KR100915278B1 - 인슐린-유사 성장 인자-1(ｉｇｆ-1) 및 폴리(에틸렌글라이콜)의 접합체 - Google Patents
인슐린-유사 성장 인자-1(ｉｇｆ-1) 및 폴리(에틸렌글라이콜)의 접합체Info
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Abstract
본 발명은 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-I) 변이체 및 1 또는 2개의 폴리(에틸렌 글라이콜) 기를 포함하는 접합체에 관한 것으로, 상기 IGF-I 변이체는 야생형 IGF-I 아미노산 서열의 아미노산 위치 27, 37, 65 및 68중의 3개 이하에서 이들 아미노산 서열의 1 또는 2개가 라이신이고, 아미노산 27이 라이신이 아닌 극성 아미노산이 되도록 하는 아미노산 변이를 갖고, 라이신의 1차 아미노 기를 통해 접합되고, 상기 폴리(에틸렌 글라이콜) 기가 20 내지 100kDa의 총 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 접합체를 개시한다. 본 발명의 접합체는 알츠하이머병 같은 신경퇴행성 장애의 치료에 유용하다.
Description
본 발명은 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-I)과 폴리(에틸렌 글라이콜)(PEG)의 접합체(conjugate), 이 접합체를 포함하는 약학 조성물, 및 이 접합체의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다.
알츠하이머병(Alzheimer's disease(AD))은 65세 초과 사람들의 치매의 전체 경우의 약 50 내지 60%의 원인이 되는, 점증하고 있는 신경퇴행의 한 형태이다. 현재 세계적으로 어림잡아 1,500백만 명의 사람들이 걸려있고, 인구에서 노령자의 상대적 증가로 인하여 이의 이환율이 다음 20 내지 30년에 걸쳐 증가할 것으로 보인다. AD는 임상적 증상의 발병과 사망 사이에 약 8.5년의 평균 지속기간을 갖는 진행성 장애이다. 고도의 정신적 기능과 연관된 뇌 영역에서 피라미드 신경세포의 사망 및 신경 시냅시스의 손실은 인식 기능의 총체적 및 진행성 손상을 특징으로 하는 전형적인 증상을 야기한다(문헌[Francis, P. T., et al., J. Neurol. Neurosurg: Psychiatry 66 (1999) 137-147] 참조). AD는 세계에서 노인성 및 초로성 치매 둘 다에서 가장 일반적인 형태이고, 기억, 지적 능력의 점진적 손실 및 언어 장애를 나타내는 가혹하게 진행하는 치매로서 임상적으로 인식된다(문헌[Merritt, A Textbook of Neurology, 6th edition, Lea & Febiger, Philadelphia, pp. 484-489, 1979] 참조). 신경병리학적으로, AD의 주된 특징은 두 가지 특징적 병변: 아밀로이드 노인성 플라크(plaque) 및 신경섬유 매듭(tangle)(NFT)의 존재이다. 플라크는 신경세포 밖에 침착되는 반면, 매듭은 사후 뇌에서 신경세포 내에서 관찰된다. 아밀로이드 플라크 코어의 주 성분중의 하나는 병리학적으로 침착된 소형 아밀로이드-β-펩티드(Aβ)이고, 이는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로부터 세크레테이스(secretase)에 의해 분절된다(문헌[Selkoe, D. J., Physiol. Rev. 81 (2001) 741-766]; [Hardy, J., and Selkoe, D. J., Science 297 (2002) 353-356]; 및 [Bush, A. I., and Tanzi, R. E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 7317- 7319] 참조). Aβ, 39 내지 43 잔기의 자가-응집 펩티드(MW 약 4kDa)는 보다 큰 APP(110 내지 120kDa)의 부분으로서 합성된다. APP는 큰 N-말단 세포외 영역, 단일 막횡단 영역 및 짧은 세포질 꼬리(cytoplasmic tail)를 갖는 유형 I의 완전 막 글리코단백질이다. Aβ 영역은 APP의 세포외 및 막횡단 영역의 부분에 걸친다. AD에서 신경 세포 사망에 APP가 참여하는 데 대한 가장 일반적인 가설은 아밀로이드 가설이다. 이 가설은 플라크 아밀로이드 침착 또는 부분적으로 응집된 가용성 Aβ가 세포독성 캐스케이드를 기동시키고, 이에 따라 AD 병리학에 유사한 신경퇴행을 유발한다고 가정한다(문헌[Selkoe, D. J., Physiol. Rev. 81 (2001) 741-766]; 및 [Hardy, J., and Selkoe, D.J., Science 297 (2002) 353-356] 참조).
인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-I)은 구조적으로 인슐린에 관련된 순환 호르몬이다. IGF-I은 전통적으로 말초 조직에서 성장 호르몬 작용의 주요 매개체로 간주되었다. IGF-I은 70개의 아미노산으로 구성되고, 또한 소마토메딘(somatomedin) C로도 불리고, 스위스프로트(SwissProt) 제 PO 1343 호에 의해 정의된다. 용도, 활성 및 제조에 대해서는, 예를 들어 문헌[le Bouc, Y., et al, FEBS Lett. 196 (1986) 108-112]; [de Pagter-Holthuizen, P., et al., FEBS Lett. 195 (1986) 179-184]; [Sandberg Nordqvist, A. C., et al., Brain Res. MoI. Brain Res. 12 (1992) 275-277]; [Steenbergh, P. H., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 175 (1991) 507-514]; [Tanner, J. M., et al., Acta Endocrinol. (Copenh.) 84 (1977) 681-696]; [Uthne, K., et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 39 (1974) 548-554]; 유럽 특허 제 0 123 228 호; 제 0 128 733 호; 및 미국 특허 제 5,861,373 호; 제 5,714,460 호; 유럽 특허 제 0 597 033 호; 국제 특허 공개 제 WO 02/32449 호; 및 제 WO 93/02695 호에 언급되어 있다.
IGF-I 기능 조절은 상당히 복잡하다. 순환시 단지 0.2%의 IGF-I만이 유리 형태로 존재하는 반면, 대부분은 IGF-결합 단백질(IGFBP)에 결합되고, 이 단백질은 IGF에 매우 높은 친화도를 갖고 IGF-I 기능을 조절한다. 이 인자는 프로티에이스에 의한 IGFBP의 단백질 분해 같은 IGF-I 방출 기전에 의해 국부적으로 유리될 수 있다.
IGF-I은 성장중 및 성숙 뇌에서 주변분비(paracrine) 역할을 담당한다(문헌[Werther, G. A., et al., MoI. Endocrinol. 4 (1990) 773-778] 참조). 시험관내 연구에서 IGF-I은 도파민 신경세포(문헌[Knusel, B., et al., J. Neurosci. 10(1990) 558-570] 참조) 및 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)(문헌[McMorris, F. A., and Dubois-Dalcq, M., J. Neurosci. Res. 21 ( 1988) 199-209]; [McMorris, F. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 822-826]; 및[Mozell, R. L., and McMorris, F. A., J. Neurosci. Res. 30 (1991) 382-390] 참조)를 포함하는 CNS(문헌[Knusel, B., et al., J. Neurosci. 10(1990) 558-570]; 및 [Svrzic, D., and Schubert, D., Biochem. Biophys. Res. Commun. 172 (1990) 54-60] 참조)에서 몇가지 유형의 신경세포에 대하여 효력있는 비선택적 영양 작용제(trophic agent)인 것으로 나타난다. 미국 특허 제 5,093,317 호에서는 콜린성 신경 세포의 생존이 IGF-I의 투여로 증진되는 것으로 언급된다. IGF-I이 말초 신경 재생을 자극하고(문헌[Kanje, M., et al., Brain Res. 486 (1989) 396-398] 참조), 오르니틴 데카복실레이스 활성을 증진시키는 것으로 또한 공지되어 있다(미국 특허 제 5,093,317 호 참조). 미국 특허 제 5,861,373 호 및 국제 특허 공개 제 WO 93/02695 호에서는 환자의 중추신경계에서 IGF-I 및/또는 이의 유사체의 활성 농도를 증가시킴으로써, 교세포(glia) 및/또는 비-콜린성 신경 세포에 현저하게 영향을 미치는 중추신경계에 대한 손상 또는 이의 질환을 치료하는 방법을 언급하고 있다. 국제 특허 공개 제 WO0232449 호는 치료학적 유효량의 IGF-I 또는 이의 생물학적 활성 변이체를 포함하는 약학 조성물을 포유동물의 비강에 투여함으로써 포유동물의 중추신경계에서 허혈성 손상을 감소시키거나 예방하는 방법에 관련된다. IGF-I 또는 이의 변이체는 허혈성 사건와 연관된 허혈성 손상을 감소시키거나 예방하기에 효과적인 양으로 포유동물의 비강을 통해 흡수되어 중추신경계로 수송된다. 유럽 특허 제 EP 0874641 호에서는 AIDS-관련 치매, AD, 파킨슨병, 픽병(Pick's Disease), 헌팅턴병(Huntington's Disease), 간장성 뇌병증(hepatic encephalopathy), 피질-기저 신경절 퇴행증(cortical-basal ganglionic syndrome), 진행성 치매, 경련성 마비(spastic paraparesis)를 동반하는 가족성 치매, 진행성 핵상 마비(supranuclear palsy), 다중 경화증, 쉴더(Schilder)의 뇌 경화증 또는 급성 괴사 출혈성 뇌척수염에 기인하는, 중추신경계의 신경세포 손상을 치료하거나 예방하는 약제의 제조를 위한 IGF-I 또는 IGF-II의 용도를 청구하고 있고, 여기서 약제는 혈액-뇌 장벽 또는 혈액-척수 장벽의 외부에서 상기 IGF의 유효량의 비경구 투여를 위한 형태이다.
유리 IGF-I의 뇌 및 혈청 수준의 감소는 AD의 산발성 및 가족성 형태의 발병과 관련된다. 더 나아가, IGF-I은 Aβ-유도 신경독성에 대하여 신경세포를 보호한다(문헌[Niikura, T., et al., J. Neurosci. 21 (2001) 1902-1910]; [Dore, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 4772-4777]; 및 [Dore, S., et al., Ann. NY Acad. Sci. 890 (1999) 356-364] 참조). 최근, 쥐와 생쥐에서 말초로 투여된 IGF-I이 뇌 Aβ 수준을 감소시킬 수 있음이 밝혀졌다(문헌[Carro, E., et al., Nat. Med. 8 (2002) 1390-1397] 참조). 더욱이, 이 연구에서는 유전자 도입(transgenic) AD 생쥐 모델에서 지속된 IGF-I 치료가 뇌 아밀로이드 플라크 하중(load)을 유의성있게 감소시킴을 보여주었다. 이들 자료는 IGF-I이 뇌로부터 Aβ를 청소(clearance)함으로써 뇌 Aβ 수준 및 플라크-연관 뇌 치매를 감소시킬 수 있음을 강력하게 지지한다.
폴리(에틸렌 글라이콜)(PEG)을 이용한 단백질의 공유결합 변형(covalent modification)은 체내에서 단백질의 순환 반감기를 연장하는 데 유용한 방법으로 입증되었다(문헌[Hershfield, M. S., et al., N. Engl. J. Med. 316 (1987) 589-596]; [Meyers, F. J., et al., Clin. Pharmacol. Ther. 49 (1991) 307-313]; [Delgado, C, et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 9 (1992) 249-304]; [Katre, Advanced Drug Delivery Systems 10 (1993) 91]; 유럽 특허 공개 제 EP-A 0 400 472 호; 문헌[Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69]; [Satake-Ishikawa, R., et al., Cell Struct. Funct. 17 (1992) 157-160]; [Katre, N. V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 1487-1491]; [Tsutsumi, Y., et al., Jpn. J. Cancer Res. 85 (1994) 9-12]; [Inoue, H., et al., J. Lab. Clin. Med. 124 (1994) 529-536]; 및 [Chamow, S.M., et al., Bioconjugate Chem. 5 (1994) 133-140] 참조).
