JP5184532B2 - インスリン様増殖因子ｉおよびポリ（エチレングリコール）の抱合体の産生のための方法 - Google Patents
インスリン様増殖因子ｉおよびポリ（エチレングリコール）の抱合体の産生のための方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、ポリ（エチレングリコール）（PEG）とのインスリン様増殖因子I（IGF-I）の抱合体の産生のための方法、このような抱合体を含有する医薬組成物、およびこのような抱合体の使用の方法に関するものである。
アルツハイマー病（AD）は、65歳を超えるヒトのうち、認知症の全体の場合の約50％〜60％を占める神経変性の増加的に蔓延している形態である。ADは今のところ、世界中で概算で1500万人に影響を及ぼし、その集団中の高齢者の相対的な増加により、その有病率が次の20〜30年にわたって増加するようである。ADは、臨床的な症状の発症および死亡の間の平均期間が約8.5年である進行性障害である。より高次の精神機能と関連した脳領域における錐体神経細胞の死滅および神経細胞シナプスの損失の結果として、認知機能の全体の進行性の機能障害を特徴とする典型的な症状を生じる（Francis, P.T., et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 66 (1999) 137-147）。ADは、世界中で老年認知症および初老期認知症の両者の最も普遍的な形態であり、記憶、知的機能の増大する損失および発話における撹乱とともに存在する容赦なく進行する認知症として臨床的に認識されている（Merritt, A Textbook of Neurology, 6th ed., Lea& Febiger, Philadelphia (1979), pp. 484-489）。神経病理学的に、ADの主要な特徴は、2つの特徴的な障害：アミロイド老年性プラークおよび神経原線維濃縮体（NFT）の存在である。プラークは、神経細胞外に沈着するが、濃縮体は、死後の脳中に神経細胞内に観察される。アミロイドプラーク中心の主要成分の1つは、病理学的に沈着された小アミロイドβペプチド（Aβ）であり、前記Aβは、アミロイド前駆体タンパク質（APP）からセクレターゼによって切断される（Selkoe, D.J., Physiol. Rev. 81 (2001) 741-766、Hardy, J. and Selkoe, DJ., Science 297 (2002) 353-356、Bush, A.I. and Tanzi, R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 7317- 7319）。39〜43残基の自己凝集ペプチドであるAβ（分子量最大4kDa）は、より大きなAPP（110〜120kDa）の一部として合成される。APPは、大きなN末端細胞外ドメイン、単一膜貫通ドメインおよび短い細胞質テイルを有するI型膜内在性糖タンパク質である。Aβ領域は、APPの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインの部分に及ぶ。ADにおける神経細胞死滅におけるAPPの関与に関する最も普遍的な仮説は、アミロイド仮説である。この仮説は、プラークアミロイド沈着または部分的に凝集した可溶性Aβが、神経毒性カスケードを惹起し、これによりAD症状と類似した神経変性を生じることを仮定する（Selkoe, DJ., Physiol. Rev. 81 (2001) 741-766、Hardy, J. and Selkoe, D.J., Science 297 (2002) 353-356）。
ヒトインスリン様増殖因子（IGF-I）は、インスリンと構造的に関連した循環ホルモンである。IGF-Iは、末梢組織に及ぼす増殖ホルモンの作用の主要介在物質であると伝統的に考えられている。IGF-Iは、70個のアミノ酸からなり、ソマトメジンCとも呼ばれ、SwissProt No. P01343によって定義される。使用、活性および産生は、例えば、le Bouc, Y., et al., FEBS Lett. 196 (1986) 108-112; de Pagter-Holthuizen, P., et al., FEBS Lett. 195 (1986) 179-184; Sandberg Nordqvist, A.C., et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 12 (1992) 275-277; Steenbergh, P.H., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 175 (1991) 507-514; Tanner, J.M., et al., Acta Endocrinol. (Copenh.) 84 (1977) 681-696; Uthne, K., et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 39 (1974) 548-554; EP 0 123 228; EP 0 128 733; US 5,861,373; US 5,714,460; EP 0 597 033; WO02/32449; WO93/02695に記載される。
IGF-Iの機能の制御は、非常に複雑である。循環において、IGF-Iのたった0.2％が、遊離形態で存在するのに対し、大部分は、IGFに対して非常に高い親和性を有しおよびIGF-Iの機能を調節するIGF結合タンパク質（IGFBP）に結合する。因子は、プロテアーゼによるIGFBPのタンパク質分解など、IGF-Iを放出するメカニズムによって局所的に遊離され得る。
IGF-Iは、発達中のおよび成熟した脳においてパラクリンの役割を担う（Werther, G.A., et al., Mol. Endocrinol. 4 (1990) 773-778）。インビトロでの研究は、IGF-Iが、ドーパミン作動性ニューロン（Knusel, B., et al., J. Neurosci. 10(1990) 558-570）およびオリゴデンドロサイト（McMorris, F.A., and Dubois-Dalcq, M., J. Neurosci. Res. 21 (1988) 199-209、McMorris, F.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 822-826、Mozell, R.L., and McMorris, F.A., J. Neurosci. Res. 30 (1991) 382-390)）を含む中枢神経系におけるニューロンのいくつもの種類に関する強力な非選択的栄養剤であることを示す（Knusel, B., et al., J. Neurosci. 10(1990) 558-570、Svrzic, D., and Schubert, D., Biochem. Biophys. Res. Commun. 172 (1990) 54-60）。米国特許第5,093,317号は、コリン作動性ニューロン細胞の生存が、IGF-Iの投与によって増強することを示す。IGF-Iが、末梢神経の再生を刺激し（Kanje, M., et al., Brain Res. 486 (1989) 396-398）、およびオルニチンデカルボキシラーゼ活性を亢進することはさらに公知である（米国特許第5,093,317号）。米国特許第5,861,373号およびWO93/02695は、患者の中枢神経系においてIGF-Iおよび/またはそのアナログの活性のある濃度を亢進させることによって、グリア細胞および/または非コリン作動性ニューロン細胞に支配的に影響する、中枢神経系に対する傷害または中枢神経系の疾病を治療する方法を記載する。WO02/32449は、哺乳動物の鼻腔へ、IGF-Iまたはその生物活性のある変異体の治療的有効量を含む医薬組成物を投与することによって、哺乳動物の中枢神経系において虚血性損傷を低下または予防するための方法に関する。IGF-Iまたはその変異体は、鼻腔を通じて吸収され、虚血事象と関連した虚血性損傷を低下または予防するのに効果的な量で、哺乳動物の中枢神経系中へと輸送される。EP 0 874 641は、エイズ関連認知症、AD、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン病、肝性脳症、皮質基底神経節症候群（cortical-basal ganglionic syndrome）、進行性認知症、痙性不全対麻痺を有する家族性認知症、進行性核上麻痺、多発性硬化症、シルダーの脳性硬化症（cerebral sclerosis of Schilder）または急性壊死性出血性脳脊髄炎による中枢神経系におけるニューロン損傷を治療または予防するための薬物の製造のためのIGF-IまたはIGF-IIの使用を主張し、この中で、前記薬物は、血液脳関門または血液脊髄関門の外側での該IGFの有効量の非経口的投与のための形態にある。
遊離IGF-Iの脳レベルおよび血清レベルの低下は、ADの散発性形態および家族性形態の病変形成と関連付けられてきた。さらに、IGF-Iは、Aβ誘発性神経毒性に対してニューロンを保護する（Niikura, T., et al., J. Neurosci. 21 (2001) 1902-1910; Dore, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 4772-4777; Dore, S., et al., Ann. NY Acad. Sci. 890 (1999) 356-364）。近年、末梢投与されたIGF-Iが、ラットおよびマウスにおいて脳Aβレベルを低下できることが示された（Carro, E., et al., Nat. Med. 8 (2002) 1390-1397）。さらに、その研究は、トランスジェニックADマウスモデルにおいて、長期化したIGF-I治療が、脳アミロイドプラーク負荷を有意に低下させることを示した。これらのデータは、脳からAβを除去することによって、IGF-Iが脳Aβレベルおよびプラーク関連脳認知症を低下できるという見解を強力に支持する。
