TW200831116A - Immune modulators, preparations and compositions including immune modulators, tests for evaluating the activity of immune modulators and preparations and compositions including the same and methods - Google Patents

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200831116 九、發明說明： 士 =申請案主張於2006年9月29日提出申請之美國臨 日夺中請案序號6G/848,348及於2G()7年9月14日提出申請 之美國專利中請案序號11/855,944的優先權，兩者的揭露 内容兹以引用方式全文納入本文中。 【發明所屬之技術領域】 ^ 纟發明係關於調節（例如引發、增強、抑制非所欲的 活動等等）個體中細胞媒介免疫之分子，包含產生及獲得 忒等刀子、包含該等分子之製備物及組成物，評估該等分 +之有A H之方法及使用方法。更特定言之，本發明係關 於在本文中稱為調節細胞調控免疫之「奈米部分 (nanofraction)」分子。 【先前技術】 • &體提供且轉移免疫性之能力為吾人所熟知且受到廣 泛研九，抗體之特徵及抗體產生之機制亦同樣如此。 包含具有介於3,500 Da與7,500 Da之間之分子量的分 子家族之轉移因子（Transfer Fact〇r)於調節細胞或τ細胞媒 介免疫性中所起之作用並不亦為吾人所熟知或並未受到廣 - 泛研究。熟習相關技術者對於轉移因子之特徵及其於生物 • 體免疫系統中之作用之瞭解已隨時間增加且繼續增加。 儘管進一步研究繼續闡明多種免疫系統組份之特性及 6 200831116 功能，但是可能存右士旦 ，該 以及 在大里不太瞭解或甚至忽視之分子 等分子可能對免游姓方& ^ 產生、維持、輸送及轉移之方式 對免疫性對壽命之作用具有影響。 【發明内容】 一各種分子在調節細胞媒介免疫中之有效性最近已以可 計量方式進行表徵。可直接或間接調節細胞媒介免疫之八 子在此項技術中稱為「免疫調節物」。一類免疫調節物： 括J聖或低刀子$奈米部分（例如至多3,〇〇〇 Da，至多3,5㈧ a 250 Da 至 2’〇〇〇 Da ’ 2,0〇〇 Da 至 4,000 Da)分子，其 引發、增強、抑制或以其他方式調節細胞媒介之免疫反應: 由於該等免疫調節物之相對較小之大小或分子量，其在本 文中稱為「奈米部分」免疫調節物及「奈米部分」分子。 曰奈米部分免疫調節物可自多種不同類型之動物來源獲 得。來源動物之實例包#(但不限於），哺乳動物㈠列如 牛）及鳥（例如雞）。在不限制本發明之範疇的情況下， 奈米部分免疫調節物可自哺乳動物產生之初乳或甚至乳汁 獲侍。如另一非限制性實施例，奈米部分免疫調節物可自 由鳥或任何其他類型之動物產生之卵獲得。初乳、卵及其 他奈米部分分子之來源在本文中總稱為「奈米部分來源」。 由來源動物天然產生·奈米部分免疫調節物可藉由使來 源動物暴露於比來源動物通常所暴露之一或多種抗原之量 大的量或濃度的此類抗原來增強。舉例而言，若特殊類型 之來源動物或甚至特定之來源動物在其典型環境中通常暴 200831116 露於某 部分分子 甚至更大 動物，藉 環境中， 源動物或 該來源動 增加該來 於增加濃 來增強， 性。 里或濃度的給定抗原，則該來源動物中包含奈米 :免疫調節物之產生可藉由將該來源動物暴露於 里（例如濃度）該抗原（例如藉由疫苗接種來源 ::來源動物置於存在更大量或濃度之該抗原的 寺等）來增強。如另一實施例，若特殊類型之來 甚至特定之來源動物典型地經給定抗原接種，則 物中—或多種奈米部分免疫調節物之產生可藉由 源動物對抗原之暴露（例如藉由將來源動物暴露 度之抗原、更有效或較高毒性形式之抗原，等等） 儘管奈米部分分子本身並不視為具有抗原特異 可使用已知方法自存在於奈米部分來源動物中之其他 刀子中地、大體上或完全地純化奈米部分免疫調節物 (其中該等分子自該奈米部分來源動物獲得），且視情況 使該等奈米部分免疫調節物濃縮。該等方法包肖（作不限 於）機械分離、相分離（例如使水性組份與非水性组份互 相分離）、沈澱、離心、過濾、（包含微㈣，其中分子量 截斷（MWCO)在.約12，嶋Da降至約4,咖以範圍内， 及奈米過mMWCO低於約4,000 Da)、透析、層析 及電泳純化法。該等方法可個別地或以任何組合實施二產 生存在一或多種類型免疫調節物之製備物。 在一態樣中，本發明包括至少部分純化、大體純化（例 如至相關技術者所接受之程度）&完全純化之免疫調節物 之製備物。另夕卜，本發明包含包括有奈米部分分子之組成 8 200831116 物。除奈米部分分子之外，該等組成物還可包含適用於支 持或調節個體之免疫系統之其他組份（例如轉移因子、抗 體等荨）以及可以其他方式有益於該個體之組份。 包含單獨或與其他免疫調節物一起使用或投予奈米部 分分子或包含其之組成物之方法亦處於本發明之範疇内。 使用方法包含向個體（例如認為可因由奈米部分分子提供 之免疫調節受益的人類或任何類型之動物）投予一或多種 類型之免疫調節物（例如呈未加工、部分純化、大體純化 或完全純化形式，呈製備物、組成物形式等等）。向個體 投予免疫調節物以使一個特定的、該所投予類型的免疫調 節物在個體體内之含量（例如濃度）增加至高於對於個體 而言正常之量的量。在不限制本發明之該態樣之範疇的情 況下，個體可接受對於使個體之免疫系統引發細胞媒介免 疫反應而言臨床上有效之量的一或多種免疫調節物，或有 效增強個體之細胞媒介免疫反應之量的一或多種免疫調節 物0 此外，評估免疫調節物之有效性之試驗及試驗方法處 於本發明之範疇内。舉例而言，可使用丁細胞免疫功能檢 定評估潛在免疫調節物單獨或與其他分子（例如抗原、致 裂物質（其誘發有絲分裂或細胞複製等等結合調節泉 與細胞媒介免疫之一或多種類型細胞（例如產生三磷酸腺 普（ATP))之活性的能力。 經由考慮隨後之描述及隨附申請專利範圍，其他特徵 及優點對於熟習此項技術者將變得顯而易見。 9 200831116 【實施方式】 最近已發現在多種分子量範圍内之小分子適用於調節 免疫細胞之活性。以下實施例闡述為達到該等結論所執行 之行為。 實施例1 使用包含相分離、沈澱、過濾、微過濾或奈米過濾及 透析之已知方法，自牛初乳及雞蛋二者中製備多種分子量 鲁 部分。自牛初乳獲得之分子量部分為：250 Da至2,0〇〇 Da， 2.000 Da 至 4,0〇〇 Da，4,000 Da 至 8,0〇〇 Da (其包含轉移 因子，且為比較之原因而包含），及8,〇〇〇 Da至12,000 Da。 類似地，自雞蛋黃製備2,000 Da至4,0〇〇 Da，4,000 Da至 8.000 Da (其包含轉移因子，且為比較之原因而包含）， 及8,000 Da至12,000 Da分子量部分。隨後將該等分子量 部分乾燥為粉末形式（例如藉由喷霧乾燥、冷凍乾燥等 等）。 _ 隨後使用該等製備物進行各種檢定以評估每一部分中 之分子調節傳送細胞免疫性之細胞（例如CD4+ T辅助細 胞）之活性的作用。特定言之，修改揭示於美國專利第 5,773,232號及第6,630,316號中及美國專利申請公開案第 20〇5/〇260563號中之該類型之檢定且將其用以評估來自實 施例1之不同分子量部分在多種條件下之活性。使用上述 檢定來評估由免疫細胞（例如CD4+ τ辅助細胞、〇〇3 +細 胞（其包含所有Τ細胞）等等）產生之三填酸腺苷（ΑΤρ )。 10 200831116 由該等細胞所產生之ATP之量可以此項技術中已知之方式 (例如藉由使用以流明計檢測之所謂「螢光素反應」）量 測。 實施例2 使用於其表面上包含或表現所謂「CD4」醣蛋白之健 康個體之白血球且使用由Cylex Incorporated ( columbia，

