JP2010504988A - 免疫モジュレーター、免疫モジュレーターを含む調製物および組成物、免疫モジュレーターならびにそれを含む調製物および組成物の活性を評価するための検査、そして方法 - Google Patents

Abstract

ナノ画分免疫モジュレーター分子（すなわち約３，０００Ｄａおよびそれより小さい分子量を有する分子）を含む、免疫モジュレーターの原料からの抽出物を含む組成物を開示する。これらの組成物はまた、他の免疫モジュレーター、例えばトランスファーファクターを含んでもよい。ナノ画分免疫モジュレーター分子を含む抽出物を含む組成物の投与は、そのような組成物を投与した被験者の細胞性免疫を調節する（例えば望ましくないＴ細胞の活性をダウンレギュレートする）。トランスファーファクターと共に投与した場合、ナノ画分免疫モジュレーター分子およびトランスファーファクターとの組み合わせは、望ましくないＴ細胞の活性をダウンレギュレートし、一方、病原体およびその他の望ましくない実体、例えば癌細胞およびその他の異常なまたは変異した細胞に対するＴ細胞の活性を増加させる、またはアップレギュレートする。様々な物質の免疫調節能力を評価するためのアッセイおよびアッセイ技術についてもまた開示する。
【選択図】なし

Description

優先権主張
本出願は、２００６年９月２９日に提出された米国仮特許出願第６０/８４８，３４８号、および２００７年９月１４日に提出された米国特許出願第１１/８５５，９４４号に対する優先権の利益を主張し、これら双方の文献の開示を、本明細書にてそれらの全内容において参照として本明細書により援用する。

技術分野
本発明は、被験者における細胞性免疫を調節する（誘発する、増強する、望ましくない活性を抑制する、など）分子に関し、そのような分子、そのような分子を含む調節物および組成物を製造し、得るための方法、そのような分子の有効性を評価するための方法、ならびに使用法を含む。より具体的には本発明は、細胞性免疫を調節する “ナノ画分”分子と本明細書において呼ぶ小分子に関する。

抗体の特徴および抗体が産生される機序と同様に、免疫を提供し伝達する抗体の活性は周知されており、広く研究されている。
細胞性免疫またはＴ細胞を介した免疫を調節する上での役割を担う、３，５００Ｄａおよび７，５００Ｄａの間の分子量を有する分子のファミリーを含む、トランスファーファクターの役割については、それほど周知されておらず、それほど広く研究されてもいない。時間と共に、トランスファーファクターの特徴、および有機体の免疫系におけるそれらの役割について当業者の有する理解は改善されてきており、今も改善され続けている。

さらなる研究が、広く多様な免疫系成分の特徴および機能に光を投じ続けてはいるものの、免疫が展開、維持、輸送、および伝達される様式に、同様に長寿命における免疫の効果に大きな影響を持つと思われる、ほとんど理解されていない、あるいは見過ごされてさえいる多数の分子が存在し得る。

細胞性免疫を調節する上での様々な分子の有効性は、近年数量化可能な様式で特徴づけられている。細胞性免疫を直接的または間接的に調節すると思われる分子は、当該技術において“免疫モジュレーター”として知られている。免疫モジュレーターの１つのクラスは、細胞性免疫の応答を誘発する、増強する、抑制する、さもなければ調節する、小さなまたは低分子量のナノ画分（例えば３，０００Ｄａまで、３，５００Ｄａまで、２５０Ｄａから２，０００Ｄａ、２，０００Ｄａから４，０００Ｄａ）分子を含む。そのような免疫モジュレーターの相対的に小さなサイズ、または分子量のため、それらを本明細書において“ナノ画分”免疫モジュレーター、および“ナノ画分”分子と呼ぶ。

ナノ画分免疫モジュレーターは、多様な異なるタイプの原料動物より得てよい。原料動物の例として、哺乳類（例えばウシ）および鳥類（例えばニワトリ）を含むがこれに限定されない。本発明の範囲を限定するものではないが、ナノ分画モジュレーターは、哺乳類により産生される初乳から、または乳汁からでも得てよい。もう１つの非限定的例として、ナノ画分免疫モジュレーターは、鳥類またはあらゆるその他のタイプの動物により産生される卵から手に入れてよい。初乳、卵、およびナノ画分分子のその他の原料をまとめて、本明細書において“ナノ画分の原料”と呼ぶ。

原料動物によるナノ画分免疫モジュレーターの天然での産生は、原料動物が通常暴露されてきた１つまたはそれより多くの抗原の量より多い量または濃度のそのような抗原（１つまたは複数）に、原料動物を暴露させることにより増強してよい。例えば特定のタイプの原料動物が、または具体的な原料動物の場合でも、その典型的な環境において、通常ある種の量または濃度の所定の抗原に暴露されてきたのであれば、ナノ画分分子を含む免疫モジュレーターの原料動物による産生は、原料動物をずっと多い量（例えば濃度）のその抗原に暴露させることにより（例えば原料動物をワクチン接種することにより、より多い量または濃度のその抗原が存在する環境内に原料動物を置くことにより、など）増強してよい。もう１つの例として、特定のタイプの原料動物を、または具体的な原料動物の場合でも、所定の抗原で典型的にワクチン接種する場合、１つまたはそれより多くのナノ画分免疫モジュレーターの原料動物による産生は、原料動物の抗原への暴露を増加することにより（例えば原料動物を、より高い濃度の抗原、より有効なまたはより病原性のある形の抗原に暴露させることにより）増強することができる、しかしナノ画分分子それ自体は抗原特異的ではないと考えられている。

公知のプロセスを使用して、ナノ画分免疫モジュレーターを得るナノ画分の原料動物中に存在するその他の分子から、ナノ画分免疫モジュレーターを部分的に、実質的に、または完全に精製してよく、そして所望によりナノ画分免疫モジュレーターを濃縮してもよい。そのようなプロセスは非限定的に、機械的な分離、相分離（例えば水性成分および非水性成分の互いからの分離）、沈殿、遠心、濾過（約１２，０００Ｄａから約４，０００Ｄａの範囲の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を伴うマイクロ濾過、および約４，０００Ｄａより小さなＭＷＣＯを伴うナノ濾過を含む）、透析、クロマトグラフィー、および電気泳動による精製プロセスを含む。そのようなプロセスを個別にまたはあらゆる組み合わせで行って、１つまたはそれより多くのタイプの免疫モジュレーターが存在する調製物を生成してよい。