ポリ（エチレングリコール）（PEG）とのタンパク質の共有結合性修飾は、身体中のタンパク質の循環半減期を延長するための有用な方法であることを証明した（Hershfield, M.S., et al., N. Engl. J. Med. 316 (1987) 589-596; Meyers, F.J., et al., Clin. Pharmacol. Ther. 49 (1991) 307-313; Delgado, C, et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 9 (1992) 249-304; Katre, Advanced Drug Delivery Reviews 10 (1993) 91-114; EP-A 0 400 472; Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69; Satake-Ishikawa, R., et al., Cell Struct. Funct. 17 (1992) 157-160; Katre, N.V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 1487-1491; Tsutsumi, Y., et al., Jpn. J. Cancer Res. 85 (1994) 9-12; Inoue, H., et al, J. Lab. Clin. Med. 124 (1994) 529-536; Chamow, S.M., et al., Bioconjugate Chem. 5 (1994) 133-140）。
ペグ化の他の利点は、溶解度の増大およびタンパク質の免疫原性における低下である（Katre, N.V., J. Immunol. 144 (1990) 209-213）。タンパク質のペグ化のための普遍的な方法は、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）のようなアミノ反応性試薬を用いて活性化したポリ（エチレングリコール）の使用である。このような試薬を用いて、ポリ（エチレングリコール）は、リジン残基のN末端αアミノ基およびεアミノ基等の遊離一次アミノ基にあるタンパク質へ付着する。しかしながら、このアプローチの主要な制限は、タンパク質が、多量のリジン残基を典型的に含有し、したがって、ポリ（エチレングリコール）基が、遊離εアミノ基のすべてにおいて非特異的様式でタンパク質へ付着し、結果として、ランダムなペグ化されたタンパク質の異種性産物の混合物を生じることである。したがって、多くのNHSによりペグ化されたタンパク質は、低い特異的活性のため、市販の用途に不適切である。不活性化は、生物活性に必要とされる1つ以上のリジン残基またはN末端アミノ残基の共有結合性修飾から、またはタンパク質の活性化部位近くでのもしくは活性化部位でのポリ（エチレングリコール）残基の共有結合性付着から結果的に生じる。例えば、NHSペグ化試薬を使用するヒト増殖ホルモンの修飾は、タンパク質の生物活性を10倍超ほど低下させることが発見された（Clark, R., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 21969-21977）。ヒト増殖ホルモンは、N末端アミノ酸に加えて、9個のリジンを含有する。これらのリジンのいくつかは、受容体結合に重大であることが公知のタンパク質の領域中に位置する（Cunningham, B.C., et al., Science 254 (1991) 821-825）。さらに、アミノ反応性ポリ（エチレングリコール）試薬の使用によるエリスロポエチンの修飾も、生物活性のほぼ完全な損失を結果的に生じる（Wojchowski, D.M., et al., Biochim. Biophys. Acta 910 (1987) 224-232）。アミノ反応性ペグ化試薬を用いたインターフェロンα2の共有結合性修飾は、生物活性の40〜75％の損失を結果的に生じる（米国特許第5,382,657号）。G-CSFの同様の修飾は、活性の60％超の損失（Tanaka, H., et al., Cancer Res. 51 (1991) 3710- 3714）およびインターロイキン2の同様な修飾は、生理活性の90％の損失を結果的に生じる（Goodson, R. J., and Katre, N. V., BioTechnology 8 (1990) 343-346）。
WO94/12219およびWO95/32003は、PEGおよびIGFまたはシステインにより変異を受けたIGFを含むポリエチレングリコール抱合体を主張し、該PEGは、変異タンパク質のN末端領域中の遊離システインにおいて該変異タンパク質へ付着する。WO2004/60300は、N末端的にペグ化されたIGF-Iを記載する。
IgAプロテアーゼの認識部位は、Yaa-Pro.!.Xaa-Proとして記載される。Yaaは、Pro（またはまれにAla、GlyもしくはThrとの組み合わせ：Pro-Ala、Pro-Gly、またはPro-Thr）を表す。Xaaは、Thr、SerまたはAlaを表す（Pohlner, J. et al., Bio/Technology 10 (1992) 799-804; Pohlner, J. et al., Nature 325 (1987) 458-462;および米国特許第5,427,927号）。天然切断部位は、Wood, S. G. and Burton J., Infect. Immun. 59 (1991) 1818-1822によって同定された。Neisseria gonorrhoea（2型）由来の免疫グロブリンA1プロテアーゼのための合成ペプチド基質は、自己タンパク質分解部位Lys-Pro-Ala-Pro.!.Ser-Pro、Val-Ala-Pro-Pro.!.Ser-Pro、Pro-Arg-Pro-Pro.!.Ala-Pro、Pro-Arg-Pro-Pro.!.Ser-Pro、Pro-Arg-Pro-Pro.!.Thr-ProならびにIgA1切断部位Pro-Pro-Thr-Pro.!.Ser-ProおよびSer-Thr-Pro-Pro.!.Thr-Proである。
WO 2006/066891は、インスリン様増殖因子I（IGF-I）変異体が、野生型IGF-Iアミノ酸配列の3個までのアミノ酸位置27、37、65、68でアミノ酸変化を有し、それにより該アミノ酸の1個または2個がリジンであり、およびアミノ酸27が、極性アミノ酸であるがリジンではなく、該リジンの一次アミノ基を介して抱合され、およびポリ（エチレングリコール）基が、20〜100kDaの全体的な分子量を有することを特徴とする、IGF-I変異体および1個または2個の該ポリ（エチレングリコール）基からなる抱合体を開示する。このような抱合体は、アルツハイマー病のような神経変性障害の治療に有用である。WO2006/074390は、IGF-I融合ポリペプチドを指す。
本発明は、別の極性アミノ酸によって独立して置換されるリジン27、65および/または68からなる群より選択される1個または2個のアミノ酸を含む、リジンのペグ化されたIGF-Iまたはリジンのペグ化されたIGF-I変異体の産生のための方法であって、
a）プロペプチドのC末端へN末端的に連結された該IGF-IまたはIGF-I変異体を含む融合タンパク質をコードする核酸を含有する発現ベクターを含む原核宿主細胞を培養すること、
b）該プロペプチドが、アミノ酸-Y-Proを有するC末端で終わり、ここで、Yが、Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Thr、Ala-Pro、Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro、またはPro-Arg-Proからなる群より選択されること、
c）該融合タンパク質を回収およびペグ化すること、
d）該ペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体を回収すること
を特徴とする。
a）プロペプチドのC末端へN末端的に連結された該IGF-IまたはIGF-I変異体を含む融合タンパク質をコードする核酸を含有する発現ベクターを含む原核宿主細胞を培養すること、
b）該プロペプチドが、アミノ酸-Y-Proを有するC末端で終わり、ここで、Yが、Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Thr、Ala-Pro、Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro、またはPro-Arg-Proからなる群より選択されること、
c）該融合タンパク質を回収およびペグ化すること、
d）該ペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体を回収すること
を特徴とする。
一実施態様において、該方法は、リジンのペグ化されたIGF-I変異体が、RRKであり、および該変異体が、リジン残基68でモノペグ化され、またはリジンのペグ化されたIGF-I変異体が、RKRであり、および該変異体が、リジン残基65でモノペグ化されることを特徴とする。
別の実施態様において、該方法は、リジンのペグ化されたIGF-I変異体がRKKであり、および該変異体が、リジン残基65および68においてモノペグ化またはジペグ化されることを特徴とする。
