本申请要求2006年9月29日递交的美国临时申请系列号60/848,348和2007年9月14日递交的美国临时专利申请系列号11/855,944的优先权权益,在此将这两篇文献的公开内容以其整体引入作为参考。
实施本发明的方式
最近已经发现了各种分子量范围的小分子可用于调节免疫细胞的活性。以下实施例列出了所进行的用于研究这些结论的工作。
实施例1
使用已知的方法,包括相分离、沉淀、过滤、微滤或纳滤和渗析,从牛初乳和鸡蛋制备各种分子量的级分。从牛初乳获得的分子量级分为:250Da至2,000Da,2,000Da至4,000Da,4,000Da至8,000Da(其包括转移因子,并包括用于比较的目的)和8,000Da至12,000Da。相似地,从鸡蛋黄制得2,000Da至4,000Da,4,000Da至8,000Da(其包括转移因子,并包括用于比较的目的)和8,000Da至12,000Da分子量级分。然后将分子量级分干燥至粉末形式(例如,通过喷雾干燥、冷冻干燥等)。
然后使用这些制剂进行各种测定来评价每种级分中分子来调节细胞的能力的效果,这些细胞传达细胞免疫(例如,CD4+T辅助细胞)。具体地,将美国专利5,773,232和6,630,316以及美国专利申请公开2005/0260563中公开的测定类型进行改进并用来评价来自实施例1的不同分子量级分在各种条件下的活性。使用上述测定来评价免疫细胞(例如,CD4+T辅助细胞,CD3+细胞(其包括所有T细胞)等)的三磷酸腺苷(ATP)产生。以本领域已知的方式(例如,使用所谓的“萤光素反应”,使用lumenometer)来测量细胞产生的ATP量。
实施例2
使用健康个体的白细胞进行第一个系列的试验,这些白细胞在其表面上包括或表达所谓的“CD4”糖蛋白,使用由Cylex Incorporatedof Columbia,Maryland产生的ImmuKnowTM试验。由于它们的CD4糖蛋白表达,也将这些白细胞称为“CD4+”细胞。CD4糖蛋白的表达将所谓的“T辅助”细胞与其他类型的白细胞区分开来,包括其他T细胞。
ImmuKnow
TM试验的试剂盒的成分为:标准96-孔“测定平板”,包括抽取式八孔片;“样品稀释液”,其包括生长培养基和防腐剂;“刺激剂”,其包括植物凝集素-L(PHA-L)(来自豆类(例如,红芸豆)的一种物质,已知其非特异性地刺激有丝分裂(其中细胞生长并分裂成两个新细胞的过程),并且因此,刺激白细胞中三磷酸腺苷(ATP)的预备性产生(即,促分裂原)),稀释于生长培养基和防腐剂中;“
CD4”,其是覆盖鼠单克隆抗人CD4抗体的磁性样品纯化珠,并通过含有牛血清白蛋白(BSA)和防腐剂的缓冲盐溶液来携带;“洗涤缓冲液”,其包括含有BSA的缓冲盐溶液;“裂解试剂”,其包括含有去污剂的低渗碱溶液,“校准组”,使用0、1、10、100和1,000ng/ml的ATP浓度;“发光试剂”,包括缓冲溶液中的萤光素和萤光素酶,其与ATP反应来形成一定量的光,这表示了已经暴露于发光试剂的ATP量;和“测量平板”,具有不透光边界(即,壁和基底)的96孔。
使用一个96-孔测定平板的八孔片,将其称为“对照片”,以提供对照,包括四个“非受激”(NS)对照孔和四个“受激”对照孔。
使用另一个96-孔测定平板的八孔片,将其称为“测定片”,用于每个待测定的样品。将每个片的四个孔指定为“非受激”孔,而每个片的另外四个孔为“受激”孔。将五十微升(50μl)样品稀释液引入对照片四个“非受激”孔中,而将25μl样品稀释液引入每个测定片的每个“非受激”孔中。将二十五微升(25μl)刺激剂引入对照片的四个“受激”孔中,和引入每个测定片的四个“受激”孔中。
