TW200819468A - Method for the production of conjugates of insulin-like growth factor I and poly(ethylene glycol) - Google Patents

Method for the production of conjugates of insulin-like growth factor I and poly(ethylene glycol) Download PDF

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Description

200819468 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於用於製造類胰島素生長因子_1( 乙二醇(PEG)之社人物夕古、土人+ 〃、不 p 口物之方法，含有該等結合物之醫藥组 合物，及該等結合物之使用方法。 、、、 【先前技術】
阿茲海默氏病（AD)為日益流行之神經退化形式，其為年 齡65歲以上之人群中約5〇%_6〇%全部癡呆症病例之原因。 據估計其目前在世界範圍内影響15⑽萬人且由於人口中老 年人之相對增加，在以後20至3〇年中其流行率可能增加。 AD為進行性病症，在臨床症狀發作與死亡之間平均持續 時間為約8,5年。與較高心理功能相關之大腦區域中錐體 神經兀之死亡及神經元突觸之減少導致典型症狀，其特徵 在於總體及進行性認知功能障礙（Francis，ρ·τ•等人，L
Neurol. Neurosurg. Psychiatry 66 (1999) 137-147)。AD為 世界上老年癡呆症與初期老年癡呆症之最常見形式且在臨 床上硪別為持續進行性癡呆症，其表現為記憶、智力功能 哀退及語言障礙漸增（Merritt，A Textbook of Neurology， 弟 6版 ’ Lea & Febiger，Philadelphia (1979)，第 484-489 頁）。在神經病理學上，AD之主要特點為存在兩種特徵性 病變··澱粉樣老年斑及神經原纖維纏結（NFT)。空斑係在 神經元外沈積，而纏結係在死後大腦中在神經元内觀察到 的。澱粉樣空斑核心之主要組份之一為病理性沈積之小澱 粉樣-β-肽（Αβ)，其係由分泌酶自澱粉樣前驅蛋白質（APP) 123528.doc 200819468 歧解而得（Seik〇e，d.J·，Physiol· Rev· 81 (2001) 741-766 · rdy，J.及 Selkoe，D.J·，Science 297 (2002) 353-356 · ush，Α·Ι·及 Tanzi，R.E·，Pr〇c. Natl. Acad. Sci· USA 99 (2⑽2) 7317_7319)。Αβ是一種39-43個殘基之自聚集肽 (MW為約4 kDa)，其係作為更大Αρρ(η〇·ΐ2〇 ki^)之部分 而合成。APP是一種具有大N末端細胞外域、單一跨膜域 及短細胞質尾之1型完整膜醣蛋白。Αβ區橫跨APP之部分 細胞外域及跨膜域。ΑΡρ參與AD中神經元細胞死亡之最常 見假說為殿粉樣蛋白假說。此假說假定空斑澱粉樣沈積或 部分聚集之可溶性Αβ引發神經毒性級聯，進而造成類似於 八〇病理之神經退化（Selkoe，D.J·，Physiol. Rev. 81 (2001) 741-766 ; Hardy，J.及 Selkoe，D.J·，Science 297 (2002) 353- 356) 〇 人類類胰島素生長因子I(IGF-I)為結構上與胰島素相關 之循環激素。傳統認為IGF-I為生長激素對周邊組織發揮 作用之主要介體。IGF-I由70個胺基酸組成且亦稱作體介 素C且係由SwissProt第P01343號定義。用途、活性及製備 描述於以下文獻中：例如le Bouc，Y.等人，FEBS Lett. 1 96 (1986) 108-1 12 ; de Pagter-Holthuizen，Ρ·等人，FEBS Lett. 195 (1986) 179_184 ; Sandberg Nordqvist，A.C·等人，
Brain Res. Mol. Brain Res. 12 (1992) 275-277 ； Steenbergh, Ρ·Η·等人，Biochem. Biophys· Res. Commun. 175 (1991) 507-5 14 ; Tanner，J.M·等人，Acta Endocrinol. (Copenh·) 84 (1977) 681-696 ; Uthne，K·等人，J. Clin· Endocrinol· 123528.doc 200819468
Metab. 39 (1974) 548-554 ； EP 0 123 228 ； EP 0 128 733 ； US 5,861,373 ; US 5,714,460 ; EP 0 597 033 ; W〇 02/32449 ; WO 93/02695。 IGF-I功能之調節相當複雜。在循環中，僅〇.2〇/()之IGF-I 係以游離形式存在，而大部分係與IGF結合蛋白（IGFBP)結 合，該等蛋白對IGF具有極高親和力且調節IGF-I功能。該 因子可藉由釋放IGF-I之機制（諸如IGFBP經蛋白酶蛋白質 水解）而局部釋放。 IGF-I在發育中及成熟之大腦中起旁分泌作用（Werther， G.A·等人，Mol. Endocrinol. 4 (1990) 773-778)。活體外研 究中指示IGF-I為CNS中數種類型神經元之強效非選擇性營 養劑（Knusel，B.等人，J. Neurosci· 10(1990) 558-570 ; Svrzic，D.及 Schubert，D·，Biochem. Biophys. Res. Commun. 172 (1990) 54·60)，該等神經元包括多巴胺能神經元 (Knusel，Β·等人，J· Neurosci. 10(1990) 558-570)及寡突細 胞（McMords，F.A·及 Dubois-Dalcq, M.，J. Neurosci· Res. 21 (1988) 199-209 ; McMorris，F.A.等人，Proc. Natl. Acad, Sci· USA 83 (1986) 822-826 ; Mozell，R.L.及 McMorris， F.A·，J· Neurosci· Res. 30 (1991) 382-390))。US 5,093,3 1 7 提及膽鹼能神經元細胞之存活可藉由投與IGF_;[來增強。 此外’已知IGF-I刺激周邊神經再生（Kanje，M.等人，Brain Res· 486 (1989) 396-398)且增強鳥胺酸脫羧酶活性（us 5,〇93,3 17)。US 5,861，373及 WO 93/02695提及一種藉由增 加患者中樞神經系統中IGF-I及/或其類似物之活性濃度來 123528.doc 200819468 治療主要影.響神經膠質及/或非膽鹼能神經元細 ^ _員傷或疾病之方法。w〇咖洲係關於藉由向》 哺乳動物之鼻腔投與包含治療有效量之服七戈其生物活 性變異體之醫藥組合物來減少或預防哺乳動物中樞神經系 統之缺血性損傷之方法。服]或其變異體係以可有效減 少或預防與缺血性事件相關之缺血性損傷之量經由鼻腔吸 收且輸送至哺乳動物之中樞神經系統中。Ep 〇 874⑷主 張1仍-1或IGF-II用於製造治療或預防中柩神經系統中神經 兀損傷之藥物的用途，其中該神經元損傷係由以下疾病造 成：Ams相關性癡呆症、AD、中白金森氏病（恤⑹⑽,s Disease)、皮克氏病（Plck’s⑴咖叫、亨廷頓氏病 (HUntington’s Disease)、肝性腦病、皮質基底神經節症候 群、進行性癡呆症、家族性痕呆症伴癌擎、性靡疾、進行性 核上麻療、多發性硬化症、希爾德病（SeMider)之腦硬化症 或急性壞死出血性腦脊髓炎，其中藥物為可將有效量之該 IGF非經腸投與血腦屏障或血-脊髓屏障外部之形式。 大腦及血清游離IGF-I含量之降低與偶發性及家族性形 式之AD之發病機理相關。此外，IGIM保護神經元免受八^ 誘發之神經毒性影響（Niikura，T.等人，j. Neur〇sci. 21 (2_) 19〇2-191〇; Dore，S·等人，Pr〇c _ Α(^ % USA 94 (1997) 4772-4777 ; Dore，S.等人，Ann Νγ Acad Sci. 890 (1999) 356-364)。近來，已展示周邊投與 IGF_U& 夠降低大鼠及小鼠之大腦Αβ含量（Carr〇，E.等人，Nat. Med. 8 (2002) 1390-1397)。此外，研究證實在轉殖基因 123528.doc 200819468 AD小鼠模型中延長之IGF-Ι治療顯著降低大腦澱粉樣空斑 負荷。此等資料強烈支持IGF_I能夠藉由將Αβ自大腦清除 而減少大腦Αβ含量及與空斑相關之大腦癡呆症的觀點。 已證實用聚乙二醇（PEG)共價修飾蛋白質為延長蛋白質 在體内之循環半衰期的有效方法（Hershfield，M.S.等人， N· Engl. J· Med. 3 16 (1987) 589-596 ; Meyers，F.J.等人， Clin· Pharmacol· Ther. 49 (1991) 307-313 ; Delgado，C·等 人，Crit. Rev· Ther. Drug Carrier Syst· 9 (1992) 249-304 ;
Katre, Advanced Drug Delivery Reviews 10 (1993) 91- 114 ; EP-A 0 400 472 ; Monfardini，C·等人，Bi〇conjUgate Chem. 6 (1995) 62-69 ; Satake-Ishikawa，R·等人，Cell Struct· Fimct· 17 (1992) 157-160 ; Katre，N.V·等人，proc· Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 1487-1491 ; Tsutsumi，Y_ 等 人 ’ Jpn. J. Cancer Res· 85 (1994) 9-12 ; Inoue，H.等人，J· Lab. Clin. Med· 124 (1994) 529-536 ; Chamow，S.M.等人， Bioconjugate Chem· 5 (1994) 133-140) 〇 PEG化之其他優點為溶解度增加及蛋白質免疫原性降低 (Katre，N.V·，J· Immunol. 144 (1990) 209-213)。蛋白質 PEG化之常用方法為使用經胺基反應性試劑（如…羥基琥轴 醯亞胺（NHS))活化之聚乙二醇。使用該等試劑，聚乙二醇 在游離第一胺基（諸如N末端α·胺基及離胺酸殘基之ε•胺基） 處與蛋白質連接。然而，此方法之主要侷限在於蛋白質通 常含有相當大量之離胺酸殘基且因此聚乙二醇基團係以非 特異性方式在所有游離心胺基處與蛋白質連接，從而產生 123528.doc -10 - 200819468
Ik機PEG化蛋白之異質產物混合物。因此，由於較低比活 性，許多NHS-PEG化蛋白不適於商業用途。生物活性所需 之一或多個離胺酸殘基或义末端胺基殘基之共價修飾或聚 乙二醇殘基在接近或在蛋白質活性位點處之共價連接可產 生滅活作用。舉例而言，已發現使用NHS-PEG化試劑修飾 人類生長激素使蛋白質之生物活性降低1〇倍以上（Clark，R. 等人，J. Biol· Chem. 271 (1996) 21969-21977)。除 N-末端 胺基酸之外，人類生長激素含有9個離胺酸。某些此等離 胺酸係位於已知對於受體結合關鍵之蛋白質區域中 (Cunningham，B.C·等人，Science 254 (1991) 821-825)。另 外，藉由使用胺基反應性聚乙二醇試劑修飾紅血球生成素 亦導致生物活性幾乎完全喪失（Wojchowski，D.M.等人，