PEG화(PEGylation)의 다른 장점은 용해도의 증가 및 단백질 면역원성의 감소이다(문헌[Katre, N.V., J. Immunol. 144 (1990) 209-213] 참조). 단백질의 PEG화의 보통의 방법은 N-하이드록시석신이미드 같은 아미노-반응성 반응 물질로 활성화된 폴리(에틸렌 글라이콜)의 사용이다. 이러한 반응 물질을 이용하여 폴리(에틸렌 글라이콜)은 라이신 잔기의 N-말단 α-아미노 기 및 ε-아미노 기와 같은 유리 1차 아미노 기에서 단백질에 부착된다. 그러나, 이 접근법의 주요 한계는 단백질이 전형적으로 상당한 양의 라이신 잔기를 포함하여 폴리(에틸렌 글라이콜) 기가 모든 유리 ε-아미노 기에서 비특이적 방식으로 단백질에 부착됨으로써, 무작위(random) PEG화 단백질의 이종 생성물 혼합물이 생성된다는 점이다. 그러므로, 많은 NHS-PEG화 단백질은 낮은 특이 활성 때문에 상업적 용도에 부적합하다. 비활성화는 생물학적 활성에 요구되는 하나 이상의 라이신 잔기 또는 N-말단 아미노 잔기의 공유결합 변형으로부터, 또는 단백질의 활성 위치의 또는 그 부근의 폴리(에틸렌 글라이콜) 잔기의 공유결합 부착으로부터 야기된다. 예를 들어, NHS-PEG화 반응 물질을 이용한 인간 성장 호르몬의 변형은 단백질의 생물학적 활성을 10-배 넘게 감소시키는 것으로 밝혀졌다(문헌[Clark, R., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 21969-21977] 참조). 인간 성장 호르몬은 N-말단 아미노산 외에 또한 9개의 라이신을 포함한다. 이들 라이신중 소정의 것은 수용체 결합에 결정적인 것으로 알려진 단백질의 영역에 위치한다(문헌[Cunningham, B. C., et al., Science 254 (1991) 821-825] 참조). 게다가, 아미노-반응성 폴리(에틸렌 글라이콜) 반응 물질을 이용한 에리트로포이에틴의 변형은 또한 생물학적 활성의 거의 완전한 손실을 야기한다(문헌[Wojchowski, D. M., et al., Biochim. Biophys. Acta 910 (1987) 224-232] 참조). 아미노-반응성 PEG화 반응 물질을 이용한 인터페론-α2의 공유결합 변형은 생활성의 40 내지 75% 손실을 유발한다(미국 특허 제 5,382,657 호 참조). G-CSF의 유사한 변형은 60% 초과의 활성 손실을 유발하고(문헌[Tanaka, H., et al., Cancer Res. 51 (1991) 3710- 3714] 참조), 인터류킨-2의 경우 90% 초과의 생활성의 손실을 유발한다(문헌[Goodson, R. J., and Katre, N. V., BioTechnology 8 (1990) 343-346] 참조).
국제 특허 공개 제 WO 94/12219 호 및 제 WO 95/32003 호에서는 PEG 및 IGF 또는 시스테인 돌연변이된 IGF를 포함하는 폴리(에틸렌 글라이콜) 접합체를 청구하고 있으며, 이 때 PEG는 뮤테인의 N-말단 영역에서 유리 시스테인에서 상기 뮤테인에 부착된다. 국제 특허 공개 제 WO 2004/60300 호에서는 N-말단 PEG화 IGF-I을 기술하고 있다.
발명의 요약
본 발명은 야생형 IGF-I 아미노산 서열의 아미노산 위치 27, 37, 65 및/또는 68에서 아미노산 37, 65 및 68중 하나 이상이 라이신(K)이고, 아미노산 27이 라이신이 아닌 극성 아미노산이 되도록 하는 아미노산 변이(alteration)를 가짐을 특징으로 하는 IGF-I 변이체를 포함한다.
바람직하게는, 아미노산 27은 아르지닌이다.
이러한 IGF-I 변이체는 라이신-PEG화 IGF-I의 제조용 중간체(IGF-I 중간체)로서 유용하다.
놀랍게도, 라이신-PEG화 IGF-I 변이체(아미노-반응성 PEG화 IGF-I 변이체), 바람직하게는 20 내지 100kDa PEG화 IGF-I 변이체, 특히 바람직하게는 모노PEG화 IGF-I 변이체가 치료적 적응과 관련하여 현저히 우수한 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 추가의 실시태양은 본 발명에 따른 라이신-PEG화 IGF-I 변이체 및 N-말단 PEG화 IGF-I 변이체의 조성물이다. 바람직하게는, 분자량 비는 9:1 내지 1:9이다. 몰비가 1:1 이상(N-말단 PEG화 IGF-I 변이체 1부당 라이신-PEG화 IGF-I 변이체 1부 이상), 바람직하게는 6:4 이상(N-말단 PEG화 IGF-I 변이체 4부당 라이신-PEG화 IGF-I 변이체 6부 이상)인 조성물이 더욱 바람직하다. 바람직하게는, 라이신-PEG화 IGF-I 변이체 및 N-말단 PEG화 IGF-I 변이체는 둘 다 모노PEG화된다. 바람직하게는 이 조성물에서 변이체는 라이신-PEG화 IGF-I 변이체 및 N-말단 PEG화 IGF-I 변이체 둘 다에서 동일하다. 바람직하게는, 변이체는 RRKK, RRKR, RRRK 및 RKRR로 구성된 군에서 선택된다. 바람직하게는, PEG는 30 내지 45kDa, 특히 30 내지 40kDa의 평균 분자량을 갖는다. 라이신-PEG화 IGF-I 변이체 및 N-말단 PEG화 IGF-I 변이체는 IGF 결합 단백질(예: BP4 및 BP5)의 결합에서는 유사한 친화도를 보이는 반면, IGF-IR 인산화와 관련해서는 상이한 활성을 보인다.
본 발명은 IGF-I 변이체(IGF-I 접합체, 또는 접합체) 및 폴리(에틸렌 글라이콜) 기로 구성된 접합체로서, IGF-I 변이체는 야생형 IGF-I 아미노산 서열의 아미노산 위치 27, 37, 65 및/또는 68에서, 아미노산 37, 65 및 68중의 하나 이상이 라이신(K)이고 아미노산 27이 라이신 이외의 극성 아미노산이 되도록 하는 아미노산 변이를 갖고, 상기 PEG가 1차 아미노 기를 통해, 바람직하게는 1차 아미노 기 라이신을 통해 상기 IGF-I 변이체에 접합됨을 특징으로 하는 접합체에 관한 것이다.
바람직하게는, 폴리(에틸렌 글라이콜) 기의 총 분자량은 20kDa 이상, 더욱 바람직하게는 약 20 내지 100kDa, 특히 바람직하게는 20 내지 80kDa이다.
폴리(에틸렌 글라이콜) 기는 IGF-I 변이체에 1차 아미노 기 라이신을 통해 아미노산 위치 37, 65 및 68중 하나 이상에서 접합하고(아미노-반응성 PEG화), 선택적으로 N-말단 아미노산에서 PEG화된다. 바람직하게는, 접합체는 아미노산 위치 37, 65 및 68중의 하나 이상의 위치에서 라이신 잔기에 모노- 또는 다이PEG화되고, 선택적으로 N-말단 아미노산에서 PEG화된다. 더욱 바람직하게는, 본 접합체는 K65, K68 또는 K37에서 모노PEG화되거나, 또는 K65 및 K68에서 다이PEG화되고, 선택적으로 N-말단 아미노산에서 PEG화된다. 바람직하게는, 20% 이하의 PEG화 IGF-I 변이체가 추가적으로 N-말단 PEG화된다.
IGF-I 변이체는 다음과 같이 설계된다: K65는 아미노산 65가 라이신임을 의미하고, R27은 아미노산 27이 아르지닌임을 의미한다. 아미노산 R27, K37, K65 및 K68을 보유하는 IGF-I 변이체는 RKKK로 명명된다. IGF-I 야생형은 KRKK로 명명된다.
특히 바람직한 IGF-I 변이체, 및 접합체에서의 변이체는 RRKK, RRKR, RRRK 및 RKRR이다.
또한, 본 발명에 따른 (PEG화) IGF-I 변이체는 N-말단에서 3개 이하(바람직하게는 3개 모두)의 아미노산이 절단된(truncated) 것이 바람직하다. 각각의 야생형 돌연변이체는 데스(Des)(1-3)-IGF-I로 명명되고 N-말단으로부터 아미노산 잔기 글라이신(gly), 프롤린(pro) 및 글루탐산(glu)이 부재한다(문헌[Kummer, A., et al., Int. J. Exp. Diabesity Res. 4 (2003) 45-57] 참조).
폴리(에틸렌 글라이콜) 기는 선형 또는 분지형이다.
또한, 본 발명은 IGF-I 중간체를 이용하여 본 발명에 따른 접합체를 제조하는 방법을 포함한다. 이 방법은 폴리(에틸렌 글라이콜)이 IGF-I 변이체의 1차 라이신 아미노 기를 통해 IGF-I 중간체에 화학적으로 결합하도록 하는 조건 하에서, IGF-I 중간체를 활성화된 폴리(에틸렌 글라이콜)과 반응시킴으로써, IGF-I 변이체 및 1 또는 2종의 폴리(에틸렌 글라이콜) 기(이 때, 폴리(에틸렌 글라이콜) 기는 바람직하게는 20kDa 이상, 더욱 바람직하게는 약 20 내지 100kDa, 특히 바람직하게는 20 내지 80kDa의 총 분자량을 갖는다)를 포함하는 접합체의 제조를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 접합체를, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 접합체를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법을 포함한다.
또한, 본 발명은 AD의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 접합체의 용도를 포함한다.
또한, 본 발명은 아미노-반응성 PEG화 IGF-I 변이체의 약학적 유효량을 AD의 치료가 필요한 환자에게, 바람직하게는 주당 1 또는 2회 적용하여 투여함을 특징으로 하는 AD의 치료 방법을 포함한다.
도 1: PEG-IGF의 IEC-HPLC. 제조용 강-양이온 교환 컬럼(TOSOH-BIOSEP, SP-5PW)을 이용하여 PEG화 혼합물로부터 순수한 위치 이성질체를 분리하였다. 5개의 상이한 피크 분획(0 내지 4로 번호 매김)을 단리하고 추가의 분석을 위해 처리하였다.
도 2: 모노PEG-IGF-I 피크의 SDS-PAGE 분석. 5개의 정제된 피크 분획(0 내지 4로 번호 매김)을 비-환원(A) 및 환원(B) 조건 하에서 4 내지 12% 트리스(Tris)-글라이신 SDS-PAGE로 전기영동하고, 겔에서 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 단백질을 염색하였다. MW, 분자량 표지자(marker).
도 3: 모노PEG화 IGF-I 피크 1, 2 및 3의 펩타이드 분석. 정제된 모노PEG화 피크 1, 2 및 3을 Asp-N으로 소화시키고, 펩타이드 분절을 HPLC로 분리하였다. PEG화 분절의 펩티드 서열을 기술된 바와 같이 에드먼(Edman) N-말단 펩티드 분해에 의해 구하였다. A. HPLC 분석으로 rhIGF-I에 대하여 30 내지 45분의 체류 시간에서 6개의 상이한 펩티드 분절, 및 약 70분의 체류 시간에서 PEG화에 대한 주요(major) 분절 7(및, 부수적(minor) 분절 7')의 피크를 생성하였다. 화살표는 rhIGF-I과 비교하여 상이한 피크에서 펩티드 분절에서 주요한 상대적 변화를 표시한다. B. rhIGF-I의 Asp-N 절단으로 수득된 6개 분절의 펩티드 서열. 라이신(K)은 진하게 표시되고, 분절 3 및 4에서 나타난다. 분절 5는 N-말단 펩티드를 설명한다. C. 에드먼 분해 후 PEG화 펩티드 분절 7의 펩티드 서열. 시스테인 및 PEG화 라이신 잔기는 펩티드 서열에서 손상(break)을 전달한다.
도 4: IGF-I 및 모노PEG화 이성질체로부터의 상이한 전체 발현 프로파일의 AD의 체계적 클러스터링. IGF-I 및 PEG화 변이체의 배양 시간은 24시간이었고, 생쥐 세포주 NIH-3T3을 이용하였다. 자료 분석을 위한 조건은 상세한 설명에 기술된다. (A) 하향 조절된 유전자의 클러스터. (B) 상향 조절된 유전자의 클러스터.