１つの側面において本発明は、少なくとも部分的に精製された、実質的に精製された（例えば当業者により受容される程度に）、および完全に精製された免疫モジュレーターの調製物を含む。加えて本発明は、ナノ画分分子を含む組成物を含む。ナノ画分分子に加えて、そのような組成物は、被験者の免疫系を補助するまたは調節する上で有用であるその他の成分（例えばトランスファーファクター、抗体、など）、ならびに他のやり方で被験者に利益をもたらすと思われる成分を含んでよい。

ナノ画分分子、または前記分子を単独で、もしくは他の免疫モジュレーターと共に含む組成物の、使用または投与を含む方法もまた、本発明の範囲内である。使用方法は、１つまたはそれより多くのタイプの免疫モジュレーター（例えば未加工の形、部分的に精製された形、実質的に精製された形、または完全に精製された形、調製物中、組成物中、など）の、被験者（例えばヒト、またはナノ画分分子により提供される免疫調節から利益を受けると考えられるあらゆるタイプの動物）への投与を含む。免疫モジュレーターは、特定の投与されるタイプの免疫モジュレーターのレベル（例えば、濃度）を、被験者の体内において、被験者にとって正常からそれを上回る量にまで増加させる量で、被験者に投与する。本発明のこの側面の範囲を限定することなく、被験者には、被験者の免疫系に細胞性免疫応答の誘発を引き起こすために臨床的に有効である量、または被験者による細胞性免疫応答を効果的に増強する量の１つまたはそれより多くの免疫モジュレーターを与えてよい。

加えて、免疫モジュレーターの有効性を評価する検査および試験の方法も、本発明の範囲内である。一例として、Ｔ細胞免疫機能アッセイを使用して、細胞性免疫に参加する１つまたはそれより多くのタイプの細胞の（例えばその細胞によるアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）産生の）活性を、単独でまたはその他の分子（例えば抗原、マイトジェン（有糸分裂または細胞の複製、などを誘導する））と組み合わせてのいずれかで調節する、潜在的免疫モジュレーターの能力を評価してよい。

その他の特性および有益性は、後述の記載および付記した請求項の考察を通して、当業者には明らかになるだろう。

図面において、図１から４は本発明の技術を組み入れた組成物に関して行った様々な検査の結果を表したグラフである。 図面において、図１から４は本発明の技術を組み入れた組成物に関して行った様々な検査の結果を表したグラフである。 図面において、図１から４は本発明の技術を組み入れた組成物に関して行った様々な検査の結果を表したグラフである。 図面において、図１から４は本発明の技術を組み入れた組成物に関して行った様々な検査の結果を表したグラフである。

多様な分子量の範囲の低分子が、免疫細胞の活性を調節する上で有用であることが、近年発見されている。以下の実施例は、これらの結論に達するために行った作業を示す。

実施例１
相分離、沈殿、濾過、マイクロ濾過またはナノ濾過、および透析を含む公知のプロセスを使用して、多様な分子量の画分を、ウシ初乳および鶏卵の双方より調製した。ウシ初乳より得た分子量画分は、２５０Ｄａから２，０００Ｄａ、２，０００Ｄａから４，０００Ｄａ、４，０００Ｄａから８，０００Ｄａ（この画分はトランスファーファクターを含んでおり、比較の目的のために含めた）、および８，０００Ｄａから１２，０００Ｄａであった。同様に２，０００Ｄａから４，０００Ｄａ、４，０００Ｄａから８，０００Ｄａ（この画分はトランスファーファクターを含んでおり、比較の目的のために含めた）、および８，０００Ｄａから１２，０００Ｄａの分子量画分を、鶏卵卵黄から調製した。その後分子量画分は（例えばスプレー乾燥、凍結乾燥、などにより）粉末の形に乾燥させた。

次にこれらの調製物を使用して様々なアッセイを行って、細胞性免疫を伝達する細胞（例えばＣＤ４+ Ｔヘルパー細胞）の活性を調節する、各画分内の分子の効果を評価した。具体的には、米国特許５，７７３，２３２号および６，６３０，３１６号ならびに米国特許出願公開２００５/０２６０５６３号に開示されているタイプのアッセイを改変し、使用して、多様な条件下で実施例１の異なる分子量画分の活性を評価した。前述のアッセイを使用して、免疫細胞（例えばＣＤ４+ Ｔヘルパー細胞、ＣＤ３＋細胞（すべてのＴ細胞を含む）など）によるアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）の産生を評価した。細胞によって産生されるＡＴＰの量は、当該技術の公知の様式で（例えば、ルミノメーターを用いてのいわゆる“ルシフェリン反応”の使用により）測定してよい。

実施例２
最初の一連のアッセイは、Columbia, Maryland のCylex Incorporated により製造されているImmuKnow（商標）アッセイを使用して、その表面上にいわゆる“ＣＤ４”糖タンパク質を含むまたは発現する、健常な個体の白血球細胞を使用して行った。これらの白血球細胞はまた、それらのＣＤ４糖タンパク質の発現のため“ＣＤ４＋”細胞とも呼ぶ。ＣＤ４糖タンパク質の発現は、他のＴ細胞を含む他のタイプの白血球細胞から、いわゆる“Ｔヘルパー”細胞を識別する。

ImmuKnow（商標）アッセイ検査キットの構成要素は以下のとおりである；標準的な９６ウェル“アッセイプレート”、これは取り外し可能な８ウェルの小板（strip）を含む；“サンプル希釈液”、これは成長培地および保存剤を含む；“刺激物質”、これは植物性血球凝集素−Ｌ（ＰＨＡ−Ｌ）（非特異的に有糸分裂（細胞が成長し２つの新しい細胞に分裂するプロセス）を刺激し、したがって白血球細胞におけるアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）の予備的産生を刺激することが知られている豆類（赤インゲン豆）由来物質（すなわち“マイトジェン”））を、成長培地および保存剤中に希釈して含む；“ダイナビーズ(Dynabeads、登録商標)^＊ＣＤ４”、これはマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ４抗体でコーティングした磁気サンプル精製ビーズであり、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および保存剤を含む緩衝化生理食塩水溶液により保管されている；“洗浄バッファー”、これはＢＳＡを含む緩衝化生理食塩水溶液含む；“溶解試薬”、これは界面活性剤を含む低張塩基性溶液を含む；“標準物質パネル”、これは０、１、１０、１００、および１，０００ｎｇ/ｍｌのＡＴＰ濃度を有する；“蛍光試薬”、これは緩衝化溶液中にルシフェリンおよびルシフェラーゼを含み、ＡＴＰと反応して、蛍光試薬が暴露されたＡＴＰの量の指標となる量の光を発する；そして“測定プレート”、これは不透明な境界面（すなわち壁面および底面）を有する９６ウェルを有する。