Maryland )生產之ImmuKn〇wTM檢定進行第一系列檢定。 該等白血球由於其表現CD4醣蛋白亦稱為「cd4+」細胞。 CD4醣蛋白之表現使所謂的「τ辅助」細胞與包含其他τ 細胞之其他類型白血球區分開。

ImmUKn〇wTM檢定試驗套組之組件為：包含可拆換8 孔測試條（strip)之標準96孔「檢定板」；包含生長培養 基及防腐劑之「樣品稀釋劑」；包含植物血球凝集素丄 (PHA-L)(來自豆（例如紅菜豆）之物質）之「刺激劑」， 已知其非特異性地刺激有絲分裂（細胞生長且分裂成兩個 新細胞之過程）且因此於生長培養基及防腐劑中稀釋之白 血球中製備性產生三碟酸腺普（Ατρ )，（亦#「致裂物 質」）；「Dynabeads^Ci^」’其為以小鼠單株抗人類cD4 抗體塗佈之磁性樣品純化珠粒且由具有牛血清白蛋白 (BSA)及防腐劑之緩衝鹽水溶液承載；「洗滌緩衝液」， 其包含具有BSA之緩衝鹽水溶液；「溶解試劑」，其包含 具有去污劑之低滲透壓鹼性溶液；「定標液」（Calibrat〇r 於緩衝溶液中包含螢光素及螢光素酶的「發光試劑」，其 200831116 與ATP反應以產生指示發光試劑所暴露之Ατρ之量之光；

及包含具有不透明邊界（亦即壁及基底）之％孔之「量 測板」。 S 使用一個可稱為「對照條」之96孔檢定板之8孔測試 ‘以提供對肤，其包含4個「未經刺激」（则） 4個「經刺激」對照孔。 ’、、、孔及 對於待測試之每一樣品使用另一可稱為「試驗侔之 96孔檢定板之8孔測試條。將每_測試條中之孔」 為「未經刺激」孔，而每一測試條中之其他4孑匕^ Γ」孔。將五十微升…)樣品稀釋劑引入二； :之4個「未經刺激」孔之每-者中，同時將25μ;、γ 一 忒驗條之「未經刺激」孔之每一者 = = 刺激劑引入對照測試條之4個「經刺 孔之每中中’且引人每—試驗條之4個「經刺激」 矛、樣口口稀釋劑或刺激劑外 鑑別之分子量邻八+ w只靶例丨中所 卞里邛分中之一者之樣品 孔中之每一去由 甘或驗條之8個 之每-者在定言之’使實施例1之分子量部分 在樣印稀釋劑中復水且以一 稀釋以提供三種不n、曲……曲 積之樣品稀釋劑 樣品後，最終分 中外加25 μΐ 叫乾燥粉末。 向該孔中添加1G旧^及_〇 衣備包含白血球之1:3 (血液： 釋度的血樣，將复▲ 樣稀釋劑」）稀 將其輕微攪動以使其組份均句分布。將七十 12 200831116 - 五微升（75 μ1)稀釋血液添加至每一測試條之每一孔中。 隨後使孔中内容物混合（例如藉由將板置於震i器板上約 3 0移），Ik後在37 C之溫度下在5% c〇2環境中培育約18 小時。 一旦完成培育，則使孔中内容物再次混合（例如藉由 將該板置於震盪器板上約3分鐘)。此後，使包含⑯ 樣品純化珠粒之溶液混合以使Dynabead,樣品純化珠粒均 勻懸汗於承載其之液體内（例如使用渦流）。如上所述， ♦該實施例中之Dynabeads®miJ?i純化珠粒包含以小鼠單株抗 人類CD4抗體塗佈之磁性珠粒。將五十微升（5〇 承 載Dynabead®樣品純化珠粒之溶液添加至每一測試條之每 一孔中。 使每-測試條孔中之内容物再次混合（例如在震盈哭 板上約15秒），隨後將其置於室溫下或於室溫下培育約二 分鐘。隨後重複該混合及培育之過程。巧遍他⑧樣品純 化珠粒上之小鼠抗人類CD4抗體僅與展現⑽_蛋白之 白血球結合。在該培育期帛，包含τ辅助細胞之CD4+白 血球由Dynabead，樣品純化珠粒上之小鼠轉抗人類cd4 抗體固定或結合於其上。 β培育之後，將每-孔中之内容物再次混合（例如於震 盈器板上約15秒至約30秒）以使該等⑯樣 化珠粒再懸浮。隨後根據闡述於附☆ ImmuKn〇wTM^、 =明中之方案將每-孔中之内容物引入磁場中（例：= 將母一 8孔測試條放置於自Cylex購得之磁般 200831116

