KR20090078824A

KR20090078824A - 무기네산 화합물의 효과적인 제조 방법

Info

Publication number: KR20090078824A
Application number: KR1020097009626A
Authority: KR
Inventors: 고스케 남바; 요시코 무라타
Original assignee: 산토리 홀딩스 가부시키가이샤
Priority date: 2006-11-14
Filing date: 2007-11-12
Publication date: 2009-07-20
Also published as: EP2103599A1; CA2669629A1; TW200827335A; JP2008120741A; CN101195598A; WO2008059782A1; RU2009122481A; US20100256395A1; AU2007320559A1; JP4117009B2

Abstract

하기 반응식으로 표시되는, 무기네산 화합물의 제조 방법을 개시하였다:

(단계 1, 단계 2, 단계 3, 단계 4, 이때, R¹ 및 R² 는 독립적으로 수소 원자 또는 히드록실기를 나타내고; R³ 은 히드록실기 또는 아미노기를 나타내고; R⁴ 및 R⁷ 은 독립적으로 수소 원자 또는 카르복실기에 대한 보호기를 나타내고; R⁵ 는 아미노기에 대한 보호기를 나타내고; R⁶ 은 카르복실기에 대한 보호기를 나타내고; R⁸ 은 -OR⁹ (이때 R⁹ 는 히드록실기에 대한 보호기를 나타냄) 또는 -NHR¹⁰ (이때 R¹⁰ 은 아미노기에 대한 보호기를 나타냄)을 나타냄).

무기네산, 철분 부족, 2'-데옥시무기네산

Description

무기네산 화합물의 효과적인 제조 방법 {EFFECTIVE PRODUCTION PROCESS FOR MUGINEIC ACID COMPOUND}

본 발명은 감소된 단계의 수로 무기네산(mugineic acid)을 제조하는 효율적인 방법에 관한 것이다.

철분 결핍은 현재 세계에서 가장 널리 퍼진 인간의 영양 문제이며, 산업화된 국가 및 개발도상국가 모두에서 많은 사람들이 상기 문제로 고통받고 있다. 인간은 또한 농작물로부터 필요한 철분을 섭취한다. 그러나, 농작물은 종종 토양으로부터 충분한 양의 철분을 흡수하지 못한다. 그 결과, 엽록소의 형성에서 촉매로서 작용하는 철분의 부족 때문에, 위황병(chlorosis), 저수율 및 영양가의 저하와 같은 문제가 발생한다. 유감스럽게도, 대부분의 농작물은 단지 부족한 양의 생물학적으로 이용가능한 철분만을 함유한다. 또한, 토양 내 이용가능한 철분의 부족은 식물의 성장을 억제할 수 있고, 이는 저수율을 야기한다. 대략 지구 상의 토양의 1/3 은 잠재적인 철분 결핍 지역으로서 간주된다. 철분 결여는 식물에 의한 낮은 철분 흡수 섭취를 야기하는 유일한 인자는 아니다. 예를 들어, 토양 내 철분의 생물학적 이용률은 특히 높은 pH (알칼리도)에 영향받기 쉽 다. 즉, 식물은 수-불용성 수산화철 (Fe(OH)₃) 형태로의 철 이온의 존재 때문에, 알칼리성 토양 내 뿌리로부터 철분을 충분히 흡수할 수 없다. 상기 문제에 관하여, 목초 식물에 의해 분비되는 식물성철분포획제(phytosiderophore)로서 공지된 금속 킬레이트제의 한 종류인, 무기네산은 불용성 철 (III)을 가용성 Fe-무기네산 착물로 전환시켜, 뿌리를 통한 상기와 같은 철분 착물의 섭취를 통해 철분 획득을 가능하게 한다 (Marschner, H. 등, Journal of Plant Nutrition (J. Plant Nutr.), 1986, 9th volume, p.695-713: 비특허 문헌 1 참조). 무기네산은 1978 년에 최초로 철분 결핍 보리 뿌리로부터 단리되고, 구조적으로 결정된, 철분을 킬레이트하는 물질이다 (Takemoto, T. 등, Proceedings of the Japan Academy (Proc. Japan Acad.), 1978, 54-B volume, p.469-473 : 비특허 문헌 2 참조). 무기네산은 환원적으로 결합된 아제티딘카르복실산 단위, 아스파르트산 단위, 및 말산 단위로 구성된 화합물이다. 그러나, 최근 몇년에 이르기까지, 각종 무기네산의 유사체 (Ma, J.F., Nomoto, K. Physiologia Plantarum (Physiol. Plant.), 1996, 97th volume, p.609-617 : 비특허 문헌 4 참조), 예컨대, 밀로부터 단리된, 2'-데옥시무기네산 (Nomoto, K. 등, Chimia, 1981, 7th volume, p. 249-250 : 비특허 문헌 3 참조)이 단리되었고, 이들 모두는 일반적으로 무기네산으로서 지칭된다.

장차 무기네산의 연구 또는 응용의 추가적인 발전에 집중된 큰 기대에도 불구하고, 대량으로 이러한 무기네산을 수득하는 것은 매우 곤란했었다. 무기네산의 제조예의 경우, 최초는 1981 년에 Ohfune 등 (Ohfune, Y. 등, Journal of the American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.), 1981, 103rd volume, p.2409-2410 : 비특허 문헌 5 참조)에 의해 보고된 2'-데옥시무기네산의 제조였고, 동시에 2'-데옥시무기네산의 대안적인 제조 방법이 Fushiya 등 (Fushiya, S. 등, Chemistry Letters (Chem. Lett.), 1981, p.909-912 : 비특허 문헌 6 참조)에 의해 보고되었다. 1986 년에, 무기네산의 제조 방법이 Hamada 등 (Hamada, Y., Shioiri, T. The Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem.), 1986, 51st volume, p.5489-5490 : 비특허 문헌 7 참조)에 의해 보고되었다. 그 후, Matsuura 등이 간소화되고 개선된 무기네산의 제조 방법을 추가로 보고하였다 (Matsuura, F. 등, Tetrahedron, 1993, 49th volume, p.8211-8222 : 비특허 문헌 8 참조). 또한, 2'-데옥시무기네산 및 무기네산의 전구체인 니코티안아민 (3"-OH 기가 아미노기로 치환된 것)의 효율적인 제조 방법이 2001 년 Miyakoshi 등 (Miyakoshi, K. 등, Tetrahedron, 2001, 57th volume, p.3355-3360 : 비특허 문헌 9 참조)에 의해 보고되었다. Miyakoshi 등에 의해 개발된 효율적인 방법 덕분에, Hasegawa 향수 회사는 니코티안아민을 상업화하기 시작했고, 따라서 많은 연구원들에 의해 입수가 용이하게 되었다. 최근에, 2'-데옥시무기네산의 효율적인 제조 방법이 Singh 등 (Singh, S. 등, Tetrahedron Letters (Tetrahedron Lett.), 2005, 46th volume, p.1419-1421 : 비특허 문헌 10 참조)에 의해 보고되었다. 상기 방법에서, 무기네산을 구성하는 3 가지 구성요소, 즉 아제티딘카르복실산 단위, 아스파르트산 단위 및 말산 단위 중에서, 2'-데옥시무기네산은 아제티딘카르복실산 단위의 보호 없이 합성될 수 있다. 그 후 2005 년 말에, 캐나다의 TRC Inc. 는 2'-데옥시무기네산을 시판하기 시작했다.

발명이 해결하고자 하는 문제

무기네산은 식물의 철분 섭취 메카니즘을 조사하는 연구에서 중요한 도구로서 이용되어 왔다. 또한, 그의 철분 킬레이팅성 덕분에, 무기네산은 각종 분야, 예를 들어 EDTA 를 대체하는 안전한 금속 킬레이트제로서, 동물 및 식물에서 철분 결핍에 효율적으로 접근하는 건강 식품으로서, 및 화장품 및 비료의 분야에서 가능성을 제공할 수 있다. 따라서, 무기네산의 제조 방법의 개선은 필수적이다.

지금까지 보고된 모든 방법에는 중간체 생성물의 단리 및 정제가 포함된다. 이러한 공정들은 많은 힘든 노력과 시간을 수반하며, 따라서 수율의 감소를 야기한다.

