分、3，，2，_ 反置之核苷酸部分、3，，2，_反置之鹼基部分、U4—丁二醇磷 酸醋、3 磷酸醯胺酯、磷酸己酯、磷酸胺基己酯、3，_磷酸 酯、3’-硫代磷酸酯、.二硫代磷酸酯、或橋連或未橋連之膦 酸曱醋部分。細節被敘述在W〇 97/26270中，以引用方式 納入本文中。3’-封蓋可包括例如4,，5，_亞曱基核苷酸、(冷 -D-赤呋喃糖基）核苷酸、4，_硫代核苷酸、碳環核苷酸、磷 酸5’-胺基烷基酯、磷酸丨，3_二胺基丙酯、磷酸3_胺基 丙酉旨、磷酸6-胺基己酯、磷酸152_胺基十二烷基酯、磷酸 羥丙酯、1，5-脫水己糖醇核苷酸、^核苷酸、α -核普酸、 經修改之鹼基核苷酸、二硫代磷酸酯、蘇-五呋喃糖基核苷 酸、非環3’，4’-seco核苷酸、3,4-二羥丁基核苷酸、3,5_二 羥戊基核苷酸；5’，5’-反置之核苷酸部分、5，，5，·反置之鹼 基部分、5’-磷酸醯胺酯、5、二硫代磷酸酯、ι，4-丁二醇磷 酸酯、5、胺基、橋連及/或未橋連之5，-磷酸醯胺醋、硫 41 200836762 代磷酸酯及/或二硫代磷酸酯、橋連或未橋連之膦酸甲酉旨 及5’-魏基部分。也參見Beaueage及Iyer之 Tetrahedron 49, 1925 ;其内容以引用方式納入本文中。

在本發明的一個較佳的觀點中，所涵蓋之siRNA涉及 抑制或向下調節腫瘤細胞抵抗抗癌治療所牵連之基因或蛋 白質。例如，以反義寡聚核苷酸向下調節的任何所屬技術 領域已知的細胞蛋白質，如BCL2可用於本發明的癌症治 療。參見在2004年4月9日提出申請的美國專利申請案 第1〇/822,2〇5號，其内容以引用方式納入本文中。較佳的 冶療的非限制性名單可包括BCL2 siRNA、HIF-la siRNA 及 Survivin siRNA 〇 在一個較佳的觀點中，含有siRNA之部分的每一股可 包括約1 8至約28個與標乾基因互補的核苷酸長度，更佳 為約20至約24個核苷酸，而最佳為約21個核苷酸。核 苦酸長度也可根據技術人員的需求及所欲之互補核酸數量 而改變。在每一股siRNA中，至少約14至24個核苷酸較 佳地與其他股之核苷酸及/或標靶基因完全互補。siRNA 較佳地包括在任一末端上約2個核苷酸長度的3，突出。 在個具體貫例中，雙股化siRNA分子可經由RNA 干擾而抑制或向下調節基因表現，如BCL2基因。在一個 車乂么的具體貝例中，SiRNA分子的反義股包括與bCL2基 因之RNA互補的核苷酸序列，用於siRNA分子經由RNa 干擾邱直接裂解RNA。 在更佳的具體實例中，含有siRNA之部分的反義股包 42 200836762 括約18至約28個與序列識別號（SEQ ID NO) : 1之核 酸序列互補的核苷酸。BCL2基因也被敘述在美國專利第 5,831，066 號、第 6,040，181 號、第 6,414，134 號及第 6,841，541 號中，每一個該等内容以引用方式納入本文中。一個特別 佳的具體實例使用含有序列識別號：3之核酸序列的含有 siRNA之部分的反義股。 BCL2siRNA ： 意義 5’-GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT-3，（序列識

別號：2) 反義 3，-dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU-5’（序歹，J 識 別號：3 )其中dT代表DNA。 在本文所述之共軛物中所使用的siRNA分子可在寡聚 核苷酸的5’或3’末端上以（CH2)W胺基酸連接基修改，其中 在該觀點中的（w)為較佳地從約1至約1 0之正整數，較佳 為6。經修改之寡聚核苷酸可為如於下所示之NH-(CH2)w-寡聚核苷酸：

RL=可釋放性連接基 在一個具體實例中，siRNA之反義股的5’末端被修改。 例如，在聚合性共軛物中所使用的siRNA以5’-C6-NH2修 改。 在供選擇的觀點中，在本文所述之共軛物可包括以含 43 200836762 有受阻酯之（CH2)W胺基連接基修改之siRNA。參見以、'用 於寡聚核苷酸輸送的基於受阻酯之生物可降解之連接基 ( Hindered Ester-Based Biodegradable Linkers for Oligonucleotide Delivery )"為標題之 PCT 申請案第 PCT/US07/78597號及以、'具有基於受阻酯之生物可降解 之連接基的聚環氧烧（Poly alky lene Oxides Having Hindered Ester-Based Biodegradable Linkers) ^ 為標題之 PCT 申請 案第PCT/US07/78593號，每一個該等内容以引用方式納 入本文中。聚合性化合物可釋放不具有胺基尾端之寡聚核 苷酸。例如，寡聚核苷酸可具有下列結構：

在還有供選擇之觀點中，siRNA可以（CH2)W硫氫基連 接基（硫代寡聚核苷酸）修改。硫代寡聚核苷酸可被用於 直接或經由順丁烯二醯亞胺基與連接基之半胱胺酸共軛。 硫代寡聚核苷酸可具有結構SH-(CH2)W -寡聚核苷酸。硫 代寡聚核苷酸也可包括具有下列結構之受阻酯：

44 200836762 E.對應於式I之較佳的具體實例 例如，根據本發明所製備的siRNA共軛物為下列之中 者：

45 200836762

46 200836762 ; 其中含有siRNA之部分的意義股與聚合物共軛。 在較佳的具體實例中，含有siRNA之部分的反義股可 包括約1 8至約28個與在癌細胞或組織中表現或過度表現 之核酸序列互補的核苷酸。在一個特別佳的具體實例中， 含有siRNA之部分可包括與序列識別號：1之核酸序列， 如序列識別號：3之核酸序列互補的核苷酸。 在一個特定的具體實例中，共軛物為下列之中者：