Biochim· Biophys. Acta 910 (1987) 224-232)。使用胺基反 應性PEG化试劑共價修飾干擾素_α2導致生物活性喪失 40%-75%(美國專利第5,382,657號）。G-CSF之類似修飾導 致大於60%之活性喪失（Tanaka，η·等人，Cancer Res· 51 (1991) 3710-37 14)且介白素_2之類似修飾導致大於90%之 生物活性喪失（Goodson，R. J.及Katre，N. V·，BioTechnology 8 (1990) 343-346) 〇 W〇94/12219及WO 95/32003主張包含PEG及IGF或經半 胱胺酸突變之IGF之聚乙二醇結合物，該PEG係在突變蛋 白之N末端區域中之游離半胱胺酸處與該突變蛋白連接。 WO 2004/603 00描述 N末端 PEG化之 IGF-I。
IgA蛋白酶之識別位點描述為Ya^pro.LXaa-Pro。Yaa代 123528.doc 11 200819468 表Pro(或極少地代表Pro與Ala、Gly或Thr之組合：Pro-Ala、Pro-Gly 或 Pr〇-Thr)。Xaa代表丁hr、Ser 或 Ala(Pohlner， J·等人，Bio/Technology 10 (1992) 799-804 ; Pohlner，J·等 人，Nature 325 (1987) 458-462 ;及 US 5,427,927)。Wood， S.G·及 Burton J·，Infect· Immun· 59 (1991) 18 18-1 822 已鑑 別天然裂解位點。來自淋病雙球菌（2型）之免疫球蛋白A1蛋 白酶之合成肽底物為自我蛋白水解位點Lys-pr〇-Ala胃 Pro.I.Ser^Pro > VaKAla-Pro-Pro.! .Ser-Pro > Pro-Arg-Pro-Pro.!.Ala-Pro > Pro-Arg-Pro-Pro.! .Ser-Pro > Pro-Arg-Pro-Pro.LThr-Pro 及 IgAl 裂解位點 pro-Pr〇-Thr_Pr〇 ! Ser_Pr〇& Ser-Thr-Pro-Pro.!.Thr-Pro。 WO 2006/066891揭示由類胰島素生長因子變異 體及或兩個I乙一醇基團組成之結合物，其特徵在於該 IGF-I變異體具有在野生型igF-I胺基酸序列之多達三個胺 基酸位置27、37、65、68處之胺基酸改變以使得該等胺基 酸中之一或兩者為離胺酸且胺基酸27為非離胺酸之極性胺 基酸，其係經由該（等）離胺酸之第一胺基結合且據揭示該 (荨）聚乙一醇基團具有20 kDa至1〇〇 kDa之總分子量。該等 結合物適用於治療神經退化性病症，如阿茲海默氏病。 WO 2006/074390 提及 IGF-I 融合多肽。 【發明内容】 本發明包含一種用於製造離胺酸_PECHtIGF_I或離胺酸· PEG化IGF-I變異體之方法，該變異體包含一或兩個選自由 獨立經另一極性胺基酸取代之離胺酸27、65及/或Μ組成 123528.doc 12 200819468 之群的胺基酸，其特徵在於： a) 培養包含含有編碼融合蛋白之核酸之表現載體的原核 宿主細胞，其中該融合蛋白包含N末端與原肽之C末端 連接之該IGF-I或IGF-I變異體， b) 藉此該原肽在C末端由胺基酸-Y-Pro終止，其中Y係選 i*Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Thr、Ala-Pro、Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro 或 Pro-Arg-Pro 組成之群， c) 回收及PEG化該融合蛋白， d) 用IgA蛋白酶裂解該PEG化融合蛋白，及 e) 回收該PEG化IGF-I或IGF-I變異體。 在一實施例中，該方法之特徵在於離胺酸-PEG化IGF-I 變異體為RRK且該變異體係在離胺酸殘基68處經單PEG化 或離胺酸-PEG化IGF-I變異體為RKR且該變異體係在離胺 酸殘基65處經單PEG化。 在另一實施例中，該方法之特徵在於離胺酸-PEG化IGF-f 1變異體為RKK且該變異體係在離胺酸殘基65及68處經單 PEG4 匕或匕。 在另一實施例中，該方法之特徵在於離胺酸-PEG化IGF-I變異體為RRK、RKR或RKK之混合物且該變異體係在離 胺酸殘基65及68處經單PEG化或二PEG化。 本發明之另一實施例為一種包含N末端與原肽之C末端 連接之該IGF-I或IGF-I變異體的融合蛋白，其特徵在於該 原肽在C末端由胺基酸-Y-Pro終止，其中Y係選自由Pro、 Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Thr、Ala-Pro、Gly-Pro、Thr- 123528.doc -13 - 200819468
Pro、Arg-Pro 或 Pro-Arg-Pro 組成之群。由於 _γ_ρΓ〇 序列， 原肽可藉由IgA蛋白酶處理而自該或IGF」變異體分 根據本發明之融合蛋白之特徵較佳在於式Met_Xl_HiSn-X2-Y-Pro-[IGF-I或 IGF-I變異體]，其中 • IGF-I表示人類IGF-i且IGF-I變異體表示其中一或兩 •個選自由離胺酸27、65及/或68組成之群之胺基酸獨 立經另一極性胺基酸取代之IGF-I， (' • Met表示甲硫胺酸， • X1為一鍵、絲胺酸或天冬醯胺酸， • His為組胺酸， • η為〇至1〇 ’較佳〇至6之數， • Χ2為連接肽’其係選自由肽SEQ ID NO:6-10組成之 群， • Pro為脯胺酸，且 ^ / Y 係适自由 Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Thr、Ala-
Pro Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro 或 Pro-Arg-Pro 組成 之群。
• 根據本發明之融合蛋白較佳係選自由融合蛋白SEQ ID . N〇:2-5 及 SEQ ID N〇：22-25 組成之群。 原狀k佳係由式Met-XpHiSn-XrY-Pro-展示，其中 • 表示甲硫胺酸， • X〗為一鍵、絲胺酸或天冬醯胺酸， • His為組胺酸， 123528.doc -14- 200819468 •η為0至1〇，較佳〇至6之數， • Χ2為連接肽’其係選自由肽SEQ ID NO:6-10組成之 群， • Pro為脯胺酸，且
Pr〇、Gly"Pro、Thr-Pr〇、Arg-Pro 或 pro-Arg-Pro 組成 之群。 原肽在C末端與igf-ι或igf-ι變異體之N末端（甘胺酸）連 接。原肽較佳不包括離胺酸殘基。原肽較佳具有至多30個 胺基酸之長度。\較佳為一鍵。n較佳為〇或6。&較佳為 肽 SEQ ID NO:7。Y較佳為 Pr…Arg-Pr〇。 本發明之另一實施例為一種離胺酸邛£〇化IGF-I，其特 徵在於不包含N末端曱硫胺酸。 本發明之另一實施例為一種離胺酸_peg化iGIM變異 體，其中一或兩個選自由離胺酸27、65及/或68組成之群 之胺基酸獨立經另一極性胺基酸取代，其特徵在於該變異 體不包含N末端甲硫胺酸。 该（等）極性胺基酸較佳獨立為精胺酸、麩酸胺酸或天冬 醯胺酸，尤其為精胺酸。 較佳之IGF-I變異體及融合蛋白中之變異體為：rkk、 RKR、RRK。IGF-I變異體如下命名：K65意謂胺基酸μ為 離胺酸’ R27意謂胺基酸27為精胺酸等。帶有胺基酸 R27、Κ6 5、Κ68之IGF-I變異體命名為RKK，且該RKK變 異體之其餘胺基酸與SEQ ID Ν〇·1之IGF-I野生型中相同。 123528.doc 200819468 因此，RKK為IGF-Ι野生型之變異體，其藉由在位置27處 將K替換為R而突變。rkR為IGF-I野生型之變異體，其藉 由在位置27及68處將K替換為R而突變。rrk為IGF-I野生 型之變異體，其藉由在位置27及65處將K替換為R而突 變。其中無胺基酸改變之IGF-I野生型命名為KKK。
離胺酸-PEG化IGF-I較佳係在離胺酸殘基27、65及68隨 機PEG化，較佳為單PEG化或二pEG化（每個沁以分子一或 兩個PEG)。離胺酸-PEGKiGFj變異體較佳係在離胺酸殘 基65及68單PEG化或二PEG化，較佳係在K65或K68單PEG 化。水（乙一醇）基團係經由離胺酸之一級胺基與該或 IGF-I變異體結合。 根據本發明之方法包含離胺酸_PEG化IGF-I或IGF-I變異 體之製備’其中每個IGF-I或IGF-1變異體之該（等）聚（乙二 醉）基團具有較佳至少20 kDa，更佳約20 kDa至1〇〇 kDa， 尤其較佳20 kDa至80 kDa之總分子量，係藉由根據本發明 之IGF-I融合蛋白與活化之聚乙二醇在使該聚乙二醇經由 IGF-I或IGF-I變異體之離胺酸一級胺基與該IGIM中間物化 學結合之條件下反應。離胺酸-PEG化IGF-I或IGF-I變異 體較佳係單PEG化。變異體較佳係選自由分別關於胺基酸 位置27、65及68之RKK、RKR、RRK組成之群。PEG較佳 具有30 kDa至45 kDa，尤其30 kDa或40 kDa之平均總分子 量。 本發明進一步包含含有根據本發明之離胺酸^^〇化1(31^ I或IGF I、欠異體，較佳連同醫藥學上可接受之載劑的醫藥 123528.doc -16- 200819468 組合物。 本發明進一步包含用於製造含有根據本發明之離胺酸_ PEG化IGF-Ι或IGF-Ι變異體之醫藥組合物的方法。 本發明進一步包含根據本發明之離胺酸—PEG化IGF_J或 IGF-I變異體用於製備治療AD之藥物的用途。 本發明進一步包含用於治療AD之方法，其特徵在於將 醫藥學上有效里之Jk基反應性PEG化IGF-I或IGF-I變異體 投與需要該治療之患者’較佳每週施用一至兩次。 【實施方式】 意外地發現IgA蛋白酶（較佳為來自淋病雙球菌之IgA蛋 白酶）能夠裂解胺基酸序列Y-Pro.!,Gly-Pro。Y係選自由
Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、pro-Thr、Ala-Pro、Gly-Pro、
Thr-Pro、Arg-Pro或Pro-Arg-Pro組成之群。較佳適用作裂 解位點的為 Pro-Pro.!.Gly-Pro(SEQ ID NO:15) *Pro-Arg-
Pro-Pro.!.Gly-Pro(SEQ ID N0:11)(·!·:裂解位置）。根據本 發明之方法所用之IgA蛋白酶裂解位點具有胺基酸一致序 列Y-Pro.!，Gly-Pro，藉此Gly-Pro為IGF-I之前兩個胺基 酸。Y較佳表示由胺基酸Pro、Pro-Ala、Arg-Pro或Pro-Arg-Pro終止之胺基酸序列。該等Y胺基酸序列（尤其是Pr〇-Arg-Pro)可由另一 Ala或Pro-Ala基團延長，如例如在Ala-Pro-Arg-Pro(SEQ ID NO:12)或 Pro-Ala-Pro-Arg-Pro(SEQ ID NO:13)中。尤其較佳的為裂解胺基酸序列Pr〇-Ala_ Pro.!.Gly-Pro(SEQ ID N0:14)、Pro-Pro_!.Gly-Pro(SEQ ID N〇：15)、Pro-Arg-Pro-Pro·!· Gly-Pro(SEQ ID NO:16)、Ala- 123528.doc 200819468