예를 들어, 상기 언급된 비특허 문헌 5 내지 8 에 의해 교시된 방법에는 많은 단계가 포함되고, 또한 중간체 생성물의 단리 및 정제를 위해 많은 노력이 요구된다. 따라서, 대량으로 안정적인 공급을 확보하기 위해 추가로 개선된 방법이 필요하다. 또한, 단지 29% 의 2'-데옥시무기네산의 저수율이 상기 언급된 비특허 문헌 9 에 의해 교시된 방법에 의해 수득되었다. 또한, 동일한 문헌에 의해 교시된 방법에 따라, 무기네산의 전구체인 니코티안아민은 상업화 덕분에 입수가 용이하게 되었지만, 2'-데옥시무기네산은 고가로 남아있고, 고수율은 아직 달성되지 않았기 때문에, 대량으로의 조달은 곤란한 것으로 남아있다.

대량으로 무기네산의 저가 공급이 가능하게 되면, 건강 식품에서 화장품 및 비료에 이르는 범위의 분야에서 해당 연구 및 응용 가능성에 대한 무수한 기여가 있을 것이다. 그러나, 상기 기술된 바와 같은 지금까지 보고된 방법에서, 많은 단계, 중간체 생성물의 단리 및 정제를 위해 요구되는 노력, 저수율 등 때문에 저비용으로의 대량 공급에 문제가 있었다.

본 발명은 선행 기술의 상기 문제들을 해결하는 것이고, 이의 목적은 저비용으로 무기네산을 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 즉, 실제로 무기네산을 제조하기 위해서는, 하기와 같은 필요 불가결한 작업이 포함된다: 1) 포함된 단계의 수의 감소; 2) 중간체 생성물의 단리 및 정제 단계의 생략, 3) 제조 공정의 간소화 및 4) 저가의 반응 시약. 따라서, 본 발명의 목적은 모든 문제를 한번에 해결하는, 무기네산의 제조 방법을 제공하는 것이다.

문제 해결 방법

무기네산은 3 가지 단위, 즉 아제티딘카르복실산 단위, 아스파르트산 단위 및 말산 단위로 구성된 화합물이다. 상기 단위들의 커플링 반응 동안, 상기 단위들의 카르복실, 아미노 또는 히드록실기의 다수의 보호기들의 탈착이 요구된다. 상기와 같은 공정이, 차례로, 포함된 단계들의 수에 추가된다. 따라서, 본 발명자들은 카르복실, 아미노 또는 히드록실의 보호기의 사용을 최소한으로 제한함에 의해 단계의 수를 감소시키고자 시도하였다. 즉, 본 발명자들은 보호기를 아제티딘카르복실산 단위 및 아스파르트산 단위의 카르복실기에 도입하지 않거나, 또는 보호기의 도입은 포함하지만 단리 및 정제 없이 다음 단계로 바로 진행하는 방법을 개발하여, 단계의 수를 감소시키고, 공정을 간소화하는 방법을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 본 발명자들에 의해 수행된 예의 연구에 따라 완성되었다.

즉, 본 발명은 하기에 관한 것이다:

(1) 하기 단계들을 포함하는, 하기 일반식 (1)로 표시되는 무기네산의 제조 방법:

(식 중, R¹ 은 수소 원자 또는 히드록실기를 나타내고, R² 는 수소 원자 또는 히드록실기를 나타내고, R³ 은 히드록실기 또는 아미노기를 나타냄);

하기 일반식 (2)로 표시되는 화합물의 비닐기의 산화 절단:

(식 중, R¹ 은 상기 정의된 바와 같고, R⁴ 는 수소 원자 또는 카르복실기의 보호기를 나타내고, R⁵ 는 아미노기의 보호기를 나타냄), 및 아제티딘-2-카르복실산과의 환원 아미노화 반응을 동시에 수행하여 하기 일반식 (3)으로 표시되는 화합물을 수득하는, 단계 1:

(식 중, R¹, R⁴ 및 R⁵ 는 상기 정의된 바와 같음);

일반식 (3)으로 표시되는 화합물의 카르복실기를 보호기로 보호하고, 상기 아미노기의 보호기를 제거하여 하기 일반식 (4)로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 수득하는, 단계 2:

(식 중, R¹ 및 R⁴ 는 상기 정의된 바와 같고, R⁶ 은 카르복실기의 보호기를 나타냄);

하기 일반식 (5)로 표시되는 알데히드:

(식 중, R² 는 상기 정의된 바와 같고, R⁷ 은 카르복실기의 보호기를 나타내고, R⁸ 은 -OR⁹ (이때 R⁹ 는 히드록실기의 보호기를 나타냄) 또는 -NHR¹⁰ (이때 R¹⁰ 은 아미노기의 보호기를 나타냄)을 나타냄)와 상기 일반식 (4)로 표시되는 화합물과의 환원 아미노화 반응을 수행하여 하기 일반식 (6)으로 표시되는 화합물을 수득하는, 단계 3:

(식 중, R¹, R², R⁴, R⁶, R⁷ 및 R⁸ 은 상기 정의된 바와 같음); 및

상기 일반식 (6)으로 표시되는 화합물의 카르복실기의 보호기 및 히드록실기 또는 아미노기의 보호기를 제거하는, 단계 4;

(2) 하기 일반식 (3-1)로 표시되는 화합물:

(식 중, R¹ 은 수소 원자 또는 히드록실기를 나타내고, Boc 은 tert-부톡시카르보닐기를 나타냄); 및

(3) 하기 일반식 (4-1)로 표시되는 화합물:

(식 중, R¹ 은 수소 원자 또는 히드록실기를 나타내고, Et 는 에틸기를 나타냄).

발명의 효과

본 발명의 무기네산의 제조 방법에 따라, 저가 반응 시약을 사용하여 무기네산을 제조하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 무기네산의 제조 방법에 따라, 출발 물질에서부터 반응 시약들을 단지 순차적으로 첨가함에 의해, 최종 목표 물질의 관능기가 보호기로 보호된, 보호된 유도체를 수득하는 것이 가능하다. 그 결과, 정제는 단지 전체 단계 중 간단한 1 회의 공정으로 수행된다. 따라서, 본 발명에 따라, 무기네산이 단시간 내에 용이하게 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법의 주요한 특징으로서, 대부분의 반응을 원-포트(one-pot) 반응으로서 수행함에도 불구하고, 매우 고수율로 목표 무기네산을 수득하는 것이 가능하다. 본 발명의 무기네산의 제조 방법에 기여하는 전체 단계의 가속화 및 제조 공정의 간소화는 저비용으로 무기네산을 대량으로 공급하는데 큰 이점을 제공한다. 본 발명의 무기네산의 제조 방법에 기초한 전체 제조 공정의 실제적 추정에 따르면, 아마 현재 시판되는 것들과 비교하여 저렴하다.

발명을 실시하기 위한 최선의 양식

본 발명은 2'-데옥시무기네산, 3-히드록시무기네산 및 3-에피히드록시무기네산과 같은 무기네산, 및 니코티안아민 또는 2"-히드록시니코티안아민과 같은 이들의 전구체의 신규한 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에서, R⁴, R⁶ 또는 R⁷ 로 표시되는 "카르복실기의 보호기" 의 예로는 에스테르 잔기가 포함되고, 상기 에스테르 잔기의 예로는 C_1-6 선형, 분지형 또는 시클릭 저급 알킬기, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-헥실, 또는 시클로헥실; 아르알킬기, 예컨대 벤질, p-니트로벤질, o-니트로벤질, m-니트로벤질, 2,4-디니트로벤질, p-클로로벤질, p-브로모벤질, 또는 p-메톡시벤질; 및 저급 지방족 아실옥시메틸기, 예컨대 아세톡시메틸, 아세톡시에틸, 프로피오닐옥시메틸, n-부틸릴옥시메틸, 이소부틸릴옥시메틸, 또는 피발로일옥시메틸이 포함된다. 상기 카르복실기의 보호기는 바람직하게는 저급 알킬기이고, 특히 바람직하게는 에틸 또는 tert-부틸이다.

본 발명에서, R⁵ 또는 R¹⁰ 으로 표시되는 "아미노기의 보호기" 의 예로는 알콕시카르보닐기, 예컨대 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐, 또는 tert-부톡시카르보닐 (이하 Boc 으로 약어화); 알케닐옥시카르보닐기, 예컨대 비닐옥시카르보닐; 아르알킬옥시카르보닐기, 예컨대 벤질옥시카르보닐 (이하 Cbz 로 약어화) 또는 9-플루오레닐메톡시카르보닐; 치환 또는 비치환 아르알킬기, 예컨대 벤질 또는 4-메톡시벤질; 아실기, 예컨대 포르밀, 아세틸, 트리플루오로아세틸, 또는 벤조일; 아릴술포닐기, 예컨대 p-톨루엔술포닐 또는 벤젠술포닐; 및 알킬술포닐기, 예컨대 메탄술포닐이 포함된다. 상기 아미노기의 보호기는 특히 바람직하게는 Boc 또는 Cbz 이다.