別の実施態様において、該方法は、リジンのペグ化されたIGF-I変異体が、RRK、RKRまたはRKKの混合物であり、ならびに該変異体が、リジン残基65および68でモノペグ化またはジペグ化されることを特徴とする。
本発明のさらなる実施態様は、プロペプチドが、アミノ酸-Y-ProでC末端的に終止し、ここで、Yが、Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Thr、Ala-Pro、Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro、またはPro-Arg-Proからなる群より選択されることを特徴とする、該プロペプチドのC末端へN末端的に連結された該IGF-IまたはIGF-I変異体を含む融合タンパク質である。-Y-Pro配列に起因して、プロペプチドは、該IGF-IまたはIGF-I変異体からIgAプロテアーゼ処置によって分離できる。
好ましくは、本発明に従った融合タンパク質は、式Met-X1-Hisn-X2-Y-Pro-[IGF-IまたはIGF-I変異体]を特徴とし、式中、
・IGF-Iが、ヒトIGF-Iを示し、およびIGF-I変異体がIGF-Iを示し、ここで、リジン27、65および/または68からなる群より選択される1個または2個のアミノ酸が、別の極性アミノ酸によって独立して置換され、
・Metが、メチオニンを示し、
・X1が、単結合、セリンまたはアスパラギンであり、
・Hisが、ヒスチジンであり、
・nが、0〜10、好ましくは0〜6の数であり、
・X2が、ペプチド配列番号6〜10からなる群より選択されるリンカーペプチドであり、
・Proが、プロリンであり、および
・Yが、Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Thr、Ala-Pro、Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro、またはPro-Arg-Proからなる群より選択される。
・IGF-Iが、ヒトIGF-Iを示し、およびIGF-I変異体がIGF-Iを示し、ここで、リジン27、65および/または68からなる群より選択される1個または2個のアミノ酸が、別の極性アミノ酸によって独立して置換され、
・Metが、メチオニンを示し、
・X1が、単結合、セリンまたはアスパラギンであり、
・Hisが、ヒスチジンであり、
・nが、0〜10、好ましくは0〜6の数であり、
・X2が、ペプチド配列番号6〜10からなる群より選択されるリンカーペプチドであり、
・Proが、プロリンであり、および
・Yが、Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Thr、Ala-Pro、Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro、またはPro-Arg-Proからなる群より選択される。
好ましくは、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号2〜5および配列番号22〜25の融合タンパク質からなる群より選択される。
好ましくは、プロペプチドは、式Met-X1-Hisn-X2-Y-Pro-によって示され、式中、
・Metが、メチオニンを示し、
・X1が、単結合、セリンまたはアスパラギンであり、
・Hisが、ヒスチジンであり、
・nが、0〜10、好ましくは0〜6の数であり、
・X2が、ペプチド配列番号6〜10からなる群より選択されるリンカーペプチドであり、
・Yが、Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Thr、Ala-Pro、Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro、またはPro-Arg-Proからなる群より選択される。
・Metが、メチオニンを示し、
・X1が、単結合、セリンまたはアスパラギンであり、
・Hisが、ヒスチジンであり、
・nが、0〜10、好ましくは0〜6の数であり、
・X2が、ペプチド配列番号6〜10からなる群より選択されるリンカーペプチドであり、
・Yが、Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Thr、Ala-Pro、Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro、またはPro-Arg-Proからなる群より選択される。
プロペプチドは、IGF-IまたはIGF-I変異体のN末端（グリシン）へC末端的に連結される。好ましくは、プロペプチドは、リジン残基を含まない。プロペプチドは好ましくは、30個までのアミノ酸の長さを有する。好ましくは、X1は単結合である。好ましくはnは、0または6である。好ましくはX2は、ペプチド配列番号7である。好ましくはYは、Ｐro-Arg-Proである。
本発明のさらなる実施態様は、N末端メチオニンを含まないことを特徴とする、リジンのペグ化されたIGF-Iである。
本発明のさらなる実施態様は、リジン27、65および/または68からなる群より選択される1個または2個のアミノ酸が、別の極性アミノ酸によって独立して置換される、リジンのペグ化されたIGF-I変異体であって、該変異体が、N末端メチオニンを含まないことを特徴とする。
好ましくは、該極性アミノ酸は独立して、アルギニン、グルタミンまたはアスパラギンであり、特にアルギニンである。
好ましいIGF-I変異体および融合タンパク質における変異体は：RKK、RKR、RRKである。 RKK, RKR, RRK.（IGF-I変異体は、以下のとおり命名される：K65は、アミノ酸65がリジンであることを意味し、R27は、アミノ酸27がアルギニンであることを意味するなどである。アミノ酸R27、K65、K68を有するIGF-I変異体は、RKKと命名され、該RRK変異体の残りのアミノ酸は、配列番号1のIGF-I野生型において同一である。したがって、RKKは、KからRへの交換によって位置27で変異したIGF-I野生型の変異体である。RKRは、KからRへの交換によって位置27および68で変異したIGF-I野生型の変異体である。RRKは、KからRへの交換によって位置27および65で変異したIGF-I野生型の変異体である。アミノ酸の変化しないIGF-I野生型は、KKKと命名される。
リジンのペグ化されたIGF-Iは、好ましくは、リジン残基27、65および68でランダムにペグ化され、好ましくは、モノペグ化またはジペグ化される（IGF-I分子につき1個または2個のPEG）。リジンのペグ化されたIGF-I変異体は、好ましくは、リジン残基65および68でモノペグ化またはジペグ化され、好ましくはK65またはK68でモノペグ化される。ポリ（エチレングリコール）基は、リジンの一次アミノ基を介して、該IGF-IまたはIGF-I変異体へ抱合される。
本発明に従った方法は、リジンのペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体の調製を含み、活性化された（ポリエチレン）グリコールが、IGF-IまたはIGF-I変異体の一次リジンアミノ基を解して該IGF-I中間体に化学的に結合するような条件下で、本発明に従ったIGF-I融合タンパク質を該（ポリエチレン）グリコールとともに反応させることによって、該ポリ（エチレングリコール）基は、好ましくは、IGF-IまたはIGF-I変異体につき少なくとも20kDaの全体的な分子量を有し、より好ましくは、約20〜100kDaを有し、特に好ましくは20〜80kDaを有する。好ましくは、リジンのペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体は、モノペグ化される。変異体は、好ましくは、アミノ酸位置27、65および68のそれぞれに関してRKK、RKR、RRKからなる群より選択される。PEGは、好ましくは、30〜45kDa、特に30kDaまたは40kDaの平均の全体的な分子量を有する。
本発明はさらに、本発明に従ったリジンのペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体を、医薬的に許容される担体とともに含有する医薬組成物を含む。
本発明はさらに、本発明に従ったリジンのペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体を含有する医薬組成物の製造のための方法を含む。
本発明はさらに、ADの治療のための薬物の調製のための本発明に従ったリジンのペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体の使用を含む。
本発明はさらに、アミノ反応性のペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体の医薬的有効量が、ADの治療を必要とする患者へ、好ましくは1週間に1〜2回の適用において投与されることを特徴とする、このような治療のための方法を含む。