47 200836762 其中siRNA具有序列識別號·· 2及3之核酸序列；而siRNA 的意義股之5’-末端被修改成C6-胺基尾端，供與PEG連 接基共軛。 F.聚合物輸送系統的合成 一般，siRNA共輛物的製造可藉由先製備活化之聚合 物，依次將其與含有siRNA之部分反應，以提供聚合性 siRNA共扼物。貫際的加入次序不限於該次序，並為那此 具有通常知識者所明白，有一些觀點中將peg先加入連接 基中，接著活化該連接基。 在本發明的一些較佳的觀點中’含有〇H或脫離基的 聚合性化合物可先與含有可釋放性連接基的親核劑反應。 可釋放性連接基接著被活化及活化之連接基與含有、 NH2或SH基團之含有siRNA之部分的官能基反應。含有 不同的活化基團之聚合物可提供趨向於各種親和性部分的 不同的化學反應性。例如’順了烯二醯亞胺基及乙稀颯基 團可選擇性地與含# SH之部分反應。關於此具體實例的 一些較佳的觀點之細節被提供在下列實施例中。 在本文所述之所有反應使用具有那些具有通常知識者 已知的必要步驟及條件的標準化學反應。在本文所述之合 成反應因此不需要不當的實驗。 連接基部分與PEG或其他聚合物的連接可使用那些具 有通常知識者熟知的標準化學合成技術，使用聚合物及偶 48 200836762 ^ δ °式片丨或藉由利用活化之聚合物而實行。活化之聚合物部 位’如SE-PEG、PEG_胺、聚乙二醇酸等可從商業來源獲 得或由技術人員合成而不需不當的實驗。 連接基部分與聚合物部位的連接係在偶合劑存在下進 行。適合的偶合劑的非限制性名單包括丨，3_二異丙基碳化 一 fe亞胺（DIPC )、任何適合的二烷基碳化二醯亞胺、鹵 化基-1-炫基喷錠（向井山（)試劑）、 一甲胺基丙基）-3-乙基碳化二醯亞胺（EDC )、丙烷磷酸 襄酐（PPACA )及一氯基磷酸苯酯等，其可取自例如商業 來源，如Sigma-Aldrich Chemica卜或使用已知的技術合 成。 較佳地’反應係在惰性溶劑中進行，如二氣曱烷、氯 仿、DMF或其混合物。反應較佳地可在鹼的存在下進行， 如二曱胺基吡啶（DMAP)、二異丙基乙胺、吡啶、三乙 胺等，以中和所產生的任何酸。該反應可在從約〇t：至高 )φ 達約22°C (室溫）之溫度下進行。 在一個觀點中，與含有SiRNA之部分反應的聚合性化 合物可在pH 5-10之水性溶劑中製備，較佳為使用如pBS 之緩衝溶液的中性pH，以保留siRNA雙股結構的完整性。 較佳地，含有siRNA之部分的意義股可為下列類型之 (1)在寡聚核苷酸的5’-或3、末端上以（CH2)w胺基連接基修 改之募聚核苷酸； (u)在寡聚核苷酸的5’-或3、末端上以硫氫基連接 49 200836762 基修改之寡聚核苷酸； (ill)以（CH2)W胺基連接基或含有受阻酯之（CH2)w硫氫基連 接基修改之寡聚核苷酸。在該觀點中的（w)為較佳地從約^ 至約10之正整數，較佳為6。

siRNA的意義股之修改可藉由所屬技術領域中已知的 標準技術達成。一些經q-nH2修改之意義股也為市場上取 自加州聖地牙哥之TriLink Bi〇Techn〇1〇gies。經修改之意 義股及未經修改之反義股接著黏著及形成siRNA的雙股結 構。可獲得siRNA雙股的意義股與活化之聚合物的創新的 選擇性共輛，部份因為在經修改之siRNA雙股中的芳香族 不具有足夠在共輛反應條件’如水性條件及pH 〇， 下反應的親核性。因此，該反應係在意義股上含有更親核 性修改之末端上進行。 關於形成含有受㈣之寡聚料酸的敘述被敘述在兵 同4定之PC丁中請案第PCT/us〇7/78597號及第 PCT/US〇7/78593號中，其内容以引用方式納入本文中。 在還有的另-觀點中，根據本發明製備的siRNA丘朝 物可包括-❹個可釋放性連接基。參見PCT專利申請索 第㈣贈/娜號，其内容以Μ方式h U中/ 有鑑於上述，本發明也提供向下 胞或組織中的基因表現之方法β p制在人類細 可在活體内及/或試管内達成。或抑制基因表現 該方法包括將人類細胞或 50 200836762 1 、、且織共本文所述之式⑴之siRNA共輛物接觸。一旦發生接 觸，當在活體内或試管内測量時，實現至少約丨〇%的抑制 或向下調節，較佳為至少約2〇%或更高時，則應視為發生 成功的基因表現抑制或向下調節，如mRNA或蛋白質水平。 就本發明的目的而言，、、抑制"或、、向下調節"應被 理解為意指基因表現，或編碼一或多個蛋白質副單元的 RNA或同專rna之水平，或一或多個蛋白質副單元，如 BLC2，之活性被減低至小於在沒有本文所述之共軛物存在 下所觀察者。 在本發明的一個較佳的觀點中，本發明導向siRNA共 軛物，其被靶定為癌症細胞或組織中有關聯且過度表現的 基因，如編碼BCL2之基因。在一個特定的具體實例中， siRNA分子的反義股包括約18至約28個與序列識別號：} 之核酸序列互補的核苷酸。 癌症細胞或組織可為從一或多個下列者··固體腫瘤、 • 淋巴癌、小細胞肺癌、急性淋巴白血病（acme lymphocytic leukemia ’ ALL )、胰臟癌、神經膠母細胞瘤、卵巢癌、 月癌 '乳癌、結腸直腸癌、攝護腺癌、_巢癌及腦腫瘤等。 在另-觀點中，本發明也提供在喷乳類中治療患有癌 症之病患、治療贅生瘤病、減低腫瘤負荷、預防贊生瘤移 轉或預防腫瘤/贅生瘤生長復發之方法。該方法包括將有 效量的含有式⑴之siRNA共軛物的醫藥組成物投予需要其 之病患。例如，如果未經共輛之siRNA(例如，原生的肌2 siRNA )具有對抗某些癌症或贅生έ 乂為玍細胞之功效，則該方法 51 200836762 可包括將含有siRNA之聚合物共軛物輸送至對原生的 siRNA具有易感受性之細胞中。輸送可以作為適合的醫藥 組成物的一部分而於活體内達成或直接輸送至活體外環境 之細胞中。在一種特定的治療中，含有siRNA分子（序列 識別號：2及3 )的聚合性共輛物可被使用。 在還有的另一觀點中，本發明提供用於抑制在活體内 或試管内的癌細胞生長或增殖之方法。該方法包括將癌細

胞與本文所述之siRNA共軛物接觸。較佳地，本發明提供 用於抑制在活體内或試管内的淋巴癌或白血病細胞生長之 方法’其中該細胞表現BCL2基因。淋巴癌或白血病細胞 接觸自本文所述之共軛物所釋放之siRNA。與自人類BCL2 基因表現之mRNA互補的反義股抑制淋巴癌或白血病細胞 的生長及減低BCL2基因在淋巴癌或白血病細胞中的表 現。或者’本發明提供用於調節在癌細胞中的細胞〉周亡之 方法。 在還有的另一觀點中，本發明也提供用於增加在活體 内或試管内的癌細胞或組織對化療劑的敏感度之方法。在 一個特定的觀點中，該方法包括將本文所述之siRNA共軛 物引入癌細胞中，以減低在癌細胞或組織中的BCL2表現， 其中忒siRNA與自BCL2基因表現之mRNA結合並減低 B C L 2基因表現。 在還有的另一觀點中，本發明提供用於殺死在活體内 或試管内的腫瘤細胞之方法。該方法包括將本文所述之 SiRNA共軛物引入腫瘤細胞中，以減低基因表現，如bcL2 52 200836762 基因，並將腫瘤細胞與足以殺死一部分腫瘤細胞之至少一 種化療劑的量接觸。因此，被殺死的一部分腫瘤細胞可大 於在沒有本文所述之siRNA共輛物的存在下以相同量的化 療劑所殺死的部分。 在本發明進一步的觀點中，化療劑可與使用本文所述 之siRNA共輟物之方法同時地或相繼地組合使用。本文所 述之siRNA共輥物可與化療劑同時或在投予化療劑之後投