Pro-Arg-Pro-Pro.!.Gly-Pro(SEQ ID NO:17)或 Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro.!.Gly-Pro(SEQ ID NO:18)。 根據本發明，術語nIgA蛋白酶n包括特異性裂解IgA之蛋 白酶且其已例如由Kornfeld，S.J.及Plaut，A.G·在Rev· 11^61〈1:.0丨8.3 (198 1) 52 1-5 34中以（例如）來自淋病雙球菌（2 型）之IgAl蛋白酶來描述。諸如DE-A 36 22 221 ; Koomey，
J.M·等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 7881· 7885 ; Bricker，J.等人，proc. Natl· Acad· Sci. USA 80 (1983) 268 1· 2685 ; Pohlner，J.等人，Nature 325 (1987) 458 462，及 Halter，R·專人，EMBO J. 3 (1984) 1 595.1601 中所述之重組IgA蛋白酶亦恰為適合的。該IgA蛋白酶較佳 為來自淋病雙球菌（較佳2型）之IgA蛋白酶。 較佳將編碼融合蛋白之基因置於適合（較佳可誘導）表現 h唬之控制下以使得可根據需要製造融合蛋白。可使用適 合原核或真核（植物以及動物）細胞作為用於製造蛋白融合 物之宿主細胞；然而，不含細胞之系統亦為可能的。 根據本發明之方法之一較佳實施例的特徵在於將宿主細 月已用重組DNA或重組載體轉化，其中DNA或載體含有至少 一個編碼根據本發明之融合蛋白之基因的複本，且將經轉 化細胞於適合培養基中培養，使編碼融合蛋白之基因在經 I中表現，將融合蛋白PEG化且隨後用IgA蛋白酶 W解且分離PEG化IGF_UiUGF_It異體。 與不含離胺 不含離胺酸 根據本發明之融合蛋白之表現可（例如）藉由 -夂之β半乳糖苦酶基因之片段融合（亦即Y含有 123528.doc -18 - 200819468 之β-半乳糖苷酶蛋白之部分）而在DNA水平上改良。專家 瞭解用於增加融合蛋白表現之其他替代方法。可藉由與其 他多肽，詳言之與多荷電多肽或蛋白質（例如聚（Lys， 或可以高親和力與特定物質結合之多肽或蛋白質（例如抗 生蛋白鏈菌素）融合來促進表現產物之純化及分離（例如參 見EP-A 0 089 626、EP_A 〇 3〇6 61〇)。尤其較佳之連接狀 為肽SEQ ID NO:6-1〇，其N末端之前較佳
(SEQ ID NO:19)、NHHHHHH(SEQ ID NO:2G)或 HHHHHH (SEQ ID NO:21) 〇 本發明亦提供一種（重組）核酸，其編碼根據本發明之融 合蛋白且其中在原肽與IGF_;[或IGiM變異體之間的接合區 域中併入IgA蛋白酶裂解位點。 根據本發明之重組DNA可以熟習分子生物學領域之技術 者已知的方式獲得。對此，通常將含有編碼ZGPq或 變異體之胺基酸序列之DNA序列的載體用限制性核酸内切 酶在此基因之5’端區域中裂解且與含有所需序列之寡核苷 酸再接合。 另外’本發明亦提供一種重組載體，其含有至少一個根 據本發明之重組DNA之複本。專家瞭解適用作原核生物體 中蛋白質表現之基礎的載體。此載體較佳為使得根據本發 明之重組DNA可高度表現之載體。載體上之重組dNA較佳 係在可誘導表現信號（例如，X、tax、iac或鄉啟動子）之控 制下。 根據本發明之載體可存在於染色體外（例如質體）以及整 123528.doc -19- 200819468 合於佰主生物體之基因組中(例如噬菌體λ)。根據本發明之 為質體。_子生物學領域之技術者已知在特 疋佰主生物體中在各情況下適用於基因表現之載體。其可 二、/、/載體但車乂佳為原核載體。適用於在原核生物中表 現根據本發明之DNA之載體的實例為⑼如）市售puc及 pUR載體。 本發明亦提供-種經根據本發明之重組dna或/及經根 據本發明之重組載體轉化之細胞，較佳為原核細胞，尤其 較佳為大腸桿菌（Ε· c〇H)細胞。 八 田融合蛋白在原核生物中表現時，形成無活性之微溶聚 集體（折射體、包涵體）。因此，必須將融合蛋白轉化為其 活性形式。使用熟習此項技術者熟知之程序（例如參見£?_ A 0 219 874、EP A 0 1 14 506、WO 84/0371 1)，首先藉由 添加變性劑進行溶解，隨後複性且必要時進行其他純化步 驟。在融合蛋白PEG化之後，用igA蛋白酶來處理融合蛋 白0 用IgA蛋白酶裂解PEG化IGF-I或IGF-1變異體之處理所需 之條件並非關鍵的。然而，在此方法中，較佳地peg化 IGF_I或IGF-I變異體與IgA蛋白酶之重量比為1:1至5〇〇:;[， 較佳為100:1。較佳在pH值為6.5至8.5之緩衝水溶液中進行 反應。緩衝液濃度較佳在介於50 mmol/l與500 mmol/1之 間之範圍内’必要時可添加〇 -1 〇〇 mm〇l/l氣化鈉。裂解較 佳在室溫下進行至少60分鐘至長達5天，較佳介於24小時 至72小時之間。 123528.doc -20- 200819468 在溶解、複性、PEG化及用IgA蛋白酶裂解之後，較佳 將以此方式獲得之PEG化裂解產物藉助於離子交換層析、 疏水性相互作用層析及/或根據尺寸分餾來純化。以此方 式製得之PEG化lGF-i或IGF-I變異體在位置1處不含甲硫胺 酸且較佳不含其他蛋白質（如非PEG化IGIM或iGF]變異 體）’且較佳不含N末端PEG化原肽，5%(w/w)或更低。 如本文中所用之”PEG化IGF-I或IGF-I變異體，，或”胺基反 應性PEG化”意謂IGIM或IGIM變異體係經由胺基反應性偶 合與聚乙二醇基團共價鍵結。PEG基團係在離胺酸側鏈之 第一 ε-胺基之IGF_b^IGF·;[變異體分子之位點處連接。此 外’ PEG化亦有可能另外發生在原肽之n末端心胺基上。 知因於所用之合成方法及融合蛋白，PEG化igf-I或igf-I 變異體可由混合物組成，藉此PEG化位點在不同分子中可 不同或關於每個分子聚乙二醇侧鏈之量及/或分子中pEG化 位點之量可大體上均勻。IGIM或IGF-；[變異體較佳係經單 PEG4b&/或二lPEG 化。 如本文中所用之胺基反應性PEG化指示一種藉由使用反 應性（經活化）聚乙二醇，較佳藉由使用（較佳）甲氧基聚乙 二醇之N-羥基琥珀醯亞胺基酯使聚乙二醇鏈與πρ]或 IGF-I變異體之第一離胺酸胺基隨機連接之方法。偶合反 應使聚乙二醇與離胺酸殘基之反應性第一 ε _胺基及視情況 與融合蛋白之Ν-末端胺基酸之α-胺基連接。此項技術中熟 知PEG與蛋白質之此胺基結合。舉例而言，Vej^eSe F.M·，Biomaterials 22 (2001) 405-417提供了 此等方法之概 123528.doc -21 - 200819468 述。根據Veronese，PEG與蛋白質之第一胺基之結合可藉 由使用實施該等第一胺基之烷基化之經活化pEG來進行。 對於此反應而言，可使用經活化烷基化PEG，例如阳G 醛、PEG-三氟乙磺醯氯或PEG環氧化物。其他適用試劑為 u 醯化PEG，諸如羧酸化PEG或其中末端羥基經氣甲酸酯或 羰基咪唑活化之PEG的羥基琥珀醯亞胺基酯。其他適用之 PEG試劑為具有胺基酸臂之PEG。該等試劑可含有所喟分 ( ' 枝PEG，藉此至少兩個相同或不同之pEG分子經肽間隔基 (較佳為離胺酸）連接在一起且（例如）以離胺酸間隔基之經 活化羧酸自旨之形式與IGF-I或IGF-I變異體結合。 如本文中所用之”PEG或聚乙二醇”意謂市售或可根據此 項技術中熟知之方法（Kodera，γ·等人，Pr〇gress in
Polymer Science 23 (1998) 1233-1271 ; Francis，G,E•等 人，IrU. J. Hematol· 68 (199δ) h8)藉由乙二醇之開環聚 合來製備之水溶性聚合物。術語”PEG，，廣泛用於涵蓋任何 ί / 聚乙二醇分子，其中乙二醇單元之數目為至少460，較佳 為460至2300且尤其較佳為460至1 840(230 PEG單元係指約 10 kDa之分子量）。PEG單元之上限數目僅由離胺酸邛eg - 化1GF·1或WF·1變異體之溶解度限制。通常不使用大於含 有2300個單元之PEG的PEG。本發明中所用之PEG較佳在 一端由羥基或曱氧基終止（曱氧基PEG，mPEG)且在另一端 經由醚氧鍵與連接基團部分共價連接。pEG聚合物為線性 或分枝的。PEG聚合物較佳為分枝的。分枝pEG描述於（例 如）Veronese，F.M·等人，Journal 〇fBi〇active — c〇mpatiMe 123528.doc -22- 200819468
Polymers 12 (1997) 196_2〇7 中。適用之 pEc}試劑可（例如） 自 Nektar Therapeutics (www.nektar.com)獲得。分枝 PEG 可 (例如）藉由將聚氧化乙烯添加至各種多元醇（包括甘油、異 戊四醇及山梨糖醇）中來製備。舉例而言，四臂分枝可 • 由異戊四醇及環氧乙烷來製備。分枝PEG通常具有2至8條 臂且描述於（例如）EP-A 〇 473 〇84及美國專利第5,932,462 唬中。具有經由離胺酸之第一胺基連接之兩個pE(}側鏈的 ( PEG(縮寫為PEG2)尤其較佳（Monfardini，C等人，
Bioconjugate Chem· 6 (1995) 62-69)。 按貫際需要，可使用（例如）約2〇千道爾頓⑴…至丨⑽kDa 之任何分子質量的PEG(n為460至2300)。PEG中之重複單 元數目，n’f係關於以道爾頓計之分子質量進行估計。舉例 而言’若兩個PEG分子與連接基團連接，在各pEG分子具 有10 kDa之相同分子質量（各η為約23 〇)之情況下，則連接 基團上PEG之總分子質量為約2〇 kDa。與連接基團連接之 (J PEG之分子質量亦可不同，例如在連接基團上之兩個分子 中’一PEG分子可為5 kDa且另一 PEG分子可為15 kDa。分 子質量通常意謂平均分子質量。 • 在以下實例中，描述用於製造胺基反應性jGF-zstgfj .變異體之一些較佳試劑。應瞭解可在程序中（例如）根據