９６ウェルアッセイプレートの８ウェルの小板の一つは、“コントロール小板”と呼んでよく、４つの“非刺激”（ＮＳ）コントロールウェル、および４つの“刺激”コントロールウェルを含むコントロールを提供するために使用した。

９６ウェルアッセイプレートの別の８ウェル小板は、“検査小板”と呼んでよく、検査する各サンプル用に使用した。各小板の４つのウェルは“非刺激”ウェルとして指定し、一方各小板の他の４ウェルは“刺激”ウェルとした。５０マイクロリットル（５０μｌ）のサンプル希釈液を、コントロール小板の４つの各“非刺激”ウェル内に導入し、一方、各検査小板の各“非刺激”ウェル内には２５μｌのサンプル希釈液を導入した。コントロール小板の４つの各“刺激”ウェル、および各々の検査小板の４つの各“刺激”ウェル内に、各々２５マイクロリットル（２５μｌ）の刺激物質を導入した。

サンプル希釈液または刺激物質に加えて、実施例１で同定した分子量画分の１つの２５μｌサンプルを、各検査小板の各８ウェル内に導入した。より具体的には、実施例１の各々の分子量画分は、サンプル希釈液中で再構成し、一定量のサンプル希釈液で希釈して、１ウェルに２５μｌのサンプルを加えて、最終的にそのウェルに対して各々１０μｇ、１００μｇ、および１，０００μｇの乾燥粉末を加えた量となるような、３つの異なる濃度を提供した。

白血球細胞を含むその構成成分が均一に分散するように緩やかに撹拌しておいた、血液サンプルの１：３（血液：“サンプル希釈液”）希釈を調製した。７５マイクロリットル（７５μｌ）の希釈血液を、各小板の各ウェルに加えた。次にウェルの内容物を（例えばプレートを約３０秒間プレート振盪器上に置くことにより）混合した後、３７℃の温度、５％ＣＯ_２環境下で約１８時間インキュベーションした。

一度インキュベーションが完了した時点で、ウェルの内容物を（例えばプレートを約３分間プレート振盪器の上に置くことにより）再度混合した。その後ダイナビーズ（登録商標）サンプル精製ビーズを含む溶液を混合して、ダイナビーズ（登録商標）サンプル精製ビーズが保管されている液体内にそれらを均一に懸濁した（例えばボルテックスを用いて）。上に記したように、本実施例におけるダイナビーズ（登録商標）サンプル精製ビーズは、マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ４抗体でコーティングした磁気ビーズを含む。５０マイクロリットル（５０μｌ）のダイナビーズ（登録商標）サンプル精製ビーズ−保管溶液を、各小板の各ウェルに加えた。

各小板のウェルの内容物を（例えば約１５秒間プレート振盪器上で）再度混合した後、室温で約１５分の間置いたまま、またはインキュベーションしたまま放置した。その後、この混合およびインキュベーションのプロセスを繰り返し行った。ダイナビーズ（登録商標）サンプル精製ビーズ上のマウス抗ヒトＣＤ４抗体は、ＣＤ４糖タンパク質を提示する白血球としか結合しない。このインキュベーションの間に、Ｔヘルパー細胞を含むＣＤ４＋白血球細胞を、ダイナビーズ（登録商標）サンプル精製ビーズ上のマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ４抗体により固定化、または結合させた。

インキュベーションに続いて、各ウェルの内容物を（例えばプレート振盪器上で約１５秒から約３０秒間）再度混合して、ダイナビーズ（登録商標）サンプル精製ビーズを再懸濁した。その後各ウェルの内容物は、ImmuKnow（商標）アッセイに添付された説明書に示されたプロトコルに従って、磁場内に（例えば各８ウェル小板を、Cylexより入手可能な磁気トレイ内に置くことにより）導入した。磁場をかけると、ダイナビーズ（登録商標）サンプル精製ビーズはそれらの入っている各ウェルの片側に引き寄せられる。次にウェルの残りの内容物を除去し（例えばピペットなどで吸引する）、ビーズとＴヘルパー細胞を１回またはそれより多く（例えば３回、各々２００μｌの洗浄バッファーにて）洗浄して、それらを実質的に純粋なものとした。

その後２００マイクロリットル（２００μｌ）の溶解試薬を各ウェルに加えた。磁場から各ウェルの内容物を取り出した後、各ウェルの内容物（すなわちダイナビーズ（登録商標）サンプル精製ビーズ、それに付着した細胞、および溶解バッファー）を、（例えばプレート振盪器上で約５分間）混合した。溶解バッファーは、ダイナビーズ（登録商標）サンプル精製ビーズ上の抗体により固定化されたＣＤ４+細胞の膜を破壊した。他の物質と共に、ＡＴＰを溶解した細胞から放出させた。

一度細胞の溶解が完了した時点で、各ウェルの内容物に再び磁場をかけ、各ウェル内のダイナビーズ（登録商標）サンプル精製ビーズをウェルの片側に引き寄せた。次に５０μｌのサンプルを、各ウェルから測定プレートの対応するウェルに移した。サンプルの移動に加えて、９６ウェル測定プレートのいくつかのウェルを、標準物質パネル溶液の様々なＡＴＰ濃度の５０μｌサンプル用に確保した。

次に１５０マイクロリットル（１５０μｌ）の蛍光試薬を、検査サンプルまたは標準物質パネル溶液のサンプルのどちらかを含む測定プレートの各ウェルに加えた。その後各ウェルからの蛍光を測定した。測定した各ウェルからの蛍光は、そのウェル内に存在するＡＴＰの量の指標を提供する。各ウェルに存在するＡＴＰの量は、今度は測定プレートの各ウェルの内容物の由来する、細胞（例えばＣＤ４+細胞）内の代謝活性の量の指標となる。ＰＨＡにより非特異的に刺激された細胞に由来するサンプルにおいては、相対的に高レベルのＡＴＰが存在すると予想される。免疫モジュレーター（例えば実施例１で同定した画分の１つからの）の添加は、ＰＨＡにより非特異的に刺激されたＣＤ４＋細胞の代謝活性を増加、もしくは減少する、または調節することになるだろう。