予。因此，該siRNA共輛物可在化療劑治療期間或之後投 〇 例如，化療劑的非限制性名單包括： (i) DNA拓樸異構酶抑制劑：阿黴素（adriamycin)、安。丫 口定（amsacrine )、喜樹驗（camptothecin )、CPT-11、SN3 8、 柔紅徽素（daunorubicin )、放線菌素 D( dactinomycin )、 小紅莓（doxorubicin)、安尼普苷（eniposide )、泛艾黴 素（epirubicin )、滅必治（etoposide )、伊達比星（idarubicin ) 或米托蒽醒（mitoxantrone ); (ii) 微小管抑制藥物，如紫杉類（taxane )，包括太平洋紫 杉醇（paclitaxel)、歐洲紫杉醇（docetaxel)、長春新驗 (vincri stin )、長春驗（vinblastin)、諾可達嗤（nocodazole)、 埃博徽素（epothilone )及諾維本（navelbine ); (iii) DNA損害劑：放線菌素（actinomycin )、安σ丫 12定 (amsacrine )、蒽環類（anthracycline )、博來霉素 (bleomycin )、邁樂寧錠（busulfan )、喜樹驗 (camptothecin )、佳銘帝（carboplatin )、氯芥苯丁酸 53 200836762 (chlorambucil )、順鉑（cisplatin )、環磷酸醯胺 (cyclophosphamide )、環磷酸醯胺（cytoxan )、放線菌 素 D ( dactinomycin)、柔紅黴素（daimorubicin )、歐洲 紫杉醇（docetaxel)、小紅莓（doxorubicin)、泛艾黴素

(epirubicin )、六甲基二聚氧胺奥沙利舶㈠乂⑷口^化）、 異環磷醯胺（iphosphamide)、美法崙（melphaian)、莫 可路塔明（merxhlorehtamine)、絲裂黴素（mitomycin)、 米托恩比（mitoxantrone )、亞硝基尿素（nitrosourea )、 卡 Μ 素（plicamycin )、丙卡巴耕（procarbazine )、紫 杉醇（taxol )、克癌易（taxotere )、替尼泊普（teniposide )、 二亞乙基硫代填酸酿胺（triethylenethiophosphoramide )或 滅必治（VP16); (iv) 抗代謝物：葉酸鹽（f〇iate)拮抗劑；及 (v) 核音酸類似物· 5 -氟尿嘴π定（5-fluorouracil )、胞嘴唆 阿拉伯糖（cytosine arabinoside )、阿紮胞苷（azacitidine )、 6·巯基嘌呤（6-mercaptopurine )、硫唑嘌呤（azathi〇prine )、 5-峨基-2’-脫氧尿普（5-iodo_2’-deoxyuridine ) 、6-硫鳥 17票 呤 （6-thioguanine ) 、2·脫氧助間型黴素 （2- deoxycoformycin)、克拉利賓（cladribine)、阿糠胞苷 (cytarabine )、氟拉達濱（fludarabine )、魏基嗓呤 (mercaptopurine)、硫鳥嘌呤（thioguanine )、潘托斯它 >丁（ pentostatin )、AZT (齊多夫定（zid〇Vudine ))、ACV、 維拉洛韋（valacylovir )、發米昔洛韋（famiciclovir )、 無環鳥芽（acyclovir )、西多夫韋（cid〇f〇vir )、潘昔洛 54 200836762

韋（penciclovir )、佳昔洛韋（ganciclovir )、瑞巴維瑞 (Ribavirin ) 、ddC、ddl (紮西他濱（zalcitabine ))、 拉米夫定（lamuvidine )、濟而剛（Abacavir )、阿狄福韋 (Adefovir )、去羥肌苷（Didanosine ) 、d4T (斯它夫定

(stavudine) )、3TC、BW 1 592、PMEA/雙-POM PMEA、 ddT、HPMPC、HPMPG、HPMPA、ΡΕΜΑ、PMEG、dOTC、 DAPD、Ara-AC、潘托斯它灯（pentostatin )、二氫-5-氮 雜胞苷（dihydro-5_azacytidine )、°塞唾咬琳（tiazofurin )、 桑黴素（sangivamycin)、Ara-A(阿糖腺苷（vidarabine))、 6-MMPR、5-FUDR(福乳定（fl〇xUrdine ))、阿糖胞苷（Ara-C ; 胞嘧啶阿拉伯糖）、5-氮雜胞苷（阿紮胞苷）、HBG [9-(4-羥丁基）鳥嘌呤]、（lS，4R)-4-[2-胺基-6-環丙胺基卜9H-嘌呤-9-基]-2-環戊烯_1_間·乙醇丁二酸鹽（、i59U89")、尿皆 (uridine )、胸腺核苷（thymidine )、埃苷（idoxuridine )、 3-去氮雜尿苷（3-deazauridine )、環胞苷（cyclocytidine )、 二氫-5·氮雜胞苷（dihydro-5_azacytidine )、曲西立濱 (triciribine )、雷巴威林（ribavirin )、福達樂錠 (fludarabine )、無環鳥普（Acyclovir ) 、阿拉伯 吱喃糖基-E-5-(2-溴基乙烯基）尿嘧啶、2，-氟基碳環-2，-脫 氧鳥苷、6’-氟基碳環-2、脫氧鳥苷、1-(沒-D-阿拉伯呋喃 糖基）-5(E)-(2-礎基乙烯基）尿嘴咬、{(ir-iQ；，2y5,3a)-2-^ 基-9-(2,3-雙（羥甲基）環丁基）_6H-嘌呤-6-酮}(洛布卡章 (Lobucavir) ) 、9H·嘌呤-2-胺、9-((2-(1_甲基乙氧基） ((1-曱基乙氧基）曱基）乙氧基）甲基）_(9C1)、三氟基胸腺核 55 200836762 普、9-(1，3-二經基_2_丙氧基）甲基鳥嗓呤（佳昔洛貪 U_ic1〇vi〇 ) 、5_乙基-2，·脫氧尿苦、ε_5·(2_漠基乙埽 基Η，-脫氧尿苦、5-(2_氣乙基)_2，·脫氧尿普、布昔洛韋 (bUCiCl°Vir )、6_脫氧無環鳥_、9-(4_經基·3_經甲基丁小 基）鳥嗓呤、E-5-(2-礙基乙烯基）1脫氧尿苦、5_乙浠基] …可拉伯吱喝糖基尿㈣、Η。，拉伯吱啥糖基胸

