TW200827335A - Efficient method for producing mugineic acids - Google Patents

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200827335 ^ 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關麥根酸的有效之短步驟製造方法。 【先前技術】 缺乏鐵質係現今世界上人類最普遍性的營養問題，在 工業國家與開發中國家兩方面，有此問題者皆為數眾多。 人類係自農作物攝取所必需之鐵。然而，農作物係往=未 『攸土壤中獲取足量之鐵，以致於缺乏在生成葉綠素時呈有 、催化性作用之鐵，而導致萎黃（chlorosis)、低產量、及二| ，降低。令人遺撼的是，幾乎所有的農 少！生物學上可利用之鐵。而且，土壤中可利用之鐵少係 限制植物生長而導致收穫量降低。據稱全世界的土約右 三分之一為潛在性的缺鐵地帶。使由植物攝取之鐵量降: 之原因，並不只有鐵不足。例如，土壤中之鐵之生體利用 高離性）影響。換言之，由於在驗性土壤 、’’、以不/谷於水之虱氧化鐵（Fe(〇H)3)之形態存 在，、故植物係無法從根部充分吸收鐵質。針對此問題，禾 本科(G:_eae)植物種係因會分泌所謂植物鐵載體 ⑽yt0slderophore)之金屬鉗合劑之麥根酸且 以麥根酸.鐵錯合物之形態令其可溶化，而能從 根部吸收此鐵錯合物以满尸 係在㈣年從缺乏鐵質之=(茶照非專利文獻D。麥根酸 定構造之鐵進行鉗合之物質中最初將經單離、決 由。丫丁饰etidin_酸單元;^專利文獻2)。麥根酸係 /羧馱早兀、天冬胺酸單元、及蘋果酸單 319705 5 200827335 元進行還原性鍵結而成之化合物，但至近年為止已單離出 有從小麥所單離出之2’-去氧麥根酸（參照非專利文獻3)等 各種麥根酸之類似物（參照非專利文獻4)，此等總稱為麥根 酸類。 雖期待使用麥根酸類之研究或利用在今後能更進一步 地發展’但大量取得此等麥根酸類係困難。麥根酸類之製 造例’最初為由Ohfune等人在1981年所報告之2’-去氧麥 根酸之製造（參照非專利文獻5)，在同時期也由Fushiya等 (人報告出2，-去氧麥根酸之其他製造方法（參照非專利文獻 6) °接著’在1986年由Hamada等人報告出麥根酸的製造 方法（參照非專利文獻7)。之後，Matsuura等人報告出改 良為更簡便之麥根酸的製造方法（參照非專利文獻8)。此 外’在2001年，Miyakoshi等人報告有效之2f-去氧麥根酸、 及做為麥根酸前驅物之於草胺（nicotianamine)(3’位之經基 經胺基取代者）的製造方法（參照非專利文獻9)。因 〇 Miyakoshi等人確立了有效之製造方法，而使菸草胺由長 谷川香料股份有限公司販售於市面，且使許多研究者能輕 易取得。近來，有由Singh等人所報告之有效之2，·去氧麥 根酸的製造方法（參照非專利文獻1〇)。若使用此方法，則 無須保護構成麥根酸之吖丁咬竣酸單元、天冬胺酸單元、 及蘋果酸單元之三個單元中之吖丁啶羧酸單元，即能合成 2_去氧麥根酸。之後，2’_去氧麥根酸係自2〇〇5年底起由 加拿大之TRC Inc·販售於市面。 〔非專利文獻 1〕Marschner，Η 等人，j· PiantNutr·，1986 319705 6 200827335 ‘年，第 9 卷，ρ·695-713 〔非專利文獻 2〕Takemoto，T 等人，Proc· Japan Acad·， 1978 年，第 54-B 卷，ρ·469-473 〔非專利文獻3〕Nomoto, K等人，Chimia，1981年，第7 卷，ρ·249_250 〔非專利文獻 4〕Ma，J· F·，Nomoto· K，Physiol· Plant·， 1996 年，第 97 卷，ρ·609-617 〔非專利文獻 5〕Ohfune，Υ·等人，J· Am· Chem· Soc·，1981 《 年，第 103 卷，ρ·2409-2410· 〔非專利文獻 6〕Fushiya，S·等人，Chem· Lett·，1981 年， p.909-912 〔非專利文獻 7〕Hamada，Y·，Shioiri· T·，J· Org· Chem·， 1986 年，第 51 卷，ρ·5489·5490 〔非專利文獻 8〕Matsuura，F·等人，Tetrahedron，1993 年， 第 49 卷，p.8211-8222· I 〔非專利文獻 9〕Miyakoshi，Κ·等人，Tetrahedron，2001 年，第 57 卷，ρ·3355_3360· 〔非專利文獻 10〕Singh，S·等人，Tetrahedron Lett·，2005 年，第 46 卷，p.1419-1421 【發明内容】 (發明欲解決的課題） 從以往到現在，麥根酸類係在植物之鐵吸收機制之解 析研究中一直使用做為非常重要之工具。並且，麥根酸類 係從其鐵鉗合能力來看，取代EDTA做為安全之金屬鉗合 7 319705 200827335 劑’且做為對於動植物之鐵f缺乏症有效之方法 有可在健康食品、化妝品或肥料等領域中使用之可能:。、 因此，改善麥根酸類的製造方法係重要。 在至今已報告之製造方法中’皆為將製造中間體 早離精製，在此等操作上需要相當大量之勞力與 時也使收率降低。 同 例如，上料專敎獻5至8所揭示之製造方法伟需 要❹步驟、或在分離精製中間體上耗f大量勞 在穩定的大量供給方面需要進一步改良。此外，在上 專利文獻9所揭示之製造方法中，2，·去氧麥根酸之=率 低，且僅止於29%。此外，雖然依該文獻所揭示之方法， .=做為麥根酸類之前驅物的菸草胺係已能輕易經由市售取 得，但2’·去氧麥根酸仍為高價，且尚無法以高收率 而尚難以大量取得。 、若能低價地提供大量之麥根酸類，則對此等之研究領 (域之貢獻、在健康食品、化妝品或肥料等領域中之利 可能性係無可估量。然而，如同上述在至今為止已報告之 製造方法中，從步驟數多、在將中間體單離精製上需要大 量，力且收率低等來看，在以低價地大量供給之方面係有 本發明係欲解決先前技術中之此種問題者，且以提供 能低價地大量供給麥根酸類的麥根酸類之製造方法作為課 題:換言之，在實用上製造麥根酸類之方面，可舉例如下 述等做為不可或缺之課題：υ縮短步驟數、2)省略製造中 319705 8 200827335 間體之單離精製操作、3)簡化製造操作、4)低價之反應試 劑等。本發明係目的為提供能一次解決此等不可或缺之課 題的麥根酸類的製造方法。 (解決課題的手段）

麥根酸係由吖丁啶羧酸單元、天冬胺酸單元、及蘋果 酸單元之3個單元所組成之化合物，但在進行此等單元之 耦合反應時，必須將具有此等單元之大量之羧基、胺基或 經基之保護基予以脫附，此種操作促使步驟數多階段化。 於是，發明人等係經由將羧基、胺基或羥基之保護基之使 用抑制於最低限度，而進行步驟數之縮短。換言之，發明 人等係發現經由構築能不導入保護基於吖丁啶 ^ 天，胺酸單元之絲、或即使導人賴基也*單離精製即 ，進仃至下個步驟的方法，*可進行步職之縮短與操作之 間化° j發明人等係進—步反覆研究後，才完成本發明。 換吕之，本發明係有關：