そのような試験の結果を、各サブセットの白血球細胞により産生されたＡＴＰの平均量を表す説明上の数値を用いて、以下の表に示す。

これらのデータは、細胞がＰＨＡに暴露されない非刺激検査において、４，０００Ｄａから８，０００Ｄａ分子量の各画分（初乳および卵由来）は、その双方ともトランスファーファクターを含有することが知られているが、ＣＤ４＋白血球細胞において付加的な代謝活性を刺激したことを示す。これらのデータは、細胞性免疫をアップレギュレートするトランスファーファクターの能力を確認するものである。

反対に４，０００Ｄａから８，０００Ｄａの初乳および卵の画分は、ＣＤ４＋細胞における代謝活性を刺激するＰＨＡの非特異的能力をダウンレギュレートした。ＰＨＡは人工の非特異的刺激物質であるため、細胞性免疫に参加するトランスファーファクターによるその活性のダウンレギュレーションは驚くにはあたらない。トランスファーファクターは、Ｔ細胞による免疫活性を（例えば細胞がそれらの本来の目標を“思い出させる”手助けをすることにより、例えば微生物（細菌、ウイルス、等）による被験者の体の感染のような望ましくない実体に対しては活性を改善する一方で、自己免疫障害および関連する障害を低減することにより、など）釣り合わせる、および集中さえさせる手助けをする、と考えられており、また先行する研究によって示されている。Ｔ細胞によるＰＨＡに刺激された活性のダウンレギュレーションは、細胞性免疫におけるトランスファーファクターのこの役割を確認するようにみえる。

同様の結果は、２５０Ｄａから２，０００Ｄａの初乳画分（アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションの双方）、２，０００Ｄａから４，０００Ｄａ初乳画分（アップレギュレーション）、および２，０００Ｄａから４，０００Ｄａの卵画分（アップレギュレーションおよびダウンレギュレーション）を含む、トランスファーファクターを含まないいくつかのその他の分子量画分においても認められた。８，０００Ｄａから１０，０００Ｄａ初乳画分もまた、ＰＨＡで刺激されてないＣＤ４+白血球細胞における活性のアップレギュレーション、およびＣＤ４＋白血球細胞におけるＰＨＡ刺激による代謝活性のダウンレギュレーションを引き起こした。

これらのデータは、トランスファーファクター以外の免疫モジュレーターが、少なくとも２５０Ｄａから２，０００Ｄａの初乳画分、２，０００Ｄａから４，０００Ｄａの初乳画分、および２，０００Ｄａから４，０００Ｄａの卵画分中に存在することを確かなものとする。これら各画分中に存在する“ナノ画分分子”の免疫調節能力は、実施例３に示す実験により、少なくとも部分的には確認された。

実施例３
活性に関する第二の一連のアッセイは、いわゆる“Ｔ記憶”細胞を含むすべてのＴ細胞を含むことが知られている、ＣＤ３糖タンパク質を提示する健常な個体の白血球細胞（すなわちＣＤ３+細胞）において、誘発した。具体的にはCylexのT-Cell Memory（商標）アッセイを使用した。CylexのT-Cell Memory（商標）アッセイのプロトコルは、以下の点を除いて実施例２に示したものと非常に類似する：ＰＨＡの代わりにコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を含む２５μｌの刺激物質は、コントロール小板の“刺激”ウェル内にのみ導入し、一方２５μｌの１：１０希釈のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ワクチンを、各検査小板の“刺激”ウェルに加えた（最終的に１ウェル当たり１：５０希釈）；マウス抗ヒトＣＤ３抗体を、磁気ビーズ表面に（T-Cell Memory（商標）検査キットに添付の説明書により）固定化して、ダイナビーズ（登録商標）サンプル精製ビーズを調製した；そしてダイナビーズ（登録商標）サンプル精製ビーズを、最初のインキュベーションの前に、血液サンプル、サンプル希釈液、刺激物質（加える場合）、およびサンプル画分（加える場合）に加えた。

T-Cell Memory（商標）アッセイにおいては、特定の抗原を認識するＴ記憶細胞の能力を評価してよいように、マイトジェン（例えばＰＨＡ）の代わりに抗原を使用する。特に、Ｔ記憶細胞は、ダイナビーズ（登録商標）の抗体分子に結合した細胞の一部のみを構成するに過ぎないため、測定プレートの各ウェルから発せられる光の強度は小さい。

これらのアッセイの結果を、検査した各サンプル（および量）について、白血球細胞により産生されるＡＴＰの平均量を表す説明上の数値を用いて、以下の表に示す。

この実施例３で行った試験から得られたデータは、抗原（マイトジェン、例えばＣｏｎＡまたはＰＨＡ、の非特異性とは反対に、特異的な刺激物質）の存在下で、３つのトランスファーファクターを含有しない初乳画分が、ＣＭＶに暴露した時に、検査した細胞の活性を増強するトランスファーファクターを含有する初乳画分である４，０００Ｄａから８，０００Ｄａと同等のサイズのサンプルの能力に匹敵する（２５０Ｄａから２，０００Ｄａ、および８，０００Ｄａから１２，０００Ｄａの初乳画分の１０μｇのサンプル）または越える（２，０００Ｄａから４，０００Ｄａの初乳画分の１０μｇおよび１００μｇのサンプル）程度にまで、検査したＴ記憶細胞のＣＭＶに対する活性を増強することを実証する。

実施例４
もう１組のアッセイは、ナノ画分免疫モジュレーター分子（すなわち２，０００Ｄａから４，０００Ｄａの初乳画分の免疫モジュレーター）またはトランスファーファクターを含有する画分（すなわち４，０００Ｄａから８，０００Ｄａの初乳画分）のどちらかが、高用量の特定の抗原に最近暴露された被験者の免疫記憶を調節する（例えば増強する）ことができるか否かを決定するために行った。具体的には、全身感染を引き起こすインフルエンザウイルスに暴露され、４週間インフルエンザの症状を患った個体から、血液サンプルを得た。