본 발명에서, R⁹ 로 표시되는 "히드록실기의 보호기" 의 예로는 C_1-6 선형 또는 분지형 저급 알킬기, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 또는 n-헥실; 트리알킬실릴기, 예컨대 트리메틸실릴, 트리에틸실릴, tert-부틸디메틸실릴; 아세탈형 보호기, 예컨대 테트라히드로피란-2-일, 메톡시메틸, 또는 메톡시에톡시메틸; 알콕시카르보닐기, 예컨대 tert-부톡시카르보닐; 및 아르알킬기, 예컨대 벤질이 포함된다. 상기 히드록실기의 보호기는 바람직하게는 저급 알킬기이고, 특히 바람직하게는 tert-부틸이다.

본 발명의 무기네산의 제조 방법은 하기 단계 1 내지 4 를 포함한다:

(식 중, 모든 기호는 상기 정의된 바와 같음).

각각의 단계는 하기에 상세하게 기술될 것이다.

(1) 단계 1

단계 1 에서, 원료 물질로서 일반식 (2)로 표시되는 화합물 (이하 화합물 (2)로서 약어화)은 바람직하게는, 예를 들어, 아미노기가 보호기로 보호된, Boc-L-알릴글리신 또는 Cbz-L-알릴글리신, 또는 이의 카르복실기가 보호기로 보호된, 화합물이다. 상기 언급된 Boc-L-알릴글리신 또는 Cbz-L-알릴글리신은 [PROTECTIVE GROUPS in ORGANIC SYNTHESIS (저자 T.W. Green; P.G.M. Wuts)]에 기술된 방법에 따라, 시판되는 L-알릴글리신을 사용하여 용이하게 제조될 수 있다. 또한, Boc-L-알릴글리신 또는 Cbz-L-알릴글리신의 시판되는 시약 또한 바람직하게 사용될 수 있다.

단계 1 에서, 화합물 (2)는 산화 절단되고, 동시에, 아제티딘-2-카르복실산과의 환원 아미노화 반응이 수행된다. 산화 절단은 바람직하게는, 예를 들어, 오존, 과망간산염, RuCl₃ 또는 OsO₄-NaIO₄ 를 사용하여 수행되며, 오존을 사용한 산화 절단이 더욱 바람직하다. 오존을 사용한 산화 절단은 바람직하게는, 예를 들어, 오존 기체를 화합물 (2)를 용매 중에 용해시킨 용액 내로 발포 (버블링)함에 의해 수행된다. 상기 용매의 예로는 유기 용매, 예컨대 메탄올, 디클로로메탄, 또는 에틸 아세테이트가 포함된다. 오존을 사용한 산화 절단의 완결시에, 오존이 상기 용액 중에 포화될 때, 상기 용액은 청색으로 변한다. 따라서 용액의 색이 청색으로 변할 때까지 오존 기체의 버블링을 수행하는 것이 바람직하다. 오존 기체의 버블링은 바람직하게는 약 -100 내지 -50 ℃ 의 저온에서 수행된다. 오존 기체는 오존 기체 발생기 등에 의해 발생될 수 있다. 오존 기체의 버블링 후 과량의 오존을 제거하기 위해, 바람직하게는 예를 들어, 산소, 질소 또는 아르곤 기체를 상기 용액의 청색이 사라질 때까지 상기 용액 내로 버블링한다.

산화 절단과 동시에 수행되는 아제티딘-2-카르복실산과의 환원 아미노화 반응은 바람직하게는 환원제의 존재 하에서 수행된다. 상기 환원제는 바람직하게는 나트륨 시아노보로히드라이드 또는 트리아세톡시 나트륨 보로히드라이드이다. 환원 아미노화 반응에서 pH 는 통상적으로 약 4 내지 7 이고, 더욱 바람직하게는 약 6 내지 7 이다. 또한, 상기 환원 아미노화 반응은 통상적으로 냉각 또는 가온 하에서, 바람직하게는 실온에서, 교반하면서, 약 1 내지 2 시간 동안 수행된다. 아제티딘-2-카르복실산의 비는 바람직하게는 화합물 (2)의 1 mol 을 기준으로 약 1 mol 이다 (상기 합성의 이점은 몰비 1:1 에서 고수율을 수득하는 것이다). 또한, 화합물 (2)의 1 mol 에 대한 상기 환원제의 비는 바람직하게는 약 1 내지 2 mol 범위 내이고, 더욱 바람직하게는 약 1.1 내지 1.5 mol 이다.

L-아제티딘-2-카르복실산으로서, 바람직하게는 시판되는 시약이 사용될 수 있다.

일반식 (3)으로 표시되는 화합물 (이하 화합물 (3)으로서 약어화)이 상기 단계 1 에 의해 수득될 수 있다.

화합물 (3)은 바람직하게는 일반식 (3-1) 또는 (3-2)로 표시되는 화합물이다 (이하 각각, 화합물 (3-1) 및 화합물 (3-2)으로서 약어화):

(식 중, R¹ 은 상기 정의된 바와 같음).

(2) 단계 2

단계 2 에서, 일반식 (4)로 표시되는 화합물 (이하 화합물 (4)로서 약어화) 또는 이들의 염은 화합물 (3)의 카르복실기를 보호기로 보호하고, 아미노기의 보호기를 제거함에 의해 수득될 수 있다. 카르복실기의 보호기로의 보호화 반응은 알콜을 사용하는 탈수 축합 반응을 포함한다. 상기 반응에서 사용되는 알콜의 예로는 메탄올, 에탄올 및 tert-부탄올이 포함된다. 단계 2 에서, 아미노기의 보호기의 제거 반응 (이하 탈보호로서 약어화)은 보호기의 유형에 따라 산 또는 염기를 사용하는 방법, 또는 촉매 환원 방법을 적절하게 선택하여 수행하는 것이 가능하다. 상기 탈보호 반응은 통상적으로 냉각 또는 가열 하에서 수행되고, 반응 시간은 바람직하게는 약 30 분 내지 24 시간이고, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 18 시간이다. 또한, 산을 사용한 Boc 기의 제거에서의 반응 온도는 바람직하게는 약 0 ℃ 내지 실온이다.

예를 들어, Boc 이 아미노기의 보호기로서 작용하는 경우, 탈보호는 바람직하게는 강한 산성 조건 하에서, 예를 들어, 트리플루오로아세트산 또는 염산-테트라히드로푸란 용액 중에서 수행된다. 더욱 구체적으로, 화합물 (3)은 바람직하게는 염산-에탄올 용액과 반응한다. 상기 반응은, 예를 들어, 얼음 냉각 하에서, 약 30 분 내지 5 시간 동안 교반, 그 후 실온에서, 약 1 내지 24 시간 동안 교반에 의해 수행될 수 있다. 상기 염산/에탄올 용액 (이하 에탄올 염산으로 약어화)은, 예를 들어, 아세틸 클로라이드를 과량의 에탄올에 첨가하여 제조될 수 있다. 에탄올의 부피는, 예를 들어, 아세틸 클로라이드의 부피의 약 20 내지 50 배이고, 더욱 바람직하게는 약 15 내지 40 배이다. 대안적으로는, 이는 또한 염산 기체를 에탄올에 버블링함에 의해 제조될 수 있다. 사전에 계량된 에탄올의 중량을 염산 기체의 버블링 후 에탄올의 중량과 비교하여 염산의 용해량을 결정하는 것이 가능하다. 상기 반응 후, 반응 혼합물은, 예를 들어, 진공 농축되고, 용매는 바람직하게는 톨루엔의 첨가에 의해 공비 증류로 증류된다. 또한, 공비 증류 후, 상기 반응 혼합물을 바람직하게는 진공 펌프를 사용하여 흡인에 의해 건조시켜, 화합물 (3)의 카르복실기는 보호기로 보호되고, 동시에, 아미노기의 보호기는 제거된, 화합물 (4)의 히드로클로라이드인, 일반식 (4-1)을 수득한다:

(식 중, R¹ 은 상기 정의된 바와 같음).