Veronese，F.M·, Biomaterials 22 (2001) 405-417所述之方 法進行修飾，只要該方法產生根據本發明之離胺酸_PEG化 IGF-I或IGF-I變異體即可。 本發明提供用於製造具有改良性質之1(^]或IGiM變異 123528.doc -23 - 200819468 體之PEG化形式之方法。該等離胺酸-PEG化IGF-Ι或IGF-I 變異體含有與其隨機連接之線性或分枝PEG，藉此離胺酸-PEG化IGF-I或IGF-I變異體中所有PEG基團之總分子量較 佳為約20 kDa至80 kDa。熟習此項技術者清楚瞭解此分子 量範圍之較小偏差係可能的，只要PEG化IGF-I或IGF-I變 異體展示出降低大腦中Αβ肽含量之活性即可。具有大於80 kDa之分子量之PEG亦可產生較高生物可用性。然而，預 期隨著分子量增加，由於降低之IGF-I受體活化及血腦屏 障輸送，此活性降低。因此，應瞭解對於PEG之分子量20 kDa至100 kDa之範圍為適用於有效治療患有AD之患者之 離胺酸-PEG化IGF-I或IGF-I變異體的最佳範圍。 較佳製造選自由RKK、RKR及RRK組成之群之單PEG化 IGF-I變異體，其中分枝PEG基團具有30-45，較佳40-45 kDa之分子量（約920個PEG單元）。舉例而言，根據PEG之 44 kDa之平均分子量及IGF-I之7.6 kDa之分子量，此單 ?£0-10卩-1之經計算平均分子量為約51.6 1^0&。尤其較佳使 用分子量為40 kDa之經N-羥基琥珀醯亞胺基活化之分枝 PEG 酉旨（mPEG2-NHS)(Monfardini，C.等人，Bioconjugate Chem· 6 (1995) 62-69 ; Veronese，F.M.等人，J. Bioactive Compatible Polymers 12 (1997) 197-207 ;美國專利第 5,932,462號）。亦較佳製造其中PEG具有30 kDa或40 kDa之 平均分子量之單PEG化IGF-I。 如本文中所用，π分子量”意謂PEG之平均分子量。 以下IGF-1或IGF-I變異體之PEG化形式為較佳產物且可 123528.doc -24- 200819468 藉由根據本發明之方法來獲得： -K 68單PEG化IGF-Ι變異體，較佳為RRK或RKK變異體， 更佳為RRK變異體，其中PEG基團具有20 kDa至80 kDa 之分子量（460至1840個PEG單元）； -K 65單PEG化IGF-Ι變異體，較佳為RKR或RKK變異體， 更佳為RKR變異體，其中PEG基團具有20 kDa至80 kDa 之分子量（460至1840個PEG單元）； - 二PEG化IGF-Ι變異體，較佳為RKK變異體，其中PEG基 團各具有約10-50 kDa之分子量（230至1150個PEG單 元）；及其混合物； -K 68單PEG化IGF-Ι變異體，較佳為RRK或RKK變異體， 更佳為RRK變異體，其包含分子量為40 kDa之PEG2基 團； -K 65單PEG化IGF-Ι變異體，較佳為RKR或RKK變異體， 更佳為RKR變異體，其包含分子量為40 kDa之PEG2基 團； - 單PEG化IGF-Ι，其中PEG基團具有20 kDa至80 kDa之分 子量（460至1840個PEG單元）； - 二PEG化IGF-Ι，其中PEG基團各具有約10-50 kDa之分 子量（230至11 50個PEG單元）； - 單PEG化IGF-Ι，其包含分子量為40 kDa之PEG2基團。 PEG化IGF-Ι或IGF-Ι變異體大體上為均勻的。製劑可含 有少量未反應（亦即無PEG基團）之蛋白質。如由肽定位所 確定，變異體之純度為至少90%(w/w)。該等製劑之進一步 123528.doc -25- 200819468 純化（包括分離單PEG化及/或二叩〇化IGIM或Ι<3ρΜ變異 體）可藉由常用純化方法，較佳藉由尺寸排阻層析、疏水 性相互作用層析及/或離子交換層析，尤其藉由陽離子交 換層析來進行。 如本文中所用之”單PEG化’’意謂IGF-I或IGF-I變異體在 每個IGF-ί或— 〗變異體分子中僅在一個離胺酸處經ρΕ〇 化。 在此項技術之目前發展水平熟知”經活化pEG或經活化 PEG試劑”。較佳使用經親電子活化之pEG，諸如聚乙二醇 之燒氧基丁酸琥珀醯亞胺基酯（”低碳烷氧基_PEg-Sba”）或 聚乙二醇之烷氧基丙酸琥珀醯亞胺基酯（，，低碳烷氧基_ PEG-SPA”）或經N-羥基琥珀醯亞胺活化之pEG。可利用使 經活化酯與胺反應以形成醯胺之任何習知方法。在經活化 PEG與IGF-I之反應中，例示性琥珀醯亞胺基酯為促使醯胺 形成之離去基。琥珀醯亞胺基酯用於製造與蛋白質之結合 物之用途揭示於美國專利第5,672,662號中。 所用反應條件對於不同PEG化之IGIM4IGF_pt異體之 相對$具有影響。藉由操控反應條件（例如，試劑比、 pH、派度、蛋白質濃度、反應時間等）可改變不同pEG化 種類之相對ϊ。反應較佳於視情況含有多達3〇%(Wv)乙醇 之緩衝水溶液（pH 8-1〇)中進行。蛋白質：pEG莫耳比較佳 為1 · 1至1 ·6，較佳為丨：2至丨：5。反應溫度及反應時間可根 據热習此項技術者之知識改變，高溫及長反應時間可使得 PEG化增加。若製備單PEG化蛋白，則較佳在4。〇與22它之 123528.doc -26- 200819468 間操作且歷時長達3〇分鐘或長達60分鐘。當PEG化試劑與 IGF-I或IGF-I變異體於較佳由50 mM硼酸鈉及25%乙醇組成 之反應緩衝液（pH約9·0-9·5)中，蛋白質：PEG比約1:3至 1:4，及反應溫度4°C組合時，產生單PEG化種類、二PEG 化種類、及痕量三PEG化種類之混合物，視蛋白質中存在 之Lys殘基而定。 根據本發明之離胺酸_PEG化IGF-I或IGF-I變異體可藉由 使IGF-I或IGF_I變異體之離胺酸一級胺基與一種雙官能試 劑共價反應以形成具有一個醯胺鍵之中間物及使該含有醯 胺鍵之中間物與一種活化之聚（乙二醇）衍生物共價反應以 形成離胺酸-PEG化IGF-I或IGF_I變異體來製備。在前述方 法中，雙官能試劑較佳為N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯基硫代 丙酉文S曰或N -破》轴亞胺基-S _乙酿基硫代乙酸5旨，活化之 聚（乙二醇）衍生物較佳係選自由碘-乙醯基-曱氧基-PEG、 甲氧基- PEG-乙細基石風、及曱氧基-p E G -順丁稀二酿亞胺組 成之群。 活化之PEG衍生物在此項技術中已知，例如pEG_乙烯基 颯描述於 Morpurgo，M·等人，J. Bioconjugate Chem. 7 (1996) 363-368中。直鏈及分支鏈PEG種類均適於製備式工 化合物。反應性PEG試劑之實例為碘-乙醯基·曱氧基_pEG 及甲氧基-PEG-乙烯基砜。此等碘活化物質之用途在此項 技術中已知，例如已由Hermanson，G.T·在Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego (1996)，第 147_!48 頁中描述。 123528.doc -27- 200819468 如本文中所用之”極性胺基酸”係指選自由半胱胺酸（c)、 天冬胺酸（D)、麵胺酸（E)、組胺酸（H)、天冬醯胺酸（n)、 麩醯胺酸（Q)、精胺酸（R)、絲胺酸（8)及蘇胺酸（τ)組成之 群之胺基酸。離胺酸亦為極性胺基酸，但將其排除在外， 因為離胺酸根據本發明經取代。精胺酸較佳用作極性胺基 酸。 醫藥調配物 根據本發明製造之PEG化IGF_I4IGF-It異體提供改良 之循環穩定性’從而使得可在較低施用間隔下遍及全身持 續接觸IGF-I受體。 本發明之化合物可根據用於製備醫藥組合物之方法進行 調配’熟習此項技術者已知該等方法。為製備該等組合 物，較佳藉由對含有醫藥組合物之所需成份之水溶液透析 或透濾將根據本發明之PEG化IGIM或IGF小變異體與醫藥 學上可接受之載劑以混合物形式組合。該等可接受之載劑 描述於（例如）由〇sl〇等人編之Remingt〇nfs pharmaceutical 心咖，第 18 版，Mack Publishing c〇mpany(例 士第143 5-1712頁中）中。典型組合物含有有效量之根據 本t明之物質（例如約01 mg/mls 1〇〇 ，以及適合 置之載劑。組合物可非經腸投與。根據本發明之PEG化 IGF I或IGF-Ι變異體較佳係經由腹膜内、皮下、靜脈内或 鼻内施用而投與。 <根據本發明之醫藥調配物可根據此項技術中已知之方法 來衣備通$，將PEG化IGF-I或IGF-I變異體之溶液對意 123528.doc -28- 200819468 欲用於醫藥組合物中之緩衝液透析或透濾且藉由濃縮或稀 釋來調節所需最終蛋白質濃度。 提供以下實例及圖式用以幫助理解本發明，本發明之真 實範疇係在所附申請專利範圍中提出。應瞭解可在不悖離 本發明之精神之情況下對所提出之程序作出修改。胺基酸 之名稱係使用一個字母編碼（例如R)或三個字母編碼（例如 Arg)來縮寫。 序列清單 SEQ ID ΝΟ:1 人類10?-1之胺基酸序列（來自8\¥丨33?1*〇1 P01343 之胺基酸 49-118)。 SEQ ID NO:2 融合蛋白 px3036—IAG_R K27R K65R K68之胺基酸序列 SEQ ID NO:3 融合蛋白 px3036_IAEE_Fl K27R K65R K68之胺基酸序列 SEQ ID NO:4 融合蛋白 px3036—IAFX—FI K27R K65R L) SEQ ID NO:5 K68之胺基酸序列 融合蛋白 px3036_IAFX—F2 K27R K65R K68之胺基酸序列 SEQ ID NO:6-10 連接子 SEQ ID ΝΟ:11-18 裂解序列 SEQ ID NO:19-21 其他 SEQ ID NO:22 融合蛋白 px3036—IAG_R K27R K65 K68R之胺基酸序列 SEQ ID NO:23 融合蛋白 px3036—IAEE_F1 K27R K65 123528.doc -29- 200819468 K68R之胺基酸序列 SEQ ID NO:24 融合蛋白 px3036—IAFX_F 1 K27R K65 K68R之胺基酸序列 SEQ ID NO:25 融合蛋白 px3036—IAFX_F2 K27R K65 K68R之胺基酸序列 實例 實例1 製得以下（式I)之具有原肽之突變體（包含IGF-I-變異體 RRK)：
突變體 Xi X2 n Y Px3036JAG K27R K65R K68 無 KAKRFKKH 6 PRPP Px3036JAG_R K27R K65R K68 無 RARRFRRH 6 PRPP Px3036 IAEE FI K27RK65RK68 s NTEHNREH 6 PRPP Px3036 IAFX FI K27RK65RK68 N IEGRH 6 PRPP Px3036 IAFX F2 K27R K65R K68 N TEFENIEH 6 PRPP K68_單-PEG化IGF-I-變異體（RRK變異體）之製備 所用表現載體及大腸桿菌菌株描述於EP 0 972 838中。 自生長於選擇性瓊脂培養盤上表現融合蛋白px3036_IAG_R K27R K65R K68、px3036_IAEE_F 1 K27R K65R K68、 px3036__IAFX__Fl K27R K65R K68 或 px3036—IAFXJF2 K27R K65R K68之大腸桿菌純系，將一個接種環轉移至 (100 ml)選擇性培養基中且在37°C下培養13小時至光學密 度（578 nm)為2-4。其後6小時將此培養物儲存於冰上，隨 後在37°C下進行主要培養物之自動接種。藉由添加1.0 mM IPTG在50之光學密度（578 nm)下起始IGF-I突變體之表 現。整個醱酵持續長達16小時。藉由在SDS-PAGE凝膠上 123528.doc -30- 200819468 比較產物蛋白質帶與IGF標準物帶之體積強度來以密度量 測法測定蛋白質之量。藉由離心收集培養物肉湯。 為獲得經純化包涵體（IB)物質，使用以下程序來處理自 標準醱酵收集之生物質：將生物質用TrisMgS〇4緩衝液 7)再懸浮且補充〇·3 g/i〇〇 g生物乾重。將溶菌酶及5 u/i呂 生物乾重Benz〇nase培育20分鐘且均質化。添加3〇 un §生 • 物乾重Benzonase且在37t下培育60分鐘。添加每公升〇·5 (, [Brij緩衝液且在室溫下培育3〇分鐘。在離心後，將離心 塊再懸浮於300 ml Tris-EDTA緩衝液/100 g生物濕重（經純 化IB濕重）中’在室溫下培育3 〇分鐘且離心。