〔1〕一種麥根酸類的製造方法 下述通式（1)所示 其中，該麥根酸係如

(弋中R、R係表示氫原子或羥基，R3俘f 基卜該“方法包括下料…//料—或胺 使如下述通式（2)所示之化合物之乙婦基氧化斷裂，同 319705 9 200827335 犄以吖丁啶-2-羧酸進行還原性胺化反應 co2r^ (2) 之 =中二：與前述同義’R4係表示氣原子或絲 保屢基，R係表示胺基之保護基） 而知到如下述通式（3)所示之化合物的步驟1 \^〇zH C02R4 •n7<^NHR5 (3) (式中’ R1、R4及R5係表示與前述同義）； 以保護基保護該通式（3)所示之化合物之缓基 除胺基之保護基，而得到如 ^ 鹽的步驟2 J如下述通式(4)所示之化合物或其 9〇2R8 rf ?〇2R4

n"^^nh2 (4) (式中，R1及R4係表示與前述 基）； 同義，R6係表示羧基之保 護 接著，使如下述通式（5)辦-—财 )所不之駱以該通式（4)所示之化 合物進行還原性胺化反應 R7 8 (5) V:1 R2 319705 200827335 中，=係表示與前述同義，r7係表示羧基之保護基， 胺 係（R9係表示經基之保護基^_NHR1g(R1g係表示 基之保護基）） '、 而件到如下述通式（6)所示之化合物的步驟3

(6) (式中’ R1、R2、R4、R6、尺7及R8係表示與前述同義）·，及 將該，式（6)所示之化合物之羧基之保護基及羥基或胺基 之保護基予以去除的步驟4 ; 〔〕 種如下述通式（3-1)所示之化合物 co2h (3-1)

nf ?〇zH NHB〇c

f H 經基，Boc係表示三級丁氧 羰 〔3〕一種如下述通式（4·1)所示之化合物 C〇2Et ._I C02Et R1 Η NH3C| (4·1) 經基，Et係表示乙基） (式中，R1係表示氫原子或 (發明的效果） 右根據本發明之麥根酸類的製造方法，則能藉甴低價 3197〇5 11 1 (式中’ R1係表示氫原子或 2 基）；以及 200827335 ‘之反應試劑而製造麥根酸類。此外，若根據本發明之麥根 酸類的製造方法，則僅以從起始物質依序加入反應試劑即 能得到最後目標物之官能基經保護基保護之保護物。結 果，在全步驟中精製係只為簡單的一次操作而已。因此， 根據本發明，能輕易地在短時間内製造麥根酸類。並且， 本發明之製造方法之明顯的特徵係儘管幾乎都以一鍋法 (one_P〇t)進行所有反應，仍能以非常高之收率得到目標之 麥根酸類。依本發明之麥根酸類的製造方法將所有步驟加 (速、將製造钿作簡化，係用於大量低價供給麥根酸類之非 吊大之優點。貫際上，在依本發明之麥根酸類之製造方法 的全製造步驟下的估算，與現今市售者相比，可變得非常 低價。 【實施方式】 本發明係有關麥根酸、2，-去氧麥根酸、3，_羥基麥根 酸、3-表羥基麥根酸（3-epihydroxymUgineie acid)等麥根酸 (類或做為其别驅物之於草胺或2"-羥基於草胺等的新穎製 造方法者。 在本發明中，以R4、R6或R7表示之「羧基之保護基」 係能例示如酯殘基，且此種酯殘基可舉例如：甲基、乙基、 正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、三級丁基、正己基、 f己基等碳數1至6直鏈狀、分支狀或環狀之低級烷基； 苯曱基、對硝基苯曱基、鄰硝基苯甲基、間硝基苯甲基、 2,4 一頌基本甲基、對氣苯曱基、對溴苯甲基、對甲氧基 本曱基#芳烷基；乙醯氧基甲基、乙醯氧基乙基、丙醯氧 319705 12 200827335 基甲基、正丁醯氧基甲基、異丁醯氧基甲基、新戊醯氧基 甲基（pivaloyloxymethyl)等低級脂肪族醯氧基甲基等。羧基 之保護基係以低級烷基為佳，且以乙基或三級丁基尤佳。 在本發明中，以R5或rig表示之「胺基之保護基」可 舉例如··甲氧羰基、乙氧羰基、2,2,2-三氯乙氧羰基、三級 丁氧羰基（以下，簡寫為B〇c)等烷氧羰基；乙烯氧羰基等 稀氧~基，本甲氧羰基（以下，簡寫為Cbz)、9-苐基甲氧羰 基等芳烷氧羰基；苯甲基、4-甲氧苯甲基等可經取代之芳 烷基，甲醯基、乙醯基、三氟乙醯基、苯甲醯基等醯基； 對甲苯磺醯基、苯磺醯基等芳磺醯基；甲磺醯基等烷磺醯 基等。胺基之保護基係以B〇c或Cbz尤佳。 在本發明中，以R9表示之「羥基之保護基」可舉例如·· 甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、三級丁 基正己基等碳數1至6之直鏈狀或分支狀之低級烷基； 亡甲基㈣基、三乙基我基、三級丁基二甲基梦烧基等 三烷基矽烷基；四氫吡喃_2-基（tetrahydr〇pyran_2_州曱 氧基甲基、甲氧基乙氧基甲基等縮醛型保護基；三級丁氧 幾基等烧氧羰基；苯甲基等芳烧基等。經基之保護基係以 低級烧基為佳’且以三級丁基尤佳。 本發明之麥根酸類的製造方法係包括以下之步驟1至 4 ： ^ 319705 13 200827335

(6) ⑴ (式中，上述各記號係表示與前述同義） 以下說明關於各步驟。 Π)步驟1 在步驟1中，做為原料之如通式（2)所示之化合物（以 下，簡寫為化合物（2))，宜舉例如胺基經保護基保護之化 合物，例如Boc-L-稀丙基甘胺酸或Cbz-L-稀丙基甘胺酸或 此等之羧基經保護基保護之化合物等。前述Boc-L-烯丙基 甘胺酸或Cbz-L-烯丙基甘胺酸等，係能按照記載於 PROTECTIVE GROUPS in ORGANIC SYNTHESIS(T. W. Green; P. G. M. Wuts著）之方法輕易地由市售之L-烯丙基 甘胺酸來製造。此外，此等係也能適用已市售做為試劑等 者。 在步驟1中，化合物（2)係其乙烯基氧化斷裂，且同時 以吖丁啶-2-羧酸進行還原性胺化反應。氧化斷裂係以藉由 例如臭氧、過錳酸鹽、RuC13或0s04-NaI04等進行為佳， 且以藉由臭氧進行氧化斷裂較佳。藉由臭氧進行之氧化斷 裂，係以例如經由在已將化合物（2)溶於溶劑之溶液中注入 14 319705 200827335 臭氧氣體（起泡）而進行為佳。溶劑可舉例如·甲醇、一* 甲烷、醋酸乙酯等有機溶劑。由於若藉由臭 二、=氯 斷裂結束且臭氧在溶液中呈飽和則溶液會變青色订 氣體之起泡係以進行直到溶液變青色為佳。臭二= 泡係以在約_100至-5〇。〇之低溫逸杆A ；； 士社自… L之低μ切為佳ϋ氣體係能藉 ^如犬減體產生機等而產生。進行臭氧氣體起泡後， ”過量之臭氧而以在溶液中進行例如氧氣、氮氣或 氬氣等起泡直到溶液之青色消失為佳。 一 性胳斷裂同時進行之以σ丫丁咬_2_㈣進行之還原 —胺化反應1以在還原劑存在下進行為佳。該還原劑係 =舉例如：氰基贼仙、三乙醯氧基简化納等。進行 迴原性胺化反應時之PH係通常以在約4至7為佳，且以 在約6至7較佳。此外，還原性胺化反應係通常在冷卻下 至加熱程度之間進行，以在室溫下進行為佳，且以麟約 1至2小時為佳。相對於化合物（2)1莫耳，竹咬_2_竣酸 之比例係以約1莫耳（以1: 1之莫耳比可得到高收率即為 本合成之優點）為佳。此外，相對於化合物（2)1莫耳，還原 劑之比例係以約i至2莫耳為佳’且以約1 1至i耳 較佳。 、 L-吖丁啶_2_羧酸係能使用已市售做為試劑等者。 ，上述步驟1而能得到如通式（3)所示之化合物（以 下’簡寫為化合物（3))。 化。物（3)宜舉例如：如通式或（3_2)所示之化合物 (以下义別簡寫為化合物（3-1)、化合物（3-2))等 319705 15 200827335