또한, 아미노기의 보호기가 벤질옥시카르보닐기 (이하 Cbz 로 약어화)인 경우, 탈보호는 바람직하게는, 예를 들어, 팔라듐 촉매화 수소화 반응 및 버치(Birch) 반응에 의해 수행된다.

(3) 단계 3

단계 3 에서, 일반식 (5)로 표시되는 알데히드 (이하 알데히드 (5)로서 약어화)의 환원 아미노화 반응은 단계 2 에서 수득된 화합물 (4)를 사용하여 수행된다. 상기 환원 아미노화 반응은 유기 용매 중에서, 화합물 (2)의 환원 아미노화 반응과 유사하게 환원제 존재 하에서 수행하는 것이 가능하다. 상기 유기 용매의 예로는 메탄올, 에탄올 및 디메틸포름아미드가 포함된다. 알데히드 (5)는, 예를 들어, [Nishimaru, T. 등 Peptide Science 2006, 42, 263-266]에 기술된 방법, 또는 이의 유사 방법에 따라 용이하게 제조된다. 환원 아미노화 반응으로부터 수득된 반응 혼합물은 일반식 (6)으로 표시되는 화합물 (이하 화합물 (6)으로서 약어화)을 함유한다. 상기 반응 혼합물로부터의 화합물 (6)의 단리 또는 정제가 바람직하다. 상기 단리 또는 정제는 통상적으로 공지된 방법, 예를 들어, 유기 용매, 예컨대 에틸 아세테이트, 클로로포름 또는 디클로로메탄을 이용한 추출, 및 담체로서 실리카겔을 이용한 크로마토그래피를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 통상적으로 공지된 방법들은 단독 또는 조합으로 수행될 수 있다.

(4) 단계 4

단계 4 에서, 화합물 (6)의 카르복실기의 보호기 및 히드록실기 또는 아미노기의 보호기의 제거 (탈보호) 반응은 보호기의 유형에 따라 산 또는 염기를 사용하는 방법, 또는 촉매 환원 방법을 적절하게 선택하여 수행하는 것이 가능하다. 산성 방법의 경우, 산은 보호기의 유형 및 기타 조건들에 따라 달라지고, 이의 예로는 무기 산, 예컨대 염산, 브롬화 수소, 불화 수소, 요오드화 수소, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, 황산, 또는 인산; 유기 산, 예컨대 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 또는 프로피온산; 및 산성 이온 교환 수지가 포함된다. 염기를 사용하는 방법의 경우, 염기는 보호기의 유형 및 기타 조건들에 따라 달라지고, 이의 예로는 무기 염기, 예컨대 알칼리 금속, 예컨대 나트륨 및 칼륨의 히드록시드 및 카르보네이트, 및 알칼리 토금속, 예컨대 칼슘 또는 마그네슘의 히드록시드 및 카르보네이트; 유기 염기, 예컨대 금속 알콕시드 유도체, 유기 아민 유도체, 또는 4차 암모늄 염; 및 염기성 이온 교환 수지가 포함된다. 용매가 산 또는 염기를 사용하는 방법에서 사용되는 경우, 예를 들어, 물, 메탄올, 에탄올, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 테트라히드로푸란, 디옥산, 피리딘, 아세트산, 아세톤, 및 메틸렌 클로라이드가 단독 또는 조합으로 사용될 수 있다. 또한, 금속 및 산을 사용하는 방법의 경우, 물 및 아세톤이 종종 용매로서 이용된다. 그러나, 산이 액체 상태인 경우, 산 그 자체가 또한 용매로서 사용될 수 있다. 산 또는 염기를 사용하는 반응은 통상적으로 냉각 또는 가열 하에서 수행되고, 반응 시간은 약 30 분 내지 20 시간이고, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 10 시간이다. 또한, 반응 온도는 바람직하게는 약 0 ℃ 에서 출발하여 점차 실온까지 증가된다. 화합물 (6)의 카르복실기의 보호기 및 히드록실기 또는 아미노기의 보호기의 탈보호는 바람직하게는 산, 예를 들어, 염산을 사용하는 방법, 및 더욱 바람직하게는 약 4 내지 6 N 염산 및 1N 수산화나트륨를 사용하는 방법에 의해 수행된다.

탈보호 반응 후, 일반식 (1)로 표시되는 화합물은 반응 혼합물로부터 단리 또는 정제된다. 상기 단리 또는 정제는 통상적으로 공지된 방법, 예를 들어, 액체 크로마토그래피 또는 재결정화를 사용하여 수행될 수 있다. 액체 크로마토그래피에는 이온 교환 크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 및 겔 투과 크로마토그래피가 포함되고, 상기와 같은 크로마토그래피(들)은 단독 또는 조합으로 수행될 수 있다.

단계 1 에서, 원료 물질로서, 화합물 (2)의 R¹ 이 수소 원자인 화합물로부터, 하기 반응식에 따라, 화합물 (2)의 R¹ 이 히드록실기인 화합물을 제조하는 것이 가능하다:

(식 중, RX 는 할로겐화 알킬을 나타내고, R⁵ 는 상기 정의된 바와 같음).

우선, 일반식 (2-1)로 표시되는 화합물 (예를 들어, Boc-L-알릴글리신 또는 Cbz-L-알릴글리신; 이하 화합물 (2-1)로서 약어화)을 용매 중에 용해시키고, 알킬 할라이드를 염기 존재 하에서, 화합물 (2-1)과 반응시켜, 카르복실기를 보호기로 보호화한다. 상기 용매의 예로는 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 및 디옥산이 포함된다. 상기 염기는 바람직하게는 탄산칼륨이다. 화합물 (2-1) 대 염기, 예컨대 탄산칼륨의 비에 관해서는, 염기의 양은 화합물 (2-1)의 1 mol 을 기준으로, 바람직하게는 약 2 내지 5 mol 이고, 더욱 바람직하게는 3 내지 4 mol 이다. 상기 예시된 바와 같은 카르복실기의 보호기로부터 선택되는 할로겐화 알킬의 알킬기가 이용되는 경우, 탈보호 및 재보호의 수행이 요구되지 않는다. 상기와 같은 알킬기를 갖는 알킬 할라이드의 예로는 알킬 요오다이드 화합물, 예컨대 메틸 요오다이드, 에틸 요오다이드, n-프로필 요오다이드, 이소프로필 요오다이드, n-부틸 요오다이드, 이소부틸 요오다이드, 또는 시클로헥실 요오다이드가 포함된다. 화합물 (2-1) 대 알킬 할라이드의 비에 관해서는, 알킬 할라이드의 양은 화합물 (2-1)의 1 mol 을 기준으로, 바람직하게는 약 1.1 내지 1.5 mol 이다. 반응 온도는 바람직하게는 냉각 하 실온에서 가열까지이다. 반응 시간은 통상적으로 약 30 분 내지 8 시간이고, 바람직하게는 약 1 내지 3 시간이다. 반응의 완결 후, 물 등을 상기 반응 혼합물에 첨가하고, 보호기로 보호된 카르복실기를 갖는 화합물을 바람직하게는 비극성 용매 (예를 들어, 에테르, 헥산, 등)로 1 번 내지 수차례 추출하는 것이 바람직하다. 보호기로 보호된 카르복실기를 갖는 화합물 (2-1)은 추출된 비극성 용매를 수집, 이어서 탈수제, 예컨대 마그네슘 술페이트를 사용하여 탈수, 여과 등을 통해 탈수제의 제거 및 여과액의 추가 농축 및 추출 용매의 증류를 통해 수득될 수 있다. 상기 추출 용매는 통상적으로 공지된 방법, 예를 들어, 진공 증류를 사용하여 증류될 수 있다.