腺核普、2，-原-2’ -脫氢象驻1 yQ 肌乳馬甘及1-冷-D-阿拉伯呋喃糖基腺嘌 σ令 〇

其他潛在的抗癌劑係選自六甲蜜胺（altretamine)、 胺魯米特（amin〇glutethimide)、安吖啶（amsacrine)、 安美達錠（anastrozole)、天冬醯胺酸酶（asparaginase)、 kg、比卡魯胺（bicalutamide)、博來霉素（ble〇mycin)、 布舍瑞林（buserelin )、邁樂寧錠（busulfan )、葉酸鈣（calcium folinate )、喜樹鹼（campothecin )、截瘤達（capecitabine )、 佳鉑帝（carboplatin)、卡莫斯汀（carmustine)、氯芥笨 丁酸（chlorambucil )、順鉑（cisplatin )、克拉利賓 (cladribine )、氯屈膦酸二鋼（clodronate )、秋水仙鍵 (colchicine )、天冬醯胺酸酶（crisantaspase )、環填酸 S鱼胺（cyclophosphamide )、環丙孕酮（cypr〇terone )、 阿糖胞普（cytarabine )、達卡巴嗪（dacarbazine )、放線 囷素 D ( dactinomycin)、柔紅黴素（daunorubicin)、雙 細雌齡（dienestrol )、二乙基己烯雌酴（diethylstilbestrol )、 多西紫杉醇（docetaxel )、小紅莓（doxorubicin )、泛艾 黴素（epirubicin )、雌二醇（estradiol )、雌莫斯、;丁 56 200836762

(estramustine )、滅必治（etoposide )、施保進（exemestane )、 惠爾 jk 添（filgrastin )、福達樂錠（fludarabine )、氟氫 可的松（fludrocortisone )、氣尿 口密咬（fluorouracil )、就 每特隆（fluoxymesterone )、象他胺（flutamide )、健擇 (gemcitabine )、染料木素（genistein )、戈舍瑞林 (goserelin )、經基尿素（hydroxyurea )、伊達比星 (idarubicin )、異環構酸醯胺（ifosfamide )、伊馬替尼 (imatinib )、干擾素（interferon )、伊立替康（irinotecan )、 伊諾替康（ironotecan )、來曲峻（letrozole )、白葉素 (leucovorin )、柳培林（leuprolide )、左美素（levamisole )、 洛莫斯 丁（ lomustine )、氮芬（mechlorethamine )、曱經 助孕酉同（medroxyprogesterone )、去氫甲孕酮（megestrol )、 美法备（melphalan )、魏基 ϋ票呤（mercaptopurine )、美 斯納（mesna )、至善錠（methotrexate )、絲裂黴素 (mitomycin )、米托坦 （mitotane )、米托蒽酉昆 (mitoxantrone )、尼魯米特（nilutamide )、諾可達 °坐 (nocodazole )、奥可退歐泰得（octreotide )、奥沙利顧 (oxaliplatin )、太平洋紫杉醇（paclitaxel )、帕米鱗酸 二鈉（pamidronate )、噴斯他丁（ pentostatin )、光神黴 素（plicamycin )、外菲爾納（porfimer )、丙卡巴肼 (procarbazine )、雷替曲塞（raltitrexed )、美羅華 (rituximab )、鏈脲佐菌素（streptozocin )、蘇拉明 (suramin )、泰莫西芬（tamoxifen )、替莫吐胺 (temozolomide )、替尼泊苦(teniposide )、睪固酮 57 200836762 (testosterone )、硫鳥嘌呤（thioguanine )、售替派 (thiotepa )、一氯二戊鈦（titanocene )二氯化物、拓撲 曰康（topotecan )、赫賽 >丁（ trastuzumab )、膚諾寧 (tretinoin )長春驗（vinblastine )、長春新驗（vincristine)、 長春地辛（vindesine)及長春花（vin〇re〗bine)。其他各 種抗癌劑被陳列在美國專利發表案第2006/0135468號中， 其内容以引用方式納入本文中。

在供選擇之觀點中，本發明提供用於治療在哺乳類中 的各種醫學症狀之方法。醫藥組成物包括本文所述之siRNA ·厄物了用於治療許多不同的疾病。簡言之，可與peg 聚合物連接的任何siRNA可於活體内或試管内投予需要該 等治療之細胞。在未共軛狀態下具有治療效果的任何siRNA 可以其共軛型式引入細胞中，如本文所達成。 H·組成物/調配物 3有本發明的siRNA共軛物之醫藥組成物可與一或多 種生理上可接受之载體結合調配，該载體包含賦形劑及輔 助二】以加速活性化合物處理成可於醫藥上使用的製劑。 適當的調配物取決於所選擇的投予途徑，即是否局部或全 面治療。在本發明的許多觀點中1非經腸途徑較佳。 含有本文所述之siRNA共輛物之醫藥組成物的投予可 為口服、經肺、局部，包括表皮、穿透皮膚，、經眼睛與經 黏膜’包括陰道及直腸傳遞’或非經腸，包括靜脈内、動 脈内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或灌注。在一個具體實 58 200836762 例中，siRNA共輕物細IV、Ip友戈成為瞬間注射心 injection )而投予。 本lx明的化合物可調配在水溶液中，較佳地在生理上 可相容之緩衝液中’如生理食鹽水緩衝液，或極性溶劑中， 包括（非限制）t各唆嗣或二甲基亞礙，以供注射，包括 (非限制）靜脈内、肌肉内及皮下注射。 ^合物也可調配以用於非經腸投予，例如以瞬間注射 或連續灌注。用於注射之調配物可以單位劑型呈現，例如 在安瓶或多劑量容器中。有用的組成物包括（非限制）在 /由性或水性媒劑中的懸浮液、溶液或乳液，並可包含佐劑， 如懸浮、穩定及/或分散劑。用於非經腸投予之醫藥組成 物包括水洛性型式的水溶液’如（非限制）活性化合物的 鹽（較佳）。另外，活性化合物的懸浮液可被製備在親脂 性媒劑中。適合的親脂性媒劑包括脂肪油，如芝麻油，合 成脂肪酸酯，如油酸乙酯及三酸甘油酯，或如脂質體之材 料。水性注射懸浮液可包含增加懸浮液黏度之物質，如羧 曱基纖維素鈉、山梨醇或聚葡萄糖。視需要地，懸浮液也 可包含適合的穩定劑及/或增加化合物溶解度之劑，以允 許高濃縮溶液之製備。或者，活性成分可具有與適合的媒 劑，例如無菌的無熱源質水在使用之前重組的粉末型式。 化合物可藉由將活性化合物與所屬技術領域中熟知的 醫藥上可接受之載體組合而調配，以供口服投予。該等載 體能夠使本發明的化合物調配成藥錠、藥丸、錠劑、糖衣 錠、膠囊、液體、凝膠、糖漿、糊漿、泥漿、溶液、懸浮 59 200836762 液、在病患的飲用水中稀釋的濃縮溶液及懸浮液、在病患 進食中稀釋的預混合物及類似物，由病患口服攝取。用於 口服使用之醫藥製劑可使用固體賦形劑製得，i需要將所 得混合物研磨，並且若想要時，在加入其他適合的輔助劑 之後’將顆粒混合物加卫’以獲得藥旋或糖衣錠核心。有 用的賦形劑’特別為填充劑’如糖，包括乳糖、蔗糖、木 糖醇或山梨醇，纖維素製劑，如，舉例而t，玉米澱粉、 小麥澱粉、稻米澱粉及馬鈴薯澱粉，及其他材料，如白明 膠、黃蕾樹膠、甲基纖維素、經丙基甲基纖維素、缓甲基 纖維素鈉及/或聚乙烯吡咯啶酮（PVp )。若想要，可加 入崩散劑，如交聯之聚乙烯吡咯啶酮、瓊脂或藻酸。也可 使用如藻酸鈉之鹽。 本發明的化合物可方便地以喷霧劑型式，使用加壓包 或喷嘴器及適合的推動劑輸送，以供吸入投予。 化合物也可使用常見的栓劑基底，如可可油或其他甘 油酯’調配在直腸組成物中，如栓劑或灌腸劑。 除了先前所述之調配物之外，化合物也可調配成長效 性製劑。該等長期作用之調配物可藉由植入（例如，皮下 或肌肉内）或肌肉内注射而投予。本發明的化合物也可就 該投予途徑與適合的聚合性或疏水性材料（例I，在與藥 理上可接受之油的乳液中）調配，與離子交換樹脂調配了 或調配成微溶性衍生物，如（非限制）微溶性鹽。 也可使用其他的輸送系統，如質脂體及乳液。 另外，共軛物可使用持續釋放系統輪送，如含有治療 200836762 劑的固體疏水性聚合物之半滲透性基質。各種持續釋放、 材料已被建立，並為那些熟習該項技術者所熟知。 、 I.劑量 治療有效量的決定完全係在熟習該項技術者之能力範 圍内’尤其依照本文的揭示内容。