(式中，R1係與上述同義）。 (2)步驟2 在步驟2中，藉由以保護基保護化合物（3)之緩基，同 時去除胺基之保護基，而能得到如下述通式(4)所如 物（以下，簡寫為化合物⑷）或其鹽。卩保護基 之 反應係可舉例如與料狀財縮妓鱗。該反應;所 使用之醇可舉例如：甲醇、乙醇、三級丁醇等。步驟2中 =胺基之m的去除反應（以τ，簡寫為脫保護）係能依 據該保，基之種類而適當選擇藉由酸或驗之方法、或是藉 接，還原之方法等來進行。脫保護時之反應溫度係通常 在冷卻+下至加熱程度之間進行，反應時間係以約％分鐘至 24 J %為佳’且以約10至18小時較佳。此外，在藉由酸 去除B0C基時，反應溫度係以約〇它至室溫為佳。 知例如备胺基之保護基為B〇c時，係以在例如三氟醋 土，麗^四氫呋喃溶液等強酸性條件下進行脫保護為 、更/、體而a ’以使化合物（3)與例如鹽酸/乙醇溶液反 ^為^圭則述反應係能經由例如在冷卻下攪拌約30分鐘至 J二接著在室溫攪拌約工至24小時而予以實施。鹽酸 友、户容液（以下，簡寫為乙醇鹽酸）係能經由例如將乙酿 氯添加至過量乙醇中而調m。關於乙醯氯與乙醇之比例， 16 319705 200827335 •係例如相對於乙醯氯】容量，乙醇以约20至50倍容旦发 佳，且以約15至40倍容量較佳。或者，也能㈣在2 :進行氯化氫氣體起泡而調製。經由將已預先秤 醇、與進订氯化氫氣體起泡後之乙醇的重量做比較，而处 決定鹽酸之溶解量。前述反應後，以將反應混合物例如ς 壓濃縮後’經由例如加入曱苯且共沸蒸餾而使溶劑去除為 佳。並且，以在共沸蒸餾後以例如真空泵等抽吸而使其乾 ，為佳。藉此，生成以保護基保護化合物（3)之羧基、 妆去除胺基之保護基的例如化合物（句之鹽酸越 (4-1)) ： 1 ^ C02Et H !〇2Et (式中，R1係與上述同義）。 此外，例如當胺基之保護基為苯甲氧羰基（以下，簡寫 為Cbz) ，係以例如以飽為觸媒之氫化反應或伯奇（Bkd) 還原等進行脫保護為佳。 £11# 驟 3 在步驟3中，以在步驟2中所得之化合物（4)，進行如 通式(5)所示之醛（以下，簡寫為醛（5))之還原性胺化反應。 該還原性胺化反應係在有機溶劑中，與上述化合物（2)之還 原性胺化反應同樣地，能在例如還原劑存在下進行。有機 溶劑可舉例如：曱醇、乙醇、二甲基甲醯胺等。醛0)係以 例如記載於 Nishimaru，Tet al· Peptide Science 2006，42, 319705 17 200827335 263-266.之方法、或依據該記载之方法而能輕易”造。 在經由逛原性胺化反應所得之反應混合物中，含有如通式 寫為化合物（6))。以從該反應混 °物刀離或精製出化合物⑹為佳。該分離或精製係能:用 已周知之方法，且能將藉由例如醋酸乙醋、氯仿或二氯甲 烷等有機溶劑萃取、或以例如石夕膝等做為载體之 單獨或合併進行。 ill# 驟 4 美之中’化合物⑹中之祕之保護基及經基或胺 基之保録的絲（絲護）反應係能依據該㈣基之種類 ，適當選擇藉由酸或鹼之方法、或是藉由接觸還原之方法 2進订。在藉由酸之方法之情形中，係因保護基之種類及 八他條件而異，酸可舉例如：鹽酸、氫演酸、氫氣酸、氫 2酸、甲俩、對甲苯續酸、三氟甲續酸、硫酸、鱗酸等 錢酸，蟻酸、醋酸、三氟錯酸、丙酸等有機酸，除此之 外還有酸性離子交換樹脂等。在藉由鹼之方法之情形中， 係因保護基之種類及其他條件而異，驗可舉例如：納、鉀