IgAプロテアーゼ、好ましくはNeisseria gonorrhoea由来のIgAプロテアーゼが、アミノ酸配列Y-Pro.!.Gly-Proを切断できることが驚くべきことに発見された。Yは、Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Thr、Ala-Pro、Gly-Pro、Thr-Pro、Arg-Pro、またはPro-Arg-Proからなる群より選択される。好ましくはPro-Pro.!.Gly-Pro（配列番号15）またはPro-Arg-Pro-Pro.!.Gly-Pro（配列番号11）が切断部位として有用である（.!.：切断位置）。本発明に従った処置のためのIgAプロテアーゼ切断部位は、アミノ酸共通配列Y-Pro.!.Gly-Proを有し、これにより、Gly-Proは、IGF-Iの最初の2個のアミノ酸である。Yは好ましくは、アミノ酸Pro、Pro-Ala、Arg-ProまたはPro-Arg-Proで終わるアミノ酸配列を表す。このようなYアミノ酸配列、特にPro-Arg-Proは、例えば、Ala-Pro-Arg-Pro（配列番号12）またはPro-Ala-Pro-Arg-Pro（配列番号13）にあるようなさらなるAla基またはPro-Ala基によって伸長できる。切断アミノ酸配列Pro-Ala-Pro.!.Gly-Pro（配列番号14）、Pro-Pro-.!.Gly-Pro（配列番号15）、Pro-Arg-Pro-Pro.!.Gly-Pro（配列番号16）、Ala-Pro-Arg-Pro-Pro.!.Gly-Pro（配列番号17）またはPro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro.!.Gly-Pro（配列番号18）が、特に好ましい。
本発明によると、「IgAプロテアーゼ」という用語には、IgAを特異的に切断し、例えばNeisseria gonorrhoea（2型）由来のIgA1プロテアーゼなど、Kornfeld, S.J. and Plaut, A.G., Rev. Infekt. Dis. 3 (1981) 521-534によって記載されるプロテアーゼが含まれる。DE-A 36 22 221；Koomey, J.M., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 7881- 7885；Bricker, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 2681- 2685；Pohlner, J., Nature 325 (1987) 458- 462；およびHalter, R., et al., EMBO J. 3 (1984) 15951601において記載されるなどの組換えIgAプロテアーゼも、まさに適している。好ましくは、該IgAプロテアーゼは、Neisseria gonorrhoea由来のIgAプロテアーゼ、好ましくは2型である。好ましくは、Neisseria gonorrhoea由来の該IgA1プロテアーゼ（2型）は、配列番号26の配列を有する。
融合タンパク質をコードする遺伝子は、好ましくは、融合タンパク質が、必要条件に従って生成できるよう、適切な（好ましくは誘導可能な）発現シグナルの調節下に置かれる。適切な原核細胞または真核（植物および動物）細胞は、タンパク質融合の生成のための宿主細胞として使用できるが、無細胞の系も可能である。
本発明に従った処置の好ましい実施態様は、宿主細胞が、組換えDNAまたは組換えベクターで形質転換され、この中で、DNAまたはベクターが、本発明に従った融合タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも1つのコピーを含有し、および形質転換された細胞が、適切な培地中で培養され、融合タンパク質をコードする遺伝子が、形質転換された細胞中で発現させられ、融合タンパク質がペグ化されおよびその後IgAプロテアーゼで切断され、ならびにペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体が単離されることを特徴とする。
本発明に従った融合タンパク質の発現は、例えば、リジンを含まないβ-ガラクトシダーゼ遺伝子のフラグメントとの融合によってDNAレベルで改良でき、すなわち、Yは、リジンを含まないβ-ガラクトシダーゼタンパク質の一部を含有する。融合タンパク質の発現を亢進させるための他の代替例は、当業者に公知である。発現産物の精製および分離は、他のポリペプチド、特に非常に荷電されたポリペプチドもしくはタンパク質（例えば、ポリ（Lys, Arg））または高い親和性で特定の物質へ結合できるポリペプチドもしくはタンパク質（例えば、ストレプトアビジン）との融合によって容易になり得る（例えば、EP-A 0 089 626、EP-A 0 306 610参照）。特に好ましいリンカーペプチドは、好ましくはSHHHHHH（配列番号19）、NHHHHHH（配列番号20）またはHHHHHH（配列番号21）によってN末端的に先行されるペプチド配列番号6〜10である。
本発明は、本発明に従った融合タンパク質をコードし、およびIgAプロテアーゼ切断部位が、プロペプチドおよびIGF-IまたはIGF-I変異体の間の接合領域中に組み込まれる（組換え）核酸も提供する。
本発明に従った組換えDNAは、分子生物学の分野における当業者に公知の様式で得られ得る。このために、IGF-IまたはIGF-I変異体のアミノ酸配列をコードするDNA配列を含有するベクターは通常、この遺伝子の5'末端の領域中の制限エンドヌクレアーゼで切断され、所望の配列を含有するオリゴヌクレオチドと再度連結される。
さらに、本発明は、本発明に従った組換えDNAの少なくとも1個のコピーを含有する組換えベクターも提供する。原核生物におけるタンパク質発現のためのベースとして適切なベクターは、当業者に公知である。このベクターは好ましくは、本発明に従った組換えDNAの高い発現が可能となるベクターである。ベクター上の組換えDNAは好ましくは、誘導可能な発現シグナルの調節下にある（例えば、λ、tac、lacまたはtrpプロモーター）。
本発明に従ったベクターは、染色体外に存在でき（例えば、プラスミド）、および宿主生物（例えば、λバクテリオファージ）のゲノム中に組み込むことができる。本発明に従ったベクターは、好ましくはプラスミドである。特定の宿主生物における遺伝子発現に各場合において適しているベクターは、分子生物学の分野の当業者に公知である。前記ベクターは、真核生物ベクターであり得るが、好ましくは原核生物ベクターである。原核生物における本発明に従ったDNAの発現に適したベクターの例は、例えば、市販のpUCベクターおよびpURベクターである。
本発明は、本発明に従った組換えDNAでおよび/または本発明に従った組換えベクターで形質転換された細胞、好ましくは原核細胞、特に好ましくはE.coli細胞も提供する。
融合タンパク質が、原核生物において発現する場合、不活性の控えめに可溶性の凝集体（屈折体、封入体）が形成される。したがって、融合タンパク質は、その活性化型形態へと形質転換されなければならない。当業者になじみのある手法を使用して（例えば、EP-A 0 219 874、EP A 0 114 506、WO84/03711参照）、まず、変性剤の添加によって可溶化が実施された後、再生および所望の場合さらなる精製工程が実施される。融合タンパク質のIgAプロテアーゼによる処置は、融合タンパク質のペグ化後に実施される。
IgAプロテアーゼで切断されるべきペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体の処置に必要な条件は、重大ではない。しかしながら、このプロセスにおいて、ペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体とIgAプロテアーゼとの重量比が1：1〜500：1、好ましくは100：1であることが好ましい。反応は好ましくは、pH6.5〜8.5のバッファー水溶液中で生じる。バッファー濃度は好ましくは、50〜500mmolの範囲にあり、所望の場合、0〜100mmol/Lの塩化ナトリウムを添加する。切断は好ましくは、室温で少なくとも60分間から5日間まで、好ましくは24〜72時間実施される。
可溶化、再生、ペグ化およびIgAプロテアーゼによる切断の後、このように得られたペグ化された切断産物は好ましくは、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび/またはサイズによる分画によって精製される。この方法で生じたペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体は、位置-1においてメチオニンがなく、好ましくは、ペグ化されていないIGF-IまたはIGF-I変異体のように他のタンパク質がなく、および好ましくは、N末端のペグ化されたプロペプチドがなく、5％（w/w）以下ほどである。
本明細書で使用される「ペグ化されたIGF-IもしくはIGF-I変異体」または「アミノ反応性ペグ化」は、IGF-IまたはIGF-I変異体が、アミノ反応性共役によってポリ（エチレングリコール）基に共有結合することを意味する。PEG基は、リジン側鎖の第一εアミノ基であるIGF-IまたはIGF-I変異体分子の部位で付着する。さらに、ペグ化が、プロペプチドのN末端αアミノ基においてさらに生じることはさらに起こり得る。使用される合成方法および融合タンパク質に起因して、ペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体は、混合物からなり得、これにより、ペグ化の部位が、異なる分子で異なり得、または1分子あたりのポリ（エチレングリコール）側鎖の量および/または分子におけるペグ化の部位に関して実質的に均一であり得る。好ましくは、IGF-IまたはIGF-I変異体は、モノペグ化および/またはジペグ化される。