I 就本發明的方法中所使用的任何共軛物而言，治療有 效量可從試管内分析而初步預估。接著可調配用於動物模 式中的劑量’以達成包括有效劑量的循環濃度範圍。然後 可使用該等資料更精確地決定在病患中有用的劑量。 們π，被用作 '^ Η V入，〜1决於复中 ^括的母體分子（即未共輛之siRNA的效力）。一般， /口療法巾所使用的前藥量為在哺乳類巾有效達成所欲之 療結果的量。當然，各種前藥化合物的劑量將取決於母 化口物（siRNA )、活體内水解速度、聚合物分子量等 二、一私度的改變。$外’當然，劑量可取決於劑型及 H然而’通常在本文所述之SiRNA共輛物 以從約1至約⑽毫克/八斤/、m 毛見/ △斤/週為靶圍之量投予，而」 至約60毫克/公斤/週。上述範圍作為說明 所、竪：“亥項技術者決定以臨床實驗及治療適應症為基」 :之最適宜的前藥服用量。此外，實際 卞途押另卞t曰 w q 外， Y里可鑑於病患的症狀而由各個醫師選擇。; 技術之化合物的毒性及治療效力可藉由使用戶“ 甲无、知的方法在細胞培養物或實驗動物中以標主 200836762 * 的醫藥步驟決定。 〜在更佳的觀點中，本發明的治療包括將從約5至約2〇 宅克/公斤/服用量之量的本文所述之s_a共輛物投予 哺乳類。 或者’本文所述之趣共軛物的輸送包括將從約〇 ι 至約1000 nM，較佳為從約10至約1〇〇〇 nM之siRNA濃 度與腫瘤細胞或組織於活體内或試管内接觸。 參該組成物可每天投予—次或分成數次服用量以成為數 週治療模式的-部分提供。精確的服用量將取決於症狀的 I段與嚴重性、腫瘤對聚合物-前藥組成物之易感受性及被 治療之病患的個人特質而定，如所屬技術領域中具有通常 知識者所認知的。 ^在投予聚合性共軛物之本發明的所有觀點中，所述之 劑，係以siRNA分子之量，而不以所投予之聚合性共輛物 之里為基準。預期提供一或多天的治療，直到獲得所欲之 • 臨床結果為止。本發明的化合物投予的實際量、頻率及期 間當然將取決於病患的性別、年齡及醫學症狀與由診斷醫 師所決定之疾病嚴重性而改變。 运有的進一步觀點包括將本文所述之本發明的化合物 與其他用於協同或加成利益之抗癌治療組合。 實施例 下列的實施例充當提供對本發明進一步的認知，但不 意味以任何方式限制本發明的範圍。在實施例中所引述之 加黑之數字對應於圖1-3中所示者。 62 200836762 通用步驟：在PEG連接基與siRNA之間所有的共軛 反應係在PBS緩衝系統中於室溫下進行。陰離子交換層析 法用於分離PEG-siRNA共軛物與未反應之過量peg連接 基及原生的siRNA，得到純產物。 HPLC方法·反應混合物及中間物與最終產物的純度 係藉由 Beckman Coulter System Gold® HPLC 儀器監控。 該儀器使用配備UV偵測器之光電二極體陣列的

Phenomenex Jupiter® 300A C18 反相管柱（150 X 4.6 毫米）， 並使用流速為1宅升/分鐘的5〇 rnM TEAA緩衝液中的25-35%乙腈梯度。陰離子交換層析法係在取自ge healthcare (Amersham Biosciences)之 AKTA 探測器 100A 上進行， 使用裝填在取自Waters之AP-Empty玻璃管柱中的取自 Applied Biosystems之P〇ros 50HQ強陰離子交換樹脂。脫 鹽化係耩由使用取自Amersham Biosciences之HiPrep 26/10 脫鹽化管柱而達成。 實施例1 :化合物3的製備 將在PBS緩衝液（2.5毫升，pH 7.4 )中的化合物1 ( 330 宅克’ 0.011毫莫耳，30當量）與化合物2 ( 5毫克，〇37 微莫耳，1.0當量）之溶液在室溫下攪拌5小時。將反應 在Milli-Q水（25毫升）中稀釋並裝載於hq/i〇 por〇s強 陰離子交換管柱（10毫米X 60毫米，床體積〜6毫升）。 將未反應之PEG連接基移除。將含有純產物之部分匯聚及 冷凍，以得到純化合物3 ( 6·5毫克，〇·ΐ5微莫耳，40% )。 63 200836762 實施例2 :化合物5的製備 使化合物4通過在實施例1中所述之條件，以提供化 合物5。 實施例3 ··化合物7的製備 使化合物6通過在實施例丨中所述之條件，以提供化 合物7。