I驗或ί、鎮等驗土金屬之氫氧化物、碳酸鹽等無機 欢、屬燒氧化物類、有機胺類、四級錢鹽等有機驗，除 2外還有驗性離子交換樹脂等。當在上述藉由酸或驗之 方法之情形中使用溶劑時’能單獨或混合使用例如：水、 甲醇、乙醇、醋酸乙自旨、氯仿、四氫π夫喃、二料（diGX 酸、丙綱或二氯甲燒等。此外在藉由金屬與酸之 "中吊使用水、丙_等做為溶劑，但酸為液體時也能使 319705 18 200827335 〆·本身做為溶劑。在藉由酸或驗之方法中，反應溫度係通 苇在~卻下至加熱程度之間進行，反應時間係約分鐘至 ^ Ψ而以約5至10小時為佳。此外，反應溫度係以在 約、〇C處理後上升至室溫為佳。化合物（6)中之羧基之保護基 及I基或胺基之保護基的脫保護係以藉由酸（例如··鹽酸）， 尤以藉由約4至61^鹽酸與1?^氳氧化鈉之方法為佳二 一在脫保歧應後，從反應混合物分離或精製如通式⑴ 所示之化合物。該分離或精製方法能使用已周知之方法， 可舉，如液體層析法或再結晶等。㈣層析法可舉例如·· 離子交換層析法、分配層析法、朗層析法、凝膠渗透層 析法等’此等能單獨或合併而進行。 化八：者：在㈣1中’原料之化合物(2)<ri為經基之 合物(2)'R1為氣原子之化合物依據例 如下述而製造： 1) RX 2) 氧化 〇〇2R OH (7) co2h /"^NHR5 (2-1) (式中，RX係表示4烧，V係表示與前述同義）。 :先’將如通夠所示之化合物(例如:b 基甘胺酸或Cbz-L_烯丙基甘胺酸等； ^ 卸丙 (2-1))溶於溶劑中，且在鹼之存在下使其鱼二^化合物 保護基保護羧基。上述溶劑可舉例如：1、^烷反，，並以 甲基亞碾（dimethyl sulfoxide)、-卩迎化少 土甲§&私、二 ”烷等。鹼宜舉例如碳 319705 19 200827335 • 酸鉀等。化合物（2-1)與碳酸鉀等驗之比例係相對於化合物 (2-1)1莫耳，鹼以約2至5莫耳為佳，且以約3至4莫耳 較佳。函烷之烷基係只要從上述已例示之羧基之保護基中 選擇使用，則無須進行脫保護及再保護。具有此種烷基之 南烧可舉例如··碘f烷、碘乙烷、碘正丙烷、碘異丙烷、 碘正丁烷、碘異丁烷、碘環己烷等碘烷化合物等。化合物 (2-1)與鹵烷之比例係相對於化合物（2-1)1莫耳，碘烷以約 1 · 1至1.5莫耳為佳。反應溫度係在冷卻至加熱下，而以室 (溫為佳。反應時間係通常約30分鐘至約8小時，而以約工 至3小時為佳。反應結束後係以在反應混合物中加入例如 水等，且以非極性溶劑（例如：乙醚、己烷等）萃取羧基經 保護基保護之化合物i至數次為佳。收集已萃取之非極= 溶劑，以例如硫酸錤等乾燥劑乾燥後，經由過遽等去除乾 燥劑，且濃縮滤液並將萃取溶劑蒸顧去除，而能得到化合 物（2-1)之縣經保護基保護之化合物。萃取 : 、除係驗已周知之方法，例如缝蒸鶴等而實施，、、顧去 接者’以將所得之化合物溶於溶劑中且使化 二…笨i三氣乙；:等有二:氣甲貌、三級丁醇、 之二氧化场存在下以二= 谷劑；氧化係可在觸媒量 化氫水溶液等進行。關^列如過乳化三丁基或過氧 丁疋叮關於一虱化硒之觸婼吾 對於化合物（2-1)1莫耳^ ^ ” 可舉例如相 、異耳，二氧化硒為約〇 5 關於氧化劑之量，例· 0.95莫耳。 以约2至5莫耳為户/於化口物叫）1莫耳，氧化劑 冥耳為I且㈣2.5至4料 f 319705 20 200827335 以在加溫下進行為佳，溫度係以在約5〇至9〇t為佳，且 以在約60至70°C較佳。氧化時之反應時間係約}至μ小 時，且以約5至10小時為佳。反應後係依一般方法 處理即可。換言之，在反應液中加入碳酸氫鋼或氯氧化納 水溶液等後’加入醋酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿等有 機溶劑且萃取1至數次。收集萃取液，且以硫酸鎂等乾燥 劑乾燥。乾燥後，過it並去除乾燥劑，且將遽液經由例如 減壓濃縮予以濃縮並蒸餾去除溶劑而能得到生成物（乃。所 得之生成物（7)係以依管柱層析法等精製為佳。 如此進行，而可以高收率製造麥根酸、2，_去氧麥根 酸、3-經基麥根酸、3_表經基麥根酸等麥根酸類或做為其 剷驅物之於卓胺或2 ” -經基終草胺等。 以下基於貝；例更具體說明本發明，但本發明並非限 定於此等。 1施Μ 1~Uoc-L-烯丙基甘胺酸贺诰化合物（3_3、 co2h d^〇NHBoc (3,) 使Boc-L-烯丙基甘胺酸lg(4 7mm〇1)溶於曱醇（15mL) 中，且在-78¾進行臭氧氣體起泡。進行起泡直到溶液變青 色後，進行氧氣起泡直到青色消失。回到室溫後，加入 V 丁咬_2_羧酸475mg(4 7mm〇1)與氰基硼氳化鈉 9 g(4.7mm〇l)且擾拌1小時。將反應混合物減壓濃縮 後，依使用矽膠之短程（short path)矽膠層析法（以移動相： 21 319705 200827335 ^ 醋酸乙酯：曱醇=9 ·· l(v/v)之混合溶液將氰基硼氫化鈉 之殘部及少量來自L-烯丙基甘胺酸之副生成物予以去除 後，使甲醇溶液流動）而得到化合物（3-3)1.3g(產量90%)。 實施例2 從化合物Π-3)製造化合物（6-1)

在 〇°C 使化合物（3-3)300mg(lmmol)溶於 10%(v/v)乙 《醇鹽酸（由乙醯氣與乙醇調製）15mL中，且在室溫攪拌一 晚。將反應混合物減壓濃縮後，經由曱苯共沸使其乾燥， 且以真空泵抽吸直到變乾硬。使生成之鹽酸鹽溶於甲醇 4mL中，且依序加入如式（5-1)所示之醛（以下，簡寫為醛 (5-l))250mg(l.lmmol)、

氰基领氳化納70mg(l.lmmol)，並攪拌約2小時。在反應 混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，且以醋酸乙酯萃取2 次。收集萃取液，且以無水硫酸鎂乾燥並過濾後，經由減 壓濃縮而得到油狀物質。將此油狀物質依短程矽膠層析法 精製（移動相：從己烷：醋酸乙酯=2 : l(v/v)至醋酸乙酯） 而得到無色油狀物質之化合物（6-l)372mg(產量79%)。 實施例3 從化合物（6-1)製造2’-去氣麥根酸 22 319705 200827335

Η 2’ -去氧麥根酸 在化合物（6_l)300mg(0.6mmol)中加入6Ν鹽酸10mL， 且攪拌約15小時。使反應混合物減壓濃縮後，加入IN氳 氧化鈉水溶液10mL且攪拌15小時後，以1N鹽酸中和反 應混合物。將反應混合物減壓濃縮而得到粗2’-去氧麥根酸 之鹽酸鹽。使此鹽溶於約5mL之水中，且以Dowex50Wx (8離子交換樹脂處理，並以氨水使其溶析，而製成2’-去氧 麥根酸之銨鹽溶液。使此溶液減壓乾燥而得到粗2’-去氧麥 根酸180mg。使此藉由水-甲醇-乙醇而結晶化，得到2’-去 氧麥根酸。所得之2’-去氧麥根酸之比旋光度、1HNMR、 13CNMR、及MS之各種光譜係與天然* — S(Nomoto，K· Chemia，（1981)，7, p249) 〇 實施例4 從Boc-L-烯丙基甘胺酸製造化合物（3-3) co2h

Boc - L-婦丙基甘胺酸 使Boc-L·烯丙基甘胺酸1.6g(7.4mmol)溶於曱醇（25mL) 中，且在-78°C進行臭氧氣體起泡。進行起泡直到溶液變青 色後，進行氧氣起泡直到青色消失。回到室溫後，加入L-吖丁咬-2-缓酸 752mg(7.4mmol)與氰基棚氫化鈉 470mg(7.4mmol)且攪拌1小時。將反應混合物減壓濃縮 23 319705 200827335 後，依使用矽膠之短程矽膠層析法（以移動相：醋酸乙酯： 曱醇=5 : 1 (v/ v)之混合溶液將氰基棚氫化納之殘部及少 量來自L-烯丙基甘胺酸之副生成物予以去除後，使甲醇溶 液流動）而得到化合物（3-3)2. lg(產量93%)。 實施例5 從Boc-L-烯丙基甘胺酸製造化合物（3-4)

，. -Boc Boc-L-稀丙基甘胺酸

OH (7-1)

OH (3-4) 使Boc_L_烯丙基甘胺酸670mg(3.1mmol)溶於二曱基 曱酸胺1 OmL中，且依序加入碳酸鉀1.3g(9. lmmol)、破乙 烧0.32mL(4.1mmol)。在室溫將反應混合物攪拌2小時後， 加入水且以乙醚萃取2次。收集萃取液後，經由以硫酸鎂 乾燥、過濾、減壓濃縮而得到乙酯體之粗生成物。使此粗 生成物溶於1，2_二氯乙燒20mL，且加入二氧化石西 ^ 320mg(2.9mmol)、5·5Μ 過氧化三級丁基 2mL(l 1.6mmol)， 並在7 0 °C攪拌8小時。在反應混合物中加入碳酸氳納溶 液，且以醋酸乙酯萃取2次。收集萃取液後，經由以硫酸 鎂乾燥、過濾、減壓濃縮而得到生成物（7-1)。將所得之粗 生成物依矽膠管柱層析法精製，而得到油狀生成物之生成 物（7-l)400mg(收率55%)。所得之生成物（7-1)係依與實施 例4同樣操作而得到化合物（3-4)(收率80%)。 實施例6 從化合物（3-3)製造化合物（6-1) 24 319705 200827335