本アッセイは、実施例３に記載した様式で、CylexのT-Cell Memory（商標）アッセイを使用して、実施例３のＣＭＶの代わりに、２００６−２００７年のインフルエンザシーズンに関する、Paris, France のAventis Pasteur により製造されたインフルエンザワクチンの１：２５希釈の形のインフルエンザ抗原（１ウェルあたり１：１２５の最終希釈として）を使用したことを除いては、同アッセイに提供され、そして実施例３に記載した指示に従って行った。

このアッセイの結果を以下の表に示す：

表３に示した（図１にグラフでも示す）結果は、特定の抗原に最近暴露された被験者のＴ記憶細胞が、特にナノ画分分子またはトランスファーファクターの存在下で、その抗原に暴露されると、ＣＤ３+記憶Ｔ細胞の活性が有意に増加することを示す。事実、相対的に少量のナノ画分分子およびトランスファーファクターは、Ｔ記憶細胞の活性における約２０％の増加を引き起こした。事実、２，０００Ｄａから４，０００Ｄａ画分の免疫モジュレーターは、検査した細胞の活性の調節において、４，０００Ｄａから８，０００Ｄａの画分中に存在するトランスファーファクターおよびあらゆるその他の分子と、ほぼ同程度の有効性があるようにみえる。

実施例１−４の結果は、２５０Ｄａから２，０００Ｄａ、２，０００Ｄａから４，０００Ｄａ、および８，０００Ｄａから１２，０００Ｄａの範囲の分子量を有する免疫モジュレーターは、様々なタイプのＴ細胞の免疫活性を調節する上で有効であることを実証する。したがって、そのような免疫モジュレーター、または免疫モジュレーターを含む調製物もしくは組成物を、被験者に投与することにより、被験者の細胞性免疫を調節してもよい。

これらの結果に基づいて、予め決定したＭＷＣＯの分子を含む様々な栄養補助食品（例えば（ウシ）初乳、（鶏）卵、など由来）を生産するためのプロセスを開発した。限定する目的はないが、例えば、少なくとも肉眼で見える粒子（例えば初乳/乳汁の固形物、卵の殻および膜、等）を（例えば相分離、濾過のプロセス、等により）除去した、ナノ画分免疫モジュレーターの原料の液体調製物を、予め決定した上限のＭＷＣＯを提供するサイズであるポアのフィルターに通してよい。非限定的例として、約３，０００Ｄａの分子量カットオフを提供するフィルターを使用してよい。あるいは所望のＭＷＣＯを提供するポアを有する透析膜の使用を含む透析プロセスを使用してもよい。そのようなプロセスの使用は、約３，０００Ｄａより大きい分子量を有するトランスファーファクター、抗体、および多様なその他の分子を含むより大きな分子を除外した、“ナノ画分”を提供する（例えば初乳、ニワトリ、および様々な原料の粉末化組成物を生成した。次に濾液（すなわちフィルターを通過した液体部分）を、公知の技術（例えば凍結乾燥、スプレー乾燥、より濃縮された液体を形成するための蒸発、ゲル内への組み入れ、など）により、さらに加工してよい。その後得られた“ナノ画分生成物”を、単独で使用してもよいし、または他の組成物中に組み入れてもよい。

トランスファーファクターもまた含む調製物（そして調製物はまた、ベースラインレベル（すなわちトランスファーファクターを得る原料（例えば初乳、卵、など）中に既に存在するレベル）を含んでいてもよい）中に、たとえ非常に少量であってもナノ画分分子を含むことにより、得られた組成物は、Ｔ細胞による望ましくない活性（例えば自己免疫障害および関連する障害、など）をダウンレギュレートし、一方では望ましいＴ細胞活性を改善する、またはアップレギュレートする、と考えられる。表４および５に示す、ナノ画分−および−トランスファーファクターの組成物を開発した。

表４の組成物はまた、“免疫調節成分”と呼んでもよい。そのような“免疫調節成分”は、免疫モジュレーターの原料（ナノ画分免疫モジュレーターの原料を含む）もしくは免疫モジュレーター原料の抽出物を組み合わせたもの、例えば表４に列記したものから本質的に成ってよく、または免疫調節成分はその他の成分を含んでもよい。

同様に本発明の教示内容を組み込む組成物は、 “免疫調節成分”、例えば表４に開示したものから本質的に成ってよく、または表５に示したようなその他の成分を含んでもよい。

本発明に従っての組成物は、液体（例えばSandy, Utah の4Life Research, LC より入手可能なRio Vida（登録商標）ドリンク中）、粉末（所望の芳香、溶解特性、などを提供する付加的な成分を含んでよい）、錠剤（その他の成分、例えば結合剤（例えばデンプン）などを付加的に含む）、ゲル（ゼラチンもしくはその他の成分を加えてよい）として、またはあらゆるその他の適切な剤形中に組み入れてもよい。本開示の目的として、本発明の組成物のそのような態様を製造するために使用する付加的な成分は、付記した請求項により別に要求していなければ、本開示の目的としては、所望によるものであり、組成物に必須ではないと単に考えてよいものと理解されなければならない。

実施例５
約４週間帯状疱疹（水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）感染）の症状を患っている個体より、血液を集めた。その後血液は、実施例２に記載した様式でImmuKnow （商標）アッセイを使用して、実施例２のサンプル画分を以下の様に置き換えてアッセイを行った：（ａ）免疫モジュレーターを含まないコントロール；（ｂ）スプレー乾燥した約３，０００ＤａのＭＷＣＯを有する初乳画分；（ｃ）Transfer Factor XF（トランスファーファクターＸＦ）（登録商標）、これは現在4Life Research より入手可能であり、約１０，０００Ｄａの上限ＭＷＣＯを含むウシ初乳抽出物を含む、を加えた；（ｄ）表４の組成物、すなわち“組成物Ａ”と命名したもの；および（ｅ）表５の組成物、すなわち“組成物Ｂ”と命名したもの。（ｂ）から（ｅ）までの各成分は、ImmuKnow（商標）アッセイに添付されたサンプル希釈液中で再構成し、一度血液サンプルおよびその他のすべての液体を各ウェルに加えた時点で、最終的に１ウェル当たり１ｍｇ/ｍｌの濃度となる濃度に希釈した。