除了样品稀释液或刺激剂,将实施例1中鉴定的分子级分之一的25μl样品引入每个测定片的八个孔中。更具体地,将实施例1的分子量级分的每一种重建于样品稀释液中,并用一定体积的样品稀释液稀释,以在最终将25μl样品加入孔中时提供三种不同的浓度,分别将10μg、100μg和1,000μg量的干粉加入孔中。
制备1∶3(血液:“样品稀释液”)的血样稀释液,已经将其温和搅拌以均匀分布其组分,包括白细胞。将七十五微升(75μl)的稀释血液加入每个片的每个孔中。然后将孔的内含物混合(例如,通过将平板置于振荡板上约30秒钟),然后在37℃的温度和5%CO2环境下孵育约18小时。
一旦完成孵育,将孔的内含物再次混合(例如,通过将平板置于振荡板上约三分钟)。此后,将包括
样品纯化珠的溶液混合,使
样品纯化珠均匀地悬浮于携带其的液体内(例如,使用涡旋)。如上所述,该实施例中的
样品纯化珠包括覆盖鼠单克隆抗人CD4抗体的磁性珠子。将五十微升(50μl)携带
样品纯化珠的溶液加入每个片的每个孔中。
将每个片孔中的内含物再次混合(例如,在振荡板上约15秒钟),然后在室温将其静置或孵育约15分钟的时间。然后重复混合和孵育的过程。
样品纯化珠上的鼠抗人CD4抗体只结合呈现CD4糖蛋白的白细胞。在该孵育过程中,包括T辅助细胞的CD4+白细胞通过
样品纯化珠上的鼠单克隆抗人CD4抗体固定,或结合
样品纯化珠上的鼠单克隆抗人CD4抗体。
孵育后,将每个孔的内含物再次混合(例如,在振荡板上约15秒钟至约30秒钟),以重悬浮
样品纯化珠。根据ImmuKnow
TM测定附加的说明书中所列的操作方案,然后将每个孔的内含物引入磁场中(例如,通过将每个八孔片置于从Cylex可获得的磁盘中)。当接受磁场时,将
样品纯化珠倒入它们存在的每个孔的一侧。然后除去孔中剩余的内含物(例如,用移液管吸取等),并将珠子和T辅助细胞洗涤一次或多次(例如,三次,每次使用200μl洗涤缓冲液),使其基本上纯化。
然后将两百微升(200μl)裂解试剂加入每个孔中。从磁场取出每个孔的内含物后,将每个孔的内含物(即,
样品纯化珠、连接珠子的细胞和裂解试剂)混合(例如,在振荡板上约五分钟)。裂解试剂破坏了由
样品纯化珠上的抗体固定的CD4+细胞的膜。其中,ATP从裂解的细胞中释放出来。
一旦完成细胞裂解,将每个孔的内含物接受磁场,将每个孔内的
样品纯化珠倒入孔的一侧。然后从每个孔中转移50μl样品至测量平板的相应孔中。除了转移样品,预留96孔测量平板的几个孔,用于校准组溶液的各种ATP浓度的50μl样品。
然后将一百五十微升(150μl)发光试剂加入测量平板的每个孔中,测量平板包括测定样品或校准组溶液的样品。然后测量每个孔的发光。所测量的每个孔的发光提供了该孔中存在的ATP量的指示。每个孔中存在的ATP量随后表示了来自测量平板每个孔中内含物的细胞(即,CD4+细胞)内代谢活性的量。在用PHA非特异性刺激的产生的样品中,预期存在相对高水平的ATP。免疫调节剂的添加(例如,来自实施例1中鉴定的级分之一)将改善或降低或调节由PHA非特异性刺激的CD4+细胞中的代谢活性。
下表中列出了该测定的结果,所示的数字表示由每个子集的白细胞产生的ATP平均量:
表1
样品 |
|
对照 |
10μg/孔 |
100μg/孔 |
1000μg/孔 |
250Da至2,000Da初乳级分 |
非受激(NS) |
14 |
52 |
50 |
37 |
|
用PHA刺激 |
388 |
336 |
253 |
127 |
|
PHA刺激降低的% |
|
13.4 |
34.8 |
67.3 |
2,000Da至4,000Da初乳级分 |
NS |
14 |
52 |
62 |
42 |
|
用PHA刺激 |
388 |