CO〇H

(3-3) CO^Bu C02Et

(6-1) (5-1) 在化合物（3-3)1.7g(5.6mmol)中加入已冷卻至〇°C之乙 醇鹽酸（由乙醯氣4mL與乙醇160mL調製）140mL，且在0 °C攪拌2小時、在室溫攪拌一晚。將反應混合物減壓濃縮 後’經由甲苯共沸使其乾燥，且以真空泵抽吸直到變乾硬。 使生成之鹽酸鹽溶於甲醇30mL中，且依序加入醛 (5-l)1.3g(5.6mmol)、氰基棚氳化鈉 354mg(5.6mmol)，並擾 拌約5小時。在反應混合物中加入飽和碳酸氫鈉水溶液， 且以醋酸乙酯萃取3次。收集萃取液，且以無水硫酸鎂乾 燥並過濾後，經由減壓濃縮而得到油狀物質。將此油狀物 質依短程矽膠層析法精製（移動相：從己烷：醋酸乙酯=2: l(v / V)至醋酸乙酯）而得到無色油狀物質之化合物 (6-l)1.8g(產量 68%)。 7 從化合物n-4)製造化合物（6-2) 丨 (5-1)

t NHBdo OH OHC (3-4) 在化合物（3-4)170mg(0.49mmol)中加入已冷卻至〇。〇 之乙醇鹽酸（由乙蕴氯（K2mL與乙醇10mL調製）i〇.2mL， 且在〇°C攪拌2小時、在室溫攪拌一晚。將反應混合物減 319705 25 200827335 壓濃縮後，經由甲苯共沸使其乾燥，且以真空泵抽吸直到 變乾硬。使生成之鹽酸鹽溶於曱醇30mL中，且依序加入 酸（5-l)113mg(0.49mmol)、氰基棚氫化納 31mg(0.49 mmol)，並攪拌約5小時。在將反應混合物減壓濃縮後， 依短程矽膠層析法精製（移動相：從己烷：醋酸乙酯=2 : 1 (v/ v)至醋酸乙醋）而得到無色油狀物質之化合物（6-2) 193mg(產量 81%)。 實施例8 從Boc-L-烯丙基甘胺酸以一鍋法製造化合物（6-1)

co2h NHBoc

Boc-L-烯丙基甘胺酸 C02Et

I C02Et CC 〇21Bu 0!Bu H (6-1) 使Boc-L-浠丙基甘胺酸400mg(l .9mmol)溶於甲醇 15mL中，且在-78°C進行臭氧起泡。進行起泡直到溶液變 青色後，進行氧氣起泡直到青色消失。加入L-σ丫丁唆_2_ 叛酸 188mg(L9mmol)與氰基棚氫化納 117mg(l ·9πιπιο1)， 且回到室溫並攪拌2小時。將反應混合物減壓濃縮後，加 入已冷卻至0°C之乙醇鹽酸40mL(由乙醯氣1.6mL與乙醇 40mL調製），且在攪拌2小時、在室溫攪拌一晚後， 經由減壓濃縮、曱苯共沸、真空泵使其變乾硬。使生成之 鹽酸鹽溶於甲醇20mL 中，且依序加入醛（5-l)428mg (1.9mmol)、氰基棚氫化鈉120mg(l ·9ππηο1)，並攪:拌約5 小時。在反應混合物中加入飽和破酸氫納水溶液，且以酷 酸乙酯萃取3次。收集萃取液，且以無水硫酸鎂乾燥並過 26 319705 200827335 濾後，經由減壓濃縮而得到油狀物質。將此油狀物質依短 程矽膠層析法精製（移動相··從己烧：醋酸乙酯=2 : 1 (v/ v)至醋酸乙酯（添加0.1%三乙胺））而得到無色油狀物質之 化合物（6-l)480mg(產量 55%)。 實施例9 從化合物（6-1)製造2’-去氣麥根酸

COoH

6NHCI quant. C02Et J C02Et CO^Bu ，八」^ N Η (6-1)

在0°C在化合物（6_l)300mg(0.6mmol)中加入6N鹽酸 10mL，且在室溫攪拌約10小時。使反應混合物減壓濃縮 後，加入1N氫氧化鈉水溶液15mL且攪拌10小時。藉由 1N鹽酸中和後，經由減壓濃縮而得到粗去氧麥根酸之 鹽酸鹽。使此鹽溶於約5mL水中，且以Dowex50Wx8離 子交換樹脂處理，並以氨水使其溶析，而製成2^去氧麥根 酸之銨鹽溶液。使此溶液減壓乾燥而得到粗2’_去氧麥根酸 ^ 180mg(產量100%)。使此藉由水·甲醇-乙醇而結晶化，得 到2’-去氧麥根酸120mg(產量66%)。所得之2’-去氧麥根酸 之比旋光度、^NMR、13CNMR、及MS之各種光譜係與 天然物一致（Nomoto, K· Chemia，（1981)，7, p249)。 實施例10 從化合物（6-2)製造春根酸 6NHC! quant. C02Et J C02Et COjBu OH H (6-2)

CO〇H I co2h co2h Qi 八Υ^νΑ^^·0Η OH H 在0°C在化合物（6-2)100mg(0.3 lmmol)中加入6N鹽酸 27 319705 200827335 10mL，且在室溫攪拌約2小時。使反應混合物減壓濃縮 後，加入1N氫氧化鈉水溶液1〇mL且攪拌10小時。將反 應混合物以1N鹽酸中和後，經由減壓濃縮而得到粗麥根 酉夂之鹽酸鹽。使此鹽溶於約5mL水中，且以Dowex5〇Wx 8離子交換樹脂處理，並以氨水使其溶析，而成為麥根酸 之銨鹽溶液。使此溶液減壓乾燥而得到粗麥根酸99mg。使 所得之粉末溶於水3mL中，以diani〇n HP20(以水溶折） 精製後，再一次冷凍乾燥，而得到麥根酸(產量。 從1HNMR、及MS光譜得知，所狀|減係天然麥根 與其2’經基立體異構物之混合物。 —實施例11 製造麥根酸之_甚他方法 ΟΟζ{Βυ ^^-^NHCbr Cbz-L-烯丙基甘 胺酸三級丁酯

Se02, lBuOOH, ClCH2CH2CI 55% rzwu 1) Q3fMeQH C02Hqf fc /OV LNH nw 002<Βυ NHCbz 1) H2r Pd-C, ΜβΟΗ 2) 002«Βυ οηο^Λ

O^Bu NaBH3CN (5-1) (8) C02Hdv0^： OH H (10)