實施例4 :在食鹽水中的試管内穩定性研究 測里PEG化之siRNA的穩定性，以測量siRNA對PEG 聚合物的共輛效果。將原生的siRNA (序列識別號·· 2及3 ) 或PEG化之siRNA共軛物（化合物3、5及7)溶解在約 0.7 *克/*升濃度之食鹽水中。將每一試驗化合物的1〇〇 微升分裝加入各個微量離心（Eppend〇rf)管中，將其在37 )φ °C下分別培育30分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時 及24小時。每一時間點的樣品係藉由將5〇_2〇〇微升分裝 注射至HPLC中並接著分析對應於pEG化之siRNA的高峰 面積。该分析就每一試驗化合物重複兩次。結果陳列在下 列表1中。 貫她例5 ·在大鼠及人類血漿中的試管内穩定性研究 進行在人類及大鼠血漿中原生的siRNA及pEG化之 siRNA的動力學研究，以評估其試管内的I〆將原生的 64 200836762 • siRNA或PEG化之siRNA共軛物（化合物3、5及7)以 〜〇·7笔克/耄升濃度溶解在新鮮血漿中。將每一試驗化 合物的100微升分裝加入每一各別微量離心管中，將其在 37°C下分別培育5分鐘、15分鐘、30分鐘、1小時、2小 時、4小時、6小時及24小時。將原生的siRNA以酚·氯 仿萃取同時將PEG-siRNA共軛物以有機溶劑乙腈/甲醇萃 取，然後注射至HPLC中。該分析就每一試驗化合物重複 兩次。 0 PEG-siRNA共軛物的試管内穩定性性質陳列在表i 中，而穩定性曲線顯示在圖4中。 表1 .PEG-siRNA共輛物内性質 化合物 MW 穩定性（24 小時，食鹽 水，所釋放 之原生的 siRNA 之％ ) τ~~ΓΓΊ 丄1/2 k小 時，大 鼠血 漿） Π Ϊ王貝 時，人 類血 漿） (W/W )在每 一共扼 物中有 活性 原生的 siRNA 13509 穩定 1.80 0.29 100 化合物3 43771 < 1% 1.54 1.46 31 化合物5 43714 < 1% 1.54 1.34 31 化合物7 43720 10% 7.7 2.03 31 結果顯示PEG-siRNA共軛物增強對血漿中的核酸酶的 穩定性。 65 200836762 實施例6 ··使用西方點墨法（Western Blot)的試管内效力 研究

siRNA及三種PEG-siRNA共軛物（化合物3、5及7 ) 與原生的siRNA的試管内效力研究係藉由使用西方點墨法 而進行。將〇·1 nM至 1，000 nM的每一試驗化合物與 SiLenFect ( BioRad)混合並加在PRMI 1640培養基中的 10,000個AK43 1K5細胞上，在37°C及5% C02之大氣中培 育72小時。在培育之後，將AK431K5細胞蛋白從以每一 試驗化合物轉染之AK431K5細胞萃取出，在4-20%SDS-PAGE上分離並轉染在Hybond薄膜上。將薄膜在4°C下於 1 / 1000 稀釋之對 BCL2 ( Santa-Cruz Biotechnology SC7328 )的單株抗體及對〇；-微管蛋白（Santa_Cruz Biotechnology SC5286 )的單株抗體中培育隔夜，接著在 至溫下於1 / 2,000稀釋之抗-小鼠IgG ( santa_Cruz， SC203 1 )中培育1小時。將薄膜在化學發光試劑中顯像。 來自西方點墨法的結果顯示在圖5中。結果顯示原生的 siRNA及PEG-siRNA共軛物呈現服用量依賴性向下調節的 BCL2蛋白質表現。該性質可有利於癌症治療，因為臨床 人員係取決於病患需求而調整治療性寡聚核苷酸之劑量。 實施例7 :使用RT-PCR的試管内效力研究 二種PEG-siRNA共軛物（化合物3、5及7)與原生 的siRNA的試管内效力研究係藉由使用RT_pcR而進行。 66 200836762

將全部的RNA依照RNA水性套組（AmBion )的指示從以 每一試驗化合物轉染之H460細胞萃取出。將取自每一樣 品的100毫微克全部的^^八以使用丁&81\^11基因表現化驗 (Applied Bio systems Hs00608023 ml)的相對定量化驗 來分析。18S rRNA基因被用作内生對照。來自RT-PCR的 結果顯示在圖6中。結果顯示原生的siRNA及PEG-siRNA 共軛物展現服用量依賴性向下調節的BCL2 mRNA表現。 結果顯示根據本發明的siRNA輸送技術允許siRNA的細胞 攝取及治療用途。 實施例8 : PEG-siRNA共軛物在ICR小鼠中的藥物動力學·· 每一試驗化合物組以30隻母小鼠經由側尾靜脈被投予 就每一 PEG-siRNA共軛物（化合物3、5及7)而言50毫 克/公斤之siRNA或siRNA同等物之單一慢速瞬間靜脈内 注射液。在投予之後，在下列提供的時間點，將小鼠（3 隻/組）以心臟穿刺抽血至含有EDTA的試管中。在將血 液以400 X g離心5分鐘之後，收集血漿，並立即在-80°C 之乾冰上冷凍。將5隻未處理之小鼠抽血，作為負對照組。 在血漿中的游離siRNA及PEG-siRNA之濃度係以HPLC 測量。藥物動力學參數係使用Pharsight之WinNonlin軟體 測量。 在研究期間檢查每一隻動物。該檢查包括一般狀況、 皮膚與皮毛、眼睛、鼻、腹部及外生殖器的觀察，與呼吸 的評估，及任何不尋常的行為或毒性或藥理效果的臨床訊 67 200836762 τ 罐 號的觀察。藥物動力學結果陳列在表2中。 表2.PEG-寡聚共軛物的活體内藥物動力學§ 化合物 cmax (微克/ 毫升） Τ 1/2 (小時） MRT (小時） CL (毫升/ 小時/公 斤） AUC (微克/ 毫升•小 時） 原生的 siRNA ND ND ND ND ND 化合物3 1018±92 0·31±0·05 〇.45±〇.〇8 109±13 460±54.5 化合物5 97·7±5·7 0.16±0·01 0.23±0.02 1128±59 22.2±1.2 化合物7 788±53 0·32±0_04 0.47 + 0.06 136±12 367±33.0 •使用單室之iv瞬間，一級消除法所決定之ρκ評估值 平均±標準偏差；ND :未偵測 靜脈内投予之PEG_siRNA共軛物的血漿濃度_時間曲 線顯不在圖7中