388 |
377 |
339 |
|
PHA刺激降低的% |
|
0 |
2.8 |
12.6 |
4,000Da至8,000Da初乳级分 |
NS |
14 |
69 |
50 |
46 |
|
用PHA刺激 |
388 |
378 |
250 |
207 |
|
PHA刺激降低的% |
|
2.6 |
35.6 |
46.6 |
8,000Da至12,000Da初乳级分 |
NS |
14 |
49 |
45 |
39 |
|
用PHA刺激 |
388 |
337 |
237 |
181 |
|
PHA刺激降低的% |
|
13.1 |
38.9 |
53.4 |
2,000Da至4,000Da蛋级分 |
NS |
14 |
49 |
33 |
44 |
|
用PHA刺激 |
388 |
228 |
161 |
148 |
|
PHA刺激降低的% |
|
41.2 |
58.5 |
61.9 |
4,000Da至8,000Da蛋级分(包括TF) |
NS |
14 |
54 |
47 |
44 |
|
用PHA刺激 |
388 |
354 |
230 |
158 |
|
PHA刺激降低的% |
|
8.8 |
40.7 |
59.3 |
这些数据表明在非刺激的测定中,其中细胞没有暴露于PHA,(来自初乳和蛋)的4,000Da至8,000Da分子量级分,已知两者都含有转移因子,刺激了CD4+白细胞中额外的代谢活性。这些数据证实了转移因子上调细胞介导免疫的能力。
相反,4,000Da至8,000Da初乳和蛋级分下调了PHA刺激CD4+细胞中代谢活性的非特异性能力。由于PHA是人造的非特异性刺激剂,参与细胞介导免疫的转移因子对其活性的下调没有令人感到惊讶。认为并且之前的研究已经表明转移因子有助于平衡甚至集中由T-细胞引起的免疫活性(例如,通过帮助细胞“记住”其最初的目的,通过降低自体免疫力和相关的障碍,这改善了对抗不利实体的活性,如受试者受到微生物(细菌、病毒等)的感染)。由T-细胞引起的PHA刺激活性的下调看来证实了转移因子在细胞介导免疫中的这种作用。
在各种不含有转移的其他分子量级分中看到相似的结果,包括250Da至2,000Da初乳级分(上调和下调),2,000Da至4,000Da初乳级分(上调)和2,000Da至4,000Da蛋级分(上调和下调)。8,000Da至10,000Da初乳级分还引起没有用PHA刺激的CD4+白细胞活性的上调和CD4+白细胞中代谢活性的PHA刺激的下调。
这些数据确定了转移因子以外的免疫调节剂至少存在于250Da至2,000Da初乳级分、2,000Da至4,000Da初乳级分和2,000Da至4,000Da蛋级分中。通过实施例3中所示实验至少部分证实了这些级分各自中存在的“纳米级分分子”的免疫调节能力。
实施例3
第二个系列的活性测定包括健康个体呈现CD3糖蛋白的白细胞(即CD3+细胞),已知其包括所有T-细胞,包括所谓的“T记忆”细胞。具体地,使用Cylex的T-细胞记忆
TM测定。Cylex的T-细胞记忆
TM测定的方案与实施例2中所示的非常相似,除了下列例外之外:25μl刺激剂,其包括伴刀豆球蛋白A(ConA),替代PHA,只引入对照片的“受激”孔中,而将25μl 1∶10稀释的巨细胞病毒(CMV)疫苗加入每个测定片的“受激”孔中(最终,每个孔的稀释度为1∶50);将鼠抗人CD3抗体固定于磁珠的表面(按照T-细胞记忆
TM试剂盒中所附的说明),以制备
样品纯化珠;并且在最初孵育之前,将
样品纯化珠加入血样、样品稀释剂、刺激剂(如果存在)和样品级分(如果存在)中。
在T-细胞记忆