NaBH3CN 86%

6NHCI quant

OH

C02H

C〇2H c〇2H OH 麥根酸；6 steps, 42% 按照實施例5，首先從Cbz-L-烯内基甘胺酸三級丁略 1.4g(4.6mmol)得到化合物（8)(收率55%)，接著從化合物 (8)550mg得到化合物（9)580mg(收率86%)。接著使化合物 (9)450mg(l.lmmol)溶於曱醇10mL中，且加入1〇%把石炭 (palladium carbon)80mg，並在氫氣環境下樓摔1小時。以 曱醇稀釋後’經由石夕藻土（celite)過據、減壓濃縮而成鞍 體。接著使減壓濃縮物溶於甲醇15mL中後，加入酷酸％ 319705 28 200827335 //L將pH調製為4至6。接著，依序加入醛（5-1)254mg (l.lmmol)、氰基爛氫化納70mg(l.imm〇i)，並撥拌約5小 時。將反應混合物減壓濃縮後，依矽膠管柱層析法以醋酸 乙酯/甲醇（4: l(v/v))溶液將氰基硼氫化鈉與醛之殘部予 以去除後，以氯仿/甲醇（4: l(v/v))溶液、接著以氯仿/ 曱醇（2 ·· l(v/v))溶液將化合物（1〇)溶析，並將溶析液蒸餾 去除而得到化合物（10)480mg(收率89%)。 使所得之化合物（10)200mg(0·41mmol)溶於0。c之6N #鹽酸中，且攪拌約2小時後使其減壓濃縮，而得到粗麥根 酸之鹽酸鹽。使此鹽溶於約5mL之水中，且以Dowex50W x8離子交換樹脂處理，並以氨水使其溶析，而成為麥根酸 之銨鹽溶液。使此溶液減壓乾燥而得到粗麥根酸。使所得 之粉末溶於水3mL中，以DIANIONHP20(以水溶析）精製 後，再一次冷凍乾燥，而得到麥根酸125mg(產量95%)。 從1HNMR、及MS光譜得知，所得之麥根酸係天然麥根酸 ^ 與其2’羥基立體異構物之混合物。 實施例12 麥根酸之来璺雛析 將在實施例11中得到之化合物（10)250mg(0.51mm〇1) 溶於20%乙腈水溶液（含有〇·1%酷酸）10ml中，且以液體層 析法分離。液體層析法之條件係如下述。 管柱：CAPCELLPAK C18-UG80(5 // m)(Shiseido) 溶析速度：9.999ml/分鐘 溶析條件·· 35%CH3CN-H20(1%醋酸） 溶析時間：次峰：14.0分鐘；主峰：16·3分鐘 29 319705 200827335 注射容量··各200// 1 收集各餾分（fraction)，且將溶劑在減壓下蒸顧去除。 將次峰、及主峰之各乾燥物溶於6N之HCl(20mL)中，且 在室溫授拌5小時。將溶劑在減壓下蒸餾去除，且使所得 之鹽酸鹽擔載於離子交換管柱（Dowex5〇W X 8，100_ 200mesh，H+ form)，並以5%NH4OH水溶液進行溶析後， 冷凍乾燥。使所得之粉末溶於水，且以DIANION HP20(以 水溶析）精製後，再一次冷凍乾燥。從次峰所得之精製物之 產量係20mg，從主峰所得之精製物之產量係81mg。次峰 精製物及主峰精製物之各種物性測定值如以下所示。 〈次峰〉 [a]24D - 63.5 ° (c 0.31, ΗζΟ)»*1!! NMR (400MHz, D2O, pH=4.53 adjusted by the addition of IN DC1)6 2.03 (1H, m), 2.19 (1H, m), 2.57 (1H, m), 2.72 (1H, m), 3.21 (1H, m), 3.29 (1H, m), 3.43 (1H, dd, J=2.7, 13.7 Hz), 3.56 (1H, dd, J=9.5, 13.7 Hz), 3.85 (1H, d, J=2.9 Hz), 4.03 (1H, app.q, J=9.7 Hz), 4.10 (1H, dt, J=4.2, 10.1 Hz), 4.17 (1H, dd, J=4.6, 7.3 Hz), 4.44 (1H, dt, J=9,3, 2.9 Hz), 4.88 (lH, t, J=9.5 Hz) ppm； 13C NMR (100MHz, D2O, pH=4.53 adjusted by the addition of IN DC1)6 24.6, 32.9, 47.9, 53.9, 59.0, 67.4 (2C), 70.6, 73.2, 171.8, 175.8, 182.3 ppm； IR (film, cm*1) 3215, 3061, 2855, 1618, 1412, 1319, 1236, 1115, 1092, 976, 773; HRMS m/z calcd for Ci2H2iN2〇8+ [M+H]+： 321.1298, found： 321.1292. 30 319705 200827335 <主峰> [α]24□ —48·8。（c 0.57，Ή NMR (400MHz，D2〇，ρΗ=4·50 adjusted by the addition of IN DC1)6 2.02 (1H, m), 2.16 (1H, m), 2.57 (1H, m), 2.70 (1H, m), 3.16 (1H, dt, J=12.7, 7.1 Hz), 3.30 (1H, dt, 12.7, 7.1 Hz), 3.41 (1H, dd, J=9.8, 13.2 Hz), 3.57 (1H, dd, J=2.7, 13.2 Hz), 3.63 (1H, d, J=8.3 Hz), 4.06 (1H, app.q, J=9.7 Hz), 4.09 (1H, m), 4.16 (1H, dd, J=4.4, 7.6 Hz), 4.22 (1H, ddd, J=2.7, 8.3, 9.8 Hz), 4.89 (1H, t, J=9.5 Hz)； 13C NMR (100MHz, D2O, pH=4.50 adjusted by the addition of IN DC1)6 24.5, 32.7， 48.1, 54.4, 60.0, 67.4, 67.5, 69.9, 73.2, 172.4, 175.7, 182.1 ppm； IR (film, cm*〇 3213, 3051, 2839, 1610,1412, 1329, 1238, 1107, 934, 773; HEMS m/z calcd for Ci2H2iN2〇8+ [M+H3+: 321.1298, found: 321.1298. (次峰精製物與主峰精製物係除了旋光度以外幾乎皆一 致。在次峰上確認出包含具有與目標之天然物相同立體結 構之麥根酸（2W立經基之S體），而在主峰上石隹認出包含2f 位羥基之R體。此外，經由W-NMR分析而得知s體與r 體之莫耳比為1 : 3。