以原生的siRNA及化合物5測試之小鼠 服以25毫克/公斤之siRNA同等物劑量。以化合物3及 無意受到理論的限制， siRNA的生物穩定性係經由 的抗性而改進。 化合物7測試之小鼠接收毫克/公斤之siRNA同等物。 在以未共耗之原生的siRNA處理之小鼠中，該侧八未於 投予5分鐘之内的灰漿中偵測出。與原生的仙财比較， 結果顯不該siRNA明顯地延長siRNA的循環。 siRNA的藥物動力學性質，如 增強siRNA對降解，即核酸酶， 68 200836762 貫施例9 ·在以人類肺腫瘤彡 邊、、、田胞異種移植之小鼠的活體内 效力研究： 使用不同的連接基所供 土所1備的PEG_siRNA共軛物（化合 物3、5及7 )的BCL2向下綱；wr _^丄么 卜調即效力係在Harlan Sprague-Dawley 之 Nu/nu 小 I Γ I、山 )中評估。該研究也包括以食鹽 水或原生的siRNA注射夕，丨合， 耵之】、既的對照組。H460非小細胞 肺腫瘤係藉由經皮下注射2 s 、 射2·5 x丨〇6個細胞/小鼠至右脅腹 而於裸小敗中建立。廬瘤之4 — 曰 生長為母週監控兩次並以觸摸 測量一次。當腫瘤遠刭 7Λ δΛ丄丄> ' 届逹到70-80立方毫米的平均體積時，將 小鼠分成實驗組（1 〇隻/ έ^ 又/、、且）。母一小鼠的腫瘤體積係藉 由卡钳的二維測量而決定且使

寬度2/2)來計算。m腫㈣積=(長度X 含有每-試驗化合物的溶液在食鹽水中製備。注射體 積為U ^升。服用溶液只在注射之前製得。每—試驗化 合物（化合物35及7)經腹膜 ^

一 厂、'工版膜内注射，除了原生的siRNA 經腫瘤内注射之外。每-試驗化合物以10毫克/八斤 (siRNA同等物）每天注射一次，直到研究終止為止;:服 用的第一天被指定為第i天。在第9天時，犧牲每一試驗 ^ 3隻小鼠’以研究在踵瘤中的峨2數值。當動物被 =日守，將大部分的腫瘤從動物割除。由於大的潰癌使腫

口無法被取得’所以一些腫瘤未被割除。該等組織的 BCL2 mRNA水平係使用RT_pCR &里亚將結果陳列在 表3中。 69 200836762 化合物 表 内的 BCL2 BCL2/ 18srRNA 對數 i平均±標準 0.87 + 0.15 Π 1 ^ 4- A A /C 〇·6〇±0,21 0.70 + 0,10^ 0·30±0·17 抑制％

食鹽水 原生的siRNA

化合物 化合物 化合物7 23 73 含有基於二羥乙甘胺酸之可釋放性連接基的PEG- s i RN A共幸厄物明顯地向下: v u 、也ΠΙ卜凋即在u H460人類癌細胞異種 移植之小鼠組織中# BCL2 mRNA表現。根據本發明的共 軛物允許在沒有轉染劑的存在下於癌細胞中的siRNA的細 胞攝取及mRNA肖下調f。該技術有益於活體内投予治療 性 siRNA。 【圖示簡單說明】 圖1概要地說明在實施例1中所述之合成方法。 圖2概要地說明在實施例2中所述之合成方法。 圖3概要地說明在實施例3中所述之合成方法。 圖4顯示在實施例5中所述之pEG-siRNA的穩定性。 圖5顯示在實施例6中所述之試管内的BCL2表現研 究。 圖6顯示在實施例7中所述之活體内的BCL2表現研 究。 70 200836762 > , 圖7顯示在實施例9中所述之PK研究。 【主要元件符號說明】 無

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Claims (1)

1. 200836762 十、申請專利範固： 1·一種式（I )之siRNA共軛物： A-Ri-(R2)e-R3 其中 A為封蓋基團或R，3-(R，2)e，-; Rl為實質上非抗原水溶性聚合物； 义2及R2為獨立地選擇之可釋放或持久性連接基或其 組合；及

   R3及R’3為相同或不同的含siRNA之部分；及 (e)及（e’）為相同或不同的正整數， 其中I及R，2與含siRNA之部分的意義股連接。 2·根據申請專利範圍第丨項之共輛物，其中a係選自 由H、NH2、〇H、C〇2H、ci-6烷氧基及d_6烷基所組成的 群組。 3·根據申請專利範圍第〗項之共軛物，具有下式： R 3-(R 2)e’-Ri-(R2)e-R3。 4.根據申請專利範圍第i項之共軛物，其中心及 係獨立地選自由基於消除苯甲基之連接基、基於鎖三烷基 之連接基、基於二羥乙甘胺酸之連接基、對酸不穩定之連 接基、溶體上可裂解之肽及組織蛋白酶B ( capthepsin B ) 可裂解之肽所組成的群組。 5·根據申請專利範圍第4項之共輛物，其中該對酸不 穩定之連接基係選自由二硫化物連接基、含腙之連接基及 含硫代丙酸酯之連接基所組成的群組。 72 200836762 6·根據申請專利範圍第1項之共軛物，其中R2及R’2 係獨立地選自由下列所組成的群組：

   73 200836762

   74 200836762

   观尤㈣㈣媽OCfi^C㈣、 ， -at-CH^cHasa^q^OK 砸aHCCIisH^H^NHCCH^rCCCH^CH^ 及 其中 Yll.19獨立地為Ο、S或NR48 ; R3 1-48、R5 0-5 1及A5 1係獨立地選自由氣、c 1 _6烧基、C 3.1 2 支鏈烷基、c3_8環烷基、經取代cv6之烷基、經取代c3_8 之環烷基、芳基、經取代之芳基、芳烷基、cv6雜烷基、 經取代之雜烷基、Ci.6烷氧基、苯氧基及c}.6雜烷氧 基所組成的群組； Ar為芳基或雜芳基部分； L"_15係獨立地選擇自二官能性間隔基； J及Γ獨立地為主動輸送至標靶細胞中的部分或 75 200836762

   其中 l3為二官能性連接基；

   Υ4為〇、S或NRn ;及 係選自由氫、cv6烷基、c3_12支鏈烷基、8環烷 基、經取代C之烧基、經取代C3·8之環烧基、芳基、經 取代之芳基、芳烷基、Cu雜烷基、經取代之Cu雜烷基、 ci·6烷氧基、苯氧基及雜烷氧基所組成的群組； (ell)、（hll)、（kll)、（111)、（mil)及（nil)係獨立地選 擇之正整數； (all)、（ell)、（gll)、（jll)、（〇11)及（qii)獨立地為 〇 或正整數；及 (bll)、（xll)、（x’11)、(fll)、（ill)及（ρΐι)獨立地為 〇 或1 Ο 7.根據申請專利範圍第1項之共輕物，其中r2及 係獨立地選自由下列所組成的群組： 76 200836762 -[Ce〇)W^#23)f^[CH5)k、 —[C^O^〇^R^^NS26[C(=C^3v^， •cce〇)]掏 併 0)]挑 ,