다음으로, 상기 수득된 화합물을 바람직하게는 용매 중에 용해시킨 후, 산화시킨다. 상기 용매의 예로는 유기 용매, 예컨대 1,2-디클로로에탄, 메틸렌 클로라이드, t-부탄올, 디옥산, 톨루엔, 및 트리클로로에탄이 포함된다. 산화는 셀레늄 디옥시드 존재 하에서, 산화제, 예를 들어 tert-부틸퍼옥시드 또는 과산화수소를 사용하여 수행될 수 있다. 셀레늄 디옥시드의 촉매량의 예로는, 예를 들어, 화합물 (2-1)의 1 mol 을 기준으로, 약 0.5 내지 0.95 mol 의 셀레늄 디옥시드이다. 상기 산화제의 양은 화합물 (2-1)의 1 mol 을 기준으로, 바람직하게는 약 2 내지 5 mol 범위 내이고, 더욱 바람직하게는 약 2.5 내지 4 mol 이다. 산화는 바람직하게는 가열 하에서, 약 50 내지 90 ℃ 의 바람직한 온도에서, 및 더욱 바람직하게는 약 60 내지 70 ℃ 에서 수행된다. 산화의 반응 시간은 약 1 내지 24 시간이고, 바람직하게는 약 5 내지 10 시간이다. 반응 후 후처리는 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다. 즉, 탄산수소나트륨 또는 수산화나트륨의 수용액을 상기 반응 용액에 첨가한 후, 유기 용매, 예컨대 에틸 아세테이트, 에테르, 디클로로메탄 또는 클로로포름을 첨가하고, 추출을 1 번 내지 수차례 수행한다. 추출물을 수집하고, 탈수제, 예컨대 마그네슘 술페이트로 건조시킨다. 건조 후, 탈수제를 여과에 의해 제거하고, 여과액을 진공 농축에 의해 농축시킨 후, 용매를 증류하여, 생성물 (7)을 수득한다. 상기 수득된 생성물 (7)은 바람직하게는 컬럼 크로마토그래피 등으로 정제된다.

상기 방법으로, 무기네산, 예컨대 무기네산, 2'-데옥시무기네산, 3-히드록시무기네산 또는 3-에피히드록시무기네산 및 이들의 전구체, 예컨대 니코티안아민 또는 2"-히드록시니코티안아민을 고수율로 제조하는 것이 가능하다.

도 1 은 천연 무기네산의 활성과 비교하여, 철분 착물 수송체의 기질로서의 무기네산의 2'-히드록시기의 S 이성질체 (천연 형태), 무기네산의 2'-히드록시기의 R 이성질체 및 2'-데옥시무기네산의 활성의 결과를 나타낸다.

본 발명을 하기 실시예의 방법으로 더욱 상세하게 기술할 것이나, 이로써 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.

실시예 1: Boc-L-알릴글리신으로부터 화합물 (3-3)의 제조

1 g (4.7 mmol)의 Boc-L-알릴글리신을 메탄올 (15 ml) 중에 용해시키고, 이어서 -78 ℃ 에서, 오존 기체로 버블링하였다. 상기 용액의 색이 청색으로 변할 때까지 버블링한 후, 청색이 사라질 때까지 산소를 버블링하였다. 실온까지 회복시킨 후, 475 mg (4.7 mmol)의 L-아제티딘-2-카르복실산 및 296 mg (4.7 mmol)의 나트륨 시아노보로히드라이드를 첨가하고, 이이서 1 시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물의 진공 농축 후, 1.3 g 의 화합물 (3-3) (수율: 90%)을 실리카겔을 사용하여 숏 패스(short-pass) 실리카겔 크로마토그래피 (나트륨 시아노보로히드라이드의 잔류물 및 L-알릴글리신으로부터 유래한 소량의 부산물을 이동상: 에틸 아세테이트:메탄올= 9:1 (v/v)의 혼합물 용액을 사용하여 제거한 후, 메탄올 용액을 통과시킴)에 의해 수득하였다.

실시예 2: 화합물 (3-3)으로부터 화합물 (6-1)의 제조

300 mg (1 mmol)의 화합물 (3-3)을 0 ℃ 에서, 15 ml 의 10% (v/v) 에탄올 염산 (아세틸 클로라이드 및 에탄올로부터 제조함) 중에 용해시키고, 이어서 실온 에서 밤새 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 진공 농축시키고, 톨루엔 공비혼합물로 건조시킨 후, 진공 펌프를 사용하여 혼합물이 건조될 때까지 흡인하였다. 상기 생성된 히드로클로라이드를 4 ml 의 메탄올 중에 용해시키고, 250 mg (1.1 mmol)의 식 (5-1) 로 표시되는 알데히드 (이하 알데히드 (5-1)로서 약어화):

및 70 mg (1.1 mmol)의 나트륨 시아노보로히드라이드를 순차적으로 첨가하고, 이어서 약 2 시간 동안 교반하였다. 탄산수소나트륨 포화 수용액을 상기 반응 혼합물에 첨가하고, 상기 혼합물을 에틸 아세테이트로 2 번 추출하였다. 추출물을 수집하고, 마그네슘 술페이트 무수물 상에서 건조, 여과한 후, 진공-농축시켜, 유성 물질을 수득하였다. 수득한 물질을 숏 패스 실리카겔 크로마토그래피 (이동상: 헥산:에틸 아세테이트= 2:1 (v/v)에서 에틸 아세테이트)로 정제하여, 372 mg 의 화합물 (6-1)을 무색 유성 물질 (수율 79%)로서 수득하였다.

실시예 3: 화합물 (6-1)로부터 2'-데옥시무기네산의 제조:

300 ml (0.6 mmol)의 화합물 (6-1)을 10 ml 의 6 N 염산과 함께 첨가하고, 이어서 약 15 시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물의 진공 농축 후, 10 ml 의 1 N 수산화나트륨 수용액을 첨가하고, 15 시간 동안 교반 후, 상기 반응 혼합물을 1 N 염산으로 중화하였다. 상기 반응 혼합물의 진공 농축 후, 미정제 2'-데옥시무기네산의 히드로클로라이드를 수득하였다. 상기 히드로클로라이드를 약 5 ml 의 물 중에 용해시키고, Dowex 50Wx8 이온 교환 수지로 처리하고, 암모니아수로 용리하여, 2'-데옥시무기네산의 암모늄 염의 용액을 수득하였다. 상기 용액을 진공 탈수시켜, 180 mg 의 미정제 2'-데옥시무기네산을 수득하였다. 상기 미정제 2'-데옥시무기네산을 물-메탄올-에탄올로부터 결정화하여, 2'-데옥시무기네산을 수득하였다. 수득한 2'-데옥시무기네산의 비선광도(specific rotation) 및 ¹H NMR, ¹³C NMR, 및 MS 를 포함하는 각종 스펙트럼은 천연 생성물 (Nomoto, K. Chemia, (1981), 7, p249)의 값들과 일치하였다.

실시예 4: Boc-L-알릴글리신으로부터 화합물 (3-3)의 제조

1.6g (7.4 mmol)의 Boc-L-알릴글리신을 메탄올 (25 ml) 중에 용해시키고, 이어서 -78 ℃ 에서, 오존 기체로 버블링하였다. 상기 용액의 색이 청색으로 변할 때까지 버블링한 후, 청색이 사라질 때까지 산소를 버블링하였다. 실온까지 회복시킨 후, 752 mg (7.4 mmol)의 L-아제티딘-2-카르복실산 및 470 mg (7.4 mmol) 의 나트륨 시아노보로히드라이드를 첨가하고, 이어서 1 시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물의 진공 농축 후, 2.1 g 의 화합물 (3-3) (수율 93%)을 실리카겔을 사용하여 숏 패스(short-pass) 실리카겔 크로마토그래피 (나트륨 시아노보로히드라이드의 잔류물 및 L-알릴글리신으로부터 유래한 소량의 부산물을 이동상: 에틸 아세테이트:메탄올= 5:1 (v/v)의 혼합물 용액을 사용하여 제거한 후, 메탄올 용액을 통과시킴)에 의해 수득하였다.

실시예 5: Boc-L-알릴글리신으로부터 화합물 (3-4)의 제조

670 mg (3.1 mmol)의 Boc-L-알릴글리신을 10 ml 의 디메틸포름아미드 중에 용해시키고, 1.3 g (9.1 mmol)의 탄산칼륨 및 0.32 ml (4.1 mmol)의 에틸 요오다이드를 순차적으로 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하고, 물을 첨가하고, 에테르로 2 번 추출하였다. 추출물을 수집하고, 마그네슘 술페이트 상에서 건조, 여과한 후, 진공-농축시켜, 에틸 에스테르 유도체의 미정제 생성물을 수득하였다. 상기 미정제 생성물을 20 ml 의 1,2-디클로로에탄 중에 용해시키고, 320 mg (2.9 mmol)의 셀레늄 디옥시드 및 2 ml (11.6 mmol)의 5.5 M tert-부틸퍼옥시드를 첨가하고, 이어서 70 ℃ 에서 8 시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물에 탄산수소나트륨 용액을 첨가하고, 에틸 아세테이트로 2 번 추출하였다. 추출물을 수집하고, 마그네슘 술페이트 상에서 건조, 여과한 후, 진공-농축시켜, 생성물 (7-1)을 수득하였다. 상기 수득한 미정제 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 400 mg 의 생성물 (7-1)을 유성 물질 (수율: 55%)로서 수득하였다. 상기 수득한 생성물 (7-1)을 실시예 4 에서와 같은 동일한 방법으로 처리하여, 화합물 (3-4) (수율: 80%)를 수득하였다.