これらのアッセイの結果を以下の表に示す：

これらの結果はまた図２のグラフにも示す。
これらの結果は、刺激の不在下で、多数のＴヘルパー細胞が被験者の血液中に残っているがＴヘルパー（ＣＤ４＋）細胞の活性は減少していると予測される時点（初期感染後約４週；すなわち回復期）で得たことを、繰り返しておく。Ｔヘルパー細胞の活性は、非特異的刺激物質ＰＨＡの不在下では、ナノ画分、ＴＦ ＸＦ、および組成物Ａによりわずかにのみ刺激されたに過ぎず、組成物Ｂによっては刺激されなかったようにみえる。しかしながら表１に示した実施例２の結果から予測されたかもしれないように、ＰＨＡによるＴヘルパー細胞の非特異的刺激は、ＴＦ ＸＦおよび組成物Ａにより有意に低減され、そして組成物Ｂによってはさらに大きな程度にまで低減された。

実施例６
より早期の時点（帯状疱疹の症状発症後約１週間）では、Ｔ記憶細胞は、帯状疱疹を引き起こすＶＺＶ感染の局所的な性質（すなわち相対的に低いＶＺＶ血液力価）のため、被験者の血液中に高濃度では存在しないものの、既にＶＺＶ感染を認識しており、ＶＺＶ抗原の存在により容易に刺激されると予測されよう。故に、実施例５で検査したのと同じ患者由来血液に由来するＴ記憶細胞に関して、T-Cell Memory（商標）アッセイを行い、ナノ画分、ＴＦ ＸＦ、組成物Ａ、および組成物Ｂの効果を決定した。以下の点を除き、実施例３に示したプロトコルに従った：ＶＺＶワクチン、これは１：１０に希釈し、ＣＭＶワクチンの代わりに使用した（最終的に１ウェル当たり１：５０希釈）；および実施例３のサンプル画分を、実施例５で使用したコントロールおよび免疫モジュレーターに置き換え、各免疫モジュレーターは１ウェル当たり１００μｇ/ｍｌの最終濃度に希釈した。

以下の表は本アッセイの結果を示す：

このデータはまた、図３にもグラフで表示した。
予測されるように、ＴＦ ＸＦ中に存在するトランスファーファクターは、Ｔ記憶細胞による活性を刺激した。トランスファーファクターへの少量の追加のナノ画分分子の添加は、付加的なＶＺＶ刺激を伴う場合もそうでない場合も双方とも、Ｔ記憶細胞の活性を有意に増加させた。したがって実施例５および６の結果は、トランスファーファクターもまた含む調製物に、例え非常に少量であっても追加のナノ画分分子を添加することで、Ｔ細胞による望ましくない活性（例えば自己免疫障害および関連する障害、など）をダウンレギュレートし、一方所望のＴ細胞活性を、改善またはアップレギュレートすることを確認した。

実施例７
もう１つの研究において、表４および５に示したトランスファーファクターおよび追加のナノ画分分子を含む組成物を含む様々な組成物の、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞への感受性のあるヒト赤芽球性白血病細胞株Ｋ−５６２に対するＮＫ細胞の活性を刺激する能力を決定するためにこの研究を行い、評価した。故に本明細書において、ＮＫ細胞はまた“エフェクター細胞”とも呼び、一方本明細書においてＫ−５６２細胞はまた“腫瘍細胞”および“標的細胞”とも呼ぶ。具体的には、ＭＴＴアッセイの技術を使用したが、このアッセイでは、黄色である３−(４，５−ジメチルチアゾール−２−イル)−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）が、生きている細胞の活性なミトコンドリア内の還元酵素により、紫色であるホルマザンに還元される。細胞傷害性の分析の直前に、ホルマザンを溶解する溶液（例えば希塩酸（ＨＣｌ）中のジメチルスルホキシド、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、など）を、各ウェルに加える。次に、各ウェル内の溶液により吸収されるある種の波長（例えば約５００ｎｍから６００ｎｍの範囲の波長）の光の量を測定する分光測定を使用して、検査組成物を添加しない１つまたはそれより多くのコントロールウェル内の生きている細胞数に相対して、アッセイを行ったウェル内の生きている細胞数を決定した。

評価した組成物は、4Life Research より入手可能なTransfer Factor Advanced（商標）；これもまた4Life Research より入手可能なTransfer Factor Plus Advanced（商標）；組成物Ａ、すなわちトランスファーファクターおよび増加した量のナノ画分分子の双方を含むもの；組成物Ｂ、すなわちトランスファーファクター、増加した量のナノ画分分子、および免疫系の活性を増強すると考えられているその他の成分を含むもの；ウシ初乳由来のナノ画分分子；鶏卵由来のナノ画分分子；およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）、これは癌細胞に対してＮＫ細胞を動員することが知られており、オランダのChiron から商標名Proleukin にて入手可能、を含んだ。

血液は５名の健常なドナーより得た。公知のプロセスを使用して、血液の他の構成物より白血球細胞を単離した。公知の密度勾配遠心法（例えばSt. Louis, MissouriのSigma-Aldrich Corporationより入手可能なHistopaque（登録商標）密度勾配を使用して）を使用して、他のタイプの白血球細胞から、ＮＫ細胞を含む単核細胞を単離した。単核細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０成長培地中に導入した。１００μｌの培養培地中に約６０，０００白血球細胞の濃度を含む、この混合物の等しい容量を、標準的な９６ウェルプレートの別個のウェル内に導入した。１ｍｌの無菌、脱イオン水に０．１００ｍｇ粉末の濃度を各々有する、上記で同定したトランスファーファクターおよび/またはナノ画分分子を含有する組成物の再構成したサンプルを、白血球細胞および成長培地を含有する３つの別個のウェルに各々加えて、合計１８のウェルとした。加えて、１，０００ＩＵ/ｍｌのＩＬ−２を、単核細胞−成長培地の混合物を含有する３つのポジティブコントロールウェル内に導入した。３つのネガティブコントロールウェルは、単核細胞−成長培地の混合物のみを含み、免疫モジュレーターは含まないものとした。３つのエフェクター細胞のみのネガティブコントロールウェルもまた、単核細胞−成長培地の混合物のみを含み、一方３つの標的細胞のみのネガティブコントロールウェルは、１００μｌの成長培地のみを含んだ。

単核細胞は、それらの各々の免疫調節組成物と共に（３つのネガティブコントロールウェルは除く）、５％ＣＯ_２の存在下、３７℃の温度および１００％の湿度で４８時間インキュベーションした。