도 5: rhIGF-I 및 모노PEG-IGF-I에 의한 IGF-IR 인산화. 인간 IGF-IR로 안정하게 감염된(transfected) NIH-3T3 세포를 하룻밤 혈청-부족 배양하고, 30분 동안 rhIGF-I 또는 모노PEG-IGF-I 이성질체(피크 1, 2, 3, 피크 혼합, 데스(l-3) 피크 3)의 점증하는 투여량(0.01 내지 10μg/ml)으로 배양하였다. 이어서, 세포를 방법 부분에서 기술한 바와 같이 웨스턴(Western) 또는 세포내(in-cell) 분석으로 처리하였다. 각각 rhIGF-I(A), 피크 1(B), 피크 2(C), 피크 3(D), 피크 혼합물(E) 및 데스(l-3) 피크 3(F)을 이용한 투여량 반응 곡선. 개개의 웰(well)에서 인산화 신호를 IGF-IR 수준에 대하여 정상화(normalization)하였다. 자료 점은 3개의 독립된 배양물로부터 6개 측정값의 평균±SEM을 의미한다.
도 6: NIH-3T3 세포에서 IGF-IR 인산화의 정량적 분석. 실시예 7에서의 실험에서 얻은 투여량 반응 곡선을 일-위치 결합 동역학(one-site binding kinetics)과 적합화시켜 특이 결합(BMax), 최대값의 절반 결합 농도(EC50) 및 힐(Hill) 계수(nH)를 구하였다. 자료값은 3개의 독립된 배양물로부터 6개 측정값의 평균±SEM을 나타낸다.
도 7: PS2APP 생쥐에서 rhIGF-I의 생체내 뇌 Aβ 강하. 2 내지 3월령(n=10)의 이중-유전자 도입 PS2AAP 생쥐를 2시간 동안 rhIGF-I(50μg/kg, i.p.)로 처리하였다. 피질 추출물을 준비하고, 방법 부분에서 기술한 바와 같이 APP, C99, Aβ 및 대조 단백질(알부민) 수준을 평가하였다. 알부민-정상화(normalized) 값으로부터, C99/APP, Aβ/APP 및 C99/Aβ의 비를 계산하고 비처리된 대조군의 %로서 표현하고 평균±SEM을 나타낸다. A. 2월령 피질 추출물이 대표적 웨스턴 블롯. rhIGF-I 처리에 의해 Aβ 수준에서 분명한 감소인 반면 다른 수준에서는 변화가 없었음이 주목된다. B. PS2APP 생쥐로부터의 피질 추출물의 정량적 분석(**, 비처리된 대조군에 대한 p<0.01 ).
도 8: rhlGF-I에 의한 PS2APP 생쥐에서 시간 경과에 따른 생체내 Aβ 강하. 2월령 생쥐를 2, 6 또는 24시간 동안 rhIGF-I(50μg/kg, i.p.)로 처리하였다. 이어서, Aβ/APP 및 C99/Aβ 수준을 평가하고 설명한 바와 같이 비를 계산하였다. 자료값은 비처리된 대조군에 대한 %로 표현되고, 평균±SEM(n=10-13)으로 나타낸다. A. 주입 후 2, 6 및 24시간 후 Aβ/PP, 및 B. C99/Aβ 비(**, 비처리된 대조군에 대한 p<0.01).β
도 9: 피크 1 내지 3에 의한 AAP 및 PS2APP에서 생체내 Aβ 강하. 단일-유전자 도입 APP 및 이중-유전자 도입 PS2APP 생쥐의 혼성 집단에서 실험을 수행하였다. 피크 1 2 및 3에 대한 Aβ/APP 및 C99/Aβ 비를 Aβ 강하 및 청소율(clearance)(n=8 내지 10)에 대한 이들의 상대적 효과의 직접적인 비교와 함께 나타낸다. A. 뇌 Aβ 하중에 대한 피크 1 내지 3의 효과를 보여주는 Aβ/APP 비. B. 뇌로부터 Aβ 의 청소를 증명하는 피크 1 내지 3의 C99/Aβ 비(*, 비처리된 대조군에 대한 p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001).
도 10: 피크 3에 의한 AAP 및 PS2APP 생쥐에서 시간 경과에 따른 생체내 Aβ 강하. 2월령의 APP 및 PS2APP의 혼성 집단을 피크 3(50μg/kg, i.p.)으로 2, 6, 24, 48 또는 72시간 동안 처리하였다. 이어서, APP, C99, Aβ 및 액틴 수준을 평가하고 설명한 바와 같이 비를 계산하였다. 자료값은 비처리 대조군에 대한 %로 표현되고 평균±SEM(n=10 내지 15)을 나타낸다. A. 주사 6, 24 및 48시간 후, Aβ/APP, 및 B. C99/Aβ 비(비처리된 대조군에 대한 *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001).
도 11: PEG-IGF 피크 1 내지 3에 의한 PS2APP 생쥐에서 생체내 Aβ 강하. 피크 1, 2 및 3에 대한 Aβ/APP 비를 Aβ 강하 및 청소율(n=3 내지 13)에 대한 이들의 상대적 효과의 직접적 비교와 함께 나타낸다(비처리된 대조군에 대한 *, p<0.05).
도 12: 피크 3에 의한 PS2APP 생쥐에서 시간 경과에 따른 생체내 Aβ 강하. 2월령 PS2APP 생쥐를 단일 주사의 피크 3(50μg/kg, i.p.)으로 2, 6, 24, 48 또는 72시간 동안 처리하였다. 이어서, 설명한 바와 같이 Aβ/APP 비를 계산하였다. 자료값은 비처리된 대조군에 대한 %로 표시되고, 평균±SEM을 나타낸다(n=4 내지 13; 비처리된 대조군에 대한 *, p<0.05; **, p<0.01).
본원에 사용된 바의 "PEG화 IGF-I 변이체" 또는 "아미노-반응성 PEG화"는 IGF-I 변이체가 IGF-I 변이체 분자의 1 또는 2개의 라이신에 아미노-반응성 결합에 의해 1 또는 2개의 폴리(에틸렌 글라이콜) 기에 공유결합함을 의미한다. PEG 기는 라이신 측쇄의 1차 ε-아미노 기인 IGF-I 변이체 분자의 위치에 부착된다. 또한, PEG화가 N-말단 α-아미노 기 상에서 추가로 일어나는 것도 가능하다. 사용된 합성 방법 및 변이체에 따라서, PEG화 IGF-I 변이체는 N-말단 PEG화를 포함하거나 포함하지 않고, K65, K68 및/또는 K37에서 PEG화된 IGF-I 변이체로 구성될 수 있고, 이에 따라 PEG화의 위치는 상이한 분자에서 상이할 수 있거나, 또는 분자당 폴리(에틸렌 글라이콜) 측쇄의 양 및/또는 분자에서 PEG화의 위치와 관련하여 실질적으로 균질할 수 있다. 바람직하게는, IGF-I 변이체는 모노- 및/또는 다이-PEG화되고, N-말단 PEG화 IGF-I 변이체로부터 특별히 정제된다.
본원에 사용되는 바의 아미노-반응성 PEG화는 반응성(활성화된) 폴리(에틸렌 글라이콜)을 사용하여, 바람직하게는 메톡시폴리(에틸렌 글라이콜)의 바람직하게는 N-하이드록시석신이미딜 에스터를 사용하여 IGF-I 변이체의 1차 라이신 아미노 기에 폴리(에틸렌 글라이콜) 쇄를 무작위로 부착하는 방법을 가리킨다. 이 결합 반응은 폴리(에틸렌 글라이콜)을 IGF-I의 라이신 잔기의 반응성 1차 ε-아미노 기 및, 선택적으로 N-말단 아미노산의 α-아미노 기에 부착한다. PEG의 단백질로의 이러한 아미노 기 접합은 당해 기술 분야에 널리 알려져 있다. 예를 들어, 이러한 방법의 고찰이 문헌[Veronese, F. M., Biomaterials 22 (2001) 405-417]에서 제공된다. 베로니스(Veronese)에 따라서, 단백질의 1차 아미노 기에의 PEG의 접합은 이 1차 아미노 기의 알킬화를 수행하는 활성화된 PEG를 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 반응을 위해, 활성화된 알킬화 PEG, 예를 들어 PEG 알데하이드, PEG-트레실 클로라이드 또는 PEG 에폭사이드를 사용할 수 있다. 추가로 유용한 반응 물질로는, 말단 하이드록시 기가 클로로포르메이트 또는 카보닐이미다졸로 활성화된 카복실화 PEG 또는 PEG의 하이드록시석신이미딜 에스터 같은 아실화 PEG가 있다. 추가로 유용한 PEG 반응 물질로는 아미노산 팔(arm)을 갖는 PEG가 있다. 이러한 반응 물질은 소위 분지쇄 PEG를 포함할 수 있고, 이에 따라 2개 이상의 동일하거나 상이한 PEG 분자가 펩티드성 간격자(spacer)(바람직하게는, 라이신)에 의해 함께 연결되고, 예를 들어 라이신 간격자의 활성화된 카복실레이트로서 IGF-I 변이체에 결합된다. 또한, 모노-N-말단 결합이 문헌[Kinstler, O., et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54 (2002) 477-485]에 기술되어 있다.
본원에 사용된 바의 "PEG 또는 폴리(에틸렌 글라이콜)"은 상업적으로 입수할 수 있거나, 또는 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법에 따라 에틸렌 글라이콜의 고리-열림 중합에 의해 제조될 수 있는 수용성 중합체를 의미한다(문헌[Kodera, Y., et al., Progress in Polymer Science 23 (1998) 1233-1271]; 및 [Francis, G. E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18] 참조). 사용된 용어 "PEG"는 에틸렌 글라이콜 단위의 수가 460 이상, 바람직하게는 460 내지 2300, 특히 바람직하게는 460 내지 1840(230 PEG 단위는 약 10kDa의 분자량을 가리킨다)인 임의의 폴리에틸렌 글라이콜 분자를 널리 포괄하는 것으로 사용된다. PEG 단위의 상위 수는 접합체의 용해도에 의해서만 제한된다. 보통, 2300 단위를 포함하는 PEG보다 더 큰 PEG는 사용되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 PEG는 한 끝에서는 하이드록시 또는 메톡시(메톡시 PEG, mPEG)로 종결되고, 다른 끝에서는 에테르 산소 결합을 통해 연결기(linker) 부분에 공유결합으로 부착된다. 중합체는 선형이거나 분지형이다. 분지형 PEG는, 예를 들어 문헌[Veronese, F. M., et al., Journal of Bioactive and Compatible Polymers 12 (1997) 196-207]에 기술되어 있다. 유용한 PEG 반응 물질은, 예를 들어 넥타 쎄라퓨틱스(Nektar Therapeutics (www.nektar.com))로부터 입수할 수 있다.
PEG의 경우 임의의 분자량을 필요에 따라, 예를 들어 약 20 내지 100kDa(n은 460 내지 2300이다)의 분자량을 이용할 수 있다. PEG에서 반복 단위의 수 "n"은 달톤(Dalton)으로 나타낸 분자량에 대하여 어림계산을 한 것이다. 예를 들어, 두 PEG 분자가 연결기에 부착된다면, 각각의 PEG 분자가 10kDa(각각의 n은 약 230이다)의 동일한 분자량을 갖는 경우, 이 때 연결기 상의 PEG의 총 분자량은 약 20kDa이다. 또한, 연결기에 부착된 PEG의 분자량은 연결기 상의 두 분자에서 상이할 수 있고, 예를 들어 한 PEG 분자는 5kDa이고, 또 한 PEG 분자는 15kDa일 수 있다. 분자량은 항상 평균 분자량을 의미한다.
하기 실시예에서, 아미노-반응성 PEG화 IGF-I 변이체의 제조를 위한 몇 개 바람직한 반응 물질이 기술된다. 본 발명에 따른 접합체를 생성하는 한, 예를 들어 문헌[Veronese, F. M., Biomaterials 22 (2001) 405-417]에 기재된 방법에 기초하여 제조 방법의 절차에 변형을 가할 수 있다.
표적 단백질에서 3개 이하의 잠재적 반응성 1차 아미노 기(2개 이하의 라이신 및 1개의 말단 아미노산)의 존재는 폴리(에틸렌 글라이콜) 쇄의 부착의 지점이 다른 일련의 PEG화 IGF-I 변이체 이성질체를 유도한다.