本明細書で使用されるアミノ反応性ペグ化は、反応性（活性化型）ポリ（エチレングリコール）の使用によって、好ましくはメトキシポリ（エチレングリコール）のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルの使用によって、IGF-IまたはIGF-I変異体の第一リジンアミノ基へポリ（エチレングリコール）鎖をランダムに付着させる方法を指定する。共役反応は、ポリ（エチレングリコール）をリジン残基の反応性第一級εアミノ基および場合により融合タンパク質のN末端アミノ酸のαアミノ基へ付着させる。タンパク質に対するPEGのこのようなアミノ基の抱合は、当技術分野において周知である。例えば、このような方法の総説は、Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417によって付与される。Veroneseによると、タンパク質の一次アミノ基に対するPEGの抱合は、該第一級アミノ基のアルキル化を実施する活性化型PEGを使用することによって実施できる。このような反応のために、活性化型アルキル化PEG、例えば、PEG無水物、塩化PEGトレシルまたはPEGエポキシドが使用できる。さらに有用な試薬は、カルボキシル化されたPEGまたは、クロロホルマートもしくはカルボニルイミダゾールによって末端のヒドロキシ基が活性化されるPEGのヒドロキシスクシンイミジルエステル等のアシル化するPEGである。さらに有用なPEG試薬は、アミノ酸アームを有するPEGである。このような試薬は、いわゆる分岐鎖PEGを含有でき、これにより、少なくとも2つの同一のまたは異なるPEG分子が、ペプチド性スペーサー（好ましくはリジン）によって互いに連結され、および例えば、リジンスペーサーの活性化されたカルボキシラートとしてIGF-IまたはIGF-I変異体へ結合される。
本明細書で使用される「PEGまたはポリ（エチレングリコール）」は、市販の、または当技術分野で周知の方法に従ったエチレングリコールの開環重合によって調製できる水溶性ポリマーを意味する（Kodera, Y., et al., Progress in Polymer Science 23 (1998) 1233-1271; Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18）。「PEG」という用語は、いずれのポリエチレングリコール分子も包含するよう広範に使用され、ここで、エチレングリコール単位の数は、少なくとも460個、好ましくは460〜2300個、および特に好ましくは460〜1840個である（230個のPEG単位は、約10kDaの分子量を指す）。PEG単位の上限数は、リジンのペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体の溶解度によってのみ制限される。通常、2300単位を含有するPEGより大きなPEGは使用されない。好ましくは、本発明において使用されるPEGは、片端においてヒドロキシまたはメトキシで終わり（メトキシPEG、mPEG）、もう片端において、エーテル酸素結合を介してリンカー部分へ共有結合性に付着する。PEGポリマーは、直鎖または分岐鎖のいずれかである。好ましくは、PEGポリマーは分岐鎖である。分岐鎖PEGは、例えば、Veronese, F.M., et al., Journal of Bioactive and Compatible Polymers 12 (1997) 196-207に記載される。有用なPEG試薬は、例えば、Nektar Therapeutics（www.nektar.com）から市販される。分岐鎖PEGは、例えば、グリセロール、ペンタエリスリトール、およびソルビトールを含む多様なポリオールへの酸化ポリエチレンの付加によって調製できる。例えば、4アーム型の分岐鎖PEGは、ペンタエリスリトールおよび酸化エチレンから調製できる。分岐鎖PEGは通常、2〜8個のアームを有し、例えば、EP-A 0 473 084および米国特許第5,932,462号に記載される。リジンの一次アミノ基を介して連結される2つのPEG側鎖を有するPEG（PEG2と略記）が特に好ましい（Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69）。
PEGに関するいかなる分子量も、実際的に望ましいものとして使用でき、例えば、約20kダルトン（Da）〜100kDaである（nは、460〜2300である）。PEGにおける反復単位「n」の数は、ダルトンで記載される分子量に近似する。例えば、2つのPEG分子が、リンカーに付着し、ここで各PEG分子が、10kDaの同一の分子量を有する場合、リンカーにおけるPEGの全体の分子量は、約20kDaである。リンカーへ付着したPEGの分子量も異なり得、例えば、リンカーにおける2個の分子のうち、1個のPEG分子は5kDaであり得、および1個のPEG分子は15kDaであり得る。分子量は常に、平均分子量を意味する。
以下の実施例において、アミノ反応性IGF-IまたはIGF-I変異体の生成のためのいくつかの好ましい試薬が記載される。例えば、Veronese, F. M., Biomaterials 22 (2001) 405-417によって記載される方法に基づいた修飾は、プロセスが、本発明に従ったリジンのペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体を結果として生じる限り、手法において実施できることは理解される。
本発明は、特性の改良されたIGF-IまたはIGF-I変異体のペグ化型の生成のための方法を提供する。このようなリジンのペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体は、これにランダムに付着する直鎖または分岐鎖PEGを含有し、これにより、リジンのペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体におけるすべてのPEG基の全体的な分子量が、好ましくは約20〜80kDaである。分子量のこの範囲からのわずかなずれは、ペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体が、脳においてAβペプチドレベルを低下させる上で活性を示す限り可能である。また、80kDaを超える分子量を有するPEGは、より高い生物学的利用率を結果的に生じる。しかしながら、このような活性は、低下したIGF-I受容体活性化および血液脳関門輸送に起因して分子量が増大するにつれて低下することは期待される。したがって、PEGの分子量についての20〜100kDaの範囲は、ADを罹患している患者の効率的な治療に有用なリジンのペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体に関する最適化された範囲として理解されなければならない。
RKK、RKRおよびRRKからなる群より選択されるモノペグ化されたIGF-I変異体が好ましく生成され、ここで、分岐鎖PEG基は、30〜45、好ましくは40〜45kDaの分子量を有する（約920PEG単位）。例えば、PEGについて44kDaの平均分子量およびIGF-Iについて7.6kDaの分子量に基づいて、このようなモノPEG-IGF-Iの算出された平均分子量は、約51.6kDaである。40kDaの分子量のN-ヒドロキシスクシンイミジルにより活性化された分岐鎖PEGエステル（mPEG2-NHS）の使用は特に好ましい（Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69; Veronese, F.M., et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12 (1997) 197-207; 米国特許第5,932,462号）。PEGが30kDaまたは40kDaの平均分子量を有する、モノペグ化されたIGF-Iも好ましく生成される。
本明細書で使用されるように、「分子量」は、PEGの平均分子量を意味する。
IGF-IまたはIGF-I変異体の以下のペグ化型は、好ましい生成物であり、本発明に従った方法によって利用可能である：
−K65モノペグ化されたIGF-I変異体、好ましくはRRKまたはRKK変異体、より好ましくはRRK変異体、ここで、PEG基は、20〜80kDaの分子量を有する（460〜1840PEG単位）；
−K68モノペグ化されたIGF-I変異体、好ましくはRKRまたはRKK変異体、より好ましくはRKR変異体、ここで、PEG基は、20〜80kDaの分子量を有する（460〜1840PEG単位）；
−ジペグ化されたIGF-I変異体、好ましくはRKK変異体、ここで、PEG基は、各々約10〜50kDaの分子量を有する（230〜1150PEG単位）；およびその混合物；
−K68モノペグ化されたIGF-I変異体、好ましくはRRKまたはRKK変異体、より好ましくはRRK変異体であり、40kDaの分子量のPEG2基を含む；
−K65モノペグ化されたIGF-I変異体、好ましくはRKRまたはRKK変異体、より好ましくはRKR変異体であり、40kDaの分子量のPEG2基を含む；
−PEG基が、20〜80kDaの分子量を有するモノペグ化されたIGF-I（460〜1840PEG単位）；
−PEG基が各々約10〜50kDaの分子量を有する（230〜1150PEG単位）ジペグ化されたIGF-I；
−40kDaの分子量のPEG2基を含む、モノペグ化されたIGF-I。
−K65モノペグ化されたIGF-I変異体、好ましくはRRKまたはRKK変異体、より好ましくはRRK変異体、ここで、PEG基は、20〜80kDaの分子量を有する（460〜1840PEG単位）；
−K68モノペグ化されたIGF-I変異体、好ましくはRKRまたはRKK変異体、より好ましくはRKR変異体、ここで、PEG基は、20〜80kDaの分子量を有する（460〜1840PEG単位）；
−ジペグ化されたIGF-I変異体、好ましくはRKK変異体、ここで、PEG基は、各々約10〜50kDaの分子量を有する（230〜1150PEG単位）；およびその混合物；
−K68モノペグ化されたIGF-I変異体、好ましくはRRKまたはRKK変異体、より好ましくはRRK変異体であり、40kDaの分子量のPEG2基を含む；
−K65モノペグ化されたIGF-I変異体、好ましくはRKRまたはRKK変異体、より好ましくはRKR変異体であり、40kDaの分子量のPEG2基を含む；