在室溫下將 每公升1 g IB溶解於6.8 Μ胍-HC卜0.1 M TrisHC卜0.1 Μ DTT(PH 8,5)中隔夜。在4°C下將混濁溶液對6·8 μ胍_HC1、 〇·1 M TrisHCl(PH 8·0)透析。透析後，藉由離心移除不溶 性組份。藉由在室溫下將prodGF]溶液5〇倍稀釋於〇 8 Μ 精胺酸、（Μ M TrisHCM、〇·1 Μ胍-HCM、1 mM GSH、1 mM GSSG(PH 8·5)中來進行摺疊。兩小時後，將溶液補充 2 Μ氯化鈉，過濾且以1〇 mi/min之流動速率施用於HIC管 柱（Butyl Sepharose 4 Fast Flow ； GE5 Amersham • Biosciences)上，該管柱已在室溫下用含有2 M NaC卜0.8 • M精胺酸、0.1 M TrisHCl、〇·ΐ Μ胍-HC1之緩衝液（ΡΗ 8·5) 平衡。將管柱用平衡緩衝液洗滌直至達到基線且隨後用1〇 倍管柱體積之以平衡緩衝液起始且以含有〇, 1 M TrisHC1、 5%乙二醇之緩衝液（pH 8·5)終止之線性梯度溶離。藉由逆 相高效層析（rpHPLC)來分析經溶離之溶離份。彙集含有具 123528.doc -31- 200819468 有正確形成之SS橋之蛋白質的溶離份。在4。〇下將池對5〇 mM硼酸鈉（pH 9.〇)透析。將經NHS活化之40 kDa分枝 PEG(mPEG MW 2〇’〇〇〇之N_羥基琥珀醯亞胺（NHs)醋 (mPEG2NHS ^ US 5?932?462，Nektar Shearwater P〇lymers? H_sville，AL))溶解於冰冷之2瘦HQ中且立即添加至經 透析蛋白質溶液（PEG-試劑/蛋白質莫耳比為2:1)中。在冰 上培育1小時及2小時後，將相同量之酸性㈤即⑺屮則溶 液添加至蛋白質/PEG反應混合物中。在第三次添加相同量 之酸性mPEG2-NHS溶液後（總共6倍莫耳過量之pEG試 劑），將反應物在冰上再培fl小時。藉由添加固體氯化銨 且再培育45分鐘來終止反應且隨後調節至pH 8〇(參見圖 1) 。將蛋白質/PEG反應混合物補充來自淋病雙球菌（2型）之 IgAl蛋白酶（w/w比為1:5〇)且在室溫下培育隔夜（參見圖 2) 。將反應混合物用50 mM乙酸（pH 4.5)1:2稀釋且隨後施 用於陽離子 IEC 管柱（MacroCap SP support ; GE，Amersham
Bioscnences，Uppsala, Sweden)上，該管柱已用 5〇 mM 乙酸 平衡。將管柱洗滌直至達到基線且隨後用2〇倍管柱體積之 以50 mM乙酸起始且以補充！ “氣化鈉之5〇 酸終止 之線性.梯度溶離。藉由SDS-PAGE來分析經溶離之溶離 份。將含有具有約60 kDa之估算相對分子尺寸之單一帶的 溶離份彙集作為K68-單PEG化IGF-I(參見圖3)。藉由分析 尺寸排阻層析（SEC)以靜態光散射偵測、騰蛋白酶水解物 之MS分析、Asp-N水解物之MS分析及分析陽離子iec來證 實鑑別K68-單PEG化IGF-I。除K68-單PEG化IGF_I之外， 123528.doc -32- 200819468 未發現其他PEG化異變異體（isovariant)。 實例2 製得以下（式I)之具有原肽之突變艟（包含IGF-I·變異體 RKR)：
突變體 Xi X2 n Y Px3036JAG K27R K65 K68R 無 KAKRFKKH 6 PRPP Px3036_IAG R_K27R K65 K68R 無 RARRFRRH 6 PRPP Px3036JAEE_Fl K27RK65 K68R S NTEHNREH 6 PRPP Px3036 IAFX FI K27RK65 K68R N IEGRH 6 PRPP Px3036—IAFX—F2 K27R K65 K68R N TEFENIEH 6 PRPP K65_單_PEG化IGF-I·變異體（RKR變異體）之製備 所用表現載體及大腸桿菌菌株描述於EP 0 972 838中。 自生長於選擇性瓊脂培養盤上表現融合蛋白px3036_IAG_R K27R K65 K68R、px3036_IAEE__F 1 K27R K65 K68R、 px3036_IAFX^Fl K27R K65 K68R 或 px3036_IAFX_F2 K27R K65 K68R之大腸桿菌純系，將一個接種環轉移至 (100 ml)選擇性培養基中且在37°C下培養13小時至光學密 (J 度（578 nm)為2-4。其後6小時將此培養物儲存於冰上，隨 後在37°C下進行主要培養物之自動接種。藉由添加1·〇 ηιΜ IPTG在50之光學密度（578 nm)下起始IGF-I突變體之表 - 現。整個醱酵持續長達16小時。藉由在SDS-PAGE凝膠上 比較產物蛋白質帶與IGF標準物帶之體積強度來以密度量 測法測定蛋白質之量。藉由離心收集培養物肉湯。 為獲得經純化包涵體（IB)物質，使用以下程序來處理自 標準醱酵收集之生物質：將生物質用TrisMgS04緩衝液（pH 7)再懸浮，且補充0.3 g/100 g生物乾重。將溶菌酶及5 U/1 123528.doc -33- 200819468 g生物乾重Benzonase培育20分鐘且均質化。添加3〇 u/;l g 生物乾重Benzonase且在37t；下培育6〇分鐘。添加每公升 〇·5 L Brij緩衝液且在室溫下培育3〇分鐘。在離心後，將離 心塊再懸浮於300 ml Tris-EDTA緩衝液/loo g生物濕重（經 純化IB濕重）中，在室溫下培育3〇分鐘且離心。在室溫下 將每公升1 g IB溶解於6·8 Μ胍-HC卜0.1 M TrisHCl、0.1 M DTT(pH 8.5)中隔夜。在4°c下將混濁溶液對6 8 乂胍_ HC1、〇·1 M TrisHCl(pH 8·0)透析。透析後，藉由離心移除 不溶性組份。藉由在室溫下將pr〇_IGF-I溶液5〇倍稀釋於 0.8 Μ 精胺酸、0.1 M TrisHCl、〇·1 Μ 胍-HC1、1 mM GSH、1 mM GSSG(pH 8.5)中來進行摺疊。2小時至48小時 後’較佳2小時至24小時後，將溶液補充2 μ氣化鈉，過濾 且以10 ml/min之流動速率施用於HIC管柱（Butyl Sephar〇se
4 Fast Flow; GE，Amersham Biosciences)上，該管柱已在 室溫下用含有2 M NaC卜〇·8 M精胺酸、0.1 M TrisHCl、 〇，l M胍-HC1之緩衝液（pH 8.5)平衡。將管柱用平衡緩衝液 洗條直至達到基線且隨後用1 〇倍管柱體積之以平衡緩衝液 起始且以含有0·1 M TrisHCl、5%乙二醇之緩衝液（PH 8.5) 終止之線性梯度 >谷離。藉由逆相高效層析（rpHpLc)來分析 經’谷_之 >谷離份。茱集含有具有正確形成之$ ^橋之蛋白質 的溶離份。在4°C下將池對50 mM硼酸鈉（pH 9.0)透析。將 經NHS活化之40 kDa分枝PEG(mPEG MW 20,000之N-羥基 琥轴醯亞胺（NHS)酯（mPEG2NHS，US 5,932,462，Nektar Shearwater Polymers，Huntsville，AL))溶解於冰冷之 2 mM 123528.doc -34- 200819468 HC1中且立即添加至經透析蛋白質溶液（peg_試劑/蛋白質 莫耳比為2:1)中。在冰上培育丨小時及2小時後，將相同量 之酸性mPEG2_NHS溶液添加至蛋白質/pEG反應混合物 中。在第三次添加相同量之酸性mPEG2_NHS溶液後（總共6 仏莫耳過$之pEG試劑），將反應物在冰上再培育1小時。 2由添加固體氯化銨且再培育45分鐘來終止反應且隨後調 節至pH 8.0(參見圖υ。將蛋白質/PEG反應混合物補充來自 淋病雙球菌（2型）之igAl蛋白酶（w/w比為1:5〇)且在室溫下 坧月隔夜（麥見圖2)。將反應混合物用5〇 mM乙酸（pH 4·5)1:2稀釋且隨後施用於陽離子IEC管柱㈧狀⑺以口 ^pport ； GE? Amersham Bi〇sciences? Uppsala, Sweden) 上"亥官柱已用5 0 mM乙酸平衡。將管柱洗滌直至達到基 線且卩返後用2〇倍管柱體積之以5〇 mM乙酸起始且以補充^ Μ氯化鈉之5〇 mM乙酸終止之線性梯度溶離。藉由SDS_ PAGE來分析經溶離之溶離份。將含有具有約之估 算相對分子尺寸之單一帶的溶離份彙集作為&65_單pEG化 WF-I。藉由分析尺寸排阻層析（SEC)以靜態光散射偵測、 胰蛋白酶水解物之MS分析、Asp-N水解物之MS分析及分 析陽離子IEC來證實鑑別K65-單PEG化IGF_I。 實例3 在活體内K68單PEG化IGF-I-變異體RRK使大腦可溶性Ap 減少 為#估K68單PEG化IGF-I變異體rrk(40 kD， PEG2)(PEG-RRK)關於降低可溶性Αβ含量之功效，將具有 123528.doc -35- 200819468 嚴重殿粉樣空斑負荷之9_ i Q個月大之B6. i 52H小鼠（表現人 類APP及PS2突變體之雙轉瘦基因小鼠）藉由每週兩次皮下 庄射5 pg/kg pEG_RRK重複治療。在μ天後偵測皮質 APP、Αβ及肌動蛋白含量。pEG_RRK未顯著改變App/肌動 蛋白比率（圖4A)，從而表明在14天内pEG_RRK對轉殖基因 表現無影響。相比之下，PEG_RRK顯著降低Αβ/肌動蛋白 (圖4Β)及Αβ/ΑΡΡ(圖4〇比率。此指示pEG_RRi^Ap清除
C/ 之與其由轉殖基因製造無關之積極影響。 【圖式簡單說明】 圖1 :單PEG化融合蛋白之肽分析。 PEG化之前及之後摺疊融合蛋白iSDS_pAGE分析。 色帶1，標準蛋白質之混合物（牛肺抗蛋白酶，6.0 kDa ;雞蛋白溶菌酶，14·4 kDa ;黃豆胰蛋白酶抑制 劑’ 2 1 · 5 kDa ;牛紅血球碳酸酐酶，3 1 · 0 kDa ;豬肌 肉乳酸脫氫酶，36·5 kDa;牛肝麩胺酸脫氫酶，55.4 kDa ;牛血清白蛋白，66.3 kDa ;兔肌肉石粦酸化酶 b，97.4 kDa ;大腸桿菌β-半乳糖苷酶，97.4 kDa ; 兔肌肉肌凝蛋白，200 kDa);色帶2，PEG化前之 pro-IGF-I ;色帶 3，PEG化後之 pro-IGF-I。 圖2 :單PEG化IGF-I變異體之肽分析。
IgA裂解之前及之後PEG化融合蛋白之SDS-PAGE分 析。色帶1，標準蛋白質之混合物（與圖1中相同）； 色帶2，IgA蛋白酶裂解前之反應混合物；色帶3， I g A蛋白酶裂解後之反應混合物。 123528.doc -36 * 200819468 圖 3 : SDS PAGE。 PEG化之前及之後摺疊融合蛋白之SDS-PAGE分析。 色帶1，標準蛋白質之混合物（與圖1中相同）；色帶 2，IEC前之反應混合物；色帶3，IEC之流過；色帶 4-19，自IEC之單一溶離溶離份。 圖4 : B6.152H小鼠中PEG-RRK之活體内大腦AP降低。 將9-10個月齡之雙轉殖基因B6.152H小鼠用媒劑 (NaCl)或PEG-RRK(5 pg/kg，皮下，每週兩次）處理 1 4天。製備可溶性大腦提取物且如所述評估APP、 Αβ及肌動蛋白含量。評估APP/肌動蛋白、Αβ/肌動 蛋白及Αβ/ΑΡΡ比率，以對照物之％表示。A，ΑΡΡ/ 肌動蛋白；Β，Αβ/肌動蛋白；C，Αβ/ΑΡΡ。上部圖 表展示單一動物資料點，下部圖表展示包括統計學 差異之條形圖表示（平均士 SEM)(*，對未經處理之對 照物ρ<0·05 ; **，對未經處理之對照物ρ<0·01， η=10) 〇 123528.doc -37- 200819468 序列表 <110>瑞士商赫孚孟拉羅股份有限公司