본 발명은 개선된 특성을 갖는 IGF-I 변이체의 PEG화 형태를 제공한다. 이러한 PEG화 IGF-I 변이체 접합체는 이에 선형으로 또는 분지형으로 및 무작위로 부착된 1 또는 2개의 PEG 기를 포함하고, 이에 따라 접합체에서 모든 PEG 기의 총 분자량은 바람직하게는 약 20 내지 80kDa이다. PEG화 IGF-I 변이체가 뇌에서 Aβ 펩티드 수준을 강하시키는 활성을 보이는 한, 이 범위의 분자량으로부터 작은 일탈이 가능함은 당해 기술 분야의 숙련자에게는 자명하다. 또한, 80kDa보다 큰 분자량을 갖는 PEG를 갖는 IGF-I 변이체의 PEG화는 더 높은 생활성을 유발한다. 그러나, 이러한 활성은 분자량이 증가함에 따라 감소된 IGF-I 수용체 활성화 및 혈류-뇌 장벽 수송으로 인하여 감소될 것으로 예상된다. 그러므로, PEG 분자량의 20 내지 100kDa 범위가 AD를 앓고 있는 환자의 치료에 유용한 PEG 및 IGF-I 변이체의 접합체에 대한 최적의 범위로서 이해된다.
본원에 사용되는 "분자량"은 PEG의 평균 분자량을 의미한다.
하기 IGF-I 변이체의 PEG화 형태는 본 발명의 접합체의 실시예이고 이의 의도된 실시태양이다:
- 모노PEG화 IGF-I 변이체(이 때, PEG 기는 20 내지 80kDa(460 내지 1840PEG 단위)의 분자량을 갖는다);
- 다이PEG화 IGF-I 변이체(이 때, PEG 기는 약 10 내지 50kDa(230 내지 1150PEG 단위)의 분자량을 갖는다); 및
이들의 혼합물.
RRKK, RRKR, RRRK 및 RKRR로 구성된 군에서 선택되는 모노PEG화 IGF-I이 특히 바람직하고, 이 때 분지형 PEG 기는 30 내지 45kDa, 바람직하게는 40 내지 45kDa(약 920PEG 단위)의 분자량을 갖는다. 예를 들어, PEG의 44kDa의 평균 분자량 및 IGF-I의 7.6kDa의 분자량을 기준으로, 이러한 모노PEG-IGF-I의 계산된 평균 분자량은 약 51.6kDa이다. 또한, PEG가 30 또는 40kDa의 평균 분자량을 갖는, RRKK, RRKR, RRRK 및 RKRR로 구성된 군에서 선택되는 모노PEG화 IGF-I이 바람직하다.
본 발명에 따른 "PEG 또는 PEG 기"는 본질적인 부분으로서 폴리(에틸렌 글라이콜)을 포함하는 잔기를 의미한다. 이러한 PEG는 결합 반응에 필요한 추가의 화학 기를 포함할 수 있고, 이는 분자의 화학적 합성으로부터 생성되거나, 또는 분자의 부분을 상호간에 최적 거리로 유지하는 간격자이다. 또한, 이러한 PEG는 함께 연결되는 하나 이상의 PEG 측쇄로 이루어질 수 있다. 하나 초과의 PEG 쇄를 갖는 PEG 기는 다중팔 형태 또는 분지형 PEG로 불린다. 분지형 PEG는, 예를 들어 폴리에틸렌 옥사이드를 글리세롤, 펜타에리트리올 및 소르비톨을 포함하는 다양한 폴리올에 첨가함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 4개의 팔이 달린 분지형 PEG는 펜타에리트리올 및 에틸렌 옥사이드로부터 제조될 수 있다. 분지형 PEG는 보통 2 내지 8개의 팔을 갖고, 예를 들어 유럽 특허 공개 제 EP-A 0 473 084 호 및 미국 특허 제 5,932,462 호에 기재되어 있다. 라이신의 1차 아미노 기를 통해 연결된 2개의 PEG 측쇄(PEG2)를 갖는 PEG가 특히 바람직하다(문헌[Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69] 참조).
본원에 사용되는 "실질적으로 균질한"은 제조되고, 포함되고 또는 사용되는 PEG화 IGF-I 변이체만이 부착된 1 또는 2개의 PEG 기를 갖는 것임을 의미한다. 제조물은 소량의 비반응(즉, PEG 기의 부족) 단백질을 포함할 수 있다. 펩티드 매핑 및 N-말단 서열분석에 의해 확인되는 바에 따르면, 90% 이상의 PEG-IGF-I 변이체 접합체 및 5% 이하의 비반응 단백질인 제조물에 대한 한 실시예가 하기에 제공된다. 이러한 균질한 PEG화 IGF-I 변이체의 제조물의 단리 및 정제는 보통의 정제 방법, 바람직하게는 치수별 배제 크로마토그래피에 이해 수행될 수 있다.
본원에 사용되는 "모노PEG화"는 IGF-I 변이체가 IGF-I 변이체 분자당 단 1개의 라이신에서만 PEG화되어, 단 1개의 PEG 기가 이 위치에서 공유결합으로 부착됨을 의미한다. 이러한 모노PEG화 IGF-I은 N-말단에서 소정의 정도로 추가로 PEG화 될 수 있다. 순수한 모노PEG화 IGF-I 변이체(N-말단 PEG화가 없음)는 제조물의 80% 이상, 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 모노PEG화 IGF-I 변이체가 제조물의 92% 이상이고, 나머지는, 예를 들어 비반응(비-PEG화) IGF-I 및/또는 N-말단 PEG화 IGF-I 변이체이다. 따라서, 본 발명에 따라 모노PEG화 IGF-I 변이체 제조물은, 예를 들어 약학적 용도에서 균질한 제조물의 장점을 나타내는 데 충분하게 균질하다. 동일한 내용이 다이PEG화 종에도 적용된다.
"활성화된 PEG 또는 활성화된 PEG 반응 물질"은 현재의 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 바람직하게는, 폴리(에틸렌 글라이콜)의 알콕시부티르산 석신이미딜 에스터("저급 알콕시-PEG-SBA"), 폴리(에틸렌 글라이콜)의 알콕시프로피온산 석신이미딜 에스터("저급 알콕시-PEG-SPA") 또는 N-하이드록시석신이미드 활성화된 PEG 같은 친전자적으로 활성화된 PEG가 사용된다. 활성화된 에스터를 아민과 반응시켜 아미드를 형성하는 임의의 통상의 방법이 사용될 수 있다. 활성화된 PEG의 IGF-I과의 반응에서, 예시되는 석신이미딜 에스터는 아미드 형성을 유발하는 이탈기이다. 단백질과의 접합체를 제조하는 데 석신이미딜 에스터의 사용은 미국 특허 제 5,672,662 호에 개시되어 있다.
사용되는 반응 조건은 상이하게 PEG화 IGF-I 변이체의 상대적 양에 영향을 미친다. 반응 조건(예를 들어, 반응 물질의 비, pH, 온도, 단백질 농도, 반응 시간 등)을 미세조작함으로써, 상이한 PEG화 종의 상대적 양이 변화될 수 있다. 바람직하게는, 이 반응은 5 내지 15%(v/v) 에탄올 및 0.5 내지 4%(v/v) 에틸렌글라이콜을 포함하는, pH 8 내지 10의 완충 수용액에서 수행된다. 바람직하게는, 단백질:PEG 비는 모노PEG화 변이체가 제조되는 경우 1:0.5 내지 1:2이고, 다이PEG화 변이체가 제조되는 경우 1:2.2 내지 1:5이다. 반응 온도 및 반응 시간은 숙련자의 지식에 따라 변화될 수 있으며, 이 때 높은 온도 및 더 긴 반응 시간에서는 PEG화가 증가된다. 따라서, 모노PEG화 변이체가 제조되는 경우, 4℃에서 30분 이하로 시행하는 것이 바람직하다. pH 약 9.0에서 약 1:1.5의 단백질:PEG 비 및 4℃의 반응 온도에서, 바람직하게는 5OmM 붕산 나트륨, 10% 에탄올 및 1% 다이(에틸렌 글라이콜)(DEG)로 이루어진 반응 완충액에서 PEG화 반응 물질이 IGF-I 변이체와 혼합되는 경우, 모노-, 다이- 및 흔적량의 트라이-PEG화 종의 혼합물이 생성된다. 단백질:PEG 비가 약 1:3인 경우, 주로 다이- 및 올리고-PEG화 종이 생성된다.
본 발명에 따른 IGF-I 변이체 접합체는, IGF-I 변이체의 1차 라이신 아미노 기를 이작용성 반응 물질과 공유결합으로 반응시켜 아미드 연결(linkage)을 갖는 중간체를 형성하고, 이 아미드 중간체를 갖는 중간체를 활성화된 폴리(에틸렌 글라이콜) 유도체와 공유결합으로 반응시켜 IGF-I 변이체 접합체를 형성시킴으로써 제조될 수 있다. 전술한 방법에서, 이작용성 반응 물질은 바람직하게는 N-석신이미딜-S-아세틸티오프로피오네이트 또는 N-석신이미딜-S-아세틸티오아세테이트이고, 활성화된 폴리(에틸렌 글라이콜) 유도체는 바람직하게는 요오도-아세틸-메톡시-PEG, 메톡시-PEG-비닐설폰 및 메톡시-PEG-말레이미드로 구성된 군에서 선택된다.
분자량 40kDa의 N-하이드록시석신이미딜 활성화된 분지형 PEG 에스터(mPEG2-NHS)를 사용하는 것이 특히 바람직하다(문헌[Monfardini, C, et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69]; [Veronese, F. M., et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12 (1997) 197-207]; 및 미국 특허 제 5,932,462 호 참조).
IGF-I 변이체 접합체는, 티올 기의 IGF-I 변이체에 대한 아미노-반응성 공유결합으로 연결시키고("활성화"), 수득된 활성화된 IGF-I 변이체를 폴리(에틸렌 글라이콜)(PEG) 유도체와 결합시킴으로써 제조될 수 있다. 제 1 단계는 IGF-I 변이체의 라이신 NH2-기를 통한 티올 기의 공유결합성 연결을 포함한다. 이 IGF-I 변이체의 활성화는 보호된 티올기, 및 추가의 반응성 기, 예를 들어 활성 에스터(예: 석신이미딜에스터), 무수물, 설폰산의 에스터, 카복실산의 할로겐화물 및 설폰산을 각각 운반하는 이작용성 반응 물질과 수행된다. 티올 기는 당해 기술 분야에 공지된 기, 예를 들어 아세틸 기로 보호된다. 이 이작용성 반응 물질은 아미드 연결을 형성하여 라이신 아미노산의 ε-아미노 기와 반응할 수 있다. 이작용성 반응 물질의 제조는 당해 기술 분야에 알려져 있다. 이작용성 NHS 에스터의 전구체는 독일 특허 제 DE 39 24 705 호에 기재되어 있고, 한편 아세틸티오 화합물의 유도체화는 문헌[March, J., Advanced Organic Chemistry (1977) 375-376]에 기재되어 있다. 이작용성 반응 물질 SATA는 상업적으로 입수할 수 있고(미국, 오리건, 유진 소재의 몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes) 및 미국, 일리노이, 록포드 소재의 피어스(Pierce)), 문헌[Duncan, R. J., Anal. Biochem. 132 (1983) 68-73]에 기재되어 있다.
반응은, 예를 들어 pH 6.5 내지 8.0의 수성 완충 용액 중에서, 예를 들어 pH 7.3의 10mM 인산 칼륨 및 300mM NaCl의 완충 용액에서 수행된다. 이작용성 반응 물질은 DMSO에 첨가될 수 있다. 반응의 완료 후, 바람직하게는 30분 후, 라이신을 첨가하여 반응을 정지시킨다. 과량의 이작용성 반응 물질은 당해 기술 분야의 공지된 방법으로, 예를 들어 투석 또는 컬럼 여과로 분리할 수 있다. IGF-I 변이체에 첨가되는 티올 기의 평균 수는, 예를 들어 문헌[Grasetti, D. R,. and Murray, J. F., in Arch. Biochem. Biophys. 119 (1967) 41-49]에 기술된 광도계 방법으로 결정될 수 있다. 상기 반응에 이어 활성화된 폴리(에틸렌 글라이콜)(PEG) 유도체의 공유결합이 뒤따른다.
활성화된 PEG 유도체는 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Morpurgo, M., et al., J. Bioconjugate Chem. 7 (1996) 363-368]에 PEG-비닐설폰에 대하여 기술되어 있다. 선형 쇄 및 분지쇄 PEG 종이 화학식 I의 화합물의 제조에 적합하다. 반응성 PEG 반응 물질의 예로는 요오도-아세틸-메톡시-PEG 및 메톡시-PEG-비닐설폰이 있다. 이러한 요오도-활성화된 물질의 사용은 당해 기술 분야에 공지이고, 예를 들어 문헌[Hermanson, G. T., in Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) pp. 147-148]에 기술되어 있다.