실시예 6: 화합물 (3-3)으로부터 화합물 (6-1)의 제조

1.7 g (5.6 mmol)의 화합물 (3-3)을 0 ℃ 에서 냉각된 140 ml 의 에탄올 염산 (4 ml 의 아세틸 클로라이드 및 160 ml 의 에탄올로부터 제조함)과 함께 첨가하고, 이어서 0 ℃ 에서 2 시간 동안 교반하고, 실온에서 밤새 추가 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 진공 농축시키고, 톨루엔 공비혼합물로 건조시킨 후, 진공 펌프를 사용하여 혼합물이 건조될 때까지 흡인하였다. 상기 생성한 히드로클로라이드를 30 ml 의 메탄올 중에 용해시키고, 1.3 g (5.6 mmol)의 알데히드 (5-1) 및 354 mg (5.6 mmol)의 나트륨 시아노보로히드라이드를 순차적으로 첨가하고, 이어서 약 5 시간 동안 교반하였다. 탄산수소나트륨 포화 수용액을 상기 반응 혼합물에 첨가하고, 에틸 아세테이트로 3 번 추출하였다. 추출물을 수집하고, 마그네슘 술페이트 무수물 상에서 건조, 여과한 후, 진공-농축시켜, 유성 물질을 수득하였다. 상기 물질을 숏 패스 실리카겔 크로마토그래피 (이동상: 헥산:에틸 아세 테이트= 2:1 (v/v) 에서 에틸 아세테이트)로 정제하여, 1.8 g 의 화합물 (6-1)을 무색 유성 물질 (수율: 68%)로서 수득하였다.

실시예 7: 화합물 (3-4)로부터 화합물 (6-2)의 제조

170 mg (0.49 mmol)의 화합물 (3-4)를 0 ℃ 에서 냉각된 10.2 ml 의 에탄올 염산 (0.2 ml 의 아세틸 클로라이드 및 10 ml 의 에탄올로부터 제조함)과 함께 첨가하고, 이어서 0 ℃ 에서 2 시간 동안 교반하고, 실온에서 밤새 추가 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 진공 농축시키고, 톨루엔 공비혼합물로 건조시킨 후, 진공 펌프를 사용하여 혼합물이 건조될 때까지 흡인하였다. 상기 생성한 히드로클로라이드를 30 ml 의 메탄올 중에 용해시키기고, 113 mg (0.49 mmol)의 알데히드 (5-1) 및 31 mg (0.49 mmol)의 나트륨 시아노보로히드라이드를 순차적으로 첨가하고, 이어서 약 5 시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 진공 농축시킨 후, 숏 패스 실리카겔 크로마토그래피 (이동상: 헥산:에틸 아세테이트= 2:1 (v/v) 에서 에틸 아세테이트)로 정제하여, 193 mg 의 화합물 (6-2)를 무색 유성 물질 (수율: 81%)로서 수득하였다.

실시예 8: Boc-L-알릴글리신으로부터 화합물 (6-1)의 원-포트 제조

400 mg (1.9 mmol)의 Boc-L-알릴글리신을 메탄올 (15 ml) 중에 용해시키고, 이어서 -78 ℃ 에서, 오존으로 버블링하였다. 상기 용액의 색이 청색으로 변할 때까지 버블링한 후, 청색이 사라질 때까지 산소를 버블링하였다. 188 mg (1.9 mmol)의 L-아제티딘-2-카르복실산 및 117 mg (1.9 mmol)의 나트륨 시아노보로히드라이드를 첨가하고, 이어서 실온까지 회복시 2 시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물의 진공 농축 후, 0 ℃ 에서 냉각시킨 40 ml 의 에탄올 염산 (아세틸 클로라이드 1.6 ml 및 에탄올 40 ml 로부터 제조함)을 첨가하고, 이어서 0 ℃ 에서 2 시간 동안 교반하고, 실온에서 밤새 추가 교반한 후, 진공 농축, 톨루엔 공비혼합물 및 진공 펌프에 의해 건조시켰다. 상기 생성된 히드로클로라이드를 20 ml 의 메탄올 중에 용해시키고, 428 mg (1.9 mmol)의 알데히드 (5-1) 및 120 mg (1.9 mmol)의 나트륨 시아노보로히드라이드를 순차적으로 첨가하고, 이어서 약 5 시간 동안 교반하였다. 탄산수소나트륨 포화 수용액을 상기 반응 혼합물에 첨가하고, 이어서 에틸 아세테이트로 3 번 추출하였다. 추출물을 수집하고, 마그네슘 술페이트 무수물 상에서 건조, 여과한 후, 진공-농축시켜, 유성 물질을 수득하였다. 상기 물질을 숏 패스 실리카겔 크로마토그래피 (이동상: 헥산:에틸 아세테 이트= 2:1 (v/v) 에서 에틸 아세테이트 (0.1% 트리에틸아민 첨가))로 정제하여, 480 mg 의 화합물 (6-1)을 무색 유성 물질 (수율: 55%)로서 수득하였다.

실시예 9: 화합물 (6-1)로부터 2'-데옥시무기네산의 제조

300 mg (0.6 mmol)의 화합물 (6-1)을 0 ℃ 에서 10 ml 의 6 N 염산과 함께 첨가하고, 이어서 실온에서 약 10 시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물의 진공 농축 후, 15 ml 의 1 N 수산화나트륨 수용액을 첨가하고, 이어서 10 시간 동안 교반하였다. 1 N 염산으로 중화 후, 상기 반응 혼합물을 진공-농축시켜, 미정제 2'-데옥시무기네산의 히드로클로라이드를 수득하였다. 상기 수득한 히드로클로라이드를 약 5 ml 의 물 중에 용해시키고, Dowex 50Wx8 이온 교환 수지로 처리한 후, 암모니아수로 용리하여, 2'-데옥시무기네산의 암모늄 염의 용액을 수득하였다. 상기 용액을 진공 탈수시켜, 180 mg 의 미정제 2'-데옥시무기네산 (수율: 100%)을 수득하였다. 상기 미정제 2'-데옥시무기네산을 물-메탄올-에탄올로부터 결정화하여, 120 mg 의 2'-데옥시무기네산 (수율: 66%)을 수득하였다. 수득한 2'-데옥시무기네산의 비선광도 및 ¹H NMR, ¹³C NMR, 및 MS 을 포함하는 각종 스펙트럼은 천연 생성물의 값들과 일치하였다 (Nomoto, K. Chemia, (1981), 7, p249).

실시예 10: 화합물 (6-2)으로부터 무기네산의 제조

100 mg (0.31 mmol)의 화합물 (6-2)를 0 ℃ 에서 10 ml 의 6N 염산과 함께 첨가하고, 이어서 실온에서 약 2 시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물의 진공 농축 후, 10 ml 의 1 N 수산화나트륨 수용액을 첨가하고, 이어서 10 시간 동안 교반하였다. 1N 염산으로 중화 후, 상기 반응 혼합물을 진공-농축시켜, 미정제 무기네산의 히드로클로라이드를 수득하였다. 상기 히드로클로라이드를 약 5 ml 의 물 중에 용해시키고, Dowex 50Wx8 이온 교환 수지로 처리한 후, 암모니아수로 용리하여, 무기네산의 암모늄 염의 용액을 수득하였다. 상기 용액을 진공에 적용시켜, 99 mg 의 미정제 무기네산을 수득하였다. 상기 수득한 분말을 물 3 ml 중에 용해시키고, DIANION HP20 (물로 용리)로 정제한 후, 다시 한번 동결-건조시켜, 95 mg 의 무기네산 (수율: 96%)을 수득하였다. ¹H NMR 및 MS 스펙트럼의 결과는 상기 수득한 무기네산이 천연 형태 무기네산 및 이의 2'-OH 입체이성질체의 혼합물임을 나타냈다.