<120>製造類胰島素生長因子I及聚乙二醇之結合物之方法 <130> 23907 FT <140> 096132101 <141> 2007-08-29 <150> EP06018170 <151> 2006-08-31 <160> 25 <170> Patentln version 3.2 T嫫o R.i 1 7 p人 >>>> 0 12 3 t—I I—ί I—< T—I 2 2 2 2 <220> <221〉 misc_feature <223> " 人類IGF-I之胺基酸序列（來自SwissProt P01343之胺基酸49-118) <400> 1
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gin Phe 1 5 10 15
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 20 25 30
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gin Thr Gly lie Val Asp Glu Cys Cys 35 40 45
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 50 55 60
Lys Pro Ala Lys Ser Ala 65 70 <21〇> 2 <211> 89 <212> PRT <213〉 人造 <220> <223〉融合蛋白px3〇36jAG_R K27R K65R K68之胺基酸序列 <400> 2 123528.doc 200819468
Met His His His His His His Arg Ala Arg Arg Phe Arg Arg His Pro 1 5 10 15
Arg Pro Pro Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala 20 25 30
Leu Gin Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Arg Pro Thr 35 40 45
Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gin Thr Gly He Val Asp 5〇 55 60
Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys 65 70 75 80
Ala Pro Leu Arg Pro Ala Lys Ser Ala 85 0 12 3 f—I i—I ϊi *—f 2 2 2 2 < v < <
<220> <223> 融合蛋白 Px3036JAEE一F1 <400> 3
Met Ser His His His His His His Asn His Asn Arg Glu His Pro Arg 10 15
Pro Pro Gly pr〇 Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu 20 25 30
Gin Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Arg Pro Thr Gly 35 40 45
Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gin Thr Gly He Val Asp Glu 50 55 60
Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala 65 70 75 80
Pro Leu Arg pr〇 Ala Lys Ser Ala 85 123528.doc 2- 200819468 <210> 4 <211〉 87 <212> PRT <213〉 人造 <220> <223> 融合蛋白px3036JAFX_Fl K27R K65R K68之胺基酸序列 <400> 4
Met Asn His His His His His His lie Glu Gly Arg His Pro Arg Pro 1 5 10 15
Pro Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gin 20 25 30
Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Arg Pro Thr Gly Tyr 35 40 45
Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gin Thr Gly lie Val Asp Glu Cys 50 55 60
Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro 65 70 75 80
Leu Arg Pro Ala Lys Ser Ala 85 <210〉 5 <211> 90 <212> PRT <213〉人造 <22〇> <223〉融合蛋白px3036_IAFX_F2 K27R K65R K68之胺基酸序列 <400> 5
Met Asn His His His His His His Thr Glu Phe Glu Asn lie Glu His 1 5 10 15
Pro Arg Pro Pro Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp 20 25 30
Ala Leu Gin Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Arg Pro 35 40 45 123528.doc 200819468
Thr Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gin Thr Gly lie Val 50 55 60
Asp Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr 65 70 75 80
Cys Ala Pro Leu Arg Pro Ala Lys Ser Ala 85 90 <21〇> 6 <211> 8 <212> PRT <213〉 人造 <220> <223>連接子 <400> β
Lys Ala Lys Arg Phe Lys Lys His 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213〉 人造 <220> <223> 連接子 <4〇〇> 7
Arg Ala Arg Arg Phe Arg Arg His 1 5
<210〉 8 <211> 8 <212> PRT <213〉 人造 <22〇> <223〉連接子 <4〇0> 8
Asn Thr Glu His Asn Arg Glu His 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213〉人造 4- 123528.doc 200819468 <22〇> <223>連接子 <400> 9 lie Glu Gly Arg 1
His 5 Γ: <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213〉 人造 <220> <223>連接子 <400> 10 Thr Glu Phe Glu 1
Asn lie Glu His 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213〉 人造 <220> <223〉裂解序列 <400> 11 Pro Arg Pro Pro 1
Gly Pro 5
<210> 12 <211> 4 <212> PRT <213〉人造 <22〇> <223>裂解序列 <400> 12 Ala Pro Arg Pro 1 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213〉 人造 <22〇> <223>裂解序列 123528.doc 200819468 <4〇0> 13
Pro Ala Pro Arg Pro 1 5 <21〇> <211> 14 5 <212> <213> PRT 人造 <220> <223> 裂解序列 <400> 14
Pro Ala Pro Gly Pro 1 5 <21〇> <211> 15 4 <212> <213> PRT 人造 <22〇> <223〉裂解序列 <4〇〇> 15
Pro Pro Gly Pro <21〇> <211> 16 6 <212> <213> PRT 人造 <22〇> <223> 裂解序列 <40〇> 16
Pro Arg Pro Pro Gly Pro 1 5 <210> <211> 17 7 <212> <213> PRT 人造 <22〇> <223> 裂解序列 <4〇0> 17 123528.doc -6 200819468
Ala Pro Arg Pro Pro Gly Pro 1 5 <210〉 18 <211> 8 <212> PRT <213〉 人造 <22〇> <223〉 裂解序列 <400> 18 Pro Ala Pro Arg 1
Pro Pro Gly Pro 5
<210〉 19 <211> 7 <212> PRT <213> 人造 <220> <223〉 其他 <40〇> 19 Ser His His His 1
His His His 5 <210〉 20 <211> 7 <212> PRT <213〉人造 <22 0〉 <223〉其他 <4〇〇> 20 Asn His His His 1
His His His 5 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> 人造 <220> <223> 其他 <400> 21
His His His His His His 1 5 123528.doc 200819468 <210> 22 <211> 89 <212> PRt <213〉 人造 <220> <22 3〉融合蛋*px3〇36_lAG_R K27R K65 K68R之胺基酸序列 <400> 22
Met His His His His His His Arg Ala Arg Arg Phe Arg Arg His Pro 1 5 10 15
Arg Pro Pro Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala 20 25 30
Leu Gin Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Arg Pro Thr
Gly Tyr Qly ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gin Thr Gly He Val Asp 50 55 60
Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys 65 70 7 5 80