모노- 및/또는 다이PEG화 IGF-I 변이체의 분리, 및 바람직하게는 N-말단 PEG화 형태로부터의 분리를 포함하는 본 발명에 따른 화합물의 추가의 정제는 당해 기술 분야에 공지인 방법으로, 예를 들어 컬럼 크로마토그래피, 바람직하게는 이온 교환 크로마토그래피, 특히 양이온성 교환 크로마토그래피로 수행될 수 있다.
모노-PEG 접합체의 백분율은 물론 모노- 및 다이-PEG 종의 비는 조성물에서 모노-PEG의 백분율을 감소시키기 위하여 용출 피크 주위의 더 넓은(broader) 분획을 수집하거나, 모노-PEG의 백분율을 증가시키기 위하여 더 좁은 분획을 수집함으로써 조절될 수 있다. 약 90%의 모노-PEG 접합체가 수율 및 활성의 양호한 균형을 제공한다. 때때로, 예를 들어 접합체의 95% 이상 또는 98% 이상이 모노-PEG 종인 조성물이 바람직하다. 본 발명의 한 실시태양에서, 모노 PEG화 접합체의 백분율은 90 내지 98%이다.
본원에 사용되는 "극성 아미노산"은 시스테인(C), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 히스티딘(H), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 아르지닌(R), 세린(S) 및 트레오닌(T)으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산을 가리킨다. 또한, 라이신도 극성 아미노산이지만, 라이신은 본 발명에 따라 치환되므로 배제된다. 바람직하게는, 극성 아미노산으로서 아르지닌이 사용된다.
약학 제형
본 발명에 따른 PEG화 IGF-I은 적은 적용 간격으로 신체를 통한 IGF-I 수용체에의 지속적 접근을 가능케 하는 순환에서의 개선된 안정성을 제공한다.
PEG화 IGF-I 변이체는 혼합물로서, 또는 이온 교환 크로마토그래피로 또는 치수 배제 크로마토그래피로 분리된 상이한 PEG화 종으로서 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 당해 기술 분야의 숙련자에게 공지인 약학 조성물의 제조 방법에 따라 제형화될 수 있다. 이러한 조성물의 제조를 위하여 본 발명에 따른 PEG화 IGF-I 변이체를 약학적으로 허용되는 담체와의 혼합물에서, 바람직하게는 약학 조성물의 바람직한 성분을 포함하는 수용액에 대한 투석에 의해 혼합한다. 이러한 허용되는 담체는, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, Mack Publishing Company, edited by Oslo et al. (e.g. pp. 1435-1712)]에 기재되어 있다. 전형적인 조성물은, 예를 들어 약 0.1 내지 100mg/ml의 유효량의 본 발명에 따른 물질과 함께 적당량의 담체를 포함한다. 조성물은 비경구로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 PEG화 IGF-I은 바람직하게는 복강내, 피하, 정맥내 또는 비강내 적용을 통해 투여된다.
본 발명에 따른 약학 제형은 당해 기술 분야에서 공지 방법에 따라 제조될 수 있다. 보통, PEG화 IGF-I 변이체의 용액을 약학 조성물에 사용될 예정인 완충액에 대하여 투석하고 농축 또는 희석에 의해 목적하는 최종 단백질 농도를 조정한다.
이러한 약학 조성물은 주사 또는 주입용으로, 바람직하게는 복강내, 피하, 정맥내 또는 비강내 적용을 통하여 투여될 수 있고, 약학적으로 허용되는 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체와 함께 유효량의 PEG화 IGF-I 변이체를 포함한다. 이러한 조성물은 다양한 완충 내용물(예: 아르지닌, 아세테이트, 포스페이트)의 희석제, pH 및 이온 강화제, 계면활성제 및 가용화제 같은 첨가제(예: 트윈(Tween)TM 80/폴리소르베이트, 플루로닉(pluronic)TM F68), 항산화제(예: 아스코브산, 나트륨 메타바이설파이트), 보존제(티머솔(Timersol)TM, 벤질 알코올) 및 장확장성 물질(bulking substances)(예: 사카로스, 마니톨)을 포함하고, 폴리락트산, 폴리글라이콜산 등 같은 중합체 화합물 물질을 미립자 제제 내로 또는 리포솜 내로 도입한다. 이러한 조성물은 본 발명에 따른 모노PEG화 IGF-I의 물리적 상태 안정성, 방출 속도 및 청소율에 영향을 미칠 수 있다.
투여량 및 약물 농도
전형적으로 표준 치료 요법에서, 환자는 1일 내지 약 30일 동안, 또는 더 길게 지속하는 소정의 기간에 걸쳐 1일당 1kg당 0.001 내지 3mg, 바람직하게는 0.01 내지 3mg의 범위의 PEG화 IGF-I 변이체의 투여량으로 치료를 받는다. 약물은 ml당 0.1 내지 100mg의 PEG화 IGF-I을 포함하는 약학 제형의 단일 일일 피하, 정맥내(i.v.) 또는 복강내(i.p.) 볼러스 주사제 또는 주입제로서 적용된다.
이 치료는 표준 치료 전, 도중 또는 후에 PEG화 IGF-I을 적용함으로써, 임의의 표준(예: 화학요법) 치료와 병용으로 행할 수 있다. 이렇게 함으로써 표준 치료 단독에 비하여 개선된 성과를 가져온다.
본 발명에 따른 PEG화 IGF-I은 성공적인 치료를 위하여 주당 단지 1 또는 2회 투여될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 추가의 실시태양은 알츠하이머병의 치료가 필요한 환자에게, 본 발명에 따른 유효량의 PEG화 IGF-I을 3 내지 8일 동안, 바람직하게는 7일 동안 kg당 0.001 내지 3mg, 바람직하게는 0.01 내지 3mg 범위로 PEG화 IGF-I 변이체의 각각의 1회 투여량으로 투여함을 포함하는, 알츠하이머병의 치료 방법이다. PEG화 IGF-I으로서, 바람직하게는 모노PEG화 IGF-I, 바람직하게는 본 발명에 따른 라이신-PEG화 IGF-I 변이체 및 N-말단 PEG화 IGF-I 변이체의 1:1 이상의 몰비의 조성물이 사용된다.
본 발명의 추가의 실시태양은 알츠하이머병의 치료가 필요한 환자에게, 유효량의 PEG화 IGF-I을 3 내지 8일 동안, 바람직하게는 7일 동안 kg당 0.001 내지 3mg, 바람직하게는 0.01 내지 3mg 범위로 PEG화 IGF-I 변이체의 1 또는 2회 투여량으로 투여함을 포함하는, 알츠하이머병의 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 PEG화 IGF-I의 용도이다. PEG화 IGF-I으로서, 바람직하게는 모노PEG화 IGF-I, 바람직하게는 본 발명에 따른 라이신-PEG화 IGF-I 변이체 및 N-말단 PEG화 IGF-I 변이체의 1:1 이상의 몰비의 조성물이 사용된다.
하기 실시예, 참고문헌 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제공되며, 본 발명의 정확한 범위는 첨부한 청구의 범위에 기재된다. 본 발명의 기술 사상으로부터 벗어나지 않고 기재된 절차에 변형을 가할 수 있음은 물론이다.
서열 목록
서열 식별 번호 1 : 인간 IGF-I의 아미노산 서열(아미노산 1 내지 70 IGF-I; 스위스프로트(SwissProt) 제 PO 1343 호에 따른 아미노산 71 내지 105 프로펩티드).
재료 및 방법
재조합 인간 인슐린-유사 성장 인자(rhIGF-I)는 셀 컨셉츠(Cell Concepts, 독일, 움키르히 소재)를 통해 펩로테크(PeproTech, 미국, 뉴저지, 록키 힐 소재)로부터 구입하였고, Des(l-3)-IGF-I은 그로펩(GroPep, 호주, 애덜레이드 소재)으로부터 입수하였다. 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 반응 물질은 넥타 리미티드(Nektar Ltd., 미국, 캘리포니아, 산 카를로스 소재)로부터 공급되었다. 이 연구를 위한 모든 다른 화학 물질 및 용매는 가능한 한 최상의 순도를 갖는 것으로 하였다. IGF-I 변이체는 최신 기술에 따라 재조합 방식으로, 예를 들어 미국 특허 제 6,509,443 호 또는 제 6,403,764 호에 기술된 바와 같이, 바람직하게는 대장균(E. coli)에서 발현 방법과 공동으로 위치 지향 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다.
IGF-I의 PEG화
단일 위치에서 PEG화된 IGF-I 이성질체(모노PEG-IGF-I)를 제조하였다. 모노PEG-IGF-I은 40kDa의 분자량을 갖는 활성화된 분지형 PEG 부분으로 IGF-I 분자의 표면에서 또는 N-말단 상에서 라이신 ε-아미노 기의 접합에 의해 제조되었다. PEG화 반응 혼합물은 pH 9.0의 50mM 붕산 나트륨 완충액(10% 에탄올 및 1% DEG)에 1:1.5 몰비로 rhIGF-I 및 40kDa PEG-NHS 반응 물질을 포함하였다. 이 반응은 4℃에서 30분 동안 수행되었다. 사용된 PEG 부분의 44kDa의 평균 분자량 및 IGF-I의 7.6kDa의 분자량에 근거하여, 모노PEG-IGF-I에 대하여 계산된 평균 분자량은 약 51.6kDa로 예상되었다.
이온 교환 크로마토그래피에 의한 PEG-IGF-I 위치 이성질체의 분리
제조용 강-양이온 교환 컬럼(TOSOH- BIOSEP, SP-5PW, 내경 30mm 및 길이 75mm)을 이용한 정제 방법을 사용하여 순수한 모노PEG-IGF-I 이성질체를 제조하였다. 완충 시스템은 pH 4.5로 조정된 7.5 mM 아세트산 나트륨, 10% 에탄올 및 1% 다이에틸렌 글라이콜(완충액 A) 및 pH 6.5로 조정된 20mM 인산 칼륨, 10% 에탄올 및 1% 다이에틸렌 글라이콜(완충액 B)로 구성되었다.
컬럼을 25% 완충액 B로 미리 평형상태로 만들었다. PEG-IGF-I 시료를 적재(loading)한 후, 컬럼을 35% 완충액 B로 세척한 후, 65% 완충액 B로의 상승 선형 농도 구배로 이성질체를 분리하였다. 비PEG화 IGF-I의 용출을 위하여, 시스템을 pH 8.0의 개질된 완충액 B로 전환하였다. 유속은 8ml/분이었고, 218nm에서 검출을 수행하였다. 생성된 단백질 시료를 수작업으로 수집하고 분할하여 -200℃에 저장하여 다양한 단백질, 화학 및 생물학 분석에 사용하였다(하기 참조).
분석용 강-양이온 교환 컬럼(TOSOH-BIOSEP, SP-NPR, 입자 크기 2.5μm, 지름4.6mm, 길이 3.5cm)을 사용하여 분리된 위치 이성질체의 순도를 조사하였다. 이 분석용 컬럼에 본 발명자들은 제조용 컬럼에서와 같은 이동상을 사용하였으나, 유속과 영동(running) 시간을 감소시켰다. 모노PEG-IGF-I 이성질체의 단백질 농도는 모노PEG-IGF-I의 단백질 부분의 280nm 흡수도(E1mg/ml 280=0.584)에 기초하여 분광 광도법으로 측정하였다.
모노PEG-IGF-I 순도의 분석
개개의 모노PEG-IGF-I 이성질체를 비-환원 또는 환원 조건 하에서 4 내지 12% 트리스-글라이신 SDS-PAGE로 분석하였다. 단백질을 고정하고 심플 블루 세이브스테인(Simple Blue SaveStain, 스위스, 바젤 소재의 인비트로젠(Invitrogen))으로 염색하였다.
모노PEG-IGF-I 이성질체의 질량 분광법 확인
정제된 모노PEG-IGF 이성질체를 Asp-N으로 절단하여 N-말단, K27, K65 또는 K68에서 4개의 가능한 PEG화 위치를 확인하였다. 절단 완충액은 0.04μg/μl Asp-N을 갖는 100mM 트리스/HCl(pH 8.0)(로쉐 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH), 독일 소재)로 구성되었다. 모노PEG-IGF 20μg을 Asp-N 1μg과 함께 37℃에서 16시간 동안 절단 완충액에서 배양하였다. 16시간 후, 반응 혼합물을 TCEP(10 mM)를 첨가하여 37℃에서 1.5시간 동안 환원시켰다. 이어서, 반응 용액에 1/20 부피의 10% TFA를 첨가하여 켄칭하여 절단 반응을 마무리하였다. 수득된 펩티드 혼합물을 온라인-HPLC ESI 질량 분광법 또는 HPLC로 직접 분석하거나, -80℃에 보관하였다.