   ，1PH>)MC^*3)分(0¾¾ 祕㈣ l·、 4C ㈣ MCl^spl^^gR^ [€_ v-， dceoivCC^R^cc^^MCHme·， iCH^vCKCldMtNR^COK^MC ㈣ k、 -[C(，^C^R潜(復2SR法[C(，v^， -[C^pmaiCClafe^^gK^CH^·， WmCORdRaCRagE^ECeOIM、 77 200836762 -[CHW^iCGR^c^^OpRd^eK%^， 4CH^P3Bai(CEd^CR^9〇MCHm^ 件順⑶—復成频€Rm3Mt ICH>)k^ -[CH))lr〇(aRdMm^〇MaMWeH^、 4〇H>)3 麵 CC»dM^R»0MC^4E^HCH^， •[Ce〇Wv(CRd^3€R^O)t(Clbi3Mf〇|PH%^， W^MvCGR^MCRiasCKasR為[C_v，、

   4C_雜22R23MCR^〇l2sRl9〇)eNR26[C(<>)k-， -阶〇調饮2^。玫2知〇)样龜)f 〇[€(，>，

   {CH^vOCCRdMiCO^CR^OR^COrl^CH^、 被，]雁麟2^R28R»〇蒙24l2sM>iC_ 矿、 -[GH5)P3Ka!(CRdMiCCR^5CR2sR®〇)^MCH>)3v-，

   似嘲禅(CR2如獅‘C(，^及 ^27 ^-(CR^Ras娜(《0)]， 78 200836762 其中 R⑽係獨立地選自氫、CK6燒基、％支鍵炫基、C 環烷基、經取代C】·6之烷基、經取代C3·8之環烷基、芳基3、8 經取代之芳基、芳烧基、C1_6雜烷基、經取狀C1二烷 基、C!_6烷氧基、苯氧基及C!_6雜烷氧基之中者； ⑴及（t’）獨立地為G或正整數，較佳為〇或整數；及 (V)及（ν’）獨立地為〇或1。 8.根據申請專利範圍第i項之共軛物，其中心及r，2 係獨立地選擇自胺基酸或胺基酸衍生物。 9·根據申請專利範圍第！項之共軛物，其中&及 係獨立地選自由下列所組成的群組：

   1〇_根據申睛專利範圍第1項之共扼物，其中（e)及（e，) 獨立地為1或2。 11 ·根據申晴專利範圍第1項之共軛物，其中R:包含 直鏈、末端支鏈式或多臂式聚環氧烷。 12·根據申請專利範圍第u項之共軛物，其中該聚環 79 200836762 ， 氧炫係選自由聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG )及聚 丙二醇所組成的群組。 13.根據申請專利範圍第11項之共軛物，其中該聚環 氧烷係選自由以下者所組成之群組： -Υτι 脅^-PB^as^rCCHaCHW^rCI^CEtYTrCCH^Ce^^YTi-及 兩 Η»ιΐ^>Υ7Ηα^ο^〇Η^〇Μαϊ2λΛτ(α^ι^-Υ7ί·，

   其中： γ71 及 γ73 獨立地為 〇、s、SO、S02、NR73 或鍵； Y72 為 Ο、S 或 NR74 ; R71_74係獨立地選自氫、CV6烷基、c2_6烯基、c2_6炔 基、C 3 _ i 9支鍵烧基、C 3 _ 8環烧基、經取代C :. 6之烧基、經 取代c2_6之烯基、經取代c2.6之炔基、經取代c3_8之環烷 基、芳基、經取代之芳基、雜芳基、經取代之雜芳基、Cb 6雜烷基、經取代之Cm雜烷基、Cw烷氧基、芳氧基、Cw 雜烷氧基、雜芳氧基、c2.6烷醯基、芳羰基、c2_6烷氧基 羰基、芳氧基羰基、c2_6烷醯氧基、芳基羰氧基、經取代 c2_6之烷醯基、經取代之芳羰基、經取代c2_6之烷醯氧基、 經取代之芳氧基羰基、經取代c2_6之烷醯氧基及經取代之 芳基幾氧基之中者； (a2)及（b2)獨立地為0或正整數；及 (η)為從約10至約2300之整數。 14.根據申請專利範圍第11項之共軛物，其中該聚環 氧烷為式-0-(CH2CH20)n-之 PEG， 200836762 其中⑷為從約10至約2,300之整數。 15.根據申請專利範圍第1項之共耗物， 從約2，_)至約1〇〇，_道耳頓之平均分子量 16·根據申請專利範圍第1項之共軛物里 從約5,000至約60,000道耳頓之平均分子量。 其中R!具有 Ο 其中Ri具有 17.根據中請專㈣圍第1項之共輛物 從約2 0，0 0 0至約4 5，0 〇 〇道耳頓 其中Ri具有 之平均分子量

   18.根據申請專利範圍第丨項之共軛物，其中該含有 siRNA部分的反義股包含約18至約28個與標靶基因互補 的核苷酸。 19·根據申請專利範圍第1項之共軛物，其中該含有 siRNA部分的反義股包含約18至約28個與序列識別號 (SEQ ID NO) : 1之核酸序列互補的核苷酸。 20.根據申請專利範圍第1項之共軛物，其中該含有 siRNA部分的反義股包含序列識別號：3之核酸序列。 21 ·根據申請專利範圍第1項之共軛物，其係選自由下 列所組成之群組： 81 200836762

   82 200836762

   其中該含有siRNA部分的反義股與該聚合物共軛。

   22.根據申請專利範圍第1項之共輛物，其係選自由下 列所組成之群組：

   83 200836762 Ο ο

   AeO Me 〇 ΗΝ〜^/^0食 0—_ΙΑ ^ b- Me

   其中： siRNA包括序列識別號：2或3之核酸序列；及 siRNA的意義股之5’-末端被修改成C6·胺基尾端，以 與PEG連接基共軛。 23 · —種抑制在人類細胞或組織中的基因表現之方法， 其包含將人類細胞或組織與申請專利範圍第1項之共輛物 接觸。 24. 根據申請專利範圍第23項之方法，其中該細胞或 組織為癌細胞或組織。 25. 根據申請專利範圍第24項之方法，其進一步包含 將該細胞或組織與化療劑接觸。 26. 根據申請專利範圍第23項之方法，其中BCL2的 表現被抑制。 27. 根據申請專利範圍第26項之方法，其中該含有 siRNA部分的反義股包含約1 8至約28個與序列識別號：1 84 200836762 / 之核酸序列互補的核苷酸。 28·根據申請專利範圍第26項之方法，其中該共軛物 係選自由下列所組成之群組：

   29· —種抑制癌細胞生長或增殖之方法，其包含有申請 專利範圍第1項之共軛物的癌細胞。 30·根據申請專利範圍第29項之方法，其中該含有 siRNA部分的反義股包含約1 8至約28個與序列識別號：1 之核酸序列互補的核苷酸。 3 1 ·根據申請專利範圍第29項之方法，其中該共軛物 係選自由下列所組成之群組：

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   十一、圖式： 如次頁

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