TM测定中,使用抗原,替代促分裂原(例如PHA),使得可以评价T记忆细胞识别特定抗原的能力。特别地,从测量平板的每个孔中发射出来的光的强度较低,因为T记忆细胞只构成一部分已经结合
的抗体分子的细胞。
这些测定的结果列于下表中,所示的数字表示由每个所测定样品(和量)的白细胞产生的ATP平均量:
表2
样品 |
|
对照 |
10μg |
100μg |
1000μg |
250Da至2,000Da初乳级分 |
非受激(NS) |
12 |
14 |
12 |
17 |
|
用CMV刺激 |
316 |
468 |
338 |
345 |
|
CMV刺激增加的% |
|
48.1 |
7.0 |
9.2 |
2,000Da至4,000Da初乳级分 |
NS |
12 |
15 |
12 |
15 |
|
用CMV刺激 |
316 |
501 |
503 |
440 |
|
CMV刺激增加的% |
|
58.5 |
59.1 |
39.2 |
4,000Da至8,000Da初乳级分 |
NS |
12 |
22 |
16 |
19 |
|
用CMV刺激 |
316 |
473 |
476 |
475 |
|
CMV刺激增加的% |
|
49.7 |
50.6 |
50.3 |
8,000Da至12,000Da初乳级分 |
NS |
12 |
14 |
18 |
26 |
|
用CMV刺激 |
316 |
453 |
404 |
370 |
|
CMV刺激增加的% |
|
43.4 |
27.8 |
17.1 |
2,000Da至4,000Da蛋级分 |
NS |
12 |
26 |
61 |
108 |
|
用CMV刺激 |
316 |
305 |
349 |
350 |
|
CMV刺激增加的% |
|
-3.5 |
10.4 |
10.8 |
4,000Da至8,000Da蛋级分(包括TF) |
NS |
12 |
34 |
39 |
108 |
|
用CMV刺激 |
316 |
310 |
280 |
381 |
|
CMV刺激增加的% |
|
-1.9 |
-11.4 |
20.6 |
从该实施例3中所进行的测定获得的数据证明了在抗原(即,特异性刺激剂,与促分裂原的非特异性如ConA或PHA相对)的存在下,三种含有非转移因子的初乳级分增强了所测定的T记忆细胞对CMV的活性,改善至与含转移因子的4,000Da至8,000Da类似大小样品的初乳级分在暴露于CMV时改善所测定细胞活性的能力相当(250至2,000Da和8,000Da至12,000Da初乳级分的10μg样品)或超过(2,000Da至4,000Da初乳级分的10μg和100μg样品)的程度。
实施例4
进行了另一个系列的试验来测定纳米级分免疫调节分子(即,2,000Da至4,000Da初乳级分的免疫调节剂)或含转移因子的级分(即,4,000Da至8,000Da初乳级分)是否能够调节(例如,增强)受试者的免疫记忆,该受试者最近已经暴露于高剂量的特定抗原。具体地,从已经暴露于引起全身性感染的流感病毒并患有流感症状四周的个体中获得血样。
以实施例3中所述的方式进行测定,根据实施例3中所示的测定提供的说明来使用Cylex T-细胞记忆TM测定,除了使用流感抗原,以Aventis Pasteur of Paris,France制造的用于2006-2007流感季节的流感疫苗的1∶25稀释液的形式(最终,每孔的稀释度为1∶125),替代实施例3中的CMV疫苗。
该测定的结果列于下表中:
表3
样品 |
|
对照 |
10μg |
100μg |
1000μg |
2,000Da至4,000Da初乳级分 |
NS |
4 |
10 |
3 |
4 |
|
用流感抗原刺激 |
827 |