關於在實施例12中得到之2’位羥基之8體（天然型） 及R體、在實施例9中得到之2’位去氧體、以及依據記載 於「Takagi· S 等人，J· Plant Nutr·，1984 年第 7 卷 p469-477」之方法從大麥精製出之麥根酸，確認該等之鐵 錯合物係藉由麥根酸鐵錯合物輸送者實際地輸送至細胞 内0 319705 31 200827335 ， <製作表現麥根酸鐵錯合物輪送者之非洲爪檐卵母細胞> 以記載於「Murata，Y·等人，Plant J·，2006年，第46卷， ρ·563-572.」之方法，在非洲爪蟾之卵母細胞中，導入欲將 大麥之麥根酸鐵錯合物輸送者（Plant J·，2006年，vol46, 563·572)編碼之基因 HvYSl基因。具體而言，在 pSP64Poly(A)載體（vector)(Promega 公司製）之 Xbal 與 BamHI之位置上，插入HvYSl cDNA(序歹ij號碼1之編碼 區），使用其並以Ambion公司之mMESSAGE mMACHINE (Kit 製作 cRNA。 剖開非洲爪蟾（從濱松生物教材買進）之腹部，並取出 印母細胞（Xenopus Oocytes)。然後，將 Collagenase typeIA(Sigma製）以使其成為2mg/mL之方式加入，且將 卵母細胞移至裝有OR-2溶液（82.5mM NaCl、2mM KC1、 ImM MgCl2、5mM HEPES)之離心沈澱管中，並在室溫擾 拌約2小時後，以OR-2溶液洗淨3次，並且以ND-96溶 I 液(96mM NaCl、2mM KC1、ImM MgCl2、1·8 mM CaCl2、 5mM HEPES)洗淨3次。以數位式微分注器（Drummond SCIENTIFIC 製）將 cRNA50/z g/mL、50nL 注入非洲爪蟾 之卵母細胞内。卵母細胞係在ND-96溶液中，在17°C培養 48至72小時。 <調製麥根酸類之鐵錯合物> 將2’位羥基之S體及R體、2’位去氧體、以及從大麥 精製出之麥根酸，各以30mM分別與氯化鐵30mM混合 後，在室溫靜置2小時，且將鐵錯合物濃度稀釋至5mM。 32 319705 200827335 、 <鐵輪送活性之比鲛> 使用印母細胞夾（oocytes clamp)OC-725C(Warner Instrument製）並經由偵測電化學信號而將輸送入細胞内之 麥根酸鐵錯合物之輸送量予以定量。具體而言，將使麥根 酸鐵錯合物輸送者HvYSl表現之卵母細胞設置於已充滿 ND-96溶液之室（chamber)中，且洗上5mM之基質鐵錯合 物溶液10 // L(最終濃度50 # M)，測定電生理活性。在卵 母細胞中插入兩支已充滿3M KCL之微電極，且以將實驗 f 槽之電位固定於0V之模式，測定在固定電位-60mV下變 化之電流值。數據係以PowerLab數據收集裝置（Chart 4軟 體）記錄。 結果如第1圖所示。以將對天然麥根酸所測定之電化 學信號之大小（電生理活性）當做100時之相對值表示對2’ 羥基S體、2’羥基R體、及2’去氧體所測定之電流值之大 小（電生理活性）。2f羥基S體、2’羥基R體、及2’去氧體之 , 電流值大小係任一皆與天然麥根酸相同。即使如同經由一 鍋合成所得之麥根酸，混合有合成之麥根酸之2’位羥基之 立體配置，或為2’去氧體，仍顯示有用於將鐵錯合物輸送 入植物内。 (產業上之可利用性） 本發明之製造方法係由於能低價地大量製造出可取代 EDTA而做為鉗合劑利用的麥根酸類，故為有用。此外， 依本發明之製造方法所製造之麥根酸，係能利用在研究植 物中之鐵輸送機制，或利用在健康食品、化妝品或肥料等 33 319705 200827335 ’領域中。 【圖式簡單說明】 第1圖係表示將以麥根酸2’羥基S體（天然型）、麥根 酸2’羥基R體、及麥根酸2’去氧體做為鐵錯合物輸送者之 基質的活性與天然麥根酸之活性加以比較後之結果的圖。 34 319705

Claims (1)

1. 200827335 十、申請專利範圍： 1. 一種麥根酸類的製造方法，其中，該麥根酸類係如下述 通式（1)所示 R1，H Η r3⑴ °2Η co2h

   (式中’ R、R係表不氫原子或縣，r3係表示經基或 胺基），該製造方法係包括下列步驟丨至4 ·· 裂 使如下述通式（2)所 不之化合物之乙烯基氧化斷 ，同時以πγτπ^2邊酸進行還原性胺化反 應

   (2) (式中’ R1係表示與前述同， 声 之你1里 ϋ 5 ^ 士 R係表不虱原子或叛基 之保濩基，R5係表示胺基 而得到如下述通式(3)所示之步驟1 9〇2r4 vnhrs COgH j ?° R1 Η (式中 R、R4 及 R5 # j # 以保護基俘罐钤1 4 J J 去除胺基之保護基===、之化合物之㈣，同時 或其鹽的步驟2 下述通式（4)所示之化合物 319705 35 200827335 CO〇R6

   =);…係表示與前述同義，R6係表示絲之保 之化：進述通式(5)所示之_通式⑷所示 化°物進仃還原性胺化反應 R7 9〇2r (5) ^Re R2 It表9示與前述同義，r7係表㈣基之保護基， 係-〇MR係表示經基之保護基）或—nhr10(r10係 表不胺基之保護基）） 而得到如下述通式（6)所示之化合物的步驟3 co2r8 r-j f〇Z^4 C〇2R7 nAhV^r8 ⑼ (式中，111、]^、114、]16、117及118係表示與前述同義）； 以及 將該如通式（6)所示之化合物之羧基之保護基及經 基或胺基之保護基予以去除的步驟4。 2·—種如下述通式（3 — 1)所示之化合物 319705 36 200827335 • go2h I c〇2h □ν〇>ΛνΗΒοο (3-1) R< H (式中，R1係表示氫原子或經基，Boc係表示三級丁氧 綠基）。 3. —種如下述通式（4 一 1)所示之化合物