ESI-LC-MS 분석을 위하여, 펩티드 혼합물을 페노메넥스 쥬피터(Phenomenex Jupiter) C18 역상 컬럼(1x250mm, 5μm, 300Å)이 장착된 애질런트(Agilent) 1100 HPLC 시스템에서 유속 40μl/분으로 분리하였다. 또한, 220nm에서의 UV 신호를 기록하였다. Q-ToF II 또는 LCT 질량 분광계(마이크로매스(Micromass))를 HPLC 시스템에 직접 연결하였다. 200 내지 2000m/z의 질량 범위에서 ESI-ToF 스펙트럼을 1스캔/초로 기록하였다. UV 및 TIC 스펙트럼을 평가하고 각각의 펩티드를 크로마토그램에서 단일 피크로 할당할 수 있었다.
HPLC 분석을 위해, 펩티드 혼합물을 페노메넥스 쥬피터 C18 역상 컬럼(1x250mm, 5μm, 300Å)이 장착된 애질런트(Agilent) 1100 HPLC 시스템에서 유속 40μl/분으로 분리하였다. 또한, 220nm에서의 UV 신호를 기록하였다. PEG 펩티드가 체류 시간에서 더 높은 아세토니트릴 농도를 향해 이동하였고, 수작업으로 수집하여 N-말달 에드먼 분해에 적용하였다.
HPLC 진행 조건(용매 A: 물 중의 0.1% TFA, 용매 B: 아세토니트릴 중의 0.1% TFA)을 하기 표 1에 나타낸다:
N-말단 에드먼 분해 서열분석은 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 단백질서열분석기 프로사이스(Procise) 492 상에서 제조자의 설명서에 따라 프로사이스 시스템 콘트롤 소프트웨어를 이용하여 수행되었다. HPLC 시행에서 수집한 분획물 20μl를 바이오브렌 플러스(BioBrene Plus)TM 조절 마이크로 TFA 필터에 직접 적용하였다. 카트리지 실(seal)로 덮인 아르곤 하에서 필터를 건조하고 단백질서열분석기에 도입하였다. 자동 표준 프로그램을 사용하여 폴리펩티드의 순차적 분해를 수행하였다. 어플라이드 바이오시스템즈 데이터 평가 소프트웨어 610A를 이용하여 각각의 분해 사이클로부터의 HPLC 크로마토그램을 분석한 결과, 각각의 아미노산의 위치가 밝혀졌다. 시스테인, 및 PEG화 라이신 같은 개질된 아미노산이 크로마토그램에서 간극(gap)으로 나타났다.
올리고뉴클레오디트 어레이 전사(transcriptional) 분석
상이한 모노PEG-IGF-I 이성질체의 시험관내 전사 프로파일 분석을 위하여, IGF-IR이 안정하게 감염된 NIH-3T3 세포를 2시간 동안 혈청-부족 배양하고 혈청의 부재 하에 0.1 또는 1μg/ml rhIGF 및 1μg/ml의 각각의 모노PEG-IGF-I 이성질체 또는 분리하지 않고 수득된 모든 이성질체의 혼합물과 함께 24시간 동안 배양하였다. 이어서, 배양된 세포를 수확하고 총 세포 RNA를 RNA-BeeTM을 이용하여 추출하였다. 각각의 시료로부터 RNA 10μg을 역전사하고, 표지하고 공급자(인비트로젠(Invitrogen), 스위스, 바젤 소재; 암비온(Ambion), 영국, 헌팅던 소재)의 설명서에 따라 시판 키트를 이용하여 처리하였다. MOE 430A 진칩(GeneChip) 어레이에 대한 알칼리 열 분절의 방법 및 혼성화(hybridization) 조건은 제조자(아피메트릭스(Affymetrix), 미국)가 공급한 표준 절차이었다.
이 어레이의 형광(세포 강도)는 공초점 레이저 스캐너(confocal laser scanner)를 이용하여 기록하고, MAS 5.0 소프트웨어(아피메트릭스, 미국)를 이용하여 자료값을 분석하였다. 평균 차이(AD)로 표시되는 불일치(mismatched) 올리고뉴클레오티드에 대한 혼성화에 비교하여, 형광 강도의 정상화된 평균 차이로서 각각의 유전자에 대한 발현 수준을 계산하였다. 생물학적 편차를 고려하기 위하여 각각의 실험은 3배수로 수행되었다.
차등 발현된 유전자의 선택을 위하여 하기 2가지 기준을 선택하였다: i) 처리된 세포의 mRNA 수준 값은 비처리된 세포에 비하여 5배 이상 높거나 1/5 이하로 낮아야 했다. ii) 표준 편차는 평균 차이에서 절대 변화(absolute change)보다 유의성있게 작아야 하고 유전자의 계산된 신뢰도 수준은 97%(p<0.03) 초과로 설정하였다.
IGF-IR 인산화 평가
인간 IGF-IR로 안정하게 감염된 NIH-3T3 세포를 통로 2 내지 4 사이의 실험에 사용하였다. 세포를 피복되지 않은 24- 또는 96-웰 판에서 배양하고, 70% 군집도(confluency)까지 성장시켰다. 이어서, 세포를 하룻밤 혈청-부족 배양한 후, rhIGF-I 또는 각각의 PEG-IGF-I 피크(또는, 피크 혼합물)와 함께 30분 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 IGF-IR 인산화의 세포내 분석하기 위하여 웨스턴용 램리(Laemmli) 완충액에서 용해하거나, 4% 파라포름알데하이드로 30분 동안 고정하였다. 웨스턴 분석의 경우, 단백질 추출물을 10% 비스-트리스 SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로스 막에 블로팅하였다. 블롯을 생쥐-항-포스포타이로신(4G10, 1:1000; 업스테이트(Upstate)) 및 토끼-항-IGF-IR(C-20, 1:1000; 산타 크루즈(Santa Cruz)) 1차 항체와 함께 공배양하고 항-생쥐-알렉사(Alexa)680(1:10000; 몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes)) 및 항-토끼-IRDye800 2차 항체(1:10000; 잭슨(Jackson))로 표지하였다. 세포내 분석의 경우, 고정된 세포를 차단하고 2% 염소 혈청 및 트리톤(Triton) X-100(0.1%)으로 투과성으로 만들고, 동일한 1차 및 2차 항체와 배양하였다. 단백질 띠(band)의 형광 검출은 오디세이 이미징 시스템(Odyssey imaging system)(리커 바이오사이언스(Licor Biosciences))로 수행하였다. 디지털 영상으로부터, 단백질 때의 화소 강도(pixel intensity)를 정량하고 투여량 반응 곡선을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 인산화 수준을 동일한 해당 영역으로부터 수득된 IGF-IR 값으로 정상화하여 실제 IGF-IR 활성화 변화를 구하였다. 실험은 2배수로 3회 반복하여 투여량당 6개의 독립된 조사값을 얻었다. 자료값은 평균±SEM으로 표현되었다.
rhIGF-I 및 PEG-IGF-I 이성질체를 이용한 생체내 실험
단일-유전자 도입 AAP 및 이중-유전자 도입 PS2AAP 생쥐(문헌[Richards, J. G., et al., J. Neurosci. 23 (2003) 8989-9003] 참조)로 구성된 알츠하이머병 생쥐 모델을 사용하여, 최근 다른 생쥐 및 쥐 모델에서 나타난 뇌 아밀로이드증(amyloidosis)에 대한 rhIGF-I(및 모노PEG-IGF-I)의 효과를 조사하였다(문헌[Carro, E., et al., Nat. Med. 8 (2002) 1390-1397] 참조). PS2APP 생쥐 모델은 2월령에서 측정가능한 Aβ 수준으로, 및 8월령에 플라크 침착을 개시하며 아밀로이드증을 진행시키는 것으로 나타났다(문헌[Richards, J. G., et al., J. Neurosci. 23 (2003) 8989-9003] 참조). 단일-유전자 도입 APP 생쥐는 이러한 어린 연령에서 매우 유사한 Aβ 수준을 보이므로 이 군에 포함시켰다. 본 발명자들은 예비-플라크 연령(2 내지 3월령)을 분석하여 가용성 뇌 Aβ 수준에 대한 rhIGF-I 및 PEG-IGF-I 이성질체의 영향을 조사하였다. 모든 실험은 스위스 동물 보호 권리에 따라 수행하였고 동물의 고통을 최소로 유지하였다. 1mM HCl(rhIGF-I) 또는 10% 글라이세롤을 포함하는 PBS(모노PEG-IGF-I 이성질체) 중의 보관 용액으로부터, 1% 미만의 용매를 갖는 0.9% NaCl 중의 주사 용액을 제조하였다. 대조군은 0.9% NaCl로 주사되었다. 주사는 약한 아이소플루란 마취 하에서 복강내(i.p) 투여로 수행되었다. 주사 후 상이한 시점(2시간, 6시간, 24시간, 48시간 또는 72시간)에 아이소플루란 마취 하에서 동물을 희생시켰다. 생쥐를 참수하고 뇌를 제거하여 단뇌(telencephalon)(해마를 포함하는 대뇌피질)를 단리하였다. 피질 단백질 추출물을 4mM 트리스(pH 7.4) 및 320mM 수크로스(둘 다 플루카(Fluka) 제품)를 포함하는 저장성(hypotonic) 용해 완충액에 프로티에이스 및 포스파테이스 억제제 칵테일(둘 다 시그마(Sigma) 제품)과 함께 준비하였다. 시료 완충액은 8M 우레아(플루카 제품)를 포함하는 램리 완충액이었다. 단백질을 4 내지 12% 비스-트리스 SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로스 막에 블로팅하였다. 블롯을 생쥐-항-아밀로이드 전구체 단백질(APP)(WO-2 클론, 1:5000; 더 제네틱스 캄파니(The Genetics Company)) 검출 APP, C99 분절 및 Aβ 및 염소-항-액틴(C-I l, 1:5000; 산타 크루즈) 1차 항체와 함께 공배양하고, 항-생쥐-알렉사680(1:10000; 몰레큘러 프로브즈) 및 항-염소-IRDye800 2차 항체(1:10000; 잭슨)로 표지하였다. 단백질 띠의 형광 검출은 오디세이 이미징 시스템(리커 바이오사이언시즈)으로 수행하였다. 디지털 영상으로부터, 단백질 띠의 화소 강도를 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 자료값은 평균±SEM으로 표현되었다.
모든 값은 액틴(또는, 대조 단백질로서 알부민)에 대하여 정상화되었고, 특정 비(C99/APP, Aβ/APP, C99/Aβ)를 계산하였다. C99/APP 비는 C99가 β-세크레테이스(secretase)의 산물이고 γ-세크레테이스의 기질이기 때문에 β- 및 γ-세크레테이스의 활성 상태에 대한 정보를 제공하고, 이 측정값에서의 변화는 더 뒤의 Aβ의 운명과 독립적으로 이들 세크레테이스의 하나에 대한 조절 효과를 가리킨다. 특정 처리 후 일정한 C99/APP 수준으로, C99/Aβ 비는 생성과는 독립적으로 Aβ의 청소율을 모니터링하여, 증가된 청소율과는 더 높고 감소된 청소율과는 더 낮아진다. 더욱이, Aβ는, 이의 생성이 개개 생쥐마다 다양한 유전자 도입 APP 발현에 의존하기 때문에, APP에 대하여 정상화시켰다. 비 계산은 모든 개개의 동물에 대하여 수행하였다. 모든 수득된 자료값은 모든 실험에 포함된 비처리된 대조군에 대한 %로 표현된다. 투여량/시간 간격마다 2 내지 5마리 동물을 가지고 개개의 실험을 2 내지 4회 반복하였다. 통계적 차이는 통계적으로 유의성있는 것으로 간주되는 p<0.05로 비결합(unpaired) t 시험에 의해 평균±SEM으로 평가하였다.