Dynabeads®樣品純化珠粒在經受磁場時被拉至其所存在於 其中之每-孔之-側。可隨後移除該孔中之剩餘内容例 如使用移液管吸出等等），且將珠粒&助細胞洗務一 或多次（例如3次，每次使用200 μ1洗滌緩衝液）以大體 上使其純化。 隨後將二百微升（200 μΐ )溶解試劑添加至每一孔中。 自磁場中移除每一孔中之内容物之後，使每一孔中内容物 (亦即Dynabeads®樣品純化珠粒、附接於其上之細胞及溶 解試劑）混合（例如於板震盪器上約5分鐘）。溶解試劑 使由Dynabeads、^品純化珠粒上之抗體固定之CD4+細胞 之膜破裂。其中，ATP自溶解之細胞中釋放。 旦凡成細胞溶解，則使每一孔中之内容物再次經受 磁％，將每一孔内之Dynabeads®樣品純化珠粒拉至該孔之 一側。隨後將5〇 μ1樣品自每一孔轉移至量測板之相應孔 中。除了轉移樣品外，還保留96孔量測板之若干孔以供5〇 μΐ具有各種Ατρ濃度之定標液溶液的樣品之用。 ^ 隨後將一百五十微升（150 μΐ )發光試劑添加至包含 忒驗樣品或定標液溶液樣品之量測板之每一孔中。隨後量 'BjJ 句 、、'孔之發光。所量測之每一孔之發光提供存在於該孔 ATP之畺的指示。存在於每一孔中ATP之量又指示細 匕（亦即CD4+細胞）内代謝活性之量，其中量測板之每 孔中之内容物係來自該等細胞。來源於以PHA非特異性 刺’敦之細胞之樣品中預期存在相對較高含量之ATP。添加 免疫调節物（例如來自於實施例1中鑑別之部分之一者） 200831116 將增加或降低或調節由PHA非特異性刺激之CD4+細胞中 之代謝活性。 該試驗之結果係闡述於下表中，其中所說明之數字表 示每一子集之白血球產生之ATP的平均（mean)(平均 (average))量： 表1 樣^ 品 對照 每孔 ίο μ§ 每孔 100 pg 每 孔 1000 pg 250 Da 至 2,000 Da 初乳部分 未經刺激 (NS) 14 52 50 37 經PHA刺激 388 336 253 127 PHA刺激下之 降低％ 13.4 34.8 67.3 2,000 Da 至 4,000 Da初乳部分 NS 14 52 62 42 經PHA刺激 388 388 377 339 PHA刺激下之 降低0/〇 0 2.8 12.6 4,000 Da 至 8,000 Da (包含TF)初 乳部分 NS 14 69 50 46 經PHA刺激 388 378 250 207 PHA刺激下之 降低0/〇 2.6 35.6 46.6 8,000 Da 至 12,000 Da初乳部分 NS 14 49 45 39 經PHA刺激 388 337 237 181 PHA刺激下之 降低％ 13.1 38,9 53.4 2,000 Da 至 4,000 Da卵部分 NS 14 49 33 44 經PHA刺激 388 228 161 148 PHA刺激下之 丨降低％ 41.2 58.5 61.9 15 200831116 4,000 Da 至 Da (包含TF)即 部分 NS 14 54 —--_ 47 ——— 44~' ........................... ' -------- 經PHA|ij激 388 354 230 *-*·**·* 40.7 一 ***" 158 593 ^ PHA厠激下之 降低％ 8.8 該等資料展示，在細胞不暴露於PHA之未經刺激之試 驗:’已知兩者皆含有轉移因子之4,〇〇〇Da至8,〇〇〇Da分 子量部分中之每一者（來自初乳及卵），激發CD4+白血 鲁球中的額外代謝活性。該等資料證實轉移因子上調細胞媒 介免疫之能力。 相反地，4,000 1^至8,000 Da初乳及卵部分下調PHA 激發CD4+細胞中代謝活性之非特異性能力。因為pHA為 非4寸異丨生刺/放劑，參與細胞媒介免疫之轉移因子對其 活性之下調並不令人吃驚。咸信且先前研究已展示，轉移 因子有助於平衡且甚至集中τ細胞之免疫活性（例如藉由 幫助、、田胞°己彳于」其主要目的，藉由降低自身免疫及相關 _ 病症，同時改良針對諸如微生物（細菌、病毒等等）感染 個體軀體之不適宜實體之活性，等等。）。τ細胞對ρΗΑ 刺激活性之下調似乎證實轉移因子在細胞媒介免疫中之此 作用。 類似結果見於數個不包含轉移因子之其他分子量部 刀’包含250 Da至2,〇〇〇 Da初乳部分（上調與下調）、2,000 Da至4,〇〇〇 Da初乳部分（上調）及2,〇〇〇 Da至4,000 Da 印部分（上調與下調）。8,〇〇〇 Da至10,000 Da初乳部分 亦引起未經PHA刺激之CD4+白血球中活性之上調及CD4+ 16 200831116