   COoEt

   (4-1) (式中，R1係表示氫原子或羥基，Et係表示乙基）。

   37 319705 200827335 序列表 〈110>三得利股份有限公司 <120〉麥根酸的製造方法 <130> S07F2386 <150> JP2006-307397 <151> 2006-11-14 <160〉 1 <210〉 1 〈211> 2430 <212> DNA <213〉大麥（Hordemn vulgare L.) . <223〉 HvYSl <220〉 <221> CDS <222> (169)·· (2202) <400> 1 60 120 177 taatctcacc gcaaaagcac acggttccag ctcgcctcgt gggcggaaac ggggaacgac ttcctggaag ctgcggcctc cagtgattct tcttccacgg tacagtgatc agtcgaccac tacgaccitg atcgttgagc agctgcggag gcaagaagca gagccacc atg gac ate Met Asp lie gtc gcc ccg gac ege aeg egg ate geg ccg gag ate gac agg gac gag Val Ala Pro Asp Arg Thr Arg lie Ala Pro Glu lie Asp Arg Asp Glu 1 225 273200827335 10 15 gcc ctg gag ggc gac agg gag teg gac ccg gcg ctg gcg teg acg Cgc Ala Leu Glu Gly Asp Arg Glu Ser Asp Pro Ala Leu Ala Ser Thr Arg 2〇 25 30 35 gag tgg cag cig gag gac atg cca egg tgg cag gac gag ctg aeg gtg Glu Trp Gin Leu Glu Asp Met Pro Arg Trp Gin Asp Glu Leu Thr Vai 40 45 50 321 egg ggc cig gtg geg geg ctg etc ate ggg ttc ate tac acc gtc ate 369 Arg Gly Leu Val Ala Ala Leu Leu lie Gly Phe lie Tyr Thr Val lie 55 60 65 gtc atg aag ate geg etc acc aeg ggg ctg gtg ccc aeg ctg aac gtc Val Met Lys lie Ala Leu Thr Thr Gly Leu Val Pro Thr Leu Asn Val 70 75 80 tee gee geg ctg etc tee ttc ctg geg etc ege ggg tgg aeg ege ctg Ser Ala Ala Leu Leu Ser Phe Leu Ala Leu Arg Gly Trp Thr Arg Leu 85 90 95 ctg gag ege ttc ggc gtc gtg tee ege ccc ttc aeg egg cag gag aac Leu Glu Arg Phe Gly Val Val Ser Arg Pro Phe Thr Arg Gin Glu Asn 100 105 Π0 115 acc ate gtc cag acc tgc ggc gtg gca igc tac acc ate geg itt gee ' Thr lie Val Gin Thr Cys Gly Val Ala Cys Tyr Thr lie Ala Phe Ala j 2〇 125 130 417 465 513 561 2 609 200827335 ggt ggg ttc ggg tea acc ttg ctg ggc ctg aac aag aag aeg tac gag Gly Gly Phe Gly Ser Thr Leu Leu Gly Leu Asn Lys Lys Thr Tyr qju 135 140 145 657 ctg gcc ggt gac teg ccg ggc aac gtg ccc gga age tgg aag gag cca Leu Ala Gly Asp Ser Pro Gly Asn Val Pro Gly Ser Trp Lys Glu Pro 150 155 160 705 ggg ata ggc tgg atg aeg ggg ttc etc etc get tgc age ttc ggg ggC / Gly lie Gly Trp Met Thr Gly Phe Leu Leu Ala Cys Ser Phe Gly Gly 165 170 175 753 etc etc act ttg ati ccc ctg aga cag gta ctg gtc gtc gac tac aaa- Leu Leu Thr Leu lie Pro Leu Arg Gin Val Leu Val Val Asp Tyr Lys 180 185 i9〇 195 801 tta gtt tac cca agt ggg act gca act get att ett ata aac ggg ttc Leu Val Tyr Pro Ser Gly Thr Ala Thr Ala He Leu lie Asn Gly Phe 200 205 210 849 cat acc gat caa ggg gac aag aat tea aga aag caa ate cgt gga ttc His Thr Asp Gin Gly Asp Lys Asn Ser Arg Lys Gin lie Arg Gly Phe 215 220 n nr ctg m tac ttt ggg ggt age ttt ctg tgg agi ttc ttc caa tgg ttc Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Ser Phe Leu Trp Ser Phe Phe Gin Trp Phe ^ 230 235 0yin 3 897 945200827335 tac act gga ggc gat get tgt gga ttt gtt cag tie cca act ttc ggt Tyr Thr Gly Gly Asp Ala Cys Gly Phe Val Gin Phe Pro Thr Phe Gly 245 250 255 ttg aag gee tgg aag cag aca tic tac ttt gac tit age atg aca tac Leu Lys Ala Trp Lys Gin Thr Phe Tyr Phe Asp Phe Ser Met Thr Tyr 260 265 270 275 gtt ggt gee ggg atg alt tgt cca cat ata gta aat ata tet acc etc Val Gly Ala Gly Met lie Cys Pro His lie Val Asn lie Ser Thr Leu 280 285 290 ett ggt gca att ate tea tgg gga ata atg tgg cca etc ate agt aaa Leu Gly Ala lie lie Ser Trp Gly lie Met Trp Pro Leu lie Ser Lys. 295 300 305 aac aag ggg gat tgg tac cct gca aaa gta cca gaa age age atg aaa Asn Lys Gly Asp Trp Tyr Pro Ala Lys Val Pro Glu Ser Ser Met Lys 310 315 320 agt ttg tac ggt tac aag gee ttc ata tgc ata get etc ate atg ggg Ser Leu Tyr Gly Tyr Lys Ala Phe lie Cys lie Ala Leu lie Met Gly 325 330 335 gat ggc atg tac cac ttc ata aaa att gtt ggc ate act get atg age Asp Gly Met Tyr His Phe lie Lys lie Val Gly lie Thr Ala Met Ser 340 345 350 355 - 993 1041 1089 1137 1185 4 1233 1329 200827335 Met Tyr Arg Gin Phe Ser His Lys Gin Val Asn Asn Lys Ala Lys Asn 360 365 370 gcg gac gac act gtc teg ctt gag gag tta cac ege cag gag ate ttt Ala Asp Asp Thr Val Ser Leu Glu Glu Leu His Arg Gin Glu lie Phe 375 380 385 1377 aag aga ggc cac ate ccc tet tgg atg gca tac get ggt tat gee ttg Lys Arg Gly His lie Pro Ser Trp Met Ala Tyr Ala Gly Tyr Ala Leu 390 395 400 f 1425 ttt age gtt ctt gca gtg gtt aca ata cca gta atg ttc aaa caa gtg Phe Ser Val Leu Ala Val Val Thr lie Pro Val Met Phe Lys Gin Val 405 410 415 · 1473 aag tgg tac tat gtt gtt ata gee tat gtc gtt gee ccc atg ctt gga Lys Trp Tyr Tyr Val Val He Ala Tyr Val Val Ala Pro Met Leu Gly 420 425 430 435 1521 ( ttt gee aat tea tac ggg aca ggg ctt acc gac ate aac atg ggc tat Phe Ala Asn Ser Tyr Gly Thr Gly Leu Thr Asp lie Asn Met Gly Tyr 440 445 450 1569 aac tat ggc aag ate get etc ttt gtc ttt gcg gga tgg gee ggt aaa Asn Tyr Gly Lys lie Ala Leu Phe Val Phe Ala Gly Trp Ala Gly Lys 455 460 465 1617 gag aat ggt gtc att gee ggc ctt gtt get ggc acc ttg gtt aag cag Glu Asn Gly Val Ils Ala Gly Leu Val Ala Gly Thr Leu Val Lys Gin 5 200827335 470 475 480 tig gtg ctt ate tet gee gat ttg atg caa gac ttc aag aeg agt tac Leu Val Leu lie Ser Ala Asp Leu Met Gin Asp Phe Lys Thr Ser Tyr 485 490 495 etc act caa aca tea cca aaa tee atg atg att gca caa gtt git gga Leu Thr Gin Thr Ser Pro Lys Ser Met Met lie Ala Gin Val Val Gly 500 505 510 515 aca gee atg ggt tgc att gtc tee ccc etc aeg ttc atg etc ttc tac Thr Ala Met Gly Cys lie Val Ser Pro Leu Thr Phe Met Leu Phe Tyr 520 525 530 aag gca ttt gat att ggt aac cca gat ggt act tgg aag gca cct tat Lys Ala Phe Asp lie Gly Asn Pro Asp Gly Thr Trp Lys Ala Pro Tyr 535 540 545 gca etc ata tac ege aat atg gca ata ctt ggt gtg gag ggc ttc teg Ala Leu lie Tyr Arg Asn Met Ala lie Leu Gly Val Glu Gly Phe Ser 550 555 560 gtg ttg ccg aag tat tgc ate gtg ata tee ggt gga ttt ttc gee ttt Val Leu Pro Lys Tyr Cys lie Val lie Ser Gly Gly Phe Phe Ala Phe 565 570 575 geg geg att tia agt ata aca aga gat gtc atg ccc cac aag tat geg * Ala Ala lie Leu Ser lie Thr Arg Asp Val Met Pro His Lys Tyr Ala 580 585 590 595 1665 1713 1761 1809 1857 1905 1953 6 200827335 aag tat gig ccc ctg cca atg gca atg gca git cca ttc clt gta ggt Lys Tyr Val Pro Leu Pro Met Ala Met Ala Val Pro Phe Leu Val Gly 600 605 610 ggg age ttt get att gat atg igc etc ggg agt ttg ata gtt ttt gca Gly Ser Phe Ala lie Asp Met Cys Leu Gly Ser Leu lie Val Phe Ala 615 620 625 tgg acc aag ata aac aag aag gag get ggc tic atg gtg cct geg gtt Trp Thr Lys lie Asn Lys Lys Glu Ala Gly Phe Met Val Pro Ala Val 630 635 640 gca tcc get tig ata tgt ggg gat ggc ata tgg aeg tic cct get tcc- Ala Ser Ala Leu lie Cys Gly Asp Gly lie Trp Thr Phe Pro Ala Ser 645 650 655 att ett get ett gcc aag att aaa cca cca att tgc atg aag ttt eta lie Leu Ala Leu Ala Lys lie Lys Pro Pro lie Cys Met Lys Phe Leu 660 665 670 675 cct get gcc taacggaccg aaaaatatac taggtgacca aagatgeatt Pro Ala Ala gaatitccat agttgtgcct tgctgaacia tcttttagtg tttgtttact ggagatgett cggtactcga gtgtctagga atgataegti ggtatgtgct tttacgggta taacctgaat tttcttattt tatgaatetg gggtatactt atcagttgct atgagtatgg atetaatgat ttggctga 2001 2049 2097 2145 2193 2242 2302 2362 2422 2430