インキュベーションの後、３つのエフェクター細胞のみのネガティブコントロールウェルを除き、約３０，０００のＫ−５６２細胞を、単核細胞および成長培地を含有する各ウェルに導入した。９６ウェルプレートおよびそのウェル内の混合物を、５％ＣＯ_２の存在下、３７℃の温度および１００％の湿度で４８時間、再度インキュベーションした。

５ｍｇ ＭＴＴ/ｍｌ Ｈｅｎｋの生理食塩水溶液の濃度を有するＭＴＴ溶液は、公知の標準的な技術に従って調製した。２０マイクロリットル（２０μｌ）のＭＴＴ溶液を、９６ウェルプレーの単核細胞−成長培地−腫瘍細胞を含有する各ウェル内に導入した。プレートおよびそのウェルの内容物を、５％ＣＯ_２の存在下、３７℃の温度および１００％の湿度で、今回は約４時間、再度インキュベーションした。

この最後のインキュベーションの後、９６ウェルプレートを約１，５００ｒｐｍで約５分間遠心した。その後上清（液体）を各ウェルから除去し、１５０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、単核細胞および腫瘍細胞を含有する各ウェル内に導入した。その後分光光度計を使用して、細胞を含有する各ウェルの５４０ｎｍの波長での光学密度を測定した。次に測定した光学密度を使用して、各検査物質により活性化された場合のＮＫ細胞の細胞傷害性指数（％）（ＣＩ（％））を、以下の式を使用して決定した：
ＣＩ（％）＝[１−(ＯＤ_ｅ＋ｔ−ＯＤ_ｅ)/ＯＤ_ｔ]×１００
式中、ＯＤ_ｅ＋ｔは、ポジティブコントロールのＩＬ−２を含む、検査組成物に対応する各検査ウェルの光学密度であり、ＯＤ_ｅは３つのエフェクター細胞のみのネガティブコントロールウェルの平均光学密度であり、そしてＯＤ_ｔは３つの標的細胞のみのネガティブコントロールウェルの平均光学密度である。ＣＩ（％）は、検査した免疫調節組成物もまた含有する各ウェルにおける、ＮＫ細胞により殺された標的細胞のパーセントを表す。結果を以下の表に表す：

これらのデータは、図４の図表にも示したが、ナノ画分分子、特にウシ初乳由来のものを含む組成物は、Ｋ−５６２主要細胞に対するＮＫ細胞活性の誘発で、ＩＬ−２とほぼ同程度、またはそれ以上に有効であり、一方初乳および卵由来のトランスファーファクターならびに初乳由来のナノ画分分子を含む組成物（すなわち組成物Ａおよび組成物Ｂ）は、ナノ画分分子を含まない組成物より有効に、ＮＫ細胞を活性化することを示す。

重量でわずか２％のさらなるナノ画分分子を、トランスファーファクターを含む組成物に加えることにより、ナノ画分分子が、被験者の免疫系の細胞性免疫部分の非特異的成分（例えばＮＫ細胞）による作用をブーストし、被験者の免疫系の細胞性部分の抗原特異的成分による活性を誘発するトランスファーファクターの能力を補完すると思われる。

まとめて考察すると実施例５から７までの結果は、トランスファーファクターはＴヘルパー細胞を制御および刺激し、そのことが病原体およびその他の望ましくない侵入物に対する被験者の免疫系が、より迅速にそして効率的に応答することを可能にすることを実証する。加えて実施例５から７は、トランスファーファクターがＴ記憶細胞の活性を増強すると思われることを説明する。

実施例５から７はまた、トランスファーファクターを含む組成物に追加のナノ画分免疫モジュレーター分子加えることで、トランスファクター、およびトランスファーファクターを含む現在ある組成物の（例えばＴヘルパー細胞、Ｔ記憶細胞、およびＮＫ細胞の）免疫調節を強化および増強すると思われることを示す。

被験者の細胞性免疫を調節する方法は、ナノ画分分子を含む組成物を被験者に（例えば経腸的に、非経口的に、など）投与することを含む。ナノ画分分子は、単独で、もしくは本質的にナノ画分分子から成る組成物の一部として投与してよく、またはナノ画分分子は、トランスファーファクターを含む組成物（例えば実施例４または実施例５に示した組成物）と共に投与してもよい。投与は、被験者の細胞性免疫における全体のバランスを維持する目的で、規定の基礎的状態において実施してよく、または被験者の細胞性免疫に影響を及ぼす（活性化または抑制する）感染、自己免疫障害、組織移植、もしくは別のイベントに応答して達成してもよい。

本発明の教示内容に従ってのナノ画分免疫モジュレーター分子を含む組成物の投与は、生理学的必要性に基づいて細胞性免疫の活性を調節すると考えられる。例えば望ましくない細胞性免疫の活性（例えば自己免疫、など）は、低減されると思われる。もう１つの例として、望ましくない病原体、ならびにその他の望ましくない実体、例えば癌細胞およびその他の異常なまたは変異した細胞を、（例えばＴヘルパー（ＣＤ４＋）細胞を活性化し、それにより今度はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化することにより、Ｔ記憶細胞の作用を可能にすることによって抗原特異的免疫を増加させることにより、など）被験者の体から除去するＴ細胞の能力もまた、特にトランスファーファクターが付加的な量のナノ画分免疫モジュレーター分子と共に投与された時に、集中および増強されると思われる。

前述の記載は多くの具体的例を含有するが、これらは本発明の範囲を限定するものとしてではなく、単に本発明に好ましい態様のいくつかの説明を提供するものとして、解釈されなければならない。同様に、本発明の精神または範囲から離れることのない本発明の他の態様を考案してもよい。異なる態様の特徴を組み合わせて使用してよい。それ故本発明の範囲は、前述の記載よりむしろ付記した請求項およびそれらの法的均等物によってのみ、示され、限定される。請求項の意味および範囲に含まれる本明細書に開示したような、本発明に対するすべての添加、削除、および修飾は、本発明により包括的に含まれるものとする。

Claims (24)