실시예 11: 무기네산의 대안적인 제조 방법

실시예 5 에 따라서, 1.4 g (4.6 mmol)의 Cbz-L-알릴글리신 t-부틸 에스테르를 우선 화합물 (8) (수율: 55%)로 전환시키고, 이어서 550 mg 의 화합물 (8)을 580 mg (수율: 86%)의 화합물 (9)로 전환시켰다. 이어서 화합물 (9) 450 mg (1.1 mmol)을 메탄올 10 ml 중에 용해시키고, 80 mg 의 10% 팔라듐 탄소를 첨가하고, 수소 대기 중에서 1 시간 동안 교반하였다. 메탄올로 희석한 후, 이를 셀리트 여과에 의해 아민화하고, 진공 농축시켰다. 그 다음, 상기 진공 농축액을 15 ml 의 메탄올 중에 용해시키고, 66 μl 의 아세트산을 첨가한 후, pH 를 4 내지 6 범위 내로 조정하였다. 그 다음, 254 mg (1.1 mmol)의 알데히드 (5-1) 및 70 mg (1.1 mmol)의 나트륨 시아노보로히드라이드를 순차적으로 첨가하고, 이어서 약 5 시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 진공 농축시키고, 에틸 아세테이트/메탄올 (4:1 (v/v)) 용액을 사용하여, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 나트륨 시아노보로히드라이드 및 알데히드 잔류물의 제거 후, 화합물 (10)을 클로로포름/메탄올 (4:1 (v/v)) 용액, 이어서 클로로포름/메탄올 (2:1 (v/v)) 용액으로 용리하고, 용리액을 추가 증류하여, 480 mg 의 화합물 (10) (수율: 89%)을 수득하 였다.

200 mg (0.41 mmol)의 상기 수득한 화합물 (10)을 0 ℃ 에서 6 N 염산 중에 용해시키고, 약 2 시간 동안 교반한 후, 진공-농축시켜, 미정제 무기네산의 히드로클로라이드를 수득하였다. 상기 히드로클로라이드를 약 5 ml 의 물 중에 용해시키고, Dowex 50Wx8 이온 교환 수지로 처리한 후, 암모니아수로 용리하여, 무기네산의 암모늄 염의 용액을 수득하였다. 상기 용액을 진공 탈수시켜, 미정제 무기네산을 수득하였다. 상기 수득한 분말을 3 ml 의 물 중에 용해키고, DIANION HP20 (물로 용리)로 정제한 후, 다시 한번 동결-건조시켜, 125 mg 의 무기네산 (수율: 95%)을 수득하였다. ¹H NMR 및 MS 스펙트럼의 결과는 상기 수득한 무기네산이 천연 형태 무기네산 및 이의 2'-OH 입체이성질체의 혼합물임을 나타냈다.

실시예 12: 무기네산의 광학 분할

250 mg (0.51 mmol)의 실시예 11 에서 수득한 화합물 (10)을 10 ml 의 20% 아세토니트릴 수용액 (0.1% 아세트산 함유) 중에 용해시키고, 액체 크로마토그래피로 분획하였다. 액체 크로마토그래피의 조건은 하기와 같다:

컬럼: CAPCELLPAK C18-UG80 (5 μm) (Shiseido)

용리 속도: 9.999 ml/분

용리 조건: 35% CH₃CN-H₂O (1% 아세트산)

용리 시간: 부(minor): 14.0 분; 주(major): 16.3 분

주입 부피: 각각 200 μl

각각의 분획을 수집하고, 용매를 감압 하에서 증류하였다. 부 피크 및 주 피크의 각각의 건조된 물질을 6N HCl (20 ml) 중에 용해시키고, 이어서 실온에서 5 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 증류하고, 수득한 히드로클로라이드를 이온 교환 컬럼 (Dowex 50Wx8, 100-200 메시, H⁺ 형태)상에 옮기고, 5% NH₄OH 수용액으로 용리한 후, 동결-건조시켰다. 상기 수득한 분말을 물 중에 용해시키고, DIANION HP20 (물로 용리)로 정제한 후, 다시 한번 동결-건조시켰다. 부 피크로부터 정제한 물질의 수율은 20 mg 이었고, 반면 주 피크로부터 정제한 물질의 수율은 81 mg 이었다. 부 피크 및 주 피크로부터 정제한 물질의 각종 물리적 성질의 측정 값은 하기에 나타냈다.

(부 피크)

(주 피크)

비선광도를 제외하고, 부 피크 정제 물질 및 주 피크 정제 물질은 거의 동일하였다. 부 피크는 그의 배열이 목표 물질의 천연 형태와 동일한 무기네산 (2'-OH 의 S 이성질체)을 함유하고, 반면 주 피크는 2'-OH 의 R 이성질체를 함유한다는 것이 검증되었다. ¹H NMR 분석은 S 이성질체 대 R 이성질체의 몰비가 1:3 임을 나타냈다.

실시예 13: 합성 무기네산의 활성의 검증

실시예 12 에서 수득한 2'-OH 의 S 이성질체 (천연 형태) 및 R 이성질체, 실시예 9 에서 수득한 2'-데옥시 이성질체, 및 [Takagi, S. 등, Journal of Plant Nutrition, 1984, 7th volume, p469-477]에 기술된 방법의 의해 보리로부터 정제한 무기네산에 관하여, 이들의 철분 착물의 세포내 섭취는 무기네산-Fe 착물 수송체를 통해 실질적으로 발생한다는 것을 검증하였다.

(무기네산-Fe 착물 수송체를 발현하는 아프리카 발톱 개구리(African Clawed Frog) 난모세포의 제조)

[Murata, Y. 등, Plant Journal (Plant J), 2006, 46th volume, p.563-572]에 기술된 방법에 따라, 보리의 무기네산-Fe 착물 수송체를 코딩하는 유전자 HvYS1 (Plant J. 2006, vol. 46, 563-572)를 아프리카 발톱 개구리의 난모세포에 도입하였다. 더욱 구체적으로, HvYS1 cDNA (서열 번호 1 의 코딩 영역)를 pSP64Poly (A) 벡터 (Promega Corporation)의 XbaI 및 BamHI 부위에 삽입하고, 이를 사용하여, cRNA 를 Ambion Corporation 의 mMESSAGE mMACHINE 키트에 의해 제조하였다.

아프리카 발톱 개구리 (Hamamatsu Seibutsu Kyozai Ltd. 로부터 구입)의 복부를 절개하고, 난모세포 (Xenopus 난모세포)를 잘라내었다. 이어서, IA 형 콜라겐분해효소 (Sigma)를 이의 농도가 2 mg/mL 가 될 만큼 첨가하고, 난모세포를 OR-2 용액 (82.5 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl₂ 및 5 mM HEPES)을 함유한 원심분리 튜브에 옮기고, 실온에서 약 2 시간 동안 교반 후, OR-2 용액으로 3 번, 및 ND-96 용액 (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1.8 mM CaCl₂ 및 5 mM HEPES)으로 3 번 세정하였다. 50nL cRNA (50 μg/mL)를 디지털형 마이크로디스펜서 (Drummond SCIENTIFIC)로 아프리카 발톱 개구리의 난모세포에 주입하였다. 상기 난모세포를 ND-96 용액 중에서, 17 ℃ 에서, 48 내지 72 시간 동안 배양하였다.

(무기네산의 철분 착물의 제조)

각각 30 mM 의 2'-OH 의 S 이성질체, 2'-OH 의 R 이성질체, 2'-데옥시 이성질체 및 보리로부터 정제한 무기네산을 30 mM 의 염화제2철과 혼합하고, 실온에서 2 시간 동안 정치시킨 후, 철분 착물 농도가 5 mM 이 될 만큼 희석하였다.

(철분 섭취 활성의 비교)

무기네산-Fe 착물의 세포내 섭취를 난모세포 클램프 OC-725C (Warner Instrument)를 사용하여, 전기화학적 신호의 검출에 의해 측정하였다. 더욱 구체적으로, 무기네산-Fe 착물 수송체 HvYS1 를 발현하는 난모세포를 ND-96 용액으로 충전한 챔버에 세팅하고, 10 μl 의 5 mM 기질-Fe 착물 용액 (최종 농도 50 μM)을 상기 난모세포 상에 뿌리고, 전기 생리학적 활성을 측정하였다. 상기 난모세포를, 3M KCl 로 충전된 2 개의 미세전극으로, 실험 탱크의 전위가 0 V 에 고정된 모드로 막고, 고정된 전위, 60 mV 에서의 전류 값 변화를 측정하였다. 상기 데이타는 PowerLab 데이타-기록 장치 (Chart 4 software)를 사용하여 기록하였다.