初乳部分及2,000 Da至4,〇〇〇 Da印± 分之每一者中之「奈米部分分子」每 部分由闡述於實施例3中之實驗證實 實施例3 進行第二系列於展現CD3 醣蛋白之健康個體白血球

檢定之方案與闡述於實施例2中之方案極類似，其中包含 以下例外：僅將包含Concanavalin A ( ConA )替代PHA 之25 μΐ刺激劑引入對照測試條之「刺激」孔中，同時將以 μΐ細胞巨大病毒（CMV)疫苗之1:1〇稀釋液添加至每一 試驗條之「刺激」孔中（每孔稀釋度為L5〇);將小鼠抗 人類CD3抗體固定於磁性珠粒表面（按照附於ell MemoryTM試驗套組之說明）以製備Dyiiabeads®樣品純化 珠粒；及在初始培育之前將Dynabeads®樣品純化珠粒添加 至金樣、樣品稀釋劑、刺激劑（若存在）及樣品部分（若 存在）中。 在T-Cell MemoryTM檢定中，使用抗原替代致裂物質 (例如PHA )以便可評估T記憶細胞識別特定抗原之能力。 自量測板之每一孔中發出之光的密度顯著較小，因為T記 17 200831116 憶細胞僅構成已結合於Dynabeads®之抗體分子之細胞的一 部分。 該等檢定之結果闡述於下表中，其中所說明之數字表 示所測試之每一樣品（及量）之白血球產生之ATP的平均 (平均）量： 表2 樣 品 對照 10 pg 100 pg 1000 pg 250 Da 至 2,000 Da 初乳部分 未經刺激 (NS) 12 14 12 17 經CMV刺激 316 468 338 345 CMV刺激下 之增加％ 48.1 7.0 9.2 2,000Da 至 4,000Da 初乳部分 NS 12 15 12 15 以CMV刺激 316 501 503 440 CMV刺激下 之增加％ 58.5 59.1 39.2 4,000 Da 至 8,000 Da (包含TF)初乳部 分 NS 12 22 16 19 經CMV刺激 316 473 476 475 CMV刺激下 之增加％ 49.7 50.6 50.3 8,000 Da 至 12,000 Da初乳部分 NS 12 14 18 26 經CMV刺激 316 453 404 370 CMV刺激下 之增加％ 43.4 27.8 17.1 18 200831116 樣 品 對照 ίο μ§ 100 pg 1000 pg 2,000Da 至 4,000Da 卵部分 NS 12 26 61 108 經CMV刺激 316 305 349 350 CMV刺激〒 之增加％ -3.5’ 10.4 10.8 4,000Da 至 8,000Da (包含TF)卵部分 NS 12 34 39 108 經CMV刺激 316 310 — 280 381 CMV鈿激下 :之增加％ -1.9 ^ 41.4 20.6 自實施例3中所進行之試驗獲得之資料證明，在抗原 ^特異性刺激劑，與諸如Cc)nA或PHA之非特異性致裂物 質相對）存在下’ 3個含非轉移因子之初乳部分使所測試 之τ記憶細胞對CMV之活性提高至相當於（丨〇 ^

=，_ Da及8，_ Da至12，_ Da初乳部分之樣品）或 ，過（10 Kg及1〇〇 Μ 2,000 Da至4，_叫初乳部分之樣 含轉移因子之4，_仏至8，_Da初乳部分之相當規 3品增強所測試細胞在暴露於CMV時之活性的能力的 貫施例4 分子（亦 或含轉移 是否可調 之個體的 之流行性 進行另纟且檢定以判定奈米部分免疫調節物 即 2 0 Ο ο τλ τ* 5 a至4,000 Da初乳部分之免疫調節物、

因子部八Γ J 卜 刀 亦即4,000 Da至8,000 Da初乳部分） 即（例如增強）最近已暴露於高劑量之特定抗原 免疫5己憶。特定言之，自已暴露於引起全身感染 19 200831116 - 感冒病毒且患有流行性感冒症狀歷時4週之個體獲得血 樣。 該檢定係以描述於實施例3中之方式，使用Cylex之 T細胞MemoryTM檢定，根據檢定提供且闡述於實施例3 中之說明進行，其中例外為使用由Aventis Pasteur ( Paris， France)為2006-2007流行性感冒季節製造之流行性感冒 疫苗的1:25稀釋液形式的流行性感冒抗原（最終每孔稀釋 度為1··125)替代實施例3之0滅¥疫苗。 _ 該檢定之結果闡述於下表中： 表3 樣 品 對照 10 pg 100 pg 1000 jig 2,000Da 至 4,000Da 初乳部分 NS 4 10 3 4 經流行性感冒 抗原刺激 827 1003 [906 936 ConA 694 流行性感冒抗 原刺激下之增 加％ 21.3 9.6 13.2 4,000 Da 8,000 Da (包含TF)初乳部 分 NS 4 36 24 11 :經流行性感冒 抗原刺激 827 989 997 830 ConA 694 流行性感冒抗 原刺激下之增 加％ 19.6 20.6 0.4 20 200831116 表3中所不之結果（其亦以圖表形式展示於圖1中） 表明，當使最近已暴露於特定抗原之個體之T記憶細胞暴 露於該抗原，尤其在奈米部分分子或轉移因子存在下時， CD3 +記憶T細胞之活性顯著增強。實際上，相對較少量之 奈米部分分子及轉移因子使# τ記憶細胞活性增加約 20%。實際上，似半2 〇ηη τλ ， ， a至⑼〇 Da部分之免疫調節