1003 |
906 |
936 |
|
ConA |
694 |
|
|
|
|
流感抗原刺激增加的% |
|
21.3 |
9.6 |
13.2 |
4,000Da至8,000Da初乳级分(包括TF) |
NS |
4 |
36 |
24 |
11 |
|
用流感抗原刺激 |
827 |
989 |
997 |
830 |
|
ConA |
694 |
|
|
|
|
流感抗原刺激增加的% |
|
19.6 |
20.6 |
0.4 |
表3中所示的结果(图1中还用图表表示了)表明,最近已经暴露于特定抗原的受试者的T记忆细胞暴露于该抗原时,特别是在纳米级分分子或转移因子的存在下,CD3+记忆T-细胞的活性显著改善。实际上,相对少量的纳米级分分子和转移因子引起T记忆细胞活性增加约20%。事实上,可以看出2,000Da至4,000Da级分的免疫调节剂与4,000Da至8,000Da级分中存在的转移因子和任何其他分子在调节所测定细胞的活性中大致同样有效。
来自实施例1-4的结果表明具有250Da至2,000Da,2,000Da至4,000Da和8,000Da至12,000Da范围中分子量的免疫调节剂在调节各种类型的T细胞的免疫活性中是有效的。因此,通过将这样的免疫调节剂或含有免疫调节剂的制剂或组合物给予受试者,可以调节受试者的细胞介导免疫。
基于这些结果,研发了生产各种含有预定MWCO分子的膳食补充剂(例如,来自(牛)初乳,(鸡)蛋等)的方法。例如,并且是非限制性的,可以将至少已经除去了大颗粒(例如,初乳/奶固体、蛋壳和膜等)(例如,通过相分离、过滤方法等)的纳米级分免疫调节剂源的液体制剂压迫通过具有设定大小的孔的滤器,以提供预定的上限MWCO。作为非限制性实例,可以使用提供约3,000Da分子量截断的滤器。或者,可以使用渗析方法,其包括使用渗析膜,其具有提供所需MWCO的孔。使用这样的方法提供了除去了较大分子的“纳米级分”,较大的分子包括转移因子、抗体和各种其他具有超过约3,000Da分子量的分子。例如,产生了初乳、鸡和各种粉状组合物。然后可以通过已知技术(例如,冷冻干燥、喷雾干燥、蒸发,以形成更的液体,掺入凝胶中等),将滤液(即,通过滤器的液体部分)进一步加工。然后可以将所得到的“纳米级分产物”单独使用或掺入其他组合物中。
认为通过在还包括转移因子(并且其还包括基线水平(即,从其获得转移因子的来源(例如,初乳,蛋等)中已经存在的那些水平)的制剂中包括纳米级分分子,即使是非常小的量,所得到的组合物将下调由T-细胞所引起的所需活性(例如,自体免疫力和相关障碍等),同时改善或上调所需的T-细胞活性。研发了表4和5中所示的纳米级分-和-转移因子组合物。
表4组合物A
成分 |
相对量(以重量计) |
牛初乳级分,上限MWCO 10,000Da(喷雾干燥) |
68% |
牛初乳级分,上限MWCO 3,000Da(纳米级分)(喷雾干燥) |
2% |
鸡蛋黄(喷雾干燥) |
30% |
表4的组合物也可以称为“免疫调节成分”。这样的“免疫调节成分”基本上可以由免疫调节剂来源(包括纳米级分免疫调节剂的来源)或免疫调节剂来源的提取物的混合物组成,如表4中所列的那些,或其可以包括其他成分。
同样,引入本发明教导的组合物可以基本上由“免疫调节成分”组成,如表4中公开的,或可以包括其他成分,如表5中所示的。
表5组合物B
成分 |
量(每份,每份大小=一粒胶囊) |
组合物A |
150mg |
锌(作为单甲硫氨酸) |
5mg |
CordyvantTM专利的多糖复合物 |
440mg |
IP-6(肌醇六磷酸) |
|
大豆提取物(植物甾醇) |
|
冬虫夏草(7%虫草酸) |
|