Ala Pro Leu Lys Pro Ala Arg Ser Ala 85 <210> 23 <211> 88 <212〉 pr丁 <213〉人造 <220> <223>融合蛋白px3036JAEE_Fl K27R K65 K68R之胺基酸序列 <400> 23
Met Ser His His His His His His Asn His Asn Arg Glu His Pro Arg 1 5 10 15
Pro Pr〇 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu 20 25 30
Gin Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Arg Pro Thr Gly 35 4〇 45 123528.doc 200819468
Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gin Thr Gly lie Val Asp 5 0 55 60
Glu
Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys 65 70 75
Ala 80
Pro Leu Lys Pro Ala Arg Ser Ala 85 <210> 24 <211> 87 <212> PRT <213〉 人造 <220> <223> 融合蛋白px3036_IAFX_Fl K27R K65 K68R之胺基酸序列f ： <400> 24 Met Asn His His His His His His lie Glu Gly Arg His Pro Arg 1 5 . 10 15
Pro
Pro Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu 20 25 30
Gin
Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Arg Pro Thr Gly 35 40 45
Tyr
Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gin Thr Gly lie Val Asp Glu 50 55 60
Cys L)
Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala 65 7〇 75
Pro 80
Leu Lys Pro Ala Arg Ser Ala 85 <21〇> 25 <211> 90 <212〉 PRT <213〉 人造 <220> <223〉融合蛋白px3036_IAFX_F2 K27R K65 K68R之胺基酸序列 <400> 25 123528.doc 200819468
Met Asn His His His His His His Thr Glu Phe Glu Asn lie Glu His 15 10 15
Pro Arg Pro Pro Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp 20 25 30
Ala Leu Gin Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Arg Pro 35 40 45
Thr Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gin Thr Gly lie Val 50 55 60
Asp Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr 65 70 75 80
Cys Ala Pro Leu Lys Pro Ala Arg Ser Ala 85 90 -10- 123528.doc

Claims (1)

  1. 200819468 十、申請專利範圍： 1. 一種用於製造離胺酸-PEG化IGF-Ι或IGF-Ι變異體之方 法，該變異體包含一或兩個選自由離胺酸27、65及/或68 組成之群的胺基酸獨立經另一個極性胺基酸取代，其特 徵在於 a) 培養包含一種表現載體含有編碼一種融合蛋白之核酸 之原核宿主細胞，其中該融合蛋白包含該IGF-Ι或 IGF-Ι變異體N端與一種原肽（pro peptide)之c端連接， b) 該原肽在C端以胺基酸-Y-pro終止，其中γ係選自由 Pro、Pro-Ala、pr〇-Gly、Pro-Thr、Ala-Pro、Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro 或 Pro-Arg-Pro 組成之群， c) 回收及PEG化該融合蛋白， d) 用IgA蛋白麵裂解該peg化融合蛋白，及 e) 回收該PEG化IGF-Ι或IGF-Ι變異體。 2. 如請求項1之方法，其特徵在於該原肽係由下式顯示 Met-X 丨- Hisn-X2-Y-Pr〇*» 其中 • Met表示曱硫胺酸， • χι為一鍵、絲胺酸或天冬醯胺酸， • His為組胺酸， • η為一個〇至1〇之數， • X2為一個連接肽，其係選自由肽此卩ID ν〇：6-1(κ& 成之群， • Pro為脯胺酸，及 123528.doc 200819468 • Υ係選自由？1'〇、？1*〇-八比、？1'〇-〇以、？1*〇-丁111'、八^ Pro、Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro 或 Pro-Arg-pro 組 成之群。 3. 如請求項1或2之方法，其特徵在於該原肽不包含離胺酸 殘基。 4. 如請求項1或2之方法，其特徵在於該（等）極性胺基酸獨 立地為精胺酸、麩醯胺酸或天冬醯胺酸。 5. 如凊求項1或2之方法，其特徵在於該離胺酸_peg化IGF-Ϊ變異體係在離胺酸殘基65及68單PEG化或二PEG化。 6·如睛求項5之方法’其特徵在於該離胺酸—peg化IGF-Ι變 異體為RRK且該變異體係在離胺酸殘基68單peg化，或 該離胺酸-PEG化IGF_I變異體為RKR且該變異體係在離 胺酸殘基65單PEG化。 7·如凊求項5之方法，其特徵在於該離胺酸—peg化IGF-I變 異體為RKK且該變異體係在離胺酸殘基65及68單PEG化 或 ^一 P E G 4 匕。 8. 如晴求項5之方法，其特徵在於該離胺酸_peg化IGF-I變 異體為RRK、RKR或RKK之混合物且該變異體係在離胺 酸殘基65及68單PEG化或二PEG化。 9. 如睛求項1或2之方法，其特徵在於該離胺酸_pEC^IGF_ Ϊ係隨機單PEG化或二PEG化。 10·如請求項1或2之方法，其特徵在於該pEG具有20 kDa至 1 00 kDa之總分子量。 1 1 ·如请求項1或2之方法，其特徵在於該（等）聚（乙二醇）基 123528.doc 200819468 團為分枝聚（乙二醇）基團。 12· —種融合蛋白，其包含離胺酸_peg化IGF_；^ IGIM變異 體，该變異體包含一或兩個選自由離胺酸27、65及/或68 組成之群的胺基酸獨立經另一個極性胺基酸取代，N端 與種原肽之c端連接，其特徵在於該原肽在c端以胺基 酸-Y-Pro終止’其中 γ係選自由 Pr〇、pr〇_Ala、pr〇_Gly、 Pro-Thr、Ala-Pro、Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro 或 Pro- Arg-Pro組成之群。 13.如請求項12之融合蛋白，其特徵在於該原肽具有多至3〇 個胺基酸之長度。 14·如請求項12或13之融合蛋白，其特徵在於式 Met-XrHiSn-XrY-Pro-RGF-I或 IGF-I變異體]， 其中 • IGF-I表示人類igF-I，IGF-I變異體表示igF-I中一 或兩個選自由離胺酸27、65及/或68組成之群之胺 基酸獨立經另一個極性胺基酸取代， • Met表示甲硫胺酸， • X1為一鍵、絲胺酸或天冬醯胺酸， • His為組胺酸， • η為一個〇至1〇之數， • χ2為一個連接肽，其係選自由肽SEQ ID N0:6-l 0組 成之群， • Pro為脯胺酸，及 • Y係選自由 Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、pr〇-Thr、Ala- 123528.doc . ^ 200819468 Pro、Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro 或 Pro-Arg-Pro 組 成之群。 1 5 · —種離胺酸-PEG化IGF-I，其特徵在於不包含一個N端曱 硫胺酸。 16. —種離胺酸-PEG化IGF_I變異體，其中一或兩個選自由 離胺酸27、65及/或68組成之群之胺基酸獨立經另一個極 性fee基取代’其特徵在於該變異體不包含一個n端甲 硫胺酸。
    1 7. —種醫藥組合物，其包含如請求項丨5之離胺酸化 IGF-I或如請求項16之離胺酸·ρ]Ε〇化異體。 阿茲 18· 一種如請求項15之離胺酸-PEG化IGF-I或如請求項16之 離胺酸-PEG化IGF-I變異體之用途，其係用於製備治療 默氏病（Alzheimer’s disease)(AD)之藥物。 123528.doc 200819468 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（1)圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： (無元件符號說明） 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無） 123528.doc
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Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1674113A1 (en) 2004-12-22 2006-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and poly(ethylene glycol)
US7989160B2 (en) 2006-02-13 2011-08-02 Alethia Biotherapeutics Inc. Polynucleotides and polypeptide sequences involved in the process of bone remodeling
US8168181B2 (en) 2006-02-13 2012-05-01 Alethia Biotherapeutics, Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15
CL2007002502A1 (es) 2006-08-31 2008-05-30 Hoffmann La Roche Variantes del factor de crecimiento similar a insulina-1 humano (igf-1) pegilados en lisina; metodo de produccion; proteina de fusion que la comprende; y su uso para tratar la enfermedad de alzheimer.