物在調節利試細胞之活性巾大致上與轉移因子及存在於 Wa至8，_ Da部分中之任何其他分子—樣有效。 只施例1 4之結果表明具有在25〇 至2,则2,〇〇〇

Da至4,_以及8，_以至12 〇〇〇以範圍内之分子量 之免疫調節物有效調節多種類型丁細胞之免疫活性。因此， 藉由向個體投予該等免疫調節物或包含該等免疫調節物之 製備物或組成物，可調節個體之細胞媒介免疫。 基於該等結果，開發出（例如自（牛）初乳、（雞） 印等等）生產包含預定Mw⑶之分子的各種膳食增補劑之 方法。舉例而t ’且不限於，可將至少大粒+(例如初乳/ ㈣形物、蛋殼及膜等等）（例如藉由相分離、過據法等 等）已經移除之奈米部分免疫調節物之來源的液體製備物 加堡通過具有大小經確定以提供預定上限Mw⑶之孔的過 濾器。作為非限制性實施例，可使用提供約3,〇〇〇 Da分子 量截斷之過濾器。或者，可使用包含使用具有提供所需 MWCO之孔之透析膜的透析法。使用該等方法提供包含轉 移因子、抗體及分子量大於約3,〇〇〇 Da之多種其他分子之 較大分子經去除的「奈米部分」。（例如生產初乳、雞及 21 200831116 各種粉狀組成物）。濾液（會 (亦即已通過過濾器之液體部分） 可隨後藉由已知技術（例如冷凍乾 — 形成更濃之液體、併入凝膠中’ 、務^ *以 T寺寻）進一步加工。所得「奈 米部分產品」可隨後單獨或併人其他組成物中使用。 咸信藉由將奈米部分奋；& 刀子即使以極少量包含於亦包含

^子之製備物（且其亦可包含獲得轉移因子之基線含 :(亦即已存在於來源（例如初乳、印等等）中之含量）） :二斤得組成物將下調不適宜之τ細胞活性（例如自身免 關病症等等），同時改良或上調所Μ細胞活性。 = 於表4及表5中之奈米部分及轉移因子組成 表4

組成物A 成

*7............··....··〜IX J (噴霧乾燥) 霧乾燥）

調節组成物亦可稱為「免疫調節組份」。該「免疫 之來源刀J可基本上由諸如該等列於表4中之免疫調節物 來源：-(包含奈米部分免疫調節物之來源）或免疫調節物 卒取物之組合組成，或其可包含其他成份。 同揭 ，，結合本發明教示之組成物可基本上由諸如揭示 22 200831116 於表4中之「免疫調節組份」組成，或其可包含如闡述於 表5中之其他成份。 表5

組成物B 成 份 量 (每份，每份大小=一個膠囊） 組成物A 150 mg 鋅（以單曱硫胺酸形式） 5 mg Cordyvant™專屬之多醣複合體 440 mg IP-6 (六磷酸肌i|) 大豆萃取物（植物崔醇） 多蟲夏草（7%蟲草酸） β-葡聚糖（來自焙用酵母）（釀酒酵母 (Saacharomyces cerevisiae )) β-葡聚糖（來自燕麥）（燕麥（ sativa )) 姬松茸⑽萃取物 甘露聚糖（來自真蘆薈（Aloe vera))(葉 子） 橄欖葉萃取物（木犀欖（Oleaeuropaea)) 舞蒜（Maitake Mushroom )(灰樹花 (GW/ο/α加))(整個植物） 冬兹（Shiitake Mushroom )(香蒜 (整個植物)(5:1 萃 取物） 本發明之組成物可以液體（例如加入自4Life Research， LC ( Sandy，Utah)購得之RioVida®飲料中）、粉劑（其可 包含其他成份以提供適宜之風味、溶解特性及其類似特 性）、錠劑（其另外包含其他成份，諸如黏合劑（例如澱 粉）及其類似物）、凝膠劑（其中可添加明膠或其他成份） 23 200831116 ， 形式或以任何其他合適形式實施。應瞭解，為本發明之目 的’用以製造本發明之組成物之該等具體實施例之額外成 份，可為本發明之目的，認為對於該組成物僅為可選擇地 及非必需成份，除非另外由隨附申請專利範圍要求。 實施例5 自已患有帶狀泡疹（水痘帶狀皰狀病毒（vzv)感染） 症狀歷時約4週之個體收集血液。隨後使用immuKn〇wTM 檢定以描述於實施例2中之方式檢定該血液，其中實施例 • 2之樣品部分經以下各物替代：（a)不包含免疫調節物之 對’ （ b )已經噴霧乾燥之具有約3,〇〇〇 Da之MWCO之 初乳部分；（c)添加轉移因子XF⑧，其目前自4Life Research 購得且包含具有約10,000 Da之上限MWC〇的牛初乳萃取 物，；（d)表4中之組成物，其經標記為「組成物a」； 及（e )表5之組成物，其經標記為「組成物B」。將（b) 至（e)中之每一者於附MImmuKn〇wTM檢定之樣品稀釋劑 中復水，且在血樣及所有其他液體添加至每一孔中時，稀 攀釋使每孔最終濃度為i mg/ml之濃度。 該等檢定之結果闡述於下表中： 表6 未經刺激（NS) 對照 奈米部分 TFXF 組成物A 組成物B 26 35 77 47 19 經PHA刺激 220 234 150 140 27 該等結果亦呈現於圖2之圖表中。 24 200831116 重申该等結果係於一時間點（初始感染後約4週；亦 即在恢復期期間）獲得，其中在不存在刺激之情況下，預 期τ輔助（CD4+)細胞活性降低，儘管大量τ輔助細胞 保留於個體之血液中。τ輔助細胞活性在不存在非特異性 刺竑劑ΡΗΑ之情況下僅輕微地由奈米部分、TF xf及組成 物A放發，且似乎不受組成物B激發。然而，pHA對τ 辅助細胞之非特異性刺激受TF XF及組成物A顯著降低， 且受組成物B降低至更大程度，可如如闡述於表丨中之實 施例2之結果所預期。 實施例6 在較早B守間點（開始帶狀泡療症狀後約一週），儘管 τ記憶細胞由於引起帶狀泡疹之vzv感染之局部性質（亦 即VZV之相對較低血液力價）不以高濃度存在於個體之血 液中，但預期其已識別VZV感染且易於受VZV抗原之存 在刺激。因此，執行T細胞MemoryTM檢定以確定奈米部 分、TF XF、組成物a及組成物B對於來自與實施例5中 所測試之相同患者之血液之T記憶細胞的作用。按照闡述 於實施例3中之方案，其中具有以下例外··使用已稀釋為 1:10之VZV疫苗替代CMV疫苗（最終每孔稀釋度為1:50); 且實施例3之樣品部分由實施例5中所用之對照及免疫調 節物替代，其中每一種免疫調節物已稀釋至100 μ§/πι1之 最終每孔濃度。 下表闡述該檢定之結果： 25 200831116 - 表7 對照 未經刺激(NS) 1 1—^ 經VZV刺激 1 經ConA刺激 ~~~ ---—— 288 分 2