β-葡聚糖(来自面包工厂酵母)(酿酒酵母)(Saacharomyces cerevisiae) |
|
β-葡聚糖(来自燕麦)(Avena sativa) |
|
姬松茸(Agaricus blazeii)提取物 |
|
甘露聚糖(来自芦荟)(叶) |
|
橄榄叶提取物(油橄榄(Olea europaea)) |
|
灰树花(Grifola frondosa)(整株植物) |
|
香菇(Lentinus edodes)(整株植物)(5∶1提取物) |
|
根据本发明的组合物可以具体为液体(例如,掺入从4LifeResearch,LC,Sandy,Utah可获得的
饮料中)、粉末(其可以包括其他成分,以提供所需的风味、溶解特性等)、片剂(其另外包括其他成分,如粘合剂(例如,淀粉)等)、凝胶(其中添加了明胶或其他成分),或以任何其他合适的形式。应当理解,为了本发明公开的目的,用于制造本发明组合物的这些实施方案的其他成分对于此公开的目的可能仅仅被认为对组合物是任选的和非必需的,除非所附权利要求另外要求。
实施例5
从已经患有带状疱疹(水痘带状疱疹病毒(VZV)感染)症状约四周的个体收集血液。然后以实施例2中所述的方式使用ImmuKnow
TM测定来测定血液,用以下物质替换实施例2的样品级分:(a)不包括免疫调节剂的对照;(b)具有约3,000Da MWCO的已经喷雾干燥的初乳级分;(c)加入转移因子
目前其可从4Life Research获得并包括具有约10,000Da上限MWCO的牛初乳提取物;(d)表4中的组合物,将其标记为“组合物A”;和(e)表5的组合物,将其标记为“组合物B”。将(b)至(e)中的每一种重建于ImmuKnow
TM测定附带的样品稀释液中,并稀释至一旦将血样和所有其他液体加入每个孔中时所得到的1mg/ml最终每孔浓度的浓度。
这些测定的结果列于下表中:
表6
|
对照 |
纳米级分 |
TF XF |
组合物A |
组合物B |
非受激(NS) |
26 |
35 |
77 |
47 |
19 |
用PHA刺激 |
220 |
234 |
150 |
140 |
27 |
这些结果还显示在图2的图中。
需要重申的是这些结果是在一定时间点(最初感染后大约四周;即,恢复过程中)下获得的,其中在不存在刺激的情况下,预期T辅助(CD4+)细胞活性降低,尽管大量T辅助细胞仍然存在于受试者血液中。在不存在非特异性刺激剂PHA的情况下,T辅助细胞活性只受到纳米级分、TF XF和组合物A的轻微刺激,并且没有显示出受到组合物B的刺激。然而,由PHA引起的T辅助细胞的非特异性刺激受到TF XF和组合物A的显著降低,并且通过组合物B甚至降低更大程度,如从列于表1中的实施例2结果可以预计的。
实施例6
在较早的时间点(带状疱疹症状发作后大约一周),将预期T记忆细胞,尽管由于引起带状疱疹的VZV感染的局部特性没有以大浓度存在于受试者血液中(即,相对低的VZV血液滴定度),将已经识别VZV感染并易于受到VZV抗原存在的刺激。因此,进行T-细胞记忆TM测定来测定纳米级分、TF XF、组合物A和组合物B对来自如实施例5中所测定的相同受试者血液的T记忆细胞的作用。按照实施例3中所示的方案,除了以下例外:替代CMV疫苗,使用VZV疫苗,其已经1∶10稀释(最终每孔稀释度为1∶50);以及用实施例5中所用的对照和免疫调节剂替代实施例3的样品级分,将每种免疫调节剂稀释至100μg/ml的最终每孔浓度。
下表列出了测定结果:
表7
|
对照 |
纳米级分 |
TF XF |
组合物A |
组合物B |
非受激的(NS) |
1 |
2 |
13 |
27 |
51 |
用VZV刺激的 |
1 |
5 |
30 |
32 |