AU2007291501B2 (en) 2006-08-31 2012-07-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the production of insulin-like growth factor-I
CA2713348C (en) 2008-01-30 2018-10-09 Indiana University Research And Technology Corporation Ester-based peptide prodrugs
WO2009121759A2 (en) * 2008-04-03 2009-10-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of pegylated igf-i variants for the treatment of neuromuscular disorders
AU2009335713A1 (en) * 2008-12-19 2010-07-15 Indiana University Research And Technology Corporation YL-based insulin-like growth factors exhibiting high activity at the insulin receptor
AU2009335715B2 (en) 2008-12-19 2016-09-15 Indiana University Research And Technology Corporation Amide-based insulin prodrugs
US8481485B2 (en) 2008-12-19 2013-07-09 Indiana University Research And Technology Corporation Insulin analogs
US20110152188A1 (en) * 2009-12-23 2011-06-23 Hanns-Christian Mahler Pharmaceutical compositions of igf/i proteins
CN102740896B (zh) * 2010-02-11 2014-08-27 霍夫曼-拉罗奇有限公司 Igf-i聚乙二醇缀合物
US8940860B2 (en) 2010-06-16 2015-01-27 Indiana University Research And Technology Corporation Single-chain insulin agonists exhibiting high activity at the insulin receptor
WO2011163462A2 (en) 2010-06-24 2011-12-29 Indiana University Research And Technology Corporation Amide-based insulin prodrugs
GB201012784D0 (en) 2010-07-29 2010-09-15 Ucb Pharma Sa Method
EP2793932B1 (en) 2011-12-20 2018-10-03 Indiana University Research and Technology Corporation Ctp-based insulin analogs for treatment of diabetes
ES2723885T3 (es) 2012-07-19 2019-09-03 Daiichi Sankyo Co Ltd Anticuerpos anti-Siglec-15
CA2886228A1 (en) 2012-09-26 2014-04-03 Indiana University Research And Technology Corporation Insulin analog dimers
CA2904332A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Indiana University Research And Technology Corporation Insulin-incretin conjugates
WO2014205617A1 (en) * 2013-06-24 2014-12-31 Shandong University Lanthanide labeled peptide and use thereof
WO2015049630A1 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Novartis Ag Insulin-like growth factor mimetics for use in therapy
UY35874A (es) 2013-12-12 2015-07-31 Novartis Ag Un proceso para la preparación de una composición de proteínas pegiladas
EP3206710B1 (en) 2014-09-24 2020-05-06 Indiana University Research & Technology Corporation Incretin-insulin conjugates
ES2947409T3 (es) 2014-09-24 2023-08-08 Univ Indiana Res & Tech Corp Profármacos de insulina a base de amida lipídica
CN109072242A (zh) * 2016-02-23 2018-12-21 科罗拉多州立大学董事会法人团体 用于治疗神经损伤的基于肽的方法
WO2020150313A1 (en) 2019-01-18 2020-07-23 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Amphipathic alpha-helical antimicrobial peptides treat infections by gram-negative pathogens

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3486216T2 (de) 1983-04-25 1994-02-17 Chiron Corp Hybrid-DNS-Synthesis von reifen insulinähnlichen Wachstumsfaktoren.
IL71991A (en) 1983-06-06 1994-05-30 Genentech Inc Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US6235488B1 (en) 1988-09-29 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Surface preparation for chemical-specific binding
ES2085297T3 (es) 1989-05-27 1996-06-01 Sumitomo Pharma Procedimiento para preparar derivados de poli(etilenglicol) y proteina modificada.
US6723699B1 (en) * 1989-06-05 2004-04-20 Cephalon, Inc. Treating disorders by application of insulin-like growth factors and analogs
US5093317A (en) * 1989-06-05 1992-03-03 Cephalon, Inc. Treating disorders by application of insulin-like growth factor
DE3924705A1 (de) 1989-07-26 1991-01-31 Boehringer Mannheim Gmbh Heterobifunktionelle verbindungen
US5158875A (en) * 1989-08-25 1992-10-27 Amgen Inc. Production of biologically active insulin-like growth factor i from high expression host cell systems
NZ236819A (en) 1990-02-03 1993-07-27 Max Planck Gesellschaft Enzymatic cleavage of fusion proteins; fusion proteins; recombinant dna and pharmaceutical compositions
US5681814A (en) 1990-06-07 1997-10-28 Genentech, Inc. Formulated IGF-I Composition
JP3051145B2 (ja) 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
US5861373A (en) 1991-08-01 1999-01-19 Genentech, Inc IGF-1 to improve the neural condition
DE69218948T2 (de) 1991-08-01 1997-07-31 Auckland Uniservices Ltd IGF-I zur Verbesserung der neuronale Lage
EP0679095A1 (en) 1992-11-25 1995-11-02 Amgen Boulder Inc. Modified insulin-like growth factors
EP0756494A1 (en) 1994-05-24 1997-02-05 Amgen Boulder Inc. Modified insulin-like growth factors
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5741776A (en) * 1995-05-22 1998-04-21 Genentech, Inc. Method of administration of IGF-I
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
JP2001511162A (ja) 1997-02-06 2001-08-07 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 付加され、そして／又は除去された付着基を有するポリペプチド−ポリマー結合体
US20030204864A1 (en) * 2001-02-28 2003-10-30 Henry Daniell Pharmaceutical proteins, human therapeutics, human serum albumin, insulin, native cholera toxic b submitted on transgenic plastids
US6767892B1 (en) 1997-11-07 2004-07-27 Chrion Corporation Compositions providing for increased IGF-I solubility
US7067485B2 (en) 1997-11-07 2006-06-27 Chiron Corporation IGF-I composition and its use
US6248546B1 (en) 1998-03-09 2001-06-19 Diagnostic Systems Laboratories, Inc. Assay of IGFBP complex
AU3764199A (en) 1998-04-29 1999-11-16 Genentech Inc. Spray dried formulations of igf-i
US6436897B2 (en) 1998-06-01 2002-08-20 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical formulations for IGF/IGFBP
EP0972838B1 (en) 1998-07-15 2004-09-15 Roche Diagnostics GmbH Escherichia coli host/vector system based on antibiotic-free selection by complementation of an auxotrophy
DK1141015T3 (da) 1999-01-06 2010-01-25 Genentech Inc Insulin-lignende vækstfaktor (IGF) I-mutantvarianter
PT1141014E (pt) 1999-01-06 2005-04-29 Genentech Inc Variante mutante do factor de crescimento semelhante a insulina (igf-i)
EP1165119B1 (en) 1999-04-08 2003-10-08 Genentech, Inc. Composition based on oppositely-charged polypeptides
US6596849B1 (en) 1999-05-28 2003-07-22 Academia Sinica Monoclonal-antibody for analysis and clearance of polyethylene glycol and polyethylene glycol-modified molecules
US7431921B2 (en) 2000-04-14 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
WO2001088149A1 (fr) * 2000-05-16 2001-11-22 Center For Advanced Science And Technology Incubation, Ltd. Polypeptides de clivage de repetitions telomeriques
EP1282437B1 (en) * 2000-05-16 2008-03-19 Genentech, Inc. Treatment of cartilage disorders
US20040014652A1 (en) 2000-06-01 2004-01-22 Andre Trouet Tumor activated prodrug compounds and methods of making and using the same
EP1286700A2 (en) 2000-06-01 2003-03-05 Universite Catholique De Louvain Tumor activated prodrug compounds
EP1370282A2 (en) 2000-10-13 2003-12-17 Chiron Corporation Method for treating ischemic events affecting the central nervous system
ES2311560T3 (es) 2000-12-07 2009-02-16 Eli Lilly And Company Proteinas de fusion glp-1.
AU2002259281A1 (en) 2001-05-21 2002-12-03 Nektar Therapeutics Al, Corporation Antibodies specific for poly(ethylene glycol)
RS20050501A (en) * 2002-12-26 2007-08-03 Mountain View Pharmaceuticals Inc., Polymer conjugates of cytokines,chemokines,growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
EP1674113A1 (en) * 2004-12-22 2006-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and poly(ethylene glycol)
AU2006203882B2 (en) 2005-01-07 2011-05-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. IGF-1 fusion polypeptides and therapeutic uses thereof
MX2008012146A (es) * 2006-03-28 2008-10-03 Biogen Idec Inc Anticuerpos anti-receptor 1 de factor de crecimiento tipo insulina (igf-1r) y uso de los mismos.
CL2007002502A1 (es) 2006-08-31 2008-05-30 Hoffmann La Roche Variantes del factor de crecimiento similar a insulina-1 humano (igf-1) pegilados en lisina; metodo de produccion; proteina de fusion que la comprende; y su uso para tratar la enfermedad de alzheimer.
WO2009121759A2 (en) 2008-04-03 2009-10-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of pegylated igf-i variants for the treatment of neuromuscular disorders

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