TFXF 13 30

組成物A

組成物B 27 32 51 69 該等資料亦以圖表形式描述於圖3中。 正如所預期，存在於Τρ >紅 > ,、 、 XF中之轉移因子刺激Τ記憶 、、、田I之活性。將少量額外 p不、木口P分分子添加至轉移因子中 在有或無其他VZV如丨# ΑΛ .、 剌斌的情況下均顯著地增加T記憶細 二之，舌性。因&，實施例5及實施例6之結果證實，將額 卜奈米部分分子即使以極少量添加至亦包含轉移因子之製 中」字下调不適且之τ細胞活性（例如自身免疫及相 來病症等等），同時改良或上調所需T細胞活性。 實施例7 在另一研究中，對旨在確定各種組成物，包含闡述於 又4及I 5巾之包含轉移因子及額外奈米部》分子之組成 勿刺/放針對對於NK細胞敏感之人類紅血球母細胞白血 病細胞株K-562之自然殺手（NK)細胞活性之能力的研究 進行評估。因此，NK細胞亦在本文中稱為「效應細胞」， ~ K 562細胞亦在本文中稱為「腫瘤細胞」且稱為「靶細 胞」。特定言之，使用MTT檢定技術，其中黃色的溴化3-(4,5-、甲基嘍唑-2-基）〜2,5_二苯基四唑鑌（MTT)經活細胞之 ’舌性粒線體中之還原酶還原為紫色的曱臢（f〇rmazan)。恰 在分析細胞毒性之前，添加將溶解甲臢之溶液（例如二曱 26 200831116 亞砜、於稀鹽酸（HCl )中之十二烷基硫酸鈉（SDs )等等） 至每一孔中。將用於量測每一孔中溶液所吸收之特定波長 (例如在約500 nm至約600 nm範圍内之波長）之光之量 的分光光度測定法隨後用於測定所檢定孔中相對於未添加 試驗組成物之一或多個對照孔中活細胞數目之活細胞數 目。 所δ平估之組成物包含·自4Life Research購得之轉移 因子AdvanCedTM;亦自4Life Research購得之轉移因子plus Advanced1™ ;包含轉移因子與增加量之奈米部分分子二者 之組成物A ;組成物B，其包含轉移因子、增加量之奈米 部分分子及認為增強免疫系統活性之其他成份；來自牛初 乳之奈米部分分子·，來自雞蛋之奈米部分分子；及可以商 標名Proleukin自荷蘭的Chiron購得之介白素_2 ( IL-2 )， 已知其招募對抗癌細胞之NK細胞。 自5個健康供體獲得血液。使用已知方法將白血球與 血液之其他組份分離。使用已知之密度梯度離心技術（例 如使用自 Sigma-Aldrich Corporation (St· Louis，Missouri) 講得之Histopaque®密度梯度）自其他類型白血球分離包含 NK細胞之單核細胞。將單核細胞引入具有〗〇%胎牛血清 (FCS)之RPMI 1640生長培養基中。將相等體積之包含 每100 μΐ培養基中約60,000個白血球之濃度的該混合物 引入標準96孔板之不同孔中。將以上所鑑別之含轉移因 子及/或奈米部分分子之組成物的各自具有1 無菌去離 子水中0.100 mg粉劑之濃度的復水樣品各自添加至3個含 27 200831116 有白血球及生長培養基之不同孔，總共十八個孔中。此外， 將1，000 IU/ml IL-2引入3個含有單核細胞.生長培養基混 合物之陽性對照孔中。3個陰性對照孔僅包含單核細胞-生 長培養基混合物而無免疫調節物。3個僅效應細胞陰性對 照孔亦僅包含單核細胞-生長培養基混合物，而3個僅靶細 胞陰性對照孔僅包含1〇〇 μ1生長培養基。 使單核細胞在5%C02存在下在37t之溫度及ι00%之 濕度下與其各別免疫調節組成物（除了 3個陰性對照孔外） 一起培育48小時。 培育之後’將約30,000個K-562細胞引入每一孔中， 除了含有單核細胞及生長培養基之3個僅效應細胞陰性對 照孔外。將96孔板及於其孔中之混合物在5% c〇2存在下 在37t：之溫度及100%之濕度下再次培育48小時。 根據已知標準技術製備濃度為每毫升Henk，s生理食鹽 水洛液具有5耄克MTT的MTT溶液。將二十微升（2〇 μΐ ) ΜΤΤ溶液引入96孔板之每一含單核細胞-生長培養基_腫瘤 細胞之孔中。將該板及其孔中之内容物在5〇/〇 c〇2存在下 在37C之溫度及100%之濕度下再次培育，此次歷時約4 小時。 在此最終培育之後’將96孔板在約ι，5〇〇 rpm下離心 約5分鐘。此後，將上清液（液體）自每一孔中移除，且 將15〇 μΐ二甲亞颯（DMSO)引入每一含單核細胞及腫瘤 細胞之孔中。隨後使用分光光度計量測每一含細胞孔在54〇 nm波長下之光學密度。隨後使用下式，使用所量測之光學 28 200831116 益度來確定當由每一測試物質活化時NK細胞之細胞毒性 指數（％) (CI(%))： CI (%) = [1 - (〇De+t-〇De)/ 〇D ] χ 1〇〇 , 其中ODe+t為對應於包含陽性對照之IL_2之所測試組 成物的每—測試孔的光學密度，叫為3個僅效應細胞陰 性對照孔之平均光學密度，且叫為3個僅乾細胞陰性對 鲁.、、、孔之平均光學岔度。CI ( % )表示每一亦含有所測試免 疫調節組成物之孔中由NK細胞殺死之乾細胞的百分比。 結果呈現於下表中： 表8 ~ —----- __免疫調節組成物 移因子 Advanced® ~—-----^ _gL(%) 43.1 .·”··.---------------------------- •~~----- _相對活性____ 55 轉移因子 Plus Advanced™ 38.5 — 49 組成物A 60.3 77 %組成物B 57.9 ，·.."·---------------------------- II —·’， 74 .争米部分分子，初乳 77.9 *******...........-.............. .. —.· 100 奈米部分分子，卵 —--------------------- / ϊ 68.7 ------------------------------------------ QQ IL-2 —----- __ 〇〇 84