69 |
用ConA刺激的 |
288 |
|
|
|
|
图3中还用图标显示了该数据。
如所预期的,T记忆细胞刺激了存在于TF XF中的转移因子的活性。将少量额外的纳米级分分子加入转移因子中显著改善了T记忆细胞的活性,在使用和没用另外的VZV刺激中都是如此。因此,实施例5和6的结果证实了将额外的纳米级分分子加入还含有转移因子的制剂中,即使是非常小的量,也将下调不需要的由T-细胞引起的活性(例如,自体免疫力和相关的障碍等),同时改善或上调所需的T-细胞活性。
实施例7
在另一个研究中,将其进行来测定各种组合物刺激自然杀伤(NK)细胞对抗人成红细胞白血病细胞系K-562(其对NK细胞敏感)活性的能力,组合物包括如表4和表5中所示的含有转移因子和额外的纳米级分分子的组合物。因此,在此也将NK细胞称为“效应细胞”,而在此也将K-562细胞称为“肿瘤细胞”和“靶细胞”。具体地,使用了MTT测定技术,其中通过活细胞的活性线粒体中的还原酶,将黄色的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)还原成紫色的甲
。就在细胞毒性分析之前,将溶解甲
的溶液(例如,稀盐酸(HCl)中的二甲基亚砜、十二烷基磺酸钠(SDS)等)加入每个孔中。然后使用分光光度测定法来测定所测定孔中的活细胞数量,相对于没有加入组合物的一个或多个对照孔中的活细胞数量,在分光光度测定法中,测量了通过每个孔中的溶液吸收的特定波长(约500nm至约600nm范围中的波长)的光量。
所评价的组合物包括转移因子AdvanceTM,可从4Life Research获得;转移因子加AdvancedTM,也可从4Life Research获得;组合物A,其含有转移因子和改善量的纳米级分分子;组合物B,其含有转移因子、升高量的纳米级分分子和认为能增强免疫系统活性的其他成分;来自牛初乳的纳米级分分子;来自鸡蛋的纳米级分分子;和白细胞间介素-2(IL-2),可依据商品名Proleukin从Chiron of theNetherlands获得,已知其能募集NK细胞来对抗癌细胞。
从五名健康捐献者获得血液。使用已知方法将白细胞从血液的其他成分中分离出来。使用已知的密度梯度离心技术(例如,使用从Sigma-Aldrich Corporation of St.Louis,Missouri可获得的
密度梯度),从其他类型的白细胞中分离出单核细胞,包括NK细胞。将单核细胞引入含有10%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640生长培养基中。将相等体积的该混合物,包括100μl培养基中约60,000白细胞的浓度,引入标准96-孔平板的不同孔中。将如上所鉴定的含有转移因子和/或纳米级分分子的组合物的重建样品,每个具有1ml无菌去离子水中0.100mg粉末的浓度,加入含有白细胞和生长培养基的三个不同孔中,总共为十八个孔。此外,将1,000IU/ml IL-2引入含有单核细胞生长培养基的三个正对照孔中。三个负对照孔只含有单核细胞生长培养基混合物,不含免疫调节剂。三个仅含效应细胞的负对照孔也只含有单核细胞生长培养基混合物,而三个仅含靶细胞的负对照孔中只含有100μl生长培养基。
在5%CO2存在下,在37℃的温度和100%的湿度下,用各自的免疫调节组合物(除了三个负对照孔)将单核细胞孵育48小时。
孵育后,将约30,000K-562个细胞引入每个含有单核细胞和生长培养基的孔中,除了只有效应细胞的三个负对照孔。在5%CO2存在下,在37℃的温度和100%的湿度下,将96-孔平板和孔中的混合物再次孵育48小时。