−PEG基が、20〜80kDaの分子量を有するモノペグ化されたIGF-I（460〜1840PEG単位）；
−PEG基が各々約10〜50kDaの分子量を有する（230〜1150PEG単位）ジペグ化されたIGF-I；
−40kDaの分子量のPEG2基を含む、モノペグ化されたIGF-I。
ペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体は、実質的に均一である。調製物は、未反応の（すなわちPEG基を欠失している）タンパク質を少量含有し得る。ペプチドマッピングによって確認されるように、変異体は、少なくとも90％（w/w）である。モノペグ化および/またはジペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体の分離を含むこのような調製物のさらなる精製は、通常の精製方法によって、好ましくは、分子ふるいクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって、および/またはイオン交換クロマトグラフィー、特に陽イオン交換クロマトグラフィーによって実施できる。
本明細書で使用される「モノペグ化された」は、IGF-IまたはIGF-I変異体が、IGF-IまたはIGF-I変異体分子あたりたった1個のリジンでペグ化されることを意味する。
「活性化型PEGまたは活性化型PEG試薬」は、当技術分野において周知である。好ましくは、ポリ（エチレングリコール）のアルコキシ酪酸スクシンイミジルエステル（「低級アルコキシ-PEG-SBA」）またはポリ（エチレングリコール）のアルコキシプロピオン酸スクシンイミジルエステル（「低級アルコキシ-PEG-SPA」）またはN-ヒドロキシスクシンイミドにより活性化されたPEG等の、求電子的に活性化されたPEGが使用される。活性化型エステルをアミンと反応させてアミドを形成するいずれの従来法も利用できる。活性化型PEGのIGF-Iとの反応において、例証されるスクシンイミジルエステルは、アミド形成を生じる脱離基である。タンパク質との抱合体を生成するためのスクシンイミジルエステルの使用は、米国特許第5,672,662号に開示される。
使用される反応条件は、異なってペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体の相対的な量に影響を及ぼす。反応条件（例えば、試薬の比率、pH、温度、タンパク質濃度、反応時間等）を操作することによって、異なるペグ化種の相対的な量は変動し得る。好ましくは、反応は、場合により30％（v/v）までのエタノールを含有するpH8〜10のバッファー水溶液中で実施される。タンパク質：PEGのモル比は、好ましくは1：1〜1：6、好ましくは1：2〜1：5である。反応温度および反応時間は、当業者の知識に従って変動でき、これにより、高温および長い反応時間の結果として、増大したペグ化が生じる。モノペグ化されたタンパク質が生成される場合、したがって、4℃〜22℃で30分間までまたは60分間まで作業することが好ましい。ペグ化試薬が、好ましくは、約9.0〜9.5のpH、約1：3〜1：4のタンパク質：PEG比、および4℃の反応温度で、50mMホウ酸ナトリウムおよび25％エタノールからなる反応バッファー中でIGF-IまたはIGF-I変異体と組み合わせられる場合、モノペグ化、ジペグ化された種の混合物およびトリペグ化された種の痕跡量が、タンパク質中のLys残基の存在に応じて生じる。
本発明に従ったリジンのペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体は、IGF-IまたはIGF−I変異体の一次リジンアミノ基を二機能性試薬と共有結合性に反応させて、アミド連結を有する中間体を形成し、およびアミド連結を含有する中間体を活性化型ポリ（エチレングリコール）誘導体と共有結合性に反応させて、リジンのペグ化されたIGF-IまたはIGF−I変異体を形成することによって調製され得る。上述のプロセスにおいて、二機能性試薬は好ましくは、N-スクシンイミジル-S-アセチルチオプロピオナートまたはN-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセタートであり、活性化型ポリ（エチレングリコール）誘導体は好ましくは、ヨード-アセチル-メトキシ-PEG、メトキシ-PEG-ビニルスルホン、およびメトキシ-PEG-マレイミドからなる群より選択される。
活性化型PEG誘導体は、当技術分野で公知であり、例えば、PEG-ビニルスルホンについてはMorpurgo, M., et al., J. Bioconjugate Chem. 7 (1996) 363-368に記載される直鎖および分岐鎖PEG種は、式Iの化合物の調製に適している。反応性PEG試薬の例は、ヨード-アセチル-メトキシ-PEGおよびメトキシ-PEG-ビニルスルホンである。これらのヨードにより活性化された物質の使用は、当技術分野で公知であり、例えば、Hermanson, G.T., in Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996), pp. 147-148によって記載される。
本明細書で使用される「極性アミノ酸」は、システイン（C）、アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）、ヒスチジン（H）、アスパラギン（N）、グルタミン（Q）、アルギニン（R）、セリン（S）およびスレオニン（T）からなる群より選択されるアミノ酸を指す。リジンも極性アミノ酸であるが、リジンが、本発明に従って置換されるので除外される。アルギニンは好ましくは、極性アミノ酸として使用される。
医薬製剤
本発明に従って生成されたペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体は、低い適用間隔で身体の至るところでIGF-I受容体への持続したアクセスを可能にする循環において改良された安定性を提供する。
本発明に従って生成されたペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体は、低い適用間隔で身体の至るところでIGF-I受容体への持続したアクセスを可能にする循環において改良された安定性を提供する。
本発明の化合物は、当業者に公知である、医薬組成物の調製のための方法に従って製剤できる。このような組成物の作製のために、本発明に従ったペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体は、医薬的に許容される担体との混合物中で、好ましくは医薬組成物の所望の成分を含有する水溶液に対する透析または透析濾過によって組み合わされる。このような許容される担体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, Mack Publishing Company, edited by Oslo et al.に記載される（例えばpp.1435〜1712）。典型的な組成物は、本発明に従った物質の有効量、例えば約0.1〜100mg/mLを、担体の適切な量とともに含有する。組成物は、非経口的に投与され得る。本発明に従ったペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体は、好ましくは腹腔内、皮下、静脈内または鼻腔内適用を介して投与される。
本発明に従った医薬製剤は、当技術分野で公知の方法に従って調製できる。通常、ペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体の溶液は、医薬組成物中で使用されるよう企図されたバッファーに対して透析または透析濾過され、所望のタンパク質終濃度は、濃縮または希釈によって調整される。
以下の実施例および配列は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、付随する特許請求の範囲において説明される。本発明の精神から逸脱せずに説明される手法において、改変がなされ得ることは理解される。アミノ酸の名称は、1文字コード（例えば、R）または3文字コード（例えば、Arg）のいずれかを使用して略記される。
（式I）のプロペプチドを有する（IGF-I変異体RRKを含む）以下の変異体を作製した。
K68モノペグ化されたIGF-I変異体（RRK変異体）の調製
使用される発現ベクターおよびE.coliは、EP 0 972 838に記載される。選択的アガープレート上で増殖し、融合タンパク質px3036_IAG_R K27R K65R K68、px3036_IAEE_Fl K27R K65R K68、px3036_IAFX_Fl K27R K65R K68またはpx3036_IAFX_F2 K27R K65R K68を発現するE.coliクローンから、1回の白金耳を（100mLの）選択培地へ転移させ、37℃で13時間、2〜4の光学密度（578nm）になるまで培養した。この培養物を次の6時間氷上で保存した後、主要培養物の自動播種を37℃で実施した。50の光学密度（578nm）で1.0mM IPTGの添加で、IGF-I変異体の発現を開始した。全体的な発酵は、16時間まで持続する。SDS-PAGEゲル上の産物のタンパク質バンドの容積測定強度をIGF標準物質のバンドと比較することによって、タンパク質の量を濃度測定で測定する。培養ブロスを遠心分離によって回収する。