亦描述於圖4之圖中之該等資料展示，包含尤其來自 牛初乳之奈米部分分子之組成物在引發對抗κ_562腫瘤细 胞之ΝΚ細胞活性方面大致上與IL_2 一樣有效或比其更有 效，而包含來自初乳及卵之轉移因子及來自初乳之 分分子之組成物（亦即組成物A及組成物B)比缺乏太^ 29 200831116 部分分子之組成物更有效地活化NK細胞。 藉由將少至2重量％之奈米部分分子再添加至包含轉 移因子之組成物中，奈米部分分子可增強個體免疫系統之 細胞媒介部分之非特異性組份（例如ΝΚ細胞）的作用， 補充轉移因子引發個體免疫系統之細胞媒介部分之抗原特 異性組份之活性的能力。 若-起考慮’則實施例5至實施例7之結果證明轉移 因子調節且引發Τ輔助細胞，其使個體之免疫系統能夠更 迅速且有效地對病原體及其他不適宜之實體作出反應。此 外，實施例5至實施例7說明轉移因子可增強了記憶細胞 之活性。 實施例5至實施例7亦展示，將額外奈米部分免疫調 節物分子添加至包含轉移因子之組成物中可增強且提高轉 移因子及現有包含轉移因子之組成物的免疫調節（例如τ 辅助細胞、Τ記憶細胞及Νκ細胞之免疫調節）。 调即個體之細胞媒介免疫之方法包含向該個體（例如 :服二非口服等等）投予包含奈米部分分子之組成物。該 等不米部分分子可單獨或作為基本上由奈米部分分子組成 、且成物之邛为投予，或其可與包含轉移因子之組成物（例 如諸如闡述於纟4或表5中之組成物）一起投予。投藥可 為維持個體細胞媒介免疫之總體平衡定期地進行，或其可 回應感染、自體免疫病症、組織移植或影響（活化或抑制） 個體細胞媒介免疫之另一情況而加以實施。 咸L基於生理學需要投予根據本發明之教示包含奈米 200831116 部分免疫調節物分子之組成物可調節細胞媒介免疫活性。 舉例而言，可降低不適宜之細胞媒介免疫活性（例如自體 免疫=等）。作為另-實施例，了細胞自個體之躯體移除 不適宜病原、冑以及諸如癌細胞及其他*常或突變細胞之其 他不適宜實體（例如藉由活化τ辅助（CD4+)細胞，其轉 而又活化自然殺手（NK)細胞，藉由使了記憶細胞能夠增 ，抗原特異性免疫料）之能力尤其在將轉移因子與額外 1之奈求部分免疫調節物分子一起投予時亦可集中且掸 明之以上描述含有許多細節，但其不應視為限制本發 Μ ’而是僅作為提供某些本發明之較佳具體實施例 類似地’可設料㈣本發明之精神或料之本 ^ ^其他具體實❹卜來自W實施例之特徵可組 ^ / Μ ’本發明之料僅由隨附中請專利範圍及其

示二效物：非由以上描述表明且限制。如本文中所揭 由此涵盍對本發明所作 請㈣範圍之意義及 1円之所有忝加、刪除及修改。 【圖式簡單說明】 各=二=:。之教，對組 【主要元件符號說明】 (無） 31

Claims (1)

1. 200831116 十、申請專利範圍： 1 · 一種用於改良免疫功能之組成物，其包括： 包含以下各物之免疫調節組份： 第一部分包含具有約10,000 Da上限分子量截斷之免 疫調節物來源之第一萃取物，包含轉移因子的食品萃取物 及具有約3,0〇〇 Da或低於3,000 Da分子量的奈米部分免疫 調節分子；及