상기 결과는 도 1 에 나타냈다. 2'-OH 의 S 이성질체, 2'-OH 의 R 이성질체 및 2'-데옥시 이성질체에 대해 측정한 전류 값의 크기 (전기 생리학적 활성)는 천연 무기네산에 대해 측정한 전기 신호의 크기 (전기 생리학적 활성)를 100% 로 설정했을 때의 상대 값으로 나타냈다. 2'-OH 의 S 이성질체, 2'-OH 의 R 이성질체 및 2'-데옥시 이성질체의 각 값은 천연 무기네산과 유사하였다. 원 포트 합성에 의해 수득한 무기네산과 유사하게, 상기 결과들은 합성 무기네산의 2'-OH 의 혼합된 배열, 및 2'-데옥시 이성질체 모두가 식물 내로의 철분 착물의 수송에 유용하다는 것을 제안한다.

본 발명의 방법은 저비용으로, EDTA 를 대체하는 킬레이트제로서 이용가능한 무기네산의 대량 제조에 유용하다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 무기네산은 식물의 철분 수송 메카니즘에 관한 연구, 및 각종 분야, 예컨대 건강 식품, 화장품 및 비료에서 이용될 수 있다.

(서열 목록)

<110> Suntory Limited <120> manufacturing method of mugineic acid <130> S07F2386 <150> JP2006-307397 <151> 2006-11-14 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2430 <212> DNA <213> Hordeum vulgare L. <220> <221> CDS <222> (169)..(2202) <223> HvYS1 <400> 1 taatctcacc gcaaaagcac acggttccag ctcgcctcgt gggcggaaac ggggaacgac 60 ttcctggaag ctgcggcctc cagtgattct tcttccacgg tacagtgatc agtcgaccac 120 tacgaccttg atcgttgagc agctgcggag gcaagaagca gagccacc atg gac atc 177 Met Asp Ile 1 gtc gcc ccg gac cgc acg cgg atc gcg ccg gag atc gac agg gac gag 225 Val Ala Pro Asp Arg Thr Arg Ile Ala Pro Glu Ile Asp Arg Asp Glu 5 10 15 gcc ctg gag ggc gac agg gag tcg gac ccg gcg ctg gcg tcg acg cgc 273 Ala Leu Glu Gly Asp Arg Glu Ser Asp Pro Ala Leu Ala Ser Thr Arg 20 25 30 35 gag tgg cag ctg gag gac atg cca cgg tgg cag gac gag ctg acg gtg 321 Glu Trp Gln Leu Glu Asp Met Pro Arg Trp Gln Asp Glu Leu Thr Val 40 45 50 cgg ggc ctg gtg gcg gcg ctg ctc atc ggg ttc atc tac acc gtc atc 369 Arg Gly Leu Val Ala Ala Leu Leu Ile Gly Phe Ile Tyr Thr Val Ile 55 60 65 gtc atg aag atc gcg ctc acc acg ggg ctg gtg ccc acg ctg aac gtc 417 Val Met Lys Ile Ala Leu Thr Thr Gly Leu Val Pro Thr Leu Asn Val 70 75 80 tcc gcc gcg ctg ctc tcc ttc ctg gcg ctc cgc ggg tgg acg cgc ctg 465 Ser Ala Ala Leu Leu Ser Phe Leu Ala Leu Arg Gly Trp Thr Arg Leu 85 90 95 ctg gag cgc ttc ggc gtc gtg tcc cgc ccc ttc acg cgg cag gag aac 513 Leu Glu Arg Phe Gly Val Val Ser Arg Pro Phe Thr Arg Gln Glu Asn 100 105 110 115 acc atc gtc cag acc tgc ggc gtg gca tgc tac acc atc gcg ttt gcc 561 Thr Ile Val Gln Thr Cys Gly Val Ala Cys Tyr Thr Ile Ala Phe Ala 120 125 130 ggt ggg ttc ggg tca acc ttg ctg ggc ctg aac aag aag acg tac gag 609 Gly Gly Phe Gly Ser Thr Leu Leu Gly Leu Asn Lys Lys Thr Tyr Glu 135 140 145 ctg gcc ggt gac tcg ccg ggc aac gtg ccc gga agc tgg aag gag cca 657 Leu Ala Gly Asp Ser Pro Gly Asn Val Pro Gly Ser Trp Lys Glu Pro 150 155 160 ggg ata ggc tgg atg acg ggg ttc ctc ctc gct tgc agc ttc ggg ggc 705 Gly Ile Gly Trp Met Thr 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gct att gat atg tgc ctc ggg agt ttg ata gtt ttt gca 2049 Gly Ser Phe Ala Ile Asp Met Cys Leu Gly Ser Leu Ile Val Phe Ala 615 620 625 tgg acc aag ata aac aag aag gag gct ggc ttc atg gtg cct gcg gtt 2097 Trp Thr Lys Ile Asn Lys Lys Glu Ala Gly Phe Met Val Pro Ala Val 630 635 640 gca tcc gct ttg ata tgt ggg gat ggc ata tgg acg ttc cct gct tcc 2145 Ala Ser Ala Leu Ile Cys Gly Asp Gly Ile Trp Thr Phe Pro Ala Ser 645 650 655 att ctt gct ctt gcc aag att aaa cca cca att tgc atg aag ttt cta 2193 Ile Leu Ala Leu Ala Lys Ile Lys Pro Pro Ile Cys Met Lys Phe Leu 660 665 670 675 cct gct gcc taacggac cgaaaaatat actaggtgac caaagatgca ttgaatttcc 2250 Pro Ala Ala atagttgtgc cttgctgaac tatcttttag tgtttgttta ctggagatgc ttcggtactc 2310 gagtgtctag gaatgatacg ttggtatgtg cttttacggg tataacctga attttcttat 2370 tttatgaatc tggggtatac ttatcagttg ctatgagtat ggatctaatg atttggctga 2430 2430

Claims

하기 단계들을 포함하는, 하기 일반식 (1)로 표시되는 무기네산의 제조 방법:

(식 중, R¹ 은 수소 원자 또는 히드록실기를 나타내고, R² 는 수소 원자 또는 히드록실기를 나타내고, R³ 은 히드록실기 또는 아미노기를 나타냄);

하기 일반식 (2)로 표시되는 화합물의 비닐기의 산화 절단:

(식 중, R¹ 은 상기 정의된 바와 같고, R⁴ 는 수소 원자 또는 카르복실기의 보호기를 나타내고, R⁵ 는 아미노기의 보호기를 나타냄), 및 아제티딘-2-카르복실산과의 환원 아미노화 반응을 동시에 수행하여 하기 일반식 (3)으로 표시되는 화합물을 수득하는, 단계 1:

(식 중, R¹, R⁴ 및 R⁵ 는 상기 정의된 바와 같음);

일반식 (3)으로 표시되는 화합물의 카르복실기를 보호기로 보호하고, 상기 아미노기의 보호기를 제거하여 하기 일반식 (4)로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 수득하는, 단계 2:

(식 중, R¹ 및 R⁴ 는 상기 정의된 바와 같고, R⁶ 은 카르복실기의 보호기를 나타냄);

하기 일반식 (5)로 표시되는 알데히드:

(식 중, R² 는 상기 정의된 바와 같고, R⁷ 은 카르복실기의 보호기를 나타내고, R⁸ 은 -OR⁹ (이때 R⁹ 는 히드록실기의 보호기를 나타냄) 또는 -NHR¹⁰ (이때 R¹⁰ 은 아미노기의 보호기를 나타냄)을 나타냄)와 상기 일반식 (4)로 표시되는 화합물과의 환원 아미노화 반응을 수행하여 하기 일반식 (6)으로 표시되는 화합물을 수득하는, 단계 3:

(식 중, R¹, R², R⁴, R⁶, R⁷ 및 R⁸ 은 상기 정의된 바와 같음); 및

상기 일반식 (6)으로 표시되는 화합물의 카르복실기의 보호기 및 히드록실기 또는 아미노기의 보호기를 제거하는, 단계 4.
하기 일반식 (3-1)으로 표시되는 화합물:

(식 중, R¹ 은 수소 원자 또는 히드록실기를 나타내고, Boc 은 tert-부톡시카르보닐기를 나타냄).
하기 일반식 (4-1)로 표시되는 화합물:

(식 중, R¹ 은 수소 원자 또는 히드록실기를 나타내고, Et 는 에틸기를 나타냄).