使用される発現ベクターおよびE.coliは、EP 0 972 838に記載される。選択的アガープレート上で増殖し、融合タンパク質px3036_IAG_R K27R K65R K68、px3036_IAEE_Fl K27R K65R K68、px3036_IAFX_Fl K27R K65R K68またはpx3036_IAFX_F2 K27R K65R K68を発現するE.coliクローンから、1回の白金耳を（100mLの）選択培地へ転移させ、37℃で13時間、2〜4の光学密度（578nm）になるまで培養した。この培養物を次の6時間氷上で保存した後、主要培養物の自動播種を37℃で実施した。50の光学密度（578nm）で1.0mM IPTGの添加で、IGF-I変異体の発現を開始した。全体的な発酵は、16時間まで持続する。SDS-PAGEゲル上の産物のタンパク質バンドの容積測定強度をIGF標準物質のバンドと比較することによって、タンパク質の量を濃度測定で測定する。培養ブロスを遠心分離によって回収する。
精製された封入体（IB）材料を得るために、標準物質の発酵から回収されたバイオマスを次の手法で処理した：バイオマスをトリスMgSO4バッファーpH7で再懸濁し、0.3g/100g生物乾燥重量を補充した。リゾチームおよび5U/1g生物乾燥重量ベンゾナーゼを20分間インキュベートし、ホモジナイズした。30U/1g生物乾燥重量ベンゾナーゼを添加し、37℃で60分間インキュベートした。0.5Lブリッジバッファー/Lを添加し、RTで30分間インキュベートした。遠心分離後、300mLのトリス-EDTA-バッファー/100g生物湿重量（精製されたIB湿重量）中にペレットを再懸濁し、RTで30分間インキュベートし、遠心分離した。6.8Mグアニジン-HCl、0.1MトリスHCl、0.1M DTT、pH8.5中で1g/LのIBを室温で一晩可溶化した。濁った溶液を6.8Mグアニジン-HCl、0.1MトリスHCl、pH8.0に対して4℃で透析した。透析後、遠心分離によって不溶性成分を除去した。室温で、プロIGF-I溶液を0.8Mアルギニン、0.1MトリスHCl、0.1Mグアニジン-HCl、1mM GSH、1mM GSSH、pH8.5中へ50倍希釈することによって、フォールディングを実施した。2時間後、溶液に2M塩化ナトリウムを補充し、濾過し、2M NaCl、0.8Mアルギニン、0.1MトリスHCl、0.1Mグアニジン-HCl、pH8.5を含有するバッファーを用いて室温で平衡化したHICカラム（Butyl Sepharose 4 Fast Flow; GE, Amersham Biosciences）へ、10mL/分の流速で適用した。ベースラインに到達するまでカラムを平衡化バッファーで洗浄した後、平衡化バッファーで開始し、0.1MトリスHCl、5％エチレングリコール、pH8.5を含有するバッファーで終了する直線勾配の10カラム容積で溶出した。逆相高速クロマトグラフィー（rpHPLC）によって、溶出した画分を分析した。正確に形成されたSS架橋を有するタンパク質を含有する画分をプールした。50mMホウ酸ナトリウム、pH9.0に対して、プールを4℃で透析した。NHS活性化型40kDa分岐鎖PEG（mPEG分子量20,000のN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステル（mPEG2NHS、米国特許第5,932,462号、Nektar Shearwater Polymers, Huntsville, AL））を氷冷2mM HCl中に可溶化し、透析されたタンパク質溶液（PEG試薬/タンパク質モル比2：1）へ即時添加した。氷上で1時間および2時間のインキュベーションの後、酸性mPEG2-NHS溶液の同一量を、タンパク質/PEG反応混合物へ添加した。酸性mPEG2-NHS溶液の同一量の3回目の添加の後（PEG試薬の全体的な6倍モル過剰量）、反応物を氷上でさらに1時間インキュベートした。固体塩化アンモニウムの添加およびさらなる45分間のインキュベーションによって反応を停止した後、pH8.0に調整した（図１参照）。タンパク質/PEG反応混合物にNeisseria gonorrhoea（2型）由来のIgA1プロテアーゼを補充し（w/w比1：50）、室温で一晩インキュベートした（図２参照）。反応混合物を50mM酢酸pH4.5で1：2に希釈した後、50mＭ酢酸で平衡化された陽イオンIECカラム（MacroCap SP support; GE, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）へ適用した。ベースラインに到達するまでカラムを洗浄した後、50mM酢酸で開始し、1M塩化ナトリウムを補充した50mM酢酸で終了する直線勾配の20カラム容積で溶出した。溶出した画分をSDS-PAGEによって分析した。約60kDaの概算された相対的な分子サイズを有する単一バンドを含有する画分を、K68モノペグ化型IGF-Iとしてプールした（図３参照）。K68モノペグ化型IGF-Iの同一性を、静的光散乱検出を使用する分析用分子ふるいクロマトグラフィー（SEC）、トリプシン消化物のMS分析、Asp-N消化物のMS分析および分析用陽イオンIECによって確認した。K68モノペグ化型IGF-I以外の他のペグ化イソ変異体（isovariant）は発見できなかった。
（式I）のプロペプチドを有する（IGF-I変異体RKRを含む）以下の変異体を作製した。
K65モノペグ化型IGF-I変異体（RKR変異体）の調製
使用するための発現ベクターおよびE..coli系は、EP 0 972 838に記載される。選択的アガープレート上で増殖し、融合タンパク質px3036_IAG_R K27R K65 K68R、px3036_IAEE_Fl K27R K65 K68R、px3036_IAFX_Fl K27R K65 K68Rまたはpx3036_IAFX_F2 K27R K65 K68Rを発現するE.coliクローンから、1回の白金耳を（100mLの）選択培地へ転移し、2〜4の光学密度（578nm）になるまで37℃で13時間培養した。この培養物を次の6時間氷上で保存した後、主要培養物の自動播種を37℃で実施した。50の光学密度（578nm）で1.0mM IPTGの添加で、IGF-I変異体の発現を開始した。全体的な発酵は、16時間まで持続する。SDS-PAGEゲル上の産物のタンパク質バンドの容積測定強度をIGF標準物質のバンドと比較することによって、タンパク質の量を濃度測定で測定する。培養ブロスを遠心分離によって回収する。
使用するための発現ベクターおよびE..coli系は、EP 0 972 838に記載される。選択的アガープレート上で増殖し、融合タンパク質px3036_IAG_R K27R K65 K68R、px3036_IAEE_Fl K27R K65 K68R、px3036_IAFX_Fl K27R K65 K68Rまたはpx3036_IAFX_F2 K27R K65 K68Rを発現するE.coliクローンから、1回の白金耳を（100mLの）選択培地へ転移し、2〜4の光学密度（578nm）になるまで37℃で13時間培養した。この培養物を次の6時間氷上で保存した後、主要培養物の自動播種を37℃で実施した。50の光学密度（578nm）で1.0mM IPTGの添加で、IGF-I変異体の発現を開始した。全体的な発酵は、16時間まで持続する。SDS-PAGEゲル上の産物のタンパク質バンドの容積測定強度をIGF標準物質のバンドと比較することによって、タンパク質の量を濃度測定で測定する。培養ブロスを遠心分離によって回収する。
精製された封入体（IB）材料を得るために、標準物質の発酵から回収されたバイオマスを次の手法で処理する：トリスMgSO4バッファーpH7でバイオマスを再懸濁し、0.3g/100生物乾燥重量リゾチームを補充し、5U/1g生物乾燥重量ベンゾナーゼを20分間インキュベートし、ホモジナイズする。30U/1g生物乾燥重量ベンゾナーゼを添加し、37℃で60分間インキュベートする。0.5Lブリッジバッファー/Lを添加し、RTで30分間インキュベートする。遠心分離後、300mLのトリス-EDTA-バッファー/100g生物湿重量（精製されたIB湿重量）中にペレットを懸濁し、RTで30分間インキュベートし、遠心分離する。6.8Mグアニジン-HCl、0.1MトリスＨＣｌ、0.1M DTT、pH8.5中で1g/LのIBを室温で一晩可溶化する。濁った溶液を6.8Mグアニジン-HCl、0.1MトリスHCl、pH8.0に対して4℃で透析する。透析後、遠心分離によって不溶性成分を除去する。プロIGF-I溶液を0.8Mアルギニン、0.1MトリスHCl、0.1Mグアニジン-HCl、1mM GSH、1mM GSSH、pH8.5中へ50倍希釈することによって、フォールディングを室温で実施する。2〜48時間後、好ましくは2〜24時間後、溶液に2M塩化ナトリウムを補充し、濾過し、2M NaCl、0.8Mアルギニン、0.1MトリスHCl、0.1Mグアニジン-HCl、pH8.5を含有するバッファーで室温で平衡化したHICカラム（Butyl Sepharose 4 Fast Flow; GE, Amersham Biosciences）へ、10mL/分の流速で適用する。ベースラインに到達するまでカラムを平衡化バッファーで洗浄した後、平衡化バッファーで開始し、0.1MトリスHCl、5％エチレングリコール、pH8.5を含有するバッファーで終了する直線勾配の10カラム容積で溶出する。逆相高速クロマトグラフィー（rpHPLC）によって、溶出した画分を分析する。正確に形成されたSS架橋を有するタンパク質を含有する画分をプールした。50mMホウ酸ナトリウム、pH9.0に対して、プールを4℃で透析する。NHS活性化型40kDa分岐鎖PEG（mPEG分子量20,000のN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステル（mPEG2NHS、米国特許第5,932,462号、Nektar Shearwater Polymers, Huntsville, AL））を氷冷2mM HCl中に可溶化し、透析されたタンパク質溶液（PEG試薬/タンパク質モル比2：1）へ即時添加する。