   弟二部分包含具有約3,000 Da上限分子量截斷之免疫 調節物來源之第二萃取物，萃取物包含更多具有約3,〇〇〇 Μ 或低於3,0〇〇 Da之分子量的奈米部分免疫調節分子。 2·如申請專利範圍第丨項之組成物，其中該萃取物包 括牛初乳萃取物。 3.如申請專利範圍第1項之組成物，其中該萃取物進 一步包括雞蛋萃取物。 4·如申請專利範圍第3項之組成物，其中該第二萃取 物包括另一牛初乳萃取物。 5·如申請專利範圍第4項之組成物，其中該另一牛初 乳萃取物包括該免疫調節組份重量之至少約2%。 6.如申請專利範圍第5項之組成物，其中： 該牛初乳萃取物包括該免疫調節組份重量之約68%· 且 ， 該雞蛋萃取物包括該免疫調節組份重量之約3〇% 7·—種用於改良免疫功能之組成物，其包括： 基本上由以下各物所組成之免疫調節組份： 32 200831116 牛初乳之具有約10,00Ό Da上限分子量截斷之粉狀萃 取物； + 牛初乳之具有約3,000 Da上限分子量截斷之粉狀萃 物；及 蛋黃粉。 8·如申請專利範圍第7項之組成物，其中牛初乳之具 有約3,000 Da上限分子量截斷之粉狀萃取物包括該免疫碉 節組份之至少約2重量％。 又” ^ 9·如中請專利範圍第8項之組成物，其中：· 牛初乳之具有約1〇，⑽〇 Da上限分子量截斷之粉狀萃 取物包括該免疫調節組份重量之約68〇/〇 ; ^牛初乳之具有約10,⑽0 Da上限分子量截斷之該粉狀 萃取物包括該免疫調節組份重量之約2% ;且 該全蛋黃粉包括該免疫調節組份重量之約30%。 10·—種用於改良免疫功能之組成物，其包括·· • 基本上由具有至多約3，_ Da之分子量的奈米部分分 子組成之免疫調節組份。 11·如申請專利範圍帛Π)項之組成物，其中該等奈米 部分分子係自牛初乳及雞蛋中之至少一者中獲得。丁 12.—種調節個體之免疫系統之方法，其包括： 源之萃取物的組成 3,000 Da之分子量 向個體投予具有來自免疫調節物來源 物，其中该萃取物基本上由具有至多約3，丨 之奈米部分免疫調節物分子組成。 其中投予基本上 13 ·如申睛專利範圍第12項之方法， 33 200831116 - 由投予基本上由該萃取物組成之組成物組成。 14·如申請專利範圍第12項之方法，其中投予包括向 該個體投予另外包含免疫調節物來源之萃取物之組成物， 其中該萃取物包括具有至多約10,000 Da之分子量之免疫 調節物分子。 15·如申請專利範圍第14項之方法，其中投予包括投 予包含至少約2重量％萃取物之組成物，其中該萃取物基 本上由具有至多約3,000 〇&之分子量之免疫調節物分子組 ⑩成。 16.如申請專利範圍第15項之方法，其中投予包括投 予包含以下各物之纟且成物·· 由以下各物組成之免疫調節組份： 約2重量。/。膳食增補劑，其包括牛初乳之萃取物且基 本上由具有至多约3,000 Dai分子量的免疫調節物分子組 成； 約68重量％膳食增補劑，其包括牛初乳之萃取物且基 •本上由具有至多、約！〇，_Da之分子量之免疫調節物分子 組成；及 約30重量％膳食增補劑，其包括雞蛋黃。 17·如申請專利範圍第16項之方法，其中投予增加τ 記憶細胞、Τ辅助細胞及自然殺手細胞中之至少一者對抗 病原體、癌細胞及異常或突變細胞之活性。 18·如申請專利範圍第17項之方法，其中投予降低不 適宜之細胞媒介免疫活性。 34 200831116 • 19·一種用於測定至少一種分子之免疫調節能力的檢定 方法，其包括： 評估至少一種類型免疫細胞之未經刺激之活性； 將至少一種類型免疫細胞暴露於刺激物分子； #估該至少一種類型免疫細胞之經刺激之活性； 將該至少一種類型免疫細胞暴露於潛在免疫調節物； 及 鲁 評估該潛在免疫調節物對於該至少一種類型免疫細胞 之經刺激之活性的作用。 20.如申請專利範圍第19項之檢定方法，其中評估至 少 〜種類型免疫細胞之活性包括評估至少一種類型T細胞 之〉舌性。 21·如申請專利範圍第20項之檢定方法，其中評估至 少__ 〜種類型T細胞之活性包括評估CD3 +細胞及CD4+細胞 中之至少一者之活性。 % 22·如申請專利範圍第19項之檢定方法，其中 將至少一種類型免疫細胞暴露於刺激物分子包括將至 /)> 〜種類型免疫細胞暴露於致裂物質；且 評估該經刺激之活性包括評估暴露於該致裂物質後該 至少一種類型免疫細胞之活性增加。 23·如申請專利範圍第19項之檢定方法，其進一步包 括： 將至少一種類型免疫細胞暴露於刺激物分子包括將至 少〜種類型免疫細胞暴露於抗原；且 35 200831116 評估該經刺激之活性包括 . 匕括汗估暴露於該抗原後該至少 一種類型免疫細胞之活性增加。 24 _如申請專利範圍第 — 弟19項之;^疋方法，其中該至 一種類型免疫細胞句也 匕匕括健康免疫細胞、來自免疫受損 之免疫細胞或來自+ A々 > 田 /7、 目正自感染中恢復或琅近已自感染中 之來源的免疫細胞中之至少一種。 Η•一、圖式： 如次頁。 36