실시예 1
모노 PEG-IGF-I 위치 이성질체의 크로마토그래피 분리
IGF-I은 잠재적 PEG화 위치로서 4개의 아미노 기를 포함하고, 4개의 가능한 모노PEG화 IGF-I(모노PEG-IGF-I) 이성질체가 예상되었다. 반응 조건에 따라서 추가의 유도체가 올리고PEG화 될 것으로 예상되었다. 강-양이온 고성능 액체 크로마토그래피 방법(IEC-HPLC)을 PEG-IGF-I 또는 데스(l-3)-IGF-I 이성질체의 분리를 위하여 이들의 국지적 전하 차이(local charge difference)에 기초하여 개발하였다. PEG-IGF-I 5mg의 제조용 용출 프로필을 도 1에 나타낸다. 이 방법의 결과, 5개의 주요 피크, 기저선(baseline) 분리를 갖는 3개의 피크 및 부분 분리를 갖는 2개의 피로 분리되었다. 크로마토그램의 끝으로 갈수록 기저선 흡수의 감소는 더 높은 체류 시간에 용출하는 추가의 모노PEG화 IGF-I 종이 없음을 시사한다. 다른 pH를 갖는 개질된 완충액 B로의 전환에 기인하는 피크 3 및 4 사이에 추가의 피크가 나타났다. 분석용 IEC-HPLC를 이용하여 개개 이성질체이 순도 및 IEC 분획에서 다른 위치 이성질체에 의한 오염을 평가하였다. 모든 모노PEG화 피크는 >99% 초과의 순도를 가졌다.
실시예 2
모노PEG-IGF-I 이성질체의 SDS-PAGE 분석
비-환원 및 환원 조건 하에서 SDS-PAGE를 수행하여 분자간 다이설파이드 가교를 통한 상이한 IGF-I 분자의 목적하지 않은 잠재적 교차-결합을 평가하였다. 두 조건 모두 유사한 결과를 보였는데, 이는 유의성있는 양의 단백질이 비정상적으로 교차-결합되지 않았음을 가리킨다(도 2). SDS-PAGE 분석에서는 피크 0이 100kDa 초과의 겉보기 분자량을 보인 반면, 주요 검출된 띠는 약 70kDa에서 피크 1 내지 3이었고, 추가적으로 피크 4가 비PEG화 IGF-I에 대하여 예상되는 크기인 약 7kDa에서 검출되었다(도 2). HPLC에서 얻은 이 영동 프로필 및 체류 시간으로부터 본 발명자들은 피크 0이 아마도 다이- 및 올리고PEG-IGF-I로 구성된 것으로 결론지었다. 대조적으로, 피크 1 내지 3은 3개의 상이한 모노PEG-IGF-I 이성질체로 지정하였다. 모노PEG-IGF-I에 대한 예상된 분자량(51.6kDa) 과 약 70kDa의 겉보기 크기 사이에는 불일치가 있었으나, 이러한 관찰된 더 높은 분자량은 PEG-IGF-I의 전기영동 이동성을 상당히 감속시키고 겉보기 분자량을 증가시키는 물 결합에 기인하는, 큰 유체역학 부피(hydrodynamic volume)에 의해 설명될 수 있다(문헌[Foser, S., et al., Pharmacogenomic J. 3 (2003) 319] 참조). 함께 고려하여, IEC-HPLC 및 SDS-PAGE 실험은 IEC 분획의 순도가 추가의 특성평가에 대하여 충분히 순수한 것으로 간주될 수 있음을 가리킨다.
PEG화 및 모노PEG-데스(l-3)-IGF-I의 분리는 rhIGF-I에 상응하게 수행되었고 유사하게 3개의 주요 모노PEG-데스(l-3)-IGF- I 피크를 산출하였다.
실시예 3
모노PEG-IGF-I 이성질체의 분석
Asp-N을 이용한 rhIGF-I의 절단에서는 HPLC에 의해 30 내지 45분의 체류 시간에 분리된 6개의 독립적인 펩티드 분절이 제공되었다(도 3A, 상부 패널). 정제된 피크 1 내지 3(도 3A, 하부 패널)의 절단 후, 상이한 분포의 6개의 분절, 및 추가의 분절(분절 7)의 존재가 약 70분의 체류 시간에서의 용출시 관찰되었다. 피크 1의 경우, 구체적으로 펩티드 분절 4가 분절 7의 동시 증가와 함께 감소되었다. 피크 2의 경우, 본 발명자들은 분절 3에서의 분명한 감소 및 분절 5에서의 약간의 감소, 및 주요 및 부수적 PEG 분절(7 및 7')의 출현을 관찰하였다. 유사하게, 피크 3의 HPLC 분석에서는 분절 3 및 5에서의 분명한 감소와 함께 분절 7 및 7'의 동반 발생을 일으켰다. 도 11B는 rhIGF-I의 Asp-N 절단에 의해 얻은 각각의 분절의 펩티드 서열을 보여준다. 에드먼 N-말단 펩티드 분해를 이용하여, 본 발명자들은 PEG화 피크 1, 2 및 3으로 얻은 주요 분절 7의 펩티드 서열을 분석하였다. 이에 의하면, 시스테인 및 PEG화 아미노산이 펩티드 서열에서 손상을 전달하였다. 이 분석을 이용하여 피크 1은 K27에서 PEG화된 rhIGF-I로서 분명하게 매핑될 수 있었다(도 3C). 피크 2의 경우, 주요 분절 7(>90%)은, 에드먼 분해에 의해 K68이 비변형된 라이신(K)으로 확인되었으므로, PEG화 K65로서 매핑되었다. 이와 대조적으로, 피크 3의 분획은 에드먼 분해 HPLC 크로마토그램에서 신호를 생성하는 K65와 함께 K68에서의 PEG화(서열에서 간극)을 전달하였다(도 3C). 부수적 피크 7'는 에드먼 분해에 의해 서열분석이 될 수 없었으며, 이는 N-말단이 아마도 PEG화에 의해 반응에 접근할 수 없었음을 가리킨다. 함께 고려하여 이들 자료값은 피크 1이 K27 PEG화 이성질체로 구성되고, 피크 2가 K65에서 PEG화된 IGF-I이고, 피크 3이 유의성있는 양의 N-말단 PEG화 IGF-I와 함께 K68 PEG화되었음을 나타낸다.
실시예 4
rhIGF-I 및 모노PEG-IGF-I 이성질체의 전사 프로필 조사
DNA 마이크로어레이를 이용하여, 본 발명자들은 rhIGF-I 또는 PEG-IGF-I 이성질체로 24시간에 걸쳐 처리하여, 인간 IGF-IR로 안정하게 감염된 NIH-3T3 세포의 전사 반응을 측정하였다. 따라서, 본 발명자들은 세포를 0.1 및 1μg/ml의 IGF-I으로 또는 1μg/ml의 모노PEG-IGF-I 피크로, 또는 PEG화 반응에서 얻은 피크 혼합물로 자극하였다. 본 발명자들은 자극된 세포의 전체 전사 활성을, 모든 공지된 IGF-I 반응 유전자를 포함하는 약 14,000 생쥐 유전자에 대한 프로브세트를 포함하는 시판 칩 타입(MOE 430A; 아피메트릭스 인코포레이티드)을 이용하여 대조 배양물과 비교하였다. mRNA 풍부(abundance)는 완전 일치 올리고뉴클레이티드 프로브와 중심 위치에서 불일치를 갖는 상응하는 프로브 사이의 평균 차이(AD)로서 표시하였다. 본 발명자들은 3개의 생물학적 복제물(replicate) 내에서 5 초과의 변화 계수(change factor)를 갖고 97% 재현성(p-값 <0.03)을 갖는 유전자만을 고려하였다. 이 분석에서는 모든 IGF-I 변이체에 의해 86개의 상향 조절된 및 76개의 하향 조절된 총 162개의 유전자를 산출하였다. 상이한 모노PEG-IGF-I 이성질체의 전사 활성에 대한 일반적 상관관계 프로필은 도 4에서 상향- 및 하향 조절된 유전자의 체계적(hierarchical) 클러스터의 형태로 설명된다. 0.1μg/ml 및 1.0μg/ml IGF-I의 개객 유전자의 유도 수준에 대한 검사에서는 선택된 클러스터가 매우 유사함을 보여준다. 피크 3은 동일한 농도에서 비PEG화 IGF-I와 유사한 발현 프로필을 형성하고, PEG-IGF 혼합물 및 다른 피크보다 더 potent 하다. 흥미롭게, 피크 2는 PEG-IGF 혼합물과 유사한 전사 반응을 기동시킨다. 생물학적 활성과 일치하게 피크 1은 가장 약한 전사 반응을 보여주고, 이는 PEG화가 수용체 상호작용으로 간섭받았음을 가리킨다.
실시예 5 및 6
rhIGF-I 및 모노PEG-IGF-I에 의한 시험관내 IGF-IR 인산화
IGF-IR 활성화의 시험관내 분석을 위하여 인간 IGF-IR을 안정하게 발현하는 NIH-3T3 세포를 사용하였다. 하룻밤 혈청-부족 배양한 후, 세포를 rhIGF-I 또는 각각의 PEG-IGF-I 이성질체를 증가하는 투여량(0.003 내지 10μg/ml)으로 처리하였다. 인산화된 IGF-IR의 웨스턴 분석을 상기 기술된 바에 따라 수행하였고, 얻은 투여량 반응 곡선을 힐계수(nH)를 포함하는 일-위치 결합 동역학에 적합화시키고, 상관 곡선의 정량 자료값을 도 6의 표에 나타낸다. rhIGF-I의 투여량 반응(도 5A)은 6.3nM의 EC50을 제공하였고, nH 2.27로 거의 전부이거나 전부 아님(all-or-nothing) 방식으로 일어났다(도 6). 이와 대조적으로, 모노PEG-IGF-I의 피크 1은 포화가 없고, nH 0.34 및 산정된 EC50 91.5nM로써 분명한 투여량 반응을 보여주지 않았다(도 5B 및 6). 피크 2 및 3(도 5C 및 5D)은 EC50 값이 각각 13.4 및 21.5nM로 유사한 결합 친화도를 보여주었다(도 6). 두 경우에서, nH는 각각 1.27 및 1.19로 regular 였다. 피크 혼합물은 EC50 28.8nM 및 정상의 nH 1.28로서 약간 낮은 친화도를 갖는 유사한 IGF-IR 활성화 패턴을 보여주었다(도 5E 및 7). 마지막으로, PEG-Des(l-3)-IGF-I 피크 3은 EC50 10.8nM 및 정상의 nH 1.08로써 모든 PEG 이성질체의 가장 높은 친화도를 가졌다(도 5F 및 7). 이들 자료값은 피크 1을 제외한 모든 피크가 rhIGF-I에 비교하여 2 내지 5배 손실로 인간 IGF-IR을 특이적으로 활성화함을 가리킨다.
실시예 7
2월령 PS2APP 생쥐에서 rhIGF-I에 의한 생체내 Aβ 강하
이중-유전자 도입 PS2APP 생쥐를 사용하여 뇌 Aβ 하중에 대한 rhIGF-I의 단기간 효과를 분석하였다. 이들 생쥐를 50μg/kg의 rhIGF-I로 처리(복강내)하고 주사 2시간 후 피질 Aβ를 분석하였다. 도 7A는 2월령 생쥐의 뇌 추출물의 웨스턴 블롯을 보여준다. APP, C99 및 대조 단백질(알부민) 수준은 rhIGF-I에 의해 변화하지 않은 것으로 나타나는 반면, Aβ 수준은 rhIGF-I 주사 2시간 후 감소되었다. 정량 분석을 수행하고 각각의 화소 강도의 비를 계산하여 Aβ 생성에 대한 rhIGF-I의 잠재적 효과에 대한 정보를 구하였다. 이 분석 결과, APP/대조 단백질(대조군의 97.5±5.7%) 및 C99/APP(대조군의 87.2±9.8%) 비는 변화하지 않아서 유전자 도입 APP 발현 및 APP 처리가 rhIGF-I로 처리한 후 2시간에 변화하지 않은 것으로 밝혀졌다(도 7B). 이와 대조적으로, Aβ/APP는 대조군의 68.4±7.1%(p<0.01)로 유의성있게 강하되고, C99/Aβ는 대조군의 157.9±16.6%(p<0.01)로 증가되어, rhIGF-I이 Aβ를 강하시킴을 보여주었다. 함께 고려하여 이들 자료값은 rhIGF-I로 2시간 동안 어린 PS2APP 생쥐를 처리하면 주로 뇌로부터 Aβ 청소를 증가시킴을 시사한다.