氷上で1時間および2時間のインキュベーションの後、酸性mPEG2-NHS溶液の同一量を、タンパク質/PEG反応混合物へ添加する。酸性mPEG2-NHS溶液の同一量の3回目の添加の後（PEG試薬の全体的な6倍モル過剰量）、反応物を氷上でさらに1時間インキュベートする。固体塩化アンモニウムの添加およびさらなる45分間のインキュベーションによって反応を停止した後、pH8.0に調整する（図１参照）。タンパク質/PEG反応混合物にNeisseria gonorrhoea（2型）由来のIgA1プロテアーゼを補充し（w/w比1：50）、室温で一晩インキュベートする（図２参照）。反応混合物を50mM酢酸pH4.5で1：2に希釈した後、50mＭ酢酸で平衡化された陽イオンIECカラム（MacroCap SP support; GE, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）へ適用する。ベースラインに到達するまでカラムを洗浄した後、50mM酢酸で開始し、1M塩化ナトリウムを補充された50mM酢酸で終了する直線勾配の20カラム容積で溶出する。溶出した画分をSDS-PAGEによって分析する。約60kDaの概算された相対的な分子サイズを有する単一バンドを含有する画分を、K65モノペグ化型IGF-Iとしてプールする。静的光散乱検出を有する分析用分子ふるいクロマトグラフィー（SEC）、トリプシン消化物のMS分析、Asp-N消化物のMS分析および分析用陽イオンIECによって、K65モノペグ化型IGF-Iの同一性を確認する。
インビボでのK68モノペグ化型IGF-I変異体RRKによる脳可溶性Aβの低下
可溶性Aβレベルを低下させることに及ぼすK68モノペグ化型IGF-I変異体RRK（40kD、PEG2）（PEG-RRK）の作用強度の評価のために、重度アミロイドプラーク負荷を有する9〜10ヶ月齢のB6.152Hマウス（ヒトAPPおよびPS2変異体を発現するダブルトランスジェニックマウス）を、5μg/kgPEG-RRKの1週間に2回のs.c.注入によって反復して処置した。14日後に、皮質性APP、Aβおよびアクチンのレベルを検出した。APP/アクチン比は、PEG-RRKによって有意に変化せず（図４A）、PEG-RRKが、14日間にわたってトランス遺伝子の発現に何ら効果がないことを示唆した。対照的に、Aβ/アクチン（図４B）およびAβ/APP（図４C）比は、PEG-RRKによって有意に低下した。このことは、トランス遺伝子によるAβの産生とは無関係のAβのクリアランスに及ぼすPEG-RRKの正の効果を示す。
可溶性Aβレベルを低下させることに及ぼすK68モノペグ化型IGF-I変異体RRK（40kD、PEG2）（PEG-RRK）の作用強度の評価のために、重度アミロイドプラーク負荷を有する9〜10ヶ月齢のB6.152Hマウス（ヒトAPPおよびPS2変異体を発現するダブルトランスジェニックマウス）を、5μg/kgPEG-RRKの1週間に2回のs.c.注入によって反復して処置した。14日後に、皮質性APP、Aβおよびアクチンのレベルを検出した。APP/アクチン比は、PEG-RRKによって有意に変化せず（図４A）、PEG-RRKが、14日間にわたってトランス遺伝子の発現に何ら効果がないことを示唆した。対照的に、Aβ/アクチン（図４B）およびAβ/APP（図４C）比は、PEG-RRKによって有意に低下した。このことは、トランス遺伝子によるAβの産生とは無関係のAβのクリアランスに及ぼすPEG-RRKの正の効果を示す。
Claims (14)
- リジンのペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体の産生のための方法であって、該変異体は、リジン27、65および/または68からなる群より選択される1個または2個のリジンが別の極性アミノ酸によって独立して置換されていることを含み、
a）プロペプチドのC末端へN末端が連結した該IGF-IまたはIGF-I変異体を含む融合タンパク質をコードする核酸を含有する発現ベクターを含む原核宿主細胞を培養すること、
b）該プロペプチドが、アミノ酸-Y-Proを有するC末端で終わり、ここで、YがPro-Arg-Proであり、該IGF-IまたはIGF-I変異体の最初の2個のアミノ酸がGly-Proであり、これにより融合タンパク質のIgAプロテアーゼ切断部位はアミノ酸共通配列Y-Pro.!.Gly-Pro（.!.：切断位置）を有し、
c）該融合タンパク質を回収し、そしてペグ化すること、
d）該ペグ化された融合タンパク質を配列番号26のIgA1プロテアーゼで切断すること、ならびに
e）該ペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体を回収すること
を特徴とする、前記方法。 - プロペプチドが、式
Met-X1-Hisn-X2-Y-Pro-
によって示され、式中
・Metが、メチオニンを示し、
・X1が、単結合、セリンまたはアスパラギンであり、
・Hisが、ヒスチジンであり、
・nが、0〜10の数であり、
・X2が、ペプチド配列番号6〜10からなる群より選択されるリンカーペプチドであり、
・Proが、プロリンであり、および
・Yが、Pro-Arg-Proである、
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。 - プロペプチドが、リジン残基を含まないことを特徴とする、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
- 極性アミノ酸が、独立してアルギニン、グルタミンまたはアスパラギンであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- リジンのペグ化されたIGF-I変異体が、リジン残基65および／または68でモノペグ化またはジペグ化されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- リジンのペグ化されたIGF-I変異体が、KからRへの置換によって位置27および65で変異したIGF-I野生型の変異体であるRRKであり、該変異体が、リジン残基68でモノペグ化されるか、またはリジンのペグ化されたIGF-I変異体が、KからRへの置換によって位置27および68で変異したIGF-I野生型の変異体であるRKRであり、該変異体が、リジン残基65でモノペグ化されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
- リジンのペグ化されたIGF-I変異体が、KからRへの置換によって位置27で変異したIGF-I野生型の変異体であるRKKであり、該変異体が、リジン残基65および68でモノペグ化またはジペグ化されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
- リジンのペグ化されたIGF-I変異体が、RRK、RKRおよびRKKの混合物であり、該変異体が、リジン残基65および／または68でモノペグ化またはジペグ化されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
- リジンのペグ化されたIGF-Iが、ランダムにモノペグ化またはジペグ化されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- PEGが、20〜100kDaの分子量を有することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
- ポリ（エチレングリコール）基が、分岐鎖ポリ（エチレングリコール）基であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
- リジンのペグ化されたIGF-IまたはIGF-I変異体を含む融合タンパク質であって、該変異体は、リジン27、65および/または68からなる群より選択される1個または2個のリジンが別の極性アミノ酸によって独立して置換されていることを含み、
プロペプチドのC末端へ該IGF-IまたはIGF-I変異体のN末端が連結し、該プロペプチドが、アミノ酸-Y-Proを有するC末端で終わり、ここで、YがPro-Arg-Proであり、該IGF-IまたはIGF-I変異体の最初の2個のアミノ酸がGly-Proであり、これにより融合タンパク質のIgAプロテアーゼ切断部位はアミノ酸共通配列Y-Pro.!.Gly-Pro（.!.：切断位置）を有することを特徴とする、前記融合タンパク質。 - プロペプチドが、30個までのアミノ酸の長さを有することを特徴とする、請求項１２に記載の融合タンパク質。
- 式
Met-X1-Hisn-X2-Y-Pro-[IGF-IまたはIGF-I変異体]
を特徴とし、式中、
・IGF-Iが、ヒトIGF-Iを示し、およびIGF-I変異体が、リジン27、65および/または68からなる群より選択される1個または2個のリジンが別の極性アミノ酸によって独立して置換されたIGF-Iを示し、
・Metが、メチオニンを示し、
・X1が、単結合、セリンまたはアスパラギンであり、
・Hisが、ヒスチジンであり、
・nが、0〜10の数であり、
・X2が、ペプチド配列番号6〜10からなる群より選択されるリンカーペプチドであり、
・Proが、プロリンであり、
・Yが、Pro-Arg-Proであり、ならびに
・IGF-IまたはIGF-I変異体の最初の2個のアミノ酸がGly-Proであり、これにより融合タンパク質のIgAプロテアーゼ切断部位はアミノ酸共通配列Y-Pro.!.Gly-Pro（.!.：切断位置）を有する、
ことを特徴とする、請求項１２または１３に記載の融合タンパク質。
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