1. 免疫機能を改善するための組成物であって、以下：
   約１０，０００Ｄａの上限分子量カットオフを有する免疫モジュレーターの原料の第一の抽出物を含む第一の部分、該食品抽出物はトランスファーファクター、および約３，０００Ｄａまたはそれより小さい分子量を有するナノ画分免疫調節分子を含む；ならびに
   約３，０００Ｄａの上限分子量カットオフを有する免疫モジュレーターの原料の第二の抽出物を含む第二の部分、該抽出物は約３，０００Ｄａまたはそれより小さい分子量を有するナノ画分免疫調節分子の多くを含む；
   を含む免疫調節成分、
   を包含する、前記組成物。
2. 抽出物がウシ初乳の抽出物を包含する、請求項１に記載の組成物。
3. 抽出物が鶏卵の抽出物をさらに包含する、請求項１に記載の組成物。
4. 第２の抽出物が、ウシ初乳のもう１つの抽出物を包含する、請求項３に記載の組成物。
5. ウシ初乳のもう１つの抽出物が、免疫調節成分の重量の少なくとも約２パーセントを構成する、請求項４に記載の組成物。
6. ウシ初乳の抽出物が、免疫調節成分の重量の約６８％を構成し；そして
   鶏卵の抽出物が、免疫調節成分の重量の約３０％を構成する；
   請求項５に記載の組成物。
7. 免疫機能を改善するための組成物であって、以下の成分：
   約１０，０００Ｄａの上限分子量カットオフを有するウシ初乳の粉末化抽出物；
   約３，０００Ｄａの上限分子量カットオフを有するウシ初乳の粉末化抽出物；および
   粉末化卵黄；
   から本質的に成る免疫調節成分、
   を包含する、前記組成物。
8. 約３，０００Ｄａの上限分子量カットオフを有するウシ初乳の粉末化抽出物が、免疫調節成分の重量の少なくとも約２パーセントを構成する、請求項７に記載の組成物。
9. 約１０，０００Ｄａの上限分子量カットオフを有するウシ初乳の粉末化抽出物が、免疫調節成分の重量の約６８％を構成し；
   約１０，０００Ｄａの上限分子量カットオフを有するウシ初乳の粉末化抽出物が、免疫調節成分の重量の約２％を構成し；そして
   粉末化した全卵の卵黄が、免疫調節成分の重量の約３０％を構成する；
   請求項８に記載の組成物。
10. 免疫機能を改善するための組成物であって、以下：
    最大でも約３，０００Ｄａの分子量を有するナノ画分分子から本質的に成る免疫調節成分
    を包含する、前記組成物。
11. ナノ画分分子を、ウシ初乳および鶏卵の少なくとも１つから得る、請求項１０に記載の組成物。
12. 被験者の免疫系を調節するための方法であって、以下：
    最大でも約３，０００Ｄａの分子量を有するナノ画分免疫モジュレーター分子から本質的に成る、免疫モジュレーターの原料からの抽出物を含む組成物を、被験者に投与すること
    を包含する、前記方法。
13. 投与が、抽出物から本質的に成る組成物を投与することから本質的に成る、請求項１２に記載の方法。
14. 投与が、約１０，０００Ｄａまでの分子量を有する免疫モジュレーター分子を含む、免疫モジュレーターの原料の抽出物を付加的に含む組成物を、被験者に投与することを含む、請求項１２に記載の方法。
15. 投与が、重量の少なくとも約２パーセントの、約３，０００Ｄａまでの分子量を有する免疫モジュレーター分子から本質的に成る抽出物、を含む組成物を投与することを包含する、請求項１４に記載の方法。
16. 投与が、以下から成る免疫調節成分であって：
    栄養補助食品の重量の約２％が、ウシ初乳の抽出物を包含し、そして約３，０００Ｄａまでの分子量を有する免疫モジュレーター分子から本質的に成り；
    栄養補助食品の重量の約６８％が、ウシ初乳の抽出物を包含し、そして約１０，０００Ｄａまでの分子量を有する免疫モジュレーター分子から本質的に成り；そして
    栄養補助食品の重量の約３０％が、鶏卵の卵黄を包含する；
    前記免疫調節成分、
    を含む組成物、を投与することを包含する、請求項１５に記載の方法。
17. 投与が、病原体、癌細胞、および異常なまたは変異した細胞に対する、Ｔ記憶細胞、Ｔヘルパー細胞、およびナチュラルキラー細胞の少なくとも１つの活性を増加させる、請求項１６に記載の方法。
18. 投与が、望ましくない細胞性免疫の活性を減少させる、請求項１７に記載の方法。
19. 以下：
    少なくとも１つのタイプの免疫細胞の刺激されていない活性を評価すること；
    少なくとも１つのタイプの免疫細胞を刺激分子に暴露させること；
    少なくとも１つのタイプの免疫細胞の刺激された活性を評価すること；
    少なくとも１つのタイプの免疫細胞を、潜在的免疫モジュレーターに暴露させること：そして
    少なくとも１つのタイプの免疫細胞の刺激された活性における、潜在的免疫モジュレーターの効果を評価すること、
    を包含する、少なくとも１つの分子の免疫調節能力を決定するためのアッセイ法。
20. 少なくとも１つのタイプの免疫細胞の活性の評価が、少なくとも１つのタイプのＴ細胞の活性を評価することを包含する、請求項１９に記載のアッセイ法。
21. 少なくとも１つのタイプのＴ細胞の活性の評価が、ＣＤ３＋細胞およびＣＤ４＋細胞の少なくとも１つの活性を評価することを包含する、請求項２０に記載のアッセイ法。
22. 少なくとも１つのタイプの免疫細胞の刺激分子への暴露が、少なくとも１つのタイプの免疫細胞をマイトジェンに暴露させることを包含し；そして
    刺激された活性の評価が、マイトジェンへの暴露に続いての、少なくとも１つのタイプの免疫細胞の活性における増加を評価することを包含する；
    請求項１９に記載のアッセイ法。
23. 以下：
    少なくとも１つのタイプの免疫細胞の刺激分子への暴露が、少なくとも１つのタイプの免疫細胞を抗原に暴露させることを包含すること；そして
    刺激された活性の評価が、抗原への暴露に続いての少なくとも１つのタイプの免疫細胞の活性における増加を評価することを包含すること；
    をさらに包含する、請求項１９に記載のアッセイ法。
24. 少なくとも１つのタイプの免疫細胞が、健常な免疫細胞、免疫学的に易感染性の原料由来の免疫細胞、または感染から回復しているもしくは感染から最近回復した原料由来の免疫細胞、の少なくとも１つを包含する、請求項１９に記載のアッセイ法。