실시예 8
PS2APP 생쥐에서 rhIGF-I에 의한 시간 경과에 따른 생체내 Aβ 강하 효과
가용성 뇌 Aβ에 대한 시간 경과에 따른 rhIGF-I의 단기간 효과를 평가하기 위하여, 뇌 플라크가 결여된 어린 PS2APP 생쥐(2월령)를 50μg/kg의 rhIGF-I을 복강내 주사로 처리하고 피질 APP, C99, Aβ 및 액틴 수준을 2, 6 또는 24시간 후에 검출하였다. 조사한 모든 시점에서 APP/알부민 및 C99/APP 비는 rhIGF-I에 의해 유의성있게 변화하지 않았다. 주사 2시간 후 rhIGF-I에 의한 Aβ/APP의 강하가 관찰된 반면, 이 효과는 6 및 24시간 후 보이지 않았다(도 8A). 유사하게, C99/Aβ 비로 모니터링한 Aβ 환원에서의 증가는 2시간에서만 검출되었고 6 및 24시간에서는 사라졌다(도 8B). 이 사실은 Aβ 청소에 대한 rhIGF-I의 효과가, 아마도 혈류에서 단리된 IGF-I의 짧은 반감기에 기인하여 짧은 지속시간을 가짐을 가리킨다.
실시예 9
2월령 APP 및 PS2APP 생쥐에서 생체내 Aβ 청소 효능에 대한 피크 1 내지 3의 비교 분석
이 실험에서, PEG-IGF-I 피크 1 내지 3에 대한 자료값을 Aβ 강하 및 Aβ 청소에 대한 효능의 직접 비교와 함께 나타낸다. rhIGF-I에 유사하게, APP/액틴(여기서 액틴은 대조 단백질로서 사용되었다) 또는 C99/APP 비는 피크 1, 2 또는 3에 임의의 농도에 의해 변화하지 않았다. 피크 3은 복강내(i.p.) 주사 6시간 후 Aβ/APP 감소에 있어서 가장 높은 효능을 가졌다(도 9A). 이와 대조적으로, 피크 1은 시험된 모든 농도 범위에 걸쳐 활성이 없었고, 피크 2는 사용된 최고 농도(500μg/kg)에서 Aβ/APP 강하에 대하여 유의성있는 효과를 나타냈다. 유사하게, 도 9B에 나타낸 바와 같이, 피크 3은 증가된 Aβ 청소를 표시하는 C99/Aβ 비의 증가에 있어서 낮은 투여량(15 내지 50μg/kg)에서 활성인 유일한 화합물이었다. 또한 이 평가에서, 피크 1은 비활성이었고, 피크 2는 500μg/kg에서만 유의성있는 효과를 나타냈다. 함께 고려하여, 이들 자료값은 피크 3이 이 생체내 실험 패러다임에서 가장 활성인 모노PEG-IGF-I 이성질체임을 시사한다. 도 11은 단독으로 이중-유전자 도입 PS2APP 생쥐 모델에서의 결과를 보여준다.
실시예 10
PS2APP 생쥐에서 피크 3에 의한 시간 경과에 따른 생체내 Aβ 강하
복강내(i.p.) 주사 6시간 후, 50μg/kg의 피크 3은 뇌 Aβ 수준의 감소에 있어서 유의성있는 효과를 나타냈다. 이 효과가 얼마나 지속되는 지를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 50μg/kg의 피크 3으로 2, 6, 24, 48 및 72시간 처리된 PS2APP 생쥐로부터의 뇌 추출물을 분석하였다. 전체 시간에 걸쳐 APP/액틴 또는 C99/APP 비의 유의성있는 변화가 관찰되지 않았다. 대조적으로, Aβ/APP 수준은 복강내(i.p.) 주사 후 6, 24 및 48시간에 유의성있게 감소되었고(각각, p<0.05, p<0.001 및 p<0.01), 이는 피크 3의 Aβ 강하 효과가 48시간 이상 지속됨을 가리킨다(도 10A). Aβ 생성과 독립적으로 Aβ 청소를 보여주는 C99/Aβ 비(C99/APP는 일정하게 유지되므로)는 주사후 24시간 이상 잘 유지되어 매우 유사한 시간 경과에서 유의성있게 증가되었다(도 10B). 함께 고려하여, 이들 자료값은 피크 3이 PS2APP에서 뇌 Aβ 를 감소시킬 수 있음을 설명한다. 도 12는 단독으로 이중-유전자 도입 PS2APP 생쥐 모델에서의 결과를 보여준다.
실시예 11
IGF 결합 단백질 IGFBP4(BP4) 및 IGFBP5(BP5)에의 결합
IGFBP4(스위스프로트 22692)를 동정하고 문헌[Shimasaki, S., Mol. Endocrinol. 4 (1990) 1451-1458]에 따라 클로닝하였다. IGFBP5(스위스프로트 24593)를 동정하고 문헌[Kiefer, M. C., Biochem. Biophys. Res. Commun. 176 (1991) 219-225]에 따라 클로닝하였다. 이 두 결합 단백질을 대장균(E. coli)에서 재조합으로 제조하였다.
단백질 상호작용의 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance(SPR)) 분석에 바이아코어(Biacore) 3000 장비를 사용하였다. 영동 및 반응 완충액은 25℃의 HBS-P(10mM HEPES, 150mM NaCl, 0.005% 복합계면활성제(polysurfactant), ph 7.4)이었다. 모든 시료는 12℃에서 예비 냉각하였다. IGFBP4 및 IGFBP5를 5μg/ml의 농도에서 아민-결합시켰다. CM5 칩에 결합시켜 약 700RU의 부하(loading) 신호를 생성하였다. PEG화 IGF-I 시료(분해물)를 5분 동안 1.23 내지 100nM의 5가지 농도로 주사하고(연합 상), 5분 동안 유속 50μl/분에서 HBS-P로 세척하였다. 칩 표면을 1분 동안 100mM HCl을 1회 주사하여 재생시켰다.
칩, 분석 방식(assay format) 및 주사의 순서는 하기 표 2의 기술 내용에 상응한다. 자료 평가는 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델을 이용하여 행하였다.
약어:
4OkDa: 40kDa PEG 분지형
40kDa/NT-RRRK: 40kDa PEG로 N-말단 PEG화된 RRRK
4OkDa/RRRK: 40kDa PEG로 K68에서 라이신 PEG화된 RRRK
조성물: 40kDa/NT-RRRK 및 4OkDa/RRRK(1:1)의 조성물
이 결과는 모든 PEG화 IGF 시료가 유사한 범위로 IGFBP4 및 IGFBP5에 활성적으로 결합했음을 보여준다. 모든 PEG화 시료는 비-PEG화 IGF에 비교하여 유의성있게 감소된 상관률 상수를 보였다.
음성(Negative) 대조 자료값(예: 완충액 곡선)은 시스템 고유 기저선 변이(system intrinsic baseline drift)를 위하여, 그리고 신호 잡음 감소를 위하여 시료 곡선으로부터 공제하였다.
실시예 12
리간드에 의한 IGF-IR의 자동 인산화
본 발명의 폴리펩티드가 IGF-IR을 활성화하고 IGF-IR 인산화를 유도하는 능력을 결정하기 위하여, IGF-IR 과발현 세포를 본 발명의 폴리펩티드로 자극하였고, 이어서 IGF-IR 인산화 상태를 ELISA로 분석하였다.
ELISA에서, 96-웰 스트렙타비딘(streptavidin) 피복된 폴리스티렌 판(넝크(Nunc))을 3% BSA를 갖는 PBST에 1:350으로 희석한, 인간 IGF-lRα에 대한 모노클로날 항체 100μl(0.5 mg/ml)로 피복하였다. 판 진탕기에서 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 피복 용액을 제거하고 판을 웰당 PBST 200μl로 3회 세척하였다.
IGF-IR 감염된 NIH-3T3 세포를 2mM L-글루타민(깁코(Gibco), 제품 번호 25030-024) 및 0.5% 열 불활성화된 FCS(PAA, 제품 번호 A15-771)를 보충한 고급 글루코스(PAA, 제품 번호 El5-009)를 갖는 MEM 둘베코(Dulbecco) 배지(DMEM)에 평판배양하였다. EC50 값을 결정하기 위하여, 웰당 1.3*104 세포를 접종한 96웰 판을 37℃ 및 5% CO2에서 2일 동안 배양하였다.
저혈청 배지로 배양한 지 48시간 후, 배지를 조심하여 제거하고 각각의 배지 50μl에 희석된 상이한 농도의 본 발명의 폴리펩티드로 대체하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 10분 동안 배양한 후, 배지를 흡인법으로 조심하여 제거하고, 냉 용해 완충액(50 mM 트리스 pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 20% 글라이세롤, 1% 트리톤-XIOO, 100 mM NaF, 1 mM NaVO4, 캄플리트(Complete)TM 프로티에이스 억제제) 120μl를 웰마다 첨가하였다. 판 진탕기 상에서 4℃에서 15분 동안 용해 완충액과 함께 판을 배양하고, 이후 웰 내용물 100μl를 인간 IGF-IR알파에 대한 모노클로날 항체로 피복된 ELISA 판에 옮겼다. 용해물을 판 진탕기에서 실온에서 1시간 동안 배양하여 포획(capture) 항체에 대한 IGF-IR 결합을 행한 후, 조심하여 흡인하였다. 결합하지 않은 물질은 각각 200μl PBST/웰로 3회 세척하여 제거하였다.
결합된 인산화 IGF-IR을 검출하기 위하여, 3% BSA/PBST에 1:12650으로 희석된, 인간 IGF-IR알파에 대한 폴리클로날 IgG 토끼 항체 100μl를 각각의 웰에 첨가한 후, 판 진탕기에서 실온에서 1시간 동안 다시 배양하였다. 웰 내용물을 다시 조심하여 제거하고 웰을 200μl PBST/웰로 3회 세척하였다. 폴리클로날 토끼 항체의 검출을 위하여, 3% BSA/PBST에 1:6000으로 희석된, HRP에 결합된 토끼 IgG(셀 시그날링 테크놀로지 인코포레이티드(Cell Signaling Technology Inc.), 미국)에 대한 폴리클로날 항체 100μl를 각각의 웰에 첨가하였다. 진탕기에서 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 결합되지 않은 검출 항체를 200μl PBST/웰로 판을 6회 세척하여 제거하였다. 항체-결합된 HRP에 대한 기질로서, 3,3'-5,5'-테트라메틸벤지딘 100μl를 각 웰에 첨가한 후, 진탕기에서 실온에서 0.5시간 동안 다시 배양하였다.
25μl/웰의 1M H2SO4로 반응을 정지시킨 후 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 정량화를 수행하였다.
수득된 시료의 OD450 값을 다음 식에 따라 100%(최대)로서 10nM IGF-I을, 0%(최소) 대조군으로서 IGF-I이 없는 경우를 이용하여 % 활성화로 변형하였다: % 활성화=(시료-최소)/(최대-최소). 산출된 EC50(IGF-lR의 최대의 절반 활성화시 폴리펩티드 농도)을 하기 표 3에 요약한다:
약어는 실시예 11을 참조한다.
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20 25 30
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
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50 55 60
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- 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-I) 변이체 RRRK(R27, R37, R65, K68)와 폴리(에틸렌 글라이콜)(PEG)로 구성되고, 상기 PEG가 1차 아미노 기를 통하여 상기 IGF-I 변이체에 접합되며, K68에서 모노PEG화되고, 상기 PEG의 총 분자량이 20 내지 100 kDa인 것을 특징으로 하는 접합체.
- 삭제
- 삭제
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- 제 2 항에 있어서,IGF-I 변이체에서 N-말단의 3개 이하의 아미노산이 절단되는(truncated) 것을 특징으로 하는 접합체.
- 제 2 항에 있어서,폴리(에틸렌 글라이콜) 기가 분지형 폴리(에틸렌 글라이콜) 기인 것을 특징으로 하는 접합체.
- 제 7 항에 있어서,폴리(에틸렌 글라이콜) 기의 총 분자량이 20 내지 100kDa인 것을 특징으로 하는 접합체.
- 삭제
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- IGF-I 변이체 RRRK(R27, R37, R65, K68) 및 총 분자량이 20 내지 100kDa인 하나의 폴리(에틸렌 글라이콜) 기를 포함하는 접합체의 제조 방법으로서,상기 IGF-I 변이체 RRRK(R27, R37, R65, K68)와 활성화된 폴리(에틸렌 글라이콜)을 상기 폴리(에틸렌 글라이콜)이 상기 IGF-I 변이체의 1차 라이신 아미노 기를 통해 상기 IGF-I 변이체에 화학적으로 결합하도록 하는 조건 하에서 반응시키는 것을 포함하는 방법.
- 삭제
- 제 2 항 또는 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 접합체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 알츠하이머병의 치료를 위한 약학 조성물.
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