根据已知的标准技术,制备MTT溶液,其具有5mg MTT/ml Henk’s盐溶液。将二十微升(20μl)MTT溶液引入96孔平板的每个含有单核细胞-生长培养基-肿瘤细胞的孔中。然后在5%CO2存在下,在37℃的温度和100%的湿度下,将平板及其内含物再次孵育,这次时间为约四小时。
这次最终孵育后,将96-孔平板在约1,500rpm下离心约五分钟。此后,从每个孔中除去上清液(液体),并将150μl二甲基亚砜(DMSO)引入每个含有单核细胞和肿瘤细胞的孔中。然后使用分光光度计在540nm的波长来测量每个含细胞孔的光密度。然后将所测得的光密度用于测定通过每种测定物质所激活的NK细胞的细胞毒性指数(%)(CI(%)),使用以下等式:
CI(%)=[1-(ODe+t-ODe)/ODt]×100,
其中ODe+t是对应于测定组合物的每个测定孔的光密度,包括正对照的IL-2,ODe是三个只含效应细胞的负对照孔的平均光密度,而ODt是三个只含靶细胞的负对照细胞的平均光密度。CI(%)表示已经由每个还含有测定调节组合物的孔中的NK细胞杀灭的靶细胞的百分比。结果呈现于下表中:
表8
这些数据,在图4的图表中也显示了,表明含有纳米级分分子的组合物,特别是来自牛初乳的那些,在引发NK细胞对抗K-562肿瘤细胞的活性中,与IL-2大致同样有效,或比IL-2更有效,而含有来自初乳和蛋的转移因子以及来自初乳的纳米级分分子的组合物(即,组合物A和组合物B)激活NK细胞比没有纳米级分分子的组合物更有效。
通过将少如2%重量的更多纳米级分分子加入含有转移因子的组合物中,纳米级分分子可以通过受试者免疫系统的细胞介导部分的非特异性成分(例如,NK细胞)来激发作用,补充转移因子通过受试者免疫系统的细胞介导部分的抗原特异性成分来引发活性的能力。
在一起考虑时,实施例5至7的结果证明转移因子调节并引发(prime)T辅助细胞,这使得受试者的免疫系统能够更快速而有效地应答病原体和其他不利的实体。此外,实施例5至7说明了转移因子可以增强T记忆细胞的活性。
实施例5至7还显示了将额外的纳米级分免疫调节分子加入含有转移因子的组合物中可以增强和改善转移因子和含有转移因子的现有组合物的免疫调节(例如,T辅助细胞、T记忆细胞和NK细胞的免疫调节)。
调节受试者细胞介导免疫的方法包括将含有纳米级分分子的组合物给予(例如,肠内、非肠道等)受试者。纳米级分分子可以单独给药,或作为基本上由纳米级分分子组成的组合物的一部分给药,或可以与含有转移因子的组合物(例如,表4或表5中所列的组合物)一起给药。可以以规律的基础给药,以努力维持受试者细胞介导免疫的整体平衡,或通过应答感染、自体免疫障碍、组织移植或影响(激活或抑制)受试者细胞介导免疫的其他情况来实现。
认为根据本发明的教导含有纳米级分免疫调节分子的组合物的给药调节了基于生理需要的细胞介导的免疫活性。例如,可以降低不利的细胞介导的免疫活性(例如,自体免疫力等)。作为另一个实例,还可以集中和增强T细胞除去受试者体内的不利病原体以及其他不利实体如癌细胞和其他异常或突变细胞的能力(例如,通过激活T辅助(CD4+)细胞,其随后激活自然杀伤(NK)细胞,通过使T记忆细胞获能改善抗原特异性免疫力),特别是将转移因子与另外量的纳米级分免疫调节剂分子一起给药时。
尽管之前的描述包含许多细节,但不应当将这些视为对本发明范围的限制,而仅仅是提供了对本发明的一些优选实施方案的说明。同样,可以设计没有脱离本发明的精神和范围的本发明的其他实施方案。来自不同实施方案的特征可以结合使用。因此,本发明的范围只受所附权利要求及其法定等同物,而不是受之前的描述所示和限制。因此将包括对在此公开的本发明所作的所有添加、删除和改进,它们都落入权利要求的含义和范围内。